CN114958787A - 新月弯孢霉甾体C14α-羟化酶CYP5103B5突变体构建及其应用 - Google Patents

新月弯孢霉甾体C14α-羟化酶CYP5103B5突变体构建及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明专利提供了新月弯孢霉甾体C14α‑羟化酶突变体Y10(S129A/T130A/D131G/T132L/V133I/R134K/S135K)、D131G，其编码核苷酸序列如SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6所示。同C14α‑羟化酶CYP5103B5相比，突变体Y10(S129A/T130A/D131G/T132L/V133I/R134K/S135K)、D131G转化甾体底物孕酮的特异性明显提高，副产物明显减少。本发明专利还提供了涉及CYP5103B5突变体异源过表达的表达载体及其甾体转化工艺，为研究开发高效孕酮C14α‑羟化生产工艺提供了宝贵材料(基因和菌种)和基础数据支撑。

Description

新月弯孢霉甾体C14α-羟化酶CYP5103B5突变体构建及其应用
技术领域：
本发明应用基因工程和酶工程技术，具体涉及C14α-羟化酶突变体及其应用。
背景技术：
甾体激素类药物被广泛应用于临床治疗。该类药物主要用于抗病毒、消炎、抗肿瘤、抗癌细胞活性、免疫调节、抗过敏、避孕、治疗心脑血管疾病以及促进骨骼发育等方面。甾体化合物的结构复杂，其生理及药理活性取决于甾体母核特定位点的取代基。
14α-羟基化反应是一个非常重要的过程，14α-羟基甾体化合物具有抗癌生物活性和特殊的促性腺激素作用。例如孕酮的14α-羟基衍生物14α-羟基-孕甾-4-烯-3，20-二酮可以作为替代化学合成途径的药物前体，生成一种广泛应用于兽用避孕及治疗的高活性抗促性腺激素药物普罗孕酮的前体；雄烯二酮(AD)的14α-羟基衍生物14α-羟基-4-烯-3，17-二酮，可以作为合成14α-羟基-4-烯-3，6，17-三酮的前体，且14α-羟基-4-烯-3，6，17-三酮被证明能够抑制人体胎盘和子宫肿瘤的芳香酶活性和雌激素的合成，并可用于乳腺癌或雌激素依赖性子宫肿瘤的化疗。除了用于抗炎及避孕外，其中几种14α-羟基甾体化合物还表现出抗肿瘤活性。除此之外，14α-羟基构型可以转化为有心脏活性类固醇结构特征的14β-构型，14β-羟基甾体化合物的衍生物是重要的心肌收缩增强剂。据报道，14-OH-5β，14β-孕甾烷的C-3糖苷衍生物已被证明与心肌的糖苷受体会产生强烈的相互作用。
尽管14α-羟基甾体化合物有许多生物活性，但合成14α-羟基甾体衍生物的方式有限。由于甾体母核C14三级结构位置的特殊性，使得利用化学合成的方法很难在该位置引入羟基，但甾体微生物转化能够通过一步将氧原子插入甾体分子的远程非活化的C-H键，且具有极好的区域和立体选择性，为工业生产有价值的中间体提供了有效的解决方案。丝状真菌是甾体选择性羟基化商业菌株的主要来源。利用新月弯孢霉虽然可以在孕酮的C14α位引入羟基，但它无法进一步积累14α-羟基孕酮，并且使用新月弯孢霉存在一些潜在的应用缺陷。一方面，新月弯孢霉生长缓慢，产孢量较弱，液体培养时很难控制其形态同质性。另一方面，新月弯曲霉构成了潜在的安全风险，因为据报道，这种真菌可能会在人类中引起几种类型的感染，如角膜炎和皮肤病。相比之下，酿酒酵母以其自然优势而闻名，如快速生长、成熟的基因操作和使用安全。因此，我们克隆鉴定了新月弯孢霉CICC40301中的C14α-羟化酶基因CYP5103B5。C14α-羟化酶CYP5103B5虽然可以转化孕酮但它无法进一步积累14α-羟基孕酮。
为了改善新月弯孢霉C14α-羟化酶CYP5103B5基因对底物孕酮的羟化特异性，利用定点突变技术对其进行分子水平上的改造，筛选获得了两个对孕酮具有高羟化特异性C14α-羟化酶突变体Y10(S129A/T130A/D131G/T132L/V1331/R134K/S135K)、D131G。发酵转化结果显示，过表达突变体Y10(S129A/T130A/D131G/T132L/V133I/R134K/S135K)、D131G的重组酿酒酵母对底物孕酮的C14α-羟化特异性明显提高，为研究开发绿色高效孕酮C14α-羟化工艺奠定了坚实的基础。
发明内容：
针对现有甾体孕酮羟化产物特异性不高的现状，本发明的第一个目标是利用分子操作技术构建重组表达载体，在酿酒酵母中进行异源表达，筛选出C14α-高羟化特异性的突变体Y10(S129A/T130A/D131G/T132L/V133I/R134K/S135K)、D131G。
本发明所述的CYP5103B5基因来源于新月弯孢霉。
本发明未定点突变的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，其相应核苷酸序列如SEQID NO：2所示。
本发明中突变体Y10(S129A/T130A/D131G/T132L/V133I/R134K/S135K)氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示，其相应核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。
本发明中突变体D131G氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示，其相应核苷酸序列如SEQID NO：6所示，以上序列属于本发明的保护范围。
利用本发明所述的编码C14α-羟化酶的基因CYP5103B5所构建的表达载体、重组表达质粒或宿主细胞也属于本发明的保护范围，所使用的扩增引物序列、针对基因片段CYP5103B5定点突变所涉及氨基酸位点也属于本发明的保护范围。
本发明所述的经定点突变技术获得的突变基因CYP5103B5编码的甾体化合物羟化酶包括但不限于酿酒酵母等宿主细胞内表达。
有益效果：
通过重组酵母菌突变体甾体转化实验，获得高羟化特异性C14α-羟化酶突变体Y10(S129A/T130A/D131G/T132L/V133I/R134K/S135K)和D131G，对甾体孕酮的转化特异性显著高于基因野生型菌株，本发明的研究成果具有重要的商业应用价值。并且重组酿酒酵母孕酮C14α-羟化工程菌的构建为研究开发高效孕酮C14α-羟化生产工艺提供了宝贵材料(基因和菌种)和基础数据支撑。
说明书附图：
图1孕酮的C14α-羟基化反应
图2基因片段CYP5103B5琼脂糖凝胶电泳验证图
其中：M为DNAMarker；
图3pYES2-CYP5103B5重组表达载体构建图
图4pYES2-CYP5103B5重组表达载体质粒酶切验证图
图5基因重组菌突变体Y10(S129A/T130A/D131G/T132L/V133I/R134K/S135K)、D131G PCR扩增产物条带琼脂糖凝胶电泳图
其中：M为DNA Marker，1-2分别是突变体Y10、D131G PCR扩增产物条带；
图6基因重组菌突变体Y10(S129A/T130A/D131G/T132L/V133I/R134K/S135K)、D131G质粒酶切验证琼脂糖凝胶电泳图
其中：M为DNA Marker，1-2分别是突变体Y10(S129A/T130A/D131G/T132L/V133I/R134K/S135K)、D131G质粒经双酶切验证图；
图7基因重组菌突变体Y10(S129A/T130A/D131G/T132L/V133I/R134K/S135K)、D131G转化底物孕酮TLC图
图8突变体Y10(S129A/T130A/D131G/T132L/V133I/R134K/S135K)和基因野生型CYP5103B5转化底物孕酮HPLC结果图
图9突变体D131G和基因野生型CYP5103B5转化底物孕酮HPLC结果图
具体实施方式：
下面通过具体的实施方案叙述本发明方法。除非特别说明，本发明所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
本发明中涉及菌株：酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae INVSc1)，新月弯孢霉(Curvularia lunata)，天津科技大学微生物菌种保藏中心。
实施例1：pYES2-CYP5103B5重组酿酒酵母载体的构建
1.CYP5103B5基因扩增
从新月弯孢霉中提取RNA，经反转录获得cDNA文库，以新月弯孢霉的cDNA为模板，设计带有EcoR I、Not I酶切位点的上下游引物，进行PCR扩增，引物由北京华大基因公司进行合成。
F：GAATTCATGGATCCCCAGACCGTC
R：GCGGCCGCCTACACAACAACCCTCTTG
(1)PCR反应体系：
Figure BSA0000274102290000041
(2)PCR反应条件：
Figure BSA0000274102290000042
PCR产物经琼脂糖凝胶电泳验证正确，如图2
2.PCR产物的纯化和酶切
50μL PCR产物经Dpn I酶(0.5μL)放置于37℃恒温培养箱内消化模板3h后，在70℃的金属浴中放置20min(灭酶活)，利用小量DNA纯化试剂盒对PCR扩增片段进行纯化回收，再经Not I和EcoR I酶进行双酶切3h后，对其产物进行纯化回收。
3.与载体骨架的连接
带有相同的Not I、EcoR I酶切位点的上述PCR纯化片段和pYES2片段进行体外连接。载体pYES2-CYP5103B5构建如图3。
Figure BSA0000274102290000051
置于金属浴16℃，进行过夜连接，之后化转至Ecoli JM109，涂布于含Ampr(100μg/mL)的LB固体培养基平板上，37℃恒温培养箱倒置培养12h，得到转化子。
4.验证转化子
待平板上长出单菌落后，挑选3个大小均匀适中的单菌落密集划线，继续37℃恒温倒置培养8～12h。提质粒后经Not I、EcoR I双酶切验证正确后，即得到重组表达载体pYES2-CYP5103B5质粒，如图4所示。
实施例2：突变体重组表达载体Y10(S129A/T130A/D131G/T132L/V133I/R134K/S135K)、D131G的构建
1.定点突变技术扩增目的片段：
以质粒pYES2-CYP5103B5作为模板，利用定点突变技术进行聚合酶链式反应，引物由北京六合华大基因科技有限公司进行合成。
Y10-F：CACAGCGGCCGGTTTGATCAAAAAGAAGCTAACGCCAGCACTTC
Y10-R：GCTTCTTTTTGATCAAACCGGCCGCTGTGTGGTGCTCGACTGTT
D131G-F：CCGGTACCGTCAGATCAAAGCTAAC
D131G-R：GGTACCGGTCGATGTGTGGTGCTC
(1)PCR反应体系(25μL)：
Figure BSA0000274102290000052
Figure BSA0000274102290000061
(2)PCR反应条件：
Figure BSA0000274102290000062
按上述PCR扩增程序分别进行定点突变，得到定点突变目标载体片段Y10(S129A/T130A/D131G/T132L/V133I/R134K/S135K)、D131G，取2μL PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳验证条带大小，见图5所示。
2.PCR产物经Dpn I酶消化3h后，在70℃的金属浴中放置20min(灭酶活)。产物经小量纯化试剂盒纯化回收后，将回收产物化转至Ecoli JM109，分别挑取转化子经密集划线后提取质粒，用Not I酶、EcoR I酶进行双酶切，验证正确后，即得到突变体Y10(S129A/T130A/D131G/T132L/V133I/R134K/S135K)、D131G质粒，如图6所示。
实施例3：突变体重组酿酒酵母Y10(S129A/T130A/D131G/T132L/V133I/R134K/S135K)、D131G的构建
1.酵母感受态的制备：
(1)从-70℃超低温冰箱中，取出保存有野生酿酒酵母菌的甘油管，在超净工作台中三区划线到YPD固体培养基上，30℃恒温培养2～3天。
(2)在培养基上挑选一个大小适中的单菌落，用无菌接种环接至50mL的YPD液体培养基中，在30℃的恒温摇床中培养，转速调整为200r/min，24h培养至OD600约为3.0左右。
(3)将培养好的菌液摇匀后，用移液枪吸取1mL～1.5mL菌液，接种至50mL的YPD液体培养基中，并测量记录初始OD600。30℃摇床培养2～4h左右，用紫外分光光度计测量细胞浓度，至OD600约为1.2～1.5左右。
(4)将菌液转移至提前预冷好的无菌50mL离心管中。设置离心机转速为2500r/min，温度设置为4℃，离心5min收集菌体。
(5)在超净工作台中，将上清液倒出，加入30mL 1×TE溶液重悬，2500r/min离心5min收集菌体。
(6)在超净台中倒掉上清液，加入2mL 1×TE/0.5×LiAc混合溶液，轻柔吹吸混匀。分装至提前预冷过的1.5mL离心管中，每支约50μL。储存在-70℃超低温冰箱中。
2.醋酸锂转化法转化酿酒酵母
(1)将10μL鲑鱼精DNA加入到50μL野生酿酒酵母感受态细胞中，混匀后将0.5μg～1μg重组DNA质粒加入并混匀。
(2)用移液枪加入700μL40％PEG 3350/1×LiAc/1×TE混合溶液，轻柔吹吸混匀。
(3)置于30℃水浴中30min。
(4)加入88μL DMSO，轻柔混匀，再放入42℃水浴7min。
(5)14000r/min离心10s，在超净台中倒掉上清液，再加入1mL 1×TE重悬细胞。
(6)14000r/min离心10s，倒掉上层清液(留下大约100μL)，将剩余液体混合均匀，涂布在SC筛选培养基上，在30℃恒温培养箱中培养2～3天，直至长出大小均匀的转化子。
实施例4：突变体重组酿酒酵母Y10(S129A/T130A/D131G/T132L/V133I/R134K/S135K)、D131G底物转化分析
1.突变体Y10(S129A/T130A/D131G/T132L/V133I/R134K/S135K)、D131G TLC底物转化
依次从含Kana抗性的SC平板上挑取突变体Y10(S129A/T130A/D131G/T132L/V133I/R134K/S135K)、D131G的单菌落，转化子密集划线到含有Kana抗性的YPD平板上，放置在30℃的恒温培养箱中静置培养2天后进行发酵。在50mL发酵管中加入3mL的YPD液体培养基，挑取适宜量的菌，于30℃摇床发酵培养24h后，甾体底物孕酮投料量为0.3g/L，再加入半乳糖(浓度2％)进行30℃、200rpm/min摇床发酵培养，72h后取样，萃取上清液，对产物进行定性分析，经TLC检测，突变体Y10(S129A/T130A/D131G/T132L/V133I/R134K/S135K)、D131G转化结果见图7，突变体Y10(S129A/T130A/D131G/T132L/V133I/R134K/S135K)、D131G同基因野生型CYP5103B5相比副产物明显减少。
(2)突变体Y10(S129A/T130A/D131G/T132L/V133I/R134K/S135K)、D131G HPLC底物转化
将上述突变体发酵转化产物进行HPLC高效液相色谱检测，用300μL乙酸乙酯萃取1mL发酵液，吸取100μL上清液至干净的EP管中通风橱晾干，后加200μL流动相液体于晾干的EP管中，混合均匀后制备液相样品，进行HPLC检测，液相条件如下：
流动相A：流动相B＝甲醇∶水＝70％∶30％；
温度：25℃；
流速：1.0mL/min；
进样量：10μL；
检测波长：254nm；
进样时间：22.5min；
检测结果分析：
由液相结果分析可知：突变体重组酿酒酵母Y10(S129A/T130A/D131G/T132L/V133I/R134K/S135K)、D131G转化孕酮生成14α-羟基孕酮的特异性分别为92.83％、93.93％。
上述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，但其并非用以限定本发明。应当指出的是，任何本领域技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，上述各实施方式还可以做出若干改进。因此，本专利的保护范围应以权利要求书所限定的内容为准。
Figure ISA0000274102310000011
Figure ISA0000274102310000021
Figure ISA0000274102310000031
Figure ISA0000274102310000041

Claims (5)

1.C14α-羟化酶基因突变体Y10(S129A/T130A/D131G/T132L/V133I/R134K/S135K)、D131G其特征在于，所述突变体的氨基酸序列是在如SEQ ID NO：1所示的序列基础上进行突变，突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：5所示，其相应的DNA序列分别如SEQID NO：4和SEQ ID NO：6所示。
2.权利要求1所述的C14α-羟化酶基因突变体Y10(S129A/T130A/D131G/T132L/V133I/R134K/S135K)、D131G其特征在于，用于转化甾体孕酮生产14α-羟基孕酮。
3.如权利要求2所述的用途，其特征在于，C14α-羟化酶基因突变体S129A/T130A/D131G/T132L/V133I/R134K/S135K、D131G转化甾体孕酮时羟化特异性提高，副产物明显减少。
4.如权利要求3所述的用途，其特征在于，重组表达载体或重组酿酒酵母宿主菌表达C14α-羟化酶突变体的应用。
5.一种制备C14α-羟基孕酮的方法，其特征在于，利用权利要求4所述的重组酿酒酵母，发酵转化底物孕酮，并从发酵液萃取C14α-羟基孕酮产物。
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