CN112980702B

CN112980702B - 一种高效表达C16β羟化酶的重组菌及其构建方法和应用

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Publication number: CN112980702B
Application number: CN202110301235.4A
Authority: CN
Inventors: 刘晓光; 路福平; 毛淑红; 陈研晞; 曾玉龙
Original assignee: Tianjin University of Science and Technology
Current assignee: Tianjin University of Science and Technology
Priority date: 2021-03-22
Filing date: 2021-03-22
Publication date: 2022-10-11
Anticipated expiration: 2041-03-22
Also published as: CN112980702A

Abstract

本发明涉及一种高效表达C16β羟化酶的重组菌及其构建方法和应用，特别涉及基因工程领域。本发明提供了一种高效表达甾体C16β羟化酶的重组菌的构建方法，包括以下步骤：PCR扩增CYP5061基因左右同源臂，分别克隆到pBluescriptⅡKS(+)中后回收，将回收得到的CYP5061基因左右同源臂分别插入pPZP中，得到重组质粒；将重组质粒电转化至根癌农杆菌中，得到重组根癌农杆菌；将所述重组根癌农杆菌与黑曲霉共培养，得到重组黑曲霉。敲除本发明所述基因得到的菌株转化4‑AD生成16β‑OH‑4AD特异性明显提高。

Description

一种高效表达C16β羟化酶的重组菌及其构建方法和应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域，特别是涉及一种高效表达C16β羟化酶的重组菌及其构建方法和应用。

背景技术

甾体激素类药物对机体起重要调节作用，是临床上必不可少的药物，广泛用于消炎、避孕、治疗心血管疾病、抗肿瘤、人体器官移植、内分泌失调和老年性疾病等。甾体激素类药物主要分为三大类：1)肾上腺皮质激素，如去氧皮质酮、氢化可的松、可的松等，主要用于免疫抑制、抗炎和抗毒素；2)性激素，包括雌激素、孕激素和雄激素三类，主要用于治疗性功能型疾病和避孕等；3)蛋白同化激素，是一种半合成激素类药物，主要通过改造天然来源的雄激素结构，是其激素活性降低，蛋白同化活性提高。如南诺龙、康力龙等，主要用于治疗骨质疏松、血管疾病和发育疾病等。

雄甾-4-烯-3，17-二酮简称雄烯二酮(4-AD)，是生产甾体激素类药物的关键中间体。4-AD在体内可作为雄激素和雌激素的前体，通过代谢生成雌雄激素来维持机体正常运转。同时4-AD可作为起始原料合成几乎可以生产所有肾上腺皮质激素、性激素及蛋白同化激素等甾体激素类药物，如用于治疗心血管疾病的坎利酮、普利酮等都可以通过4-AD生产。

甾体微生物转化是利用微生物代谢产生的酶对甾体底物的特定部位进行的化学结构修饰的反应。微生物转化甾体具有化学合成所没有的区域选择性和立体选择性，被广泛应用于甾体类药物及其关键中间体的生产。在甾体微生物羟化反应中，11α、11β、15α、16α因其能产皮质甾类化合物类似物而应用广泛。但16β羟基化的相关报导仍然较少。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种高效表达C16β羟化酶的重组菌及其构建方法和应用。敲除所述基因后所得菌株能够高效转化4-AD，且特异性明显提高。

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

本发明提供了一种高效表达甾体C16β羟化酶的重组菌的构建方法，包括以下步骤：

(1)PCR扩增CYP5061基因左右同源臂，分别克隆到pBluescriptⅡKS(+)中后回收，将回收得到的CYP5061基因左右同源臂分别插入pPZP中，得到重组质粒；

所述CYP5061基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；所述CYP5061基因的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示；

克隆CYP5061基因的左臂时，利用SacⅠ和KpnⅠ将CYP5061基因左臂克隆到pBluescriptⅡKS(+)中；

克隆CYP5061基因的右臂时，利用XbaⅠ和HindⅢ将CYP5061基因右臂克隆到pBluescriptⅡKS(+)中；

所述CYP5061基因的左臂在pPZP中的插入位点为SacⅠ和KpnⅠ，所述CYP5061基因的右臂在pPZP中的插入位点为XbaⅠ和HindⅢ；

(2)将重组质粒电转化至根癌农杆菌中，得到重组根癌农杆菌；

(3)将所述重组根癌农杆菌与黑曲霉共培养，得到重组黑曲霉。

优选的，扩增CYP5061基因的左同源臂时，所用的引物对包括CYP5061-L-F和CYP5061-L-R；所述CYP5061-L-F核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述CYP5061-L-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

扩增CYP5061基因的右同源臂时，所用的引物对包括CYP5061-R-F和CYP5061-R-R；所述所述CYP5061-R-F核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述CYP5061-R-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

优选的，所述PCR扩增的反应程序包括：95℃预变性5min；95℃变性45s，58℃退火45s，72℃延伸1min，30个循坏；72℃延伸10min。

优选的，扩增CYP5061基因的左同源臂时，所述PCR扩增的反应体系以50μL计，包括DNA模板2μL、CYP5061-L-F 2μL、CYP5061-L-R 2μL、10×Pyrobest BufferⅡ5μL、PyrobestDNA Polymerase 0.5μL和余量的ddH₂O；

扩增CYP5061基因的右同源臂时，所述PCR扩增的反应体系以50μL计，包括DNA模板2μL、CYP5061-R-F 2μL、CYP5061-R-R 2μL、10×Pyrobest BufferⅡ5μL、Pyrobest DNAPolymerase 0.5μL和余量的ddH₂O。

优选的，所述CYP5061-L-F、CYP5061-L-R、CYP5061-R-F和CYP5061-R-R的工作浓度均为10μmol/L。

优选的，所述根癌农杆菌优选为根癌农杆菌AGL-1。

本发明利用上述构建方法构建得到的高效表达甾体C16β羟化酶的重组菌。

本发明利用上述构建方法构建得到的重组菌在高效表达甾体C16β羟化酶和高效表达甾体C16β-OH-4-AD中的应用。

本发明提供了一种高效制备C16β-OH-4-AD的方法，包括以下步骤：

利用上述构建方法构建得到的重组菌发酵转化底物4-AD从发酵液中萃取产物C16β-OH-4-AD。

优选的，所述发酵的温度为28℃，时间为48h。

有益效果：

本发明提供了一种高效表达甾体C16β羟化酶的重组菌的构建方法，包括以下步骤：PCR扩增CYP5061基因左右同源臂，分别克隆到pBluescriptⅡKS(+)中后回收，将回收得到的CYP5061基因左右同源臂分别插入pPZP中，得到重组质粒；将重组质粒电转化至根癌农杆菌中，得到重组根癌农杆菌；将所述重组根癌农杆菌与黑曲霉共培养，得到重组黑曲霉。实验结果表明：本发明利用同源重组敲除了CYP5061基因后得到的菌株表达甾体C16β羟化酶的特异性明显提高。

附图说明

图1为同源重组敲除原理示意图，CYP5061-L为11α羟化酶基因CYP5061左臂，CYP5061-R为11α羟化酶基因CYP5061右臂，A.niger表示黑曲霉ATCC1015基因组示意图，recombinant A.niger表示敲除CYP5061基因后的重组菌基因组示意图；

图2为CYP5061基因同源左右臂PCR扩增电泳图，其中M为DNA Marker，1、2分别为左臂、右臂；

图3为本发明重组质粒pPZP-KOCYP5061酶切验证图，其中M为DNA Marker，(a)中1～3为重组质粒pPZP-KOCYP5061经XhoI单酶切条带，(b)中1～3为重组质粒pPZP-KOCYP5061经BamHI单酶切条带；

图4为本发明农杆菌AGL-1转化子PCR产物电泳图，其中M为DNA Marker，1～6：农杆菌AGL-1转化子PCR结果；

图5为本发明甾体羟化酶基因CYP5061敲除突变株PCR电泳图，其中M为DNAMarker，W为野生黑曲PCR验证结果，2、4为敲除转化子PCR验证结果；

图6为甾体羟化酶基因CYP5061敲除突变株转化4-AD的TLC结果；

图7为甾体羟化酶基因CYP5061敲除突变株转化4-AD的HPLC结果。

具体实施方式

如无特殊要求，本发明所用试剂和菌株均为本领域技术人员常规购买所得。

本发明PCR扩增CYP5061基因左右同源臂，分别克隆到pBluescriptⅡKS(+)中后，将CYP5061基因左右臂分别插入pPZP中，得到重组质粒；所述CYP5061基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示：ATGGCAGTCATCCTTGAGGTCCTCGATAACCAACACCTCTTGCAAGGTGTTGTACTGGCCCTGGTCTTGGTATTTGTTTCCAGTTTCTACCATGAAATAGCAGATAGTTTCCCTTACAAGAATATTCCCCTAGTTGGGAAAGGTAAGTGGGAGATCACAAACACCAAGGCCAAGCACCGATTTGTTACATCTGCAAAGGAGCTCTTCGCCGAGGGTTTCAGTCAGGGTCGGAAAGCGTTCCAGGTCCATTTCTCGGCTAGGCCGACCATCGTCCTTCATCCAAGCCTAACAAACGAGGTCAAGAACAATCCACTTCTTGACTTCAATGAAGCAAACAAGAAGATTCCTGGATTTGAGCCGTTCGATGGATTAGATCATGAGGGCATTTTCCTAGAGGTGATCAACAAAAAAATTACTCAAGGGCTTGGGCAGCTGACCACTCCACTTTCAAGAGAGACTATTGCAGTTTTAAATGAGAAGCTTCCGGACTCGGGGGAATGGCTTCCCTTCACCTTTGCACAGGAGATCCCCCATATCGTAGCTCGCCTGTCCTCTCTCGTGTTTCTGGGAGAGAAGATTTGCCGCGACAAGCAGTGGTTGGACGTTTCCGTCAATTATACCATCCATGCTTTCGTTGCTGCTCGTGACCTCAGACTTTACCCTACGGTTCTCCGTCCTTTTGTCCACTGGTTCTTGTCGTCGACTCGCAGGACCCGGCAAGACATTCGCGTCGCTTCCGCCATTATCAACCGTGAGGTAGAAAAGCGAATACTCATCCGGGAAGGCAAGCTTCCTGAAGAGGACCCTCCAAGGACGCACGCAGACACATTGGACTGGTTTGAAGAGGTTGCTGCGGGTCGGCCGTTAGACCTCGCTGTGGCCCAGGTCGGCCTTTCTCTGGCCGCGATTCACACGACATCTAATCTCCTCACGAATATCATGTACGACTTGACAGCCTACCCAGAGCACATCCAGCCACTGAGAGACGAGATCAAGGCCATCATCAGTGAAGATGGAGGCTTGAAGAAGACCAGCCTGACCAAGATGAAAATGATGGATAGCGTGCTGAAAGAATCCCAGCGAATGCACCCCGCCGGCGTTGCCTTCATCAATCGCGTCGCCATGGGAGATATTACCCTCTCCGATGGCACCCGCATTCCCAAGGGTGCCAGCATAGCAGTTTCGGCGCACAACATGGAAGATGAAAGCCTCTACCCGAACGCGAAGACGTACGATGGCTTCCGATTCTACAAGAAGCGTCAAGAACCCGGCAATGAGCACCGGTTCCAGTTCGTGACAACCAGCCCGGAACATCTCGGCTTCGGACACGGCATGCATGCATGCCCGGGACGCTTTTTCGCCTCGAACGAAGTGAAGATTCTCCTCATCCACTTTCTCATGAGATATGACTGGAAGTTCGCAGATGGCCGCACAACGCGACCGATGAACTTTATGCACGGAACGGAGTCGATTTGCGATCCGACAGTGGAATTCCTGTTCAAGCCCCGACAGCCAGAGGTTGATCTGTCATGA；

所述CYP5061基因的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示：MAVILEVLDNQHLLQGVVLALVLVFVSSFYHEIADSFPYKNIPLVGKGKWEITNTKAKHRFVTSAKELFAEGFSQGRKAFQVHFSARPTIVLHPSLTNEVKNNPLLDFNEANKKIPGFEPFDGLDHEGIFLEVINKKITQGLGQLTTPLSRETIAVLNEKLPDSGEWLPFTFAQEIPHIVARLSSLVFLGEKICRDKQWLDVSVNYTIHAFVAARDLRLYPTVLRPFVHWFLSSTRRTRQDIRVASAIINREVEKRILIREGKLPEEDPPRTHADTLDWFEEVAAGRPLDLAVAQVGLSLAAIHTTSNLLTNIMYDLTAYPEHIQPLRDEIKAIISEDGGLKKTSLTKMKMMDSVLKESQRMHPAGVAFINRVAMGDITLSDGTRIPKGASIAVSAHNMEDESLYPNAKTYDGFRFYKKRQEPGNEHRFQFVTTSPEHLGFGHGMHACPGRFFASNEVKILLIHFLMRYDWKFADGRTTRPMNFMHGTESICDPTVEFLFKPRQPEVDLS*；克隆CYP5061基因的左臂时，利用SacⅠ和KpnⅠ将CYP5061基因左臂克隆到pBluescriptⅡKS(+)中；克隆CYP5061基因的右臂时，利用XbaⅠ和HindⅢ将CYP5061基因右臂克隆到pBluescriptⅡKS(+)中；所述CYP5061基因的左臂在pPZP中的插入位点为SacⅠ和KpnⅠ，所述CYP5061基因的右臂在pPZP中的插入位点为XbaⅠ和HindⅢ。本发明对插入的方式没有任何限定，采用本领域技术人员所熟知的方式即可。

本发明扩增CYP5061基因的左同源臂时，所用的引物对优选包括CYP5061-L-F和CYP5061-L-R；所述CYP5061-L-F核苷酸序列优选如SEQ ID NO.1所示：CGAGCTCTTGGCATAGTCATCGAGAATG；所述CYP5061-L-R的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.2所示：GGGGTACCAATGAAACCCCAGGGAGAC；扩增CYP5061基因的右同源臂时，所用的引物对优选包括CYP5061-R-F和CYP5061-R-R；所述CYP5061-R-F核苷酸序列优选如SEQ ID NO.3所示：GCTCTAGATACCGCACCACACTACTAC；所述CYP5061-R-R的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.4所示：CCCAAGCTTTGT GAGCATTAGTATCTTGTG。

在本发明中，所述PCR扩增的反应程序优选包括：95℃预变性5min；95℃变性45s，58℃退火45s，72℃延伸1min，30个循坏；72℃延伸10min。在本发明中，扩增CYP5061基因的左同源臂时，所述PCR扩增的反应体系以50μL计，优选包括DNA模板2μL、CYP5061-L-F 2μL、CYP5061-L-R 2μL、10×Pyrobest BufferⅡ5μL、Pyrobest DNA Polymerase 0.5μL和余量的ddH₂O；扩增CYP5061基因的右同源臂时，所述PCR扩增的反应体系以50μL计，优选包括DNA模板2μL、CYP5061-R-F 2μL、CYP5061-R-R 2μL、10×Pyrobest BufferⅡ5μL、Pyrobest DNAPolymerase 0.5μL和余量的ddH₂O；所述CYP5061-L-F、CYP5061-L-R、CYP5061-R-F和CYP5061-R-R的工作浓度优选均为10μmol/L。

本发明将重组质粒电转化至根癌农杆菌中，得到重组根癌农杆菌。在本发明中，所述根癌农杆菌优选为根癌农杆菌AGL-1。在本发明中，所述电转化的电容(capatiance)优选为25μF，电压(voltage)优选为1.8kF，电阻(resistance)优选为200Ω，脉冲(pulse)优选为5ms。

本发明将所述重组根癌农杆菌与黑曲霉共培养，得到重组黑曲霉。在本发明具体实施例中所述黑曲霉优选为ATCC1015。在本发明中，共培养时，所述重组根癌农杆菌与黑曲霉的体积比优选为1:1；所述共培养的温度优选为25℃；所述共培养的时间优选为48h。

本发明所述重组菌能够以胞内产酶方式诱导甾体C16β羟化酶，因此所述重组菌能够高效、特异性的表达甾体C16β羟化酶，而且本发明所述重组菌能够高效转化4-AD，进而达到高效制备C16β-OH-4-AD的效果。

本发明所述重组菌能够以胞内产酶方式诱导甾体C16β羟化酶，进而达到够高效、特异性的表达甾体C16β羟化酶的效果，所以本发明所述重组菌能够用于高效表达甾体C16β羟化酶。

本发明提供了上述构建方法构建得到的重组菌在高效表达甾体C16β羟化酶和高效表达甾体C16β-OH-4-AD中的应用。

在本发明中，所述发酵的时间优选为48h～72h，更优选为48h；所述发酵的温度优选为28℃；萃取时，萃取溶剂优选为乙酸乙酯；所述发酵液与乙酸乙酯的体积比优选为1mL：200μL。

在本发明中，所述萃取后，优选还包括对萃取所得萃取液进行离心；所述离心的转速优选为12000rpm；所述离心的时间优选为5min。

为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的一种高效表达C16β羟化酶的重组菌及其构建方法和应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

甾体羟化酶基因CYP5061左右同源臂克隆

1、黑曲霉基因组DNA提取

取1mL黑曲霉ATCC1015孢子悬液(1×10⁶个/mL)接种于装有50mL YPD液体培养基(2％葡萄糖、2％tryptone、1％yeast extract)的250mL摇瓶中，28℃、200rpm摇床培养20h，黑曲霉提基因组具体方法如下：

(1)用4层纱布过滤收集培养好的菌丝体，并用无菌水冲洗三次后拧干备用；

(2)将拧干的新鲜菌丝迅速放入液氮预冷的研钵中，倒入液氮，顺时针快速研磨至菌丝体形成均匀细腻的粉末为止；

(3)将适量研磨好的菌丝体放入1.5mL EP管中，加入800μL丝状真菌裂解液(0.5gSDS，1.4g NaCl，0.73g EDTA，20mL Tris-HCl(pH7.0)定容至100mL后，加入5μLβ-巯基乙醇)和2μLRNase(康为世纪，货号CW0600S)，上下颠倒混匀，静置10min；

(4)12000rpm离心10min，取上清液至新的1.5mL EP管中；

(5)加入3.5μL蛋白酶K(美国Invitrogone，货号QS0512)，使其终浓度为50μg/mL，56℃水浴60min；

(6)加入等体积的酚仿混合液，剧烈摇晃，使其充分混合均匀，1200rpm离心10min，将上清液转移至新的1.5mL EP管中；

(7)重复步操(6)的操作；

(8)加入等体积的氯仿，剧烈摇晃使其充分混匀后，12000rpm离心10min，将上清转移至新的1.5mL EP管中；

(9)加入二倍体积的无水乙醇或等体积的异丙醇，-70℃静置20min，1200rpm离心10min，弃上清；

(10)用700μL 75％乙醇洗涤沉淀，200rpm离心2min，将上清液轻轻的倒出，再离心30s用移液枪吸干上清液；

(11)室温静置15min使离心管中的乙醇完全挥发；

(12)加30μL灭菌的ddH₂O将沉淀完全溶解，65℃灭酶30min，于-20℃保存备用。

2、左右臂引物设计

甾体羟化酶基因CYP5061基因(Gene ID:4984427)序列与黑曲霉CBS513.88中的一段基因序列的同源性为98％，而黑曲霉CBS513.88的全基因组测序已经完成，因此可根据黑曲霉CBS513.88序列的上下游基因组序列来设计左右同源臂的引物。左/右臂设计长度约为1000bp，左右同源臂的引物引物由北京六合华大合成：

CYP5061-L-F：CGAGCTCTTGGCATAGTCATCGAGAATG(SEQ ID NO.1)；

CYP5061-L-R：GGGGTACCAATGAAACCCCAGGGAGAC(SEQ ID NO.2)；

CYP5061-R-F：GCTCTAGATACCGCACCACACTACTAC(SEQ ID NO.3)；

CYP5061-R-R：CCCAAGCTTTGTGAGCATTAGTATCTTGTG(SEQ ID NO.4)；

左右同源臂的引物分别引入酶切位点：SacⅠ、KpnⅠ、XbaⅠ、HindⅢ。

以黑曲霉ATCC1015基因组DNA为模板进行PCR扩增，PCR扩增的反应体系(50μL)，在0.2mL EP管中按以下顺序分别加入表1中的各个试剂。

表1 PCR扩增的反应体系

成分	用量
		ddH<sub>2</sub>O	33.5μL
10×Pyrobest BufferⅡ	5μL
		DNA模板	2μL
10μmol/L上游引物	2μL
		10μmol/L下游引物	2μL
10×Pyrobest BufferⅡ	5μL
		Pyrobest DNA Polymerase(5U/μL)	0.5μL
总体积	50μL

注：扩增CYP5061基因的左同源臂时，所述上游引物为CYP5061-L-F 2μL，所述下游引物为CYP5061-L-R 2μL；扩增CYP5061基因的右同源臂时，所述上游引物为CYP5061-R-F 2μL，所述下游引物为CYP5061-R-R 2μL。

扩增条件为：95℃预变性5min；95℃变性45s，58℃退火45s，72℃延伸1min，30个循坏；72℃延伸10min。

PCR扩增产物经0.8％琼脂糖凝胶电泳，得到1000bp的条带，用小量DNA胶回收试剂盒(普通DNA纯化试剂盒，天根生化科技(北京)有限公司，货号：DP204)回收PCR产物，并进行双酶切和纯化回收，结果如图2所示：得到甾体羟化酶基因CYP5061左右同源臂。

3、同源臂连接至克隆载体并转化

将纯化回收的左、右臂与pBluescriptⅡKS(+)进行连接，连接体系如表2所示。

表2连接体系

成分	用量
		pBluescriptⅡKS(+)	1μL
目的基因	5μL
		T4 DNA ligase	1μL
10×T4 buffer	1μL
		ddH<sub>2</sub>O	至总体积10μL

将连接产物放入22℃金属浴中3h，将上述连接产物转化至E.coliJM109中，阳性克隆重组质粒(分别为CYP5061-L(CYP5061基因的左臂)、CYP5061-R(CYP5061基因的右臂))。

实施例2

敲除载体pPZP-KOCYP5061构建

1、用SacⅠ、KpnⅠ双酶切左臂，用XbaⅠ、HindⅢ双酶切右臂，用KpnⅠ、XbaⅠ双酶切质粒pCSN44获得筛选标记HYg片段，用SacⅠ、XbaⅠ双酶切载体pPZP获得载体骨架。将上述酶切体系进行胶回收，获得目的片段；酶切体系如表3所示。

表3酶切体系

成分	用量
		plasmid	1μL
10×buffer	5μL
		Restriction enzyme1	2μL
Restriction enzyme2	2μL
		ddH<sub>2</sub>O	至总体积10μL

2、37℃反应3h，琼脂糖凝胶电泳检测，胶回收所需片段。

2.1、胶回收

(1)切下目的条带，称量胶块重量，计算溶胶液体积(按照1mg＝1mL计算)；

(2)55℃加热10min，同时间断颠倒混匀，使胶块充分融化；

(3)将溶液转移至吸附柱中，静置2min，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液；

(4)向吸附柱中加入700μL漂洗液，静置2min，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液；

(5)重复步骤(4)；

(6)12000rpm离心2min，尽量除去漂洗液。将吸附柱放入一个干净的EP管中，室温放置10min，彻底晾干；

(7)向吸附膜中间位置悬空滴加30～50μL ddH₂O，室温静置2min，12000rpm离心2min，收集DNA溶液；

(8)取2μL回收产物用琼脂糖凝胶电泳检测。

2.2、4个片段连接体系见表4。

表4链接体系

成分	用量
		pPZP骨架	2μL
HYg抗性片段	2μL
		CYP5061-L	上下游引物各1.5μL
CYP5061-R	上下游引物各1.5μL
		T4DNA ligase	1μL
10×T4 buffer	1μL
		ddH2O	1μL

22℃金属浴中连接3h。

将上述连接产物转化至E.coliJM109，得重组菌(JM109/pPZP-KOCYP5061)，进行阳性克隆重组质粒验证，结果如图3所示，验证敲除载体构建正确。

实施例3

农杆菌介导敲除CYP5061基因

1、敲除载体pPZP-CYP5061转化至根癌农杆菌AGL-1

(1)农杆菌感受态细胞制备

1)取农杆菌甘油管三区划线接种于LB平板上28℃培养至长出单菌落；

2)挑取单菌落接种于5mL LB液体培养基中，28℃，200rpm摇床培养约12h；

3)以2％的接种量将上述菌液接种于50mL LB液体培养基中，28℃，200rpm摇床培养4～6h，至OD600值为0.8；

4)将培养好的菌液冰浴30min后转移至灭菌的50mL离心管中，4℃，5000rpm离心4min，弃上清；

5)用10mL预冷的无菌水重悬菌体，4℃，5000rpm离心4min，弃上清；

6)用20mL预冷的10％甘油重悬菌体，4℃，5000rpm离心4min，弃上清；

7)重复上步操作；

8)用1mL 10％甘油重悬菌体，按90mL/管分装于1.5mLEP管中，于-70℃保存备用。

(2)农杆菌电转化

1)向提前于冰上溶化的农杆菌感受态中加入1μL的重组质粒，用移液枪轻轻混匀；

2)冰浴10min后，将菌液转移至0.1cm点转杯中；

3)将点转杯插入eppendorf电转仪的电转槽中进行电转，电转参数见表5。

表5电转参数

成分	设置
		capatiance	25μF
voltage	1.8kF
		resistance	200Ω
pulse	5ms

4)电转后，向电转杯中加入800μL LB复苏液，于28℃，200rpm复苏3h。随后按复苏液500μL、100μL、20μL、5μL、0.25μL梯度涂布于30μg/mLKan抗性LB(生工生物工程(上海)股份有限公司，货号：B540726-0010)平板上，28℃培养箱培养36～48h。

2、阳性农杆菌转化子验证

(1)挑单菌落于浓度为100mg/mL的LB平板上进行密集划线，于28℃培养箱培养2～3d；

(2)用10μL的枪头沾取菌，在预先加有100μL无菌的ddH₂O轻轻吹吸3次；

(3)菌悬液在开水中煮沸2min，得菌液；

(4)将步骤(3)所得菌液作为模板，进行菌落PCR验证(克隆扩增标记基因hygB)，结果如图(4)所示，得到1.6kb大小的条带；

(5)将正确的转化子保菌备用。

3、农杆菌介导黑曲霉转化

(1)将电转化导入质粒的农杆菌AGL1在LB平板上三区划线，于28℃培养箱培养2d，同时将黑曲霉ATCC1015孢子甘油管于PDA试管斜面划线，于28℃培养箱培养3～4d；

(2)农杆菌长出单菌落后，接种于5mL LB液体培养基中，于28℃摇床，200rpm培养24h；

(3)取250μL培养好的农杆菌于装有50mL LB液体培养基的250mL摇瓶中，28℃摇床200rpm培养8～10h，直至OD₆₀₀值为0.8；

(4)取15mL菌液于50mL离心管内，5000rpm离心10min，弃上清；

(5)用5mL IM液体培养基重悬菌体，5000rpm离心10min，弃上清；

(6)用15mL IM液体培养基重选菌体，于28℃，200rpm诱导培养5h；

(7)农杆菌诱导期间，收集黑曲霉ATCC1015孢子，调整孢子悬液为10⁷个/mL备用；

(8)将诱导好的农杆菌于黑曲霉孢子悬液按体积比1：1混合均匀，取0.5mL涂布于铺有转移膜的IM平板上，25℃共培养48h，其中转移膜材质为孔径0.45μm的混合纤维素膜；

(9)将转移膜揭下置于培养皿盖上，用1mL生理盐水将菌丝洗下，并用涂布器打碎涂布于CM平板上(含有Amp、Kan、Cefo、HygB(北京索莱宝科技有限公司，货号：Amp:C8252-1g、Cefo:C8240-5g、HygB:H8080-10ml(1g)；Kan厂家：生工生物工程(上海)股份有限公司，货号：B540726-0010；浓度：Amp:100μg/mL、Cefo:50μg/mL、HygB:300μg/mL、Kan:50μg/mL))初筛。

4、黑曲霉阳性转化子验证

(1)待步骤(9)中长出单菌落，在其产孢前，挑取菌丝于300μg/mL HygB抗性的PDA试管斜面进行复筛，于28℃培养箱培养2～3d；

(2)待试管中转化子产孢后，用生理盐水将孢子洗下并保菌，余下孢子悬液接种于PDA液体培养基，培养菌丝，提取基因组进行PCR验证。

实施例4

黑曲霉敲除突变株验证

1、设计敲除验证引物进行PCR扩增验证

以黑曲霉转化子的基因组DNA为模板，以KO-F、KO-R为引物进行PCR验证，将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳。验证引物如下：

KO-F:5’-CAAAGCAAGTAGCGAGTAGC-3’(SEQ ID NO.5)；

KO-R:5’-GTTCCTGTCTGCTAATAAGAG-3’(SEQ ID NO.6)；

引物为北京六合华大合成。

PCR反应体系(10μL)，在0.2mL EP管中按照表6进行添加。

表6 PCR反应体系

成分	用量
		ddH<sub>2</sub>O	3μL
ES Taq	5μL
		基因组模板	1μL
上下游引物(10μmol/L)	各0.5μL

PCR反应条件为94℃预变性5min；94℃变性30s，56℃退火45s，72℃延伸1min反应30个循坏；72℃延伸10min。

PCR扩增产物经0.8％琼脂糖凝胶电泳。

本实施例以KO-F、KO-R为引物敲除黑曲霉中CYP5061基因后，进行PCR扩增，对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳。结果如图5所示：野生型不能扩增出条带，扩增出1.6kb大小的条带的转化子为敲除突变株图。

2、敲除转化子底物转化验证

将PCR验证正确的ΔCYP5061的孢子悬液及黑曲霉ATCC1015的孢子悬液，调整孢子浓度到1×10⁸个/mL后，分别接种100μL孢子悬液接种于50mL YPD液体培养基(2％葡萄糖、2％tyrptone、1％yeast extract，即2g葡萄糖、2g tyrptone、1g yeast extract、100mL水)中，28℃培养24h，得到重组菌发酵培养基和黑曲霉野生型菌株发酵培养基。称取0.03g 4-AD底物完全溶解于600μL无水乙醇后，加入50mL重组菌发酵培养基中28℃，200rpm摇床发酵48h；称取0.03g 4-AD底物完全溶解于600μL无水乙醇后，加入50mL黑曲霉ATCC1015发酵培养基中28℃，200rpm摇床发酵48h。

取样：分别取1mL底物发酵液于1.5mL EP管，加入200μL乙酸乙酯，剧烈震荡萃取，使其与发酵液充分混合，12000rpm离心5min分层。用内径为0.3mm的毛细管(长10cm)吸取2～4mm上层乙酸乙酯层点样于硅胶层析板上。在距离层析板边缘1cm处点样，样点间距0.7cm

TLC检测：将点有样品的硅胶板放入层析杠中展开，加盖，密封，待展开剂(氯仿：丙酮：乙酸乙酯＝5.5：3.5：1)前沿到顶端时，取出硅胶板，烘干，采用紫外检测仪观察层析斑点大小。

检测结果如图6所示：经过TLC定性分析后，发现与黑曲霉ATCC1015相比，重组菌株(即敲除CYP5061基因后得到的菌株)副产物明显减少，即特异性明显提高。

HPLC检测：取萃取发酵产物上清液100μL烘干，加800μL超声混合均匀的流动相液体，混合均匀后制备液相样品，进行HPLC检测，液相条件为流动相A：流动相B＝乙腈：水＝80％：20％；温度：30℃；流速：1.0mL/min；进样量：10μL；检测波长：254nm；进样时间：10min。检测结果如图7所示：经过HPLC进一步证明，重组菌株(即敲除CYP5061基因后得到的菌株)与黑曲霉ATCC1015相比，RT＝8.157和RT＝8.156处吸收峰面积明显减小甚至消失，表明敲除CYP5061基因后，重组菌株特异性明显增加，能更高效转化4-AD为C16β-OH-4-AD。

虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可以做各种改动和修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

序列表

<110> 天津科技大学

<120> 一种高效表达C16β羟化酶的重组菌及其构建方法和应用

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cgagctcttg gcatagtcat cgagaatg 28

<210> 2

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ggggtaccaa tgaaacccca gggagac 27

<210> 3

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gctctagata ccgcaccaca ctactac 27

<210> 4

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cccaagcttt gtgagcatta gtatcttgtg 30

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

caaagcaagt agcgagtagc 20

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gttcctgtct gctaataaga g 21

<210> 7

<211> 1533

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

atggcagtca tccttgaggt cctcgataac caacacctct tgcaaggtgt tgtactggcc 60

ctggtcttgg tatttgtttc cagtttctac catgaaatag cagatagttt cccttacaag 120

aatattcccc tagttgggaa aggtaagtgg gagatcacaa acaccaaggc caagcaccga 180

tttgttacat ctgcaaagga gctcttcgcc gagggtttca gtcagggtcg gaaagcgttc 240

caggtccatt tctcggctag gccgaccatc gtccttcatc caagcctaac aaacgaggtc 300

aagaacaatc cacttcttga cttcaatgaa gcaaacaaga agattcctgg atttgagccg 360

ttcgatggat tagatcatga gggcattttc ctagaggtga tcaacaaaaa aattactcaa 420

gggcttgggc agctgaccac tccactttca agagagacta ttgcagtttt aaatgagaag 480

cttccggact cgggggaatg gcttcccttc acctttgcac aggagatccc ccatatcgta 540

gctcgcctgt cctctctcgt gtttctggga gagaagattt gccgcgacaa gcagtggttg 600

gacgtttccg tcaattatac catccatgct ttcgttgctg ctcgtgacct cagactttac 660

cctacggttc tccgtccttt tgtccactgg ttcttgtcgt cgactcgcag gacccggcaa 720

gacattcgcg tcgcttccgc cattatcaac cgtgaggtag aaaagcgaat actcatccgg 780

gaaggcaagc ttcctgaaga ggaccctcca aggacgcacg cagacacatt ggactggttt 840

gaagaggttg ctgcgggtcg gccgttagac ctcgctgtgg cccaggtcgg cctttctctg 900

gccgcgattc acacgacatc taatctcctc acgaatatca tgtacgactt gacagcctac 960

ccagagcaca tccagccact gagagacgag atcaaggcca tcatcagtga agatggaggc 1020

ttgaagaaga ccagcctgac caagatgaaa atgatggata gcgtgctgaa agaatcccag 1080

cgaatgcacc ccgccggcgt tgccttcatc aatcgcgtcg ccatgggaga tattaccctc 1140

tccgatggca cccgcattcc caagggtgcc agcatagcag tttcggcgca caacatggaa 1200

gatgaaagcc tctacccgaa cgcgaagacg tacgatggct tccgattcta caagaagcgt 1260

caagaacccg gcaatgagca ccggttccag ttcgtgacaa ccagcccgga acatctcggc 1320

ttcggacacg gcatgcatgc atgcccggga cgctttttcg cctcgaacga agtgaagatt 1380

ctcctcatcc actttctcat gagatatgac tggaagttcg cagatggccg cacaacgcga 1440

ccgatgaact ttatgcacgg aacggagtcg atttgcgatc cgacagtgga attcctgttc 1500

aagccccgac agccagaggt tgatctgtca tga 1533

<210> 8

<211> 510

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

Met Ala Val Ile Leu Glu Val Leu Asp Asn Gln His Leu Leu Gln Gly

1 5 10 15

Val Val Leu Ala Leu Val Leu Val Phe Val Ser Ser Phe Tyr His Glu

20 25 30

Ile Ala Asp Ser Phe Pro Tyr Lys Asn Ile Pro Leu Val Gly Lys Gly

35 40 45

Lys Trp Glu Ile Thr Asn Thr Lys Ala Lys His Arg Phe Val Thr Ser

50 55 60

Ala Lys Glu Leu Phe Ala Glu Gly Phe Ser Gln Gly Arg Lys Ala Phe

65 70 75 80

Gln Val His Phe Ser Ala Arg Pro Thr Ile Val Leu His Pro Ser Leu

85 90 95

Thr Asn Glu Val Lys Asn Asn Pro Leu Leu Asp Phe Asn Glu Ala Asn

100 105 110

Lys Lys Ile Pro Gly Phe Glu Pro Phe Asp Gly Leu Asp His Glu Gly

115 120 125

Ile Phe Leu Glu Val Ile Asn Lys Lys Ile Thr Gln Gly Leu Gly Gln

130 135 140

Leu Thr Thr Pro Leu Ser Arg Glu Thr Ile Ala Val Leu Asn Glu Lys

145 150 155 160

Leu Pro Asp Ser Gly Glu Trp Leu Pro Phe Thr Phe Ala Gln Glu Ile

165 170 175

Pro His Ile Val Ala Arg Leu Ser Ser Leu Val Phe Leu Gly Glu Lys

180 185 190

Ile Cys Arg Asp Lys Gln Trp Leu Asp Val Ser Val Asn Tyr Thr Ile

195 200 205

His Ala Phe Val Ala Ala Arg Asp Leu Arg Leu Tyr Pro Thr Val Leu

210 215 220

Arg Pro Phe Val His Trp Phe Leu Ser Ser Thr Arg Arg Thr Arg Gln

225 230 235 240

Asp Ile Arg Val Ala Ser Ala Ile Ile Asn Arg Glu Val Glu Lys Arg

245 250 255

Ile Leu Ile Arg Glu Gly Lys Leu Pro Glu Glu Asp Pro Pro Arg Thr

260 265 270

His Ala Asp Thr Leu Asp Trp Phe Glu Glu Val Ala Ala Gly Arg Pro

275 280 285

Leu Asp Leu Ala Val Ala Gln Val Gly Leu Ser Leu Ala Ala Ile His

290 295 300

Thr Thr Ser Asn Leu Leu Thr Asn Ile Met Tyr Asp Leu Thr Ala Tyr

305 310 315 320

Pro Glu His Ile Gln Pro Leu Arg Asp Glu Ile Lys Ala Ile Ile Ser

325 330 335

Glu Asp Gly Gly Leu Lys Lys Thr Ser Leu Thr Lys Met Lys Met Met

340 345 350

Asp Ser Val Leu Lys Glu Ser Gln Arg Met His Pro Ala Gly Val Ala

355 360 365

Phe Ile Asn Arg Val Ala Met Gly Asp Ile Thr Leu Ser Asp Gly Thr

370 375 380

Arg Ile Pro Lys Gly Ala Ser Ile Ala Val Ser Ala His Asn Met Glu

385 390 395 400

Asp Glu Ser Leu Tyr Pro Asn Ala Lys Thr Tyr Asp Gly Phe Arg Phe

405 410 415

Tyr Lys Lys Arg Gln Glu Pro Gly Asn Glu His Arg Phe Gln Phe Val

420 425 430

Thr Thr Ser Pro Glu His Leu Gly Phe Gly His Gly Met His Ala Cys

435 440 445

Pro Gly Arg Phe Phe Ala Ser Asn Glu Val Lys Ile Leu Leu Ile His

450 455 460

Phe Leu Met Arg Tyr Asp Trp Lys Phe Ala Asp Gly Arg Thr Thr Arg

465 470 475 480

Pro Met Asn Phe Met His Gly Thr Glu Ser Ile Cys Asp Pro Thr Val

485 490 495

Glu Phe Leu Phe Lys Pro Arg Gln Pro Glu Val Asp Leu Ser

500 505 510

Claims

1.一种表达甾体C16β羟化酶的重组菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述构建方法，其特征在于，扩增CYP5061基因的左同源臂时，所用的引物对包括CYP5061-L-F和CYP5061-L-R；所述CYP5061-L-F核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述CYP5061-L-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

扩增CYP5061基因的右同源臂时，所用的引物对包括CYP5061-R-F和CYP5061-R-R；所述所述CYP5061-R-F核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述CYP5061-R-R的核苷酸序列如SEQID NO.4所示。

3.根据权利要求2所述构建方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应程序包括：95℃预变性5min；95℃变性45s，58℃退火45s，72℃延伸1min，30个循坏；72℃延伸10min。

4.根据权利要求3所述构建方法，其特征在于，扩增CYP5061基因的左同源臂时，所述PCR扩增的反应体系以50μL计，包括DNA模板2μL、CYP5061-L-F2μL、CYP5061-L-R 2μL、10×Pyrobest BufferⅡ5μL、Pyrobest DNA Polymerase 0.5μL和余量的ddH₂O；

5.根据权利要求4所述构建方法，其特征在于，所述CYP5061-L-F、CYP5061-L-R、CYP5061-R-F和CYP5061-R-R的工作浓度均为10μmol/L。

6.根据权利要求1所述构建方法，其特征在于，所述根癌农杆菌优选为根癌农杆菌AGL-1。

7.利用权利要求1～6任一项所述构建方法构建得到的重组菌在表达甾体C16β羟化酶和表达甾体C16β-OH-4-AD中的应用。

8.一种制备C16β-OH-4-AD的方法，其特征在于，包括以下步骤：

利用权利要求1～6任一项所述构建方法构建得到的重组菌发酵转化底物4-AD从发酵液中萃取产物C16β-OH-4-AD。

9.根据权利要求8所述方法，其特征在于，所述发酵的温度为28℃，时间为48h。