CN109797159A

CN109797159A - 小麦黄条纹病毒n基因重组表达蛋白、多克隆抗体制备方法及其应用

Info

Publication number: CN109797159A
Application number: CN201910159178.3A
Authority: CN
Inventors: 刘艳; 付玉梅; 杜真真; 王锡锋
Original assignee: Institute of Plant Protection of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Plant Protection of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2019-03-04
Filing date: 2019-03-04
Publication date: 2019-05-24
Anticipated expiration: 2039-03-04
Also published as: CN109797159B

Abstract

本发明公开了小麦黄条纹病毒N基因重组表达蛋白、多克隆抗体制备方法及其应用。多克隆抗体的制备包括以下步骤：根据WYSV的N基因的序列，首次优化密码子合成了该基因并亚克隆到用于大肠杆菌表达的靶载体pET‑30a中；重组蛋白经原核表达，免疫新西兰大白兔制备得到了WYSV‑N蛋白的多克隆抗体。Western blot检测表明制备的抗体能与有毒虫样品特异性结合，说明获得的抗体特异性高。本发明所述免疫荧光检测方法可以在实验室条件下快速检测介体昆虫是否携带WYSV，为WYSV的预测预报以及介体异沙叶蝉与WYSV互作机制的研究奠定了基础。

Description

小麦黄条纹病毒N基因重组表达蛋白、多克隆抗体制备方法及其应用

技术领域

本发明属于农业生物学技术领域，具体地涉及一种小麦黄条纹病毒N基因重组表达蛋白、多克隆抗体制备方法和基于抗体建立的免疫荧光标记的原位杂交病毒检测体系等应用，从而达到快速、高效检测WYSV及明确病毒组织分布的目的。

背景技术

小麦黄条纹病毒(Wheat yellow striate virus,WYSV)是2016年陕西韩城病害田间调查时发现的一种新的细胞核弹状病毒，由介体异沙叶蝉(Psammotettix striatus L.)以持久增殖方式传播，可由异沙叶蝉传播到小麦、大麦等禾本科作物上。异沙叶蝉(是一种农业昆虫，隶属于半翅目叶蝉科(Cicadellidae)角顶叶蝉亚科(Deltocephalinae)隆脊叶蝉族(Paralimnini)的沙叶蝉属(Psammotettix)。它广泛分布于欧洲、非洲北部、北美及亚洲中北部地区，同时也是我国的西北、华北地区干旱、半干旱地区麦田叶蝉的优势种受WYSV侵染的小麦无明显矮化，表现为严重黄化、发病叶片沿叶脉失绿，逐渐发展为从叶尖开始干枯，最后枯死。WYSV为负义单链RNA病毒，整个WYSV基因组全长为14486nt，含有7个开放阅读框(ORF)，每个ORF对应编码的蛋白分别为：核衣壳蛋白N(ORF1),磷蛋白P(ORF2),假定蛋白P3(ORF3),基质蛋白M(ORF4),糖蛋白G(ORF5),假定蛋白P6(ORF6)和聚合酶蛋白L(ORF7)七个蛋白，在反义链上以“N-P-P3-M-G-P6-L”顺序依次编码蛋白。目前这种病毒病的发生、流行规律尚不清楚，鉴于小麦黄条纹病毒病为虫传病毒，其大面积爆发主要依赖于介体异沙叶蝉的传播，因此检测异沙叶蝉的带毒率是该病害预测预报的前提，而且研究病毒在介体体内的分布和传毒机理可为控制小麦黄条纹病毒病流行的奠定基础。

介体昆虫带毒常见的检测手段有分子生物学如RT-PCR,核酸斑点杂交等，或者是一些基于血清学手段的检测如dot-ELISA、免疫荧光标记检测等。其中免疫荧光标记检测方法已被广泛应用于观察病毒在介体组织中的分布，如：Chen等人通过免疫荧光标记的方法观察了水稻矮缩病毒在介体黑尾叶蝉体内的分布；Chen等验证了莴苣侵染性黄化病毒CPm蛋白介导病毒在介体体内的滞留与传播；王亚娇等用WDV-CP重组蛋白制备的抗体检测了小麦矮缩病毒WDV在介体条沙叶蝉体内的分布。而病毒特异性抗血清是实施免疫荧光检测的前提。但是由于提纯植物病毒需要繁殖大量的毒源，并且提纯程序较为复杂，因此很多研究采用原核表达制备抗体。本研究首先用WYSV病毒编码的ORF1蛋白(即N蛋白)直接构建原核表达载体并尝试表达未获成功。继而，本发明优化了N基因的密码子并进行了原核表达，成功地制备了高特异性的多克隆抗体，并应用该抗体观察了WYSV在带毒条沙叶蝉肠道组织中的分布，以期为研究异沙叶蝉的传毒机制和WYSV的预测预报研究奠定基础。

发明内容

本发明的目的是提供一种小麦黄条纹病毒WYSV-N的抗体，并以此抗体为基础建立了免疫荧光标记检测方法，为病毒检测及在介体体内分布提供了一种快速、便捷、灵敏以及特异性好的方法。

一种基于小麦黄条纹病毒N基因的重组蛋白的制备方法，是将含有经密码子优化的小麦黄条纹病毒N蛋白重组质粒转入到大肠杆菌DL21原核系统中进行表达而得到；所述重组质粒是将含小麦黄条纹病毒N蛋白中第94至1188nt的核苷酸经密码子优化并添加有酶切位点、His标签以及终止密码子，按NdeI-(WYSV-N)--His tag--Stop codon-HindIII的顺序合成基因，利用无缝克隆技术将合成基因转入载体pET-30a中得到阳性重组质粒，合成基因的氨基酸的序列如SEQ ID No.1，所述的核苷酸的序列如SEQ ID No.2所示。

所述表达而得到的重组蛋白需经过纯化，所述纯化是应用Ni²⁺NTA亲和层析柱纯化回收蛋白：将获得含有N蛋白的上清液，通过Ni²⁺亲和柱，再用5倍柱体积的250mM咪唑浓度洗脱缓冲液洗脱，收集洗脱下来的蛋白并利用分光光度仪测定A280处读数，当有蛋白峰时开始收集样品，直至A280又恢复至基准线，得到纯化的重组蛋白。

上述方法制备得到的重组蛋白。

一种基于小麦黄条纹病毒N蛋白的多克隆抗体的制备方法，将上述纯化的重组蛋白作为抗原通过皮下多点注射新西兰大白兔免疫制备得到多克隆抗体。

所述注射是将纯化后的可溶性N蛋白与完全弗氏佐剂乳化后，皮下多点免疫于新西兰雄兔，10天后进行第二次免疫，以后每隔一周加强免疫，加强免疫采用与不完全弗氏佐剂乳化，大腿肌肉注射方法。

所述免疫制备得到多克隆抗体的方法为在免疫后5d取少量血清，用间接ELISA测定抗体的效价，当效价达到l：100 000以上时，取血并分离血清，采用protein A-Sepharoseaffinity column从抗血清中提纯获得多克隆抗体anti-WYSV-N-IgG。

上述方法制备得到的小麦黄条纹病毒N蛋白多克隆抗体。

所述小麦黄条纹病毒N蛋白多克隆抗体在检测WYSV病毒中的应用。

所述检测的方法为免疫荧光原位杂交检测。

所述免疫荧光原位杂交检测，包括上述小麦黄条纹病毒N蛋白多克隆抗体和FITC标记的二抗。

所述的二抗为商品化的FITC标记的Goat anti-rabbit IgG-561抗体，其工作浓度为1:200。

所述的免疫荧光原位杂交检测方法，其特征在于：

显微解剖镜下解剖出带毒介体异沙叶蝉的消化道，用4％的多聚甲醛固定2h，磷酸盐缓冲液(PBS)清洗3次；0.2％Triton-X-100渗透30min，PBS清洗3次；加入用抗体稀释液(含有3％牛血清白蛋白的PBS)稀释后的一抗anti-WYSV-N(1:200)孵育1h，PBS清洗3次；再用以1:200比例稀释FITC标记的Goat anti-rabbit IgG-561二抗和以1:20的比例稀释肌动蛋白(Actin)染料即罗丹明标记的鬼笔环肽(Invitrogen公司)共同孵育1h，PBS清洗3次；最后将消化道固定在载玻片上，用共聚焦显微镜(Leica TCS SP5,Germany)观察分析。通过观察荧光反应判断实验结果：待测的样品中肠道或唾液腺部位如显示有绿色荧光，则携带WYSV病毒；否则待测样品不携带WYSV病毒。

本发明利用原核表达经密码子优化的WYSV-N蛋白，制备了多克隆抗体(polyclonal antibodies，PAbs)，并利用制备的抗体建立WYSV的免疫荧光标记的原位杂交病毒检测体系。

本发明具有以下优点：

1)利用原核表达的经密码子优化的WYSV-N蛋白作为免疫原，克服了全长序列难以正常表达的缺点。制备的多克隆抗体与其他病毒或健康样品均无交叉反应，能特异性地检测携WYSV的介体昆虫样品，说明该抗体能很好地用于WYSV病毒的检测。

2)利用制备的WYSV病毒的特异性多克隆抗体建立了一种免疫荧光标记原位杂交检测方法，该方法具有快速灵敏、特异性强，无需PCR，操作简单方便，兼顾实用性和快速性，具有良好的应用前景。为研究WYSV在介体条沙叶蝉体内的分布以及WYSV与介体的互作机制的研究奠定了基础。本实验为研究其它昆虫的获毒、病毒与介体的特异性识别以及病毒在昆虫体内的运动提供理论参考。

附图说明

图1.重组N蛋白的NdeI和HindШ双酶切验证：M)Marker DL10000；1)pET-30a空载体；2)pET-30a-N。

图2.SDS-PAGE电泳分析WYSV-N重组蛋白的表达：PC1)BSA(1μg)；PC2)BSA(2μg)；M1)蛋白marker；NC)未诱导全细胞裂解物；1)15℃诱导16小时的细胞裂解物；2)37℃诱导4小时的细胞裂解物；NC1)未诱导的细胞裂解物上清液；NC2)未诱导的细胞裂解物的碎片；3)在15℃诱导16小时的细胞裂解物上清液；4)在15℃诱导16小时的细胞裂解物的碎片；5)在37℃诱导4小时的细胞裂解物上清液；6)在37℃诱导4小时的细胞裂解物的碎片。

图3.Western-blot分析WYSV-N重组蛋白的表达：M2)蛋白marker；1)15℃诱导16小时的细胞裂解物；2)37℃诱导4小时的细胞裂解物；3)在15℃诱导16小时的细胞裂解物上清液；4)在15℃诱导16小时的细胞裂解物的碎片；5)在37℃诱导4小时的细胞裂解物上清液；6)在37℃诱导4小时的细胞裂解物的碎片。

图4.Western-blot分析WYSV-N多克隆抗体的特异性：1)蛋白Marker；2)异沙叶蝉无毒虫样品；3)异沙叶蝉有毒虫样品。

图5.WYSV病毒在异沙叶蝉总肠道中的分布观察：A)和B)分别为有毒虫和无毒虫肠道组织。其中肠道各部位分别为：Oe：食管；fc：滤室；amg：前中肠；mmg：中中肠；pmg：后中肠；hg：后肠；mt：马氏管。

图6.WYSV病毒在有毒异沙叶蝉虫体的前中肠(A)和中中肠(B)中的分布观察。

图7.WYSV病毒在异沙叶蝉唾液腺中的分布观察：A)和B)分别为无毒虫和有毒虫唾液腺组织。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件。

需特别指出的是，尽管本发明阐述的是应用WYSV N重组蛋白抗体，针对异沙叶蝉体内WYSV的免疫荧光病毒鉴定技术，因此应用本发明对任何WYSV引起在其他介体昆虫上检测均也包括在本发明所要求的权利范围之内。

下述实验病毒，本申请人实验室均有保存，可以对外公开发放。

实施例1.小麦黄条纹病毒N蛋白的基因优化及合成、亚克隆

根据WYSV的全长基因序列(GenBank登录号MG604920)，利用软件分析该病毒的ORF1编码的蛋白即糖蛋白Nucleocapsid protein(N)，发现N蛋白基因全长1635nt，编码544个氨基酸，预测的分子量和等电点分别为59.8KDa和8.81。

利用在线软件SignalP(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)和TMHMMServer v.2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)预测蛋白的信号肽和跨膜区,经分析发现WYSV的N蛋白没有潜在的信号肽剪切位点和跨膜区。运用Optimum Gene^TM密码子优化技术(南京金斯瑞公司科技有限公司),最终选取365个氨基酸(原蛋白核苷酸序列的第94至1188nt)优化密码子，并在3’端加上His标签，按“NdeI--(WYSV-N)--His tag--Stopcodon--HindIII”基因合成策略进行合成(氨基酸序列见SEQ ID No.1和对应的核苷酸序列见SEQ ID No.2)，再将合成的基因利用无缝克隆技术克隆至pET-30a(+)(Novagen公司)的载体中，经NdeI和HindIII双酶切验证准确无误后(酶切图1)，用于下一步实验。

实施例2.WYSV-N重组蛋白表达及纯化

将重组表达质粒pET-30a-(WYSV-N)通过热击发转化至BL21(DE3)表达菌株，经测序验证后，将挑选阳性克隆即含有正确重组表达质粒的BL21菌液接种于含50ug/mL卡那霉素的4mL LB液体培养基中，37℃、200rpm培养至OD600为0.6～0.8，加入IPTG至终浓度为0.3mmol/L在15℃条件下诱导16h，然后37℃继续诱导培养4h后收集1mL菌液，离心收集菌体。经12％的SDS-PAGE凝胶电泳检测，分别检测全菌、上清和沉淀中蛋白表达情况。发现在诱导处理的样品中检测到目的蛋白特异表达，大小约为42kDa，与预计的融合蛋白大小一致，而在未诱导的样品中没有检测到目的条带(图2)。因表达的蛋白带有6×His标签靶序列，故利用6×His标签单克隆抗体(南京金斯瑞生物技术有限公司,货号A00186)进行Western blot分析，结果发现表达的重组蛋白与6×His单克隆抗体有特异性反应(图3)，表明WYSV的N蛋白基因已经在大肠杆菌DL21中融合表达。应用Ni²⁺NTA亲和层析柱纯化回收蛋白。获得含有N蛋白的上清液，将该上清液通过Ni²⁺亲和柱，再用5倍柱体积的250mM咪唑浓度洗脱缓冲液洗脱，收集洗脱下来的蛋白并利用分光光度仪测定A280处读数，当有蛋白峰时开始收集样品，直至A280又恢复至基准线，得到纯化的N蛋白，储存于含0.5％SDS的1×PBS缓冲液中(pH 7.4)。

实施例3.N蛋白抗体的制备

纯化后的可溶性蛋白与完全弗氏佐剂乳化后，皮下多点免疫于新西兰雄兔，10天后进行第二次免疫，以后每隔一周加强免疫，加强免疫采用与不完全弗氏佐剂乳化，大腿肌肉注射方法。每次免疫后5d取少量血清，用间接ELISA测定抗体的效价，当效价达到l：100000以上时，取血并分离血清。采用protein A-Sepharose affinity column从抗血清中提纯获得anti-WYSV-N-IgG，按照500×2¹(1000)至500×2¹⁰(512 000)连续倍比稀释，实验分别以免疫前血清为阴性对照和PBS缓冲液为空白对照，结果表明，间接ELISA测定效价大于1:512000。然后，提取取食过WYSV的叶蝉及健康虫体的总蛋白，经SDS-PAGE凝胶电泳后，电转至硝酸纤维素膜上，用封闭缓冲液稀释的多抗血清作为一抗(1:200稀释)，进行Westernblot特异性分析，结果表明取食过WYSV的叶蝉提取液中有一条约42kDa大小的条带，而健康虫体的提取液中没有，说明提纯的抗体有较好的特异性(图4)。

实施例4.N抗体应用于免疫荧光标记观察WYSV在介体异沙叶蝉体内的定位研究

选取3-4龄无毒的异沙叶蝉，在WYSV病株上饲毒两天，转移至健株饲养2周以上度过循回期保证充分带毒。在显微镜下进行解剖无毒和带毒叶蝉，经过免疫荧光标记，对消化道部位进行观察，解剖出消化道和唾液腺，用4％的多聚甲醛室温固定2h，0.01M磷酸盐缓冲液(PBS)清洗3次；加入0.2％Triton-X-100渗透30min，用0.01M的PBS清洗3次，每次10min；加入用抗体稀释液(含有3％牛血清白蛋白的PBS)稀释后的一抗anti-WYSV-N(1:200)37℃孵育1h，0.01M的PBS清洗3次；用0.01M PBS分别以1:200比例稀释FITC标记的Goat anti-rabbit IgG-561二抗、以1:20的比例稀释肌动蛋白(Actin)染料即罗丹明标记的鬼笔环肽(Invitrogen公司)，把肠道等组织小心地放入该稀释液中，37℃下避光孵育1h，用0.01M的PBS清洗3次，每次10min；取一载玻片加一滴甘油，将肠道等组织小心地放入甘油中，并盖上盖玻片，用共聚焦显微镜(Leica TCS SP5,Germany)进行观察分析。在共聚焦显微镜下发现抗体能够在带毒叶蝉肠道组织特异性地结合WYSV病毒(绿色荧光标记)上面(图5中A)，而无毒叶蝉肠道组织中未发现荧光信号(图5中B)，说明制备的抗体能很好地用于介体内WYSV病毒的检测。WYSV主要分布在条沙叶蝉的前中肠(图6中A)和中中肠部位(图6中B)，在肠道其它部位未发现明显荧光信号。此外，带毒叶蝉唾液腺组织能特异性地结合WYSV病毒(绿色荧光标记)(图7中A)，而无毒叶蝉唾液腺组织中未发现绿色荧光信号(图7中B)。

序列表

<110> 中国农业科学院植物保护研究所

<120> 小麦黄条纹病毒N基因重组表达蛋白、多克隆抗体制备方法及其应用

<141> 2019-03-04

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 372

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Gly Ala Ser Cys Ser Ser Ile Ser His Phe Lys Asn Pro Asn Asn

1 5 10 15

Asn Phe Thr Gly Thr Met Ala Gln Asn Pro Asn Val Ala Asn Tyr Ala

20 25 30

Asn Ala Ala Pro Leu Pro Arg Phe Glu Gly Leu Gly Asp Arg Glu Asn

35 40 45

Leu Ala Pro Ile Gly Asn Glu Ala Val Glu Ile Pro Tyr Gln Lys Glu

50 55 60

Ala Tyr Leu Ala Trp Ile Asn Glu Gly Arg Val Phe Gln Val Asn Gln

65 70 75 80

Leu Thr Asp Glu Gln Met Ile Gln Met Trp Glu Thr Val Lys Thr Ser

85 90 95

Met Gln Gly Asn Thr Phe Ser Glu Gln His Met Arg Asp Ile Val Gln

100 105 110

Met Ala Cys Asn Leu Lys Gly Val Asp Pro Ala Thr Lys Pro Leu Tyr

115 120 125

Arg Gln Tyr Glu Met Pro Glu Asn Gly Arg Trp Ala Asp Ala Pro Ser

130 135 140

Gln Asp Pro Ile Phe Ser Gly Gln Gln Val Ala Gly Val Ile Val Pro

145 150 155 160

Leu Gln Glu Ala Gln Pro Leu Val Glu Asp Val Ser Gly Lys Ala Arg

165 170 175

Ala Ile Gly Phe Ile Cys Gly Phe Leu Leu Arg Phe Ile Val Lys Thr

180 185 190

Glu Glu His Leu Asn Asn Ser Leu Ala Asn Leu Lys Leu Gln Phe Ser

195 200 205

Arg Ile Tyr Gly Val Gln Ser Ala Thr Ile Asn Gln Trp Asn Pro Thr

210 215 220

Thr Thr Trp Ala Ser Arg Ile Lys Leu Ala Phe Asp Thr Tyr Leu Thr

225 230 235 240

Leu Arg Ala Thr Val Ala Leu His Val Ala Leu Ala Asp Gly Asn Leu

245 250 255

Asn Ala Asp Asn Val Asn Phe Gly Leu Cys Arg Met Leu Val Phe Gln

260 265 270

His Leu Glu Leu Ser Gly Leu Gln Leu Tyr Lys Met Thr Met Thr Leu

275 280 285

Ile Ser His Leu Asn Leu Ile Ser Pro Ala Lys Phe Leu Ser Trp Val

290 295 300

Tyr Asp Pro Leu Ala Glu Lys Pro Ile Thr Gln Ile Tyr Thr Ile Ala

305 310 315 320

Thr Thr His Asp Thr Arg Asp Arg Gln Asp Gln Lys His Trp Lys Tyr

325 330 335

Ala Lys Leu Ala Arg Gly Gln Tyr Trp Leu Asp Thr Thr Val Lys Arg

340 345 350

Asn Gln Phe Phe Ala Tyr Val Leu Ala Asp Leu Glu Val Arg His His

355 360 365

His His His His

370

<210> 2

<211> 1131

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

catatgggcg cgagctgcag cagcatcagc cacttcaaga acccgaataa taactttacc 60

ggcaccatgg cgcagaaccc gaatgttgcg aactatgcga acgcggcgcc gctgccgcgt 120

tttgagggtc tgggcgatcg tgaaaacctg gcgccgattg gtaacgaggc ggtggaaatc 180

ccgtaccaga aagaggcgta tctggcgtgg attaacgaag gccgtgtgtt tcaggttaac 240

caactgaccg acgagcagat gatccaaatg tgggaaaccg ttaagaccag catgcagggt 300

aacaccttca gcgagcaaca catgcgtgat atcgtgcaga tggcgtgcaa cctgaaaggt 360

gttgacccgg cgaccaagcc gctgtaccgt caatatgaga tgccggaaaa cggccgttgg 420

gcggatgcgc cgagccagga cccgattttc agcggtcagc aagtggcggg cgtgatcgtt 480

ccgctgcagg aagcgcaacc gctggttgag gatgttagcg gtaaagcgcg tgcgatcggt 540

ttcatttgcg gctttctgct gcgtttcatt gtgaaaaccg aggaacacct gaacaacagc 600

ctggcgaacc tgaagctgca gtttagccgt atttacggcg ttcagagcgc gaccatcaac 660

caatggaacc cgaccaccac ctgggcgagc cgtatcaaac tggcgttcga cacctatctg 720

accctgcgtg cgaccgtggc gctgcatgtt gcgctggcgg atggtaacct gaacgcggac 780

aacgtgaact ttggcctgtg ccgtatgctg gttttccaac acctggagct gagcggtctg 840

cagctgtata agatgaccat gaccctgatt agccacctga acctgatcag cccggcgaaa 900

tttctgagct gggtgtacga tccgctggcg gaaaagccga tcacccaaat ttataccatc 960

gcgaccaccc acgacacccg tgatcgtcag gaccaaaagc actggaaata cgcgaagctg 1020

gcgcgtggcc agtattggct ggacaccacc gttaagcgta atcaattctt cgcgtatgtt 1080

ctggcggacc tggaagttcg tcatcaccat catcatcatt aatgaaagct t 1131

Claims

1.一种基于小麦黄条纹病毒N基因的重组蛋白的制备方法，是将含有经密码子优化的小麦黄条纹病毒N蛋白重组质粒转入到大肠杆菌DL21原核系统中进行表达而得到；所述重组质粒是将含小麦黄条纹病毒N蛋白中第94至1188nt的核苷酸经密码子优化并添加有酶切位点、His标签以及终止密码子，按NdeI-(WYSV-N)--His tag--Stop codon-HindIII的顺序合成基因，利用无缝克隆技术将合成基因转入载体pET-30a中得到阳性重组质粒，合成基因的氨基酸的序列如SEQ ID No.1，所述的核苷酸的序列如SEQ ID No.2所示。

2.根据权利要求1所述的制备方法中，所述表达而得到的重组蛋白需经过纯化，所述纯化是应用Ni²⁺NTA亲和层析柱纯化回收蛋白：将获得含有N蛋白的上清液，通过Ni²⁺亲和柱，再用5倍柱体积的250mM咪唑浓度洗脱缓冲液洗脱，收集洗脱下来的蛋白并利用分光光度仪测定A280处读数，当有蛋白峰时开始收集样品，直至A280又恢复至基准线，得到纯化的重组蛋白。

3.根据权利要求1-2任一所述方法制备得到的重组蛋白。

4.一种基于小麦黄条纹病毒N蛋白的多克隆抗体制备方法，将纯化的权项3所述的重组蛋白作为抗原通过皮下多点注射新西兰大白兔免疫制备得到多克隆抗体。

5.根据权利要求4所述的制备方法，所述注射是将纯化后的可溶性N蛋白与完全弗氏佐剂乳化后，皮下多点免疫于新西兰雄兔，10天后进行第二次免疫，以后每隔一周加强免疫，加强免疫采用与不完全弗氏佐剂乳化，大腿肌肉注射方法；

6.权利要求4-5任一所述的制备方法制备得到的小麦黄条纹病毒N蛋白多克隆抗体。

7.权利要求6所述多克隆抗体在WYSV病毒检测中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，所述检测的方法为免疫荧光原位杂交检测。

9.根据权利要求8所述的应用，所述免疫荧光原位杂交检测采用权利要求6所述的小麦黄条纹病毒N蛋白多克隆抗体，和FITC标记的二抗；所述的二抗为商品化的FITC标记的Goatanti-rabbit IgG-561抗体，其工作浓度为1:200。

10.根据权利要求9所述的应用，所述的免疫荧光原位杂交检测方法如下：

显微解剖镜下解剖出带毒介体异沙叶蝉的消化道，用4％的多聚甲醛固定2h，磷酸盐缓冲液PBS清洗3次；0.2％Triton-X-100渗透30min，PBS清洗3次；加入用抗体稀释液即含有3％牛血清白蛋白的PBS稀释后的一抗anti-WYSV-N孵育1h，PBS清洗3次，所述一抗工作浓度为1:200；再用以1:200比例稀释FITC标记的Goat anti-rabbit IgG-561二抗和以1:20的比例稀释肌动蛋白Actin染料即罗丹明标记的鬼笔环肽共同孵育1h，PBS清洗3次；最后将消化道固定在载玻片上，用共聚焦显微镜观察分析；通过观察荧光反应判断实验结果：待测的样品中肠道或唾液腺部位如显示有绿色荧光，则携带WYSV病毒；否则待测样品不携带WYSV病毒。