BR112014023176B1

BR112014023176B1 - Métodos de produção de uma proteína recombinante

Info

Publication number: BR112014023176B1
Application number: BR112014023176-1A
Authority: BR
Inventors: Michael W. Laird; Bradley R. Snedecor; Deepa Nadarajah; Jane V. Gunson; Kim Kaleas; Rachel Adams; Richard St. John
Original assignee: Genentech, Inc.
Priority date: 2012-03-27
Filing date: 2013-03-14
Publication date: 2021-09-28
Also published as: HRP20171966T1; US20180291411A1; AR116615A2; SI2831261T1; CA3086730A1; KR102096678B1; US9765379B2; AU2013240280A1; ES2654424T3; WO2013148249A1; SG10202007206WA; IL234377B; AU2017202484A1; ZA201406434B; MX2014011558A; MX2019007032A; MX365947B; JP2015512259A; AU2019226192A1; CN104350156A

Abstract

métodos de produção de uma proteína recombinante. trata-se de métodos de produção de uma proteína recombinante que compreende fermentar uma célula hospedeira procariótica em que a dita célula hospedeira procariótica foi transformada com um ácido nucleico que codifica a dita proteína recombinante, colher a dita proteína recombinante sob condições em que níveis de do2 são maiores do que 0%, purificar a dita proteína recombinante a um volume filtrado, em que o dito volume filtrado não contém aduto de proteína recombinante dhna detectável, conforme mensurado por um ensaio de iec a 310 nm. ademais, o método de produção de uma proteína recombinante que compreende fermentar uma célula hospedeira procariótica deletada de gene mene em que a dita célula hospedeira procariótica foi transformada com um ácido nucleico que codifica a dita proteína recombinante, colher a dita proteína recombinante, purificar a dita proteína recombinante a um volume filtrado, em que o dito volume filtrado não contém aduto de proteína recombinante dhna detectável, conforme mensurado por um ensaio de iec a 310 nm, em que o rendimento de proteína recombinante é aumentado em cerca de 20% ou mais é contemplado.

Description

REFERÊNCIA CRUZADA AOS PEDIDOS RELACIONADOS

[001] Este pedido reivindica o benefício de prioridade do pedido provisório de n° U.S. 61/616.297 depositado em 27 de março de 2012, que é incorporado a este documento a título de referência em sua integridade.

CAMPO DA INVENÇÃO

[002] A invenção se refere a métodos aprimorados para cultivar proteínas recombinantes em células hospedeiras procarióticas.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[003] A purificação econômica em grande escala de proteínas é exigida para produtos viáveis de biotecnologia. Em geral, proteínas são produzidas por cultura celular, com o uso de linhagens celulares tanto mamíferas como bacterianas manipuladas para produzir a proteína de interesse inserindo-se de um plasmídeo recombinante que contém o gene para essa proteína. Visto que as linhagens celulares usadas são organismos vivos, as mesmas precisam ser alimentadas com um meio de cultivo complexo que contém geralmente uma mistura de sais, açúcares, aminoácidos, vitaminas, oligoelementos e peptonas. A separação da proteína desejada da mistura de componentes alimentados às células e dos subprodutos das próprias células a uma pureza suficiente para uso como um produto terapêutico humano propõe um desafio formidável.

[004] Proteínas terapêuticas recombinantes são comumente produzidas em diversas linhagens de célula hospedeira que inclui células hospedeiras de mamíferos, tais como, por exemplo, células murina myeloma NS0 e Ovário de Hamster Chinês (CHO) (Anderson, D. C e Krummen, L. (2002) Curr. Opin. Biotech. 13: 117 a 123; Chu, L. E Robinson, D. K. (2001) Curr. Opin. Biotechnol. 12: 180 a 187) e células hospedeiras bacterianas que incluem Escherichia coli (E. Coli). Cada linhagem celular tem vantagens e desvantagens em termos de produtividade e as características das proteínas produzidas das células. Escherichia coli foi a mais extensivamente usada para a produção em larga escala de proteínas terapêuticas, que não exigem glicosilação complexa para bioatividade. Proteínas heterólogas expressas por E. Coli pode acumular como produto solúvel ou agregados insolúveis. Em geral, para isolar as proteínas, as células podem ser submetidas a tratamentos para extração periplásmica ou serem lisadas para liberar produtos intracelulares que são de outro modo inacessível. Avanços nos conjuntos de procedimentos de fermentação e cultura celular aumentaram amplamente os títulos de proteínas recombinantes almejadas.

[005] Escolhas de linhagens celulares de produção comercial frequentemente equilibram a necessidade de alta produtividade com a capacidade de entregar os atributos de qualidade de produto exigidos de um dado produto. Sob procedimentos de fermentação cGMP, a qualidade é construída no processo inteiro garantindo que exigências de agências de regulamentação sejam cumpridas em termos de segurança, identidade de produto, qualidade e pureza. No entanto, ocasionalmente aparecem problemas nos quais um dado produto não cumpre suas especificações. O desafio é desenvolver um processo robusto no qual para identificar e isolar o problema, então mitigar o problema de modo que os controles de processo possam ser mantidos dentro de faixas de parâmetro estabelecidas, e assegurar o processo de forma consistente produz um produto que cumpre as especificações de produto. Há uma necessidade na técnica de mitigar ou eliminar a incidência de produtos que não cumprem as especificações.

DESCRIÇÃO RESUMIDA DA INVENÇÃO

[006] A presente invenção contempla um método de produção de uma proteína recombinante que compreende (a) fermentar uma célula hospedeira procariótica em que a dita célula hospedeira procariótica foi transformada com um ácido nucleico que codifica a dita proteína recombinante, e (b) colher (harvesting) a dita proteína recombinante sob condições em que os níveis de oxigênio dissolvido (dO2) são maiores do que 0%, e (c) purificar a dita proteína recombinante a um volume filtrado (filtered bulk) para armazenamento (FBS), em que o dito volume filtrado não contém aduto de proteína recombinante 1,4-diidroxi-2-naftoato (DHNA) detectável, conforme mensurado por um ensaio de cromatografia de troca iônica (IEC) a 310 nm. Em uma realização, no método descrito acima, o ensaio analítico é por HPLC, RP HPLC, HIC HPLC, NMR, espectrometria de massa, ou espectrometria de UV.

[007] A presente invenção contempla um método de produção de uma proteína recombinante que compreende (a) fermentar uma célula hospedeira procariótica em que a dita célula hospedeira procariótica foi transformada com um ácido nucleico que codifica a dita proteína recombinante, e (b) colher a dita proteína recombinante sob condições em que níveis de dO2 são maiores do que 0%, e (c) purificar a dita proteína recombinante a um FBS, em que o dito volume filtrado não contém aduto de proteína recombinante DHNA detectável, conforme mensurado por um ensaio de IEC a 310 nm, em que a dita proteína recombinante é um polipeptídio recombinante ou um anticorpo isolado.

[008] A presente invenção contempla um método de produção de uma proteína recombinante que compreende (a) fermentar uma célula hospedeira procariótica em que a dita célula hospedeira procariótica foi transformada com um ácido nucleico que codifica a dita proteína recombinante, e (b) colher a dita proteína recombinante sob condições em que níveis de dO2 são maiores do que 0%, e (c) purificar a dita proteína recombinante a um FBS, em que o dito volume filtrado não contém aduto de proteína recombinante DHNA detectável, conforme mensurado por um ensaio de IEC a 310 nm, em que a fermentação é independente de escala.

[009] A presente invenção contempla um método de produção de uma proteína recombinante que compreende (a) fermentar uma célula hospedeira procariótica em que a dita célula hospedeira procariótica foi transformada com um ácido nucleico que codifica a dita proteína recombinante, e (b) colher a dita proteína recombinante sob condições em que níveis de dO2 são maiores do que 0%, e (c) purificar a dita proteína recombinante a um FBS, em que o dito volume filtrado não contém aduto de proteína recombinante DHNA detectável, conforme mensurado por um ensaio de IEC a 310 nm, em que a dita célula hospedeira procariótica é Escherichia coli (E. Coli), Enterobacter, Azotobacter, Erwinia, Bacillus, Pseudomonas, Klebsiella, Proteus, Salmonella, Serratia, Shigella, Rhizobia, Vitreoscilla, e Paracoccus.

[010] A presente invenção contempla um método de produção de uma proteína recombinante que compreende (a) fermentar uma célula hospedeira procariótica em que a dita célula hospedeira procariótica foi transformada com um ácido nucleico que codifica a dita proteína recombinante, e (b) colher a dita proteína recombinante sob condições em que níveis de dO2 são maiores do que 0%, e (c) purificar a dita proteína recombinante a um FBS, em que o dito volume filtrado não contém aduto de proteína recombinante DHNA detectável, conforme mensurado por um ensaio de IEC a 310 nm, em que o dito dO2 é mantido em níveis maiores do que 0% continuamente durante toda a operação de colheita da etapa (b). Em uma realização no método descrito acima, as operações de colheita compreendem um estágio de homogeneização. Em outra realização, o dO2 é mantido em cerca de 30% a cerca de 75% antes da homogeneização. Em ainda outra realização, o dO2 é mantido em níveis maiores do que 75% antes da homogeneização. Em ainda outra realização, o dO2 é mantido em cerca de 50%>após a homogeneização. Em outra realização, o dO2 é mantido em níveis maiores do que 50%>após a homogeneização. Em uma realização, o dO2 é mantido por um período maior ou igual a 1,5 horas. Em ainda outra realização, o dO2 é mantido por um período maior ou igual a 2 horas.

[011] A presente invenção contempla um método de produção de uma proteína recombinante que compreende (a) fermentar uma célula hospedeira procariótica em que a dita célula hospedeira procariótica foi transformada com um ácido nucleico que codifica a dita proteína recombinante, e (b) colher a dita proteína recombinante sob condições em que níveis de dO2 são maiores do que 0%>, e (c) purificar a dita proteína recombinante a um FBS, em que o dito volume filtrado não contém aduto de proteína recombinante DHNA detectável, conforme mensurado por um ensaio de IEC a 310 nm, em que o dO2 é mantido com ar de sobreposição ou borrifado, com contrapressão aumentada, ou com agitação (isto é sacudimento). Em uma realização, o ar de sobreposição é de cerca de 0,4 vvm a cerca de 0,8 vvm. Em outra realização, o ar de sobreposição é almejado em 0,6 vvm. Em outra realização, a contrapressão aumentada está entre cerca de 6,8 a cerca de 206,8 Kpa (1,0 a cerca de 30 psi). Em uma realização, a contrapressão aumentada é almejada em 131,01 Kpa (19 psi). Em ainda outra realização, a taxa de agitação é de cerca de 6 Watts/L a cerca de 8 Watts/L. Em ainda outra realização, a taxa de agitação é de pelo menos 6 Watts/L. Em outra realização, a taxa de agitação é almejada em 6 Watts/L.

[012] Em outro aspecto da presente invenção, um método de produção de uma proteína recombinante que compreende (a) fermentar uma célula hospedeira procariótica deletada de gene menE em que a dita célula hospedeira procariótica foi transformada com um ácido nucleico que codifica a dita proteína recombinante, (b) colher a dita proteína recombinante; e (c) purificar a dita proteína recombinante a um FBS, em que o dito volume filtrado não contém aduto de proteína recombinante DHNA detectável, conforme mensurado por um ensaio de IEC a 310 nm, é contemplado. Conforme uma realização adicional ao método descrito acima, o rendimento de proteína recombinante é aumentado em cerca de 20%> ou mais, em cerca de 30%> ou mais, em cerca de 40%> ou mais, em cerca de 50%> ou mais, em cerca de 60%> ou mais, conforme comparado ao rendimento com o uso de uma célula hospedeira procariótica controle.

[013] Em outro aspecto da presente invenção, um método de produção de uma proteína recombinante que compreende (a) fermentar uma célula hospedeira procariótica deletada de gene menE em que a dita célula hospedeira procariótica foi transformada com um ácido nucleico que codifica a dita proteína recombinante, (b) colher a dita proteína recombinante; e (c) purificar a dita proteína recombinante a um FBS, em que o dito volume filtrado não contém aduto de proteína recombinante DHNA detectável, conforme mensurado por um ensaio de IEC a 310 nm, é contemplado, em que o rendimento de proteína recombinante é aumentado em cerca de 20%> ou mais, em cerca de 30%> ou mais, em cerca de 40%> ou mais, em cerca de 50%> ou mais, em cerca de 60%> ou mais, conforme comparado ao rendimento com o uso de uma célula hospedeira procariótica controle, em que a fermentação é independente de escala.

[014] Em outro aspecto da presente invenção, um método de produção de uma proteína recombinante que compreende (a) fermentar uma célula hospedeira procariótica deletada de gene menE em que a dita célula hospedeira procariótica foi transformada com um ácido nucleico que codifica a dita proteína recombinante, (b) colher a dita proteína recombinante; e (c) purificar a dita proteína recombinante a um FBS, em que o dito volume filtrado não contém aduto de proteína recombinante DHNA detectável, conforme mensurado por um ensaio de IEC a 310 nm, é contemplado, em que o rendimento de proteína recombinante é aumentado em cerca de 20% ou mais, em cerca de 30% ou mais, em cerca de 40% ou mais, em cerca de 50% ou mais, em cerca de 60%> ou mais, conforme comparado ao rendimento com o uso de uma célula hospedeira procariótica controle, em que a dita proteína recombinante é um polipeptídio recombinante ou um anticorpo isolado.

[015] Em outro aspecto da presente invenção, um método de produção de uma proteína recombinante que compreende (a) fermentar uma célula hospedeira procariótica deletada de gene menE em que a dita célula hospedeira procariótica foi transformada com um ácido nucleico que codifica a dita proteína recombinante, (b) colher a dita proteína recombinante; e (c) purificar a dita proteína recombinante a um FBS, em que o dito volume filtrado não contém aduto de proteína recombinante DHNA detectável, conforme mensurado por um ensaio de IEC a 310 nm, é contemplado, em que o rendimento de proteína recombinante é aumentado em cerca de 20% ou mais, em cerca de 30% ou mais, em cerca de 40% ou mais, em cerca de 50% ou mais, em cerca de 60% ou mais, conforme comparado ao rendimento com o uso de uma célula hospedeira procariótica controle, em que a dita célula hospedeira procariótica é Escherichia coli (E. Coli), Enterobacter, Azotobacter, Erwinia, Bacillus, Pseudomonas, Klebsiella, Proteus, Salmonella, Serratia, Shigella, Rhizobia, Vitreoscilla, e Paracoccus.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[016] A Figura 1 mostra os resultados de ensaio de COC de três execuções de fabricação de um produto no qual duas Execuções, Execução 2 e Execução 3, não cumpriram os resultados esperados para o ensaio de COC. PW = água purificada, C = controle de execução de desenvolvimento, 1 = Execução 1, 2 = Execução 2, e 3 = Execução 3.

[017] A Figura 2A mostra os espectros de UV/vis (10 cm) para as Execuções 1 a 3 - próximas a UV, em que as Execuções 1 a 3 são representadas. Novos picos de absorbância foram observados aproximadamente a 320 nm e a 460 nm que não foram evidentes para a Execução 1. A Figura 2B mostra os Espectros de UV/vis para a Execução 3 menos Execução 1, na qual a diferença dos picos de absorbância para as Execuções 2 e 3 pode ser distinguida da Execução 1.

[018] A Figura 3 mostra um ensaio de IEC monitorado a 310 nm para as Execuções 1 a 3. Um ligeiro pico secundário atrás do pico principal foi observado para as Execuções 2 e 3, enquanto o perfil para a Execução 1 foi comparável ao Material de Referência.

[019] A Figura 4 mostra uma análise 2D LC-MS das Execuções 1 a 3 intactas, monitoradas a 280 nm e 310 nm. Uma massa esperada foi observada para a Execução 1, enquanto a massa esperada e uma massa adicional a 157 Da foram observadas para as Execuções 2 e 3.

[020] A Figura 5 mostra um 2D-LC MS e identificação de massa por mapa de peptídeo tríptico com detecção de MS de uma fração coletada do aduto marrom - um pico menor do ensaio de IEC foi coletado. A partir da análise 2D LC-MS, adicionalmente à massa esperada, uma massa de +156 Da foi observada para o pico secundário fracionado.

[021] A Figura 6 mostra a análise de LC-MS-MS do pico de aduto marrom inovador observado em 48,8 minutos a 310 nm foi determinado a ser o peptídeo T20 com Cysl 82 modificado com +154,006 Da. Peptídeos T6 e T16 modificados (em cistina, +154,006 Da) e livres também foram detectados por extração de massa.

[022] A Figura 7 compara os dados 1H-15N HSQC de produto a um peptídeo sintético (NH2-IVQCR-COOH) e mostrou que uma correlação Cys NH estava ausente na amostra de produto.

[023] A Figura 8 mostra a estrutura proposta confirmada por forte nOe observado entre o CH de Cys e o NH de arginina.

[024] Com base nos dados de NMR coletados, a estrutura proposta do aduto marrom é apresentada na Figura 9.

[025] A Figura 10 mostra a via de biossíntese em células procarióticas para produzir menaquinonas.

[026] A Figura 11 mostra um produto de filtrado recombinante de volume representativo testado para a formação de aduto marrom por cromatografia de troca iônica a 310 nm e não mostrou formação de aduto mensurável.

[027] A Figura 12 mostra um esquema exemplificador das intensificações de processo de Hi-dO implantadas em torno das operações de colheita.

DESCRIÇÃO DETALHADA DAS REALIZAÇÕES DA INVENÇÃO I. DEFINIÇÕES

[028] A menos que declarado de outro modo, os termos e frases a seguir conforme usado no presente documento são destinados a ter os seguintes significados:

[029] O termo "taxa de agitação" é a mistura do caldo de cultura ou do homogeneizado, que é tipicamente mensurado como revoluções por minuto (rpm). Em uma realização, a taxa de agitação pode ser medida por uma "potência por volume de unidade". Por exemplo, a 200 rpm em um fermentador de 1.000 litros, a taxa de agitação tem um valor de aproximadamente 6 Watts/L.

[030] O termo "anticorpo" no presente documento é usado no sentido mais amplo e cobre especificamente anticorpos monoclonais, anticorpos policlonais, anticorpos multiespecíficos (por exemplo, anticorpos biespecíficos), e fragmentos de anticorpo, enquanto os mesmos exibem a atividade biológica desejada. Os anticorpos pode ser murinos, humanos, humanizados, quiméricos, ou derivados de outras espécies. O termo "anticorpo," conforme usado no presente documento, também se refere a uma molécula de imunoglobulina de comprimento total ou um porção imunologicamente ativa de uma molécula de imunoglobulina de comprimento total, isto é, uma molécula que contém um sítio de ligação de antígeno que liga imunoespecificamente um antígeno de um alvo de interesse ou parte do mesmo, sendo que tais alvos incluem, porém, sem limitação, célula cancerígena ou células que produzem anticorpos autoimunes associados a uma doença autoimune. A imunoglobulina revelada no presente documento pode ser de qualquer tipo (por exemplo, IgG, IgE, IgM, IgD, e IgA), classe (por exemplo, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl e IgA2) ou subclasse de molécula de imunoglobulina. As imunoglobulinas podem ser derivadas de qualquer espécie. Em um aspecto, no entanto, a imunoglobulina é de origem humana, murina, ou de coelho.

[031] "Fragmentos de anticorpo" compreendem uma porção de um anticorpo de comprimento total, em geral, a ligação de antígeno ou região variável do mesmo. Exemplos de fragmentos de anticorpo incluem fragmentos de Fab, Fab', F(ab')2, e Fv; diacorpos; anticorpos lineares; fragmentos produzidos por uma biblioteca de expressão Fab, anticorpos anti-idiotípicos (anti-Id), CDR (região de determinação complementar), ECD (domínio extracelular), e fragmentos de ligação de epítope de qualquer um dos supracitados que ligam imunoespecificamente a antígeno de célula cancerígenas, antígenos virais ou antígenos microbianos, moléculas de anticorpo de cadeia única; e anticorpos multiespecíficos formados de fragmentos de anticorpo.

[032] "Ensaio de Claridade, Opalescência e Coloração (COC)"é definido como o uso de tubos idênticos de teste de vidro incolor, transparente e neutro com uma base plana e um diâmetro interno de 15 a 25 mm, comparam o líquido a ser examinado com uma suspensão de referência recém-preparada conforme descrito abaixo, sendo que a profundidade da camada é de 40 mm. As soluções de cor padrão listadas na Farmacopeia dos E.U.A 2012 (USP Monografia 631, Color and Achromicity) ou na Farmacopeia europeia 5,0 (método EP 2.2.2, Grau de Coloration of Liquids) pode ser usado para confirmação da designação de cor apropriada.

[033] O termo "l,4-diidroxi-2-naftoato (DHNA)"é um produto químico derivado de células de E. Coli. Okada Y, Tsuzuki Y, Miyazaki J, Matsuzaki K, Hokari R, Komoto S, et al. (2006) Gut 55: 681 a 8. DHNA é um intermediário na menaquinona (MK), também conhecido como vitamina K2, biosynthesis pathway of E. Coli cells. Neidhardt, F.C. (2010) Escherichia coli e Salmonella (versão online: Módulo 3.2.2 pgs. 36 a 37); Inledew, W.J. & R.K. Poole (1984) The cadeira respiratórias of Escherichia coli. Microbiological reviews. 48: 222 a 271; Nowicka, B. & J. Cruk (2010) Occurrence, Biosynthesis e Function of Isoprenoid Quinones. Biochimica et Biophysica Acta 1797: 1587 a 1605.

[034] O termo "oxigênio dissolvido" (dO2) é uma medição relativa da quantidade de oxigênio que é dissolvido ou carregado em um dado meio. A mesma pode ser medida com uma sonda de oxigênio dissolvido tal como um sensor de oxigênio em meio líquido.

[035] O termo "fermento" ou "fermentação"conforme usado no presente documento significa o processo de cultivar células hospedeiras procarióticas que foram transformadas para induzir a produção de uma proteína recombinante de interesse.

[036] O termo "volume filtrado" ou "substância volume filtrado (FBS)" significa a proteína recombinante de interesse produto após a colheita e purificação, em que a proteína foi liberada da célula hospedeira, centrifugada e/ou filtrada para remover quaisquer detritos celulares, purificada em colunas adequadas de cromatografia, e subsequentemente concentrada por um processo de filtração.

[037] O termo "fluido celular de cultura colhida", também indicado como HCCF, significa fluido celular de cultura procariótica ou eucariótica do qual as células foram removidas, por meios que incluem centrifugação ou filtração. A cultura celular é o processo pelo qual tanto as células procarióticas como as células eucarióticas são cultivadas sob condições controladas. O termo "cultura celular" se refere à cultura de células derivadas de eucariontes multicelulares, que incluem células animais ou procarionte monocelular, que incluem bactérias e levedura. As culturas celulares eucarióticas incluem células mamíferas tais como Células de Ovário de Hamster Chinês, hibridiomas, e células de insetos. Com um vaso de cultura celular apropriado, proteínas secretadas podem ser obtidas de células dependentes de ancoragem ou linhagens celulares de suspensão. Culturas celulares mamíferas incluem células de Ovário de Hamster Chinês (CHO) ou células de NSO.

[038] O termo "operações de colheita" ou "colher" significa, sem limitação, um processo que compreende a lisagem ou homogeneização, e então centrifugação e/ou filtração de uma cultura de célula hospedeira procariótica fermentada que foi transformada para produzir uma proteína recombinante de interesse, de modo a começar a isolar e purificar a dita proteína de interesse.

[039] O termo "Hi-dO", conforme usado no presente documento, se refere a um processo intensificado, conforme descrito no presente documento, que é a manutenção de um nível de oxigênio dissolvido maior do que 0% durante as operações de colheita. Para alcançar isso, a presente invenção contempla uma combinação de ar de sobreposição, contrapressão e taxa de agitação que pode ser usada para manter o nível de dO2 em um ponto de ajuste ou acima do mesmo, isto é, acima de 0%, ou em cerca de 30% a cerca de 75%, ou em níveis maiores do que 75%, ou em cerca de 50%, ou em níveis maiores do que 50%. Em outra realização, as pessoas versadas na técnica também poderiam borrifar ar ou oxigênio puro ao caldo diretamente para alcançar níveis de Hi-dO de oxigênio dissolvido maiores do que 0%.

[040] O termo "homogeneização"conforme usado no presente documento significa um processo de lisagem ou da lise celular mecânica de células hospedeiras procarióticas transformadas com uma proteína recombinante de interesse de modo a liberar a dita proteína da célula hospedeira.

[041] O termo "contrapressão aumentada"é usado para aumentar a taxa de transferência de oxigênio através do caldo de cultura. A contrapressão é tipicamente medida tanto em psi como em bar.

[042] "Menaquinonas (MK)"são homólogos de vitaminas K2 e servem como moléculas lançadeiras de elétron na cadeira respiratória entre os complexos de proteína de ligação de membrana durante as condições micro- aeróbicas e/ou anaeróbicas. O termo "menE"é um gene na via de biossíntese para produzir menaquinonas.

[043] O termo "fermentação microbiana" significa a cultura celular das bactérias ou levedura que é geneticamente manipulada para produzir proteínas e pequenas moléculas (por exemplo metabólitos secundários). A fermentação é usada para propagar bactérias de levedura recombinantes, assim como outros micro-organismos e produzem proteínas de valor. A produtividade e cultivo celular desses organismos são maximizados suprindo- se meios particulares de cultivo e controle e vários fatores ambientais (tais como pH, temperatura, e aeração). O fluido de fermentação bacteriana pode ser derivado de culturas de E. Coli.

[044] O termo "anticorpo monoclonal", conforme usado no presente documento, se refere a um anticorpo obtido de uma população de anticorpos substancialmente homogêneos, isto é, os anticorpos individuais que compreendem a população são idênticos exceto para possíveis mutações naturalmente ocorrentes que pode estar presentes em quantidades menores. Anticorpos monoclonais são altamente específicos, sendo direcionados em um único sítio antigênico. Ademais, em contraste às preparações de anticorpo policlonal que incluem diferentes anticorpos direcionados em diferentes determinantes (epítopes), cada anticorpo monoclonal é direcionado em um único determinante no antígeno. Adicionalmente a sua especificidade, os anticorpos monoclonais são vantajosos no fato de que os mesmos podem ser sintetizados não contaminados por outros anticorpos. O modificador "monoclonal" indica o caráter do anticorpo como sendo obtida a partir de uma população de anticorpos substancialmente homogênea, e não deve ser interpretado como exigindo a produção do anticorpo por qualquer método particular. Por exemplo, os anticorpos monoclonais a serem usados em conformidade com a presente invenção podem ser feitos pelo método de hibridoma primeiramente descrito por Kohler et al (1975) Nature 256:495, ou pode ser feito por métodos de DNA recombinante (documento de patente n° U.S. 4.816.567). OS "anticorpos monoclonais" também podem ser isolados doas bibliotecas de anticorpo de fago com o uso de os conjuntos de procedimentos descritas por exemplo em Clackson et al (1991) Nature, 352:624 a 628; Marks et al (1991) J. Mol. Biol. 222:581 a 597.

[045] O termo "ar de sobreposição" significa o ar soprado do topo do fermentador que contém o caldo de cultura. Tipicamente, o oxigênio é suprido a um fermentador borbulhando-se ar através do meio de cultura de líquido, frequentemente acompanhado por vigorosa agitação para efetuar uma fina dispersão de bolha.

[046] O termo "célula hospedeira procariótica" conforme usado na presente invenção deve abranger aqueles que utilizam a via de biossíntese de menaquinona. Em uma realização, as células hospedeiras procarióticas abrangem, por exemplo, Archaebacteria e Eubacteria, tais como organismos gram-negativos ou gram-positivos. Exemplos de bactérias úteis incluem as espécies Escherichia (por exemplo, E. Coli), Bacilli (por exemplo, B. subtilis), Enterobacteria, Pseudomonas (por exemplo, P. Aeruginosa), Salmonella typhimurium, Serratia marcescans, Klebsiella, Proteus, Shigella, Rhizobia, Vitreoscilla ou Paracoccus. Em uma realização, as células gram-negativas são usadas. Em outra realização, as células de E. Coli são usados como hospedeiros para a invenção (Bachmann, Cellular and Molecular Biology, vol. 2 (Washington, D.C.: American Society for Microbiology, 1987), páginas 1190 a 1219; ATCC Deposito N° 27.325) e derivados dos mesmos, que incluem cepa 33D3 que tem genótipo W3110 ΔfhuA (ΔtonA) ptr3 laclq lacL8 ΔompT Δ(nmpC- fepE) degP41 kanR (documento de patente n° U.S. 5.639.635). Evidentemente, outras cepas e derivados das mesmas, tais como E. Coli 294 (ATCC 31,446), E. Coli B, E. Coli 1776 (ATCC 31,537) e E. Coli RV308 (ATCC 31,608) também são adequadas. Esses exemplos são ilustrativos em vez de limitantes. Os métodos para construir derivados de qualquer uma das bactérias mencionadas acima que têm genótipos definidos são conhecidos na técnica e descritos em, por exemplo, Bass et al. (1990) Proteins, 8: 309 a 314. É, evidentemente, necessário para selecionar as bactérias apropriadas levando em consideração a capacidade de replicação do replicão nas células de uma bactéria. Por exemplo, espécies E. Coli, Serratia, ou Salmonella podem ser adequadamente usadas como o hospedeiro quando plasmídeos conhecidos tais como pBR322, pBR325, pACYC177, ou pKN410 são usados para suprir o replicão.

[047] Conforme usado no presente documento, "proteína recombinante" se refere, em geral a peptídeos e proteínas, que incluem anticorpos. Tais proteínas recombinantes são "heterólogas," isto é, estranhas à célula hospedeira que utilizada, tais como uma proteína humana produzida por E. Coli. O polipeptídio pode ser produzido como um agregado insolúvel ou como um polipeptídio solúvel no espaço periplásmico ou citoplasma.

[048] O termo "independente de escala" significa que a capacidade de volume do processo de fermentação da presente invenção pode ser concluída com o uso de qualquer escala, tal como, por exemplo, de cerca de 1 litro ou mais, ou cerca de 10 litros ou mais, ou cerca de 100 litros ou mais, ou cerca de 500 litros ou mais, ou cerca de 1,000 litros ou mais, ou cerca de 10, 000 litros ou mais, ou cerca de 100,000 litros ou mais.

II. MODOS PARA REALIZAR A INVENÇÃO

[049] A presente invenção diz respeito a métodos aprimorados de produção de proteínas recombinantes em um sistema procariótico. A invenção é baseada em evitar uma formação de aduto marrom constatado durante a fabricação de uma proteína recombinante que fez com que determinados lotes do produto não cumprissem as especificações. Conforme ilustrado nos exemplos fornecidos no presente documento, o problema do aduto marrom resultou de um potencial de óxidoredução inconsistente durante as operações de colheita. Foi agora constatado de forma surpreendente que a formação de aduto marrom pode ser evitada mantendo-se um ambiente de oxigênio dissolvido maior do que zero durante as operações de colheita ou alternativamente, deletando-se geneticamente o gene de menE no genoma de célula hospedeira procariótica usado para produzir de forma recombinante a proteína recombinante de interesse.

PRODUÇÃO RECOMBINANTE DE PROTEÍNAS RECOMBINANTES EM CÉLULAS PROCARIÓTICAS

[050] Na primeira etapa dos processos acima, o ácido nucleico heterólogo (por exemplo, cDNA ou DNA genômico) usado para produzir a proteína recombinante de interesse, é adequadamente inserida em um vetor replicável para expressão na bactéria sob o controle de um promotor adequado para bactéria. Muitos vetores estão disponíveis para esse propósito, e a seleção do vetor apropriado dependerá principalmente do tamanho do ácido nucleico a ser inserido no vector e a célula hospedeira particular a ser transformada com o vetor. Cada vector contém vários componentes dependendo de sua função (amplificação de DNA ou expressão de DNA) e a célula hospedeira particular com a qual a mesma é compatível. Os componentes de vetor para transformação bacteriana podem incluir uma sequência de sinal para o polipeptídio heterólogo e incluirão uma sequência de sinal e também incluirão um promotor induzível para o polipeptídio heterólogo. Os mesmos também incluirão, em geral, uma origem de replicação e um ou mais genes marcadores, descritos no presente documento.

[051] Se o polipeptídio heterólogo tiver de ser secretado, o DNA que codifica o polipeptídio heterólogo de interesse no presente documento contém uma sequência de sinal, tal como uma no terminal N do polipeptídio heterólogo maduro. Em general, a sequência de sinal pode ser um componente do vetor, ou a mesma pode ser uma parte do polipeptídio heterólogo DNA que é inserida no vetor. A sequência de sinal heteróloga selecionada deve ser aquela que é reconhecida e processada (isto é, clivada por uma peptidase de sinal) pela célula hospedeira. Para células hospedeiras bacterianas que não reconhecem e processam a sequência de sinal de polipeptídio heterólogo nativo, a sequência de sinal é substituída por qualquer sequência de sinal bacteriano comumente conhecida.

[052] Os vetores de expressão contêm uma sequência de ácido nucleico que permite que o vetor replique em uma ou mais células hospedeiras selecionadas. Tais sequências são conhecidas para uma variedade de bactérias. A origem de replicação do plasmídeo pBR322 é adequada para a maioria das bactérias gram-negativas.

[053] Os vetores de expressão também contêm, em geral, um gene de seleção, também denominado como marcador selecionável. Esse gene codifica uma proteína necessária para a sobrevivência ou cultivo de células hospedeiras transformadas cultivadas em um meio de cultura seletivo. As células hospedeiras não transformadas com o vetor que contém o gene de seleção não sobreviverá no meio de cultura. Genes típicos de seleção codificam as proteínas que (a) conferem resistência a antibióticos ou outras toxinas, por exemplo, ampicillina, neomicina, metotrexato, ou tetraciclina, (b) complementam deficiências auxotróficas, ou (c) suprem nutrientes cruciais não disponíveis a partir dos meios complexos, por exemplo, o gene que codifica D- alanina racemase para Bacilli. Um exemplo de um esquema de seleção utiliza um fármaco para reter o cultivo de uma célula hospedeira. Aquelas células que são transformadas de forma bem sucedida com um gene heterólogo produzem uma proteína que confere ao fármaco resistência e, desse modo, sobrevivem ao regime de seleção.

[054] O vetor de expressão para produzir um polipeptídio heterólogo também contém um promotor induzível que é reconhecido pelo organismo bacteriano hospedeiro e é ligado de forma operativa ao ácido nucleico que codifica o polipeptídio heterólogo de interesse. O mesmo também contém um promotor induzível separado ou promotor de baixa expressão basal ligado de forma operativa ao ácido nucleico que codifica as enzimas líticas. Os promotores induzíveis adequados para uso com hospedeiros bacterianos incluem os sistemas promotores beta-lactamase e lactose (Chang et al., Nature, 275: 615 (1978); Goeddel et al., Nature, 281 : 544 (1979)), o sistema promotor de arabinose, que inclui o promotor de araBAD (Guzman et al., J. Bacterid., 174: 7716 a 7728 (1992); Guzman et al., J. Bacterid., 177: 4121 a 4130 (1995); Siegele e Hu, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94: 8168 a 8172 (1997)), o promotor de ramnose (Haldimann et al., J. Bacterid., 180: 1277 a 1286 (1998)), o promotor de fosfatase alcalina, um sistema promotor de triptofano (trp) (Goeddel, Ácidos nucleicos Res., 8: 4057 (1980) e documento n° EP 36,776), os Promotores de P.sub.LtetO-1 e P.sub.lac/are-1 (Lutz e Bujard, Núcleosc Acids Res., 25: 1203 a 1210 (1997)), e promotores híbridos tais como o promotor tac. de Boer et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 80: 21 a 25 (1983). No entanto, outros promotores bacterianos conhecidos induzíveis e promotores de baixa expressão basal são adequados. As sequências de nucleotídeo foram publicadas, permitindo assim que um trabalhador habilitado os ligue de forma operativa ao DNA que codifica o polipeptídio heterólogo de interesse ou aos ácidos nucleicos que codificam as enzimas líticas (Siebenlist et al., Cell, 20: 269 (1980)) com o uso de ligantes ou adaptadores para suprir quaisquer sítios exigidos de restrição. Se um promotor forte e altamente vazável, tais como o promotor trp, for usado, o mesmo é geralmente usado somente para expressão do ácido nucleico que codifica o polipeptídio heterólogo e não para o ácido nucleico de codificação de enzima lítica. Os promotores tac e PL poderiam ser usados para qualquer um dos mesmos, mas não para ambos. Em uma realização, o promotor de fosfatase alcalina (phoA) é usado para o produto e o promotor de arabinose (ara) para as enzimas líticas.

[055] Os promotores para uso em sistemas bacterianos também contêm em geral uma Sequência de Shine-Dalgarno (SD) ligada de forma operativa ao DNA que codifica o polipeptídio heterólogo de interesse. O promotor pode ser removido do DNA de fonte bacteriana por digestão de enzima de restrição e inserido ao vetor que contém o DNA desejado. O promotor de phoA pode ser removido do DNA de fonte bacteriana por digestão de enzima de restrição e inserido no vetor que contém o DNA desejado.

[056] A construção de vetores adequados que contém um ou mais dos componentes listados acima emprega conjuntos de procedimentos de ligação padrão comumente conhecidas às pessoas versadas na técnica. Os plasmídeos isolados ou fragmentos de DNA são clivados, adaptados, e religados na forma desejada para gerar os plasmídeos exigidos.

[057] As células hospedeiras procarióticas adequadas para a invenção reivindicada incluem qualquer uma que utilize a via de biossíntese para produzir menaquinonas, conforme definido no presente documento. Alguns exemplos não limitativos podem incluir, por exemplo, Escherichia coli (E. Coli), Enterobacter, Azotobacter, Erwinia, Bacillus, Pseudomonas, Klebsiella, Proteus, Salmonella, Serratia, Shigella, Rhizobia, Vitreoscilla, e Paracoccus.

[058] A transformação significa introduzir DNA no hospedeiro procariótico de modo que o DNA seja replicável, tanto como um elemento extracromossômico como por integrante cromossômico. Dependendo da célula hospedeira usada, a transformação é feita com o uso de conjuntos de procedimentos padrão apropriadas a tais células. O tratamento de cálcio que emprega cloreto de cálcio é, em geral, usado para células bacterianas que contém barreiras de parede celular substanciais. Outro método for transformação emprega polietileno glicol/DMSO. Ainda outro conjunto de procedimentos usado é eletroporação.

[059] As células procarióticas usadas para produzir os polipeptídios da invenção são cultivadas em meios conhecidos na técnica e adequadas para cultura das células hospedeiras selecionadas. Exemplos de meios adequados incluem caldo de Luria-Bertani (LB) caldo mais suplementos de nutrientes necessários. Em determinadas realizações, os meios também contêm um agente de seleção, escolhido com base na construção do vetor de expressão, para permitir de modo selecionável o cultivo de células procarióticas que contêm o vetor de expressão. Por exemplo, ampicillina é adicionada aos meios para cultivo de células que expressam gene resistente a ampicillina. Quaisquer suplementos necessários além de carbono, nitrogênio, e fontes de fosfato inorgânico também podem ser incluídos em concentrações apropriadas introduzidas sozinhas ou como uma mistura com outro suplemento ou meio tal como uma fonte complexa de nitrogênio.

[060] Para acúmulo de um produto de gene expresso, a célula hospedeira é cultivada sob condições suficientes para acúmulo do gene produto. Tais condições incluem, por exemplo, temperatura, nutriente, e condições de densidade de célula que permitem expressão de proteína e acúmulo pela célula. Ademais, tais condições são aquelas que sob as quais a célula pode realizar funções celulares básicas de transcriptação, translação, e passagem de proteínas de um compartimento celular a outro para as proteínas secretadas, conforme são conhecidas a aqueles versados na técnica.

[061] As células hospedeiras procarióticas são cultivadas em temperaturas adequadas. Para cultivo de E. Coli, por exemplo, a temperatura típica varia de cerca de 20 °C a cerca de 39 °C. Em uma realização, a temperatura é de cerca de 25 °C a cerca de 37 °C. Em outra realização, a temperatura está em cerca de 30 °C.

[062] O pH do meio de cultura pode ser qualquer pH de cerca de 5 a 9, dependendo principalmente do organismo hospedeiro. Para E. Coli, o pH é de cerca de 6,8 a cerca de 7,4, ou cerca de 7,0.

[063] Para indução, tipicamente, as células são cultivadas até que uma determinada densidade óptica seja alcançada, por exemplo, um A550 de cerca de 80 a 100, na qual o ponto de indução é iniciado (por exemplo, por adição de um indutor, por esgotamento de um repressor, supressor, ou componente de meio, etc.) para induzir a expressão do gene que codifica o polipeptídio heterólogo.

[064] Após o acúmulo de produto, opcionalmente antes da recuperação do produto, o lisato de caldo é incubado por um período de tempo suficiente para liberar o polipeptídio heterólogo contido nas células. Em uma realização alternativa, ou subsequente ao procedimento, as células presentes na cultura podem ser lisadas mecanicamente, com o uso de quaisquer meios mecânicos conhecidos na técnica, que podem incluir, por exemplo, lise química ou choque osmótico de modo a liberar a dita proteína da célula hospedeira.

[065] Uma vez lisado, o lisato ou homogenato pode ser transferido a um tanque de retenção em que o mesmo pode aguardar a adição de mais bateladas de lisato/homogenato e/ou em que processamento adicional pode ocorrer, tal como, por exemplo, diluição com água, adição de tampões ou floculante, ajuste de pH, ou alteração ou manutenção da temperatura do lisato/homogenato na preparação para etapas de recuperação subsequentes.

[066] Em uma etapa subsequente, o polipeptídio heterólogo, como um produto solúvel ou insolúvel liberado da matriz celular, é recuperado do lisato, ou homogeneizado, de maneira que minimize a correcuperação de detritos celulares com o produto. A recuperação pode ser feita por qualquer meio, mas em uma realização, pode compreender sedimentar partículas retráteis que contém o polipeptídio heterólogo ou coletam sobrenadante que contém produto solúvel. Um exemplo de sedimentação é a centrifugação. Nesse caso, a recuperação ocorre, antes de absorção de leito expandido (EBA) ou sedimentação, na presença de um agente que rompe a parede celular externa para aumentar a permeabilidade e permite que mais sólidos sejam recuperados. Exemplos de tais agentes incluem um agente de quelação tal como ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) ou um zwentérion tal como, por exemplo, um detergente iônico dipolar tal como detergente ZWITTERGENT 316™. Em uma realização, a recuperação ocorre na presença de EDTA.

[067] Se centrifugação for usada para recuperação, a força centrífuga relativa (RCF) é um fator importante. A RCF é ajustada para minimizar a cossedimentação de detritos celulares com as partículas refratárias liberadas da parede celular em lise. A RCF específica usada para esse propósito irá variar com, por exemplo, o tipo de produto a ser recuperado, mas é pelo menos cerca de 3.000 x g, mais preferencialmente cerca de 3.500 a 6.000 x g, ou cerca de 4.000 a 6.000 x g.

[068] A duração de centrifugação dependerá de diversos fatores. A taxa de sedimentação dependerá, por exemplo, do tamanho, formato, e densidade da partícula retrátil e da densidade e viscosidade do fluido. O tempo de sedimentação para sólidos dependerá, por exemplo, da distância e taxa de sedimentação. É razoável esperar que as centrífugas de discos contínuos trabalhem de forma satisfatória para a recuperação dos agregados heterólogos liberados de polipeptídio ou para a remoção de detritos celulares em larga escala, visto que essas centrífugas podem processar em altas velocidades de fluido devido à sua força centrífuga relativamente grande e a distância de sedimentação relativamente pequena.

[069] O polipeptídio heterólogo capturado na etapa de recuperação inicial pode ser então adicionalmente purificada da proteína de contaminação. Em uma realização, o polipeptídio heterólogo agregado é isolado, seguido por uma solubilização simultânea e redobramento do polipeptídio, conforme revelado no documento de patente n° U.S. 5.288.931. Alternativamente, o produto solúvel é recuperado por conjuntos de procedimentos padrão conforme descrito abaixo.

[070] Métodos cromatográficos gerais e seu uso são conhecidos a uma pessoa versada na técnica. Consulte por exemplo, Cromatography, 5° edição, Part one: Fundamentals and Techniques, Heftmann, E. (ed), Elsevier Science Publishing Company, Nova Iorque, (1992); Advanced Cromatographic and Electromigration Methods in Biosciences, Deyl, Z. (ed.), Elsevier Science BV, Amsterdã, Holanda, (1998); Cromatography Today, Poole, C. F., e Poole, S. K., Elsevier Science Publishing Company, Nova Iorque, (1991); Scopes, Protein Purification Principles and Practice (1982); Sambrook, J., et al. (ed), Molecular Cloning: a Laboratory Manual, Segunda Edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989; ou Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, F. M., et al. (eds), John Wiley & Sons, Inc., Nova Iorque. Os procedimentos a seguir são exemplos de procedimentos de purificação adequada para o polipeptídio heterólogo solúvel liberado do periplasma ou do citoplasma, e são conhecidos na técnica: fracionamento em imunoafinidade ou colunas de troca iônica; precipitação de etanol; HPLC de fase reversa; cromatografia em sílica ou em uma resina de troca de cátion tal como DEAE; cromatofocalização; SDS-PAGE; precipitação de sulfato de amônio; e filtração de gel com o uso de, por exemplo, SEPHADEX™ G-75.

[071] Em um aspecto da invenção, a produção de anticorpo é conduzida em grande quantidade por um processo de fermentação. Vários procedimentos de fermentação de batelada alimentada em larga escala estão disponíveis para a produção de proteínas recombinantes. Fermentações em larga escala têm pelo menos 1.000 litros de capacidade, preferencialmente cerca de 1.000 a 100.000 litros de capacidade. Esses fermentadores usam impulsores de agitador para distribuir oxigênio e nutrientes, especialmente glicose (A fonte preferencial de carbono/energia). Fermentação em pequena escala se refere, em geral, à fermentação em um fermentador que tem não mais do que aproximadamente 20 litros de capacidade volumétrica.

[072] Conforme discutido no presente documento, a invenção reivindicada pode ser usada para produzir proteínas recombinantes, incluindo, por exemplo, peptídeos e proteínas, incluindo os anticorpos.

[073] Exemplos de peptídeos e proteínas recombinantes que pode ser produzida pelo método da invenção incluem, porém, sem limitação, moléculas tais como, por exemplo, renina, um hormônio de crescimento, incluindo hormônio de crescimento humano; hormônio de crescimento bovino; fator de liberação de hormônio de crescimento; hormônio de paratireoide; hormônio estímulo de tireoide; lipoproteínas; α1-antitripsina; cadeia A de insulina; cadeia B de insulina; proinsulina; trombopoietina; hormônio de estímulo de folículo; calcitonina; hormônio de luteinize; glucagon; fatores de coagulação tais como fator VIIIC, fator IX, fator de tecido, e fator de von Willebrands; fatores de anti-coagulação, tais como Protein C; fator naturiético atrial; tensoativo de pulmão; um ativador de plasminogênio, tal como uroquinase ou urina humana ou ativador de plasminogênio (t-PA) de tipo de tecido; bombesina; trombina; fator de crescimento hemopoiético; fator-alfa e— beta de necrose de tumor; encefalinase; uma albumina de soro, tal como albumina humana de soro; substancia de inibição mulleriana; cadeia A de relaxina; cadeia B de relaxina; prorelaxina; peptídeo associado à gonadotropina de camundongo; uma proteína microbiana, tal como beta-lactamase; DNase; inhibina; activina; fator de crescimento endotelial vascular (VEGF); receptores para hormônios ou fatores de crescimento; integrina; proteína A ou D; fatores de reumatoide; um fator neurotrófico, tal como fator neurotrófico derivado de cérebro (BDNF), neurotrophina-3, -4, -5, ou -6 (NT-3, NT-4, NT-5, ou NT-6), ou um fator de crescimento de nervo, tal como NGF-β; cardiotrofinas (fator de hipertrofia cardíaca) tais como cardiotrofina-1 (CT-1); fator de crescimento derivado de plaqueta (PDGF); fator de crescimento fibroblasto tais como aFGF e bFGF; fator de crescimento epidérmico (EGF); fator de crescimento de transformação (TGF) tal como TGF-alfa e TGF-beta, incluindo TGF-β1, TGF- β 2, TGF-β3, TGF- β4, ou TGF β5; fator -I e -II de crescimento similar à insulina (IGF-I e IGF-II); des(1 a 3)-IGF-I (cérebro IGF-I), proteínas de ligação de fator de crescimento similar à insulina; Proteínas CD, tais como CD-3, CD-4, CD-8, e CD-19; eritropoietina; fatores osteoindutivos; imunotoxinas; uma proteína morfogenética óssea (BMP); um interferon, tal como interferon-alfa, -beta, e - gama; fatores de estímulo de colônia (CSFs), por exemplo, M-CSF, GM-CSF, e G-CSF; interleucinas (ILs), por exemplo, IL-1 a IL-13; anticorpo anti-HER-2; dismutase de superóxido; receptores de célula T; proteínas de membrana de superfície; fator de aceleração de declínio; antígeno viral, tal como, por exemplo, uma porção do envelope de AIDS; proteínas de transporte; receptores domésticos; adressinas; proteínas reguladoras.

[074] Os anticorpos produzidos pela invenção reivindicada podem ser anticorpos monoclonais que são populações homogêneas de anticorpos a um determinante antigênico particular (por exemplo, um antígeno de célula cancerígena, um antígeno viral, um antígeno microbiano, uma proteína, um peptídeo, um carboidrato, um produto químico, ácido nucleico, ou fragmentos dos mesmos). Um anticorpo monoclonal (MAb) a um alvo de interesse pode ser preparado com o uso de qualquer conjunto de procedimentos conhecido na técnica que fornece a produção de moléculas de anticorpo por linhagens celulares continua em cultura. Esses incluem, porém, sem limitação, o conjunto de procedimentos de hibridoma originalmente descrito por Kohler e Milstein (1975) Nature 256:495 a 497), o conjunto de procedimentos de célula B humana de hibridoma (Kozbor et al (1983) Immunology Today 4:72), e o conjunto de procedimentos de hibridoma EBV (Cole et al (1985) em Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., páginas 77 a 96). Tais anticorpos podem ser de qualquer classe de imunoglobulina que inclui IgG, IgM, IgE, IgA, e IgD e qualquer subclasse dos mesmos. A hibridoma que produz as MAbs de uso nesta invenção pode ser cultivada in vitro ou in vivo.

[075] Anticorpos monoclonais úteis incluem, porém, sem limitação, anticorpos monoclonais humanos, anticorpos monoclonais humanizados, fragmentos de anticorpo, ou anticorpos monoclonais de humano- camundongo (ou outras espécies) quiméricos. Anticorpos monoclonais humanos podem ser feitos por quaisquer inúmeros conjuntos de procedimentos conhecidos na técnica (Teng et al (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:7308 a 7312; Kozbor et al (1983) Immunology Today 4:72 a 79; e Olsson et al (1982) Methods in Enzymology 92:3 a 16).

[076] O anticorpo também pode ser um anticorpo biespecífico. Anticorpos biespecíficos pode ter uma cadeia pesada de imunoglobulina híbrida com uma primeira especificidade de ligação em um ramo, e um par de cadeia pesada-cadeia leve de imunoglobulina híbrida (que fornece uma segunda especificidade de ligação) no outro ramo. Essa estrutura assimétrica facilita a separação do composto biespecífico desejado de combinações de cadeia de imunoglobulina indesejada, à medida que a presença de uma cadeia leve de imunoglobulina em somente uma metade da molécula biespecífica fornece um modo fácil de separação (documento n° WO 94/04690; Suresh et al (1986) Methods in Enzymology, 121 :210; Rodrigues et al (1993) J. Of Immunology 151 :6954 a 6961 ; Carter et al (1992) Bio/Technology 10: 163 a 167; Carter et al (1995) J. Of Hematotherapy 4:463 a 470; Merchant et al (1998) Nature Biotechnology 16:677 a 681. Os métodos para produzir anticorpos biespecíficos são conhecidos na técnica (Milstein et al (1983) Nature 305:537 a 539; documento n° WO 93/08829; Traunecker et al (1991) EMBO J. 10:3655 a 3659. Com o uso de tais conjuntos de procedimentos, os anticorpos biespecíficos podem ser preparados para conjugação como um conjugado de fármaco de anticorpo (ADC) no tratamento ou prevenção de doenças conforme definido no presente documento.

[077] O anticorpo, conforme definido, pode ser um fragmento funcionalmente ativo, derivado ou análogo de um anticorpo que liga de forma imunoespecífica ao antígeno de célula cancerígenas, antígenos virais, ou antígenos microbianos ou outros anticorpos ligados a células ou matriz de tumor. A esse respeito, "funcionalmente ativo" significa que o fragmento, derivado ou análogo tem capacidade de obter anticorpos anti-anti-idiótipo que reconhecem o mesmo antígeno que o anticorpo do qual o fragmento, derivado ou análogo é derivado reconhecido. Especificamente, em uma realização exemplificativa, a antigenicidade do idiótipo da molécula de imunoglobulina pode ser intensificada por apagamento da estrutura e sequências de CDR que tem terminais C à sequência de CDR que reconhece especificamente o antígeno. Para determinar quais sequências de CDR ligam o antígeno, peptídeo sintéticos que contêm as sequências de CDR pode ser usado em ensaios de ligação com o antígeno por qualquer método de ensaio de ligação conhecidos na técnica, por exemplo o ensaio BIA core (Kabat et al, (1991) em Sequences of Proteins of Immunological Interest, quinta Edição, National Institute of Health, Bethesda, Md.; Kabat et al (1980) J. Of Immunology 125(3):961 a 969).

[078] Outros anticorpos úteis incluem fragmentos de anticorpos tais como, porém, sem limitação, fragmentos F(ab')2, que contêm a região variável, a região constante de cadeia leve e o domínio CHI da cadeia pesada pode ser produzida por digestão de pepsina da molécula de anticorpo, e fragmentos de Fab, que podem ser gerados reduzindo-se as pontes de dissulfieto dos fragmentos de F(ab’)2. Outros anticorpos úteis são dímeros de cadeia pesada e cadeia leve de anticorpos, ou qualquer fragmento mínimo dos mesmos, tais como Fvs ou anticorpos de cadeia única (SCAs) (por exemplo, conforme descrito no documento de patente n° U.S. 4.946.778; Bird (1988) Science 242:423 a 42; Huston et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:5879 a 5883; e Ward et al (1989) Nature 334:544 a 54), ou qualquer outra molécula com a mesma especificidade que o anticorpo.

[079] O anticorpo pode ser uma proteína de fusão de um anticorpo, ou um fragmento funcionalmente ativo da mesma, por exemplo, na qual o anticorpo é fundido por meio de uma ligação covalente (por exemplo, uma ligação de peptídeo), tanto no terminal N como no terminal C a uma sequência de aminoácido de outra proteína (ou porção da mesma, tal como porção de pelo menos 10, 20 ou 50 aminoácido da proteína) que não é o anticorpo. O anticorpo ou fragmento do mesmo pode ser ligado de modo covalente à outra proteína no terminal N do domínio constante.

[080] Os anticorpos monoclonais no presente documento incluem especificamente anticorpos "quiméricos"nos quais uma porção da cadeia pesada e/ou leve é idêntica às sequências correspondentes ou homólogas às mesmas em anticorpos derivados de uma espécie particular ou que pertence a uma classe ou subclasse particular de anticorpo, enquanto o restante da(s) cadeia(s) é idêntico às sequências correspondentes ou homólogas às mesmas em anticorpos derivados de outras espécies ou que pertence a outra classe ou subclasse de anticorpo, assim como fragmentos de tais anticorpos, enquanto as mesmas exibem a atividade biológica desejada (documento de patente n° U.S. 4.816.567; e Morrison et al (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 81: 6851 a 6855). Um anticorpo quimérico é uma molécula na qual diferentes porções são derivadas de diferentes espécies animais, tais como aquelas que têm uma região variável derivada de murina monoclonal e regiões constantes de imunoglobulina humana (documentos de patente n° U.S. 4.816.567; 4.816.397). Os anticorpos quiméricos incluem anticorpos "primatizados" que compreendem sequências de ligação de antígeno de domínio variável derivadas de um primata não humano (por exemplo, Macacos do Velho Mundo, Ape etc.) e sequências de região constante humanas.

[081] Anticorpos monoclonais quiméricos e humanizados, que compreendem porções tanto humanas quanto não humanas, podem ser feitas com o uso de conjuntos de procedimentos de DNA recombinante padrão (documento n° WO 87/02671; documento n° EP 184.187; documento n° EP 171496; documento n° EP 173494; documento n° WO 86/01533; documento de patente n° U.S. 4.816.567; documento n° EP 12023; Berter et al (1988) Science 240: 1041 a 1043; Liu et al (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84: 3439 a 3443; Liu et al (1987) J. Immunol. 139: 3521 a 3526; Sun et al (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84: 214 a 218; Nishimura et al (1987) Cancer. Res. 47: 999 a 1005; Wood et al (1985) Nature 314: 446 a 449; e Shaw et al (1988) J. Natl. Cancer Inst. 80: 1553 a 1559; Morrison (1985) Science 229: 1202 a 1207; Oi et al (1986) BioTechniques 4: 214; documento de patente n° U.S. 5.225.539; Jones et al (1986) Nature 321: 552 a 525; Verhoeyan et al (1988) Science 239: 1534; e Beidler et al (1988) J. Immunol. 141: 4053 a 4060; sendo cada um dos quais incorporado ao presente documento a título de referência em sua integridade.

[082] Anticorpos monoclonais terapêuticos que podem ser produzidos pelos métodos da invenção incluem, para não são limitados a, trastuzumabe (HERCEPTIN®, Genentech, Inc., Carter et al (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 89:4285 a 4289; documento de patente n° U.S. 5.725.856); anticorpos anti-CD20 tais como anti-CD20 "C2B8"quimérico (documento de patente n° U.S. 5.736.137); rituximabe (RITUXAN®), ocrelizumabe, uma variante quimérica ou humanizada do anticorpo 2H7 (documento de patente n° U.S. 5.721.108; documento n° WO 04/056312) ou tositumomabe (BEXXAR®); anti-IL-8 (St John et al (1993) Chest, 103:932, e documento n° WO 95/23865); anticorpos focados em outras interleucinas, tais como IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-9, IL-10, IL-12, IL-13; anti-VEGF anticorpos que incluem anticorpos anti-VEGF maduros humanizados ou de afinidade, tais como o anticorpo huA4.6.1 anti-VEGF humanizado bevacizumabe (AVASTIN®, Genentech, Inc., Kim et al (1992) Growth Factors 7: 53 a 64, documento n° WO 96/30046, documento n° WO 98/45331); anticorpos anti-PSCA (documento n° WO 01/40309); anticorpos anti-CD40, que incluem S2C6 e variantes humanizados dos mesmos (documento n° WO 00/75348); anti-CDl l a (documento de patente n° U.S. 5.622.700; documento n° WO 98/23761 ; Steppe et al (1991) Transplant Intl. 4:3 a 7; Horamant et al (1994) Transplantation 58:377 a 380); anti-IgE (Presta et al (1993) J. Immunol. 151 :2623 a 2632; documento n° WO 95/19181); anti-CD18 (documento de patente n° U.S. 5.622.700; documento n° WO 97/26912); anti-IgE, que incluem E25, E26 e E27 (documentos de patente n° U.S. 5.714.338; 5,091,313; documento n° WO 93/04173; documento de patente n° U.S. 5.714.338); anticorpo anti-Apo- 2 receptor (documento n° WO 98/51793); anticorpos anti-TNF-alfa que incluem cA2 (REMICADE®), CDP571 e MAK-195 (documento de patente n° U.S. 5.672.347; Lorenz et al (1996) J. Immunol. 156(4): 1646 a 1653; Dhainaut et al (1995) Crit. Care Med. 23(9): 1461 a 1469); fator anti-tecido (TF) (documento n° EP 0 420 937 Bl); integrina alfa 4 beta 7 anti-humana (documento n° WO 98/06248); anti-EGFR, anticorpo quimerizado ou humanizado 225 (documento n° WO 96/40210); anti-CD3 anticorpos tal como OKT3 (documento de patente n° U.S. 4,515,893); anti-CD25 ou anticorpos anti-tac, tai como CHI-621 SIMULECT® e ZENAPAX® (documento de patente n° U.S. 5.693.762); anticorpos anti-CD4, tais como o anticorpo cM-7412 (Choy et al (1996) Arthritis Rheum 39(1): 52 a 56); anticorpos anti-CD52 tais como CAMPATH-1H (Riechmann et al (1988) Nature 332: 323 a 337); anticorpos receptores anti-Fc, tais como o anticorpo M22 direcionado em Fc gama RI como em Graziano et al (1995) J. Immunol. 155(10): 4996 a 5002; anticorpos antígeno anti- carcinoembriônico (CEA) tal como hMN-14 (Sharkey et al (1995) Cancer Res. 55(23 Suppl): 5935s a 5945s; anticorpos direcionados em células mamárias epiteliais que incluem huBrE-3, hu-Mc 3 e CHL6 (Ceriani et al (1995) Cancer Res. 55(23): 5852s a 5856s; e Richman et al (1995) Cancer Res. 55(23 Supp): 5916s a 5920s); anticorpos que se ligam à célula de carcinoma de colo, tais como C242 (Litton et al (1996) Eur J. Immunol. 26(1): 1 a 9); anticorpos anti- CD38, por exemplo AT 13/5 (Ellis et al (1995) J. Immunol. 155(2): 925 a 937); anticorpos anti-CD33, tais como Hu Ml 95 (Jurcic et al (1995) Cancer Res 55(23 Suppl): 5908s a 5910s e CMA-676 ou CDP771 ; anticorpos anti-CD22, tais como LL2 ou LymphoCide (Juweid et al (1995) Cancer Res 55(23 Suppl): 5899s a 5907s); anticorpos anti-EpCAM tais como 17-1A (PANOREX®); anticorpos anti-GpIIb/IIIa tais como abciximab ou c7E3 Fab (REOPRO®); anticorpos anti-RSV tais como MEDI-493 (SYNAGIS®); anticorpos anti-CMV, tais como PROTOVIR®); anticorpos anti-HIV, tais como PR0542; anticorpos anti-hepatite, tais como o anticorpo anti-Hep B OSTAVIR®); anticorpo anti-CA 125 OvaRex; anticorpo epítope anti-idiotípico GD3 BEC2; anticorpo de carcinoma renal anti-humano, tal como ch-G250; ING-1 ; anticorpo anti-humano 17-1A (3622W94); anticorpo de tumor corectal anti-humano (A33); anticorpo de melanoma anti-humano R24 direcionado em gangliosideo GD3; carcinoma de célula escamosa anti-humana (SF-25); e antígeno de leucócito anti-humano (HLA) anticorpos tais como Smart ID10 e o anticorpo DR anti-HLA Oncolym (Lym-1).

III. MÉTODOS E ENSAIOS MÉTODOS/ENSAIOS ANALÍTICOS ENSAIO DE CLARIDADE, OPALESCÊNCIA E COLORAÇÃO (COC)

[083] O grau de opalescência também pode ser determinado por medição instrumental da luz absorvida ou dispersa em consideração à densidade óptica submicroscópica em homogeneidades de soluções e suspensões opalescentes. Tais conjuntos de procedimentos são nefelometria e turbidimetria. Para medição de turbicidade de amostras coloridas, turbidimetria e nefelometria de relação com seleção de relação são usadas. O efeito de dispersão de luz de partículas suspensas pode ser mensurado por observação tanto da luz transmitida (turbidimetria) como da luz dispersa (nefelometria). A turbidimetria de razão combina os princípios tanto de nefelometria quanto de turbidimetria. A turbidimetria e nefelometria são úteis para a medição de suspensões ligeiramente opalescentes. As suspensões de referência produzidas sob condições bem definidas precisam ser usadas. As soluções de cor padrão listadas em Farmacopéia dos E.U.A 2012 (USP Monografia 631, Color and Acromicity) ou na Farmacopéia Europeia 5,0 (método EP 2.2.2, Grau de Coloration of Liquids) para confirmação da designação de cor apropriada. Para medições quantitativas, a construção de curvas de calibração é essencial, visto que a relação entre as propriedades ópticas da suspensão e da concentração da fase dispersa é, no mínimo, semi-empírica. A determinação de opalescência de líquidos coloridos é feita com turbidímetros de relação ou nefelometros com seleção de relação uma vez que a cor fornece uma interferência negativa, atenuando tanto a luz incidente quanto a luz dispersa e diminuindo o valor de turbidez. O efeito é tão grande mesmo para amostras moderadamente coloridas cujos nefelometros convencionais não podem ser usadas. A avaliação instrumental de claridade e opalescência fornece um teste mais discriminatório que não depende da acuidade visual do analista. Resultados numéricos são mais úteis para controle de monitoramento e processo de qualidade, especialmente em estudos de estabilidade. Por exemplo, dados numéricos anteriores de estabilidade podem ser projetados para determinar se uma dada batelada de formulação de dosagem ou ingrediente farmacêutico ativo excederá os limites de vida de prateleira antes dos dados de validade.

ENSAIO HPLC

[084] Cromatografia Líquida de Alto Desempenho, também conhecida como Cromatografia Líquida de Alta Pressão, abreviada como HPLC, é uma forma especial de cromatografia líquida e usada nos dias atuais frequentemente em bioquímica e química analítica. O analito é forçado através de uma coluna da fase estacionária em um liquido (fase móvel) em alta pressão, que diminui o tempo que os componentes separados permanecem na fase estacionária e, desse modo, o tempo que os mesmos têm para difundir dentro da coluna. Isso induz a picos mais estreitos no cromatograma resultante e, portanto, à melhor resolução e sensibilidade conforme comparado ao LC. A fase móvel é escolhida para garantir solubilidade dos solutos de amostra. Para a fase estacionária, preferencialmente, sílica microparticulada (não revestida ou quimicamente modificada) é usada, devido ao fato de que sua alta área de superfície acentua as diferenças de interações de fase estacionária de soluto. O uso de uma fase estacionária que interage fortemente com solutos em relação às interações de fase móvel solúvel resultará em tempos muito longos de retenção, uma situação que não é analiticamente útil. Então, a fase estacionária precisa ser selecionada de modo a provocar interações de soluto fracas a moderadas em relação àquelas na fase móvel. Como consequência, na natureza do soluto determina o tipo de LC selecionado. As interações mais fortes devem ocorrer na fase móvel para garantir solubilidade de amostra e eluição pronta, enquanto a fase estacionária deve ser responsiva a diferenças mais sutis entre os solutos. Por exemplo, componentes neutros polares são geralmente melhor analisados com o uso de uma fase móvel polar junto com uma fase estacionária não polar que distingue diferenças sutis no caráter dispersivo dos solutos. Um dos aspectos fortes do HPLC é que a fase móvel pode ser variada para alterar o mecanismo de retenção. Modificadores podem ser adicionados à fase móvel para controlar a retenção. Por exemplo, pH é uma variante importante nas fases móveis aquosas.

[085] Cromatografia de fase reversa (RP-HPLC) requer o uso de uma fase estacionária não polar e uma fase móvel polar (composta de um ou mais dos solventes polares, por exemplo água, metanol, acetonitrila, e tetrahidrofurano).

[086] Cromatografia de interação hidrofóbica (HIC) HPLC: Esse método cromatográfico é satisfatório para analisar bioconjugados proteínas ou bioconjugados de anticorpo/proteína com base em sua hidrofobicidade. A teoria atrás de cromatografia de interação hidrofóbica é que as proteínas são ligadas à resina empregando-se uma fase móvel de salta salinidade aquosa. As condições salinas contribuem a um efeito liotrópico que permite que as proteínas se liguem à cobertura de superfície inferior de um ligante hidrofóbico. As proteínas são eluídas pelo simples conjunto de procedimentos de diminuir a concentração de sal. Os alvos mais terapêuticos são eluídos em um baixo sal ou um tampão sem sal. Desse modo, o composto pode ser eluído em um ambiente mais polar e menos desnaturado. Por exemplo, HIC foi usado extensivamente para analisar carregamento de fármaco nos conjugados de anticorpo-fármaco ou proteína-fármaco.

ENSAIO NMR

[087] A detecção de Ressonância Magnética Nuclear (NMR) é baseada no fato de que determinados núcleos com massas de número ímpar, incluindo H e 13C, giram em torno de um eixo geométrico, de modo aleatório. No entanto, quando colocado entre polos de um imã forte, os giros são alinhados tanto paralelos como antiparalelos ao campo magnético, com a orientação paralela favorecida uma vez que a mesma tem energia ligeiramente inferior. Os núcleos são então irradiados com radiação eletromagnética que é absorvida e coloca os núcleos paralelos em um estado de energia maior; consequentemente, os mesmos estão agora em "ressonância" com a radiação. Cada H ou C produzirá diferentes espectros dependendo de sua localização e moléculas adjacentes, ou elementos no composto, devido ao fato de que todos os núcleos nas moléculas são circundados por nuvens de elétron que mudam o campo magnético abrangente e assim, alteram a frequência de absorção.

ESPECTROMETRIA DE MASSA

[088] Espectrometria de massa é um conjunto de procedimentos analíticos usados para medir a relação de massa-carga (m/z ou m/q) dos íons. É mais geralmente usado para analisar a composição de uma amostra física gerando-se um espectro de massa que representa as massas de componentes de amostra. O conjunto de procedimentos tem diversas aplicações que incluem identificar componentes desconhecidos pela massa do composto e/ou fragmentos dos mesmos, determinar a composição isotópica de um ou mais elementos em um composto, determinar a estrutura de componentes observando-se a fragmentação do composto, quantificar a quantidade de um composto em uma amostra com o uso de métodos cuidadosamente projetados (espectrometria de massa não é inerentemente quantitativa), estudar os fundamentos de química de íon de fase gasosa (a química de íons e neutros em vácuo), e determinar outras propriedades físicas, químicas ou mesmo biológicas de componentes com uma variedade de outras abordagens.

[089] Um espectrômetro de massa é um dispositivo usado para espectrometria de massa, e o mesmo produz um espectro de massa de uma amostra para analisar sua composição. Isso é normalmente alcançado ionizando-se a amostra e separando-se os íons de massas divergentes e registrando-se sua abundância relativa medindo-se intensidades de fluxo de íon. Um típico espectrômetro de massa compreende três partes: uma fonte de íon, um analisador de massa, e um detector.

[090] O tipo de fonte de íon é um fator de contribuição que influencia potencialmente quais tipos de amostras podem ser analisadas por espectrometria de massa. A ionização de elétron e ionização química são usadas para gases e vapores. Em fontes de ionização química, o analito é ionizado por reações químicas de molécula de íon durante colisões na fonte. Os dois conjuntos de procedimentos frequentemente usados com amostras biológicas liquidas e sólidas incluem ionização de eletroaspersão (ESI) e dessorção/ionização a laser assistida de matriz (MALDI). Outros conjuntos de procedimentos incluem bombardeamento rápido de átomos (FAB), termoaspersão, ionização química de pressão atmosférica (APCI), espectrometria de massa de íon secundário (SIMS), e ionização térmica.

ESPECTROMETRIA UV

[091] A espectrometria visível a ultravioleta ou espectrofotometria visível á ultravioleta (UV-Vis ou UV/Vis) se refere à espectrometria de absorção ou refletância espectrometria na região espectral visível a ultravioleta. Isso significa que o mesmo faz uso de luz nas faixas visíveis e adjacentes (quase UV e quase-infravermelho (NIR)). A absorção ou refletância na faixa visível afeta diretamente a cor percebida dos produtos químicos envolvidos. Na região do espectro eletromagnético, as moléculas sofrem transições eletrônicas. Esse conjunto de procedimentos é complementar à espectrometria de florescência, no fato de que a fluorescência lida com transições do estado excitado ao estado de solo, enquanto a absorção mede transições do estado de solo ao estado excitado. Um espectrômetro de UV é um instrumento que usa um feixe de luz de uma fonte de luz visível e/ou de UV (de núcleo vermelho) é separada em seus comprimentos de onda de componente por um prisma ou grade de difração. Cada feixe monocromático (comprimento de onda único), por sua vez, é dividido em dois feixes de intensidade igual por um dispositivo meio-espelhado. Um feixe, o feixe de amostra (de núcleo magenta), passa através de um pequeno recipiente transparente (cadinho) que contém uma solução do composto que é estudado em um solvente transparente. O outro feixe, a referência (de núcleo azul), passa através de um cadinho idêntico que contém somente o solvente. As intensidades desses feixes de luz são então medidas por detectores eletrônicos e comparadas. A intensidade do feixe de referência, que deve ter sofrido pouca ou nenhuma absorção de luz, é definida como 10. A intensidade do feixe de amostra é definida como I. Durante um curto período de tempo, o espectrômetro varre automaticamente todos os comprimentos de onda de componente na maneira descrita. A região ultravioleta (UV) varrida é normalmente de 200 a 400 nm, e a porção visível é de 400 a 800 nm.

IV. EXEMPLOS

[092] Os exemplos a seguir são exemplos de métodos e composições da invenção. Entende-se que várias outras realizações podem ser praticadas, dada a descrição geral fornecida acima.

EXEMPLO 1: DETECÇÃO DE ADUTO

[093] Durante uma fabricação de uma proteína recombinante particular, foram produzidos sete volumes filtrados para armazenamento (FBS) em que resultados típicos nos critérios de aparência de produto foram obtidos para cinco dos sete volumes. A especificação por fabricação, as instruções de teste específicos de produto exigem o uso da série de cor Amarela (Y) para a avaliação das amostras de produto pelo ensaio de COC, um método para a determinação de claridade/grau de opalescência, grau de coloração, e aparência. No entanto, dois volumes (Execuções 2 e 3) apareceram de cor marrom in cor e não cumpriram a critério de cor de série amarela esperado de < Y7 para o ensaio de COC. Uma comparação dos resultados de COC para as Execuções 1 a 3 é mostrado na Figura 1. Para investigar a discrepância ainda mais, as sete amostras de FBS foram concentradas para aumentar a intensidade da cor. As amostras concentradas foram comparadas em todas as soluções de cor padrão listadas na Farmacopéia dos E.U.A 2012 (USP Monografia 631, Color and Achromicity) ou na Farmacopéia Européia 5,0 (método EP 2.2.2, Degree of Coloration of Liquids) para confirmação da designação de cor apropriada. As amostras foram comparadas em luz do dia difusa 5 min após a preparação da amostra de referência, visualizando-se verticalmente em um fundo negro. A difusão de luz precisa ser de tal modo que a amostra de referência I possa ser prontamente distinguida da água e que a suspensão de referência II possa ser prontamente distinguida da suspensão de referência I. Um líquido foi considerado limpo se sua claridade foi a mesma que a da água R ou do solvente usado quando examinado sob as condições descritas acima, ou se sua opalescência não foi mais pronunciada do que a da amostra de referência I.

[094] Visto que a causa da coloração foi desconhecida para as Execuções 2 e 3, múltiplos estudos investigacionais foram completados para determinar a fonte e causa da cor marrom atípica. As amostras das Execuções 1 a 3 foram analisadas para metais, oligoelementos (exceto os metais), e cromóforos. Esses estudos sugeriram que a coloração observada nas Execuções 2 e 3 não foram devido aos metais ou outros oligoelementos (dados não mostrados).

[095] Para determinar se cromóforos foram associados à cor inesperada observada no FBS, as Execuções 1 - 3 foram analisadas com o uso de espectrometria ultravioleta e visível (UV/vis) com um cadinho de 1 cm comprimento de caminho. Os espectros de UV (200 - 600 nm) não exibiram nenhuma diferença significativa no perfil de observância para as amostras analisadas.

[096] Para aumentar a sensibilidade do UV espectrofotômetro, o experimento foi repetido com o uso de um cadinho de 10 cm de comprimento de caminho. O cadinho de 10 cm oferece sensibilidade aumentada ao cadinho de 1 cm devido à absorbância de uma amostra é proporcional ao número de moléculas de absorção no feixe de luz de mensurador de espectrofotômetro. As amostras foram varridas entre 200 a 700 nm para determinar o espectro de absorção das Execuções 1 a 3. O formato dos espectros para as Execuções 2 e 3 foi diferente da Execução 1 : novos picos de absorbância foram observados aproximadamente a 320 nm e a 460 nm que não foram aparentes para a Execução 1 (Figura 2A). A diferença pode ser observada mais claramente quando o espectro da Execução 1 é subtraído do espectro de Execução 3 (Figura 2B). O pico observado a 460 nm para as Execuções 2 e 3 é consistente com uma impressão digital de flavina (por exemplo, vitamina).

[097] Com base nos resultados de 10 cm UV/vis, a análise de espectro total para RP-HPLC e IEC com opções para detecção de MS foram realizadas em FBS das Execuções 1 a 3.

[098] Com o uso de detecção de espectro total para RP-HPLC, nenhuma diferença cromatográfica foi observada para a Execução 1 a 3 (dados não mostrados). No entanto, para IEC a 310 nm, diferenças menores foram observadas. Conforme mostrado na Figura 3, um ligeiro pico atrás do pico principal é observado para as Execuções 2 e 3 enquanto o perfil para a Execução 1 é comparável ao Material de Referência.

[099] Amostras intactas foram submetidas para 2D LC-MS e monitoradas tanto em 280 quanto em 310 nm. A análise 2D LC-MS consiste em duas partes - primeira dimensão é a separação por RP-HPLC com a segunda dimensão como picos fracionados para análise de espectrometria de massa. A partir desse experimento, a massa esperada foi observada para a Execução 1 enquanto a massa esperada e uma massa adicional de aproximadamente +157 Da foram observadas para as Execuções 2 e 3 (Figura 4).

EXEMPLO 2: ELUCIDAÇÃO DO ADUTO:

[0100] Para melhor elucidar o aduto, A Execução 3 foi selecionada para fracionamento (o pico menor do ensaio de IEC (Figura 3) foi coletado) e adicionalmente analisado por 2D-LC MS e identificação de massa por mapa de peptídeo tríptico com detecção de MS.

[0101] A partir da análise 2D LC-MS (Figura 5), adicionalmente à massa esperada, uma massa aproximada de aumento de +156 Da foi novamente observado para o pico secundário fracionado. Mediante redução em linha (com DTT) da amostra, a massa reduzida esperada foi observada. Os quatro Daltons adicionais observados entre as análises reduzidas e nativas são devido à ruptura das ligações de dissulfeto e a adição de quatro hidrogênios. A massa adicional foi novamente observada, sugerindo que a modificação foi não reversível ou covalente.

[0102] A partir do mapa de peptídeo tríptico, a amostra foi coletada tanto em 214 nm quanto em 310 nm. Conforme mostrado na Figura 6, picos inovadores são intensificados na região de 45 a 55 minutos. A análise de LC-MS-MS do pico inovador observada em 48,8 minutos a 310 nm foi determinada para ser peptídeo T20 com o resíduo de cistina modificado com +154,006 Da. modificado (em cistina, +154,006 Da) e peptídeos livres T6 e T16 também foram detectados pela extração de massa. T21 reduzido ou T21 modificado não foram detectados, mas isso pode ter sido devido aos baixos níveis presentes. Os outros dois picos observados que eluem entre 50 a 56 minutos a 310 nm não continham nenhuma espécie exclusiva quando comparada à referência.

[0103] A análise de ID e 2D 1H NMR foi coletada para determinar a estrutura de aduto. Dados adicionais foram adquiridos com o uso de TOSCY (Espectrometria de Correlação Total), HSQC (Coerência Quântica Única Heteronuclear), HMBC (Correlação de Ligação Múltipla Heteronuclear), e ROESY (Espectroscopia de Efeito Overhauser de quadro rotativo (nOe)).

[0104]TOCSY cria correlações entre todos os prótons que são acoplados uns aos outros assim como todos os outros prótons dentro de um dado sistema de giro. O experimento de HSQC correlaciona desvios químicos de núcleos diretamente ligados (isto é, dois tipos de núcleos químicos) enquanto o Experimento HMBC correlaciona desvios químicos de dois tipos de núcleos separados um do outro com duas ou mais ligações químicas. ROESY utiliza nOe que usa o espaço, não através de ligações químicas para confirmar uma conformação molecular precisa (isto é, estrutura tridimensional de uma molécula). O peptídeo coletado observado ao longo da faixa 1H a 13C que acopla entre prótons aromáticos (quinona) e C=0 em 182 ppm. Os desvios químicos de HSQC 1H a 13C para o peptídeo coletado na região aromática são uma combinação próxima a aquele observado para a ligação de composto de modelo sintético ao naftaleno- 1, 4 -diona. Dados de TOCSY determinam as ressonâncias Q, V, e R no produto. A comparação de dados 1H-15N HSQC do produto a um peptídeo sintético (NH2-IVQCR-COOH) mostrou que uma correlação Cys NH foi perdida na amostra de produto conforme mostrado na Figura 7. A estrutura proposta é confirmada por forte nOe observado entre o CH de Cys e o NH de Arg (Figura 8). Com base nos dados de NMR coletados, a estrutura proposta é apresentada na Figura 9.

[0105]A identificação das espécies com núcleos como 1,4- diidroxi-2-naftoato (DHNA) que formou o aduto marrom de proteína recombinante foi baseado em MS, NMR e dados genéticos. Os dados de NMR confirmaram que DHNA foi anexado à proteína recombinante por meio de resíduos de cistina. DHNA é um produto derivado da via de biossíntese de menaquinona de células de E. Coli (Figura 10). A menaquinona está presente em E. Coli mas produção da mesma é aumentada quando a cultura está em uma condição anaeróbica e/ou micro- aeróbica. A menaquinona é usada para transporte de elétrons em ambientes de oxigênio limitado e usada para retornar a ligação de dissulfeto que forma a proteína DsbB ao estado oxidado ativo em condições anaeróbicas (micro-aeróbicas).

EXEMPLO 3: PROCESSO DE HI-DO PARA MITIGAR A FORMAÇÃO DE ADUTO DE PRODUTO DE DHNA

[0106]Uma estratégia controle foi desenvolvida para evitar a geração de um tiols livres do produto e a formação subsequente do aduto de produto de DHNA. A causa da formação de cor foi determinada para ser o resultado de um ambiente de baixa oxidoredução durante as operações de colheita devido ao fato de que as Execuções 2 e 3 exibiram os maiores títulos e densidades celulares, ambos foram submetidos a maiores tempos de retenção para seus homogeneizados diluídos, durações maiores prolongadas para os homogeneizados para alcançar menos do que os 15°C de temperatura de alvo e tiveram tempos e taxas subideais de mistura de homogenato (dados não mostrados). Esses fatores contribuíram para gerar um baixo ambiente de oxigênio que promoveu a redução das ligações de dissulfeto de produto e permitiram a oportunidade para DHNA para anexar os tiols livres do produto de proteína.

[0107]Visto que o aduto de proteína DHNA foi formado durante o ambiente de baixa oxidoredução durante as operações de colheita que induziram às ligações reduzidas de dissulfeto reduzido (isto é, tiols livres), uma abordagem foi desenvolvida para evitar a geração de tiols livres e a formação do aduto de produto de DHNA. Esse controle de processo intensificado, chamado Hi-dO, mantém os níveis de oxigênio dissolvido nas operações de colheita em mais do que zero (>0%) para eliminar o ambiente de redução (isto é nenhuma geração de tiol livre).

[0108]A formação do aduto de produto de DHNA é uma reação biológica complexa que exige a combinação de múltiplos eventos através da fermentação e operações de colheita. O resultado do processo de fermentação é a produção de níveis consideráveis e/ou disponibilidade de DHNA. O esquema abaixo mostra os três estágios principais de uma típica operação de colheita: estágio de pós fermentação, um estágio de homogeneização, então um estágio de pós-homogeneização.

[0109] Diversas etapas de processos foram testadas pós- fermentação/pré-homogeneização e testadas pós- homogeneização, para determinar se tais ações mitigariam o ambiente de redução ou geração de tiol livre. Tais intensificações de processo testadas são mostradas na Tabela 1 e na Figura 12. TABELA 1. INTENSIFICAÇÕES DE PROCESSO (HI-DO)

[0110] Os resultados das intensificações de processo destacadas na Tabela 1 e na Figura 12 são mostradas na Tabela 2. Tabela 2 ANÁLISES DE QUALIDADE DE PRODUTO DE EXECUÇÕES DE DESENVOLVIMENTO REALIZADAS COM OS CONTROLES DE PROCESSO INTENSIFICADO DE HI-DO

[0111] Uma análise de causa básica foi realizada para entender as origens da coloração marrom. Essa análise resultou na identificação das espécies com núcleos (DHNA), sua anexação a um produto de proteína recombinante, a estrutura de aduto (proteína DHNA), sua origem e o mecanismo proposto de como e quando DHNA se anexou ao produto durante o processo de produção. Conforme a Tabela 1 resume, uma estratégia de mitigação foi implantada para evitar a formação do aduto marrom, mantendo-se o nível de oxigênio dissolvido maior do que zero (> 0%) em todas as operações de colheita para eliminar o ambiente de redução e evitar a formação de tiols livres de produto. Como resultado, conforme mostrado por análises de IEC, à medida que a % de pico anômalo demonstrou 0%, a formação de aduto marrom não foi detectada na FBS (Tabela 2).

EXEMPLO 4: GERAÇÃO DE CÉLULAS HOSPEDEIRAS DE E. COLI DELETADA DE GENE MENE

[0112] Adicionalmente ao processo de colheita de Hi-dO da invenção, outra abordagem foi tomada para mitigar a formação de aduto marrom. Isso envolveu manipular geneticamente a célula hospedeira procariótica de modo que o gene de menE fosse anulado do genoma, evitando assim a produção de qualquer intermediário DHNA da via de biossíntese de menaquinona que poderia ser anexada ao produto recombinante.

[0113] As células hospedeiras de gene de menE anulado foram geradas como um mutante knockout de gene único in-frame que segue os métodos descritos em Baba et al., Construction of E. Coli K-12 in-frame, singlegene knockout mutants: the Keio collection, Molecular Systems Biology, vol. 21, p.1 a 10 (2006) que é incorporado a este documento a título de referência. O gene de menE foi almejado para mutagênese com produtos de PCR que contêm um cassete de resistência (tal como canamicina) flanqueado por reconhecimento de sítios alvo FLP e 50 homologias de pares de base às sequências cromossômicas adjacentes.

[0114] A mutagênese rendeu aproximadamente 10 a 1.000 colônias de resistência de canamicina quando as células hospedeiras foram incubadas aerobiamente a 37°C em ágar de caldo de Luria-Bertani (LB) que contém 30 μg/mL de canamicina.

EXEMPLO 5: PRODUÇÃO DE PROTEÍNAS RECOMBINANTES COM O USO DE CÉLULAS HOSPEDEIRAS DE E. COLI DELETADA DE GENE MENE

[0115] A capacidade das células hospedeiras de E. Coli deletada de gene menE para produzir proteína recombinante que não exibiu aduto de proteína associado a DHNA foi testada. Brevemente, as células de E. Coli deletada de gene menE foram transformadas com construtos de plasmídeo que codificaram para duas proteínas recombinantes, PROT 1 e PROT 2, e dois anticorpos recombinantes, AB 1 e AB2, por conjuntos de procedimentos padrão conhecidos por aqueles versados na técnica (consulte, por exemplo, Simmons et al., Expression of full-length immunoglobulins in E. Coli: rapid e efficient production of aglycosylated antibodies, J of Immunol Methods 263 p. 133 a 147 (2002)). A fermentação das quatro proteínas recombinantes/anticorpos procedeu conforme descrito no presente documento (consulte também o documento n° US 6.979.556 que é incorporado a este documento a título de referência).

[0116] O produto de volume recombinante filtrado para todas as quatro proteínas / anticorpos recombinantes foram testados para formação de aduto de proteína DHNA por ensaio de IEC a 310 nm e não mostrou nenhum formação de aduto de proteína DHNA detectável (consulte a Figura 11 para resultados exemplificadores para PROT 1).

[0117] De forma surpreendente, constatou-se que o rendimento de recombinante produto como resultado de uso das células de E. Coli de menE anulado aumentou de forma apreciável em cerca de 20% a 50% conforme comparado ao rendimento com o uso de células hospedeiras de E. Coli com um gene de menE de tipo selvagem intacto. Tabela 3 mostra esses resultados. TABELA 3 - RENDIMENTOS DE PROTEÍNA RECOMBINANTE COMO USO DE CÉLULAS HOSPEDEIRAS DELETADA DE GENE MENE

Claims

1. MÉTODO DE PRODUÇÃO DE UMA PROTEÍNA RECOMBINANTE, caracterizado por compreender (a) fermentar uma célula hospedeira procariótica deletada de gene menE, em que a dita célula hospedeira procariótica foi transformada com um ácido nucleico que codifica a dita proteína recombinante, (b) colher a dita proteína recombinante; e (c) purificar a dita proteína recombinante a um volume filtrado para armazenamento (FBS), em que o dito volume filtrado não contém aduto detectável de proteína recombinante de 1,4-diidroxi-2-naftoato (DHNA), conforme mensurado por um ensaio de cromatografia de troca iônica (IEC) a 310 nm, e em que o rendimento de proteína recombinante é aumentado em 20% ou mais, em 30% ou mais, em 40% ou mais, em 50% ou mais, em 60% ou mais, em comparação ao rendimento com o uso de uma célula hospedeira procariótica controle, em que a dita célula hospedeira procariótica é Escherichia coli (E. coli).

2. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela fermentação ser independente de escala.

3. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela dita proteína recombinante ser um polipeptídio recombinante ou um anticorpo recombinante.