CN105400816A - 用于膀胱癌检测的逻辑与门基因线路的构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于膀胱癌检测的逻辑与门基因线路的构建方法，a)用PCR方法扩增序列：如SEQIDNO:1所示的hUPII启动子序列，如SEQIDNO:2所示的氨酰tRNA合成酶AcKRS基因序列，SEQIDNO:3所示的hTERT启动子序列，如SEQIDNO:4所示的tRNA序列，如SEQIDNO:6所示的pCMV6-AC-GFP37TAG质粒序列；b)将所述hUPII启动子与AcKRS基因，所述hTERT启动子与tRNA分别连接到如SEQIDNO:7所示的psiCHECK-2质粒中构建重组载体；c)将所述重组载体与所述pCMV6-AC-GFP37TAG质粒，共同转入膀胱癌细胞，构建出所述基因线路。当将上述基因线路转入膀胱癌细胞，并加入乙酰化赖氨酸时，绿色荧光蛋白只在膀胱癌细胞中表达，而在正常细胞中不表达。
Description
技术领域
本申请涉及一种用于膀胱癌检测的逻辑与门基因线路的构建方法及其应用。
背景技术
膀胱癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤，也是全身十大常见肿瘤之一。目前的诊治手段由于缺乏膀胱癌高特异性靶点等原因，不能有效地通过单靶点区分正常细胞和膀胱癌细胞，急需研发对膀胱癌更加特异的精准治疗方法。膀胱癌系统生物学和基因组学的研究，使人们有可能对肿瘤细胞基因突变以及潜在的治疗靶点有比较全面的认识和了解。
发明内容
本发明提供一种新的用于检测膀胱癌的试剂盒。
本发明提供一种用于膀胱癌检测的逻辑与门基因线路的构建方法，包括：
a)用PCR方法扩增序列：如SEQIDNO:1所示的hUPII启动子序列，如SEQIDNO:2所示的氨酰tRNA合成酶AcKRS基因序列，SEQIDNO:3所示的hTERT启动子序列，如SEQIDNO:4所示的tRNA序列，如以SEQIDNO:5所示的pCMV6-AC-GFP质粒序列为模板PCR扩增SEQIDNO:6所示的pCMV6-AC-GFP37TAG质粒序列；
b)将所述hUPII启动子与AcKRS基因，所述hTERT启动子与tRNA分别连接到如SEQIDNO:7所示的psiCHECK-2质粒中构建重组载体；
c)将所述重组载体与所述pCMV6-AC-GFP37TAG质粒，共同转入膀胱癌细胞，构建出所述基因线路。
所述膀胱癌细胞是5637。所述步骤c)中，将含有UAG终止密码子的效应基因一起转入所述膀胱癌细胞。所述效应基因是绿色荧光蛋白GFP。
一种尿道上皮细胞特异启动子hUPII与一种能在真核细胞编码乙酰化赖氨酸的氨酰tRNA合成酶AcKRS组成的DNA序列，hUPII序列如SEQIDNO:1所示，AcKRS序列如SEQIDNO:2所示。
一种癌症细胞特异启动子hTERT与一种能在真核细胞编码乙酰化赖氨酸的tRNA组成的DNA序列，hTERT序列如SEQIDNO:3所示，tRNA序列如SEQIDNO:4所示。
当将上述基因线路转入膀胱癌细胞，并加入N-乙酰-L-赖氨酸时，绿色荧光蛋白只在膀胱癌细胞中表达，而在正常细胞中不表达。
一种膀胱癌检测试剂盒，包括序列如SEQIDNO:8所示的psiCHECK-2-hUPII/AcKRS重组载体、序列如SEQIDNO:9所示的psiCHECK-2-hTERT/tRNA重组载体、序列如SEQIDNO:6所示pCMV6-AC-GFP37TAG质粒。所述的试剂盒，还包括含有UAG终止密码子的效应基因。所述效应基因是绿色荧光蛋白GFP。
本发明的有益效果是：本发明将乙酰化赖氨酸氨酰tRNA合成酶AcKRS基因、乙酰化赖氨酸tRNA分别构建在膀胱癌特异性启动子下游，并与含有UAG终止密码子的效应基因绿色荧光蛋白GFP一起转入细胞，构建的逻辑与门乙酰化赖氨酸基因线路只在膀胱癌细胞中启动乙酰化赖氨酸氨酰tRNA合成酶、乙酰化赖氨酸tRNA转录，在外源加入N-乙酰-L-赖氨酸的条件下，表达全长的绿色荧光蛋白GFP；而在其他类型细胞中，膀胱癌特异启动子无法同时启动乙酰化赖氨酸tRNA和乙酰化赖氨酸氨酰tRNA合成酶的转录，绿色荧光蛋白GFP基因翻译时会在UAG终止密码子处终止，不能表达全长的绿色荧光蛋白GFP；从而可以通过比较细胞绿色荧光强弱或者Westernblot检测GFP表达的方法，区分膀胱癌细胞和正常细胞。
附图说明
图1是跑胶检测重组载体构建情况，其中，字符1代表BglII/XhoI双酶切后的psiCHECK-2-hUPII/AcKRS重组载体，箭头所指hUPII/AcKRS的片段；2代表BglII/XhoI双酶切后的psiCHECK-2-hTERT/tRNA重组载体，箭头所指hTERT/tRNA的片段；3代表PCR定点突变的pCMV6-AC-GFP37TAG重组载体，箭头所指pCMV6-AC-GFP37TAG的片段；
图2是基因线路转入细胞后，用荧光显微镜观察含有UAG终止密码子的GFP在正常膀胱上皮细胞SV-HUC-1和膀胱癌细胞5637中的表达情况，字符1代表正常细胞，2代表膀胱癌细胞；
图3是Westernblot检测GFP含有UAG终止密码子的GFP在正常膀胱上皮细胞SV-HUC-1和膀胱癌细胞5637中的表达情况，字符1代表正常细胞样品，2代表膀胱癌细胞样品。
具体实施方式
1.psiCHECK-2-hUPII/AcKRS重组载体的构建
扩增hUPII启动子序列SEQIDNO:1，正向插入psiCHECK-2质粒SEQIDNO:7的BgIII和Nhel酶切位点之间，即替换该载体中原有的启动子SV40。将AcKRS基因序列SEQIDNO:2扩增出来，并装载入突变的质粒psiCHECK-2-hUPII的NheI和XhoI之间。将AcKRS和psiCHECK-2-hUPII酶切产物与T4连接酶混合，16度连接过夜，将酶连产物化转Top10感受态细胞，37度培养过夜后，挑单克隆送样测序，选取测序成功的psiCHECK-2-hUPII/AcKRS重组载体进行后续试验。
PCR反应体系：
PCR反应程序：
限制性内切酶酶切反应体系：
| Enzyme I | 1μl |
| Enzyme II | 1μl |
| PCR产物 | 1μg |
| Water | up to 10μl |
T4连接酶连接反应体系：
| Enzyme | 1μl |
| DNA酶切产物 | 1μg |
| Water | up to 10μl |
2.psiCHECK-2-hTERT/tRNA重组载体的构建
扩增hTERT启动子序列SEQIDNO:3，正向插入psiCHECK-2质粒SEQIDNO:7的BgIII和Nhel酶切位点之间，即替换该载体中原有的启动子SV40。扩增tRNA序列SEQIDNO:4，给两端添加NheI和XhoI位点，连入突变后的psiCHECK-2-hTERT。将tRNA和psiCHECK-2-hTERT酶切产物与T4连接酶混合，16度连接过夜，将酶连产物化转Top10感受态细胞，37度培养过夜后，挑单克隆送样测序，选取测序成功的psiCHECK-2-hTERT/tRNA重组载体进行后续试验，反应体系如前所述。
3.pCMV6-AC-GFP37TAG重组载体的构建
以pCMV6-AC-GFP序列SEQIDNO:5为模板，通过PCR定点突变的方法扩增pCMV6-AC-GFP37TAG序列SEQIDNO:6，向PCR产物中加入DpnI酶切5小时，并将酶切产物化转Top10感受态细胞，37度培养过夜后，挑单克隆送样测序，选取测序成功的pCMV6-AC-GFP37TAG重组载体进行后续试验。
DpnI酶切反应体系：
| Enzyme | 1μl |
| PCR产物 | 1μg |
| Water | up to 10μl |
4.荧光显微镜观察含有UAG终止密码子的GFP在正常膀胱上皮细胞SV-HUC-1和膀胱癌细胞5637中的表达情况
将适量细胞接种至confocal皿中，待细胞密度长至60％-80％后，将培养基换成无血清培养基。将需要转染的psiCHECK-2-hUPII/AcKRS，psiCHECK-2-hTERT/tRNA，pCMV6-AC-GFP37TAG质粒(1μg)和lipo2000脂质体(1μl)在无血清培养基中混匀，室温静置15分钟后加入细胞培养基中，5小时后更换为含10％胎牛血清的培养基。转染后24小时至48小时后，用荧光显微镜观察拍照。
5.Westernblot检测GFP含有UAG终止密码子的GFP在正常膀胱上皮细胞SV-HUC-1和膀胱癌细胞5637中的表达情况
待转染的细胞密度长至60％-80％，更换新鲜培养基。将需要转染的质粒(1μg)和lipo2000脂质体(1μl)在无血清培养基中混匀，室温静置15分钟后加入细胞培养基中。按照需要在转染后24小时至48小时后收取细胞样品，用PBS反复清洗几次，之后加入双蒸水裂解细胞，加入loading后在沸水中煮样品20-30分钟。
采用SDS-PAGE标准方法配制聚丙烯酰胺蛋白胶，将玻璃板凝胶放入电泳槽中，并在槽中加入电泳液，加入蛋白marker及制备的蛋白样品，接通电源跑胶，在浓缩胶部分采用80V稳压，当溴酚蓝指示剂进入分离胶后调高至120V稳压。停止电泳后，取出凝胶，裁剪与凝胶大小相等的滤纸和硝酸纤维素膜，用溶液法转膜系统，350mA转膜1.5-2小时。取出硝酸纤维素膜用丽春红染色，观察蛋白转移效果，用铅笔进行标记，并将膜裁剪至合适大小后用TBST脱色5分钟。
用新鲜5％(w/v)脱脂牛奶配制合1:5000的GFP抗体(SantaCruz,sc-9996)，4度过夜，之后用TBST洗膜3次，每次5分钟，之后取出滤膜用1:2000的羊抗鼠二抗(SantaCruz,sc-2005)室温杂膜2小时，之后用TBST洗膜3次，每次5分钟。之后采用化学发光底物检查信号。用X光片在暗室中进行曝光，显影，停影，定影。
本发明利用CRISPR-Cas9系统成功构建了能在体外特异识别并杀伤膀胱癌细胞的逻辑与门基因线路。但后续研究发现，CRISPR-Cas9系统在膀胱癌细胞中存在显著的脱靶效应，因此仍需要寻找特异性更高的生物正交系统来构建新一代的基因线路，提高膀胱癌识别和干预的特异性。本发明选用的逻辑与门乙酰化赖氨酸基因线路包括膀胱癌特异启动子和在真核细胞中生物正交的乙酰化赖氨酸插入系统。逻辑与门中的与门(ANDgate)又称“与电路”，是执行“与”运算的基本逻辑门电路；有多个输入端，一个输出端。当所有的输入端同时输入时，输出端才输出；只要有一个输入端不输入，则输出端不输出。真核细胞中生物正交的乙酰化赖氨酸插入系统包括乙酰化赖氨酸氨酰tRNA合成酶，乙酰化赖氨酸tRNA，含有UAG终止密码子的效应基因和N-乙酰-L-赖氨酸，四个元件缺少其中一个，则效应基因得不到全长表达。绿色荧光蛋白GFP作为效应基因，可以用来表征膀胱癌特异启动子启动下游基因的细胞选择性。通过建立上述乙酰化赖氨酸基因线路干预膀胱癌研究的科学实验体系，实现在活细胞中可控高效地操纵多个膀胱癌靶标，并通过逻辑与门的方式多靶点区分正常细胞和膀胱癌细胞，揭示乙酰化赖氨酸基因线路干预膀胱癌的分子机制，为基因线路干预膀胱癌提供理论基础和科学依据。
以上内容是结合具体的实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换。
Claims (7)
1.一种用于膀胱癌检测的逻辑与门基因线路的构建方法，其特征在于，
a)用PCR方法扩增序列：如SEQIDNO:1所示的hUPII启动子序列，如SEQIDNO:2所示的氨酰tRNA合成酶AcKRS基因序列，SEQIDNO:3所示的hTERT启动子序列，如SEQIDNO:4所示的tRNA序列，如以SEQIDNO:5所示的pCMV6-AC-GFP质粒序列为模板PCR扩增SEQIDNO:6所示的pCMV6-AC-GFP37TAG质粒序列；
b)将所述hUPII启动子与AcKRS基因，所述hTERT启动子与tRNA分别连接到如SEQIDNO:7所示的psiCHECK-2质粒中构建重组载体；
c)将所述重组载体与所述pCMV6-AC-GFP37TAG质粒，共同转入膀胱癌细胞，构建出所述基因线路。
2.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述膀胱癌细胞是5637。
3.如权利要求1或2所述的构建方法，其特征在于，所述步骤c)中，将含有UAG终止密码子的效应基因一起转入所述膀胱癌细胞。
4.如权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述效应基因是绿色荧光蛋白GFP。
5.一种膀胱癌检测试剂盒，其特征在于，包括序列如SEQIDNO:8所示的psiCHECK-2-hUPII/AcKRS重组载体、序列如SEQIDNO:9所示的psiCHECK-2-hTERT/tRNA重组载体、序列如SEQIDNO:6所示pCMV6-AC-GFP37TAG质粒。
6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，还包括含有UAG终止密码子的效应基因。
7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述效应基因是绿色荧光蛋白GFP。
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