CN101503470A - rhDSL重组蛋白及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种生物工程技术领域的rhDSL重组蛋白及其制备方法，该rhDSL含有6×His标签的Notch配体Delta－like－1的衍生多肽，衍生多肽含有进化中的保守结构区DSL和与之相邻的N－端的50个氨基酸，氨基酸序列为：LHTDSPDDLATENPERLISRLATQRHLTVGEEWSQDLHSSGRTDLKYSYRFVCDEHYYGEGCSVFCRPRDDAFGHFTCGERGEKVCNPGWKGPYCTEPI。本发明在构建rhDSL的原核表达载体pQE30－hDSL基础上，以大肠杆菌DH5α为宿主表达了rhDSL并采用Q Sepharose阴离子交换层析与金属离子Ni²⁺亲和层析相结合纯化出rhDSL重组蛋白。rhDSL是一种新的结构简单、分子量小的Notch配体衍生多肽。

Description

rhDSL重组蛋白及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种生物工程技术领域的蛋白及其制备方法，具体涉及一种rhDSL重组蛋白及其制备方法。

背景技术

Notch信号传导通路广泛存在于脊椎和非脊椎动物中，是影响细胞决定的重要通路之一，在进化上具有高度的保守性。Notch信号传导通路由Notch受体、配体及其下游的信号传导共同组成。相邻细胞间通过Notch受体传递信号可以调节包括干细胞在内的多种细胞的分化、增殖和凋亡，影响器官形成和形态发生。目前已经发现的人的Notch配体有Jaggedl、Jagged2、Deltal、Delta3、Delta4。Notch配体的胞外区含有数量不等的EGF样重复序列以及N端保守的DSL(Delta/Serrate/Lag2)结构域，该DSL结构域在结合与活化Notch受体的过程中起关键作用。

来自于野生Notch配体的重组蛋白或者多肽被认为是有效的Notch激活剂。体外实验已经证明，从Jaggedl、Deltal中衍生而来的重组蛋白及多肽具有Notch激活特性(Shimizu K，et al.J Biol Chem，1999，274(46)：32961～32969)。Han等(Blood，2000，95(5)：1616～1625)通过对人类Deltal蛋白结构的功能域的研究，成功的选出了具有Notch受体激活功能的Deltal最小功能蛋白序列，包括进化中的保守结构区DSL和与之相邻的N-端的50个氨基酸，克隆并表达纯化出具有GST(谷胱甘肽-S-转移酶)标签的重组融合蛋白，命名为hD111^NDSL。经对现有技术的文献检索发现，中国专利公开号为CN101063127A，专利名称为“GST-hDSL重组蛋白的制备方法”，该专利中介绍的制备方法步骤为“第一步，构建重组表达质粒pGEX-2T-hDSL；第二步，诱导表达重组表达质粒pGEX-2T-hDSL；第三步，将表达产物依次经变性，复性，离心，冲洗，洗脱后纯化得到GST—hDSL重组蛋白的。”该方法虽然可以得到较高浓度(0.5mg/mL以上)和纯度(95％以上)的GST-hDSL重组蛋白，但是所得到的重组蛋白分子量较大、结构较为复杂，不利于生产中成本的节约及相关体内外研究中的运用。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种rhDSL重组蛋白及其制备方法，使其进一步简化了hD111^NDSL重组蛋白的结构，首次构建了含6×His(组氨酸)标签的重组rhDSL蛋白，rhDSL是一种新的结构简单、分子量较小的Notch配体衍生多肽。

本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明所涉及的rhDSL重组蛋白，为含有6×His(组氨酸)标签的Notch配体Delta-like-1的衍生多肽。

所述的衍生多肽，由含有进化中的保守结构区DSL和与之相邻的N-端的50个氨基酸构成，共99个氨基酸，其氨基酸序列为(Blood，2000，95(5)：1616～162)：

LHTDSPDDLATENPERLISRLATQRHLTVGEEWSQDLHSSGRTDLKYSYRFVCDEHYYGEGCSVFCRPRDDAFGHFTCGERGEKVCNPGWKGPYCTEPI。

所述rhDSL重组蛋白以pQE30为表达载体构建重组表达质粒pQE30-hDSL，以大肠杆菌DH5α为宿主进行重组蛋白的表达，在大肠杆菌中表达后以包涵体形式存在。

本发明所涉及的rhDSL重组蛋白的制备方法，包括如下步骤：

第一步，构建rhDSL的重组表达质粒pQE30-hDSL；

第二步，以大肠杆菌DH5α为宿主表达rhDSL重组蛋白；

第三步，采用Q Sepharose阴离子交换层析与金属离子(Ni²⁺)亲和层析相结合的纯化方法进行rhDSL重组蛋白的纯化，得到高纯度(纯度>99％)低内毒素含量的rhDSL重组蛋白。

所述构建rhDSL的重组表达质粒pQE30-hDSL，是指：以重组质粒pGEX-2T/hDSL(林小娟等，现代生物医学进展，2008，8(4)：612)为模板，PCR的方法扩增hDSL基因片段，包括进化中的保守结构区DSL和与之相邻的N-端的50个氨基酸，共99个氨基酸，共298bp。割胶回收后的PCR目的产物和原核表达质粒pQE30(含6×His标签)经限制性内切酶HindIII、BamH I双酶切。连接割胶回收后的酶切产物，并将连接产物转化到预先制备的DH5α感受态细胞中，挑选阳性克隆，经测序证实无突变且读框正确。(以上为常规技术和条件，可以重复实施)

所述以大肠杆菌DH5α为宿主表达rhDSL重组蛋白，是指：挑取pQE30-hDSL质粒的DH5α的单菌落，25～30mL LB培养基(含100μg/mL Amp)，37℃振荡培养过夜；次日将过夜菌液按2％的接种量转接到1L～2L的LB培养基(含100μg/mL Amp)内，转接后37℃培养2.5～3.0h左右，待OD600＝0.6～0.8的时候停止培养，加入IPTG至终浓度为1mM，诱导表达4h，收集菌体。Western-blot鉴定所表达蛋白为rhDSL重组蛋白。

所述rhDSL重组蛋白的纯化，是指：收集的菌体经超声裂解和溶菌酶裂解细菌后，高速离心，收集沉淀包涵体(表达产物以包涵体形式存在)。包涵体经8M尿素变性后，用稀释法缓慢复性。取复性后的上清液经Q Sepharose阴离子交换层析，得到初步纯化的rhDSL重组蛋白。将阴离子交换层析后所得蛋白溶液进一步通过金属离子(Ni2+)亲和层析并透析，得到高纯度(纯度>99％)低内毒素含量(鲎试剂测定内毒素含量为0.117EU/μg)的rhDSL重组蛋白。

本发明在构建rhDSL的原核表达载体pQE30-hDSL基础上，以大肠杆菌DH5α为宿主表达了rhDSL并采用Q Sepharose阴离子交换层析与金属离子(Ni2+)亲和层析相结合的方法，纯化出高纯度(纯度>99％)、低内毒素含量的rhDSL重组蛋白。rhDSL是一种新的结构简单、分子量较小的Notch配体衍生多肽。

本发明制备的rhDSL重组蛋白衍生自Notch配体Delta-like-1，可通过与细胞表面的Notch受体相结合，激活Notch信号传导通路，从而应用于与Notch信号通路活化相关领域的研究。研究表明，C2成肌细胞可以表达包括Notch-1，Notch-2，Notch-3在内的至少三种Notch受体(Jarriault S，Mol Cell Biol.1998，18(12)7423~7431)。本发明用纯化后的rhDSL培养C2成肌细胞，17h后，收集C2成肌细胞，以RT-PCR的方法检测Notch信号下游靶基因Hes-1表达水平。结果发现，Hes-1表达水平提高，说明rhDSL重组蛋白活化了Notch信号传导通路。

附图说明

图1为本发明实施例中重组表达质粒pQE30-hDSL图谱；

其中：下划线部分为引物。反向引物中包含终止密码子“TAA”。

图2为本发明实施例中rhDSL重组蛋白的表达与包涵体的分离示意图；

其中：

(A)rhDSL在大肠杆菌DH5α内的表达。M：蛋白标志物；1，2：未诱导的菌体；3，4：IPTG诱导4h的菌体；5：超声离心后的上清；6：超声离心后的沉淀。

(B)rhDSL重组蛋白的western-blot检测(anti-6×His antibody)。M：蛋白标志物；1：未经诱导的菌体；2：IPTG诱导4h的菌体。

图3为本发明实施例中rhDSL重组蛋白的纯化示意图；

其中：

(A)Q Sepharose FF阴离子交换纯化rhDSL。M：蛋白标志物；1：洗脱液；

(B)离子交换层析后rhDSL的亲和纯化：M：蛋白标志物；1：洗脱液；

(C)阴离子交换层析与亲和层析纯化后蛋白的银染检测：M：蛋白标志物；1：纯化后的rhDSL。

图4为本发明实施例中以rhDSL重组蛋白培养C2成肌细胞的结果示意图；

其中：经rhDSL培养17h后，C2成肌细胞内Hes-1表达水平的RT-PCR检测(以看家基因GAPDH为对照)。1：经rhDSL培养的C2成肌细胞；2：未经rhDSL培养的C2成肌细胞。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的实施例作详细说明：本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照试验手册或者常规条件，所用的试剂均可以在市场上购买。

设备和试剂：

质粒

1)原核表达载体pQE30，Qiagene

酶和化学试剂

1)限制性内切酶BamH I、HindIII，10×Buffer(酶切)，T₄DNA连接酶，10×T₄DNA Ligase Buffer，Ferments公司产品

2)10×PCR Buffer，Mg²⁺(25mM)，dNTP(2mM)，Tag DNA聚合酶，上海生工生物工程技术服务有限公司产品

3)NaCl，冰乙酸，EDTA，国药集团化学试剂有限公司产品

4)蛋白胨，酵母膏，琼脂粉，琼脂糖，OXOID公司产品

5)引物合成和序列测序由上海生工生物工程技术服务有限公司完成

6)试剂盒：华舜小量PCR产物纯化试剂盒；天为时代琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒；V-gene日常型质粒DNA小量快速制备试剂盒；

7)KH₂PO₄，上海试剂四厂产品

8)Na₂HP04·12H₂O，博大泰克产品

9)EDTA-Na₂，上海美季生物技术有限公司产品

10)TritonX-100，甘氨酸，上海思吉生物制品有限公司产品

11)IPTG，丙烯酰胺，甲叉双丙烯酰胺，APS，TEMED，DTT，BSA，上海生工生物工程技术服务有限公司产品

12)Tris碱，PMSF(苯甲基氟磺酰)，溶菌酶，考马斯亮蓝G-250，考马斯亮蓝R-250，尿素，Amp，北京鼎国生物技术有限公司产品

13)咪唑，中国医药(集团)上海化学试剂公司产品产品

14)蛋白标志物：北京莱博生物实验材料研究所，TIANGEN公司产品

15)NiSO₄·6H₂O，中国同济微量元素研究所产品

16)DAB，TIANGEN公司产品

17)Q Sepharose^TM Fast Flow，Amersham产品

18)HIS-Select^TM Nickel Affinity Gel，Sigma产品

实验仪器

1)蛋白纯化分析仪(AKTA PURIFIER-10)，pharmacia公司产品

2)超声波细胞粉碎仪(Soniprep 150)，三洋公司产品

3)核酸蛋白电泳仪(Power pac Basic)，Bio-Rad公司产品

4)凝胶图像处理系统(TanonGIS-2008)，上海天能科技有限公司

溶液配制

1)LB液体培养基

称取胰蛋白胨10g(10％，W/V)，酵母提取物5g(5％，W/V)，NaCl 10g(10％，W/V)，加双蒸水800mL溶解，用5mol/L NaOH调至pH7.4，定容至1000mL，转移至三角烧瓶中，以121℃高压灭菌20min。

实施例1  重组表达质粒pQE30-hDSL的构建

以克隆质粒pGEX-2T/hDSL为模板，通过PCR方法扩增目的片段hDSL(包括进化中的保守结构区DSL和与之相邻的N-端的50个氨基酸，共99个氨基酸)。PCR反应引物如下：

Sense(27mer)：5’-CG GGATCC CTC CAC ACA GAT TCT CCT G-3’

Antisense(30mer)：5’-CG AAGCTT TTA GAT CGG CTC TGT GCA GTA G-3

sense端酶切位点为BamH I，antisense端酶切位点为HindIII(引物序列中下划线部分为酶切位点)。

反应条件：

1.94℃                                        5min

2.94℃                                        45sec

3.55℃                                        45sec

4.72℃                                        1min

5.Go To 2，26 Cycles

6.72℃                                        10min

扩增产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定，条带大小为与理论相符。将质粒pQE30(含6×His标签)和目的片段经限制性内切酶HindIII、BamH I双酶切，割胶回收，经T4DNA连接酶16℃连接过夜，构建原核表达质粒pQE30-hDSL。连接产物转化大肠杆菌DH5α，挑选阳性克隆，经质粒提取、酶切鉴定后测序。重组表达质粒pQE30-hDSL的示意图见图1。经HindIII、BamH I双酶切的质粒pQE30及目的片段经连接酶连接后构建出原核表达质粒pQE30-hDSL。其中质粒pQE30含6×His标签，目的片段下划线部分为引物。反向引物中包含终止密码子“TAA”。重组表达质粒pQE30-hDSL图谱见图1。

实施例2  rhDSL重组蛋白的表达与包涵体的分离

1)挑取平板上的单菌落接种至25～30mL LB培养基(含100μg/mL Amp)，37℃振荡培养过夜；

2)次日将过夜菌液按2％的接种量转接到1L～2L的LB培养基(含100μg/mLAmp)内，转接后37℃培养2.5～3.0h左右，待OD600＝0.6～0.8的时候停止培养；

3)在该1L菌液内加500mM IPTG 2mL，使IPTG终浓度达到1mM，之后37℃培养4小时(每瓶取1mL菌液，收集菌体作为对照)；Western Blot免疫印迹法检测目标蛋白的表达(一抗：兔抗6×his Tag多克隆抗体；二抗：山羊抗兔IgG)

4)用250mL的大离心管收集菌体，室温离心5000rpm×20min，收集菌体；

5)用30mL预冷1×PBS洗涤菌体：先将菌体用PBS充分悬浮，之后将菌液合并至1个50mL灭菌离心管内，10000rpm×3min离心，再收集菌体；

6)将洗涤后的菌体用30mL预冷Sonicate buffer(PBS，1mMEDTA，5mMDTT，0.1mM PMSF，pH7.3)重悬；

7)超声破菌：中等程度超声，每次超声30sec、停30sec，共20次；

8)4℃高速离心，15000rpm×20min；

9)用15mL预冷1×PBS重悬超声并离心后的沉淀；

10)加150uL溶菌酶(10mg/mL)，置于冰上20min，偶尔搅拌混合一下；

11)37℃温育10min；

12)取一洁净50mL离心管，空管称重，把加毕溶菌酶的1×PBS(pH＝8.5)悬浮液移到该管内，4℃高速离心10000rpm×5min；

13)离心后去上清，尽量沥干将沥干上清后的离心管称重，根据空管的重量计算出沉淀重量；

14)每g沉淀用18mL Pellet Wash Buffer(PBS，1％Triton X-100，10mMEDTA，50mM NaCl，pH7.3)重悬(加1/1000的100mM PMSF)，充分悬浮，离心10000rpm×5min，去上清；

15)重复步骤15，2次；

16)将上清沥干，再次称重，计算此时的沉淀重量。

如图2所示，(A)泳道1-4为pQE30-hDSL/DH5α经IPTG诱导前后，所表达蛋白的变化状况，由图可见经IPTG诱导后，在15KD处出现一表达量明显增加的蛋白。泳道5-6为包涵体分离的结果。将IPTG诱导4h的pQE30-hDSL/DH5α收集，超声离心后分别取上清进行SDS-PAGE分析，结果表明rhDSL重组蛋白主要以包涵体的形式存在。(B)为rhDSL重组蛋白的western-blot检测。以anti-6×His antibody为一抗，进行western-blot检测，结果表明所表达蛋白为目标产物rhDSL重组蛋白。

实施例3rhDSL重组蛋白的纯化

1)蛋白的变性

(1)每g包涵体沉淀加9mL Buffer/Urea(8M urea，50mM Tris-HCl，1mM EDTA，50mM NaCl，0.1mM PMSF，pH8.5)重悬；

(2)置于摇床上缓慢振摇1小时(室温)；

(3)4℃高速离心10000rpm×15min。

2)蛋白的复性

(1)小心把上清转移至一洁净的离心管(50mL或15mL离心管)中；

(2)用流动泵将上清缓慢加入到10倍于Buffer/Urea体积的AlkalineBuffer A(50mM NaH₂PO₄，0.1mM PMSF，pH10.7)内，要持续检测溶液的pH值(稀释过程中pH值会变小)，使之维持稀释以前的pH10.7溶液pH值，边加边搅拌；

(3)按照1:1的比例，用流动泵加稀释液(20mM Tris-HCl，0.1mM PMSF，pH8.0)到步骤(2)得到的溶液内稀释(稀释完毕后尿素浓度为0.36M)。

3)Q Sepharose FF阴离子交换层析对hDSL重组蛋白的纯化

(1)将复性后的溶液调节至pH9.0，并调节样品中NaCl浓度为20mM/L；

(2)将变性-复性后的蛋白溶液小心封好，4℃静置过夜，待过柱纯化；

(3)次日将4℃静置的蛋白溶液离心18000rpm×30min，收集上清；

(4)Q Sepharose FF柱先用ddH20清洗4个柱体积；

(5)Wash Buffe(20mM Tris-HCl，pH9.1)平衡4个柱体积；

(6)将步骤(2)得到的上清上柱；

(7)Wash Buffer C洗涤2个柱体积；

(8)洗涤完毕，用elution buffer(20mM Tris-HCl，1M NaCl，pH9.1)梯度洗脱蛋白；

(9)每4mL收集一管，峰值蛋白每2mL收集一管，直至将蛋白峰收集完毕；

(10)Bradford法检测蛋白浓度；

(11)根据蛋白浓度测定结果，用SDS-PAGE凝胶电泳检纯化结果。

4)亲和层析分离纯化hDSL蛋白

(1)将离子交换层析纯化得到的各管蛋白混合；

(2)每10mL蛋白溶液加入1.43mL8×His-Tag咪唑补充液(0.4M imidazole，20mM Tris，pH8.5)，使蛋白样品中咪唑的终浓度为50mM，并调节溶液pH为8.5；

(3)4℃高速离心10000rpm×15min，收集上清；

(4)取10mL无菌针筒一只，将其倒置并垂直固定于支架上；

(5)剪切两块与针筒内径大小一致的滤纸膜，将其重叠至于针筒底部；

(6)取5mL His-Select^TM Nickel Affinity Gel介质置于针筒内部；

(7)用ddH20清洗4个柱体积；

(8)用1×His-Tag Charge Buffer(0.4M NiSO₄)平衡4个柱体积，使介质镍合；

(9)用1×His-Tag Binding Buffer(0.05M imidazole，0.5M NaCl，20mMTris，pH8.5)平衡4个柱体积；

(10)将步骤(3)得到的上清上柱；

(11)1×His-Tag Binding Buffer洗涤2个柱体积；

(12)1×His-Tag Wash Buffer(0.06M imidazole，0.5M NaCl，20mMTris，pH8.5)洗涤2个柱体积；

(13)1×His-Tag Elution Buffer(0.2M imidazole，0.5M NaCl，20mM Tris，pH8.5)洗脱目的蛋白，3个柱体积；

(14)每1mL收集一管；

(15)Bradford法检测收集的蛋白浓度；根据蛋白浓度测定结果，用SDS-PAGE凝胶电泳纯化结果，银染法检测蛋白纯度，显色基质鲎试剂测蛋白内毒素含量。纯化的rhDSL蛋白的内毒素含量为0.117EU/μg，可应用于相关的体内外研究。

如图3所示。(A)为Q Sepharose FF阴离子交换纯化后的结果，可见纯化后的蛋白液中含有杂蛋白。(B)为离子交换层析后再经亲和纯化的结果，可见rhDSL纯度较高，未见杂蛋白。(C)为阴离子交换层析与亲和层析纯化后蛋白的银染检测，蛋白上样量为100ng，未见杂带。因银染检测蛋白的灵敏度为0.3ng，因此纯化后rhDSL重组蛋白的纯度>99％。

实施例4rhDSL重组蛋白对Notch信号传导通路的活化

(1)1.3×10⁶C2成肌细胞转接至10cm培养皿中，于DMEM/10％FBS培养基中贴壁培养24h；

(2)更换培养基，加入纯化的rhDSL重组蛋白，使其终浓度为1.5μg/ml；

(3)17h后，收集细胞，Trizol抽提总RNA；

(4)取2μg总RNA逆转录合成cDNA；

(5)以cDNA为模板，PCR反应扩增目的基因Hes-1及对照的看家基因GAPDH，引物为：

Hes-1：

forward primer，5’-GAA AGA TAG CTC CCG GCAT-3’；

reverse primer，5’-GTC ACC TCG TTC ATG CAC T-3’.

GAPDH：

forward primer，5’-GGG CTC ATG ACC ACA GTC-3’；

reverse primer，5’-GTT CAG CTC TGG GAT GAC-3’.

(6)琼脂糖凝胶电泳检测目的条带的含量。

如图4所示。经rhDSL重组蛋白培养后的C2成肌细胞，其Notch信号下游靶基因Hes-1的表达量增高，说明rhDSL重组蛋白活化了Notch信号传导通路。

本发明涉及的rhDSL序列及记号分列如下：

<110>上海交通大学

<120>rhDSL重组蛋白及其制备方法

<210>1

<211>105

<212>PRT

<213>人(Homo sp.)

<400>1

His His His His His His Leu His Thr Asp Ser Pro Asp Asp Leu

1              5                  10                 15

Ala Thr Glu Asn Pro Glu Arg Leu Ile Ser Arg Leu Ala Thr Gln

               20                 25                 30

Arg His Leu Thr Val Gly Glu Glu Trp Ser Gln Asp Leu His Ser

               35                 40                 45

Ser Gly Arg Thr Asp Leu Lys Tyr Ser Tyr Arg Phe Val Cys Asp

               50                 55                 60

Glu His Tyr Tyr Gly Glu Gly Cys Ser Val Phe Cys Arg Pro Arg

               65                 70                 75

Asp Asp Ala Phe Gly His Phe Thr Cys Gly Glu Arg Gly Glu Lys

               80                 85                 90

Val Cys Asn Pro Gly Trp Lys Gly Pro Tyr Cys Thr Glu Pro Ile

               95                 100                105

Claims (10)

1、一种rhDSL重组蛋白，其特征在于为含有6×His组氨酸标签的Notch配体Delta-like-1的衍生多肽，所述衍生多肽由含有进化中的保守结构区DSL和与之相邻的N-端的50个氨基酸构成，共99个氨基酸，其氨基酸序列为：

LHTDSPDDLATENPERLISRLATQRHLTVGEEWSQDLHSSGRTDLKYSYRFVCDEHYYGEGCSVFCRPRDDAFGHFTCGERGEKVCNPGWKGPYCTEPI。

2、根据权利要求1所述的rhDSL重组蛋白，其特征是，所述rhDSL重组蛋白，以pQE30为表达载体构建表达质粒pQE30-hDSL。

3、根据权利要求1或2所述的rhDSL重组蛋白，其特征是，所述rhDSL重组蛋白，以大肠杆菌DH5α为载体进行重组蛋白的表达。

4、根据权利要求1或2所述的rhDSL重组蛋白，其特征是，所述rhDSL重组蛋白，在大肠杆菌中表达后以包涵体形式存在。

5、一种如权利要求1所述的rhDSL重组蛋白的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

第一步，构建rhDSL的重组表达质粒pQE30-hDSL；

第二步，以大肠杆菌DH5α为宿主表达rhDSL重组蛋白；

第三步，采用Q Sepharose阴离子交换层析与金属离子Ni²⁺亲和层析相结合的纯化方法进行rhDSL重组蛋白的纯化，得到rhDSL重组蛋白。

6、如权利要求5所述的rhDSL重组蛋白的制备方法，其特征是，所述构建rhDSL的重组表达质粒pQE30-hDSL，是指：以重组质粒pGEX-2T/hDSL为模板，PCR的方法扩增hDSL基因片段，包括进化中的保守结构区DSL和与之相邻的N-端的50个氨基酸，共99个氨基酸，共298bp；割胶回收后的PCR目的产物和原核表达质粒pQE30经限制性内切酶HindIII、BamH I双酶切，连接割胶回收后的酶切产物，并将连接产物转化到预先制备的DH5α感受态细胞中，挑选阳性克隆，经测序证实无突变且读框正确。

7、如权利要求6所述的rhDSL重组蛋白的制备方法，其特征是，所述原核表达质粒pQE30含6×His标签。

8、如权利要求5所述的rhDSL重组蛋白的制备方法，其特征是，所述以大肠杆菌DH5α为宿主表达rhDSL重组蛋白，是指：挑取pQE30-hDSL质粒的DH5α的单菌落，25～30mL LB培养基37℃振荡培养过夜，次日将过夜菌液按2％的接种量转接到1L～2L的LB培养基内，转接后37℃培养2.5～3.0h左右，待OD600＝0.6～0.8的时候停止培养，加入IPTG至终浓度为0.1mmol/L，诱导表达4h，收集菌体。

9、如权利要求8所述的rhDSL重组蛋白的制备方法，其特征是，所述LB培养基含100μg/mL Amp。

10、如权利要求5所述的rhDSL重组蛋白的制备方法，其特征是，所述rhDSL重组蛋白的纯化，是指：收集的菌体经超声裂解和溶菌酶裂解细菌后，离心，收集沉淀包涵体，包涵体经8M尿素变性后，用稀释法缓慢复性，取复性后的上清液经Q Sepharose阴离子交换层析，得到初步纯化的rhDSL重组蛋白，将阴离子交换层析后所得蛋白溶液进一步通过金属离子Ni²⁺亲和层析并透析，得到rhDSL重组蛋白。

Images