JP2010516251A - ジスルフィド結合を含む活性なタンパク質の増強された無細胞合成の方法 - Google Patents
ジスルフィド結合を含む活性なタンパク質の増強された無細胞合成の方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2010516251A JP2010516251A JP2009546434A JP2009546434A JP2010516251A JP 2010516251 A JP2010516251 A JP 2010516251A JP 2009546434 A JP2009546434 A JP 2009546434A JP 2009546434 A JP2009546434 A JP 2009546434A JP 2010516251 A JP2010516251 A JP 2010516251A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- reaction mixture
- sulfhydryl
- protein
- cell
- concentration
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
Description
大腸菌(Escherichia coli)は、異種タンパク質の発現のために広く用いられる生物である。それは、安価な基質上で高い細胞密度まで容易に増殖し、優れた体積的および経済的な生産性を提供する。十分に確立された遺伝子組換え技術および各種発現ベクターによって、大腸菌の使用が生産用宿主として正当であることがさらに証明される。しかしながら、活性な生体分子の効率的な生産のためには、高速なタンパク質合成は、必要であるが決して十分ではない。生物学的に活性であるためには、ポリペプチド鎖が、ジスルフィド結合の適切な形成を含む、正確な天然の三次元構造に折り畳まれなければならない。
生物学的に活性なタンパク質、特に一つまたは複数のジスルフィド結合を含むタンパク質の無細胞合成用の組成物および方法を提供する。本発明の一つの態様において、無細胞タンパク質合成の開始前に、反応用混合物は、内在性の酸化還元酵素反応に関係する酵素の不活性化によって安定化される。これらの態様のいくつかにおいて、無細胞合成系は、グルタチオン還元酵素遺伝子が不活性化され、かつ/またはチオレドキシン還元酵素遺伝子がタンパク質の除去に有用なアフィニティータグを含むように操作された細菌株由来の細胞抽出物を含む。抽出物は、遊離のスルフヒドリル基を不活性化、例えば、非可逆的に不活性化する低濃度の化合物で処理されている。
本発明が、記載された特定の方法、手順、細胞株、動物種または属、および試薬に制限されず、それ自体変更され得ることが理解されなければならない。また、本明細書で使用する専門用語は、特定の態様を説明する目的のためのみに用いられ、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される本発明の範囲を制限する意図はないことも理解されなければならない。
本発明の方法において、無細胞合成反応の前に、合成反応用混合物の細胞抽出物成分は、例えば遊離スルフヒドリルのアルキル化またはアセチル化によって、スルフヒドリル基を化学的に阻害する低濃度の化合物で処理される。この「低濃度」は、例えば、図5に示したように、反応用混合物中における抽出物が、エネルギー源としてグルコースまたは高エネルギーリン酸結合を欠いた解糖中間体を用いて、ポリペプチドを翻訳および/またはポリヌクレオチドを転写する能力を保持したまま、図3〜4に示したように、合成反応における適切に折り畳まれたポリペプチド数の増加、例えば、未処理の抽出物と比較して少なくとも約25%、少なくとも約50%、少なくとも約100%、少なくとも約150%、少なくとも約200%またはそれ以上の増加を提供する濃度である。
本発明の目的のため、生物抽出物は、通常は細菌細胞の抽出物である、タンパク質合成機構の構成成分を含む任意の調製物であって、そのような構成成分は、所望のタンパク質をコードする核酸を翻訳できる。従って、細菌抽出物は、所望のタンパク質をコードする伝令リボ核酸(mRNA)を翻訳できる構成成分を含み、かつ所望のタンパク質をコードするDNAを転写できる構成成分を任意で含む。そのような構成成分は、例えば、DNA依存性RNAポリメラーゼ(RNAポリメラーゼ)、所望のタンパク質をコードするDNAの転写開始に必要な任意の転写活性化因子、転移リボ核酸(tRNA)、アミノアシルtRNA合成酵素、70Sリボソーム、N10-ホルミルテトラヒドロ葉酸、ホルミルメチオニン-tRNAfMet合成酵素、ペプチド転移酵素、IF-1、IF-2、およびIF-3のような開始因子、EF-Tu、EF-Ts、およびEF-Gのような伸長因子、RF-1、RF-2、およびRF-3のような終結因子、などを含む。
本願方法のための生物抽出物は、酸化還元緩衝液を還元するように作用する、抽出物中の酵素および他の生体分子を実質的に除去するために最適化されている。特定の望ましくない酵素、例えばグルタチオン還元酵素は、遺伝子的に不活性化されるか、または反応用混合物に利用される細胞抽出物から除去されている。さらに、反応用混合物は、上述のとおり、低濃度の不活性化剤で処理されてもよい。そのような処理の最適な濃度は、もしあれば、記載された実験例において説明したような方法によって、容易に決定することができる。
本願発明における合成反応用混合物は、酸化還元緩衝液の追加によって改変されてもよい。そのような緩衝液は、一つまたは複数のグルタチオン、システイン、ホモシステインなどのような、遊離のスルフヒドリル基および/またはジスルフィド結合を有する化合物を、還元型もしくは酸化型、または両者の混合物として含む。選択された反応時間で求められる還元能力または酸化能力に達するために必要な、還元剤および/または酸化剤の濃度、ならびに酸化型および還元型の比率は、還元剤または酸化剤の強さ、系における酸素レベル、および反応時間の長さによって変化すると考えられる。
本願発明の反応用混合物は、折り畳みおよびジスルフィド結合の形成を増強する一つまたは複数の酵素、すなわちフォルダーゼ、シャペロニン、などの含有によってさらに改変されてもよい。本発明の一つの態様において、細菌のフォルダーゼ酵素が反応用混合物に添加される。例えば、ジスルフィド結合形成を触媒する多くのシステイン酸化還元酵素が、大腸菌において特徴付けられてきた。関心対象の酵素またはシャペロニンは、RotA(PpiA)、FkpA、Skp、SurA、PpiD、DsbA、DsbB、DsbC、DsbD、PDI(タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ)、GroEL/ES、DnaK、DnaJ、GrpE、BIP(免疫グロブリン重鎖結合タンパク質)、PPI(ペプチジルプロリルイソメラーゼ)、およびサイクロフィリンなどを含む(Schafer et al. (1999) J Biol Chem 274(35):24567-74;Muller et al. (2001) Prog Nucleic Acid Res Mol Biol. 66:107-57参照)。発現されたタンパク質生成物の生物学的活性の力価測定によって実験的に決定される、関心対象の標的タンパク質全体の活性の向上に効果的である濃度で、折り畳み酵素が添加される。
上記のように、本発明は、生物学的に活性なタンパク質、特に一つまたは複数のジスルフィド結合を含むタンパク質を合成するための方法およびシステムである。無細胞タンパク質合成用の反応用混合物は、タンパク質の折り畳みおよびジスルフィド結合の形成を改善するために改変され、その方法は、高エネルギーリン酸結合を欠いたエネルギー源、例えばグルコースおよび解糖中間体の使用を含んでもよい。
材料および方法
KGK10株の構築
ここでの目的は、グルタチオン還元酵素(Gor)をコードする遺伝子の除去およびヘマグルチニンタグ(HAタグ)をコードする配列をtrxB遺伝子に加えることであった。後者のため、Datsenko and Wanner (2000) Proc Natl Acad Sci USA 97:6640-5に記載のpKD3プラスミドを鋳型とし、プライマー
を用いてPCRカセットを作製した。これらのプライマーにおいて、相同領域を小文字で示し、HAタグ配列には下線を引き、終止コドンは太字とし、そしてpKD3プラスミドにアニールする領域は大文字とする。このカセットは、BW25113 pDK46株で形質転換し、LB-クロランフェニコール上で選択した。成功した組換え体からKC6へ遺伝子変異を移行するために、P1バクテリオファージでの形質導入を用いた。次に、pCP20プラスミドからのFLPリコンビナーゼの発現を用いて、クロランフェニコール耐性マーカーを除去して菌株KC6 TrxB-HAを得た。
を用いてPCRカセットを作製した。gorが除去され、trxBが3' HAタグ配列を獲得し、かつahpCが変異していないか確認するために、KGK10におけるtrxB、gor、およびahpCの位置を配列決定した。
グルコースおよびアミノ酸を、酢酸塩の蓄積を回避しながら高細胞密度まで対数増殖を可能にする手段(Zawada and Swartz (2005) Biotechn and Bioeng 89:407-415)を用いて発酵槽に供給した、確定した培地を用いて、10リットルの発酵槽でKGK10またはKC6を増殖させた。30 OD600で発酵槽を回収し、Liu et al. (2005) Biotech Prog 21:460-465に記載のように抽出物を調製した。
表示されているものを除いて、全ての化学薬品はSigma-Aldrich(セントルイス、ミズーリ州)から購入した。この研究では、二つの類似の無細胞タンパク質合成系を用いた。どちらの系も、以下の標準的な成分を含んだ:130 mMグルタミン酸カリウム;10 mMグルタミン酸アンモニウム;1.2 mM AMP;0.85 mMのGMP、UMP、およびCMPのそれぞれ;1.5 mMスペルミジン;1.0 mMプトレッシン;34μg/mLフォリン酸;170.6μg/mL 大腸菌tRNA混合物(Roche、インディアナポリス、インディアナ州);10 mMリン酸カリウム(pH 7.2);20の天然アミノ酸2 mMずつ;5μM L-[U-14C]-ロイシン(Amersham Pharmacia、ウプサラ、スウェーデン);0.33 mMニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NAD);0.27 mMコエンザイムA(CoA);26.6μg/mLプラスミド;100μg/mL T7 RNAポリメラーゼ;および0.24体積の大腸菌S30抽出物。PANOx-SP系は、16 mMグルタミン酸マグネシウム;33 mMホスホエノールピルビン酸(PEP;Roche、インディアナポリス、インディアナ州);および2.7 mM シュウ酸ナトリウムも含んだ。標準的な試薬に加えて、グルコース系は、8 mMグルタミン酸マグネシウム; 90 mM Bis-Tris緩衝液pH 7.0;および33 mMグルコースを含んだ。
反応直後に、インビトロ合成反応のサンプル5μLを一片のろ紙上に滴下した。タンパク質に取り込まれたL-[U-14C]-ロイシン量を、合成されたタンパク質を沈殿させるため、すでに記述されたトリクロロ酢酸法(Calhoun and Swartz (2005) Biotechnol Prog 21:1146-53)を用いて、液体シンチレーションカウンター(LS3801、Beckman Coulter, Inc.)で定量化した。生産物であるタンパク質の可溶性分画は、14,000 x gで15分間4℃でサンプルを遠心分離して単離した。上精の5μLを用いて、同様の方法でL-[U-14C]-ロイシンの取り込みを測定した。
酸化グルタチオンの還元を、スルフヒドリル基濃度の増加を経時的に観察することによって測定した。インビトロ合成反応の全量15μLを等量の10%トリクロロ酢酸で希釈し、12,000 x g、4℃で10分間遠心分離した。上清の10μLを、96穴マイクロタイタープレートのウェルに加えた。各ウェルに、90μLの1 M Tris-HCl(pH 7.8)と0.44 mg/mL DTNB (5,5'-ジチオビス-2-ニトロ安息香酸、TCI America)を加えた。室温で3分後、412 nmでの吸光度を測定し、既知の濃度のGSH溶液で確定した検量線との比較から、遊離のチオール濃度を決定した。
チオレドキシン還元酵素は、すでに記述されたようにインビトロ合成反応で生産された(Knapp and Swartz (2004) FEBS Lett 559:66-70)。少量の濃縮されたKOHまたはHClにより、未精製反応生産物のアリコートのpHを、所望の値に調整した。続いてこれらのアリコートを、IAMの最終濃度が7mMとなるように、少量のIAM濃縮物と混合した。これらのサンプルを室温で30分間インキュベートし、続いてこのサンプルのチオレドキシン還元酵素活性を測定した。チオレドキシン還元酵素の活性試験は、以下の構成要素を含む:50 mM リン酸二水素ナトリウム pH 7.6、1.5 mM EDTA、10 mM グルコース6-リン酸、200μM DTNB、300μM NADPH、3μM 大腸菌チオレドキシン(EMD Biosciences;ダルムシュタット、ドイツ)、および0.2 Uグルコース6-リン酸脱水素酵素(Sigma)。約500 ngのチオレドキシン還元酵素を、1 mLの試験用混合物に加え、412 nmにおける吸光度の増加速度を37℃で90秒間測定した。DTNBは、還元されて2分子のニトロチオ安息香酸を生成した。反応速度の計算には、ニトロチオ安息香酸の吸光係数(13,600 M-1 cm-1)を用いた。
遠心分離後、上清10μLを、80μLの試験緩衝液(50 mM Tris-HCl、38 mM NaCl pH 8.8)および10μLの基質溶液(2 mM Chromozym U;Roche Applied Science)を含むマイクロタイタープレートのウェルに加えた。405 nmにおける吸光度の変化速度を、マイクロプレートリーダー(SpectraMax 190、Molecular Devices)で測定した。マウスウロキナーゼのセリンプロテアーゼ領域を、記述(Kim and Swartz (2004) Biotechnol Bioeng 85:122-9)にしたがって生産、精製、および試験した。この研究により、87 ngの酵素が10 mOD-mL/分の活性を発生することが示された。活性なUKの収量は、その比活性に基づいて算出した。
mGM-CSFの生物学的活性を、マウスGM-CSF依存性細胞株NFS-60に対する増殖誘導能によって試験した。NFS-60細胞は、酵母由来GM-CSF(Immunex)存在下、10%FCSを含むRPMI培地(Invitrogen)で増殖させた。細胞は対数期に回収して、3回洗浄し、そしてウェル当たり5000細胞の濃度で、標準的な96穴組織培養プレートに蒔いた。三通りの希釈した標準的な大腸菌由来のmGM-CSF(R&D Systems、ミネアポリス、ミネソタ州)または無細胞発現mGM-CSFをウェルに加え、5%二酸化炭素環境下、37℃でインキュベートした。約20時間後、6.7μCi/mLの[3H]-チミジン(Amersham Biosciences)を加えて、インキュベーションを再開した。7から10時間後に、グラスファイバーフィルターマット上に細胞を回収し、Wallach 1450 Micro-betaシンチレーションカウンター(PerkinElmer、ウェレスレイ、マサチューセッツ州)により[3H]-チミジン取り込みを測定した。
本発明者らは、アフィニティー除去過程と組み合わせた場合に、全ての公知である細胞質での還元経路を欠いた無細胞抽出物をもたらす、二つの染色体改変を、菌株KC6(Calhoun and Swartz (2006) J Biotechnol. 123:193-203)に対して行った。第一の変異は、GSSGの還元を触媒する酵素であるgorを除去することである。図1Aのデータは、この除去ではGSSG(KGK10細胞抽出物)を完全に安定化しないことを示している。本発明者らは、Δgor株におけるGSSGの継続する還元は、チオレドキシン還元酵素(TrxB)が介在する系の活性が原因であると判断した。
Claims (21)
- 少なくとも一つのジスルフィド結合を含む適切に折り畳まれたポリペプチドの無細胞合成方法であって、
この改良点が、グルタチオン還元酵素を不活化するために遺伝子操作され、かつ低濃度のスルフヒドリル不活性化剤で前処理された細菌細胞に由来する生物抽出物を含む反応用混合物において該ポリペプチドを合成することを含み、
低濃度のスルフヒドリル不活性化剤が、10μMから約100μMの濃度のヨードアセトアミドと、スルフヒドリル不活化活性について同等である、
方法。 - スルフヒドリル不活性化剤が、遊離のスルフヒドリル基をアルキル化またはアセチル化する、請求項1記載の方法。
- スルフヒドリル不活性化剤が、ヨードアセトアミドである、請求項2記載の方法。
- 生物抽出物が、チオレドキシン還元酵素を除去するために処理される、請求項1記載の方法。
- 生物抽出物が由来する細菌細胞が、チオレドキシン還元酵素タンパク質がアフィニティータグを含むように遺伝子操作されており、かつチオレドキシン還元酵素の除去処理が、該生物抽出物と該アフィニティータグに特異的な親和性樹脂との接触を含む、請求項4記載の方法。
- 反応用混合物が、高エネルギーリン酸結合を欠いたエネルギー源を少なくとも約50mMの濃度で含む、請求項1記載の方法。
- エネルギー源が、グルコースまたは高エネルギーリン酸結合を欠いた解糖中間体である、請求項6記載の方法。
- 反応用混合物が、酸化還元緩衝剤をさらに含む、請求項1記載の方法。
- 酸化還元緩衝剤が、グルタチオン、システイン、およびホモシステインの一つまたは複数を含む、請求項8記載の方法。
- 酸化還元緩衝剤が、酸化グルタチオンおよび還元グルタチオンの混合物を含む、請求項9記載の方法。
- 反応用混合物が、ポリペプチドの折り畳みまたはジスルフィド結合の生成を増進する1種類または複数の酵素を含む、請求項1記載の方法。
- ポリペプチドの折り畳みまたはジスルフィド結合の生成を増進する1種類または複数の酵素が、フォルダーゼ酵素である、請求項11記載の方法。
- 反応用混合物が、ポリエチレングリコールを実質的に含まない、請求項1記載の方法。
- 反応用混合物が、スペルミン、スペルミジン、およびプトレッシンの一つまたは複数を含む、請求項13記載の方法。
- グルタチオン還元酵素を不活化するために遺伝子操作され、かつ低濃度のスルフヒドリル不活性化剤で前処理された細菌細胞に由来する生物抽出物を含む無細胞タンパク質翻訳用の反応用混合物であって、低濃度のスルフヒドリル不活性化剤が、10μMから約100μMの濃度のヨードアセトアミドと、スルフヒドリル不活化活性について同等である、反応用混合物。
- スルフヒドリル不活性化剤が、遊離のスルフヒドリル基をアルキル化またはアセチル化する、請求項15記載の反応用混合物。
- スルフヒドリル不活性化剤が、ヨードアセトアミドである、請求項16記載の方法。
- 生物抽出物が、チオレドキシン還元酵素を除去するために処理される、請求項15記載の反応用混合物。
- 生物抽出物が由来する細菌細胞が、チオレドキシン還元酵素タンパク質がアフィニティータグを含むように遺伝子操作されており、かつチオレドキシン還元酵素の除去処理が、該生物抽出物と該アフィニティータグに特異的な親和性樹脂との接触を含む、請求項18記載の反応用混合物。
- 高エネルギーリン酸結合を欠いたエネルギー源を少なくとも約50mMの濃度で含む、請求項15記載の反応用混合物。
- エネルギー源が、グルコースまたは高エネルギーリン酸結合を欠いた解糖中間体である、請求項20記載の反応用混合物。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US88125107P | 2007-01-18 | 2007-01-18 | |
PCT/US2008/000699 WO2008088884A2 (en) | 2007-01-18 | 2008-01-18 | Enhanced cell-free synthesis of active proteins containing disulfide bonds |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2010516251A true JP2010516251A (ja) | 2010-05-20 |
JP2010516251A5 JP2010516251A5 (ja) | 2010-07-22 |
Family
ID=39636597
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2009546434A Pending JP2010516251A (ja) | 2007-01-18 | 2008-01-18 | ジスルフィド結合を含む活性なタンパク質の増強された無細胞合成の方法 |
Country Status (6)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US7871794B2 (ja) |
EP (1) | EP2109682A4 (ja) |
JP (1) | JP2010516251A (ja) |
AU (1) | AU2008205479A1 (ja) |
CA (1) | CA2673765A1 (ja) |
WO (1) | WO2008088884A2 (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2019521961A (ja) * | 2016-05-10 | 2019-08-08 | メディミューン,エルエルシー | タンパク質ジスルフィド結合の還元の防止 |
Families Citing this family (19)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2010077806A1 (en) | 2008-12-15 | 2010-07-08 | Greenlight Biosciences, Inc. | Methods for control of flux in metabolic pathways |
US9040253B2 (en) | 2010-04-14 | 2015-05-26 | Sutro Biopharma, Inc. | Method for enhancing recombinant protein production by cell-free protein expression system |
KR20130071433A (ko) | 2010-05-07 | 2013-06-28 | 그린라이트 바이오사이언시스, 아이엔씨. | 효소의 재배치를 통한 대사 경로에서의 흐름의 제어 방법 |
CA2809284C (en) | 2010-08-31 | 2021-02-23 | Greenlight Biosciences, Inc. | Methods for control of flux in metabolic pathways through protease manipulation |
US9982227B2 (en) | 2011-03-08 | 2018-05-29 | University Of Maryland, Baltimore County | System and method for production of on-demand proteins in a portable unit for point of care delivery |
KR20150010932A (ko) | 2011-09-09 | 2015-01-29 | 그린라이트 바이오사이언시스, 아이엔씨. | 카바페넴의 무세포 제조법 |
SG11201504930PA (en) | 2012-12-21 | 2015-07-30 | Greenlight Biosciences Inc | Cell-free system for converting methane into fuel, pyruvate or isobutanol |
WO2014116730A2 (en) | 2013-01-23 | 2014-07-31 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Stabilized hepatitis b core polypeptide |
JP6463732B2 (ja) | 2013-04-19 | 2019-02-06 | ストロ バイオファーマ, インコーポレイテッド | 上昇したレベルの外因性シャペロンを有する細胞抽出物を用いる細菌無細胞合成系における生物活性のあるタンパク質の発現 |
US9688977B2 (en) | 2013-08-05 | 2017-06-27 | Greenlight Biosciences, Inc. | Engineered phosphoglucose isomerase proteins with a protease cleavage site |
MX2017012665A (es) | 2015-03-30 | 2018-04-24 | Greenlight Biosciences Inc | Produccion de acido ribonucleico libre de celulas. |
WO2017176963A1 (en) | 2016-04-06 | 2017-10-12 | Greenlight Biosciences, Inc. | Cell-free production of ribonucleic acid |
US11951165B2 (en) | 2016-12-30 | 2024-04-09 | Vaxcyte, Inc. | Conjugated vaccine carrier proteins |
MA47223A (fr) | 2016-12-30 | 2019-11-06 | Sutrovax Inc | Conjugués polypeptide-antigène avec des acides aminés non naturels |
EP3565892A4 (en) | 2017-01-06 | 2020-10-07 | Greenlight Biosciences, Inc. | ACELLULAR SUGAR PRODUCTION |
CN109423509B (zh) * | 2017-08-27 | 2023-11-21 | 康码(上海)生物科技有限公司 | 一种葡萄糖检测方法、试剂盒及其应用 |
KR102571743B1 (ko) | 2017-10-11 | 2023-08-29 | 그린라이트 바이오사이언시스, 아이엔씨. | 뉴클레오시드 트리포스페이트 및 리보핵산 생산을 위한 방법 및 조성물 |
US11673921B2 (en) | 2017-11-10 | 2023-06-13 | Northwestern University | Cell-free protein synthesis platform derived from cellular extracts of Vibrio natriegens |
CN112094825B (zh) * | 2019-06-18 | 2024-07-30 | 凯熙医药(武汉)股份有限公司 | 硫氧还蛋白还原酶重组蛋白及其编码基因 |
Family Cites Families (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
AU2660397A (en) * | 1996-04-05 | 1997-10-29 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Methods for producing soluble, biologically-active disulfide bond-containing eukaryotic proteins in bacterial cells |
US7041479B2 (en) | 2000-09-06 | 2006-05-09 | The Board Of Trustess Of The Leland Stanford Junior University | Enhanced in vitro synthesis of active proteins containing disulfide bonds |
US6548276B2 (en) | 2000-09-06 | 2003-04-15 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Enhanced in vitro synthesis of active proteins containing disulfide bonds |
-
2008
- 2008-01-18 JP JP2009546434A patent/JP2010516251A/ja active Pending
- 2008-01-18 EP EP08724626A patent/EP2109682A4/en not_active Withdrawn
- 2008-01-18 WO PCT/US2008/000699 patent/WO2008088884A2/en active Application Filing
- 2008-01-18 AU AU2008205479A patent/AU2008205479A1/en not_active Abandoned
- 2008-01-18 CA CA002673765A patent/CA2673765A1/en not_active Abandoned
- 2008-01-18 US US12/016,763 patent/US7871794B2/en active Active
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
JPN6012062808; Biotechnol. Bioeng. Vol. 97, No. 4, 2007, p. 901-908 * |
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2019521961A (ja) * | 2016-05-10 | 2019-08-08 | メディミューン,エルエルシー | タンパク質ジスルフィド結合の還元の防止 |
JP7170542B2 (ja) | 2016-05-10 | 2022-11-14 | メディミューン,エルエルシー | タンパク質ジスルフィド結合の還元の防止 |
JP2023011805A (ja) * | 2016-05-10 | 2023-01-24 | メディミューン,エルエルシー | タンパク質ジスルフィド結合の還元の防止 |
JP7514900B2 (ja) | 2016-05-10 | 2024-07-11 | メディミューン,エルエルシー | タンパク質ジスルフィド結合の還元の防止 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
AU2008205479A1 (en) | 2008-07-24 |
CA2673765A1 (en) | 2008-07-24 |
US20080248521A1 (en) | 2008-10-09 |
WO2008088884A2 (en) | 2008-07-24 |
US7871794B2 (en) | 2011-01-18 |
EP2109682A4 (en) | 2012-05-09 |
WO2008088884A3 (en) | 2008-10-30 |
EP2109682A2 (en) | 2009-10-21 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP2010516251A (ja) | ジスルフィド結合を含む活性なタンパク質の増強された無細胞合成の方法 | |
JP4889185B2 (ja) | ジスルフィド結合を含む活性タンパク質の向上したインビトロ合成方法 | |
US10774354B2 (en) | Expression of biologically active proteins in a bacterial cell-free synthesis system using bacterial cells transformed to exhibit elevated levels of chaperone expression | |
US7041479B2 (en) | Enhanced in vitro synthesis of active proteins containing disulfide bonds | |
JP5313129B2 (ja) | 非天然アミノ酸置換ポリペプチド | |
EP2035554B1 (en) | Cell-free synthesis of proteins containing unnatural amino acids | |
AU2001288931A1 (en) | Enhanced in vitro synthesis of active proteins containing disulfide bonds | |
US20210108213A1 (en) | A method for optimizing antibody expression | |
US20190338293A1 (en) | High growth capacity auxotrophic escherichia coli and methods of use | |
JP2004513652A (ja) | エネルギー源として解糖中間体を使用するインビトロにおけるタンパク質合成方法 | |
WO2011100369A2 (en) | Methods for altering polypeptide expression and solubility | |
WO2007127589A2 (en) | Artificial disulfide isomerases and uses thereof |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20100531 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20101130 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20121203 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20130228 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20130307 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20130724 |