CN116355101A - 一种门冬胰岛素的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种门冬胰岛素的制备方法,特别是一种门冬胰岛素前体的纯化方法及门冬胰岛素的制备方法。本发明充分利用Lys‑C酶特点,设计专门适用Lys‑C酶酶切的重组构建体和门冬胰岛素制备工艺。本发明的制备工艺简化、且使用Lys‑C酶,在保证较高酶切效率的同时,显著降低了生产成本。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域,尤其涉及一种门冬胰岛素的制备方法,特别是一种门冬胰岛素前体的纯化方法及门冬胰岛素的制备方法。
背景技术
糖尿病是一种由于机体胰岛素分泌不足或利用缺陷而导致的慢性疾病,胰岛素是由胰脏胰岛β细胞受到内源性或外源性物质如葡萄糖、乳糖、胰高血糖素等的刺激所分泌的蛋白质激素,能够使血液中的葡萄糖进入细胞并转化为机体活动所需的能量。人胰岛素由α、β两个前体组成其中,α链有11种21个氨基酸,β链有15种30个氨基酸。糖尿病患者体内胰岛素的缺乏或作用缺陷使体内的葡萄糖持续存留在循环血液中,而这种高血糖可能会引起如糖尿病酮症酸中毒、高糖高渗性昏迷、乳酸性酸中毒等急性并发症,心血管疾病、肾病等慢性并发症,致残致死率高。
胰岛素治疗是控制高血糖的重要手段,按照种类不同,胰岛素分为动物胰岛素、重组人胰岛素和胰岛素类似物三代产品。其中,上世纪70年代通过基因工程开发出的重组人胰岛素具有免疫原性低、长期使用安全可靠、效价比高等优点,在临床中应用最为广泛。到了90年代,随着胰岛素生产技术的不断发展,人们又相继开发出了具有不同作用时间特点的胰岛素类似物,例如赖脯胰岛素、门冬胰岛素、甘精胰岛素、德谷胰岛素等。
门冬胰岛素(美国专利US5618913,US5547930,US5834422)是一种快速作用的胰岛素类似物,由丹麦诺和诺德公司研制开发。与人胰岛素不同之处在于,将人胰岛素氨基酸链B28位的脯氨酸用带负电荷的门冬氨酸取代,增强了电荷排斥,从而能够阻止六聚体形成。因此,与正常的人胰岛素相比,门冬胰岛素的作用更迅速,效力持续时间更短。此外,门冬胰岛素与血浆蛋白的结合程度较低,它比普通人胰岛素能够更快的从血液中清除(NosekL等人,Diabetes,ObesityandMetabolism,15:77-83,2013;和SanliogluAD等人,Clinicalutility of insulin and insulin analogs.Islets5(2):67-78,2013.)。同时门冬胰岛素制剂的药代动力学接近人胰岛素的生理分泌曲线,且与常规人胰岛素相比,其药代动力学特性是常规人胰岛素的一半左右,起效时间为10-20分钟,达到峰值时间为40分钟,作用持续时间3-5小时,既有效控制了血糖,也不会造成夜间严重的低血糖事件。
目前,门冬胰岛素的制备一般采用基因工程技术制备前体,原研公司诺和诺德以酿酒酵母为表达宿主,利用重组DNA技术生产得到门冬胰岛素前体,再通过转肽等一系列复杂工艺制备门冬胰岛素。该方法在宿主菌改造等方面技术难度大、工艺复杂。由于酿酒酵母自身表达能力较弱,因此门冬胰岛素产量不高,其工程菌摇床培养最高为21.5mg/L,一定程度上增加了药品生产成本。相比酿酒酵母,毕赤酵母操作简单、易于培养、生长速度快、外源蛋白表达量高、AOX强效启动子将甲醇作为唯一碳源进行高密度发酵,受甲醇严格调控,是目前最强、调控机制最严格的启动子之一,可控制外源蛋白大量表达并以分泌形式释放到胞外,产物后期处理同样简单。与酿酒酵母相比,该系统外源蛋白表达量更高、糖基化程度低,表达产物不会出现过度糖基化现象。因此毕赤酵母是目前最为理想的真核表达系统之一。但目前现有的纯化方法的酶切效率较低,且纯化困难和收率较低。
因此,提供一种回收效率高、产品纯度高的门冬胰岛素的前体纯化及制备工艺显得尤为重要。
发明内容
为了解决上述技术问题,本发明提供了一种门冬胰岛素的制备方法。
本发明充分利用Lys-C酶特异性高、成本低的优势,针对门冬胰岛素B链第29位氨基酸为Lys-C酶酶切位点的特点,设计表达含有门冬胰岛素前体(A链和去掉第30位苏氨酸的B链)的重组构建体,经纯化后,再经转肽连接上B链第30位的苏氨酸。本发明的方法简单、便于工业化。其中,所述门冬胰岛素前体是指去掉B链第30位苏氨酸的门冬胰岛素。
第一方面,本发明提供了一种门冬胰岛素前体的纯化方法,所述纯化方法包括如下步骤:
(1)收集包含门冬胰岛素前体融合蛋白的发酵液;
(2)发酵液经过层析纯化处理、酶切、反相层析纯化处理、等电点沉淀,得到所述门冬胰岛素前体,所述酶切使用Lys-C酶。
本发明方法使用的Lys-C酶可以是野生型Lys-C酶,也可以是Lys-C酶突变体,如申请人先期设计得到一种活性较高的Lys-C酶突变体,发明人发现,该酶的使用能够进一步提高酶切效率,降低生产成本。因此,本发明提供的纯化方法和制备方法特别适合从包含Lys-C酶酶切位点和门冬胰岛素前体的融合蛋白中纯化制备门冬胰岛素前体,并从而制备门冬胰岛素。
因此,本发明所述Lys-C酶可以为野生型Lys-C酶,也可以是Lys-C酶突变体。所述Lys-C酶突变体优选为专利CN202211681726.7中记载的HSE-LC。HSE-LC是将野生型赖氨酰特异性内切酶中第51位和第137位的氨基酸进行如下突变得到的:Y51D突变和R137K突变。所述野生型赖氨酰特异性内切酶的氨基酸序列为Genbank中Sequence ID:1ARB_A所示。
同时,由于门冬胰岛素B链序列的B29为氨基酸K,因此,在利用Lys-C酶进行酶切反应时,需要构建不包含B30位氨基酸T的融合蛋白,在酶切纯化后再添加B30的氨基酸T而制备门冬胰岛素。即,本发明提供的纯化方法具体适用如下所示的融合蛋白:
Leader-FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTDK-Linker-GIVE QCCTSICSLYQLENYCN;
其中,Leader为C末端为K的引导肽,其通过所述氨基酸K与门冬胰岛素B链N末端的氨基酸F相连;Linker为C末端为K的连接肽,用于连接门冬胰岛素A链和B链,并通过末端的K与门冬胰岛素A链N末端的G相连。
门冬胰岛素为诺和诺德研发的速效胰岛素类似物,是由门冬氨酸替代人胰岛素B链28位的脯氨酸,而形成生物合成的速效人胰岛素类似物。门冬胰岛素B链为第28位脯氨酸替换为门冬氨酸的天然人胰岛素B链;本发明中的desB30门冬胰岛素B链是指去掉第30位苏氨酸的门冬胰岛素B链;而门冬胰岛素A链与天然人胰岛素A链完全相同,由21个氨基酸组成。
本发明的引导肽可以是现有技术中已知的可用引导肽,并在其C末端连接K,例如EEAEAEAEPK(SEQ ID NO.1,仅例举,并不构成对本申请使用引导肽的限制)。而所述Linker可以为C末端为K的连接肽,例如可以是MWK(仅例举,并不构成对本申请使用连接肽的限制)。
优选地,所述Leader可以是EEAEAEAEPK,所述Linker可以是AAK、MWK等。
在本发明提供的纯化方法中:
所述层析纯化处理的方法为:将发酵液离心收集上清液,上清液进行阳离子交换层析纯化处理,并收集洗脱溶液。
所述酶切的方法为:将洗脱溶液调节pH至7.5-8.0,按照Lys-C酶:门冬胰岛素前体融合蛋白的质量比为1:(10000-10500)的比例添加Lys-C酶,进行酶切反应,得到酶切反应溶液。
所述反相层析纯化处理的方法为:酶切反应溶液利用C8硅胶树脂进行反相层析纯化处理,得到反相层析溶液。
所述等电点沉淀的方法为:将反相层析溶液进行稀释,并调节pH至5.3-5.7,离心收集沉淀。
作为本发明的一种优选技术方案,在所述层析纯化处理中,使用的层析介质为交联琼脂糖,更优选为键合磺酸基丙基的交联琼脂糖;使用的平衡液为pH为3.0-4.0的乙酸钠溶液;使用的洗脱溶液为三羟甲基氨基甲烷溶液;层析柱介质载量为60-65g/L。
作为本发明的一种优选技术方案,所述酶切的方法为:将洗脱溶液调节温度为33-36℃,利用三羟甲基氨基甲烷溶液稀释至浓度为4.5-8.5g/L,调节pH至7.5-8.0,按照Lys-C酶:门冬胰岛素前体融合蛋白的质量比为1:(10000-10500)的比例添加Lys-C酶,进行酶切反应40-50h,得到酶切反应溶液。
作为本发明的一种优选技术方案,在所述反相层析纯化处理中,层析柱介质载量为25-30g/L,控制流速不高于420cm/h,使用的层析溶液以硫酸铵-三羟甲基氨基甲烷溶液为A相,乙腈-三羟甲基氨基甲烷溶液为B相,使用的平衡液为5%的B相。
在所述反相层析纯化处理中,洗脱梯度见表1:
表1
柱床体积(CV) | A(%) | B(%) |
0 | 95 | 5 |
2 | 75 | 25 |
12 | 60 | 40 |
作为本发明的一种优选技术方案,所述等电点沉淀的方法为:将反相层析溶液稀释2-3倍,并调节pH至5.3-5.7,离心收集沉淀,按照1g样品湿重:(8-12)mL纯化水的比例添加纯化水洗涤,离心收集沉淀,重复洗涤一次后,按照1g样品湿重:(8-12)mL纯化水的比例添加纯化水匀浆,冻干。
作为本发明的一种优选技术方案,所述Leader为EEAEAEAEPK;Linker为AAK或MWK,优选所述Linker为MWK。
作为本发明的一种优选技术方案,所述Lys-C酶为HSE-LC。
第二方面,本发明提供了一种门冬胰岛素的制备方法,所述制备方法包括:将第一方面所述的纯化方法制备得到的门冬胰岛素前体利用修饰剂和Lys-C酶进行转肽反应,反应结束后经过反相层析I、沉淀分离、脱保护,得到含有门冬胰岛素粗品的过滤液,所述修饰剂为[H-Thr(tBu)-OtBu·AcOH]。
作为本发明的一种优选技术方案,所述含有门冬胰岛素粗品的过滤液经反相层析II、结晶,得到门冬胰岛素纯品。
作为本发明的一种优选技术方案,所述转肽反应的方法为:将门冬胰岛素前体溶解在转肽反应液中,按照门冬胰岛素前体:修饰剂的质量比为1:(2.5-3)的比例添加修饰剂,按照Lys-C酶:门冬胰岛素前体的质量比为1:(1400-1500)的比例添加Lys-C酶,进行反应,反应结束后,稀释产物溶液并调节pH至5.4-5.6,离心收集沉淀,盐酸复溶,并加入乙腈和乙二胺四乙酸二钠,调节pH至8.0-8.5,得到产物稀释液,所述转肽反应液为二甲基亚砜、三羟甲基氨基甲烷和1,4-丁二醇的混合液。
作为本发明的一种优选技术方案,所述转肽反应的方法为:设置温度为28-35℃,将门冬胰岛素前体溶解在反应液中,所述反应液为二甲亚砜、三羟甲基氨基甲烷和1,4-丁二醇的混合液,按照门冬胰岛素前体:修饰剂的质量比为1:(2.5-3)的比例添加修饰剂,按照Lys-C酶:门冬胰岛素前体的质量比为1:(1400-1500)的比例添加Lys-C酶,进行转肽反应20-30h,反应结束后,用乙腈将产物溶液稀释4-6倍,加入乙酸锌至浓度为8-12mmol/L,并调节pH至5.4-5.6,离心收集沉淀,盐酸复溶,调节pH至8.5-9.0,加入乙腈和乙二胺四乙酸二钠至终浓度为48-52mmol/L,混匀后调节pH至8.0-8.5。
作为本发明的一种优选技术方案,所述反相层析I的方法为:产物稀释液利用C8硅胶树脂进行反相层析I纯化处理,得到反相层析I溶液。
作为本发明的一种优选技术方案,在所述反相层析I中,使用的介质为C8硅胶树脂,载量为10-15g/L,控制流速不高于420cm/h,使用的层析溶液以硫酸铵-三羟甲基氨基甲烷溶液为A相,乙腈为B相,使用的平衡液为20%的B相。
所述反相层析I的层析溶液A相的pH为8.0-9.0,洗脱梯度见表2:
表2
柱床体积(CV) | A相(%) | B相(%) |
0 | 80 | 20 |
20 | 60 | 40 |
作为本发明的一种优选技术方案,所述沉淀分离的方法为:反相层析I溶液进行稀释,并调节pH至5.3-5.6,离心收集沉淀。
作为本发明的一种优选技术方案,所述沉淀分离的方法为:将反相层析I溶液稀释1-3倍,加入乙酸锌溶液至浓度为8-12mmol/L,用盐酸调节pH至5.3-5.6,离心收集沉淀,重复洗涤一次,然后利用纯化水匀浆,冻干,得到冻干粉。
作为本发明的一种优选技术方案,所述脱保护的方法为:按照冻干粉:三氟乙酸的质量体积比为1g:(11-12)mL的比例,将冻干粉与三氟乙酸混合进行脱保护反应,然后利用预冷的稀释液进行稀释,并过滤,得到含有门冬胰岛素粗品的过滤液;
作为本发明的一种优选技术方案,所述脱保护的方法为:按照冻干粉:三氟乙酸的质量体积比为1g:(11-12)mL的比例,将冻干粉与三氟乙酸混合进行脱保护反应25-35min,然后利用预冷的稀释液稀释至pH为7.3-7.6,并过滤,得到含有门冬胰岛素粗品的过滤液,所述稀释液为含有三羟甲基氨基甲烷的乙二胺四乙酸二钠溶液。
作为本发明的一种优选技术方案,所述反相层析II的方法为:将过滤液利用C8硅胶树脂进行反向层析II纯化处理,得到反相层析II溶液;
作为本发明的一种优选技术方案,在所述反相层析II中,使用的介质为C8硅胶树脂,载量为5-10g/L,控制流速不高于420cm/h,使用的层析溶液以硫酸铵-乙酸铵溶液为A相,50%乙腈为B相,使用的平衡液为40%的B相;
所述反相层析II的洗脱梯度见表3:
表3
柱床体积(CV) | A相(%) | B相(%) |
0 | 60 | 40 |
20 | 35 | 65 |
作为本发明的一种优选技术方案,所述结晶的方法为:将反相层析II溶液与氯化钠、甘氨酸、苯酚、注射用水、氯化锌和盐酸混合、静置、收集沉淀,然后利用无水乙醇重悬、离心后用注射用水匀浆,水洗、冻干。
作为本发明的一种优选技术方案,所述结晶的方法为:将反相层析II溶液与氯化钠、甘氨酸、苯酚、注射用水、氯化锌和盐酸混合均匀,在2-8℃下静置18-22h,离心收集沉淀,然后利用无水乙醇重悬、离心后用注射用水匀浆,并调节pH至5.3-5.6,重复注射用水水洗,调节pH至5.4-5.6,最后用注射用水重悬后冻干。
在所述结晶方法中,根据反相层析II溶液体积和蛋白浓度计算氯化钠、甘氨酸、苯酚、注射用水、氯化锌和盐酸的加入量,计算方法为:
将反相层析II收集液体积设为V L、蛋白浓度设为M g/L,根据如下计算式计算,其中:
1)补入2mol/L氯化钠(3×V/10)L;
2)补入1mol/L甘氨酸体积(V/10)L;
3)补入20%苯酚(V/50)L;
4)补入10mmol/L氯化锌[(7×M×V)/653.8]L;
5)补入0.2mol/L盐酸约(V/30)L;
6)补入注射用水:0.547×V-[(7×M×V)/653.8]L。
本发明实施例提供的技术方案与现有技术相比具有如下优点:
(1)本发明提供的纯化方法能够得到纯度较高的门冬胰岛素前体,Lys-C酶能够显著提高酶切效率,降低生产成本;
(2)本发明提供的门冬胰岛素的制备方法回收效率高、产品纯度高,其中,总收率达到81%以上,纯度达到99%以上;
(3)本发明提供的纯化方法特别适用从包含Lys-C酶酶切位点和门冬胰岛素前体蛋白的融合蛋白中纯化制备门冬胰岛素前体,并进而制备得到门冬胰岛素。
具体实施方式
为了能够更清楚地理解本发明的上述目的、特征和优点,下面将对本发明的方案进行进一步描述。需要说明的是,在不冲突的情况下,本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明,但本发明还可以采用其他不同于在此描述的方式来实施;显然,说明书中的实施例只是本发明的一部分实施例,而不是全部的实施例。
实施例1
本实施例提供了一种包含门冬胰岛素前体的融合蛋白的发酵液。
按照专利CN202010455882.6的方法构建得到能够表达门冬胰岛素前体的融合蛋白的重组工程菌,并按照上述专利发酵制备得到包含所述融合蛋白的发酵液,其中,所述融合蛋白氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示,具体为:
Leader-FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTDK-Linker-GIVE
QCCTSICSLYQLENYCN;
其中,Leader为EEAEAEAEPK;Linker为MWK。
另外,根据专利CN202211681726.7中实施例记载方法制备得到Lys-C酶,具体使用的为HSE-LC。
实施例2
本实施例提供了在实施例1得到的发酵液的基础上制备并纯化门冬胰岛素前体的方法,具体方法如下:
(1)阳离子交换层析
将发酵液离心收集上清并过滤,过滤后样品进行阳离子交换层析纯化。层析介质为键合磺酸基丙基的交联琼脂糖,柱高25.1cm,载量62.15g/L介质,流速不高于170cm/h;用10mmol/L乙酸钠(pH:3.0-4.0)进行平衡,上样后用100mmol/L三羟甲基氨基甲烷(Tris)进行洗脱,得到层析样品;检测波长280nm。
(2)酶切
收集层析样品并调节温度在33-36℃,用100mmol/L三羟甲基氨基甲烷稀释至样品浓度4.5-8.5g/L,按照Lys-C酶:门冬胰岛素前体融合蛋白的质量比为1:(10000-10500)的比例添加Lys-C酶,酶切时间40-50h,酶切样品调pH到7.5-8.0。
(3)反相层析
将上述酶切溶液进行反相层析纯化。层析介质为C8硅胶树脂,柱高25.7cm,载量28.15g/L介质,流速不高于420cm/h。
层析溶液:A相是1%硫酸铵-25mmol/L Tris(pH7.5-8.0),B相是90%乙腈-25mmol/L Tris(pH7.5-8.0)。使用5%B相平衡,上样过程中添加5%B相,梯度洗脱程序见表1。检测波长280nm,收峰范围峰尖-1000mAU。
(4)等电点沉淀
将反相层析收集液稀释2倍,pH调至5.3-5.7,离心收集沉淀;按照1g湿重:8-12mL比例添加纯化水,离心,收集沉淀,重复洗涤一次后。将沉淀用纯化水匀浆,按照1g湿重:8-12mL比例添加纯化水,重悬后的匀浆倒入冻干盘冻干;并保存于-20℃以下。
利用实施例2提供的纯化方法进行多批次制备得到门冬胰岛素前体,其中两批次的结果见表4:
表4
批次 | 收率/% | 酶切效率/% | 纯度/% |
1 | 79.92 | 95.83 | 96.78 |
2 | 80.06 | 95.96 | 96.93 |
由表4可知,本发明提供的纯化方法酶切效率达到95%以上,说明本发明利用Lys-C酶对门冬胰岛素融合蛋白进行酶切能够显著提高酶切效率,降低生产成本。
实施例3
本实施例提供了一种门冬胰岛素的制备方法。
(1)转肽
开启转肽修饰罐,设置温度在30.0℃,将实施例2得到的冻干粉在反应液中溶解,配制为浓度45-55g/L的转肽反应溶液,所述反应液由40%二甲亚砜(DMSO)、20%的0.5mol/L Tris溶液、40%的1,4-丁二醇组成(体积比)。按照冻干粉:修饰剂的质量比为1:(2.5-3)的比例,加入修饰剂[H-Thr(tBu)-OtBu·AcOH]。按照Lys-C酶:冻干粉质量比为1:(1400-1500)比例,添加Lys-C酶,反应20-30h。
反应结束后,用5%乙腈稀释4-6倍,补入1mol/L乙酸锌至终浓度为10mmol/L,调节pH至5.4-5.6,离心收集沉淀,洗涤后稀盐酸复溶。调节pH至8.5-9.0,补入乙腈至终浓度20%,补入0.2mol/L乙二胺四乙酸二钠(EDTA)至终浓度为50mmol/L,混匀后调节pH至8.0-8.5。
(2)反相层析I
上述转肽反应后溶液进行反相层析I纯化。层析介质为C8硅胶树脂;柱高26.5cm,载量13.35g/L介质,流速不高于420cm/h。
层析溶液:A相是1%硫酸铵-50mmol/L Tris(溶液pH8.0-9.0),B相是乙腈。用20%B相平衡,转肽样品上样,梯度洗脱程序见表2。检测波长280nm,收峰范围1000mAU-峰尖-1300mAU。
(3)乙酸锌沉淀
将反相层析I合样加入等体积注射用水,添加1mol/L乙酸锌溶液至终浓度为10mmol/L,用盐酸将样品pH调至5.3-5.6。离心收集沉淀,用纯化水重悬沉淀,离心,收集沉淀。重复洗涤一次后,将沉淀用纯化水匀浆,重悬后的匀浆倒入冻干盘冻干。
(4)脱保护
步骤(3)得到的冻干粉添加三氟乙酸(每g冻干粉添加11-12mL三氟乙酸)进行脱保护,脱保护时间为25-35min,用预冷的稀释液(1mol/L三羟甲基氨基甲烷,50mmol/L乙二胺四乙酸二钠溶液)稀释至pH为7.3-7.6,并过滤。
(5)反相层析II
过滤液进行反相层析II纯化,层析介质为C8硅胶树脂;柱高25.9cm,载量5.63g/L介质,流速不高于420cm/h。
层析溶液:A相是2%硫酸铵-0.2mol/L乙酸铵,B相是50%乙腈。用40%B相平衡,上样过程添加40%B相,梯度洗脱程序见表3。检测波长280nm,收峰范围1200mAU-峰尖-1700mAU。
(6)结晶
根据反相层析II收集液体积(设为V L)、蛋白浓度(设为M g/L)计算如下参数:
1)补入2mol/L氯化钠(3×V/10)L;
2)补入1mol/L甘氨酸体积(V/10)L;
3)补入20%苯酚(V/50)L;
4)补入10mmol/L氯化锌[(7×M×V)/653.8]L;
5)补入0.2mol/L盐酸约(V/30)L;
6)补入注射用水:0.547×V-[(7×M×V)/653.8]L;
在反相层析II合样中加入2mol/L氯化钠、1mol/L甘氨酸、20%苯酚、注射用水、10mmol/L氯化锌及0.2mol/L盐酸等。搅拌后,2-8℃静置18-22h,离心收集沉淀。用无水乙醇重悬沉淀,离心,用注射用水匀浆,调节至pH5.3-5.6,重复注射用水水洗,调节至pH5.4-5.6。用注射用水重悬后倒入冻干盘冻干,保存于-20℃以下。
利用实施例3提供的制备方法进行多批次制备得到门冬胰岛素,其中两批次的结果见表5:
表5
批次 | 收率/% | 纯度% |
1 | 81.96 | 99.44 |
2 | 82.68 | 99.52 |
注:(1)收率是指:反相层析II工序收率,收率=合样体积(L)×合样含量(g/L)÷上样蛋白量(g)×100%;
(2)纯度是指:扣除空白及苯酚,按照面积归一化法计算,B28 iso Asp门冬胰岛素应不得过0.3%;脱氨门冬胰岛素(A21 Asp门冬胰岛素、B3 Asp门冬胰岛素、B3 iso Asp门冬胰岛素之和)应不得过1.0%;其它有关物质总量应不得过0.5%。
由表5可知,利用本发明提供的制备方法,得到的门冬胰岛素的收率能够达到81%以上,纯度达到99%以上。
需要说明的是,在本文中,诸如“第一”和“第二”等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来,而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且,术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含,从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素,而且还包括没有明确列出的其他要素,或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下,由语句“包括一个……”限定的要素,并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。
以上所述仅是本发明的具体实施方式,使本领域技术人员能够理解或实现本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的技术人员来说将是显而易见的,本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下,在其它实施例中实现。因此,本发明将不会被限制于本文所述的这些实施例,而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
Claims (12)
1.一种门冬胰岛素前体的纯化方法,其特征在于,所述纯化方法包括如下步骤:
(1)收集包含门冬胰岛素前体融合蛋白的发酵液,所述门冬胰岛素前体融合蛋白的氨基酸结构如下所示:
Leader-FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTDK-Linker-GIVEQCCTSICSLYQLENYCN;
其中,
Leader为C末端为K的引导肽;
Linker为C末端为K的连接肽,分别与门冬胰岛素B链的C末端和门冬胰岛素A链的N末端相连;
(2)发酵液经过层析纯化处理、酶切、反相层析纯化处理、等电点沉淀,得到所述门冬胰岛素前体,所述酶切使用Lys-C酶;
其中,所述层析纯化处理的方法为:将发酵液离心收集上清液,上清液进行阳离子交换层析纯化处理,并收集洗脱溶液;
所述酶切的方法为:将洗脱溶液调节pH至7.5-8.0,按照Lys-C酶:门冬胰岛素前体融合蛋白的质量比为1:(10000-10500)的比例添加Lys-C酶,进行酶切反应,得到酶切反应溶液;
所述反相层析纯化处理的方法为:酶切反应溶液利用C8硅胶树脂进行反相层析纯化处理,得到反相层析溶液;
所述等电点沉淀的方法为:将反相层析溶液进行稀释,并调节pH至5.3-5.7,离心收集沉淀。
2.根据权利要求1所述的纯化方法,其特征在于,在所述层析纯化处理中,使用的层析介质为键合磺酸基丙基的交联琼脂糖;使用的平衡液为pH为3.0-4.0的乙酸钠溶液;使用的洗脱溶液为三羟甲基氨基甲烷溶液;层析柱介质载量为60-65g/L。
3.根据权利要求1所述的纯化方法,其特征在于,所述酶切的方法为:将洗脱溶液调节温度为33-36℃,利用三羟甲基氨基甲烷溶液稀释至浓度为4.5-8.5g/L,调节pH至7.5-8.0,按照Lys-C酶:门冬胰岛素前体融合蛋白的质量比为1:(10000-10500)的比例添加Lys-C酶,进行酶切反应40-50h,得到酶切反应溶液。
4.根据权利要求1所述的纯化方法,其特征在于,在所述反相层析纯化处理中,层析柱介质载量为25-30g/L,控制流速不高于420cm/h,使用的层析溶液以硫酸铵-三羟甲基氨基甲烷溶液为A相,乙腈-三羟甲基氨基甲烷溶液为B相,使用的平衡液为5%的B相。
5.根据权利要求1所述的纯化方法,其特征在于,所述等电点沉淀的方法为:将反相层析溶液稀释2-3倍,并调节pH至5.3-5.7,离心收集沉淀,按照1g样品湿重:(8-12)mL纯化水的比例添加纯化水洗涤,离心收集沉淀,重复洗涤一次后,按照1g样品湿重:(8-12)mL纯化水的比例添加纯化水匀浆,冻干。
6.一种门冬胰岛素的制备方法,其特征在于,所述制备方法包括:将权利要求1-5中任一项所述的纯化方法制备得到的门冬胰岛素前体利用修饰剂和Lys-C酶进行转肽反应,反应结束后经过反相层析I、沉淀分离、脱保护,得到含有门冬胰岛素粗品的过滤液,所述修饰剂为[H-Thr(tBu)-OtBu·AcOH];
所述含有门冬胰岛素粗品的过滤液经反相层析II、结晶,得到门冬胰岛素纯品。
7.根据权利要求6所述的制备方法,其特征在于,所述转肽反应的方法为:将门冬胰岛素前体溶解在转肽反应液中,按照门冬胰岛素前体:修饰剂的质量比为1:(2.5-3)的比例添加修饰剂,按照Lys-C酶:门冬胰岛素前体的质量比为1:(1400-1500)的比例添加Lys-C酶,进行反应,反应结束后,稀释产物溶液并调节pH至5.4-5.6,离心收集沉淀,盐酸复溶,并加入乙腈和乙二胺四乙酸二钠,调节pH至8.0-8.5,得到产物稀释液,所述转肽反应液为二甲基亚砜、三羟甲基氨基甲烷和1,4-丁二醇的混合液。
8.根据权利要求6所述的制备方法,其特征在于,所述反相层析I的方法为:产物稀释液利用C8硅胶树脂进行反相层析I纯化处理,得到反相层析I溶液。
9.根据权利要求6所述的制备方法,其特征在于,所述沉淀分离的方法为:反相层析I溶液进行稀释,并调节pH至5.3-5.6,离心收集沉淀,并冻干。
10.根据权利要求6所述的制备方法,其特征在于,所述脱保护的方法为:按照冻干粉:三氟乙酸的质量体积比为1g:(11-12)mL的比例,将冻干粉与三氟乙酸混合进行脱保护反应,然后利用预冷的稀释液进行稀释,并过滤,得到含有门冬胰岛素粗品的过滤液。
11.根据权利要求10所述的制备方法,其特征在于,所述反相层析II的方法为:将过滤液利用C8硅胶树脂进行反向层析II纯化处理,得到反相层析II溶液。
12.根据权利要求6所述的制备方法,其特征在于,所述结晶的方法为:将反相层析II溶液与氯化钠、甘氨酸、苯酚、注射用水、氯化锌和盐酸混合、静置、收集沉淀,然后利用无水乙醇重悬、离心后用注射用水匀浆,水洗、冻干。
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CB02 | Change of applicant information | ||
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Address after: 100025 21 floor, 2 building, 2000 business center, Eight Mile Village, Chaoyang District, Beijing. Applicant after: Beijing huizhiheng Biotechnology Co.,Ltd. Applicant after: Jilin Huisheng Biopharmaceutical Co.,Ltd. Address before: 100025 21 floor, 2 building, 2000 business center, Eight Mile Village, Chaoyang District, Beijing. Applicant before: Beijing huizhiheng Biotechnology Co.,Ltd. Applicant before: Jilin Huisheng biopharmaceutical Co.,Ltd. |
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GR01 | Patent grant | ||
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