RU2636353C2 - Усовершенствованные способы выделения рекобинантных белков - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к области биохимии, генной инженерии и биотехнологии, в частности к способу получения рекомбинантного белка. Данный способ включает культивирование прокариотической клетки-хозяина, продуцирующей рекомбинантный белок, выделение указанного рекомбинантного белка и его очистку до отфильтрованного препарата для хранения (FBS). Этап выделения указанного рекомбинантного белка включает стадию гомогенизации. Настоящий способ отличается тем, что уровень растворенного кислорода при выделении указанного рекомбинантного белка поддерживается на уровне 75% или более до гомогенизации и на уровне 50% или более после гомогенизации. Изобретение также относится к способу получения рекомбинантного белка, включающему культивирование прокариотической клетки-хозяина с делецией гена menE. Способ предусматривает культивирование указанной прокариотической клетки-хозяина, продуцирующей рекомбинантный белок, выделение рекомбинантного белка и его очистку до FBS. Способы по изобретению отличаются тем, что полученный FBS не содержит детектируемых количеств аддукта рекомбинантного белка и 1,4-дигидрокси-2-нафтоата (DHNA) по данным ионообменной хроматографии (IEC) при 310 нм. Изобретение позволяет получать рекомбинантный белок, отфильтрованный препарат которого не содержит коричневый аддукт и соответствует техническим требованиям. 2 н. и 16 з.п. ф-лы, 12 ил., 3 табл., 5 пр.

Description

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

Настоящая заявка испрашивает приоритет по предварительной заявке США 61/616297, поданной 27 марта 2012, которая включена в настоящее описание посредством ссылки во всей своей полноте.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение относится к усовершенствованным способам культивирования рекомбинантных белков в прокариотических клетках-хозяевах.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Масштабная экономически эффективная очистка белков необходима для получения конкурентоспособных биотехнологических продуктов. Как правило, белки получают путем культивирования клеток с использованием либо клеточных линий млекопитающих, либо бактериальных клеточных линий, созданных для получения интересующего белка путем вставки рекомбинантной плазмиды, содержащей ген этого белка. Поскольку используемые клеточные линии являются живыми организмами, их культивируют в сложной среде сложного состава, которая, как правило, содержит смесь солей, сахаров, аминокислот, витаминов, микроэлементов и пептоны. Отделение желаемого белка от смеси соединений, в которых культивируют клетки, и от побочных продуктов самих клеток, с чистотой, достаточной для использования в качестве лекарства для человека, представляет собой сложную задачу.

Рекомбинантные терапевтические белки, как правило, производят в нескольких линиях клеток-хозяев, в том числе клетках-хозяевах млекопитающих, таких как, например, клетки мышиной миеломы NS0 и клетки яичника китайского хомячка (СНО), (Anderson, D.С and Krummen, L. (2002) Curr. Opin. Biotech. 13: 117-123; Chu, L. and Robinson, D.K. (2001) Curr. Opin. Biotechnol. 12: 180-187), и бактериальных клетках-хозяевах, в том числе в клетках Escherichia coli (E. coli). Каждая линия клеток имеет свои преимущества и недостатки с точки зрения производительности и характеристик белков, продуцируемых клетками. Escherichia coli наиболее широко используется для крупномасштабного получения терапевтических белков, которые не требуют сложного гликозилирования для биологической активности. Гетерологичные белки, экспрессируемые в Е. coli, могут накапливаться как растворимый продукт или в виде нерастворимых агрегатов. Как правило, чтобы выделить белки, клетки могут быть подвергнуты обработке для извлечения белка из периплазматического пространства, или клетки могут быть лизированы, чтобы выделить внутриклеточные продукты, которые в противном случае недоступны. Достижения методов ферментации и культивирования клеток значительно увеличили выходы целевых рекомбинантных белков.

Выбор клеточных линий для коммерческого получения часто определяется балансом между потребностью в высокой производительности и возможностью обеспечения характеристик качества, необходимых для данного продукта. По текущим правилам организации производства и контроля качества процедур культивирования, качество контролируется на протяжении всего процесса, гарантируя, что продукт удовлетворяет требованиям регулирующих инстанций с точки зрения безопасности, идентичности продукта, качества и чистоты. Тем не менее, время от времени возникают проблемы, когда данный продукт не соответствует его техническим характеристикам. Задача состоит в том, чтобы разработать надежный процесс, в котором идентифицирована и выделена проблема, затем минимизировать проблему таким образом, что процесс может поддерживаться в пределах установленных диапазонов параметров, и убедиться, что процесс воспроизводимо дает продукцию, отвечающую требованиям технических характеристик продукта. В данной области существует потребность в уменьшении или устранении частоты получения продуктов, которые не соответствуют техническим характеристикам.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к способу получения рекомбинантного белка, включающему (а) культивирование прокариотической клетки-хозяина, где прокариотическая клетка-хозяин трансформирована нуклеиновой кислотой, кодирующей указанный рекомбинантный белок, и (б) выделение рекомбинантного белка в условиях, где уровень растворенного кислорода (dO₂) превышает 0%, и (в) очистку указанного рекомбинантного белка до отфильтрованного препарата для хранения (FBS), где указанный отфильтрованный препарат не содержит детектируемых количеств аддукта рекомбинантного белка и 1,4-дигидрокси-2-нафтоата (DHNA) по данным ионообменной хроматографии (IEC) при 310 нм. В одном варианте осуществления в способе, описанном выше, аналитическим анализом является метод HPLC, RP HPLC, HIC HPLC, ЯМР, масс-спектрометрии или УФ-спектроскопии.

Настоящее изобретение относится к способу получения рекомбинантного белка, включающему (а) культивирование прокариотической клетки-хозяина, где прокариотическая клетка-хозяин трансформирована нуклеиновой кислотой, кодирующей указанный рекомбинантный белок, и (б) выделение указанного рекомбинантного белка в условиях, где уровень dO₂ превышает 0%, и (в) очистку указанного рекомбинантного белка до FBS, где отфильтрованный препарат не содержит детектируемых количеств аддукта рекомбинантного белка и DHNA по данным анализа IEC при 310 нм, где рекомбинантный белок представляет собой рекомбинантный полипептид или выделенное антитело.

Настоящее изобретение относится к способу получения рекомбинантного белка, включающему (а) культивирование прокариотической клетки-хозяина, где прокариотическая клетка-хозяин трансформирована нуклеиновой кислотой, кодирующей указанный рекомбинантный белок, и (б) выделение рекомбинантного белка в условиях, где уровень dO₂ превышает 0%, и (в) очистку указанного рекомбинантного белка до FBS, где отфильтрованный препарат не содержит детектируемых количеств аддукта рекомбинантного белка и DHNA по данным анализа IEC при 310 нм, где культивирование не зависит от масштаба культивирования.

Настоящее изобретение относится к способу получения рекомбинантного белка, включающему (а) культивирование прокариотической клетки-хозяина, где прокариотическая клетка-хозяин трансформирована нуклеиновой кислотой, кодирующей указанный рекомбинантный белок, и (б) выделение рекомбинантного белка в условиях, где уровень dO₂ превышает 0%, и (в) очистку указанного рекомбинантного белка до FBS, где отфильтрованный препарат не содержит детектируемых количеств аддукта рекомбинантного белка и DHNA по данным анализа IEC при 310 нм, где прокариотической клеткой-хозяином является Escherichia coli (Е. coli), Enterobacter, Azotobacter, Erwinia, Bacillus, Pseudomonas, Klebsiella, Proteus, Salmonella, Serratia, Shigella, Rhizobia, Vitreoscilla и Paracoccus. Настоящее изобретение относится к способу получения рекомбинантного белка, включающему (а) культивирование прокариотической клетки-хозяина, где прокариотическая клетка-хозяин трансформирована нуклеиновой кислотой, кодирующей указанный рекомбинантный белок, и (б) выделение рекомбинантного белка в условиях, где уровень dO₂ превышает 0%, и (в) очистку указанного рекомбинантного белка до FBS, где отфильтрованный препарат не содержит детектируемых количеств аддукта рекомбинантного белка и DHNA по данным анализа IEC при 310 нм, где dO₂ поддерживается на уровне превышает 0%, непрерывно в ходе процедуры выделения стадии (б). В одном варианте осуществления изобретения в способе, описанном выше, процедуры выделения включают стадию гомогенизации. В другом варианте осуществления dO₂ поддерживают на уровне от примерно 30% до примерно 75% до гомогенизации. В еще одном варианте осуществления dO₂ поддерживают на уровне более 75% до гомогенизации. В еще одном варианте осуществления dO₂ поддерживают на уровне примерно 50% после гомогенизации. В другом варианте осуществления dO₂ поддерживают на уровне более 50% после гомогенизации. В одном варианте осуществления уровень dO₂ поддерживают в течение периода, больше или равного 1,5 часам. В еще одном варианте осуществления dO₂ поддерживают в течение периода, больше или равного 2 часам.

Настоящее изобретение относится к способу получения рекомбинантного белка, включающему (а) культивирование прокариотической клетки-хозяина, где прокариотическая клетка-хозяин трансформирована нуклеиновой кислотой, кодирующей указанный рекомбинантный белок, и (б) выделение рекомбинантного белка в условиях, где уровень dO₂ превышает 0%, и (в) очистку указанного рекомбинантного белка до FBS, где отфильтрованный препарат не содержит детектируемых количеств аддукта рекомбинантного белка и DHNA по данным анализа IEC при 310 нм, где dO₂ поддерживают с использованием нагнетаемого в пространство над средой воздуха или барботажного воздуха, увеличением противодавления или с помощью перемешивания (т.е. смешивания). В одном варианте осуществления количество нагнетаемого в пространство над средой воздуха составляет от примерно 0,4 до примерно 0,8 vvm. В другом варианте осуществления количество нагнетаемого в пространство над средой воздуха ориентировано на 0,6 vvm (объемов воздуха на объем жидкой среды в минуту). В другом варианте осуществления увеличенное противодавление составляет от примерно 1,0 до примерно 30 фунтов на квадратный дюйм. В одном варианте осуществления увеличенное противодавление ориентировано на 19 фунтов на квадратный дюйм. В еще одном варианте осуществления скорость перемешивания составляет от примерно 6 Вт/л до примерно 8 Вт/л. В еще одном варианте осуществления скорость перемешивания составляет, по меньшей мере, 6 Вт/л. В другом варианте осуществления скорость перемешивания ориентирована на 6 Вт/л.

В другом аспекте настоящего изобретения предложен способ получения рекомбинантного белка, включающий (а) культивирование прокариотической клетки-хозяина с делецией гена menE, где указанная прокариотическая клетка-хозяин трансформирована нуклеиновой кислотой, кодирующей указанный рекомбинантный белок, (б) выделение рекомбинантного белка и (в) очистку указанного рекомбинантного белка до FBS, где отфильтрованный препарат не содержит детектируемых количеств аддукта рекомбинантного белка и DHNA по данным анализа IEC при 310 нм. В еще одном варианте осуществления способа, описанного выше, выход рекомбинантного белка увеличен примерно на 20% или более, примерно на 30% или более, примерно на 40% или более, примерно на 50% или более, примерно на 60% или более по сравнению с выходом при использовании контрольной прокариотической клетки-хозяина.

В другом аспекте настоящего изобретения предложен способ получения рекомбинантного белка, включающий (а) культивирование прокариотической клетки-хозяина с делецией гена menE, где указанная прокариотическая клетка-хозяин трансформирована нуклеиновой кислотой, кодирующей указанный рекомбинантный белок, и (б) выделение рекомбинантного белка и (в) очистку указанного рекомбинантного белка до FBS, где отфильтрованный препарат не содержит детектируемых количеств аддукта рекомбинантного белка и DHNA по данным анализа IEC при 310 нм, где выход рекомбинантного белка увеличен примерно на 20% или более, примерно на 30% или более, примерно на 40% или более, примерно на 50% или более, примерно на 60% или более по сравнению с выходом при использовании контрольной прокариотической клетки-хозяина, где культивирование не зависит от масштаба культивирования.

В другом аспекте настоящего изобретения предложен способ получения рекомбинантного белка, включающий (а) культивирование прокариотической клетки-хозяина с делецией гена menE, где указанная прокариотическая клетка-хозяин трансформирована нуклеиновой кислотой, кодирующей указанный рекомбинантный белок, и (б) выделение рекомбинантного белка и (в) очистку указанного рекомбинантного белка до FBS, где отфильтрованный препарат не содержит детектируемых количеств аддукта рекомбинантного белка и DHNA по данным анализа IEC при 310 нм, где выход рекомбинантного белка увеличен примерно на 20% или более, примерно на 30% или более, примерно на 40% или более, примерно на 50% или более, примерно на 60% или более по сравнению с выходом с использованием контрольной прокариотической клетки-хозяина, где указанный рекомбинантный белок является полипептидом или выделенным антителом.

В другом аспекте настоящего изобретения предложен способ получения рекомбинантного белка, включающий (а) культивирование прокариотической клетки-хозяина с делецией гена menE, где указанная прокариотическая клетка-хозяин трансформирована нуклеиновой кислотой, кодирующей указанный рекомбинантный белок, и (б) выделение рекомбинантного белка и (в) очистку указанного рекомбинантного белка до FBS, где отфильтрованный препарат не содержит детектируемых количеств аддукта рекомбинантного белка и DHNA по данным анализа IEC при 310 нм, где выход рекомбинантного белка увеличен примерно на 20% или более, примерно на 30% или более, примерно на 40% или более, примерно на 50% или более, примерно на 60% или более по сравнению с выходом с использованием контрольной прокариотической клетки-хозяина, где указанной прокариотической клеткой-хозяином является Escherichia coli (Е. coli), Enterobacter, Azotobacter, Erwinia, Bacillus, Pseudomonas, Klebsiella, Proteus, Salmonella, Serratia, Shigella, Rhizobia, Vitreoscilla и Paracoccus.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

На фигуре 1 показаны результаты анализа прозрачности, опалесценции и окраски (анализ СОС) для трех партий, где две партии, партия 2 и партия 3, не соответствовали ожидаемым результатам анализа СОС. PW = очищенная вода, С = контроль опытной партии, 1 = партия 1, 2 = партия 2 и 3 = партия 3.

Фигура 2А показывает спектр поглощения в УФ/видимом спектре (10 см) - ближний УФ для партий 1-3. Новые пики поглощения, которых не наблюдали для партии 1, наблюдали примерно при 320 нм и при 460 нм. Фигура 2В показывает УФ/видимый спектр для партии 3 после вычитания спектра партии 1, где можно видеть разницу пиков поглощения партий 2 и 3 и партии 1.

На Фигуре 3 показан анализ IEC при 310 нм для партий 1-3. Небольшой пик-плечо позади главного пика наблюдали в партиях 2 и 3, в то время как профиль для партии 1 сопоставим со стандартным материалом.

Фигура 4 показывает результаты анализа 2D LC-MS интактных партий 1-3 с детекцией при 280 нм и 310 нм. Для партии 1 наблюдали расчетную массу, в то время как для партий 2 и 3 наблюдали ожидаемую массу и дополнительную массу в 157 дальтон.

Фигура 5 демонстрирует 2D-LC-MS и масс-идентификацию триптической пептидной карты с MS детекцией собранной фракции коричневого аддукта (собирали минорные пики из анализа IEC). В анализе 2D LC-MS в дополнение к ожидаемой массе наблюдали массу +156 Да для выделенного пика плеча.

Фигура 6 показывает анализ LC-MS-MS нового пика коричневого аддукта, наблюдаемого на 48,8 минуте при 310 нм, который определили как пептид Т20, в котором Cys182 модифицирован фрагментом с массой 154,006 дальтон. Модифицированные (по цистеину, +154,006 Да) и свободные пептиды Т6 и Т16 также были обнаружены при разделении масс.

Фигура 7 сравнивает данные HSQC 1H-15N продукта и синтетического пептида (NH₂-IVQCR-COOH) и показывает, что в образце продукта отсутствовала корреляция Cys NH.

На Фигуре 8 показаны данные, позволяющие предположить структуру, подтверждаемую сильным nOe, наблюдаемым между СН Cys и NH аргинина.

На основании объединенных данных ЯМР предлагаемая структура коричневого аддукта представлена на Фигуре 9.

На Фигуре 10 показан путь биосинтеза менахинонов в клетках прокариот.

На Фигуре 11 показан репрезентативный пример отфильтрованного препарата рекомбинантного продукта, проверенный на формирование коричневого аддукта с помощью ионообменной хроматографии при 310 нм, и не показавший измеримого количества аддукта.

На Фигуре 12 показан пример схемы усовершенствованного процесса Hi-dO, реализуемого при процедурах выделения.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

I. ОПРЕДЕЛЕНИЯ

Если не указано иное, следующие термины и фразы, используемые здесь, имеют следующие значения.

Термин «скорость перемешивания» означает перемешивание жидкости для культивирования или гомогената, которое, как правило, измеряют в оборотах в минуту (RPM). В одном варианте осуществления скорость перемешивания может быть измерена в «мощности на единицу объема». Например, при 200 оборотах в минуту в 1000-литровом ферментере скорость перемешивания составляет примерно 6 Вт/л.

Термин «антитело» в данном документе используется в самом широком смысле, и, в частности, охватывает моноклональные антитела, поликлональные антитела, мультиспецифические антитела (например, биспецифические антитела) и фрагменты антител, при условии, что они проявляют желаемую биологическую активность.

Антитела могут быть мышиными, человеческими, гуманизированными, химерными или полученными из других видов. Термин «антитело», используемый в настоящем документе, относится также к полноразмерной молекуле иммуноглобулина или к иммунологически активной части полноразмерной молекулы иммуноглобулина, то есть к молекуле, которая содержит антигенсвязывающий сайт, который иммуноспецифически связывается с антигеном интересующей мишени, или его часть, такие мишени включают, но не ограничиваются ими, раковые клетки или клетки, которые продуцируют антитела, связанные с аутоиммунным заболеванием. Иммуноглобулины, описанные здесь, могут относится к любому типу (например, IgG, IgE, IgM, IgD и IgA), классу (например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2) или подклассу молекул иммуноглобулинов. Иммуноглобулины могут быть получены из любых видов. В одном аспекте, однако, иммуноглобулин происходит из человека, мыши или кролика.

«Фрагменты антител» включают часть полноразмерного антитела, как правило, связывающую антиген часть или вариабельные области антитела. Примеры фрагментов антител включают фрагменты Fab, Fab', F(ab')2 и Fv; диатела; линейные антитела; фрагменты, полученные с помощью экспрессионной библиотеки Fab, антиидиотипические (анти-Id) антитела, CDR (участки, определяющие комплементарность), связывающие ECD (внеклеточный домен) и связывающие эпитоп фрагменты любых вышеупомянутых молекул, которые иммуноспецифически связываются с антигеном раковых клеток, вирусным антигеном или микробным антигеном, молекулы одноцепочечных антител; и мультиспецифические антитела, образованные фрагментами.

«Анализ прозрачности, опалесценции и окраски» (СОС) проводят с использованием идентичных пробирок из бесцветного, прозрачного, нейтрального стекла с плоским основанием и внутренним диаметром 15-25 мм, где сравниваемые жидкости должны быть рассмотрены вместе со свежеполученной контрольной суспензией, приготовленной так, как описано ниже, глубина слоя должна составлять 40 мм. Для надлежащей оценки цвета могут быть использованы стандартные окрашенные растворы, перечисленные в фармакопее США 2012 (USP Monograph 631, Color and Achromicity) или в Европейской Фармакопее 5.0 (ЕР Method 2.2.2, Degree of Coloration of Liquids).

Термин «1,4-дигидрокси-2-нафтоат» (DHNA) означает химический продукт, полученный из клеток E. coli. Okada Y, Tsuzuki Y, Miyazaki J, Matsuzaki K, Hokari R, Komoto S, et al. (2006) Gut 55: 681-8. DHNA является промежуточным продуктом в пути биосинтеза менахинона (МК), также известного как витамин К2, в клетках E. coli. Neidhardt, F.C. (2010) Escherichia coli and Salmonella (версия он-лайн: Module 3.2.2 pgs. 36-37); Inledew, W.J. & R.K. Poole (1984) The respiratory chains of Escherichia coli. Microbiological reviews. 48: 222-271; Nowicka, B. & J. Cruk (2010) Occurrence, Biosynthesis and Function of Isoprenoid Quinones. Biochimica et Biophysica Acta 1797: 1587-1605.

Термин «содержание растворенного кислорода» (dO₂) представляет собой относительное измерение количества кислорода, который растворен или содержится в данной среде. Оно может быть измерено с помощью растворимого сенсора кислорода, такого как сенсор кислорода в жидких средах.

Термин «культивирование» или «ферментация», используемый в настоящем документе, означает процесс выращивания прокариотических клеток-хозяев, которые были трансформированы для получения интересующего рекомбинантного белка

Термин «отфильтрованный препарат» или «вещество отфильтрованного препарата» (FBS) означает продукт интересующего рекомбинантного белка после выделения и очистки, где белок был высвобожден из клетки-хозяина, центрифугирован и/или отфильтрован для удаления клеточного дебриса, далее очищен на подходящих хроматографических колонках, а затем сконцентрирован путем процесса фильтрации. Термин «собранная жидкость для культивирования», также обозначенный как HCCF, означает жидкость для культивирования прокариотических или эукариотических клеток, из которой эти клетки были удалены, в том числе путем центрифугирования или фильтрации. Культивирование клеток является процессом, при котором либо прокариотические, либо эукариотические клетки выращивают в контролируемых условиях. Термин «культура клеток» относится к культивированию клеток, полученных из многоклеточных эукариот, в том числе клеток животных, или одноклеточных прокариот, в том числе бактерий и дрожжей. Культуры эукариотических клеток включают клетки млекопитающих, такие как клетки яичника китайского хомячка, гибридомы и клетки насекомых. При использовании подходящей емкости для культивирования клеток, секретируемые белки могут быть получены из клеток прикрепленных клеточных линий или суспензионных клеточных линий. Культуры клеток млекопитающих включают клетки яичника китайского хомячка (СНО) или клетки Ns0.

Термин «процедуры выделения» или «выделение» означает, без ограничения, процесс, включающий лизис или гомогенизацию, а затем центрифугирование и/или фильтрацию культивируемой культуры прокариотических клеток-хозяев, которые были трансформированы для получения интересующего рекомбинантного белка, чтобы начать выделение и очистку указанного интересующего белка.

Термин «Hi-dO», используемый в настоящем документе, относится к улучшенным способам, описанным в настоящем документе, и заключается в поддержании уровня растворенного кислорода более 0% в ходе процедур выделения. Для достижения этой цели настоящее изобретение включает сочетание нагнетаемого в пространство над средой воздуха, противодавления и скорости перемешивания, которые могут использоваться для поддержания dO₂ на уровне или выше заданного значения, то есть выше 0%, или от примерно 30% до примерно 75%, или на уровне более 75%, или примерно 50%, или на уровне более 50%. В другом варианте осуществления специалист в данной области техники может также использовать барботирование воздухом или чистым кислородом среды непосредственно для достижения уровня растворенного кислорода Hi-dO, превышающего 0%.

Термин «гомогенизация», используемый в настоящем документе, означает процесс лизиса или механического лизиса прокариотических клеток-хозяев, трансформированных нуклеиновой кислотой, кодирующей интересующий рекомбинантный белок, чтобы высвободить указанный белок из клетки-хозяина. Термин «увеличение противодавления» используется для обозначения увеличения скорости переноса кислорода через среду для культивирования. Противодавление, как правило, измеряется либо в фунтах на квадратный дюйм, либо в барах.

«Менахиноны» (МК) являются гомологами витамина К2 и выполняют функцию молекул переносчиков электронов в дыхательной цепи между связанными с мембраной белковыми комплексами в микро-аэробных и/или анаэробных условиях. Термин «menE» означает ген в пути биосинтеза менахинонов.

Термин «культивирование микроорганизмов» означает культуру клеток бактерий или дрожжей, которые были изменены с помощью генной инженерии для получения белков и низкомолекулярных соединений (например, вторичных метаболитов). Культивирование используется для размножения рекомбинантных бактерий и дрожжей, а также других микроорганизмов, и образования целевых белков. Производительность и рост клеток этих организмов оптимизируют путем подачи конкретных питательных сред и контроля различных факторов окружающей среды (например, pH, температура и аэрация). Жидкость после культивирования бактерий может быть получена из культуры E. coli.

Термин «моноклональное антитело», используемый в настоящем документе, относится к антителу, полученному из популяции по существу гомогенных антител, т.е. индивидуальные антитела, составляющие популяцию, являются идентичными за исключением возможных природных мутаций, которые могут присутствовать в незначительных количествах. Моноклональные антитела являются высоко специфичными, направленными против одного антигенного сайта. Кроме того, в отличие от препаратов поликлональных антител, которые включают различные антитела, направленные против различных детерминант (эпитопов), каждое моноклональное антитело направлено против одной детерминанты на антигене. В дополнение к их специфичности, моноклональные антитела обладают тем преимуществом, что они могут быть синтезированы без загрязнения другими антителами. Термин «моноклональное» указывает на характер антитела, полученного из по существу гомогенной популяции антител, и не должно быть истолковано как антитело, требующее получения любым конкретным способом. Например, моноклональные антитела, которые будут использоваться в соответствии с настоящим изобретением, могут быть получены методом гибридом, впервые описанным Kohler et al (1975) Nature 256: 495, или могут быть получены методами рекомбинантных ДНК (патент США 4816567). «Моноклональные антитела» также могут быть выделены из фаговых библиотек антител с использованием способов, описанных, например, в Clackson et al (1991) Nature, 352: 624-628; Marks et al (1991) J. Mol. Biol., 222: 581-597. Термин «нагнетаемый в пространство над средой воздух» означает воздух, подаваемый в верхнюю части ферментера, содержащего среду с культурой. Как правило, кислород подают в ферментер барботированием воздуха через жидкую среду для культивирования, что часто сопровождается интенсивным перемешиванием, чтобы создать дисперсию мелких пузырей.

Термин «прокариотическая клетка-хозяин», используемый в настоящем изобретении, включает хозяев, которые используют путь биосинтеза менахинона. В одном варианте осуществления прокариотические клетки-хозяева включают, например, Archaebacteria и Eubacteria, такие как грамотрицательные или грамположительные организмы. Примеры подходящих бактерий включают Escherichia (например, Е. coli), Bacilli (например, В. subtilis), Enterobacteria, виды Pseudomonas (например, P. aeruginosa), Salmonella typhimurium, Serratia marcescans, Klebsiella, Proteus, Shigella, Rhizobia, Vitreoscilla или Paracoccus. В одном варианте осуществления используются грамотрицательные клетки. В другом варианте в качестве хозяев для изобретения используют клетки E. coli (Bachmann, Cellular and Molecular Biology, vol. 2 (Washington, D.C.: American Society for Microbiology, 1987), pp. 1190-1219; ATCC Deposit No. 27,325) и их производные, включая штамм 33D3, имеющий генотип W3110 ΔfhuA (ΔtonA) ptr3 lacIq lacL8 ΔompT Δ(nmpC-fepE) degP41 kanR (патент США 5639635). Конечно, также подходят другие штаммы и их производные, такие как E. coli 294 (ATCC 31446), E. coli В, Е. coliλ 1776 (ATCC 31537) и E. coli RV308 (ATCC 31608). Эти примеры являются иллюстративными, а не ограничивающими. Способы создания производных любой из вышеуказанных бактерий, имеющих определенные генотипы, известны в данной области и описаны, например, Bass et al. (1990) Proteins, 8: 309-314. Конечно, необходимо выбрать подходящие бактерии с учетом воспроизводимости репликона в клетках бактерии. Например, виды E. coli, Serratia или Salmonella подходят для использования в качестве хозяина, если для обеспечения репликона используют хорошо известные плазмиды, такие как pBR322, pBR325, pACYC177 или pKN410.

Используемый в настоящем документе термин «рекомбинантный белок» относится в целом к пептидам и белкам, в том числе антителам. Такие рекомбинантные белки «гетерологичны», то есть являются чужеродными к используемой клетке-хозяину, примером является человеческий белок, полученный с использованием E. coli. Полипептид может быть получен в виде нерастворимого агрегата или в виде растворимого полипептида в периплазматическом пространстве или в цитоплазме.

Термин «не зависит от масштаба культивирования» означает, что процесс культивирования в варианте осуществления настоящего изобретения может быть выполнен в емкости любого объема, такого как, например, от примерно 1 литра или более, или примерно 10 литров или более, или примерно 100 литров или более, или примерно 500 литров или более, или примерно 1000 литров или более, или примерно 10000 литров или более или примерно 100000 литров или более.

II. СПОСОБЫ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к усовершенствованным способам рекомбинантного получения белков в прокариотической системе. Изобретение основано на предотвращении образования коричневого аддукта, обнаруживаемого в ходе получения рекомбинантного белка, которое приводит к несоответствию некоторого количества продукта техническим требованиям. Как показано в представленных здесь примерах, проблема коричневого аддукта является результатом нестабильного окислительно-восстановительного потенциала во время процедур выделения. Было неожиданно обнаружено, что образование коричневого аддукта может быть предотвращено путем поддержания уровня растворенного кислорода, превышающего ноль, во время процедур выделения или, в качестве альтернативы, путем делеции гена menE в геноме прокариотической клетки-хозяина, используемой для рекомбинантного получения интересующего рекомбинантного белка.

Рекомбинантное получение рекомбинантных белков в прокариотических клетках На первой стадии указанного выше способа гетерологичную нуклеиновую кислоту (например, кДНК или геномную ДНК), используемую для получения интересующего рекомбинантного белка, соответствующим образом встраивают в реплицируемый вектор для экспрессии в бактерии под контролем подходящего для бактерии промотора. Для этой цели подходит множество векторов, и выбор соответствующего вектора зависит главным образом от размера нуклеиновой кислоты, которую будут вставлять в вектор, и конкретной клетки-хозяина, которую будут трансформировать вектором. Каждый вектор содержит различные компоненты в зависимости от его функции (амплификация ДНК или экспрессия ДНК) и конкретной клетки-хозяина, с которой он совместим. Компоненты вектора для трансформации бактерий могут включать сигнальную последовательность для гетерологичного полипептида, сигнальную последовательность, а также индуцируемый промотор для гетерологичного полипептида. Они также обычно включают участок начала репликации и один или несколько маркерных генов, описанных в настоящем документе.

Если гетерологичный полипептид должен секретироваться, ДНК, кодирующая интересующий гетерологичный полипептид, содержит сигнальную последовательность, например, на N-конце зрелого гетерологичного полипептида. В общем, сигнальная последовательность может быть компонентом вектора, или она может быть частью ДНК гетерологичного полипептида, которая встроена в вектор. Гетерологичная сигнальная последовательность должны быть выбрана так, чтобы ее могла распознавать и процессировать (например, расщеплять сигнальной пептидазой) клетка-хозяин. Для бактериальных клеток-хозяев, которые не распознают и не процессируют нативную сигнальную последовательность гетерологичного полипептида, сигнальная последовательность может быть заменена любой из широко известных бактериальных сигнальных последовательностей.

Экспрессионные векторы содержат нуклеотидную последовательность, которая позволяет вектору реплицироваться в одном или нескольких выбранных клетках-хозяевах. Такие последовательности хорошо известны для различных бактерий. Участок начала репликации из плазмиды pBR322 подходит для большинства грамотрицательных бактерий.

Экспрессионные векторы обычно также содержат ген для селекции, также называемый селективным маркером. Этот ген кодирует белок, необходимый для выживания или роста трансформированных клеток-хозяев, выращиваемых в селективной среде для культивирования. Клетки-хозяева, не трансформированные вектором, содержащим ген для селекции, не выживут в среде для культивирования. Типичные гены для селекции кодируют белки, которые (а) придают устойчивость к антибиотикам или другим токсинам, например, ампициллину, неомицину, метотрексату или тетрациклину, (б) дополняют ауксотрофную недостаточность или (в) обеспечивают доступность необходимых питательных веществ, не доступных из сложных сред, например, ген, кодирующий D-аланинрацемазу для Bacilli. Один из примеров схемы селекции включает использование лекарственного средства для остановки роста клетки-хозяина. Те клетки, которые успешно трансформированы гетерологичным геном, продуцируют белок, обеспечивающий резистентность к лекарственным средствам и, таким образом, выживают при селекции. Экспрессионный вектор для получения гетерологичного полипептида также содержит индуцируемый промотор, который распознается бактериальным организмом-хозяином, и который функционально связан с нуклеиновой кислотой, кодирующей интересующий гетерологичный полипептид. Вектор также содержит отдельный индуцируемый промотор или промотор с низким базовым уровнем экспрессии, функционально связанный с нуклеиновой кислотой, кодирующей литические ферменты. Индуцируемые промоторы, пригодные для использования с бактериальными хозяевами, включают бета-лактамазные и лактозные промоторные системы (Chang et al., Nature, 275: 615 (1978); Goeddel et al., Nature, 281: 544 (1979)), арабинозные промоторные системы, в том числе промотор araBAD (Guzman et al., J. Bacteriol., 174: 7716-7728 (1992); Guzman et al., J. Bacteriol., 177: 4121-4130 (1995); Siegele and Hu, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94: 8168-8172 (1997)), рамнозный промотор (Haldimann et al., J. Bacteriol., 180: 1277-1286 (1998)), промотор щелочной фосфатазы, триптофановую (trp) промоторную систему (Goeddel, Nucleic Acids Res., 8: 4057 (1980) и ЕР 36,776), промоторы P.sub.LtetO-1 и P.sub.lac/are-1 (Lutz and Bujard, Nucleic Acids Res., 25: 1203-1210 (1997)) и гибридные промоторы, такие как промотор tac, deBoer et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 80: 21-25 (1983). Тем не менее, также подходят другие известные бактериальные индуцируемые промоторы и промоторы с низким базовым уровнем экспрессии. Их нуклеотидные последовательности опубликованы, тем самым предоставляя квалифицированному специалисту возможность функционально лигировать их с ДНК, кодирующей интересующий гетерологичный полипептид, или с нуклеиновой кислотой, кодирующей литические ферменты (Siebenlist et al., Cell, 20: 269 (1980)), используя линкеры или адаптеры для создания любых необходимых сайтов рестрикции. Если используется сильный промотор с высоким уровнем базальной экспрессии, такой как промотор trp, как правило, его используют только для экспрессии нуклеиновой кислоты, кодирующей гетерологичный полипептид, а не для нуклеиновой кислоты, кодирующей литический фермент. Промоторы tac и PL могут быть использованы по отдельности для всех компонентов, но не оба вместе. В одном варианте осуществления используют промотор щелочной фосфатазы (phoA) для продукта и арабинозный промотор (ara) для литических ферментов.

Промоторы для использования в бактериальных системах также обычно содержат последовательность Шайна-Дальгарно (SD), функционально связанную с ДНК, кодирующей интересующий гетерологичный полипептид. Промотор может быть удален из исходной бактериальной ДНК с помощью расщепления ферментом рестрикции и вставлен в вектор, содержащий желаемую ДНК. Промотор phoA может быть удален из исходного источника бактериальной ДНК с помощью ферментов рестрикции и вставлен в вектор, содержащий желаемую ДНК.

Создание подходящих векторов, содержащих один или более из перечисленных выше компонентов, включает использование стандартных способов лигирования, широко известных специалистам в данной области. Выделенные плазмиды или фрагменты ДНК расщепляют, обрабатывают и повторно лигируют в требуемом виде для получения требуемой плазмиды.

Подходящие прокариотические клетки-хозяева для заявленного изобретения включают любые клетки-хозяева, которые используют пути биосинтеза менахинонов, как это определено в настоящем документе. Некоторые неограничивающие примеры включают, например, Escherichia coli (Е. coli), Enterobacter, Azotobacter, Erwinia, Bacillus, Pseudomonas, Klebsiella, Proteus, Salmonella, Serratia, Shigella, Rhizobia, Vitreoscilla и Paracoccus. Трансформация означает введение ДНК в прокариотического хозяина таким образом, что ДНК является реплицируемой, либо в виде внехромосомного элемента, либо в виде вставки в хромосому. В зависимости от используемой клетки-хозяина, трансформация осуществляется с использованием стандартных методов, подходящих для таких клеток. Обработку кальцием с использованием хлорида кальция, как правило, используют для бактериальных клеток, которые имеют существенные барьеры в виде клеточных стенок. В другом способе трансформации используют полиэтиленгликоль/ДМSO. Еще одним способом является электропорация.

Прокариотические клетки, используемые для получения полипептидов согласно изобретению, выращивают в среде, известной в данной области техники и подходящей для культивирования выбранных клеток-хозяев. Примеры подходящих сред включают среду Luria-Bertani (LB) и необходимые питательные добавки. В некоторых вариантах осуществления среда также содержит агент для селекции, выбранный на основе конструкции экспрессионного вектора, избирательно позволяющий расти прокариотическим клеткам, содержащим экспрессионный вектор. Например, ампициллин добавляют в среду для роста клеток, экспрессирующих ген устойчивости к ампициллину. Любые необходимые добавки, кроме углерода, азота и неорганического фосфата, также могут быть добавлены в соответствующих концентрациях, они введены по отдельности или в виде смеси с другой добавкой или средой, такой как комплексный источник азота.

Для накопления экспрессированного продукта гена клетку-хозяина культивируют в условиях, достаточных для накопления продукта гена. Такие условия включают, например, определенную температуру, определенные питательные вещества и определенные условия плотности клеток, которые позволяют происходить экспрессии белка и его накоплению в клетке. Кроме того, условия являются такими, при которых клетка может выполнять основные клеточные функции транскрипции, трансляции и перемещения белков из одного компартмента клетки в другой для секретируемых белков, которые известны специалистам в данной области техники.

Прокариотические клетки-хозяева культивируют при подходящей температуре. Для роста Е. coli, например, типичный диапазон температур составляет от примерно 20°С до примерно 39°С. В одном варианте осуществления изобретения температура составляет от примерно 25°С до примерно 37°С. В другом варианте осуществления температура составляет примерно 30°С.

pH среды для культивирования может быть любым pH в диапазоне 5-9, в зависимости, главным образом, от организма-хозяина. Для Е. coli pH составляет от примерно 6,8 до примерно 7,4, или примерно 7,0.

Для индукции, как правило, клетки культивируют до тех пор, пока не достигается определенная оптическая плотность, например, А550 примерно 80-100, после этого осуществляют индукцию (например, добавлением индуктора, истощением репрессора, супрессора или компонента среды и т.д.), чтобы индуцировать экспрессию гена, кодирующего гетерологичный полипептид.

После накопления продукта, необязательно, перед выделением продукта лизат культуры инкубируют в течение периода времени, достаточного, чтобы высвободить гетерологичный полипептид, содержащийся в клетках. В альтернативном варианте осуществления, или после предыдущего этапа, клетки, присутствующие в культуре, можно лизировать механически, с помощью любых механических средств, известных в данной области, которые могут включать, например, химический лизис или осмотический шок, чтобы высвободить указанный белок из клеток-хозяев.

После лизиса лизат или гомогенат может быть перенесен в емкость для хранения, куда могут быть добавлены дополнительные порции лизата/гомогената и/или, где может иметь место дальнейшая обработка, такая как, например, разбавление водой, добавление буферных растворов или флокулянтов, регуляторов pH, изменение или поддержание температуры лизата/гомогената для подготовки к последующим действиям по выделению.

На последующем этапе гетерологичный полипептид в виде растворимого или нерастворимого продукта, высвобожденного из клеточного матрикса, выделяют из лизата или гомогената, таким образом, чтобы свести к минимуму совместное выделение клеточного дебриса с продуктом. Выделение может быть осуществлено с помощью любых средств, но в одном варианте осуществления выделение может включать осаждение преломляющих свет частиц, содержащих гетерологичный полипептид, или сбор супернатанта, содержащего растворимый продукт. Примером осаждения является центрифугирование. В этом случае выделение происходит перед адсорбцией на слой вспученного адсорбента (ЕВА) или осаждением, в присутствии агента, который разрушает наружную клеточную стенку, чтобы увеличить проницаемость, и позволяет выделить больше нерастворенных частиц. Примеры таких агентов включают хелатирующий агент, такой как этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА), или цвиттер-ионы, такие как, например, дипольный ионный детергент, такой как детергент Zwittergent 316 ТМ. В одном варианте осуществления выделение происходит в присутствии ЭДТА.

Если для выделения используют центрифугирование, важным фактором является центробежное ускорение (RCF). Ускорение выбирают, чтобы свести к минимуму свести совместное осаждение клеточного дебриса с преломляющими свет частицами, высвобожденными из клеточной стенки при лизисе. Конкретное RCF, используемое для этой цели, будет зависеть, например, от типа продукта, который выделяют, но составляет, по меньшей мере, примерно 3000×g, более предпочтительно примерно 3500-6000×g или примерно 4000-6000×g.

Продолжительность центрифугирования зависит от нескольких факторов. Скорость оседания зависит, например, от размера, формы и плотности собираемых частиц, плотности и вязкости жидкости. Время оседания для твердых веществ зависит, например, от расстояния оседания и скорости. Разумно ожидать, что тарельчатая центрифуга-сепаратор непрерывного действия будет хорошо работать для выделения высвобожденного гетерологичного полипептида или агрегатов, или для удаления клеточных остатков в большом масштабе, так как эти центрифуги могут обрабатывать жидкости при высоких скоростях вследствие их сравнительно большого центробежного ускорения и относительно небольшого расстояния осаждения.

Гетерологичный полипептид, полученный на начальной стадии выделения, может быть затем дополнительно очищен от загрязняющих белков. В одном варианте осуществления агрегированный гетерологичный полипептид выделяют, затем одновременно растворяют и проводят рефолдинг полипептида, как описано в патенте US 5288931. В другом случае растворимый продукт выделяют с помощью стандартных способов, как описано ниже.

Хроматографические методы и их применение известны специалистам в данной области. См., например, Chromatography, 5th edition, Part A: Fundamentals and Techniques, Heftmann, E. (ed), Elsevier Science Publishing Company, New York, (1992); Advanced Chromatographic and Electromigration Methods in Biosciences, Deyl, Z. (ed.), Elsevier Science BV, Amsterdam, The Netherlands, (1998); Chromatography Today, Poole, C.F., and Poole, S.K., Elsevier Science Publishing Company, New York, (1991); Scopes, Protein Purification Principles and Practice (1982); Sambrook, J., et al. (ed), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989; or Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, F.M., et al. (eds), John Wiley & Sons, Inc., New York. Следующие процедуры являются примерами подходящих способов очистки растворимого гетерологичного полипептида, полученного из периплазмы или цитоплазмы, и они хорошо известны специалистам в данной области техники: фракционирование на иммуноаффинных или ионообменных колонках; осаждение этанолом; RP-HPLC; хроматография на силикагеле или на катионообменной смоле, такой как DEAE; хроматофокусирование; SDS-PAGE; осаждение сульфатом аммония и гель-фильтрация с использованием, например, SEPHADEX™ G-75.

В одном аспекте настоящего изобретения получение антител проводят в большом масштабе в процессе культивирования. Для получения рекомбинантных белков доступны различные крупномасштабные процедуры периодического культивирования с добавлением субстрата. Крупномасштабное культивирование осуществляется в объеме, по крайней мере, 1000 литров, предпочтительно, примерно от 1000 до 100000 литров. Эти ферментеры используют лопастные мешалки для распределения кислорода и питательных веществ, особенно глюкозы (предпочтительный источник углерода/энергии). Культивирование в малом объеме в целом относится к культивированию в ферментере с вместимостью не более чем примерно 20 литров.

Как обсуждалось в данном документе, заявленное изобретение может быть использовано для получения рекомбинантных белков, в том числе, например, пептидов и белков, в том числе антител.

Примеры рекомбинантных пептидов и белков, которые могут быть получены с помощью способа согласно изобретению, включают, но не ограничиваются ими, молекулы, такие как, например, ренин, гормон роста, в том числе гормон роста человека; бычий гормон роста; рилизинг-фактор гормона роста; паратгормон; тиреотропный гормон; липопротеины; α1-антитрипсин; А-цепь инсулина; В-цепь инсулина; проинсулин; тромбопоэтин; фолликулостимулирующий гормон; кальцитонин; лютеинизирующий гормон; глюкагон; факторы свертывания крови, такие как фактор VIIIC, фактор IX, тканевой фактор и фактор фон Виллебранда; факторы антисвертывания, такие как протеин С; предсердный натрийуретический фактор; сурфактант легких; активаторы плазминогена, такие как урокиназа или человеческие активаторы плазминогена урокиназного или тканевого типа (t-PA); бомбезин; тромбин; гемопоэтические факторы роста; фактор некроза опухоли альфа и бета; энкефалиназы; сывороточный альбумин, такой как человеческий сывороточный альбумин; ингибирующий фактор Мюллера; А-цепь релаксина; В-цепь релаксина; прорелаксин; гонадотропин-ассоциированный пептид мыши; микробные белки, такие как бета-лактамазы; ДНКазы; ингибин; активин; фактор роста эндотелия сосудов (VEGF); рецепторы гормонов или факторов роста; интегрин; белок А или D; ревматоидный фактор; нейротрофический фактор, например, нейротрофический фактор головного мозга (BDNF), нейротрофин-3, -4, -5, -6 (NT-3, NT-4, NT-5 или NT-6) или фактор роста нервов, такой как NGF-β; кардиотрофины (фактор гипертрофии сердца, такой как кардиотрофин-1 (СТ-1); фактор роста тромбоцитов (PDGF); фактор роста фибробластов, такой как aFGF и bFGF; эпидермальный фактор роста (EGF); трансформирующий фактор роста (TGF), такой как TGF-альфа и TGF-бета, в том числе TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, TGF-β4 или TGF-β5; инсулиноподобный фактор роста I и II (IGF-I и IGF-II); des(1-3)-IGF-I (IGF-I мозга), белки, связывающие инсулиноподобный фактор роста; белки CD, такие как CD-3, CD-4, CD-8 и CD-19; эритропоэтин; остеоиндуктивные факторы; иммунотоксины; костный морфогенетический белок (BMP); интерферон, такой как интерферон-альфа, -бета и -гамма; колониестимулирующие факторы (CSF), например, M-CSF, GM-CSF и G-CSF; интерлейкины (IL), например, от IL-1 до IL-13; антитело против HER2; супероксиддисмутазы; Т-клеточные рецепторы; поверхностные мембранные белки; комплементзависимый стимулятор гемолиза; вирусный антиген, такой как, например, часть оболочки ВИЧ; транспортные белки; рецепторы хоминга; адрессины; регуляторные белки.

Антитела, получаемые в соответствии с настоящим изобретением, могут быть моноклональными антителами, которые являются однородной популяцией антител против конкретной антигенной детерминанты (например, антигена раковых клеток, вирусного антигена, микробного антигена, белка, пептида, углевода, химического вещества, нуклеиновой кислоты или их фрагментов). Моноклональное антитело (MAb) против интересующей мишени может быть получено с помощью любого способа, известного в данной области техники, который обеспечивает образование молекул антител стабильными клеточными линиями в культуре. Они включают, но не ограничиваются ими, метод гибридом, впервые описанный Köhler and Milstein (1975) Nature 256: 495-497), метод гибридомы человеческих В-клеток, описанный Kozbor et al (1983) Immunology Today 4: 72), и метод EBV-гибридомы (Cole et al (1985) в Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96). Такие антитела могут относиться к любому классу иммуноглобулинов, в том числе к IgG, IgM, IgE, IgA, IgD и любому их подклассу. Гибридомы, образующие Mab, использующиеся в настоящем изобретении, можно культивировать in vitro или in vivo.

Полезные моноклональные антитела включают, но не ограничиваются ими, человеческие моноклональные антитела, гуманизированные моноклональные антитела, фрагменты антител или химерные моноклональные антитела человек-мышь (или других видов). Человеческие моноклональные антитела могут быть получены с помощью любого из многочисленных способов, известных в данной области (Teng et al (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80: 7308-7312; Kozbor et al (1983) Immunology Today 4: 72-79; and Olsson et al (1982) Methods in Enzymology 92: 3-16).

Антитело может также быть биспецифическим антителом. Биспецифические антитела могут иметь в одном плече гибридную тяжелую цепь иммуноглобулина с одной специфичностью связывания и гибридную пару тяжелая цепь-легкая цепь иммуноглобулина (обеспечивающую вторую специфичность связывания) в другом плече. Эта асимметричная структура облегчает отделение нужного биспецифического соединения от нежелательных комбинаций цепей иммуноглобулина, поскольку присутствие легкой цепи иммуноглобулина только в одной половине биспецифической молекулы обеспечивает легкий путь отделения (WO 94/04690; Suresh et al (1986) Methods in Enzymology, 121: 210; Rodrigues et al (1993) J. of Immunology 151: 6954-6961; Carter et al (1992) Bio/Technology 10: 163-167; Carter et al (1995) J. of Hematotherapy 4: 463-470; Merchant et al (1998) Nature Biotechnology 16: 677-681. Способы получения биспецифических антител известны в данной области (Milstein et al (1983) Nature 305: 537-539; WO 93/08829; Traunecker et al (1991) EMBO J. 10: 3655-3659. При использовании таких способов биспецифические антитела могут быть подготовлены для конъюгации с получением конъюгатов лекарственного средства с антителом (ADC) для лечения или профилактики заболеваний, как описано в настоящем документе.

Антитело, как определено в настоящем документе, может быть функционально активным фрагментом, производным или аналогом антитела, который связывается с иммуноспецифичным антигеном раковых клеток, вирусным антигеном или микробным антигеном, или другими антителами, связывающимися с опухолевыми клетками или матриксом. В связи с этим «функционально активный» означает, что фрагмент, производное или аналог способен вызывать образование анти-антиидиотипических антител, которые узнают тот же антиген, что и антитело, из которого получен фрагмент, производное или аналог. В частности, в примере варианта осуществления антигенность идиотипа молекулы иммуноглобулина может быть повышена за счет делеции каркасных областей и последовательностей CDR, которые являются С-концевыми относительно последовательности CDR, которая специфически распознает антиген. Чтобы определить, какие последовательности CDR связывают антиген, синтетические пептиды, содержащие последовательности CDR, могут быть использованы в анализах связывания с антигеном в любом способе анализа связывания, известном в данной области, например, анализе BIAcore (Kabat et al, (1991) in Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, National Institute of Health, Bethesda, Md.; Kabat et al (1980) J. of Immunology 125(3): 961-969).

Другие полезные антитела включают фрагменты антител, включая, но не ограничиваясь ими, F(ab')2 фрагменты, которые содержат вариабельную область, константную область легкой цепи и домен СН1 тяжелой цепи, которые могут быть получены путем обработки пепсином молекулы антитела, и Fab-фрагменты, которые могут быть получены восстановлением дисульфидных мостиков F(ab')2 фрагментов. Другими полезными антителами являются димеры тяжелой и легкой цепей антитела или любой минимальный фрагмент, такой как Fv или одноцепочечные антитела (SCA) (например, как описано в патенте США 4946778; Bird (1988) Science 242: 423-42; Huston et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85: 5879-5883; and Ward et al (1989) Nature 334: 544-54), или любая другая молекула с той же специфичностью, что и антитело.

Антитело может быть слитым белком антитела или его функционально активного фрагмента, например, если антитело соединено посредством ковалентной связи (например, пептидной связи), либо своим N-концом, либо своим С-концом с аминокислотной последовательностью другого белка (или его частью, например, частью белка длиной, по меньшей мере 10, 20 или 50 аминокислот), который не является антителом. Антитело или его фрагмент может быть ковалентно соединен с другим белком N-концом последовательности константного домена.

Моноклональные антитела в данном описании специально включают «химерные» антитела, в которых часть тяжелой и/или легкой цепи идентична или гомологична соответствующим последовательностям в антителах, полученных из определенного вида или принадлежащих к определенному классу или подклассу антител, а остальные части цепи идентичны или гомологичны соответствующим последовательностям антител, полученным из другого вида или принадлежащих к другому классу или подклассу антител, а также фрагменты таких антител, при условии, что они проявляют желаемую биологическую активность (патент США 4816567 и Morrison et al (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 81: 6851-6855). Химерное антитело представляет собой молекулу, в которой различные части молекулы являются производными от молекул различных видов животных, например, молекулу, которая имеет вариабельную область, полученную из моноклонального иммуноглобулина мыши, и имеет константные области иммуноглобулина человека (патенты США 4816567; 4816397). Химерные антитела включают «приматизированные» антитела, содержащие антигенсвязывающие последовательности вариабельного домена, полученные из приматов, отличных от человека, (например, мартышковые, человекообразные обезьяны и т.д.) и последовательности константных областей человека.

Химерные и гуманизированные моноклональные антитела, включающие как человеческие, так и не человеческие участки, могут быть созданы с использованием стандартных методик рекомбинантной ДНК (WO 87/02671; ЕР 184187; ЕР 171496; ЕР 173494; WO 86/01533; патент США 4816567; ЕР 12023; Berter et al (1988) Science 240: 1041-1043; Liu et al (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84: 3439-3443; Liu et al (1987) J. Immunol. 139: 3521-3526; Sun et al (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84: 214-218; Nishimura et al (1987) Cancer. Res. 47: 999-1005; Wood et al (1985) Nature 314: 446-449; и Shaw et al (1988) J. Natl. Cancer Inst. 80: 1553-1559; Morrison (1985) Science 229: 1202-1207; Oi et al (1986) BioTechniques 4: 214; патент США 5225539; Jones et al (1986) Nature 321: 552-525; Verhoeyan et al (1988) Science 239: 1534; и Beidler et al (1988) J. Immunol. 141: 4053-4060; каждый из которых включен в настоящее описание посредством ссылки в полном объеме.

Терапевтические моноклональные антитела, которые могут быть получены с помощью способов согласно настоящему изобретению, включают, но не ограничиваются ими, трастузумаб (HERCEPTIN®, Genentech, Inc., Carter et al (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 89: 4285-4289; патент США 5725856); антитела против CD20, такие как химерное антитело против CD20 «С2В8» (патент США 5736137); ритуксимаб (RITUXAN®), окрелизумаб, химерные или гуманизированные варианты антитела 2Н7 (патент США 5721108; WO 04/056312) или тозитумомаб (Bexxar®); антитела против IL-8 ((St John et al (1993) Chest, 103: 932 и WO 95/23865); антитела, направленные на другие интерлейкины, такие как IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-9, IL-10, IL-12, IL-13; антитела против VEGF, включая гуманизированные антитела против VEGF и/или антитела с созревшей аффинностью против VEGF, такие как гуманизированное антитело против VEGF huA4.6.1 бевацизумаб (AVASTIN®, Genentech, Inc., Kim et al (1992) Growth Factors 7: 53-64, WO 96/30046, WO 98/45331); антитела против PSCA (WO 01/40309); антитела против CD40, в том числе S2C6 и его гуманизированные варианты (WO 00/75348); антитела против CD11a (патент США 5622700; WO 98/23761; Steppe et al (1991) Transplant Intl. 4: 3-7; Hourmant et al (1994) Transplantation 58:377-380); антитела против IgE (Presta et al (1993) J. Immunol. 151: 2623-2632; WO 95/19181); антитела против CD18 (патент США 5622700; WO 97/26912); антитела против IgE, в том числе Е25, Е26 и Е27 (патенты США 5714338; 5091313; WO 93/04173; патент США 5714338); антитела против рецептора Аро-2 (WO 98/51793); антитела против TNF-альфа, включая сА2 (REMICADE®), CDP571 и МАК-195 (патент США 5672347; Lorenz et al (1996) J. Immunol. 156(4): 1646-1653; Dhainaut et al (1995) Crit. Care Med. 23(9): 1461-1469); антитела против тканевого фактора (TF) (ЕР 0420937 В1); антитела против интегрина альфа-4-бета-7 человека (WO 98/06248); антитела против EGFR, химеризированное или гуманизированное антитело 225 (WO 96/40210); антитела против CD3, такие как ОКТ3 (патент США 4515893);. антитела против CD25 или против Тас, такие как Chi-621 SIMULECT® и ZENAPAX® (патент США 5693762); антитела против CD4, такие как антитело СМ-7412 (Choy et al (1996) Arthritis Rheum 39(1): 52-56); антитело против CD52, такое как САМРАТН-1Н (Riechmann et al (1988) Nature 332: 323-337); антитела против рецепторов Fc, такие как антитело М22, направленное против Fc гамма RI, Graziano et al (1995) J. Immunol. 155(10): 4996-5002; антитело против карциноэмбрионального антигена (СБА), такое как hMN-14 (Sharkey et al (1995) Cancer Res. 55(23 Suppl): 5935s-5945s; антитела, направленные против эпителиальных клеток молочных желез, в том числе huBrE-3, HU-Mc 3 и CHL6 (Ceriani et al (1995) Cancer Res. 55(23): 5852s-5856s; и Richman et al (1995) Cancer Res. 55(23 Supp): 5916s-5920s); антитела, которые связываются с клетками рака толстой кишки, такие как С242 (Litton et al (1996) Eur J. Immunol. 26(1): 1-9); антитела против CD38, например, AT 13/5 (Ellis et al (1995) J. Immunol. 155(2): 925-937); антитела против CD33, такие как Hu М195 (Jurcic et al (1995) Cancer Res 55(23 Suppl): 5908s-5910s) и CMA-676 или CDP771; антитела против CD22, такие как LL2 или LymphoCide (Juweid et al (1995) Cancer Res 55 (23 Suppl): 5899s-5907s); антитела против EpCAM, такие как 17-1A (PANOREX®); антитела против GPIIb/IIIa, такие как абциксимаб или Fab с7Е3 (REOPRO®); антитела против RSV, такие как Medi-493 (SYNAGIS®); антитела против CMV, такие как PROTOVIR®; антитела против ВИЧ, такие как PRO542; антитела против вируса гепатита, такие как антитело anti-Hep В (OSTAVIR®); антитело OvaRex против СА 125; антиидиотипическое антитело ВЕС2 к эпитопу GD3; антитела против рака почки человека, такие как CH-G250; ING-1; антитела против 17-1А человека (3622W94); антитело против колоректальной опухоли человека (А33); антитело R24 против меланомы человека, направленное против ганглиозида GD3; антитело против человеческого плоскоклеточного рака (SF-25); и антитела против лейкоцитарного антигена человека (HLA), такие как Smart ID 10, и антитело Oncolym (Lym-1) против HLA DR.

III. СПОСОБЫ И АНАЛИЗЫ

АНАЛИТИЧЕСКИЕ СПОСОБЫ/АНАЛИЗЫ

Анализ прозрачности, опалесценции и окраски (СОС)

Степень опалесценции может быть также определена с помощью инструментального измерения света, поглощаемого или рассеянного за счет субмикроскопической оптической плотности неоднородностей опалесцирующих растворов и суспензий. Такими способами являются нефелометрия и турбидиметрия. Для измерения мутности окрашенных образцов используется относительная турбидиметрия и нефелометрия с выбором отношения. Эффект рассеяния света взвешенными частицами может быть измерен путем наблюдения либо проходящего света (турбидиметрия), либо рассеянного света (нефелометрия). Относительная турбидиметрия сочетает в себе принципы как нефелометрии, так и турбидиметрии. Турбидиметрия и нефелометрия могут быть использованы для измерения слегка опалесцирующий суспензии. Должны использоваться контрольные суспензии, полученные при четко определенных условиях. Для подтверждения надлежащей оценки цвета должны использоваться стандартные окрашенные растворы, перечисленные в фармакопее США 2012 (USP Monograph 631, Color and Achromicity) или в Европейской фармакопее 5.0 (ЕР Method 2.2.2, Degree of Coloration of Liquids). Для количественных измерений большое значение имеет построение калибровочных кривых, так как зависимость между оптическими свойствами суспензии и концентрацией дисперсной фазы, в лучшем случае, является полуэмпирической. Определение опалесценции цветных жидкостей осуществляют с применением относительных турбидиметров или нефелометров с выбором отношения, так как цвет вызывает отрицательную интерференцию, ослабляя как падающий, так и рассеянный свет, и уменьшает значение мутности. Эффект настолько велик даже для умеренно окрашенных образцов, что обычные нефелометры не могут быть использованы. Инструментальная оценка прозрачности и опалесценции обеспечивает более чувствительный тест, который не зависит от остроты зрения специалиста, выполняющего анализ. Численные результаты являются более полезными для контроля качества и процессов, особенно в исследованиях стабильности. Например, предыдущие численные данные о стабильности можно экстраполировать, чтобы определить, превысит ли данная партия дозированной лекарственной формы или активного фармацевтического ингредиента минимальную необходимую активность на момент окончания срока годности.

Анализ HPLC

Высокоэффективная жидкостная хроматография, также известная как жидкостная хроматография при высоком давлении, сокращенно HPLC, является особой формой жидкостной хроматографии и в настоящее время часто используются в бIECимии и аналитической химии. Аналит пропускают через колонку с неподвижной фазой в жидкой (подвижной) фазе при высоком давлении, что приводит к уменьшению времени, которое разделенные компоненты находятся на неподвижной фазе и, таким образом, уменьшению времени, в течении которого они диффундируют внутри колонки. Это приводит к более узким пикам в конечной хроматограмме, и, следовательно, к лучшему разрешению и чувствительности по сравнению с LC. Подвижную фазу выбирают так, чтобы обеспечить растворимость образца растворенных веществ. Для неподвижной фазы, предпочтительно, используют микрочастицы силикагеля (необработанные или химически модифицированные), потому что его высокая площадь поверхности усиливает различия при взаимодействиях растворимых веществ и неподвижной фазы. Использование неподвижной фазы, которая сильно взаимодействует с растворенными веществами относительно взаимодействия растворенного вещества с подвижной фазой, приведет к очень продолжительному времени удержания, т.е. ситуации, которая не является аналитически полезной. Поэтому неподвижная фаза должна быть выбрана так, чтобы обеспечить слабое или умеренное взаимодействие с нею растворенных веществ по сравнению с взаимодействиями с подвижной фазой. Как следствие, природа растворенного вещества определяет тип выбранной LC. Более сильные взаимодействия должны возникать в подвижной фазе, чтобы обеспечить растворимость образца и быстрое элюирование, в то время как неподвижная фаза должна реагировать на более тонкие различия между растворенными веществами. Например, полярные нейтральные соединения, как правило, лучше анализировать с использованием полярной подвижной фазы вместе с неполярной неподвижной фазой, что выявляет тонкие различия в дисперсионном характере растворенных веществ. Один из самых мощных аспектов HPLC заключается в том, что подвижная фаза может изменяться для изменения механизма удержания. В подвижную фазу могут быть добавлены модификаторы, чтобы контролировать удержание. Например, pH является важной переменной в водных подвижных фазах.

Хроматография с обращенной фазой (RP-HPLC) требует использования неполярной неподвижной фазы и полярной подвижной фазы (состоящей из одного или более полярных растворителей, например, воды, метанола, ацетонитрила и тетрагидрофурана).

HPLC гидрофобных взаимодействий (HIC). Этот хроматографический способ подходит для анализа белков или биоконъюгатов антитело/белок на основе их гидрофобности. Принцип способа хроматографии гидрофобного взаимодействия основывается на том, что белки связываются со смолой при использовании водной подвижной фазы с высоким содержанием соли. Высокая соленость способствует лиотропному эффекту, который позволяет белкам связываться с поверхностью с меньшим покрытием гидрофобным лигандом. Белки элюируют с помощью простого способа уменьшения концентрации соли. Большинство терапевтических мишеней элюируют буфером с низкой концентрацией соли или без соли. Таким образом, соединение может быть элюировано в более полярном и менее денатурирующем окружении. Например, HIC широко используется для анализа присоединения лекарственного средства в конъюгатах антитело-лекарственное средство или белок-лекарственное средство.

Анализ ЯМР

Детекция ядерного магнитного резонанса (ЯМР) основана на том факте, что некоторые ядра с нечетной массой, в том числе Н и ¹³С, имеют случайно направленный спин. Однако, если поместить их между полюсами сильного магнита, спины ориентируются параллельно или антипараллельно к магнитному полю, с преимущественно параллельной ориентацией, так как она немного ниже по энергии. Ядра затем облучают электромагнитным излучением, которое поглощается и переводит параллельные ядра в более высокое энергетическое состояние; следовательно, они находятся в «резонансе» с излучением. Каждый Н или С дает различные спектры в зависимости от их расположения и соседних молекул или элементов в соединении, поскольку все ядра в молекулах окружены электронными облаками, которые изменяют окружающее магнитное поле и тем самым изменяют частоту поглощения.

Масс-спектрометрия

Масс-спектрометрия представляет собой аналитический способ, используемый для измерения отношения массы к заряду (m/z или m/q) ионов. Данный метод обычно используют для анализа состава физического образца, получая масс-спектр, представляющий массы компонентов образца. Методика имеет несколько применений, включая идентификацию неизвестных соединений по массе соединения и/или его фрагментов, определение изотопного состава одного или нескольких элементов в соединении, определение структуры соединений путем наблюдения фрагментации соединения, определение количества соединения в образце с использованием тщательно разработанных способов (масс-спектрометрия сама по себе не является количественным методом), изучение основ ионной химии газовой фазы (химии ионов и нейтральных частиц в вакууме), и определения других физических, химических или даже биологических свойств соединений с использованием множества других подходов.

Масс-спектрометр представляет собой устройство, которое используется для масс-спектрометрии, и он обеспечивает масс-спектр образца для анализа его состава. Обычно это достигается путем ионизации образца, разделения ионов различных масс и записи их относительного содержания путем измерения интенсивности потока ионов. Типичный масс-спектрометр состоит из трех частей: источника ионов, масс-анализатора и детектора.

Вид источника ионов является фактором, который сильно влияет на то, какие типы образцов могут быть проанализированы с помощью масс-спектрометрии. Для газов и паров используют ионизацию электронами и химическую ионизацию. В химических источниках ионизации аналит ионизируют химическими ионно-молекулярными реакциями во время столкновений в источнике. Два способа, часто используемые с жидкими и твердыми биологическими образцами, включают ионизацию электрораспылением (ESI) и матрично-активированную лазерную десорбцию/ионизацию (MALDI). Другие способы включают бомбардировку ускоренными атомами (FAB), термораспыление, химическую ионизацию при атмосферном давлении (APCI), масс-спектрометрию вторичных ионов (SIMS) и тепловую ионизацию.

УФ спектроскопия

Ультрафиолетовая и видимая спектроскопия или ультрафиолетовая и видимая спектрофотометрия (УФ-Вид или УФ/Вид) относится к абсорбционной спектроскопии или отражательной спектроскопии в ультрафиолетовой и видимой областях спектра. Это означает, что используется свет в видимом диапазоне и прилегающих (ближний УФ и ближний инфракрасный (NIR)) диапазонах. Поглощение или отражение в видимом диапазоне непосредственно влияет на воспринимаемый цвет химического вещества. В этой области электромагнитного спектра молекулы испытывают электронные переходы. Эта методика дополняет флуоресцентную спектроскопию, так как флуоресценция дает информацию о переходах из возбужденного состояния в основное состояние, в то время как поглощение измеряет переходы из основного состояния в возбужденное состояние. УФ-спектрометр является инструментом, который использует луч света от источника видимого и/или УФ света (окрашен красным цветом), разделяемый на составляющие его длины волн призмой или дифракционной решеткой. Каждый монохроматический (одной длины волны) луч света, в свою очередь, разделен на два луча равной интенсивности полуотражающим устройством. Один луч, луч образца (окрашен пурпурным), проходит через небольшой прозрачный контейнер (кювету), содержащую раствор исследуемого соединения в прозрачном растворителе. Другой луч, контрольный (окрашен синим цветом), проходит через идентичную кювету, содержащую только растворитель. Интенсивность этих световых пучков затем измеряют с помощью электронных детекторов и сравнивают. Интенсивность контрольного пучка, который должен слабо поглощаться или вообще не поглощаться, определяется как 10. Интенсивность луча образца определяется как I. В течении короткого периода времени спектрометр автоматически сканирует все длины волн также, как описано выше. Ультрафиолетовая (УФ) область сканирования, как правило, имеет диапазон от 200 до 400 нм, а видимая часть имеет диапазон от 400 до 800 нм.

IV. ПРИМЕРЫ

Ниже приведены примеры способов и композиций согласно изобретению. Понятно, что на практике могут применяться различные другие варианты осуществления, учитывая общее описание, приведенное выше.

Пример 1. Детекция аддукта

Во время получения конкретного рекомбинантного белка получили семь отфильтрованных препаратов для хранения (FBS), среди которых обычные результаты по критериям внешнего вида получили пять из семи препаратов. В соответствии с техническими требованиями к процессу получения, инструкции для проверки продукта требуют использования серий растворов желтого (Y) цвета для оценки образцов анализом СОС в качестве способа определения прозрачности/степени опалесценции, степени окраски и внешнего вида. Тем не менее, у двух препаратов (партия 2 и 3) появилось коричневое окрашивание, и они не соответствовали ожидаемым критериям желтого цвета ≤ Y7 по анализу СОС. Сравнение результатов СОС для партий 1-3 показано на фигуре 1. Чтобы дополнительно исследовать различие, образцы из семи FBS сконцентрировали, чтобы увеличить интенсивность цвета.

Концентрированные образцы сравнивали со всеми стандартными окрашенными растворами, перечисленными в Фармакопее США 2012 (USP Monograph 631, Color and Achromicity) или в Европейской Фармакопее 5.0 (ЕР Method 2.2.2, Degree of Coloration of Liquids) для подтверждения надлежащей оценки цвета. Образцы сравнивали при рассеянном дневном свете через 5 мин после приготовления эталонного образца, на растворы смотрели вертикально на черном фоне. Диффузия света должна быть такой, чтобы стандартный образец I можно было легко отличить от воды, и чтобы стандартную суспензию II можно было легко отличить от стандартной суспензии I. Жидкость считали прозрачной, если ее прозрачность была такой же, как у химически чистой воды или растворителя, используемого при исследовании, в условиях, описанных выше, или если его опалесценция не была более выражена, чем у стандартного образца I.

Поскольку причина окрашивания в партиях 2 и 3 была неизвестна, выполнили несколько поисковых исследований, чтобы определить источник и причину нетипичного коричневого цвета. Образцы из партий 1-3 проанализировали на металлы, микроэлементы (кроме металлов) и хромофоры. Эти исследования показали, что окраска, наблюдаемая в партиях 2 и 3, не была связана с металлами или другими микроэлементами (данные не показаны).

Чтобы определить, был ли неожиданный цвет связан с хромофорами, FBS партий 1-3 проанализировали с использованием ультрафиолетовой и видимой (УФ/Вид) спектроскопии с оптическим путем внутри кюветы 1 см. УФ-спектры (200-600 нм) не выявили никаких существенных различий в профиле поглощения анализируемых образцов.

Для повышения чувствительности УФ-спектрофотометра эксперимент повторили с использованием кюветы с длиной оптического пути 10 см. Десятисантиметровая кювета обеспечивает повышенную чувствительность по сравнению с сантиметровой кюветой за счет того, что поглощение образца пропорционально числу поглощающих молекул в световом пучке спектрофотометра. Образцы сканировали в диапазоне 200-700 нм, чтобы определить спектр поглощения партий 1-3. Форма спектров для партий 2 и 3 отличалась от партии 1: наблюдали новые пики поглощения примерно при 320 нм и 460 нм, которые не наблюдали для партии 1 (фигура 2А). Эта разницу наблюдали более четко, когда спектр партии 1 вычитали из спектра партии 3 (фигура 2В). Пик, наблюдаемый при 460 нм, в партиях 2 и 3 согласуется с пиком, характерным для флавина (например, витамина).

Основываясь на результатах УФ/Вид спектроскопии при 10 см, для FBS партий 1-3 провели полный спектр анализов RP-HPLC и IEC с возможностью детекции с помощью MS.

Используя полный спектр детекции RP-HPLC, не обнаружили никаких хроматографических различий для партий 1-3 (данные не показаны). Тем не менее, при анализе IEC при 310 нм наблюдали незначительные отличия. Как показано на фигуре 3, наблюдали небольшой пик позади основного пика в партиях 2 и 3, а профиль для партии 1 сравним с эталонным материалом.

Интактные образцы исследовали с помощью 2D LC-MS с детекцией при 280 и 310 нм. Анализ 2D LC-MS состоял из двух частей - первое измерение являлось разделением RP-HPLC, а второе измерение - масс-спектрометрический анализ фракционированных пиков. В этом эксперименте в партии 1 наблюдали расчетную массу, в то время как в партиях 2 и 3 наблюдали расчетную массу и дополнительную массу примерно +157 Да (фигура 4).

Пример 2. Установление аддукта

Чтобы лучше установить аддукт, для фракционирования выбрали партию 3 (собрали минорный пик из анализа IEC (фигура 3)) и дополнительно проанализировали ее с помощью 2D LC-MS и идентикации массы по триптической пептидной карте с детекцией MS.

Из анализа 2D LC-MS (фигура 5), в дополнение к ожидаемой массе, снова наблюдали увеличение массы примерно на +156 для фракционированного пика плеча. При одновременном восстановлении образца (с помощью DTT) наблюдали ожидаемую массу восстановленного образца. Увеличение массы на четыре дальтона, наблюдаемые при сравнении восстановленного и нативного образцов, связано с разрушением дисульфидных связей и добавлением четырех атомов водорода. Дополнительную массу снова наблюдали, что свидетельствовало о том, что модификация была необратимой или ковалентной.

Из триптической пептидной карты образец собирали при длине волны 214 нм и 310 нм. Как показано на фигуре 6, новые пики проявлялись в области 45-55 минут. LC-MS-MS анализ нового пика, наблюдаемого на 48,8 минуте при 310 нм, показал, что пик представляет собой модифицированный пептид Т20, в котором остаток цистеина модифицирован фрагментом +154,006 дальтон. Модифицированные (по цистеину, +154,006 Да) и свободные пептиды Т6 и Т16 также были обнаружены при разделении масс. Восстановленный пептид Т21 или модифицированный пептид Т21 не были обнаружены, но это может быть связано с низким уровнем их содержания. Остальные два пика, наблюдаемые при элюции от 50 до 56 минут при 310 нм, не имели никаких уникальных черт по сравнению с контролем.

Для определения структуры аддукта провели 1D и 2D ЯМР 1Н анализ. Дополнительные данные получили с помощью TOSCY (спектроскопия тотальных корреляций), HSQC (гетероядерная спектроскопия с одноквантовым переносом когеренции), НМВС (гетероядерная спиновая корреляция с дальними атомами) и ROESY (спектроскопия ядерного эффекта Оверхаузера (nOe) во вращающейся системе координат).

TOCSY дает корреляцию между всеми протонами, которые сопряжены друг с другом, а также всеми другими протонами в пределах данной спиновой системы. Эксперимент HSQC представляет корреляции с химическими сдвигами напрямую связанных ядер (то есть химических ядер двух типов), а эксперимент НМВС представляет корреляции с химическими сдвигами двух типов ядер, отделенных друг от друга двумя или более химическими связями. ROESY использует передачу nOe через пространство, а не через химические связи, и позволяет прецизионно подтвердить конформацию молекулы (т.е., трехмерную структуру молекулы). Выделенный пептид показал дальние взаимодействия 1Н-13С между ароматическими (хиноновыми) протонами и С=О при 182 ppm. В HSQC химические сдвиги 1Н-13С для выделенного пептида в ароматической области демонстрировали близкое соответствие тем, которые наблюдаются для синтетического модельного соединения, связанного с нафталин-1,4-дионом. Данные TOCSY выявили Q, V, и R резонансы в продукте. Сравнение 1H-15N данных методом HSQC для продукта и синтетического пептида (NH2-IVQCR-COOH) показало, что отсутствовала корреляция Cys NH, как показано на фигуре 7. Предлагаемая структура подтверждается сильным nOe, наблюдаемым между СН из Cys и NH из Arg (фигура 8). На основании объединенных данных ЯМР, предлагаемая структура представлена на фигуре 9.

Идентификация окрашенного соединения как 1,4-дигидрокси-2-нафтоата (DHNA), который образует коричневый аддукт с рекомбинантным белком, была основана на данных MS, ЯМР и генетических данных.

Данные ЯМР подтвердили, что DHNA был присоединен к рекомбинантному белку с помощью цистеиновых остатков. DHNA является продуктом, образующимся в пути биосинтеза менахинонов клеток E.coli (фигура 10). Менахинон присутствует в E. coli, но его образование увеличено, когда культура находится в анаэробных и/или микро-аэробных условиях. Менахинон используется для переноса электронов в условиях недостатка кислорода и используется для возвращения дисульфидных связей в белке DsbB к активному окисленному состоянию в анаэробных (микро-аэробных) условиях.

Пример 3. Процесс Hi-dO для уменьшения образования аддукта DHNA-продукт

Чтобы предотвратить образование свободных тиолов в продукте и последующее образование аддукта DHNA-продукт, разработали стратегию контроля технологического процесса. Причину формирования цвета определили как результат низкого окислительно-восстановительного потенциала окружения во время процедуры выделения, потому что партии 2 и 3 демонстрировали самые высокие титры и плотности клеток, обе партии дольше хранились в виде разбавленных гомогенатов, гомогенаты дольше охлаждались до достижения необходимой температуры менее 15°С и имели субоптимальные для гомогенатов время и скорость перемешивания (данные не показаны). Эти факторы способствовали образованию среды с низким содержанием кислорода, которая способствовала восстановлению дисульфидных связей в продукте и делала возможным присоединение DHNA к свободным тиолам белкового продукта.

Поскольку аддукт DHNA и белка образовывался условиях низкого окислительно-восстановительного потенциала окружения во время процедуры выделения, что приводило к восстановлению дисульфидных связей (т.е. свободным тиолам), был разработан подход, позволяющий предотвратить образование свободных тиолов и образование аддукта DHNA-продукт. Этот усиленный контроль технологического процесса, названный Hi-dO, поддерживает уровень растворенного кислорода при процедурах выделения больше нуля (>0%), чтобы устранить восстановительную среду (т.е. отсутствие образования свободных тиолов).

Образование аддукта DHNA-продукт является сложной биологической реакцией, которая требует сочетания нескольких событий при процедурах культивирования и выделения. Результатом процесса культивирования является образование значительных уровней и/или присутствие DHNA. Схема ниже показывает три основных этапа типичной процедуры выделения: стадия пост-культивирования, стадия гомогенизации, затем стадия пост-гомогенизации.

Протестировали несколько этапов процесса на стадиях пост-культивирования/пред-гомогенизации и пост-гомогенизации, чтобы определить, могут ли такие действия уменьшить восстановительную среду и образование свободных тиолов. Такие улучшения процесса показаны в таблице 1 и на фигуре 12.

Результаты усовершенствований процесса, описанных в таблице 1 и на фигуре 12, приведены в таблице 2.

Провели анализ причин, чтобы понять происхождение коричневой окраски. Этот анализ привел к идентификации окрашенного соединения (DHNA), его связи с рекомбинантным белковым продуктом, структуры аддукта (DHNA-белок), его происхождения и предположительному механизму, как и когда DHNA присоединяется к продукту во время процесса получения. Как указано в таблице 1, авторы реализовали стратегию, позволяющую предотвратить образование коричневого аддукта за счет поддержания уровня растворенного кислорода больше нуля (>0%) на протяжении всех процедур выделения, чтобы устранить восстановительное окружение и предотвратить образование свободных тиолов в продукте. В результате, как показал анализ IEC, так как % аномального пика составил 0%, образование коричневого аддукта в FBS не обнаружили (таблица 2).

Пример 4. Создание клеток-хозяев Е. coli с делецией гена menE

В дополнение к процессу выделения Hi-dO согласно изобретению осуществили еще один подход, позволяющий уменьшить образование коричневого аддукта. Он включал применение генной инженерии к прокариотической клетке-хозяину таким образом, что ген menE удалили из ее генома, тем самым предотвращая образование в пути биосинтеза менахинонов любого промежуточного продукта DHNA, который может быть присоединен к рекомбинантному продукту.

Клетки-хозяева с делецией гена menE получили мутацией в рамке считывания с нокаутом одного гена с помощью способов, описанных в статье Baba et al., Construction of E. coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection, Molecular Systems Biology, vol. 21, p. 1-10 (2006), включенной в данное описание посредством ссылки. Ген menE подвергли мутагенезу с помощью PCR продуктов, содержащих кассету устойчивости (например, к канамицину), фланкированную направляющими участками узнавания FLP и 50 парами оснований, гомологичных соседним последовательностям хромосомы.

Мутагенез приводил к примерно 10-1000 устойчивым к канамицину колониям, когда клетки-хозяева инкубировали в аэробных условиях при 37°С в агаризованной среде Luria-Bertani (среда LB), содержащей 30 мкг/мл канамицина.

Пример 5. Получение рекомбинантных белков с использованием клеток-хозяев Е. coli с делецией гена menE

Проверили способность клеток-хозяев Е. coli с делецией гена menE образовывать рекомбинантный белок, который не демонстрирует образование аддукта с DHNA. Коротко, клетки E. coli с делецией гена menE трансформировали плазмидными конструкциями, которые кодировали два рекомбинантных белка, PROT1 и PROT2, и два рекомбинантных антитела, АВ1 и АВ2, с использованием стандартных методик, хорошо известных специалистам в данной области (смотри, например, Simmons et al., Expression of full-length immunoglobulins in E. coli: rapid and efficient production of aglycosylated antibodies, J of Immunol Methods 263 p. 133-147 (2002)). Культивирование четырех рекомбинантных белков/антител проводили, как описано в настоящем документе (смотри также патент США 6979556, который включен в настоящее описание посредством ссылки).

Отфильтрованный препарат рекомбинантного продукта для всех четырех рекомбинантных белков/антител проверили на образование аддукта DHNA-белок анализом IEC при 310 нм и не обнаружили детектируемого образования аддукта DHNA-белок (фигура 11 показывает пример результатов для PROT 1).

Неожиданно авторы обнаружили, что выход рекомбинантного продукта в результате применения клеток E. coli с делецией гена menE заметно увеличился примерно от 20% до 50%) по сравнению с выходом при использовании клеток-хозяев E. coli с интактным геном menE дикого типа. В таблице 3 приведены полученные результаты.

Claims (18)

1. Способ получения рекомбинантного белка, включающий (а) культивирование прокариотической клетки-хозяина, где указанная прокариотическая клетка-хозяин использует путь биосинтеза менахинонов и трансформирована нуклеиновой кислотой, кодирующей указанный рекомбинантный белок, и (б) выделение указанного рекомбинантного белка, где выделение включает стадию гомогенизации, в условиях, где уровень растворенного кислорода (dO2) поддерживается на уровне 75% или более до гомогенизации и на уровне 50% или более после гомогенизации, и (в) очистку указанного рекомбинантного белка до отфильтрованного препарата для хранения (FBS), где указанный отфильтрованный препарат не содержит детектируемых количеств аддукта рекомбинантного белка и 1,4-дигидрокси-2-нафтоата (DHNA) по данным ионообменной хроматографии (IEC) при 310 нм.

2. Способ по п. 1, в котором указанный уровень dO2 поддерживают на уровне более 75% в течение периода, равного или превышающего 1,5 ч, до гомогенизации.

3. Способ по п. 1, в котором указанный уровень dO2 поддерживают на уровне 50% или более в течение периода, равного или превышающего 2 ч, после гомогенизации.

4. Способ по п. 1, в котором указанный уровень dO2 поддерживают с использованием нагнетаемого в пространство над средой воздуха или барботажного воздуха с помощью увеличенного противодавления или с помощью скорости перемешивания.

5. Способ по п. 4, в котором количество нагнетаемого в пространство над средой воздуха составляет от около 0,4 vvm до около 0,8 vvm.

6. Способ по п. 5, в котором количество нагнетаемого в пространство над средой воздуха ориентировано на 0,6 vvm.

7. Способ по п. 4, в котором увеличенное противодавление составляет от около 1,0 до около 30 фунтов на квадратный дюйм.

8. Способ по п. 7, в котором увеличенное противодавление ориентировано на 19 фунтов на квадратный дюйм.

9. Способ по п. 4, в котором скорость перемешивания составляет от около 6 Вт/л до около 8 Вт/л.

10. Способ по п. 9, в котором скорость перемешивания ориентирована на около 6 Вт/л.

11. Способ по пп. 1-10, где культивирование не зависит от объема культивирования.

12. Способ по п. 1, в котором указанный рекомбинантный белок представляет собой рекомбинантный полипептид или выделенное антитело.

13. Способ по п. 1, в котором указанной прокариотической клеткой-хозяином является Escherichia coli (Е. coli), Enterobacter, Azotobacter, Erwinia, Bacillus, Pseudomonas, Klebsiella, Proteus, Salmonella, Serratia, Shigella, Rhizobia, Vitreoscilla и Paracoccus.

14. Способ получения рекомбинантного белка, включающий (а) культивирование прокариотической клетки-хозяина с делецией гена menE, где указанная прокариотическая клетка-хозяин трансформирована нуклеиновой кислотой, кодирующей указанный рекомбинантный белок, (б) выделение указанного рекомбинантного белка и (в) очистку указанного рекомбинантного белка до FBS, где указанный отфильтрованный препарат не содержит детектируемых количеств аддукта рекомбинантного белка и 1,4-дигидрокси-2-нафтоата (DHNA) по данным ионообменной хроматографии (IEC) при 310 нм.

15. Способ по п. 14, в котором выход рекомбинантного белка увеличен примерно на от 20% до 50% по сравнению с выходом при использовании контрольной прокариотической клетки-хозяина.

16. Способ по пп. 14 и 15, где культивирование не зависит от объема культивирования.

17. Способ по п. 14, в котором указанный рекомбинантный белок представляет собой рекомбинантный полипептид или выделенное антитело.

18. Способ по п. 14, в котором указанной прокариотической клеткой-хозяином является Escherichia coli (Е. coli), Enterobacter, Azotobacter, Erwinia, Bacillus, Pseudomonas, Klebsiella, Proteus, Salmonella, Serratia, Shigella, Rhizobia, Vitreoscilla и Paracoccus.

Images