CN116425884A - 一种德谷胰岛素的纯化及制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种德谷胰岛素的纯化及制备方法。本发明充分利用Lys‑C酶特点，设计专门适用Lys‑C酶酶切的重组构建体，进而提高了酶切效率，降低了生产成本，使得本发明提供的纯化方法和制备方法具备较高的回收率和产品纯度。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及一种德谷胰岛素的纯化及制备方法。
背景技术
糖尿病是一种由于机体胰岛素分泌不足或利用缺陷而导致的慢性疾病，胰岛素是由胰脏胰岛β细胞受到内源性或外源性物质如葡萄糖、乳糖、胰高血糖素等的刺激所分泌的蛋白质激素，能够使血液中的葡萄糖进入细胞并转化为机体活动所需的能量。人胰岛素由α、β两个肽链组成其中，α链有11种21个氨基酸，β链有15种30个氨基酸。糖尿病患者体内胰岛素的缺乏或作用缺陷使体内的葡萄糖持续存留在循环血液中，而这种高血糖可能会引起如糖尿病酮症酸中毒、高糖高渗性昏迷、乳酸性酸中毒等急性并发症，心血管疾病、肾病等慢性并发症，致残致死率高。
胰岛素治疗是控制高血糖的重要手段，按照种类不同，胰岛素分为动物胰岛素、重组人胰岛素和胰岛素类似物三代产品。其中，上世纪70年代通过基因工程开发出的重组人胰岛素具有免疫原性低、长期使用安全可靠、效价比高等优点，在临床中应用最为广泛。到了90年代，随着胰岛素生产技术的不断发展，人们又相继开发出了具有不同作用时间特点的胰岛素类似物，例如赖脯胰岛素、门冬胰岛素、甘精胰岛素、德谷胰岛素等。
由丹麦诺和诺德公司研制的重组德谷胰岛素注射液“Tresiba”是一种新型的长效胰岛素类似物。2013年1月得到欧盟批准，应用于I型和II型糖尿病患者的治疗。德谷胰岛素是新一代胰岛素类似物：其结构特点为通过一个L-γ-Glu连接子将重组desB30人胰岛素(去除B链第30位苏氨酸的人胰岛素肽链)的B链29位赖氨酸侧链ε-NH2基与16碳脂肪二酸侧链偶联而成。此设计提供一种独特的延长作用时间的机制。该种胰岛素类似物具有作用时间超长、变异性小、能够和速效胰岛素形成复方制剂等优点，皮下注射后会形成六聚体结构，此结构可作为一个存储库缓慢释放德谷胰岛素单体，这些单体能够缓慢并持续的被吸收利用。
目前，国内外关于德谷胰岛素制备的报道很多，一般是通过一种基因重组技术得到德谷胰岛素肽链，再通过液相合成方法连接侧链得到德谷胰岛素。在目前的现有方法中，德谷胰岛素肽链一般有两种来源，一种为包涵体来源，另一种为分泌蛋白来源。一般包涵体来源的德谷胰岛素肽链的纯化方法为阳离子层析纯化，然后经复性、酶切，得到德谷胰岛素肽链粗品，再经纯化步骤得到德谷胰岛素肽链。分泌蛋白来源的德谷胰岛素肽链的纯化方法包括前处理(微滤或盐析)，阳离子层析捕获，酶切得到德谷胰岛素肽链粗品，再经纯化步骤得到德谷胰岛素肽链。目前现有的纯化方法的酶切效率较低，且纯化困难和收率较低。
因此，提供一种回收效率高、产品纯度高的德谷胰岛素的纯化及制备工艺显得尤为重要。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种德谷胰岛素的纯化及制备方法。
第一方面，本发明提供了一种德谷胰岛素肽链的纯化方法，所述纯化方法包括如下步骤：
收集包含德谷胰岛素前体融合蛋白的发酵液，所述德谷胰岛素前体融合蛋白的氨基酸结构如下所示：
Leader-FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPK-Linker-GIVE
QCCTSICSLYQLENYCN；
其中，
Leader为C末端为K的引导肽；
Linker为C末端为K的连接肽，分别与德谷胰岛素B链的C末端和德谷胰岛素A链的N末端相连；
(2)发酵液经过层析纯化处理、酶切、反相层析纯化处理、沉淀分离，得到所述德谷胰岛素肽链，所述酶切使用Lys-C酶。
本发明方法使用的Lys-C酶可以是野生型Lys-C酶，也可以是Lys-C酶突变体，如申请人先期设计得到一种活性较高的Lys-C酶突变体，发明人发现，该酶的使用能够进一步提高酶切效率，降低生产成本。因此，本发明提供的纯化方法和制备方法特别适合从包含Lys-C酶酶切位点和德谷胰岛素肽链的融合蛋白中纯化制备德谷胰岛素肽链，并由德谷胰岛素肽链制备德谷胰岛素。
因此，本发明所述Lys-C酶可以为野生型Lys-C酶，也可以是Lys-C酶突变体。所述Lys-C酶突变体优选为专利CN202211681726.7中记载的HSE-LC。HSE-LC是将野生型赖氨酰特异性内切酶中第51位和第137位的氨基酸进行如下突变得到的：Y51D突变和R137K突变。所述野生型赖氨酰特异性内切酶的氨基酸序列为Genbank中Sequence ID:1ARB_A所示。
在本发明中，所述包含德谷胰岛素前体融合蛋白的发酵液按照本发明申请人在CN201811257578.X中记载方法制备，具体为以毕赤酵母为宿主菌构建重组工程菌，并通过高密度发酵方法得到发酵液。
德谷胰岛素为诺和诺德研发的每日一次长效胰岛素类似物，其德谷胰岛素B链意为其肽链的结构的B链，具体为desB30人胰岛素B链，即将人胰岛素B链的第30位氨基酸去除的肽链，剩余29位氨基酸序列与天然人胰岛素B链相同；而德谷胰岛素A链意为其肽链的结构的A链，其与天然人胰岛素A链完全相同，由21个氨基酸组成。
本发明的引导肽可以是现有技术中已知的可用引导肽，并在其C末端连接K，例如EEAEAEAEPK(SEQ ID NO.1，仅例举，并不构成对本申请使用引导肽的限制)。而所述Linker可以为C末端为K的连接肽，例如可以是AAK或MWK(仅例举，并不构成对本申请使用连接肽的限制)。
在本发明提供的纯化方法中：
所述层析纯化处理的方法为：将发酵液离心收集上清液，上清液进行阳离子交换层析纯化处理，并收集洗脱溶液。
所述酶切的方法为：将洗脱溶液调节pH至10-10.5，按照Lys-C酶:德谷胰岛素前体融合蛋白的质量比为1:(16000-16500)的比例添加Lys-C酶，进行酶切反应，得到酶切反应溶液。
所述反相层析纯化处理的方法为：酶切反应溶液利用C8硅胶树脂进行反向层析纯化处理，得到反相层析溶液。
所述沉淀分离的方法为：将反相层析溶液进行稀释，并调节pH至5.3-5.7，离心收集沉淀。
作为本发明的一种优选技术方案，在所述层析纯化处理中，使用的层析介质为交联琼脂糖，更优选为键合磺酸基丙基的交联琼脂糖；使用的平衡液为pH为3.0-4.0的无水乙酸钠；使用的洗脱溶液为三羟甲基氨基甲烷；层析柱介质载量为50-55g/L。
作为本发明的一种优选技术方案，所述酶切的方法为：将洗脱溶液调节温度为33-36℃，调节pH至10-10.5，按照Lys-C酶:德谷胰岛素前体融合蛋白的质量比为1:(16000-16500)的比例添加Lys-C酶，进行酶切反应18-25h，得到酶切反应溶液。
作为本发明的一种优选技术方案，在所述反相层析纯化处理中，树脂载量为25-30g/L，控制流速不高于420cm/h，使用的层析溶液以硫酸铵-三羟甲基氨基甲烷溶液为A相，乙腈-三羟甲基氨基甲烷溶液为B相，使用的平衡液为20％的B相，
在所述反相层析纯化处理中，洗脱梯度见表1：
表1
| 柱床体积(CV) | A相(％) | B相(％) |
| 0 | 80 | 20 |
| 2 | 75 | 25 |
| 12 | 65 | 35 |
作为本发明的一种优选技术方案，所述沉淀分离的方法为：将反相层析溶液稀释2-3倍，并调节pH至5.3-5.7，按照样品湿重:纯化水的质量体积比为1g:(9-12)mL的比例添加纯化水洗涤，离心收集沉淀，重复洗涤1-2次，然后按照样品湿重:纯化水的质量体积比为1g:(9-12)mL的比例添加纯化水，冻干。
作为本发明的一种优选技术方案，所述Lys-C酶为HSE-LC。
第二方面，本发明提供了一种德谷胰岛素的制备方法，所述制备方法包括：将第一方面所述的纯化方法制备得到的德谷胰岛素肽链利用修饰剂进行修饰反应，反应结束后经过沉淀分离、脱保护，得到德谷胰岛素粗品，所述修饰剂为(S)-1-叔丁氧基-5-(2,5-二羰基吡咯烷-1-基)-2-(16-叔丁氧基羰基十六烷酰胺基)戊二酸酯。
德谷胰岛素粗品经超滤、阴离子交换层析、反向层析I和等电点沉淀，得到德谷胰岛素纯品。
作为本发明的一种优选技术方案，所述修饰反应的方法包括：将德谷胰岛素肽链溶解在缓冲溶液中，调节pH至11-11.5，按照德谷胰岛素肽链:修饰剂的质量比为(6.5-7.5):1的比例添加修饰剂，进行修饰反应25-35min，所述缓冲液为100mmol/L硼酸-10mmol/L乙二胺四乙酸二钠溶液。
作为本发明的一种优选技术方案，进行修饰反应后，所述沉淀分离和脱保护的方法为：将反应液进行稀释并调节pH至5.2-5.5，离心收集沉淀，干燥得干粉，然后按照干粉:三氟乙酸的质量体积比为1g:(10-15)mL的比例添加三氟乙酸，进行脱保护反应25-35min，得到德谷胰岛素粗品。
作为本发明的一种优选技术方案，所述超滤的处理方法为：对德谷胰岛素粗品进行超滤，然后洗滤2-4次，稀释至电导为4.5-5.0mS/cm，得到包含德谷胰岛素粗品的超滤液。
作为本发明的一种优选技术方案，在所述阴离子交换层析中，使用的介质为Source-30Q阴离子填料，载量为10-15g/L，控制流速不高于340cm/h，使用的层析溶液以乙腈-三羟甲基氨基甲烷溶液为A相，乙腈-三羟甲基氨基甲烷-氯化钠的混合溶液为B相。
所述阴离子交换层析的层析溶液A相和B相的pH各自独立地选自7.6-7.8，洗脱梯度见表2：
表2
| 柱床体积(CV) | A相(％) | B相(％) |
| 0 | 100 | 0 |
| 20 | 0 | 100 |
作为本发明的一种优选技术方案，在所述反相层析I中，使用的介质为C4硅胶树脂，载量为5-10g/L，控制流速不高于420cm/h，使用的层析溶液以硫酸铵-乙酸铵溶液为A相，乙腈为B相，使用的平衡液为5％的B相。
所述反相层析I的层析溶液A相的pH为7.0-8.0，洗脱梯度见表3：
表3
| 柱床体积(CV) | A相(％) | B相(％) |
| 0 | 95 | 5 |
| 2 | 95 | 5 |
| 3 | 75 | 25 |
| 23 | 65 | 35 |
作为本发明的一种优选技术方案，所述等电点沉淀的方法为：将反相层析I样品进行稀释，并调节pH至5.2-5.6，离心收集沉淀，利用注射水重悬、离心分离，重复洗涤2-3次后，将沉淀用纯化水匀浆，重悬后的匀浆冻干。
本发明实施例提供的技术方案与现有技术相比具有如下优点：
(1)本发明提供的纯化方法能够得到纯度较高的德谷胰岛素肽链，Lys-C酶能够显著提高酶切效率，降低生产成本；
(2)本发明提供的纯化方法特别适用于通过Lys(K)连接德谷胰岛素肽链的A链和B链及表达元件的融合蛋白的纯化处理；
(3)本发明提供的德谷胰岛素的制备方法回收效率高、产品纯度高，其中，总收率达到60％左右，纯度达到99％以上。
具体实施方式
为了能够更清楚地理解本发明的上述目的、特征和优点，下面将对本发明的方案进行进一步描述。需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但本发明还可以采用其他不同于在此描述的方式来实施；显然，说明书中的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。
实施例1
本实施例提供了一种包含德谷胰岛素前体融合蛋白的发酵液。
为了获得能够稳定高表达的德谷胰岛素肽链，实现产业化应用价值的提升，发明人设计了一种包含德谷胰岛素前体的融合蛋白结构，并将其插入表达载体中。关于合成融合多肽编码基因、构建重组表达载体、构建重组工程菌和重组工程菌的发酵等具体参见在先专利申请CN201811257578.X。
本实施例所述的融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，具体为：
Leader-FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPK-Linker-GIVE
QCCTSICSLYQLENYCN；
其中，Leader为EEAEAEAEPK；Linker为MWK。
另外，根据专利CN202211681726.7中实施例记载方法制备得到Lys-C酶，具体使用的为HSE-LC。
实施例2
本实施例提供了在实施例1得到的发酵液的基础上制备并纯化德谷胰岛素肽链的方法，具体方法如下：
(1)阳离子交换层析
将发酵液稀释并离心，收集上清并过滤，过滤后样品进行阳离子交换层析纯化。层析介质为键合磺酸基丙基的交联琼脂糖；柱高25.1cm，载量54.45g/L介质，流速不高于170cm/h，电导率为11.95mS/cm。用10mmol/L的pH为3.0-4.0的无水乙酸钠进行平衡，上样后用100mmol/L的三羟甲基氨基甲烷(Tris)进行洗脱。
(2)酶切
将洗脱样品调节温度为33-36℃，利用1mol/L的氢氧化钠溶液调节pH至10-10.5，按照Lys-C酶:德谷胰岛素前体融合蛋白的质量比为1:(16000-16500)的比例添加Lys-C酶，进行酶切反应18-25h，得到包含酶切产物的溶液。
(3)反相层析
酶切后样品进行反向层析，层析介质为C8硅胶树脂，柱高25.9cm，载量29.63g/L，流速不高于420cm/h。
层析溶液：A相是3％硫酸铵-75mmol/L的Tris溶液，pH为7.5-8.5；B相是90％乙腈-25mmol/L的Tris溶液，pH为7.5-8.5。
使用20％B相平衡，上样过程中添加20％B相，梯度洗脱程序见表1。检测波长280nm，收峰范围峰尖-1000mAU。
(4)沉淀分离
将反相层析收集样品稀释2倍，调节pH至5.3-5.7。离心收集沉淀，按照1g湿重:(9-12)mL比例添加纯化水，离心收集沉淀，重复洗涤一次。然后将沉淀用纯化水匀浆，按照湿重:纯化水的质量体积比为1g:(9-12)mL的比例添加纯化水，重悬后的匀浆倒入冻干盘，冻干保存，得到德谷胰岛素肽链冻干粉。
利用实施例2提供的纯化方法进行多批次制备得到德谷胰岛素肽链，其中两批次的结果见表4：
表4
| 批次 | 收率/％ | 酶切效率/％ | 纯度/％ |
| 1 | 77.14 | 95.46 | 97.56 |
| 2 | 77.87 | 96.01 | 97.83 |
由表4可知，本发明提供的纯化方法酶切效率达到95％以上，说明本发明利用Lys-C酶对德谷胰岛素前体融合蛋白进行酶切能够显著提高酶切效率，降低生产成本。
实施例3
本实施例提供了一种德谷胰岛素的制备方法。
(1)脂肪酸侧链修饰
开启转肽修饰罐，将实施例2制备得到的德谷胰岛素肽链冻干粉，溶解在100mmol/L硼酸-10mmol/L乙二胺四乙酸二钠的缓冲溶液中，溶解浓度100-120mg/mL；用4mol/L的氢氧化钠溶液调节pH至11-11.5，按照冻干粉量与修饰剂[(S)-1-叔丁氧基-5-(2,5-二羰基吡咯烷-1-基)-2-(16-叔丁氧基羰基十六烷酰胺基)戊二酸酯]质量比为(6.5-7.5):1添加修饰剂，修饰反应时间25-35min。
反应结束后，添加等体积的纯化水，并用3mol/L的盐酸调节pH至5.2-5.5。将样品进行离心收集沉淀。用纯乙腈重悬沉淀，按照1g沉淀用5-10mL乙腈进行复溶，将沉淀重悬，离心收集沉淀，用乙腈重复洗涤1次，过夜干燥，得冻干粉。
(2)脱保护
将收集的步骤(1)的冻干粉，按照1g冻干粉添加10-15mL三氟乙酸的比例添加三氟乙酸，脱保护25-35min，用预冷的1.5mol/L的三羟甲基氨基甲烷稀释至pH为7.5-8.0，过滤收集过滤液。
(3)超滤
将上述收集的过滤液超滤至原体积的20％-50％，补加至原体积进行洗滤，洗滤2-4次，然后加入纯化水将超滤样品进行稀释，稀释至电导在4.5-5.0mS/cm之间。
(4)阴离子交换层析
将超滤液进行阴离子交换层析，层析介质为Source-30Q阴离子填料，柱高25.9cm，载量12.43g/L，流速不高于340cm/h。
层析溶液：A相是30％乙腈-25mmol/L的Tris溶液，pH为7.70；B相是30％乙腈-25mmol/L的Tris-0.5mol/L氯化钠的混合溶液，pH为7.73。梯度洗脱程序见表2。检测波长280nm，收峰范围1500mAU-峰尖-1000mAU。
(5)反相层析I
将阴离子交换层析液进行反相层析I纯化；层析介质为C4硅胶树脂，柱高25.9cm，载量5.77g/L，流速不高于420cm/h。
层析溶液：A相是2％硫酸铵-0.2mol/L乙酸铵，pH为7.0-8.0，B相是100％乙腈。
使用的平衡液为5％B相，梯度洗脱见表3。
检测波长280nm，收峰范围1200mAU-峰尖-1700mAU。
(6)等电点沉淀
将反相层析I合样加入等体积注射用水，滴加3mol/L冰醋酸调节pH至5.2-5.6。离心收集沉淀，用注射水重悬沉淀，离心，收集沉淀。重复洗涤三次后，将沉淀用纯化水匀浆，重悬后的匀浆倒入冻干盘冻干。
利用实施例3提供的制备方法进行多批次制备得到德谷胰岛素，其中两批次的结果见表5：
表5
| 批次 | 总收率/％ | 纯度/％ |
| 1 | 59.45 | 99.47 |
| 2 | 60.02 | 99.51 |
注：纯度是指：按照面积归一化法计算，德谷胰岛素亲水性杂质不超过1.2％；疏水性有关物质不超过3.3％；疏水性杂质不超过1.2％。
由表5可知，利用本发明提供的制备方法，得到的德谷胰岛素的收率能够达到60％左右，纯度达到99％以上。
需要说明的是，在本文中，诸如“第一”和“第二”等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。
以上所述仅是本发明的具体实施方式，使本领域技术人员能够理解或实现本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所述的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
Claims (11)
1.一种德谷胰岛素肽链的纯化方法，其特征在于，所述纯化方法包括如下步骤：
(1)收集包含德谷胰岛素前体融合蛋白的发酵液，所述德谷胰岛素前体融合蛋白的氨基酸结构如下所示：
Leader-FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPK-Linker-GIVEQCCTSICSLYQLENYCN；
其中，
Leader为C末端为K的引导肽；
Linker为C末端为K的连接肽，分别与德谷胰岛素B链的C末端和德谷胰岛素A链的N末端相连；
(2)发酵液经过层析纯化处理、酶切、反相层析纯化处理、沉淀分离，得到所述德谷胰岛素肽链，所述酶切使用Lys-C酶；
其中，所述层析纯化处理的方法为：将发酵液离心收集上清液，上清液进行阳离子交换层析纯化处理，并收集洗脱溶液；
所述酶切的方法为：将洗脱溶液调节pH至10-10.5，按照Lys-C酶:德谷胰岛素前体融合蛋白的质量比为1:(16000-16500)的比例添加Lys-C酶，进行酶切反应，得到酶切反应溶液；
所述反相层析纯化处理的方法为：酶切反应溶液利用C8硅胶树脂进行反向层析纯化处理，得到反相层析溶液；
所述沉淀分离的方法为：将反相层析溶液进行稀释，并调节pH至5.3-5.7，离心收集沉淀。
2.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，在所述层析纯化处理中，使用的层析介质为键合磺酸基丙基的交联琼脂糖；使用的平衡液为pH为3.0-4.0的无水乙酸钠；使用的洗脱溶液为三羟甲基氨基甲烷；层析柱介质载量为50-55g/L。
3.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，所述酶切的方法为：将洗脱溶液调节温度为33-36℃，调节pH至10-10.5，按照Lys-C酶:德谷胰岛素前体融合蛋白的质量比为1:(16000-16500)的比例添加Lys-C酶，进行酶切反应18-25h，得到酶切反应溶液。
4.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，在所述反相层析纯化处理中，树脂载量为25-30g/L，控制流速不高于420cm/h，使用的层析溶液以硫酸铵-三羟甲基氨基甲烷溶液为A相，乙腈-三羟甲基氨基甲烷溶液为B相，使用的平衡液为20％的B相。
5.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，所述沉淀分离的方法为：将反相层析溶液稀释2-3倍，并调节pH至5.3-5.7，按照样品湿重:纯化水的质量体积比为1g:(9-12)mL的比例添加纯化水洗涤，离心收集沉淀，重复洗涤1-2次，然后按照样品湿重:纯化水的质量体积比为1g:(9-12)mL的比例添加纯化水，冻干。
6.一种德谷胰岛素的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：将权利要求1-5中任一项所述的纯化方法制备得到的德谷胰岛素肽链利用修饰剂进行修饰反应，反应结束后经过沉淀分离、脱保护，得到德谷胰岛素粗品，所述修饰剂为(S)-1-叔丁氧基-5-(2,5-二羰基吡咯烷-1-基)-2-(16-叔丁氧基羰基十六烷酰胺基)戊二酸酯；
德谷胰岛素粗品经超滤、阴离子交换层析、反向层析I和等电点沉淀，得到德谷胰岛素纯品。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述修饰反应的方法包括：将德谷胰岛素肽链溶解在缓冲溶液中，调节pH至11-11.5，按照德谷胰岛素肽链:修饰剂的质量比为(6.5-7.5):1的比例添加修饰剂，进行修饰反应25-35min；
进行修饰反应后，所述沉淀分离和脱保护的方法为：将反应液进行稀释并调节pH至5.2-5.5，离心收集沉淀，干燥得干粉，然后按照干粉:三氟乙酸的质量体积比为1g:(10-15)mL的比例添加三氟乙酸，进行脱保护反应25-35min，得到德谷胰岛素粗品。
8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述超滤的处理方法为：对德谷胰岛素粗品进行超滤，然后洗滤2-4次，稀释至电导为4.5-5.0mS/cm，得到包含德谷胰岛素粗品的超滤液。
9.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，在所述阴离子交换层析中，使用的介质为Source-30Q阴离子填料，载量为10-15g/L，控制流速不高于340cm/h，使用的层析溶液以乙腈-三羟甲基氨基甲烷溶液为A相，乙腈-三羟甲基氨基甲烷-氯化钠的混合溶液为B相，所述阴离子交换层析的层析溶液A相和B相的pH各自独立地选自7.6-7.8。
10.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，在所述反相层析I中，使用的介质为C4硅胶树脂，载量为5-10g/L，控制流速不高于420cm/h，使用的层析溶液以硫酸铵-乙酸铵溶液为A相，乙腈为B相，使用的平衡液为5％的B相，所述反相层析I的层析溶液A相的pH为7.0-8.0。
11.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述等电点沉淀的方法为：将反相层析I样品进行稀释，并调节pH至5.2-5.6，离心收集沉淀，利用注射水重悬、离心分离，重复洗涤2-3次后，将沉淀用纯化水匀浆，重悬后的匀浆冻干。
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