本発明は20種の天然アミノ酸により制限される翻訳系を使用する際の固有の問題を解決する方法を提供する。これらの解決方法は直交翻訳系を使用して新規性質をもつ非天然アミノ酸を蛋白質にプログラム下で部位特異的に生合成的に組込む。本明細書ではセレクターコドン(例えば、アンバーナンセンスコドンTAG)に応答して各種非天然アミノ酸を蛋白質に高い効率で特異的に遺伝的に組込むための新規組成物(例えば、新規アミノアシルtRNAシンテターゼ)と新規方法について記載する。
場合により、非天然アミノ酸側鎖をその後、特異的且つ位置選択的に修飾することができる。これらの非天然アミノ酸置換基のユニークな反応化学により、これらを組込んだ蛋白質を非常に高い選択性で修飾することができる。場合により、非天然アミノ酸反応基はin vivo系に対して完全に外来性であるため、反応選択性を改善できるという利点がある。所定側面では、蛋白質に関するin vitro及びin vivo両者の結合反応を可能にする比較的温和な反応条件を使用して修飾反応を実施することができるので、蛋白質の生物活性を維持できる。蛋白質中の非天然アミノ酸と結合する材料の種類は特に限定されず、任意所望物質とすることができ、例えば、色素、フルオロフォア、架橋剤、糖誘導体、ポリマー(例えばポリエチレングリコール誘導体)、光架橋剤、細胞傷害性化合物、アフィニティーラベル、ビオチン誘導体、樹脂、ビーズ、第2(又は第3以下)の蛋白質又はポリペプチド、ポリヌクレオチド(例えばDNA,RNA等)、金属キレート剤、補因子、脂肪酸、炭水化物等が挙げられる。
他の側面では、組込まれた非天然アミノ酸はこの非天然アミノ酸が組込まれた蛋白質に新規生物学的性質を付与する。例えば、非天然アミノ酸は蛍光アミノ酸、フォトケージド又は光活性化可能なアミノ酸、供与体又は受容体としてFRET対で使用可能なアミノ酸、レドックス活性アミノ酸、金属キレート化アミノ酸等とすることができる。
所定側面では、(限定されないが)本発明を実証するために、本明細書の開示は非天然アミノ酸部分をモデル蛋白質に組込むことができることを実証する。非天然アミノ酸の組込みをこのようなモデル蛋白質に限定するものではない。本明細書の開示から明らかなように、任意所定該当蛋白質への非天然アミノ酸の組込みは治療及び研究用の多様な蛋白質に有利である。
本発明者らはセレクターコドンに応答して非天然アミノ酸(例えば、図1に示す非天然アミノ酸)を部位特異的に組込むために真正細菌と酵母で機能する新規直交tRNA/アミノアシルtRNAシンテターゼ対を開発した。要約すると、本発明者らは夫々大腸菌宿主細胞又は酵母宿主細胞でサプレッサーtRNAに非天然アミノ酸を選択的に負荷するMethanococcus janaschiiチロシルtRNAシンテターゼ及び大腸菌ロイシルtRNAシンテターゼの新規突然変異体を同定した。
これらの進化型tRNA−シンテターゼ対は各非天然アミノ酸を蛋白質に部位特異的に組込むために使用することができる。非天然アミノ酸の蛋白質組込みは非天然アミノ酸の組込みを指示するセレクターコドンを含むように該当蛋白質をコードするポリヌクレオチドを組換えることにより任意所望位置で行われるようにプログラムすることができる。
直交tRNA/アミノアシルtRNAシンテターゼ技術
本発明の新規組成物及び方法の理解は直交tRNAと直交アミノアシルtRNAシンテターゼの対に関連する活性を理解することにより容易になる。直交tRNA及びアミノアシルtRNAシンテターゼ技術については例えば、国際公開WO2002/085923、WO2002/086075、WO204/09459、WO2005/019415、WO2005/007870及びWO2005/007624に記載されている。その開示内容全体を参考資料として本明細書に組込むWang and Schultz“Expanding the Genetic Code,”Angewandte Chemie Int.Ed.,44(1):34−66(2005)も参照。
付加反応性非天然アミノ酸を遺伝コードに付加するためには、宿主翻訳機構で効率的に機能することができるが、対が翻訳系に内在性のシンテターゼ及びtRNAから独立して機能するという意味で該当翻訳系に対して「直交性」のアミノアシルtRNAシンテターゼと適切なtRNAを含む新規直交対が必要である。直交対の所望特徴としては、内在tRNAによりデコードされない特定コドン(例えばセレクターコドン)のみをデコード又は認識するtRNAと、そのコグネイトtRNAをただ1種の特定非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化(又は負荷)するアミノアシルtRNAシンテターゼが挙げられる。O−tRNAは更に一般に内在シンテターゼによりアミノアシル化されない。例えば大腸菌では、直交対は例えば大腸菌に存在する40種の内在tRNAのいずれとも交差反応しないアミノアシルtRNAシンテターゼと、例えば大腸菌に存在する21種の内在シンテターゼのいずれによってもアミノアシル化されない直交tRNAを含む。
本発明は真正細菌(例えば大腸菌)又は酵母の蛋白質に非天然アミノ酸を遺伝的にコードさせて組込むための直交対を提供し、直交成分は宿主細胞の翻訳機構の内在大腸菌又は酵母成分と交差反応しないが、所望非天然アミノ酸を認識し、セレクターコドン(例えば、アンバーナンセンスコドンTAG)に応答して蛋白質に組込む。本発明により提供される直交成分としては、真正細菌宿主細胞で直交対として機能するMethanococcus jannaschiiチロシルtRNAシンテターゼから誘導される直交アミノアシルtRNAシンテターゼと、突然変異体チロシルtRNACUAアンバーサプレッサーが挙げられる。本発明は更に、酵母宿主細胞で直交対として機能する大腸菌ロイシルRNAシンテターゼから誘導される直交成分と突然変異体大腸菌ロイシルtRNACUAアンバーサプレッサーも提供する。これらの系では、突然変異体アミノアシルtRNAシンテターゼはサプレッサーtRNAを夫々の非天然アミノ酸でアミノアシル化するが、20種の標準アミノ酸のいずれでもアミノアシル化しない。
本発明は非天然アミノ酸を蛋白質に組込むために使用することができる付加直交tRNA−アミノアシルtRNAシンテターゼ対(例えばO−tRNA/O−RS対)の組成物と、前記対の同定及び作製方法を提供する。本発明のO−tRNA/O−RS対はO−tRNAにより認識されるセレクターコドンを含むポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質への非天然アミノ酸(例えば図1に示す非天然アミノ酸)の例えばin vivoでの組込みを媒介することができる。O−tRNAのアンチコドンループはmRNA上のセレクターコドンを認識し、そのアミノ酸(例えば図1に示す非天然アミノ酸)をポリペプチドのこの部位に組込む。一般に、本発明の直交アミノアシルtRNAシンテターゼはそのO−tRNAをただ1種の特定非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化(又は負荷)する。
非天然アミノ酸(例えば図1に示す非天然アミノ酸)を蛋白質に部位特異的に組込むことができると、蛋白質の研究を助長できると共に、新規性質をもつ蛋白質の開発が可能になる。例えば、1種以上の非天然アミノ酸を組込んだ蛋白質の発現は特異的標識による蛋白質の試験を容易にし、酵素の触媒機能を改変し、生体活性を改善又は基質に対する交差反応性を低減し、蛋白質を他の蛋白質、小分子又は生体分子と架橋し、蛋白質分解を低減又は排除し、(例えば、導入した反応部位のペグ化又は他の修飾により)蛋白質のin vivo半減期を改善すること等が可能になる。
直交tRNA/直交アミノアシルtRNAシンテターゼ及びその対
1種以上の非天然アミノ酸を含む蛋白質の作製に適した翻訳系は例えば国際公開WO2002/086075、発明の名称「直交tRNA−アミノアシルtRNAシンテターゼ対を作製するための方法及び組成物(METHODS AND COMPOSITION FOR THE PRODUCTION OF ORTHOGONAL tRNA−AMINOACYL−tRNA SYNTHETASE PAIRS)」;WO2002/085923、発明の名称「非天然アミノ酸のインビボ組込み(IN VIVO INCORPORATION OF UNNATURAL AMINO ACIDS)」;WO2004/094593、発明の名称「真核遺伝コードの拡張(EXPANDING THE EUKARYOTIC GENETIC CODE)」;WO2005/019415(出願日2004年7月7日);WO2005/007870(出願日2004年7月7日);及びWO2005/007624(出願日2004年7月7日)に記載されている。これらの各出願はその開示内容全体を参考資料として本明細書に組込む。その開示内容全体を参考資料として本明細書に組込むWang and Schultz“Expanding the Genetic Code,”Angewandte Chemie Int.Ed.,44(1):34−66(2005)も参照。このような翻訳系は一般に直交tRNA(O−tRNA)と、直交アミノアシルtRNAシンテターゼ(O−RS)と、非天然アミノ酸を含む細胞(例えば大腸菌等の非真核細胞又は酵母等の真核細胞とすることができる)を含み、O−RSはO−tRNAを非天然アミノ酸でアミノアシル化する。本発明の直交対はO−tRNA(例えばサプレッサーtRNA、フレームシフトtRNA等)とO−RSを含む。本発明は個々の成分も提供する。
一般に、直交対がセレクターコドンを認識し、セレクターコドンに応答してアミノ酸を負荷するとき、直交対はセレクターコドンを「抑圧」すると言う。即ち、翻訳系の(例えば細胞の)内在機構により認識されないセレクターコドンは通常翻訳されないので、非抑圧下で核酸から翻訳されるポリペプチドの生産を阻止することができる。本発明のO−tRNAはセレクターコドンを認識し、本明細書の配列表に記載するようなポリヌクレオチド配列を含むか又は前記配列によりコードされるO−tRNAの抑圧効率に比較してコグネイトシンテターゼの存在下でセレクターコドンに応答して少なくとも例えば約45%、50%、60%、75%、80%、又は90%以上の抑圧効率を含む。O−RSはO−tRNAを該当非天然アミノ酸でアミノアシル化する。細胞は例えば該当ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸を介して成長中のポリペプチド鎖に非天然アミノ酸を組込むためにO−tRNA/O−RS対を使用し、ポリヌクレオチドはO−tRNAにより認識されるセレクターコドンを含む。所定の望ましい側面では、細胞は付加O−tRNA/O−RS対を含むことができ、付加O−tRNAは付加O−RSにより別の非天然アミノ酸を負荷される。例えば、O−tRNAの一方は4塩基コドンを認識することができ、他方は終止コドンを認識することができる。あるいは、複数の異なる終止コドン又は複数の異なる4塩基コドンが異なるセレクターコドンを特異的に認識することができる。
本発明の所定態様では、直交tRNA(O−tRNA)と、直交アミノアシルtRNAシンテターゼ(O−RS)と、非天然アミノ酸と、該当ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸を含む細胞(例えば大腸菌細胞又は酵母細胞)が提供され、ポリヌクレオチドはO−tRNAにより認識されるセレクターコドンを含む。翻訳系は無細胞系でもよく、例えば各種市販「in vitro」転写/翻訳系の任意のものを本明細書に記載するようなO−tRNA/ORS対及び非天然アミノ酸と併用することができる。
1態様では、O−RSとO−tRNAの併用による抑圧効率はO−RSの不在下のO−tRNAの抑圧効率の例えば約5倍、10倍、15倍、20倍、又は25倍以上である。1側面では、O−RSとO−tRNAの併用による抑圧効率は本明細書の配列表に記載するような直交シンテターゼ対の抑圧効率の少なくとも例えば約35%、40%、45%、50%、60%、75%、80%、又は90%以上である。
上記のように、本発明は場合により細胞又は他の翻訳系に複数のO−tRNA/O−RS対を含み、2種以上の非天然アミノ酸を組込むことができる。例えば、細胞は更に別の付加O−tRNA/O−RS対と第2の非天然アミノ酸を含むことができ、この付加O−tRNAは第2のセレクターコドンを認識し、この付加O−RSはO−tRNAを第2の非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する。例えば、O−tRNA/O−RS対(O−tRNAは例えばアンバーセレクターコドンを認識する)を含む細胞は更に第2の直交対を含むことができ、第2のO−tRNAは別のセレクターコドン(例えばオパールコドン、4塩基コドン等)を認識する。各直交対は異なるセレクターコドンの認識を助長できるように異なる起源に由来することが望ましい。
O−tRNA及び/又はO−RSは天然に存在するものでもよいし、例えば種々の生物の任意のものに由来するtRNAのライブラリー及び/又はRSのライブラリーを作製するか及び/又は種々の利用可能な突然変異ストラテジーの任意のものを使用することにより、天然に存在するtRNA及び/又はRSの突然変異により誘導してもよい。例えば、直交tRNA/アミノアシルtRNAシンテターゼ対を作製するための1つのストラテジーは例えば宿主細胞以外の起源又は多重起源に由来する(宿主に対して)異種のtRNA/シンテターゼ対を宿主細胞に導入する方法である。異種シンテターゼ候補の特性としては、例えば宿主細胞tRNAに負荷しないことが挙げられ、異種tRNA候補の特性としては、例えば宿主細胞シンテターゼによりアミノアシル化されないことが挙げられる。更に、異種tRNAは全宿主細胞シンテターゼに対して直交性である。
直交対を作製するための第2のストラテジーはO−tRNA又はO−RSをスクリーニング及び/又は選択するための突然変異体ライブラリーを作製する方法である。これらのストラテジーを組み合わせてもよい。
直交tRNA(O−tRNA)
本発明の直交tRNA(O−tRNA)はO−tRNAにより認識されるセレクターコドンを含むポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質への非天然アミノ酸の例えばin vivo又はin vitroでの組込みを媒介することが望ましい。所定態様では、本発明のO−tRNAは本明細書の配列表のO−tRNA配列に記載するようなポリヌクレオチド配列を含むか又は前記配列によりコードされるO−tRNAに比較してコグネイトシンテターゼの存在下でセレクターコドンに応答して少なくとも例えば約45%、50%、60%、75%、80%、又は90%以上の抑圧効率を含む。
抑圧効率は当分野で公知の多数のアッセイの任意のものにより測定することができる。例えば、β−ガラクトシダーゼレポーターアッセイを使用することができ、例えば本発明のO−tRNAを含むプラスミドと共に修飾lacZプラスミド(構築物はlacZ核酸配列中にセレクターコドンをもつ)を適当な生物(例えば直交成分を使用することができる生物)に由来する細胞に導入する。コグネイトシンテターゼも(ポリペプチド又は発現されるとコグネイトシンテターゼをコードするポリヌクレオチドとして)導入することができる。細胞を培地で所望密度(例えばOD600=約0.5)まで増殖させ、例えばBetaFluor(登録商標)β−ガラクトシダーゼアッセイキット(Novagen)を使用してβ−ガラクトシダーゼアッセイを実施する。比較可能な対照(例えば所望位置にセレクターコドンではなく対応するセンスコドンをもつ修飾lacZ構築物から観測される値)に対するサンプルの活性百分率として抑圧百分率を計算することができる。
本発明のO−tRNAの例を本明細書の配列表に記載する。代表的O−tRNA及びO−RS分子の配列については本明細書の表、実施例及び図面も参照。更に、本明細書の「核酸及びポリペプチド配列と変異体」のセクションも参照。O−RS mRNA又はO−tRNA分子等のRNA分子では、所与配列又はその相補配列に対してチミン(T)がウラシル(U)で置換されている(コーディングDNAでは逆)。塩基に付加修飾を加えてもよい。
本発明は本明細書に記載する特定O−tRNAに対応するO−tRNAの保存変異体も含む。例えば、O−tRNAの保存変異体としては、例えば本明細書の配列表に記載するような特定O−tRNAと同様に機能し、適当な自己相補性によりtRNA L形構造を維持するが、例えば本明細書の配列表、図面又は実施例に記載する配列と同一配列をもたない分子が挙げられる(更に野生型tRNA分子以外のものであることが望ましい)。本明細書の「核酸及びポリペプチド配列と変異体」のセクションも参照。
O−tRNAを含む組成物は更に直交アミノアシルtRNAシンテターゼ(O−RS)を含むことができ、O−RSはO−tRNAを非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する。所定態様では、O−tRNAを含む組成物は更に(例えばin vitro又はin vivo)翻訳系を含むことができる。該当ポリペプチドをコードし、O−tRNAにより認識されるセレクターコドンを含むポリヌクレオチドを含む核酸、又はこれらの1種以上の組み合わせも細胞に加えることができる。本明細書の「直交アミノアシルtRNAシンテターゼ」のセクションも参照。
直交tRNA(O−tRNA)の作製方法も本発明の特徴である。本方法により作製されたO−tRNAも本発明の特徴である。本発明の所定態様では、O−tRNAは突然変異体ライブラリーを作製することにより作製することができる。突然変異体tRNAのライブラリーは当分野で公知の種々の突然変異誘発技術を使用して作製することができる。例えば、突然変異体tRNAは例えば表5の代表的O−tRNAの部位特異的突然変異、ランダム点突然変異、相同組換え、DNAシャフリング又は他の帰納的突然変異誘発法、キメラ構築又はその任意組み合わせにより作製することができる。
tRNAの所望ループ又は領域(例えばアンチコドンループ、受容体ステム、Dアーム又はループ、可変ループ、TPCアーム又はループ、tRNA分子の他の領域又はその組合せ)の特定位置(例えば非保存位置又は保存位置)、ランダム位置又は両者の組合せに付加突然変異を導入することができる。一般に、tRNAの突然変異としてはセレクターコドンの認識を可能にするように突然変異体tRNAライブラリーの各メンバーのアンチコドンループを突然変異させる方法が挙げられる。この方法は更にO−tRNAに付加配列を付加する段階を含むことができる。一般に、O−tRNAは所望RSに対するその親和性等を維持しながら、出発材料(例えば複数のtRNA配列)に比較して所望生物に対する直交性が改善されている。
前記方法は場合によりtRNA及び/又はアミノアシルtRNAシンテターゼの配列の類似性(及び/又は推定相同性)を分析し、特定生物に対して直交性であると思われるO−tRNA、O−RS及び/又はその対の潜在候補を決定する段階を含む。分析には、当分野で公知であり、本明細書に記載するコンピュータープログラム(例えばBLAST及びpileupプログラム)を使用することができる。1例では、大腸菌で使用するための潜在的直交翻訳成分を選択するためには、真正細菌生物に密接な配列類似性を示さないシンテターゼ及び/又はtRNAを選択する。
一般に、O−tRNAは複数の潜在的O−tRNAのメンバーを含む第1の種の細胞の集団に例えばネガティブ選択を実施することにより得られる。ネガティブ選択は細胞に内在性のアミノアシルtRNAシンテターゼ(RS)によりアミノアシル化される潜在的O−tRNAライブラリーのメンバーを含む細胞を排除する。こうして、第1の種の細胞に直交性のtRNAプールが得られる。
所定態様において、ネガティブ選択では、ネガティブ選択マーカー(例えば抗生物質耐性を付与する酵素(例えばβ−ラクタマーゼ)、検出可能な産物を付与する酵素(例えばβ−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT))、例えば毒性物質(例えばバルナーゼ))をコードするポリヌクレオチドの(例えば機能的バルナーゼを依然として産生する)非必須位置等にセレクターコドンを導入する。場合により選択物質(例えばアンピシリン等の抗生物質)の存在下で細胞集団を増殖させることによりスクリーニング/選択を実施する。1態様では、選択物質の濃度を変動させる。
例えば、サプレッサーtRNAの活性を測定するためには、セレクターコドン(例えばネガティブ選択マーカー(例えばβ−ラクタマーゼ遺伝子(bla))をコードするポリヌクレオチドに導入されたナンセンス(例えば終止)又はフレームシフト突然変異)のin vivo抑圧に基づく選択システムを使用する。例えば、所定位置(例えばA184)にセレクターコドンをもつポリヌクレオチド変異体(例えばbla変異体)を構築する。細胞(例えば細菌)をこれらのポリヌクレオチドで形質転換する。内在大腸菌シンテターゼにより効率的に負荷することができない直交tRNAの場合には、抗生物質耐性(例えばアンピシリン耐性)はプラスミドで形質転換されていない細菌と同等以下のはずである。tRNAが非直交性の場合、又はtRNAに負荷することが可能な異種シンテターゼをシステムで同時発現させる場合には、より高レベルの抗生物質(例えばアンピシリン)耐性が観測される。プラスミドで形質転換されていない細胞と同等の抗生物質濃度のLB寒天プレートで増殖することができない細胞(例えば細菌)を選択する。
毒性物質(例えばリボヌクレアーゼ又はバルナーゼ)の場合には、複数の潜在的tRNAのメンバーが内在宿主(例えば大腸菌)シンテターゼによりアミノアシル化されるとき(即ち、宿主(例えば大腸菌)シンテターゼに非直交性であるとき)には、セレクターコドンは抑圧され、生産される毒性ポリヌクレオチド産物は細胞死を生じる。直交tRNA又は非機能的tRNAを含む細胞は生存する。
1態様では、所望生物に直交性のtRNAプールに次にポジティブ選択を実施し、セレクターコドンを例えばβ−ラクタマーゼ遺伝子等の薬剤耐性遺伝子によりコードされるポジティブ選択マーカーに配置する。ポジティブ選択は細胞に直交性のtRNAプールのメンバーをコードするか又は前記メンバーを含むポリヌクレオチドと、ポジティブ選択マーカーをコードするポリヌクレオチドと、コグネイトRSをコードするポリヌクレオチドを含む細胞で実施される。所定態様では、第2の細胞集団はネガティブ選択により排除されなかった細胞を含む。ポリヌクレオチドを細胞で発現させ、選択物質(例えばアンピシリン)の存在下で細胞を増殖させる。次に、同時発現させたコグネイトシンテターゼによりアミノアシル化され、このセレクターコドンに応答してアミノ酸を挿入することができるtRNAを選択する。一般に、これらの細胞は非機能的tRNA、又は該当シンテターゼにより効率的に認識することができないtRNAを含む細胞に比較して高い抑圧効率を示す。非機能的tRNA又は該当シンテターゼにより効率的に認識されないtRNAを含む細胞は抗生物質に感受性である。従って、(i)内在宿主(例えば大腸菌)シンテターゼの基質ではなく;(ii)該当シンテターゼによりアミノアシル化することができ;(iii)翻訳で機能的なtRNAが両者選択後に生存している。
従って、スクリーニングされる状況に応じて同一マーカーがポジティブマーカーにもネガティブマーカーにもなる。即ち、マーカーがポジティブスクリーニングされる場合にはポジティブマーカーであり、ネガティブスクリーニングされる場合にはネガティブマーカーである。
上記方法における選択(例えばポジティブ選択、ネガティブ選択又はポジティブ選択とネガティブ選択の両者)のストリンジェンシーは場合により選択ストリンジェンシーの変動を含む。例えば、バルナーゼは極毒性蛋白質であるので、異なる数のセレクターコドンをバルナーゼ遺伝子に導入するか及び/又は誘導プロモーターを使用することによりネガティブ選択のストリンジェンシーを制御することができる。別の例では、選択又はスクリーニング物質の濃度(例えばアンピシリン濃度)を変動させる。本発明の1側面では、初期ラウンド中の所望活性は低いと思われるのでストリンジェンシーを変動させる。即ち、初期ラウンドでは低ストリンジェンシー選択基準を適用し、後期ラウンドの選択では高ストリンジェンシー基準を適用する。所定態様では、ネガティブ選択、ポジティブ選択又はネガティブ選択とポジティブ選択の両方を複数回反復することができる。複数の異なるネガティブ選択マーカー、ポジティブ選択マーカー又はネガティブ選択マーカーとポジティブ選択マーカーの両方を使用することができる。所定態様では、ポジティブ選択マーカーとネガティブ選択マーカーを同一にすることができる。
本発明ではセレクターコドンに応答して非天然アミノ酸を負荷する直交翻訳成分(例えばO−tRNA、O−RS、及びO−tRNA/O−RS対)を作製するために他の型の選択/スクリーニングを使用することもできる。例えば、ネガティブ選択マーカー、ポジティブ選択マーカー又はポジティブ選択マーカーとネガティブ選択マーカーの両方として、適切な反応体の存在下で蛍光発光するか又は発光反応を触媒するマーカーを使用することができる。別の態様では、蛍光活性化細胞ソーティング(FACS)又は発光によりマーカーの産物を検出する。場合により、マーカーはアフィニティースクリーニングマーカーを含む。Francisco,J.A.ら,(1993)Production and fluorescence−activated cell sorting of Escherichia coli expressing a functional antibody fragment on the external surface.Proc Natl Acad Sci U S A.90:10444−8も参照。
組換え直交tRNAの他の作製方法も例えば国際出願公開WO2002/086075、発明の名称「直交tRNA−アミノアシルtRNAシンテターゼ対を作製するための方法及び組成物(METHODS AND COMPOSITIONS FOR THE PRODUCTION OF ORTHOGONAL tRNA AMINOACYL−tRNA SYNTHETASE PAIRS)」;WO2004/094593、発明の名称「真核遺伝コードの拡張(EXPANDING THE EUKARYOTIC GENETIC CODE)」;及びWO2005/019415(出願日2004年7月7日)に記載されている。Forsterら,(2003)Programming peptidomimetic synthetases by translating genetic codes designed de novo PNAS 100(11):6353−6357;及びFengら,(2003),Expanding tRNA recognition of a tRNA synthetase by a single amino acid change,PNAS 100(10):5676−5681も参照。
直交アミノアシルtRNAシンテターゼ(O−RS)
本発明のO−RSはin vitro又はin vivoでO−tRNAを非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する。本発明のO−RSはO−RSを含むポリペプチド及び/又はO−RS又はその一部をコードするポリヌクレオチドにより翻訳系(例えば細胞)に提供することができる。例えば、O−RSの1例は本明細書の配列表と実施例に記載するようなアミノ酸配列、又はその保存変異体を含む。別の例では、O−RS、又はその一部は本明細書の配列表又は実施例に記載する配列を含むアミノ酸をコードするポリヌクレオチド配列、又はその相補的ポリヌクレオチド配列によりコードされる。例えば、代表的O−RS分子の配列については本明細書の表及び実施例参照。本明細書の「核酸及びポリペプチド配列と変異体」のセクションも参照。
O−tRNAと併用する直交アミノアシルtRNAシンテターゼ(O−RS)(例えばO−RS)の同定方法も本発明の特徴である。例えば、1方法は第1の種の細胞集団について選択(例えばポジティブ選択)を実施する段階を含み、前記細胞は1)複数のアミノアシルtRNAシンテターゼ(RS)のメンバー(例えば複数のRSは突然変異体RS、第1の種以外の種に由来するRS又は突然変異体RSと第1の種以外の種に由来するRSの両方を含むことができる)と;2)(例えば1種以上の種に由来する)直交tRNA(O−tRNA)と;3)(例えばポジティブ)選択マーカーをコードし、少なくとも1個のセレクターコドンを含むポリヌクレオチドを各々含む。複数のRSのメンバーを含まないか又はその量の少ない細胞に比較して抑圧効率の高い細胞について細胞を選択又はスクリーニングする。抑圧効率は当分野で公知の技術及び本明細書に記載するように測定することができる。抑圧効率の高い細胞はO−tRNAをアミノアシル化する活性RSを含む。第1の種に由来する第1組のtRNAの活性RSによる(in vitro又はin vivo)アミノアシル化レベルを第2の種に由来する第2組のtRNAの活性RSによる(in vitro又はin vivo)アミノアシル化レベルと比較する。アミノアシル化レベルは検出可能な物質(例えば標識非天然アミノ酸)により測定することができる。第1組のtRNAに比較して第2組のtRNAをより効率的にアミノアシル化する活性RSを一般に選択することにより、O−tRNAと併用する効率的(最適化)直交アミノアシルtRNAシンテターゼが得られる。この方法により同定されたO−RSも本発明の特徴である。
アミノアシル化を測定するためには多数のアッセイの任意のものを使用することができる。これらのアッセイはin vitro又はin vivoで実施することができる。例えば、in vitroアミノアシル化アッセイは例えばHoben and Soll(1985)Methods Enzymol.113:55−59に記載されている。アミノアシル化は直交翻訳成分と共にレポーターを使用し、蛋白質をコードする少なくとも1個のセレクターコドンを含むポリヌクレオチドを発現する細胞でレポーターを検出することにより測定することもできる。WO2002/085923、発明の名称「非天然アミノ酸のインビボ組込み(IN VIVO INCORPORATION OF UNNATURAL AMINO ACIDS)」;及びWO2004/094593、発明の名称「真核遺伝コードの拡張(EXPANDING THE EUKARYOTIC GENETIC CODE)」も参照。
同定されたO−RSを更に操作し、所望非天然アミノ酸のみをO−tRNAに負荷し、20種の標準アミノ酸のいずれをも負荷しないようにシンテターゼの基質特異性を改変することができる。非天然アミノ酸に対して基質特異性をもつ直交アミノアシルtRNAシンテターゼの作製方法は例えばシンテターゼの活性部位、シンテターゼの編集メカニズム部位、シンテターゼの各種ドメインを組み合わせることによる各種部位等でシンテターゼを突然変異させる段階と、選択プロセスを適用する段階を含む。ポジティブ選択後にネガティブ選択を行う併用に基づくストラテジーを使用する。ポジティブ選択では、ポジティブマーカーの非必須位置に導入したセレクターコドンが抑圧されると、細胞はポジティブ選択圧下で生存する。従って、天然アミノ酸と非天然アミノ酸の両者の存在下で生存細胞は直交サプレッサーtRNAに天然又は非天然アミノ酸を負荷する活性シンテターゼをコードする。ネガティブ選択では、ネガティブマーカーの非必須位置に導入したセレクターコドンが抑圧されると、天然アミノ酸特異性をもつシンテターゼは除去される。ネガティブ選択とポジティブ選択の生存細胞は直交サプレッサーtRNAを非天然アミノ酸のみでアミノアシル化(負荷)するシンテターゼをコードする。その後、これらのシンテターゼを更に突然変異誘発(例えばDNAシャフリング又は他の帰納的突然変異誘発法)に付すことができる。
突然変異体O−RSのライブラリーは当分野で公知の種々の突然変異誘発技術を使用して作製することができる。例えば、突然変異体RSは部位特異的突然変異、ランダム点突然変異、相同組換え、DNAシャフリング又は他の帰納的突然変異誘発法、キメラ構築又はその任意組み合わせにより作製することができる。例えば、突然変異体RSのライブラリーは2種以上の他の例えばサイズとダイバーシティーの小さい「サブライブラリー」から作製することができる。RSのキメラライブラリーも本発明に含まれる。なお、場合により各種生物(例えば真正細菌又は古細菌等の微生物)に由来するtRNAシンテターゼのライブラリー(例えば天然ダイバーシティーを含むライブラリー)(例えば米国特許第6,238,884号(Shortら);米国特許第5,756,316号(Schallenbergerら);米国特許第5,783,431号(Petersenら);米国特許第5,824,485号(Thompsonら);米国特許第5,958,672号(Shortら)参照)を構築し、直交対についてスクリーニングする。
シンテターゼにポジティブ及びネガティブ選択/スクリーニングストラテジーを実施した後、これらのシンテターゼを更に突然変異誘発することができる。例えば、O−RSをコードする核酸を単離することができ;(例えばランダム突然変異誘発、部位特異的突然変異誘発、組換え又はその任意組み合わせにより)突然変異O−RSをコードする1組のポリヌクレオチドを核酸から作製することができ;O−tRNAを非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する突然変異O−RSが得られるまでこれらの個々の段階又はこれらの段階の組み合わせを繰り返すことができる。本発明の所定側面では、前記段階を複数回、例えば少なくとも2回実施する。
O−tRNA、O−RS、又はその対を作製するための本発明の方法では、付加レベルの選択/スクリーニングストリンジェンシーを使用することもできる。選択又はスクリーニングストリンジェンシーはO−RSの作製方法の一方又は両方の段階で変動させることができる。これは例えば選択/スクリーニング物質の使用量等の変動とすることができる。付加ラウンドのポジティブ及び/又はネガティブ選択を実施することもできる。選択又はスクリーニングは更にアミノ酸浸透率の変化、翻訳効率の変化、翻訳忠実度の変化等の1種以上を含むこともできる。一般に、1種以上の変化は蛋白質を生産するために直交tRNA−tRNAシンテターゼ対を使用する生物における1個以上の遺伝子の突然変異に基づく。
O−RSの作製と、シンテターゼの基質特異性の改変に関するその他の一般的な詳細については国際公開WO2002/086075、発明の名称「直交tRNA−アミノアシルtRNAシンテターゼ対を作製するための方法及び組成物(METHODS AND COMPOSITIONS FOR THE PRODUCTION OF ORTHOGONAL tRNA AMINOACYL−tRNA SYNTHETASE PAIRS)」;及びWO2004/094593、発明の名称「真核遺伝コードの拡張(EXPANDING THE EUKARYOTIC GENETIC CODE)」に記載されている。その開示内容全体を参考資料として本明細書に組込むWang and Schultz“Expanding the Genetic Code,”Angewandte Chemie Int.Ed.,44(1):34−66(2005)も参照。
資源及び宿主生物
本発明の直交翻訳成分(O−tRNAとO−RS)はO−tRNA/O−RS成分と宿主系が直交に作用するという条件で他の任意種に由来する宿主翻訳系で使用するために任意生物(又は生物組み合わせ)に由来することができる。直交対のO−tRNAとO−RSは同一生物に由来する必要はない。所定側面では、直交成分は真正細菌宿主系で使用するために古細菌遺伝子(即ち古細菌)に由来する。
例えば、直交O−tRNAは古細菌生物、例えばMethanococcus jannaschii、Methanobacterium thermoautotrophicum、Halobacterium(例えばHaloferax volcanii及びHalobacterium種NRC−1)、Archaeoglobus fulgidus、Pyrococcus furiosus、Pyrococcus horikoshii、Aeuropyrum pernix、Methanococcus maripaludis、Methanopyrus kandleri、Methanosarcina mazei(Mm)、Pyrobaculum aerophilum、Pyrococcus abyssi、Sulfolobus solfataricus(Ss)、Sulfolobus tokodaii、Thermoplasma acidophilum、Thermoplasma volcanium等の古細菌や、Escherichia coli,Thermus thermophilus,Bacillus stearothermphilus等の真正細菌に由来することができ、直交O−RSは生物又は生物組み合わせ、例えばMethanococcus jannaschii、Methanobacterium thermoautotrophicum、Halobacterium(例えばHaloferax volcanii及びHalobacterium種NRC−1)、Archaeoglobus fulgidus、Pyrococcus furiosus、Pyrococcus horikoshii、Aeuropyrum pernix、Methanococcus maripaludis、Methanopyrus kandleri、Methanosarcina mazei、Pyrobaculum aerophilum、Pyrococcus abyssi、Sulfolobus solfataricus、Sulfolobus tokodaii、Thermoplasma acidophilum、Thermoplasma volcanium等の古細菌や、Escherichia coli,Thermus thermophilus,Bacillus stearothermphilus等の真正細菌に由来することができる。1態様では、例えば植物、藻類、原生動物、真菌類、酵母、動物(例えば哺乳動物、昆虫、節足動物等)等の真核資源もO−tRNA及びO−RSの資源として使用することができる。
O−tRNA/O−RS対の個々の成分は同一生物に由来するものでも異なる生物に由来するものでもよい。1態様では、O−tRNA/O−RS対は同一生物に由来する。あるいは、O−tRNA/O−RS対のO−tRNAとO−RSは異なる生物に由来する。
O−tRNA、O−RS又はO−tRNA/O−RS対はin vivo又はin vitroで選択又はスクリーニングすることができ、及び/又は非天然アミノ酸を組込んだポリペプチドを生産するために細胞(例えば真正細菌細胞)で使用することができる。使用される真正細菌細胞は限定されないが、例えば大腸菌(Escherichia coli)、Thermus thermophilus、Bacillus stearothermphilus等である。本発明の翻訳成分を含む真正細菌細胞の組成物も本発明の特徴である。
別の種で使用するためにある種のO−tRNA及び/又はO−RSをスクリーニングする方法については、国際出願公開WO2004/094593、発明の名称「真核遺伝コードの拡張(EXPANDING THE EUKARYOTIC GENETIC CODE)」(出願日2004年4月16日)も参照。
所定側面では、非天然アミノ酸を組込んだポリペプチドを生産するためにO−tRNA、O−RS又はO−tRNA/O−RS対をin vivo又はin vitroで選択又はスクリーニング及び/又は細胞(例えば真核細胞)で使用することができる。使用する真核細胞は限定されず、例えばSaccharomyces cerevisiae(S.cerevisiae)等の適切な任意酵母細胞を使用することができる。本発明の翻訳成分を組込んだ真核細胞の組成物も本発明の特徴である。
Saccharomyces cerevisiaeは各種利点があるので、真核宿主種として選択することができる。この種は単細胞であり、1世代の寿命が短く、遺伝的に十分に特性決定されている。例えばD.Burkeら,(2000)Methods in Yeast Genetics.Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY参照。更に、真核生物の翻訳機構は高度に保存されている(例えば(1996)Translational Control.Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,NY;Y.Kwok,& J.T.Wong,(1980),Evolutionary relationship between Halobacterium cutirubrum and eukaryotes determined by use of aminoacyl−tRNA synthetases as phylogenetic probes,Canadian Journal of Biochemistry 58:213−218;及び(2001)The Ribosome.Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY参照)ので、S.cerevisiaeで発見された非天然アミノ酸の組込み用O−RS遺伝子(例えば、野生型大腸菌RS配列に由来するO−RS遺伝子)を高等真核生物(例えば哺乳動物細胞)に導入し、非天然アミノ酸を組込むためにコグネイトtRNAと併用することができる(例えばK.Sakamotoら,(2002)Site−specific incorporation of an unnatural amino acid into proteins in mammalian cells,Nucleic Acids Res.30:4692−4699;及びC.Kohrerら,(2001),Import of amber and ochre suppressor tRNAs into mammalian cells:a general approach to site−specific insertion of amino acid analogues into proteins,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.98:14310−14315参照)。
(例えば、O−RSとO−tRNAと非天然アミノ酸を含む)直交翻訳系は非天然アミノ酸をもつ蛋白質を生産するために培養宿主細胞を利用することができるが、本発明の直交翻訳系は無傷の生存宿主細胞を必要とするものではない。例えば、直交翻訳系は細胞抽出液の存在下で無細胞系を利用することができる。実際に、蛋白質生産に無細胞in vitro転写/翻訳系を使用することは確立した技術である。本明細書に記載する直交翻訳系成分を使用して非天然アミノ酸をもつ蛋白質を生産するようにこれらのin vitro系を適応させることは十分に本発明の範囲に含まれる。
セレクターコドン
本発明のセレクターコドンは蛋白質生合成機構の遺伝コドン枠を拡張する。例えば、セレクターコドンとしては例えばユニーク3塩基コドン、ナンセンスコドン(例えばアンバーコドン(UAG)又はオパールコドン(UGA)等の終止コドン)、非天然コドン、少なくとも4塩基のコドン、レアコドン等が挙げられる。例えば1個以上、2個以上、4個以上等の多数のセレクターコドンを所望遺伝子に導入することができる。複数の異なるセレクターコドンを使用することにより、これらの異なるセレクターコドンを使用して(例えば少なくとも1種の非天然アミノ酸を含む)複数の非天然アミノ酸の同時部位特異的組込みを可能にする複数の直交tRNA/シンテターゼ対を使用することができる。
1態様では、本方法は非天然アミノ酸を細胞にin vivo組込むために終止コドンであるセレクターコドンを使用する。例えば、終止コドンを認識し、O−RSにより非天然アミノ酸でアミノアシル化されるO−tRNAを作製する。このO−tRNAは天然に存在する宿主のアミノアシルtRNAシンテターゼにより認識されない。慣用部位特異的突然変異誘発法を使用して該当ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの該当部位に終止コドンを導入することができる。例えばSayers,J.R.ら,(1988),5’,3’Exonuclease in phosphorothioate−based oligonucleotide−directed mutagenesis.Nucleic Acids Res.791−802参照。O−RS、O−tRNA及び該当ポリペプチドをコードする核酸を例えばin vivoで併用すると、非天然アミノ酸は終止コドンに応答して組込まれ、特定位置に非天然アミノ酸を含むポリペプチドが得られる。本発明の1態様では、セレクターコドンとして使用される終止コドンはアンバーコドンUAG及び/又はオパールコドンUGAである。1例では、セレクターコドンとしてUAGとUGAの両者を使用する遺伝コードは存在度が最も高い終結シグナルであるオーカーナンセンスコドンUAAを保存しながら22種のアミノ酸をコードすることができる。
非天然アミノ酸のin vivo組込みは宿主細胞をさほど撹乱せずに実施することができる。例えば、大腸菌等の非真核細胞では、UAGコドンの抑圧効率はO−tRNA(例えばアンバーサプレッサーtRNA)と(UAGコドンと結合してリボソームから成長中のペプチドの放出を開始する)放出因子1(RF1)の競合に依存するので、例えばO−tRNA(例えばサプレッサーtRNA)の発現レベルを増加するか又はRF1欠損株を使用することにより抑圧効率を調節することができる。真核細胞では、UAGコドンの抑圧効率はO−tRNA(例えばアンバーサプレッサーtRNA)と(終止コドンと結合してリボソームから成長中のペプチドの放出を開始する)真核放出因子(例えばeRF)の競合に依存するので、例えばO−tRNA(例えばサプレッサーtRNA)の発現レベルを増加することにより抑圧効率を調節することができる。更に、付加化合物、例えばジチオスレイトール(DTT)等の還元剤も加えてもよい。
非天然アミノ酸はレアコドンでコードすることもできる。例えば、in vitro蛋白質合成反応でアルギニン濃度を下げると、レアアルギニンコドンAGGはアラニンでアシル化された合成tRNAによるAlaの挿入に有効であることが分かっている。例えばMaら,Biochemistry,32:7939(1993)参照。この場合には、合成tRNAは大腸菌に少量種として存在する天然tRNAArgと競合する。更に、生物によっては全トリプレットコドンを使用しないものもある。Micrococcus luteusで割り当てられないコドンAGAがin vitro転写/翻訳抽出物へのアミノ酸挿入に使用されている。例えばKowal and Oliver,Nucl.Acid.Res.,25:4685(1997)参照。本発明の成分はこれらのレアコドンをin vivo使用するために作製することができる。
セレクターコドンは更に拡張コドン(例えば4、5、6塩基以上のコドン等の4塩基以上のコドン)も含むことができる。4塩基コドンの例としては例えばAGGA、CUAG、UAGA、CCCU等が挙げられる。5塩基コドンの例としては例えばAGGAC、CCCCU、CCCUC、CUAGA、CUACU、UAGGC等が挙げられる。本発明の方法はフレームシフト抑圧に基づく拡張コドンの使用を含む。4塩基以上のコドンは例えば1又は複数の非天然アミノ酸を同一蛋白質に挿入することができる。他の態様では、アンチコドンループは例えば少なくとも4塩基コドン、少なくとも5塩基コドン、又は少なくとも6塩基コドン又はそれ以上をデコードすることができる。4塩基コドンは256種が考えられるので、4塩基以上のコドンを使用すると同一細胞で複数の非天然アミノ酸をコードすることができる。Andersonら,(2002)Exploring the Limits of Codon and Anticodon Size,Chemistry and Biology,9:237−244;及びMagliery,(2001)Expanding the Genetic Code:Selection of Efficient Suppressors of Four−base Codons and Identification of “Shifty” Four−base Codons with a Library Approach in Escherichia coli,J.Mol.Biol.307:755−769も参照。
例えば、in vitro生合成法を使用して非天然アミノ酸を蛋白質に組込むために4塩基コドンが使用されている。例えばMaら,(1993)Biochemistry,32,7939;及びHohsakaら,(1999)J.Am.Chem.Soc.,121:34参照。2個の化学的にアシル化されたフレームシフトサプレッサーtRNAを用いて2−ナフチルアラニンとリジンのNBD誘導体をストレプトアビジンに同時にin vitroで組込むためにCGGGとAGGUが使用されている。例えばHohsakaら,(1999)J.Am.Chem.Soc.,121:12194参照。in vivo試験では、MooreらはNCUAアンチコドンをもつtRNALeu誘導体がUAGNコドン(NはU、A、G又はCであり得る)を抑圧する能力を試験し、4塩基UAGAはUCUAアンチコドンをもつtRNALeuにより13〜26%の効率でデコードすることができるが、0又は−1フレームでは殆どデコードできないことを見出した。Mooreら,(2000)J.Mol.Biol.,298:195参照。1態様では、レアコドン又はナンセンスコドンに基づく拡張コドンを本発明で使用し、他の望ましくない部位でのミスセンス読み飛ばしとフレームシフト抑圧を減らすことができる。4塩基コドンは各種直交系でセレクターコドンとして使用されている。例えば、WO2005/019415;WO2005/007870;及びWO2005/007624参照。その開示内容全体を参考資料として本明細書に組込むWang and Schultz“Expanding the Genetic Code,”Angewandte Chemie Int.Ed.,44(1):34−66(2005)も参照。下記実施例ではアンバーセレクターコドンを使用しているが、4塩基O−tRNAと各種非天然アミノ酸O−RSについて従来記載されている突然変異と同様の突然変異を含むように改変したシンテターゼを使用するように下記実施例を変更することにより、4塩基以上のコドンも使用することができる。
所与系では、セレクターコドンは更に天然3塩基コドンの1種を含むことができ、内在系はこの天然塩基コドンを使用しない(又は殆ど使用しない)。例えば、天然3塩基コドンを認識するtRNAをもたない系、及び/又は3塩基コドンがレアコドンである系がこれに該当する。
セレクターコドンは場合により非天然塩基対を含む。これらの非天然塩基対は更に既存遺伝子アルファベットを拡張する。塩基対が1個増えると、トリプレットコドン数は64から125に増す。第3の塩基対の性質としては安定的且つ選択的な塩基対合、高い忠実度でポリメラーゼによるDNAへの効率的な酵素組込み、及び新生非天然塩基対の合成後の効率的な持続的プライマー伸長が挙げられる。方法と組成物に適応可能な非天然塩基対については、例えばHiraoら,(2002)An unnatural base pair for incorporating amino acid analogues into protein,Nature Biotechnology,20:177−182に記載されている。Wu,Y.ら,(2002)J.Am.Chem.Soc.124:14626−14630も参照。他の関連文献は以下に挙げる。
in vivo使用では、非天然ヌクレオシドは膜透過性であり、リン酸化され、対応する三リン酸塩を形成する。更に、増加した遺伝情報は安定しており、細胞内酵素により破壊されない。Bennerらによる従来の報告はカノニカルワトソンクリック対とは異なる水素結合パターンを利用しており、そのうちで最も注目される例はイソC:イソG対である。例えばSwitzerら,(1989)J.Am.Chem.Soc.,111:8322;及びPiccirilliら,(1990)Nature,343:33;Kool,(2000)Curr.Opin.Chem.Biol.,4:602参照。これらの塩基は一般に天然塩基とある程度まで誤対合し、酵素複製することができない。Koolらは水素結合を塩基間の疎水性パッキング相互作用に置き換えることにより塩基対の形成を誘導できることを立証した。Kool,(2000)Curr.Opin.Chem.Biol.,4:602;及びGuckian and Kool,(1998)Angew.Chem.Int.Ed.Engl.,36,2825参照。上記全要件を満足する非天然塩基対を開発する目的でSchultz,Romesbergらは一連の非天然疎水性塩基を体系的に合成し、試験した。PICS:PICS自己対は天然塩基対よりも安定しており、大腸菌DNAポリメラーゼIのKlenowフラグメント(KF)によりDNAに効率的に組込むことができる。例えばMcMinnら,(1999)J.Am.Chem.Soc.,121:11586;及びOgawaら,(2000)J.Am.Chem.Soc.,122:3274参照。生体機能に十分な効率と選択性でKFにより3MN:3MN自己対を合成することができる。例えばOgawaら,(2000)J.Am.Chem.Soc.,122:8803参照。しかし、どちらの塩基も後期複製用チェーンターミネーターとして作用するものである。PICS自己対を複製するために使用できる突然変異体DNAポリメラーゼが最近開発された。更に、7AI自己対も複製することができる。例えばTaeら,(2001)J.Am.Chem.Soc.,123:7439参照。Cu(II)と結合すると安定な対を形成する新規メタロ塩基対Dipic:Pyも開発された。Meggersら,(2000)J.Am.Chem.Soc.,122:10714参照。拡張コドンと非天然コドンは天然コドンに本質的に直交性であるので、本発明の方法は天然コドンに直交性のtRNAを作製するためにこの性質を利用することができる。
翻訳バイパス系を使用して非天然アミノ酸を所望ポリペプチドに組込むこともできる。1翻訳バイパス系では、大きい配列が遺伝子に挿入されるが、蛋白質に翻訳されない。この配列はリボソームに配列を飛び越させて挿入の下流の翻訳を再開するための合図として機能する構造を含む。
非天然アミノ酸
本明細書で使用する非天然アミノ酸とはセレノシステイン及び/又はピロリジンと20種の遺伝的にコードされる以下のα−アミノ酸、即ちアラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、バリン以外の任意アミノ酸、修飾アミノ酸又はアミノ酸類似体を意味する。α−アミノ酸の一般構造は式I:
により表される。
非天然アミノ酸は一般に式Iをもつ任意構造であり、式中、R基は20種の天然アミノ酸で使用されている以外の任意置換基である。20種の天然アミノ酸の構造については、例えばL.Stryer著Biochemistry,第3版,1988,Freeman and Company,New York参照。なお、本発明の非天然アミノ酸は上記20種のα−アミノ酸以外の天然化合物でもよい。
本発明の非天然アミノ酸は一般に側鎖が天然アミノ酸と異なるので、天然蛋白質と同様に他のアミノ酸(例えば天然又は非天然アミノ酸)とアミド結合を形成する。一方、非天然アミノ酸は天然アミノ酸と異なる側鎖基をもつ。
本発明では図1に示す非天然アミノ酸が特に重要である。例えば、これらの非天然アミノ酸としては限定されないが、p−エチルチオカルボニル−L−フェニルアラニン、p−(3−オキソブタノイル)−L−フェニルアラニン、1,5−ダンシル−アラニン、7−アミノ−クマリン−アラニン、7−ヒドロキシ−クマリン−アラニン、ニトロベンジル−セリン、O−(2−ニトロベンジル)−L−チロシン、p−カルボキシメチル−L−フェニルアラニン、p−シアノ−L−フェニルアラニン、m−シアノ−L−フェニルアラニン、ビフェニルアラニン、3−アミノ−L−チロシン、ビピリジルアラニン、p−(2−アミノ−1−ヒドロキシエチル)−L−フェニルアラニン、p−イソプロピルチオカルボニル−L−フェニルアラニン、3−ニトロ−L−チロシン及びp−ニトロ−L−フェニルアラニンが挙げられる。本発明ではこれらの非天然アミノ酸のL及びDエナンチオマーのどちらも利用できる。
図1の非天然アミノ酸に加え、例えば本発明により提供される直交対と適切な第2のO−tRNA/O−RS対を併用して他の非天然アミノ酸を同時に該当ポリペプチドに組込むことができる。多数のこのような付加非天然アミノ酸と適切な直交対が公知である。本明細書の引用文献参照。例えば、その開示内容全体を参考資料として本明細書に組込むWang and Schultz“Expanding the Genetic Code,”Angewandte Chemie Int.Ed.,44(1):34−66(2005)参照。
他の非天然アミノ酸では、例えば、式IにおけるRは場合によりアルキル、アリール、アシル、ヒドラジン、シアノ、ハロ、ヒドラジド、アルケニル、エーテル、硼酸、ボロン酸、ホスホ、ホスホノ、ホスフィン、エノン、イミン、エステル、ヒドロキシルアミン、アミン基等又はその任意組合せを含む。他の該当非天然アミノ酸としては限定されないが、光架橋基をもつアミノ酸、スピン標識アミノ酸、蛍光アミノ酸、金属結合性アミノ酸、金属含有アミノ酸、放射性アミノ酸、新規官能基をもつアミノ酸、他の分子と共有又は非共有的に相互作用するアミノ酸、フォトケージド及び/又は光異性化可能なアミノ酸、ビオチン又はビオチン類似体を含有するアミノ酸、ケト含有アミノ酸、グリコシル化アミノ酸、アミノ酸側鎖と結合した糖部分、ポリエチレングリコール又はポリエーテルを含むアミノ酸、重原子置換アミノ酸、化学分解性又は光分解性アミノ酸、天然アミノ酸に比較して延長側鎖(例えばポリエーテル又は例えば約5もしくは約10炭素長を上回る長鎖炭化水素等)をもつアミノ酸、炭素結合糖含有アミノ酸、アミノチオ酸含有アミノ酸、及び1個以上の毒性部分を含むアミノ酸が挙げられる。
別の側面では、本発明は下式IV:
により表される一般構造をもつ非天然アミノ酸を提供する。
この構造をもつ非天然アミノ酸は一般にR1が20種の天然アミノ酸の1種で使用される置換基(例えば、チロシン又はフェニルアラニン)であり、R2が置換基である任意構造である。従って、この種のアミノ酸は天然アミノ酸誘導体とみなすことができる。
図1に示す非天然アミノ酸等の新規側鎖を含む非天然アミノ酸に加え、非天然アミノ酸は場合により例えば式II及びIII:
の構造により表されるような修飾主鎖構造も含み、上記式中、Zは一般にOH、NH2、SH、NH−R’又はS−R’を含み、XとYは同一でも異なっていてもよく、一般にS又はOであり、RとR’は場合により同一又は異なり、一般に式Iをもつ非天然アミノ酸について上記に記載したR基と同一の基及び水素から選択される。例えば、本発明の非天然アミノ酸は場合により式II及びIIIにより表されるようにアミノ又はカルボキシル基に置換を含む。この種の非天然アミノ酸としては限定されないが、例えば20種の標準天然アミノ酸に対応する側鎖又は非天然側鎖をもつα−ヒドロキシ酸、α−チオ酸、α−アミノチオカルボキシレートが挙げられる。更に、α炭素の置換は場合によりL、D又はα,α−ジ置換アミノ酸(例えばD−グルタミン酸、D−アラニン、D−メチル−O−チロシン、アミノ酪酸等)を含む。他の代替構造としては環状アミノ酸(例えばプロリン類似体や、3、4、6、7、8及び9員環プロリン類似体)、β及びγアミノ酸(例えば置換β−アラニン及びγ−アミノ酪酸)が挙げられる。
所定側面では、本発明はL配置の非天然アミノ酸を利用する。しかし、本発明はL配置非天然アミノ酸の使用に限定されない。本発明ではこれらの非天然アミノ酸のDエナンチオマーも利用できると考えられる。
チロシン類似体としてはパラ置換チロシン、オルト置換チロシン、及びメタ置換チロシンが挙げられ、置換チロシンはアルキニル基、アセチル基、ベンゾイル基、アミノ基、ヒドラジン、ヒドロキシルアミン、チオール基、カルボキシ基、イソプロピル基、メチル基、C6−C20直鎖又は分岐鎖炭化水素、飽和又は不飽和炭化水素、O−メチル基、ポリエーテル基、ニトロ基等を含む。更に、多置換アリール環も考えられる。本発明のグルタミン類似体としては限定されないが、α−ヒドロキシ誘導体、γ置換誘導体、環状誘導体及びアミド置換グルタミン誘導体が挙げられる。フェニルアラニン類似体の例としては限定されないが、パラ置換フェニルアラニン、オルト置換フェニルアラニン、及びメタ置換フェニルアラニンが挙げられ、置換基はアルキニル基、ヒドロキシ基、メトキシ基、メチル基、アリル基、アルデヒド、ニトロ、チオール基又はケト基等を含む。非天然アミノ酸の特定例としては限定されないが、p−エチルチオカルボニル−L−フェニルアラニン、p−(3−オキソブタノイル)−L−フェニルアラニン、1,5−ダンシル−アラニン、7−アミノ−クマリンアミノ酸、7−ヒドロキシ−クマリンアミノ酸、ニトロベンジル−セリン、O−(2−ニトロベンジル)−L−チロシン、p−カルボキシメチル−L−フェニルアラニン、p−シアノ−L−フェニルアラニン、m−シアノ−L−フェニルアラニン、ビフェニルアラニン、3−アミノ−L−チロシン、ビピリジルアラニン、p−(2−アミノ−1−ヒドロキシエチル)−L−フェニルアラニン、p−イソプロピルチオカルボニル−L−フェニルアラニン、3−ニトロ−L−チロシン及びp−ニトロ−L−フェニルアラニンが挙げられる。更に、p−プロパルギルオキシフェニルアラニン、3,4−ジヒドロキシ−L−フェニルアラニン(DHP)、3,4,6−トリヒドロキシ−L−フェニルアラニン、3,4,5−トリヒドロキシ−L−フェニルアラニン、4−ニトロ−フェニルアラニン、p−アセチル−L−フェニルアラニン、O−メチル−L−チロシン、L−3−(2−ナフチル)アラニン、3−メチルフェニルアラニン、O−4−アリル−L−チロシン、4−プロピル−L−チロシン、3−ニトロ−チロシン、3−チオール−チロシン、トリ−O−アセチル−GlcNAcβ−セリン、L−Dopa、フッ素化フェニルアラニン、イソプロピル−L−フェニルアラニン、p−アジド−L−フェニルアラニン、p−アシル−L−フェニルアラニン、p−ベンゾイル−L−フェニルアラニン、L−ホスホセリン、ホスホノセリン、ホスホノチロシン、p−ヨードフェニルアラニン、p−ブロモフェニルアラニン、p−アミノ−L−フェニルアラニン、及びイソプロピル−L−フェニルアラニン等が挙げられる。各種非天然アミノ酸の構造は本明細書(例えば図1)に示す。公開国際出願WO2004/094593、発明の名称「真核遺伝コードの拡張(EXPANDING THE EUKARYOTIC GENETIC CODE)」も参照。
非天然アミノ酸の化学的合成
上記非天然アミノ酸の多くは例えばSigma(米国)やAldrich(Milwaukee,WI,米国)から市販されている。市販されていないものは場合により各種刊行物に記載されている方法や当業者に公知の標準方法を使用して合成される。有機合成技術については例えばFessendonとFessendon著Organic Chemistry(1982,第2版,Willard Grant Press,Boston Mass.);March著Advanced Organic Chemistry(第3版,1985,Wiley and Sons,New York);及びCareyとSundberg著Advanced Organic Chemistry(第3版,Parts A and B,1990,Plenum Press,New York)参照。非天然アミノ酸の合成について記載しているその他の刊行物としては例えばWO2002/085923、発明の名称「非天然アミノ酸のインビボ組込み(In vivo incorporation of unnatural amino acids)」;Matsoukasら,(1995)J.Med.Chem.,38,4660−4669;King,F.E.& Kidd,D.A.A.(1949)A New Synthesis of Glutamine and of γ−Dipeptides of Glutamic Acid from Phthylated Intermediates.J.Chem.Soc.,3315−3319;Friedman,O.M.& Chatterrji,R.(1959)Synthesis of Derivatives of Glutamine as Model Substrates for Anti−Tumor Agents.J.Am.Chem.Soc.81,3750−3752;Craig,J.C.ら(1988)Absolute Configuration of the Enantiomers of 7−Chloro−4[[4−(diethylamino)−1−methylbutyl]amino]quinoline(Chloroquine).J.Org.Chem.53,1167−1170;Azoulay,M.,Vilmont,M.& Frappier,F.(1991)Glutamine analogues as Potential Antimalarials.Eur.J.Med.Chem.26,201−5;Koskinen,A.M.P.& Rapoport,H.(1989)Synthesis of 4−Substituted Prolines as Conformationally Constrained Amino Acid Analogues.J.Org.Chem.54,1859−1866;Christie,B.D.& Rapoport,H.(1985)Synthesis of Optically Pure Pipecolates from L−Asparagine.Application to the Total Synthesis of(+)−Apovincamine through Amino Acid Decarbonylation and Iminium Ion Cyclization.J.Org.Chem.1989:1859−1866;Bartonら,(1987)Synthesis of Novel α−Amino−Acids and Derivatives Using Radical Chemistry:Synthesis of L−and D−α−Amino−Adipic Acids,L−α−aminopimelic Acid and Appropriate Unsaturated Derivatives.Tetrahedron Lett.43:4297−4308;及びSubasingheら,(1992)Quisqualic acid analogues:synthesis of beta−heterocyclic 2−aminopropanoic acid derivatives and their activity at a novel quisqualate−sensitized site.J.Med.Chem.35:4602−7が挙げられる。国際公開WO2004/058946、発明の名称「蛋白質アレー(PROTEIN ARRAYS)」(出願日2003年12月22日)も参照。
非天然アミノ酸の細胞取込み
細胞による非天然アミノ酸取り込みは例えば蛋白質に組込むように非天然アミノ酸を設計及び選択する場合に一般に考慮される問題の1つである。例えば、α−アミノ酸は電荷密度が高いため、これらの化合物は細胞に浸透しにくいと思われる。天然アミノ酸は異なる程度のアミノ酸特異性を示すことが多い一連の蛋白質輸送システムにより細胞に取り込まれる。非天然アミノ酸が細胞に取り込まれる場合にはどの非天然アミノ酸が取り込まれるかを判断する迅速なスクリーニングを実施することができる。例えば国際公開WO2004/058946、発明の名称「蛋白質アレー(PROTEIN ARRAYS)」(出願日2003年12月22日);及びLiu and Schultz(1999)Progress toward the evolution of an organism with an expanded genetic code.PNAS 96:4780−4785における毒性アッセイ参照。取込みは種々のアッセイで容易に分析されるが、細胞取込み経路に利用可能な非天然アミノ酸を設計する代替方法は、アミノ酸をin vivo生産する生合成経路を提供する方法である。
非天然アミノ酸の生合成
細胞にはアミノ酸と他の化合物を生産するために多数の生合成経路が元々存在している。特定非天然アミノ酸の生合成法は自然界(例えば細胞中)には存在しないと思われるが、本発明はこのような方法を提供する。例えば、非天然アミノ酸の生合成経路は場合により新規酵素を付加するか又は既存宿主細胞経路を改変することにより宿主細胞で作製される。付加新規酵素は場合により天然酵素又は人工的に進化させた酵素である。例えば、(WO2002/085923、前出の実施例に記載されているような)p−アミノフェニルアラニンの生合成は他の生物に由来する公知酵素の組合せの付加に依存している。これらの酵素の遺伝子はこれらの遺伝子を含むプラスミドで細胞を形質転換することにより細胞に導入することができる。これらの遺伝子は細胞で発現されると、所望化合物を合成するための酵素経路を提供する。場合により付加される酵素種の例は下記実施例に記載する。その他の酵素配列は例えばGenbankに登録されている。人工的に進化させた酵素も場合により同様に細胞に付加する。このように、非天然アミノ酸を生産するように細胞機構と細胞資源を操作する。
実際に、生合成経路で使用する新規酵素を生産するため又は非天然アミノを生産するように既存経路をin vitroもしくはin vivoで進化させるためには種々の方法の任意のものを使用することができる。非天然アミノ酸を生産するため(又は、実際に新規基質特異性もしくは他の該当活性をもつようにシンテターゼを進化させるため)には、酵素及び他の生合成経路成分を進化させる方法として入手可能な多数の方法を本発明に適用することができる。例えば、非天然アミノ酸を生産(又は新規シンテターゼを生産)するように新規酵素及び/又は前記酵素の経路をin vitro又はin vivoで開発するためには、場合によりDNAシャフリングを使用する。例えばStemmer(1994),Rapid evolution of a protein in vitro by DNA shuffling,Nature 370(4):389−391;及びStemmer,(1994),DNA shuffling by random fragmentation and reassembly:In vitro recombination for molecular evolution,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,91:10747−10751参照。関連アプローチは所望特性をもつ酵素を迅速に進化させるために関連(例えば相同)遺伝子のファミリーをシャフリングする。このような「ファミリー遺伝子シャフリング」法の1例はCrameriら(1998)“DNA shuffling of a family of genes from diverse species accelerates directed evolution”Nature,391(6664):288−291に記載されている。(生合成経路成分であるか又はシンテターゼであるかを問わずに)新規酵素は例えばOstermeierら(1999)“A combinatorial approach to hybrid enzymes independent of DNA homology”Nature Biotech 17:1205に記載されているような「ハイブリッド酵素作製用インクリメンタルトランケーション(incremental truncation for the creation of hybrid enzymes:ITCHY)」として知られるDNA組換え法を使用して作製することもできる。このアプローチは1種以上のin vitro又はin vivo組換え法の基質として使用することができる酵素又は他の経路変異体のライブラリーを作製するために使用することもできる。Ostermeierら(1999)“Combinatorial Protein Engineering by Incremental Truncation,”Proc.Natl.Acad.Sci.USA,96:3562−67,及びOstermeierら(1999),“Incremental Truncation as a Strategy in the Engineering of Novel Biocatalysts,” Biological and Medicinal Chemistry,7:2139−44も参照。別のアプローチは例えば非天然アミノ酸(又は新規シンテターゼ)の生産に関連する生合成反応を触媒する能力について選択する酵素又は他の経路変異体のライブラリーを作製するために指数的集合突然変異誘発を使用する。このアプローチでは、該当配列中の小群の残基を並行してランダムに突然変異させ、機能的蛋白質をもたらすアミノ酸を各変異位置で同定する。非天然アミノ酸(又は新規シンテターゼ)の生産用新規酵素を作製するように本発明に応用することができるこのような方法の例はDelegrave & Youvan(1993)Biotechnology Research 11:1548−1552に記載されている。更に別のアプローチでは、例えばArkin and Youvan(1992)“Optimizing nucleotide mixtures to encode specific subsets of amino acids for semi−random mutagenesis”Biotechnology 10:297−300;又はReidhaar−Olsonら(1991)“Random mutagenesis of protein sequences using oligonucleotide cassettes”Methods Enzymol.208:564−86の一般突然変異誘発法を使用することにより、酵素及び/又は経路成分操作にドープ又は縮重オリゴヌクレオチドを使用するランダム又は半ランダム突然変異誘発を使用することができる。ポリヌクレオチドリアセンブリと部位飽和突然変異誘発を使用する更に別のアプローチ(「非確率論的」突然変異誘発と呼ぶことが多い)を使用すると、酵素及び/又は経路成分を作製した後に、(例えば非天然アミノ酸のin vivo生産のための)1種以上のシンテターゼ又は生合成経路機能を実施する能力についてスクリーニングすることができる。例えばShort「遺伝子ワクチン及び酵素の非確率論的作製(NON−STOCHASTIC GENERATION OF GENETIC VACCINES AND ENZYMES)」WO00/46344参照。
このような突然変異法の代替方法は生物の全ゲノムを組換え、得られた子孫を特定経路機能について選択する方法である(「全ゲノムシャフリング」と呼ぶことが多い)。このアプローチは、例えばゲノム組換えと非天然アミノ酸(又はその中間体)の生産能に関する生物(例えば大腸菌又は他の細胞)の選択により本発明に適用することができる。例えば、非天然アミノ酸をin vivo生産するように細胞で既存及び/又は新規経路を進化させるための経路設計には、以下の刊行物に教示されている方法を適用することができる:Patnaikら(2002)“Genome shuffling of lactobacillus for improved acid tolerance”Nature Biotechnology,20(7):707−712;及びZhangら(2002)“Genome shuffling leads to rapid phenotypic improvement in bacteria”Nature,February 7,415(6872):644−646。
例えば所望化合物を生産するための他の生物及び代謝経路組換え技術も利用可能であり、同様に非天然アミノ酸の生産に適用することができる。有用な経路組換えアプローチを教示している刊行物の例としては、Nakamura and White(2003)“Metabolic engineering for the microbial production of 1,3 propanediol”Curr.Opin.Biotechnol.14(5):454−9;Berryら(2002)“Application of Metabolic Engineering to improve both the production and use of Biotech Indigo”J.Industrial Microbiology and Biotechnology 28:127−133;Bantaら(2002)“Optimizing an artificial metabolic pathway:Engineering the cofactor specificity of Corynebacterium 2,5−diketo−D−gluconic acid reductase for use in vitamin C biosynthesis” Biochemistry,41(20),6226−36;Selivonovaら(2001)“Rapid Evolution of Novel Traits in Microorganisms”Applied and Environmental Microbiology,67:3645、及び他の多数の文献が挙げられる。
使用する方法に関係なく、一般に本発明の組換え生合成経路を使用して生産される非天然アミノ酸は効率的な蛋白質生合成に十分な濃度(例えば天然細胞内量)で生産されるが、他の細胞内アミノ酸濃度を有意に変化させたり細胞内資源を枯渇させる程ではない。このようにin vivo生産される典型的な濃度は約10mM〜約0.05mMである。特定経路に所望される酵素を生産するように細胞を組換え、非天然アミノ酸を作製したら、場合によりin vivo選択を使用してリボソーム蛋白質合成と細胞増殖の両方に適合するように非天然アミノ酸の生産を更に最適化させる。
非天然アミノ酸を組込むための直交成分
本発明はセレクターコドン(例えばアンバー終止コドン、ナンセンスコドン、4塩基以上のコドン等)に応答して成長中のポリペプチド鎖に非天然アミノ酸(例えば図1に示す非天然アミノ酸)を例えばin vivoで組込むための直交成分を作製する組成物及び方法を提供する。例えば、本発明は直交tRNA(O−tRNA)、直交アミノアシルtRNAシンテターゼ(O−RS)及びその対を提供する。これらの対は成長中のポリペプチド鎖に非天然アミノ酸を組込むために使用することができる。
本発明の組成物は直交アミノアシルtRNAシンテターゼ(O−RS)を含み、O−RSはO−tRNAをp−エチルチオカルボニル−L−フェニルアラニン、p−(3−オキソブタノイル)−L−フェニルアラニン、1,5−ダンシル−アラニン、7−アミノ−クマリン−アラニン、7−ヒドロキシ−クマリン−アラニン、o−ニトロベンジル−セリン、O−(2−ニトロベンジル)−L−チロシン、p−カルボキシメチル−L−フェニルアラニン、p−シアノ−L−フェニルアラニン、m−シアノ−L−フェニルアラニン、ビフェニルアラニン、3−アミノ−L−チロシン、ビピリジルアラニン、p−(2−アミノ−1−ヒドロキシエチル)−L−フェニルアラニン、p−イソプロピルチオカルボニル−L−フェニルアラニン、3−ニトロ−L−チロシン又はp−ニトロ−L−フェニルアラニンで優先的にアミノアシル化する。所定態様では、O−RSは配列番号7−10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、50、52−55、57及び59−63とその保存変異体のいずれか1種を含むアミノ酸配列を含む。本発明の所定態様では、O−RSは内在tRNAよりもO−tRNAを優先的に特定非天然アミノ酸でアミノアシル化し、O−RSはO−tRNAを優先し、非天然アミノ酸を負荷されるO−tRNAと同一非天然アミノ酸を負荷される内在tRNAの比は1:1を上回り、O−RSはO−tRNAに排他的又はほぼ排他的に負荷することがより好ましい。
O−RSを含む組成物は場合により更に直交tRNA(O−tRNA)を含むことができ、O−tRNAはセレクターコドンを認識する。一般に、本発明のO−tRNAは本明細書の配列表(例えば配列番号1)及び実施例に記載するようなポリヌクレオチド配列を含むか又は前記配列によりコードされるO−tRNAの抑圧効率に比較してコグネイトシンテターゼの存在下でセレクターコドンに応答して少なくとも例えば約45%、50%、60%、75%、80%、又は90%以上の抑圧効率を含む。1態様では、O−RSとO−tRNAの併用による抑圧効率はO−RSの不在下のO−tRNAの抑圧効率の例えば5倍、10倍、15倍、20倍、25倍又はそれ以上である。所定側面では、O−RSとO−tRNAの併用による抑圧効率はMethanococcus jannaschiiに由来する直交チロシルtRNAシンテターゼ対、あるいは大腸菌に由来する直交ロイシルtRNAシンテターゼ対の抑圧効率の少なくとも45%である。
O−tRNAを含む組成物は場合により細胞(例えば大腸菌細胞等の真正細菌細胞、又は酵母細胞等の真核細胞)、及び/又は翻訳系を含むことができる。
本発明は翻訳系を含む細胞(例えば真正細菌細胞又は酵母細胞)も提供し、前記翻訳系は直交tRNA(O−tRNA)と;直交アミノアシルtRNAシンテターゼ(O−RS)と;非天然アミノ酸(例えば図1に示すアミノ酸)を含む。一般に、O−RSは内在tRNAよりもO−tRNAを優先的に非天然アミノ酸でアミノアシル化し、O−RSはO−tRNAを優先し、非天然アミノ酸を負荷されるO−tRNAと非天然アミノ酸を負荷される内在tRNAの比は1:1を上回り、O−RSはO−tRNAに排他的又はほぼ排他的に負荷することがより好ましい。O−tRNAは第1のセレクターコドンを認識し、O−RSはO−tRNAを非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する。1態様では、O−tRNAは配列番号1、配列番号2に記載のポリヌクレオチド配列又はその相補的ポリヌクレオチド配列を含むか又は前記配列によりコードされる。1態様では、O−RSは配列番号7−10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、50、52−55、57、59−63及びその保存変異体の任意1種に記載のアミノ酸配列を含む。
本発明の細胞は場合により異なる付加O−tRNA/O−RS対と第2の非天然アミノ酸を更に含むことができ、例えばこのO−tRNAは第2のセレクターコドンを認識し、このO−RSは対応するO−tRNAを第2の非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化し、第2のアミノ酸は第1の非天然アミノ酸と異なる。場合により、本発明の細胞は該当ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸を含み、前記ポリヌクレオチドはO−tRNAにより認識されるセレクターコドンを含む。
所定態様では、本発明の細胞は直交−tRNA(O−tRNA)と、直交アミノアシルtRNAシンテターゼ(O−RS)と、非天然アミノ酸と、該当ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸を含む真正細菌細胞(例えば大腸菌細胞)又は酵母細胞であり、前記ポリヌクレオチドはO−tRNAにより認識されるセレクターコドンを含む。本発明の所定態様では、O−RSはO−RSが任意内在tRNAをアミノアシル化する効率よりも高い効率でO−tRNAを非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する。
本発明の所定態様では、本発明のO−tRNAは本明細書の配列表(例えば配列番号1又は配列番号2)もしくは実施例に記載するようなポリヌクレオチド配列、又はその相補的ポリヌクレオチド配列を含むか又は前記配列によりコードされる。本発明の所定態様では、O−RSは本明細書の配列表に記載するようなアミノ酸配列、又はその保存変異体を含む。1態様では、O−RS又はその一部は本明細書の配列表もしくは実施例に記載するようなアミノ酸をコードするポリヌクレオチド配列、又はその相補的ポリヌクレオチド配列によりコードされる。
本発明のO−tRNA及び/又はO−RSは種々の生物(例えば真核及び/又は非真核生物)の任意のものに由来することができる。
ポリヌクレオチドも本発明の特徴である。本発明のポリヌクレオチドは本明細書の配列表に記載するようなポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む人工(例えば人為的に作製され、天然には存在しない)ポリヌクレオチドを含むか、及び/又は前記ポリヌクレオチド配列に相補的であるか又は前記配列をコードする。本発明のポリヌクレオチドは更に核酸の実質的に全長にわたって高ストリンジェント条件下で上記ポリヌクレオチドとハイブリダイズする核酸も含むことができる。本発明のポリヌクレオチドは更に天然に存在するtRNA又は対応するコーディング核酸のポリヌクレオチドと例えば少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%又はそれ以上一致するポリヌクレオチドを含み(但し、本発明のポリヌクレオチドは天然に存在するtRNA又は対応するコーディング核酸以外のものである)、前記tRNAはセレクターコドン(例えば4塩基コドン)を認識する。上記任意ポリヌクレオチド及び/又は上記任意ポリヌクレオチドの保存変異体を含むポリヌクレオチドと例えば少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%又はそれ以上一致する人工ポリヌクレオチドも本発明のポリヌクレオチドに含まれる。
本発明のポリヌクレオチドを含むベクターも本発明の特徴である。例えば、本発明のベクターはプラスミド、コスミド、ファージ、ウイルス、発現ベクター及び/又は同等物を含むことができる。本発明のベクターを含む細胞も本発明の特徴である。
O−tRNA/O−RS対の成分の作製方法も本発明の特徴である。これらの方法により作製された成分も本発明の特徴である。例えば、細胞に対して直交性である少なくとも1種のtRNA(O−tRNA)の作製方法は突然変異体tRNAのライブラリーを作製する段階と;セレクターコドンを認識できるように突然変異体tRNAのライブラリーの各メンバーのアンチコドンループを突然変異させることにより、潜在的O−tRNAのライブラリーを提供する段階と、潜在的O−tRNAのライブラリーのメンバーを含む第1の種の第1の細胞集団についてネガティブ選択を実施する段階を含む。ネガティブ選択は細胞に内在性のアミノアシルtRNAシンテターゼ(RS)によりアミノアシル化される潜在的O−tRNAライブラリーのメンバーを含む細胞を排除する。こうして、第1の種の細胞に対して直交性のtRNAプールが得られ、それにより少なくとも1種のO−tRNAが得られる。本発明の方法により作製されたO−tRNAも提供する。
所定態様では、前記方法は更に第1の種の第2の細胞集団についてポジティブ選択を実施する段階を含み、前記細胞は第1の種の細胞に対して直交性のtRNAプールのメンバーと、コグネイトアミノアシルtRNAシンテターゼと、ポジティブ選択マーカーを含む。ポジティブ選択を使用し、コグネイトアミノアシルtRNAシンテターゼによりアミノアシル化され、ポジティブ選択マーカーの存在下で所望応答を示すtRNAプールのメンバーを含む細胞について細胞を選択又はスクリーニングすることにより、O−tRNAを得る。所定態様では、第2の細胞集団はネガティブ選択により排除されなかった細胞を含む。
非天然アミノ酸をO−tRNAに負荷する直交アミノアシルtRNAシンテターゼの同定方法も提供する。例えば、方法は第1の種の細胞集団に選択を実施する段階を含み、前記細胞は、1)複数のアミノアシルtRNAシンテターゼ(RS)(例えば複数のRSは突然変異体RS、第1の種以外の種に由来するRS、又は突然変異体RSと第1の種以外の種に由来するRSの両方を含むことができる)のメンバーと;2)(例えば1種以上の種に由来する)直交−tRNA(O−tRNA)と;3)ポジティブ選択マーカーをコードし、少なくとも1個のセレクターコドンを含むポリヌクレオチドを各々含む。
複数のRSのメンバーを含まないか又はその量の少ない細胞に比較して抑圧効率の高い細胞について細胞(例えば宿主細胞)を選択又はスクリーニングする。これらの選択/スクリーニングした細胞はO−tRNAをアミノアシル化する活性RSを含む。この方法により同定された直交アミノアシルtRNAシンテターゼも本発明の特徴である。
非天然アミノ酸を選択位置にもつ蛋白質を細胞(例えば大腸菌細胞等の真正細菌細胞、又は酵母細胞)で生産する方法も本発明の特徴である。例えば、1方法は、少なくとも1個のセレクターコドンを含み、蛋白質をコードする核酸を含む細胞を適当な培地で増殖させる段階と、非天然アミノ酸を提供する段階と、少なくとも1個のセレクターコドンによる核酸の翻訳中に蛋白質の特定位置に非天然アミノ酸を組込むことにより、蛋白質を生産する段階を含む。細胞は更に、細胞で機能し、セレクターコドンを認識する直交tRNA(O−tRNA)と;O−tRNAを非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する直交アミノアシルtRNAシンテターゼ(O−RS)を含む。この方法により生産された蛋白質も本発明の特徴である。
本発明は例えばp−エチルチオカルボニル−L−フェニルアラニン、p−(3−オキソブタノイル)−L−フェニルアラニン、1,5−ダンシル−アラニン、7−アミノ−クマリン−アラニン、7−ヒドロキシ−クマリン−アラニン、ニトロベンジル−セリン、O−(2−ニトロベンジル)−L−チロシン、p−カルボキシメチル−L−フェニルアラニン、p−シアノ−L−フェニルアラニン、m−シアノ−L−フェニルアラニン、ビフェニルアラニン、3−アミノ−L−チロシン、ビピリジルアラニン、p−(2−アミノ−1−ヒドロキシエチル)−L−フェニルアラニン、p−イソプロピルチオカルボニル−L−フェニルアラニン、3−ニトロ−L−チロシン又はp−ニトロ−L−フェニルアラニンを組込んだ蛋白質を含有する組成物も提供する。所定態様では、蛋白質は公知蛋白質(例えば治療用蛋白質、診断用蛋白質、産業用酵素、又はその部分)のアミノ酸配列と少なくとも75%一致するアミノ酸配列を含む。場合により、組成物は医薬的に許容可能なキャリヤーを含有する。
核酸及びポリペプチド配列と変異体
本明細書に記載するように、本発明は例えばO−tRNA及びO−RSをコードするポリヌクレオチド配列と、ポリペプチドアミノ酸配列(例えばO−RS)と、例えば前記ポリヌクレオチド又はポリペプチド配列を含む組成物、系及び方法を提供する。前記配列(例えばO−tRNA及びO−RSアミノ酸及びヌクレオチド配列)の例を本明細書に開示する(表5、例えば配列番号7−10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、50、52−55、57及び59−63参照)。しかし、当業者に自明の通り、本発明は本明細書、例えば実施例や配列表に開示する配列に限定されない。当業者に自明の通り、本発明は本明細書に記載する機能をもつ多数の関連配列(例えば、本明細書に開示するO−RSの保存変異体をコードするポリヌクレオチド及びポリペプチド)も提供する。
O−tRNAを非天然アミノ酸(例えば図1に示す非天然アミノ酸)でアミノアシル化することが可能な直交シンテターゼ種(O−RS)の構築と分析を実施例1〜16に記載する。これらの実施例は非天然アミノ酸p−エチルチオカルボニル−L−フェニルアラニン、p−(3−オキソブタノイル)−L−フェニルアラニン、1,5−ダンシル−アラニン、7−アミノ−クマリン−アラニン、7−ヒドロキシ−クマリン−アラニン、o−ニトロベンジル−セリン、O−(2−ニトロベンジル)−L−チロシン、p−カルボキシメチル−L−フェニルアラニン、p−シアノ−L−フェニルアラニン、m−シアノ−L−フェニルアラニン、ビフェニルアラニン、3−アミノ−L−チロシン、ビピリジルアラニン、p−(2−アミノ−1−ヒドロキシエチル)−L−フェニルアラニン、p−イソプロピルチオカルボニル−L−フェニルアラニン、3−ニトロ−L−チロシン及びp−ニトロ−L−フェニルアラニンを組込むことが可能なO−RS種の構築と分析について記載する。
本発明はポリペプチド(O−RS)とポリヌクレオチド(例えばO−tRNA、O−RS又はその部分をコードするポリヌクレオチド、アミノアシルtRNAシンテターゼクローンを単離するために使用されるオリゴヌクレオチド等)を提供する。本発明のポリヌクレオチドとしては、1個以上のセレクターコドンをもつ本発明の該当蛋白質又はポリペプチドをコードするものが挙げられる。更に、本発明のポリヌクレオチドとしては、例えば配列番号11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、51、56及び58に記載のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド;そのポリヌクレオチド配列に相補的であるか又は前記配列をコードするポリヌクレオチドが挙げられる。本発明のポリヌクレオチドは更に配列番号7−10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、50、52−55、57及び59−63を含むO−RSアミノ酸配列をコードする任意ポリヌクレオチドを含む。同様に、核酸の実質的に全長にわたって高ストリンジェント条件下で上記ポリヌクレオチドとハイブリダイズする人工核酸(天然ポリヌクレオチド以外のもの)も本発明のポリヌクレオチドである。1態様では、組成物は本発明のポリペプチドと賦形剤(例えば緩衝液、水、医薬的に許容可能な賦形剤等)を含有する。本発明は本発明のポリペプチドに対して特異的に免疫反応性の抗体又は抗血清も提供する。人工ポリヌクレオチドは人為的に作製され、天然には存在しないポリヌクレオチドである。
本発明のポリヌクレオチドは天然に存在するtRNAのポリヌクレオチドと例えば少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%又はそれ以上一致する人工ポリヌクレオチド(但し、天然に存在するtRNA以外のもの)も含む。ポリヌクレオチドは天然に存在するtRNAのポリヌクレオチドと例えば少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%又はそれ以上一致する(但し100%は一致しない)人工ポリヌクレオチドも含む。
所定態様では、ベクター(例えばプラスミド、コスミド、ファージ、ウイルス等)に本発明のポリヌクレオチドを組込む。1態様では、ベクターは発現ベクターである。別の態様では、発現ベクターは本発明のポリヌクレオチドの1種以上と機能的に連結されたプロモーターを含む。別の態様では、本発明のポリヌクレオチドを組込んだベクターを細胞に導入する。
同様に当業者に自明の通り、開示配列の多数の変異体も本発明に含まれる。例えば、機能的に同一配列となる開示配列の保存変異体も本発明に含まれる。少なくとも1種の開示配列とハイブリダイスする核酸ポリヌクレオチド配列の変異体も本発明に含むものとする。例えば標準配列比較法により判定した場合に本明細書に開示する配列のユニークサブ配列であると判断される配列も本発明に含まれる。
保存変異
遺伝コードの縮重により、「サイレント置換」(即ちコードされるポリペプチドに変化を生じない核酸配列の置換)はアミノ酸配列をコードする全核酸配列の暗黙の特徴である。同様に、「保存アミノ酸置換」はアミノ酸配列中の1個又は少数のアミノ酸を高度に類似する性質をもつ別のアミノ酸で置換するものであり、このような置換も開示構築物と高度に類似することが容易に認められる。各開示配列のこのような保存変異体は本発明の特徴である。
特定核酸配列の「保存変異体」とは同一又は本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸を意味し、核酸がアミノ酸配列をコードしない場合には本質的に同一の配列を意味する。当業者に自明の通り、コードされる配列中の単一アミノ酸又は低百分率(一般に5%未満、より一般には4%、2%又は1%未満)のアミノ酸を置換、付加又は欠失させる個々の置換、欠失又は付加の結果としてアミノ酸を欠失するか、アミノ酸が付加されるか、又はアミノ酸が化学的に類似するアミノ酸で置換される場合には、これらの変異は「保存修飾変異」である。従って、本発明の指定ポリペプチド配列の「保存変異体」としては、ポリペプチド配列のアミノ酸の低百分率、一般に5%未満、より一般には2%又は1%未満が同一保存置換基のアミノ酸で置換される場合が挙げられる。最後に、非機能的配列の付加のように核酸分子のコードされる活性を変えない配列の付加も基本核酸の保存変異である。
機能的に類似するアミノ酸を示す保存置換表は当分野で周知であり、このようなアミノ酸では、あるアミノ酸残基が類似の化学的性質(例えば芳香族側鎖又は正荷電側鎖)をもつ別のアミノ酸残基に置換しているため、ポリペプチド分子の機能的性質は実質的に変化しない。化学的性質が類似する天然アミノ酸を含む代表的グループを以下に示すが、これらのグループ内の置換は「保存置換」である。
核酸ハイブリダイゼーション
本発明の核酸の保存変異体を含めて本発明の核酸を同定するためには比較ハイブリダイゼーションを使用することができ、この比較ハイブリダイゼーション法は本発明の核酸を識別する1好適方法である。更に、高、超高及び超々高ストリンジェンシー条件下で配列番号11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、51、56及び58により表される核酸とハイブリダイズするターゲット核酸も本発明の特徴である。このような核酸の例としては所与核酸配列と比較して1又は少数のサイレント又は保存核酸置換をもつものが挙げられる。
試験核酸が完全にマッチする相補的ターゲットに比較して少なくとも50%の割合でプローブとハイブリダイズする場合、即ちマッチしないターゲット核酸の任意のものとのハイブリダイゼーションに観測されるシグナル対ノイズ比の少なくとも約5倍〜10倍で完全にマッチするプローブが完全にマッチする相補的ターゲットと結合する条件下におけるプローブとターゲットのハイブリダイゼーションに比較してシグナル対ノイズ比が少なくとも1/2である場合に試験核酸はプローブ核酸と特異的にハイブリダイズすると言う。
核酸は一般に溶液中で会合するときに「ハイブリダイズ」する。核酸は水素結合、溶媒排除、塩基スタッキング等の種々の十分に特性決定された物理化学的力によりハイブリダイズする。核酸ハイブリダイゼーションの詳しい手引きはTijssen(1993)Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology−−Hybridization with Nucleic Acid Probes part I chapter 2,“Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays,”(Elsevier,New York)、及びCurrent Protocols in Molecular Biology,Ausubelら編,Current Protocols,a joint venture between Greene Publishing Associates,Inc.and John Wiley & Sons,Inc.(2004年補遺)(「Ausubel」)に記載されており、Hames and Higgins(1995)Gene Probes 1 IRL Press at Oxford University Press,Oxford,England,(Hames and Higgins 1)と、Hames and Higgins(1995)Gene Probes 2 IRL Press at Oxford University Press,Oxford,England(Hames and Higgins 2)はオリゴヌクレオチドを含むDNAとRNAの合成、標識、検出及び定量について詳細に記載している。
サザン又はノーザンブロットで100個を上回る相補的残基をもつ相補的核酸のハイブリダイゼーションをフィルター上で行うためのストリンジェントハイブリダイゼーション条件の1例は、50%ホルマリンにヘパリン1mgを加え、42℃で一晩ハイブリダイゼーションを実施する。ストリンジェント洗浄条件の1例は65℃、0.2×SSCで15分間洗浄する(SSC緩衝液の説明についてはSambrook,前出参照)。多くの場合には高ストリンジェンシー洗浄の前に低ストリンジェンシー洗浄を実施してバックグラウンドプローブシグナルを除去する。低ストリンジェンシー洗浄の1例は40℃、2×SSCで15分間である。一般に、シグナル対ノイズ比が特定ハイブリダイゼーションアッセイで無関係プローブに観測される比の5倍(以上)である場合に特異的ハイブリダイゼーションが検出されたとみなす。
サザン及びノーザンハイブリダイゼーション等の核酸ハイブリダイゼーション実験において「ストリンジェントハイブリダイゼーション洗浄条件」は配列依存性であり、各種環境パラメーターにより異なる。核酸ハイブリダイゼーションの詳しい手引きはTijssen(1993),前出やHames and Higgins 1及び2に記載されている。ストリンジェントハイブリダイゼーション及び洗浄条件は任意試験核酸について経験により容易に決定することができる。例えば、高ストリンジェントハイブリダイゼーション及び洗浄条件を決定するには、一連の選択基準に合致するまで(例えばハイブリダイゼーション又は洗浄における温度上昇、塩濃度低下、界面活性剤濃度増加及び/又はホルマリン等の有機溶媒濃度増加により)ハイブリダイゼーション及び洗浄条件を徐々に増加する。例えば、高ストリンジェントハイブリダイゼーション及び洗浄条件では、マッチしないターゲットとプローブのハイブリダイゼーションに観測されるシグナル対ノイズ比の少なくとも約5倍でプローブが完全にマッチする相補的ターゲットと結合するまでハイブリダイゼーション及び洗浄条件を徐々に増加する。
「超ストリンジェント」条件は特定プローブの熱融点(Tm)に等しくなるように選択される。Tmは(規定イオン強度及びpH下で)試験配列の50%が完全にマッチするプローブとハイブリダイズする温度である。本発明の目的には、一般に規定イオン強度及びpHで特定配列のTmよりも約5℃低くなるように「高ストリンジェント」ハイブリダイゼーション及び洗浄条件を選択する。
「超高ストリンジェンシー」ハイブリダイゼーション及び洗浄条件は完全にマッチする相補的ターゲット核酸とプローブの結合に観測されるシグナル対ノイズ比がマッチしないターゲット核酸の任意のものとのハイブリダイゼーションに観測されるシグナル対ノイズ比の少なくとも10倍になるまでハイブリダイゼーション及び洗浄条件のストリンジェンシーを増加する条件である。完全にマッチする相補的ターゲット核酸のシグナル対ノイズ比の少なくとも1/2で前記条件下にプローブとハイブリダイズする場合にターゲット核酸は超高ストリンジェンシー条件下でプローブと結合すると言う。
同様に、該当ハイブリダイゼーションアッセイのハイブリダイゼーション及び/又は洗浄条件を徐々に増加することにより更に高レベルのストリンジェンシーを決定することもできる。例えば、完全にマッチする相補的ターゲット核酸とプローブの結合に観測されるシグナル対ノイズ比がマッチしないターゲット核酸の任意のものとのハイブリダイゼーションに観測されるシグナル対ノイズ比の少なくとも10倍、20倍、50倍、100倍又は500倍以上になるまでハイブリダイゼーション及び洗浄条件のストリンジェンシーを増加する条件である。完全にマッチする相補的ターゲット核酸のシグナル対ノイズ比の少なくとも1/2で前記条件下にプローブとハイブリダイズする場合にターゲット核酸は超々高ストリンジェンシー条件下でプローブと結合すると言う。
ストリンジェント条件下で相互にハイブリダイズしない核酸でも、これらの核酸によりコードされるポリペプチドが実質的に同一である場合には実質的に同一である。これは、例えば遺伝コードに許容される最大コドン縮重を使用して核酸のコピーを作製する場合に該当する。
ユニークサブ配列
所定側面では、本発明は本明細書に開示するO−tRNA及びO−RSの配列から選択される核酸中にユニークサブ配列を含む核酸を提供する。ユニークサブ配列は任意公知O−tRNA及びO−RS核酸配列に対応する核酸に比較してユニークである。例えばデフォルトパラメーターに設定したBLASTを使用してアラインメントを実施することができる。任意ユニークサブ配列は例えば本発明の核酸を同定するためのプローブとして有用である。
同様に、本発明は本明細書に開示するO−RSの配列から選択されるポリペプチド中にユニークサブ配列を含むポリペプチドを含む。この場合には、ユニークサブ配列は任意公知ポリペプチド配列に対応するポリペプチドに比較してユニークである。
本発明はO−RSの配列から選択されるポリペプチド中のユニークサブ配列をコードするユニークコーディングオリゴヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズするターゲット核酸も提供し、この場合には、ユニークサブ配列は対照ポリペプチド(例えば本発明のシンテターゼを例えば突然変異により誘導した元の親配列)の任意のものに対応するポリペプチドに比較してユニークである。ユニーク配列は上記のように決定する。
配列比較、一致度及び相同度
2種以上の核酸又はポリペプチド配列に関して「一致」又は「一致度百分率」なる用語は2種以上の配列又はサブ配列を最大限に対応するように対比及び整列させ、以下に記載する配列比較アルゴリズム(又は当業者に入手可能な他のアルゴリズム)の1種を使用するか又は目視により測定した場合に相互に同一であるか又は同一のアミノ酸残基もしくはヌクレオチドの百分率が特定値であることを意味する。
2種以上の核酸又はポリペプチド(例えばO−tRNAもしくはO−RSをコードするDNA又はO−RSのアミノ酸配列)に関して「実質的に一致」なる用語は2種以上の配列又はサブ配列を最大限に対応するように対比及び整列させ、配列比較アルゴリズムを使用するか又は目視により測定した場合にヌクレオチド又はアミノ酸残基一致度が少なくとも約60%、約80%、約90〜95%、約98%、約99%又はそれ以上であることを意味する。このような「実質的に一致」する配列は一般に実際の起源が記載されていなくても「相同」であるとみなす。少なくとも約50残基長の配列の領域、より好ましくは少なくとも約100残基長の領域にわたって「実質的一致」が存在していることが好ましく、少なくとも約150残基又は比較する2配列の全長にわたって配列が実質的に一致していることが最も好ましい。
蛋白質及び/又は蛋白質配列は共通の祖先蛋白質又は蛋白質配列から天然又は人工的に誘導される場合に「相同」である。同様に、核酸及び/又は核酸配列は共通の祖先核酸又は核酸配列から天然又は人工的に誘導される場合に相同である。例えば、1個以上のセレクターコドンを含むように任意天然核酸を利用可能な任意突然変異誘発法により改変することができる。この突然変異誘発した核酸は発現されると、1種以上の非天然アミノ酸を含むポリペプチドをコードする。突然変異法は当然のことながら更に1個以上の標準コドンを変異させ、得られる突然変異体蛋白質の1個以上の標準アミノ酸も変異させることができる。相同性は一般に2種以上の核酸又は蛋白質(又はその配列)間の配列類似度から推定される。相同性の判定に有用な配列間類似度の厳密な百分率は該当核酸及び蛋白質により異なるが、通常は25%程度の低い配列類似度を使用して相同性を判定する。例えば30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%又は99%以上のより高レベルの配列類似度を使用して相同性を判定することもできる。配列類似度百分率の決定方法(例えばデフォルトパラメーターを使用するBLASTP及びBLASTN)は本明細書に記載し、一般に入手可能である。
配列比較及び相同性判定には、一般にある配列を参照配列としてこれに試験配列を比較する。配列比較アルゴリズムを使用する場合には、試験配列と参照配列をコンピューターに入力し、必要に応じてサブ配列座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムパラメーターを指定する。こうすると、配列比較アルゴリズムは指定プログラムパラメーターに基づいて参照配列に対して試験配列の配列一致度百分率を計算する。
比較のための最適な配列アラインメントは例えばSmith & Waterman,Adv.Appl.Math.2:482(1981)の局所相同性アルゴリズム、Needleman & Wunsch,J.Mol.Biol.48:443(1970)の相同性アラインメントアルゴリズム、Pearson & Lipman,Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 85:2444(1988)の類似性探索法、これらのアルゴリズムのコンピューターソフトウェア(Wisconsin Genetics Software Package,Genetics Computer Group,575 Science Dr.,Madison,WIのGAP、BESTFIT、FASTA及びTFASTA)、又は目視(一般にCurrent Protocols in Molecular Biology,Ausubelら編,Current Protocols,a joint venture between Greene Publishing Associates,Inc.and John Wiley & Sons,Inc.(2004年補遺)参照)により実施することができる。
配列一致度及び配列類似度百分率を決定するのに適したアルゴリズムの1例はAltschulら,J.Mol.Biol.215:403−410(1990)に記載されているBLASTアルゴリズムである。BLAST分析を実施するためのソフトウェアはNational Center for Biotechnology Information(www.ncbi.nlm.nih.gov/)から公共入手可能である。このアルゴリズムはデータベース配列中の同一長さの単語と整列した場合に所定の正の閾値スコアTと一致するか又はこれを満足するクエリー配列中の長さWの短い単語を識別することによりまず高スコア配列対(HSP)を識別する。Tを隣接単語スコア閾値と言う(Altschulら,前出)。これらの初期隣接単語ヒットをシードとして検索を開始し、これらの単語を含むもっと長いHSPを探索する。次に、累積アラインメントスコアを増加できる限り、単語ヒットを各配列に沿って両方向に延長する。ヌクレオチド配列の場合にはパラメーターM(1対のマッチ残基のリウォードスコア、常に>0)及びN(ミスマッチ残基のペナルティースコア、常に<0)を使用して累積スコアを計算する。アミノ酸配列の場合には、スコアリングマトリクスを使用して累積スコアを計算する。累積アラインメントスコアがその最大到達値から量Xだけ低下するか、累積スコアが1カ所以上の負スコア残基アラインメントの累積によりゼロ以下になるか、又はどちらかの配列の末端に達したら各方向の単語ヒットの延長を停止する。BLASTアルゴリズムパラメーターW、T及びXはアラインメントの感度と速度を決定する。BLASTNプログラム(ヌクレオチド配列用)は語長(W)11、期待値(E)10、カットオフ100、M=5、N=4、及び両鎖の比較をデフォルトとして使用する。アミノ酸配列用として、BLASTPプログラムは語長(W)3、期待値(E)10、及びBLOSUM62スコアリングマトリクスをデフォルトとして使用する(Henikoff & Henikoff(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10915参照)。
配列一致度百分率の計算に加え、BLASTアルゴリズムは2配列間の類似性の統計分析も実施する(例えばKarlin & Altschul,Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 90:5873−5787(1993)参照)。BLASTアルゴリズムにより提供される類似性の1尺度は2種のヌクレオチド又はアミノ酸配列間に偶然にマッチが起こる確率を示す最小合計確率(P(N))である。例えば、試験核酸を参照核酸に比較した場合の最小合計確率が約0.1未満、より好ましくは約0.01未満、最も好ましくは約0.001未満である場合に核酸は参照核酸に類似しているとみなす。
突然変異誘発及び他の分子生物学技術
本発明のポリヌクレオチドとポリペプチド及び本発明で使用されるポリヌクレオチドとポリペプチドは分子生物学技術を使用して操作することができる。分子生物学技術について記載している一般教科書としてはBerger and Kimmel,Guide to Molecular Cloning Techniques,Methods in Enzymology volume 152 Academic Press,Inc.,San Diego,CA(Berger);Sambrookら,Molecular Cloning−A Laboratory Manual(第3版),Vol.1−3,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,New York,2001(「Sambrook」)及びCurrent Protocols in Molecular Biology,F.M.Ausubelら編,Current Protocols,a joint venture between Greene Publishing Associates,Inc.and John Wiley & Sons,Inc.(2004年補遺)(「Ausubel」)が挙げられる。これらの教科書は突然変異誘発法、ベクターの使用、プロモーター、更に例えば非天然アミノ酸、直交tRNA、直交シンテターゼ及びその対を含む蛋白質を生産するためのセレクターコドンを含む遺伝子の作製に関連する他の多くの関連事項について記載している。
例えばtRNA分子を突然変異させるため、tRNAのライブラリーを作製するため、シンテターゼのライブラリーを作製するため、非天然アミノ酸をコードするセレクターコドンを該当蛋白質又はポリペプチドに挿入するために、本発明では各種突然変異誘発法を使用する。これらの方法としては限定されないが、部位特異的、ランダム点突然変異誘発、相同組換え、DNAシャフリング又は他の帰納的突然変異誘発法、キメラ構築、ウラシル含有鋳型を使用する突然変異誘発、オリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発、ホスホロチオエート修飾DNA突然変異誘発、ギャップデュプレクスDNAを使用する突然変異誘発等、又はその任意組み合わせが挙げられる。他の適切な方法としては点ミスマッチ修復、修復欠損宿主株を使用する突然変異誘発、制限−選択及び制限−精製、欠失突然変異誘発、完全遺伝子合成による突然変異誘発、2本鎖切断修復等が挙げられる。例えばキメラ構築物を使用する突然変異誘発も本発明に含まれる。1態様では、天然分子又は改変もしくは突然変異させた天然分子の既知情報(例えば配列、配列比較、物性、結晶構造等)に基づいて突然変異誘発を誘導することができる。
本発明のポリヌクレオチド又は本発明のポリヌクレオチドを組込んだ構築物(例えばクローニングベクター又は発現ベクター等の本発明のベクター)で宿主細胞を遺伝子組換え(例えば形質転換、形質導入又はトランスフェクション)する。例えば、直交tRNA、直交tRNAシンテターゼ、及び修飾すべき蛋白質のコーディング領域を所望宿主細胞で機能的な遺伝子発現制御エレメントに機能的に連結する。典型的なベクターは転写及び翻訳ターミネーターと、転写及び翻訳開始配列と、特定ターゲット核酸の発現の調節に有用なプロモーターを含む。ベクターは場合により少なくとも1個の独立ターミネーター配列と、真核生物又は原核生物又は両者(例えばシャトルベクター)でカセットの複製を可能にする配列と、原核系と真核系の両者の選択マーカーを含む包括的発現カセットを含む。ベクターは原核生物、真核生物、又は好ましくは両者での複製及び/又は組込みに適している。Giliman & Smith,Gene 8:81(1979);Robertsら,Nature,328:731(1987);Schneider,B.ら,Protein Expr.Purif.6435:10(1995);Ausubel,Sambrook,Berger(いずれも前出)参照。ベクターは例えばプラスミド、細菌、ウイルス、裸のポリヌクレオチド又はポリヌクレオチドコンジュゲートの形態とすることができる。ベクターはエレクトロポレーション(Fromら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82,5824(1985))、ウイルスベクターによる感染、核酸を小ビーズもしくは粒子のマトリックスに埋込むか又は表面に付着させて小粒子形態で高速射入する方法(Kleinら,Nature 327,70−73(1987))、及び/又は同等方法等の標準方法により細胞及び/又は微生物に導入する。
大腸菌でアンバー終止コドン(UAG)に応答して非天然アミノ酸を蛋白質に部位特異的に組込むための非常に効率的で多目的な単一プラスミドシステムが開発された。新規システムでは、M.jannaschiiサプレッサーtRNAtyr(CUA)とチロシルtRNAシンテターゼの対は大半の大腸菌発現ベクターと適合可能な単一プラスミドでコードされる。最適二次構造とtRNAプロセシングのためにproKプロモーター及びターミネーターの制御下のモノシストロンtRNAオペロンが構築された。シンテターゼのglnSプロモーターの突然変異形を導入すると、抑圧効率と忠実度の両者が有意に増加した。抑圧効率の増加はtRNA遺伝子の多重コピーとシンテターゼの特異的突然変異(D286R)によっても得られた(Kobayashiら,“Structural basis for orthogonal tRNA specificities of tyrosyl−tRNA synthetases for genetic code expansion,”Nat.Struct.Biol.,10(6):425−432[2003])。最適化システムの汎用性は蛋白質機能及び構造の研究におけるそのユニークな有用性が従来認められている数種の異なる非天然アミノ酸が非常に効率的且つ正確に組込まれることによっても実証された。
クローニングに有用な細菌とバクテリオファージのカタログは例えばATCCから入手でき、例えばATCCから刊行されたThe ATCC Catalogue of Bacteria and Bacteriophage(1996)Ghernaら(編)が挙げられる。シーケンシング、クローニング及び分子生物学の他の側面のその他の基本手順と基礎理論事項もSambrook(前出)、Ausubel(前出)、及びWatsonら(1992)Recombinant DNA Second Edition,Scientific American Books,NYに記載されている。更に、Midland Certified Reagent Company(Midland,TX mcrc.com)、The Great American Gene Company(Ramona,CA,ワールドワイドウェブgenco.comで販売)、ExpressGen Inc.(Chicago,IL,ワールドワイドウェブexpressgen.comで販売)、Operon Technologies Inc.(Alameda,CA)及び他の多数の企業等の各種販売会社からほぼ任意核酸(及び標準又は標準外を問わずほぼ任意標識核酸)をオーダーメード又は標準注文することができる。
遺伝子組換えした宿主細胞は例えばスクリーニング段階、プロモーター活性化又は形質転換細胞選択等の操作に合うように適宜改変した慣用栄養培地で培養することができる。これらの細胞は場合によりトランスジェニック生物で培養することができる。例えば細胞単離及び培養(例えば後期核酸単離)に有用な他の文献としては、Freshney(1994)Culture of Animal Cells,a Manual of Basic Technique,第3版,Wiley−Liss,New Yorkとその引用文献;Payneら(1992)Plant Cell and Tissue Culture in Liquid Systems John Wiley & Sons,Inc.New York,NY;Gamborg and Phillips(編)(1995)Plant Cell,Tissue and Organ Culture;Fundamental Methods Springer Lab Manual,Springer−Verlag(Berlin Heidelberg New York)及びAtlas and Parks(編)The Handbook of Microbiological Media(1993)CRC Press,Boca Raton,FLが挙げられる。
該当蛋白質及びポリペプチド
特定位置に非天然アミノ酸を組込んだ蛋白質を細胞で生産する方法も本発明の特徴である。例えば、1方法は、少なくとも1個のセレクターコドンを含み、蛋白質をコードする核酸を含む細胞を適当な培地で増殖させる段階と、非天然アミノ酸を提供する段階を含み、細胞は更に、細胞で機能し、セレクターコドンを認識する直交tRNA(O−tRNA)と;O−tRNAを非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する直交アミノアシルtRNAシンテターゼ(O−RS)を含む。この方法により生産された蛋白質も本発明の特徴である。
所定態様では、O−RSは発現系において内在tRNAよりもコグネイトO−tRNAのアミノアシル化を優先する。O−tRNAとO−RSが等モル濃度で存在する場合にO−RSにより負荷されるO−tRNAと内在tRNAの相対比は1:1を上回り、好ましくは少なくとも約2:1、より好ましくは5:1、更に好ましくは10:1、更に好ましくは20:1、更に好ましくは50:1、更に好ましくは75:1、更に好ましくは95:1、98:1、99:1、100:1、500:1、1,000:1、5,000:1又はそれ以上である。
本発明は非天然アミノ酸を組込んだ蛋白質を含有する組成物も提供する。所定態様では、蛋白質は治療用蛋白質、診断用蛋白質、産業用酵素、又はその部分のアミノ酸配列と少なくとも75%一致するアミノ酸配列を含む。
本発明の組成物と本発明の方法により作製された組成物は場合により細胞に導入する。その後、本発明のO−tRNA/O−RS対又は個々の成分を宿主系の翻訳機構で使用することができ、その結果として、非天然アミノ酸が蛋白質に組込まれる。国際公開WO2004/094593、出願日2004年4月16日、発明の名称「真核遺伝コードの拡張(EXPANDING THE EUKARYOTIC GENETIC CODE)」、及びWO2002/085923、発明の名称「非天然アミノ酸のインビボ組込み(IN VIVO INCORPORATION OF UNNATURAL AMINO ACIDS)」はこのプロセスを記載しており、参考資料として本明細書に組込む。例えば、O−tRNA/O−RS対を宿主(例えば大腸菌細胞又は酵母細胞)に導入すると、前記対はセレクターコドンに応答してp−エチルチオカルボニル−L−フェニルアラニン、p−(3−オキソブタノイル)−L−フェニルアラニン、1,5−ダンシル−アラニン、7−アミノ−クマリン−アラニン、7−ヒドロキシ−クマリン−アラニン、o−ニトロベンジル−セリン、O−(2−ニトロベンジル)−L−チロシン、p−カルボキシメチル−L−フェニルアラニン、p−シアノ−L−フェニルアラニン、m−シアノ−L−フェニルアラニン、ビフェニルアラニン、3−アミノ−L−チロシン、ビピリジルアラニン、p−(2−アミノ−1−ヒドロキシエチル)−L−フェニルアラニン、p−イソプロピルチオカルボニル−L−フェニルアラニン、3−ニトロ−L−チロシン又はp−ニトロ−L−フェニルアラニン等の非天然アミノ酸のin vivo蛋白質組込みを誘導する。系に付加される非天然アミノ酸は合成アミノ酸(例えばフェニルアラニン又はチロシン誘導体)とすることができ、外部から増殖培地に添加することができる。場合により、本発明の組成物はin vitro翻訳系に導入してもよいし、in vivo系に導入してもよい。
本発明の細胞は非天然アミノ酸を組込んだ蛋白質を大量の有用な量で合成することができる。所定側面では、組成物は場合により、非天然アミノ酸を組込んだ蛋白質を例えば少なくとも10μg、少なくとも50μg、少なくとも75μg、少なくとも100μg、少なくとも200μg、少なくとも250μg、少なくとも500μg、少なくとも1mg、少なくとも10mg、又はそれ以上、あるいはin vivo蛋白質生産方法で達成可能な量で含有する(組換え蛋白質生産及び精製に関する詳細は本明細書に記載する)。別の側面では、蛋白質は場合により例えば細胞溶解液、緩衝液、医薬緩衝液、又は他の懸濁液中(例えば約1nl〜約100Lの任意の容量中)に例えば少なくとも10μg蛋白質/l、少なくとも50μg蛋白質/l、少なくとも75μg蛋白質/l、少なくとも100μg蛋白質/l、少なくとも200μg蛋白質/l、少なくとも250μg蛋白質/l、少なくとも500μg蛋白質/l、少なくとも1mg蛋白質/l、又は少なくとも10mg蛋白質/l以上の濃度で組成物中に存在する。少なくとも1種の非天然アミノ酸を組込んだ蛋白質を細胞で大量(例えば他の方法、例えばin vitro翻訳で一般に可能な量よりも多量)に生産することも本発明の特徴である。
非天然アミノ酸の組込みは例えば寸法、酸性度、求核性、水素結合、疎水性、プロテアーゼ標的部位接近性、(例えば蛋白質アレーのための)部分へのターゲット、ラベル又は反応基の組込み等を変化させるように例えば蛋白質構造及び/又は機能の変化を調整するために実施することができる。非天然アミノ酸を組込んだ蛋白質は触媒性又は物性を強化するか又は全く新規にすることができる。例えば、非天然アミノ酸を蛋白質に組込むことにより、場合により毒性、生体分布、構造的性質、分光学的性質、化学及び/又は光化学的性質、触媒能、半減期(例えば血清半減期)、他の分子との(例えば共有又は非共有)反応性等の性質を改変する。少なくとも1種の非天然アミノ酸を組込んだ蛋白質を含有する組成物は例えば新規治療薬、診断薬、触媒酵素、産業用酵素、結合蛋白質(例えば抗体)、及び例えば蛋白質構造と機能の研究に有用である。例えばDougherty,(2000)Unnatural Amino Acids as Probes of Protein Structure and Function,Current Opinion in Chemical Biology,4:645−652参照。
本発明の所定側面では、組成物は少なくとも1個、例えば少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個、少なくとも6個、少なくとも7個、少なくとも8個、少なくとも9個、又は少なくとも10個以上の非天然アミノ酸を組込んだ少なくとも1種の蛋白質を含有する。非天然アミノ酸は同一でも異なっていてもよく、例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10種以上の異なる非天然アミノ酸を含む1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10個以上の異なる部位が蛋白質に存在することができる。別の側面では、組成物は蛋白質に存在する特定アミノ酸の全部よりは少ないが少なくとも1個が非天然アミノ酸で置換された蛋白質を含有する。2個以上の非天然アミノ酸を組込んだ所与蛋白質では、非天然アミノ酸は同一でも異なっていてもよい(例えば蛋白質は2個以上の異なる型の非天然アミノ酸を組込んでもよいし、2個の同一非天然アミノ酸を組込んでもよい)。3個以上の非天然アミノ酸を組込んだ所与蛋白質では、非天然アミノ酸は同一でも異なっていてもよいし、同一種の複数の非天然アミノ酸と少なくとも1個の別の非天然アミノ酸の組み合わせでもよい。
本明細書に記載する組成物と方法を使用して非天然アミノ酸を含むほぼ任意蛋白質(又はその部分)(及び例えば1個以上のセレクターコドンを含む対応する任意コーディング核酸)を生産することができる。数十万種の公知蛋白質を列挙するには及ばないが、例えば該当翻訳系に1個以上の適当なセレクターコドンを含むように入手可能な任意突然変異法を調整することにより、1種以上の非天然アミノ酸を組込むように公知蛋白質の任意のものを改変することができる。公知蛋白質の一般的な配列寄託機関としてはGenBank、EMBL、DDBJ及びNCBIが挙げられる。他の寄託機関もインターネットを検索することにより容易に確認できる。
一般に、蛋白質は入手可能な任意蛋白質(例えば治療用蛋白質、診断用蛋白質、産業用酵素、又はその部分等)と例えば少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は少なくとも99%以上一致しており、1種以上の非天然アミノ酸を含む。1種以上の非天然アミノ酸を組込むように改変することができる治療用、診断用、及び他の蛋白質の例としては限定されないが、国際公開WO2004/094593、出願日2004年4月16日、発明の名称「真核遺伝コードの拡張(Expanding the Eukaryotic Genetic Code)」;及びWO2002/085923、発明の名称「非天然アミノ酸のインビボ組込み(IN VIVO INCORPORATION OF UNNATURAL AMINO ACIDS)」に記載されているものが挙げられる。1種以上の非天然アミノ酸を組込むように改変することができる治療用、診断用、及び他の蛋白質の例としては限定されないが、例えばα1アンチトリプシン、アンジオスタチン、抗血友病因子、抗体(抗体の詳細については後述する)、アポリポ蛋白質、アポ蛋白質、心房性ナトリウム利尿因子、心房性ナトリウム利尿ポリペプチド、心房性ペプチド、C−X−Cケモカイン(例えばT39765、NAP−2、ENA−78、Gro−a、Gro−b、Gro−c、IP−10、GCP−2、NAP−4、SDF−1、PF−4、MIG)、カルシトニン、CCケモカイン(例えば単球化学誘引蛋白質−1、単球化学誘引蛋白質−2、単球化学誘引蛋白質−3、単球炎症性蛋白質−1α、単球炎症性蛋白質−1β、RANTES、I309、R83915、R91733、HCC1、T58847、D31065、T64262)、CD40リガンド、Cキットリガンド、コラーゲン、コロニー刺激因子(CSF)、補体因子5a、補体阻害剤、補体受容体1、サイトカイン(例えば上皮好中球活性化ペプチド−78、GROα/MGSA、GROβ、GROγ、MIP−1α、MIP−1δ、MCP−1)、表皮増殖因子(EGF)、エリスロポエチン(「EPO」)、表皮剥離毒素A及びB、IX因子、VII因子、VIII因子、X因子、繊維芽細胞増殖因子(FGF)、フィブリノーゲン、フィブロネクチン、G−CSF、GM−CSF、グルコセレブロシダーゼ、ゴナドトロピン、増殖因子、ヘッジホッグ蛋白質(例えばソニック、インディアン、デザート)、ヘモグロビン、肝細胞増殖因子(HGF)、ヒルジン、ヒト血清アルブミン、インスリン、インスリン様増殖因子(IGF)、インターフェロン(例えばIFN−α、IFN−β、IFN−γ)、インターロイキン(例えばIL−1、IL−2、IL−3、IL−4、IL−5、IL−6、IL−7、IL−8、IL−9、IL−10、IL−11、IL−12等)、ケラチノサイト増殖因子(KGF)、ラクトフェリン、白血病阻害因子、ルシフェラーゼ、ニュールチュリン、好中球阻害因子(NIF)、オンコスタチンM、骨形成蛋白質、副甲状腺ホルモン、PD−ECSF、PDGF、ペプチドホルモン(例えばヒト成長ホルモン)、プレイオトロピン、プロテインA、プロテインG、発熱外毒素A、B及びC、リラキシン、レニン、SCF、可溶性補体受容体I、可溶性I−CAM1、可溶性インターロイキン受容体(IL−1、2、3、4、5、6、7、9、10、11、12、13、14、15)、可溶性TNF受容体、ソマトメジン、ソマトスタチン、ソマトトロピン、ストレプトキナーゼ、スーパー抗原即ちブドウ球菌エンテロトキシン(SEA、SEB、SEC1、SEC2、SEC3、SED、SEE)、スーパーオキシドジスムターゼ(SOD)、毒素性ショック症候群毒素(TSST−1)、チモシンα1、組織プラスミノーゲンアクチベーター、腫瘍壊死因子β(TNFβ)、腫瘍壊死因子受容体(TNFR)、腫瘍壊死因子α(TNFα)、血管内皮増殖因子(VEGEF)、ウロキナーゼ並びに他の多数の蛋白質が挙げられる。
本明細書に記載する非天然アミノ酸のin vivo組込み用組成物及び方法を使用して生産することができる蛋白質の1類としては転写モジュレーター又はその部分が挙げられる。転写モジュレーターの例としては細胞増殖、分化、制御等を調節する遺伝子及び転写モジュレーター蛋白質が挙げられる。転写モジュレーターは原核生物、ウイルス及び真核生物(例えば真菌、植物、酵母、昆虫、及び哺乳動物を含む動物)に存在し、広範な治療ターゲットを提供する。当然のことながら、発現及び転写アクチベーターは例えば受容体との結合、シグナル伝達カスケードの刺激、転写因子の発現調節、プロモーターやエンハンサーとの結合、プロモーターやエンハンサーと結合する蛋白質との結合、DNA巻き戻し、プレmRNAスプライシング、RNAポリアデニル化及びRNA分解等の多数のメカニズムにより転写を調節する。
本発明の蛋白質(例えば1種以上の非天然アミノ酸を組込んだ蛋白質)の1類としてはサイトカイン、炎症性分子、増殖因子、その受容体、及び腫瘍遺伝子産物等の生体活性蛋白質が挙げられ、例えばインターロイキン(例えばIL−1、IL−2、IL−8等)、インターフェロン、FGF、IGF−I、IGF−II、FGF、PDGF、TNF、TGF−α、TGF−β、EGF、KGF、SCF/c−キット、CD40L/CD40、VLA−4/VCAM−1、ICAM−1/LFA−1及びヒアルリン/CD44;シグナル伝達分子及び対応する腫瘍遺伝子産物(例えばMos、Ras、Raf及びMet);並びに転写アクチベーター及びサプレッサー(例えばp53、Tat、Fos、Myc、Jun、Myb、Rel、及びステロイドホルモン受容体(例えばエストロゲン、プロゲステロン、テストステロン、アルドステロン、LDL受容体リガンド及びコルチコステロン))が挙げられる。
少なくとも1種の非天然アミノ酸を組込んだ酵素(例えば産業用酵素)又はその部分も本発明により提供される。酵素の例としては限定されないが、例えばアミダーゼ、アミノ酸ラセマーゼ、アシラーゼ、デハロゲナーゼ、ジオキシゲナーゼ、ジアリールプロパンペルオキシダーゼ、エピメラーゼ、エポキシドヒドロラーゼ、エステラーゼ、イソメラーゼ、キナーゼ、グルコースイソメラーゼ、グリコシダーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、ハロペルオキシダーゼ、モノオキシゲナーゼ(例えばp450類)、リパーゼ、リグニンペルオキシダーゼ、ニトリルヒドラターゼ、ニトリラーゼ、プロテアーゼ、ホスファターゼ、スブチリシン、トランスアミナーゼ及びヌクレアーゼが挙げられる。
これらの蛋白質の多くは市販されており(例えばSigma BioSciences 2002カタログ及び価格表参照)、対応する蛋白質配列と遺伝子及び、一般に多くのその変異体も周知である(例えばGenbank参照)。例えば1種以上の該当治療、診断又は酵素特性に関して蛋白質を改変するように本発明に従って1種以上の非天然アミノ酸を挿入することにより前記蛋白質の任意のものを改変することができる。治療関連特性の例としては血清半減期、貯蔵半減期、安定性、免疫原性、治療活性、(例えば非天然アミノ酸へのレポーター基(例えばラベル又はラベル結合部位)の付加による)検出性、LD50又は他の副作用の低減、胃管を経由して体内に導入できること(例えば経口利用性)等が挙げられる。診断特性の例としては貯蔵半減期、安定性、診断活性、検出性等が挙げられる。該当酵素特性の例としては貯蔵半減期、安定性、酵素活性、産生能等が挙げられる。
他の各種蛋白質も本発明の組成物と方法を使用して1種以上の非天然アミノ酸を組込むように改変することができる。例えば、本発明は例えば感染性真菌(例えばAspergillus、Candida種);細菌、特に病原細菌モデルとして利用できる大腸菌や医学的に重要な細菌(例えばStaphylococci(例えばaureus)又はStreptococci(例えばpneumoniae));原生動物(例えば胞子虫類(例えばPlasmodia)、根足虫類(例えばEntamoeba)及び鞭毛虫類(Trypanosoma、Leishmania、Trichomonas、Giardia等));ウイルス(例えば(+)RNAウイルス(例えばポックスウイルス(例えばワクシニア)、ピコルナウイルス(例えばポリオ)、トガウイルス(例えば風疹)、フラビウイルス(例えばHCV)、及びコロナウイルス)、(−)RNAウイルス(例えばラブドウイルス(例えばVSV)、パラミクソウイルス(例えばRSV)、オルトミクソウイルス(例えばインフルエンザ)、ブンヤウイルス及びアレナウイルス)、dsDNAウイルス(例えばレオウイルス)、RNA→DNAウイルス(即ちレトロウイルス、例えばHIV及びHTLV)、及び所定のDNA→RNAウイルス(例えばB型肝炎))に由来する蛋白質において、1種以上のワクチン蛋白質中の1種以上の天然アミノ酸を非天然アミノ酸で置換することができる。
昆虫耐性蛋白質(例えばCry蛋白質)、澱粉及び脂質産生酵素、植物及び昆虫毒素、毒素耐性蛋白質、マイコトキシン解毒蛋白質、植物成長酵素(例えばリブロース1,5−ビスリン酸カルボキシラーゼ/オキシゲナーゼ、「RUBISCO」)、リポキシゲナーゼ(LOX)及びホスホエノールピルビン酸(PEP)カルボキシラーゼ等の農業関連蛋白質も非天然アミノ酸修飾の適切なターゲットである。
所定態様では、本発明の方法及び/又は組成物における該当蛋白質又はポリペプチド(又はその部分)は核酸によりコードされる。一般に、核酸は少なくとも1個のセレクターコドン、少なくとも2個のセレクターコドン、少なくとも3個のセレクターコドン、少なくとも4個のセレクターコドン、少なくとも5個のセレクターコドン、少なくとも6個のセレクターコドン、少なくとも7個のセレクターコドン、少なくとも8個のセレクターコドン、少なくとも9個のセレクターコドン、10個以上のセレクターコドンを含む。
該当蛋白質又はポリペプチドをコードする遺伝子は例えば非天然アミノ酸を組込むための1個以上のセレクターコドンを付加するように本明細書の「突然変異誘発及び他の分子生物学技術」のセクションに記載する当業者に周知の方法を使用して突然変異誘発することができる。例えば、1個以上のセレクターコドンを付加するように該当蛋白質の核酸を突然変異誘発し、1種以上の非天然アミノ酸を挿入できるようにする。本発明は例えば少なくとも1種の非天然アミノ酸を組込んだ任意蛋白質のこのような任意変異体(例えば突然変異体、変形)を含む。同様に、本発明は対応する核酸、即ち1種以上の非天然アミノ酸をコードする1個以上のセレクターコドンを含む任意核酸も含む。
非天然アミノ酸を組込んだ蛋白質を生産するためには、直交tRNA/RS対による非天然アミノ酸のin vivo組込みに適した宿主細胞及び生物を使用することができる。直交tRNA、直交tRNAシンテターゼ、及び修飾すべき蛋白質をコードするベクターを発現する1種以上のベクターで宿主細胞を遺伝子組換え(例えば形質転換、形質導入又はトランスフェクション)する。これらの成分の各々を同一ベクターに配置してもよいし、各々別々のベクターに配置してもよいし、2成分を第1のベクターに配置し、第3の成分を第2のベクターに配置してもよい。ベクターは例えばプラスミド、細菌、ウイルス、裸のポリヌクレオチド又はポリヌクレオチドコンジュゲートの形態とすることができる。
免疫反応性によるポリペプチドの定義
本発明のポリペプチドは種々の新規ポリペプチド配列(例えば本発明の翻訳系で合成される蛋白質の場合には非天然アミノ酸を含み、例えば新規シンテターゼの場合には標準アミノ酸の新規配列を含むポリペプチド)を提供するので、ポリペプチドは例えばイムノアッセイで認識することができる新規構造特徴も提供する。本発明のポリペプチドに特異的に結合する抗血清の作製及び前記抗血清と結合するポリペプチドも本発明の特徴である。本明細書で使用する「抗体」なる用語は限定されないが、検体(抗原)と特異的に結合してこれを認識する1又は複数の免疫グロブリン遺伝子又はそのフラグメントにより実質的にコードされるポリペプチドを意味する。例としてはポリクローナル、モノクローナル、キメラ、及び1本鎖抗体等が挙げられる。Fabフラグメントやファージディスプレイを含む発現ライブラリーにより生産されるフラグメント等の免疫グロブリンフラグメントも本明細書で使用する「抗体」なる用語に含まれる。抗体構造及び用語については、例えばPaul,Fundamental Immunology,4th Ed.,1999,Raven Press,New York参照。
イムノアッセイ用抗血清を作製するためには、免疫原性ポリペプチドの1種以上を本明細書に記載するように作製し、精製する。例えば、組換え蛋白質を組換え細胞で生産することができる。(マウスの仮想遺伝子一致により結果の再現性が高いのでこのアッセイで使用する)近交系マウスに標準マウス免疫プロトコールに従って標準アジュバント(例えばフロイントアジュバント)と共に免疫原性蛋白質を免疫する(抗体作製、イムノアッセイフォーマット及び特異的免疫反応性を測定するために使用可能な条件の標準解説については例えばHarlow and Lane(1988)Antibodies,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Publications,New York参照)。蛋白質、抗体、抗血清等に関するその他の詳細は国際公開WO2004/094593、発明の名称「真核遺伝コードの拡張(EXPANDING THE EUKARYOTIC GENETIC CODE)」;WO2002/085923、発明の名称「非天然アミノ酸のインビボ組込み(IN VIVO INCORPORATION OF UNNATURAL AMINO ACIDS)」;WO2004/035605、発明の名称「糖蛋白質合成(GLYCOPROTEIN SYNTHESIS)」;及びWO2004/058946、発明の名称「蛋白質アレー(PROTEIN ARRAYS)」に記載されている。
O−tRNA及びO−RS及びO−tRNA/O−RS対の使用
本発明の組成物と本発明の方法により作製された組成物は場合により細胞に導入する。その後、本発明のO−tRNA/O−RS対又は個々の成分を宿主系の翻訳機構で使用することができ、その結果として、非天然アミノ酸が蛋白質に組込まれる。国際公開WO2002/085923、発明者Schultzら、発明の名称「非天然アミノ酸のインビボ組込み(IN VIVO INCORPORATION OF UNNATURAL AMINO ACIDS)」はこのプロセスを記載しており、参考資料として本明細書に組込む。例えば、O−tRNA/O−RS対を宿主(例えば大腸菌又は酵母)に導入すると、前記対はセレクターコドン(例えばアンバーナンセンスコドン)に応答して外部から増殖培地に添加することができる非天然アミノ酸の蛋白質(例えばミオグロビン試験蛋白質又は治療用蛋白質)へのin vivo組込みを誘導する。場合により、本発明の組成物はin vitro翻訳系に導入してもよいし、細胞内in vivo系に導入してもよい。非天然アミノ酸を組込んだ蛋白質は多様な用途の任意のものに使用することができる。例えば、蛋白質に組込まれた非天然部分は例えば、他の蛋白質、小分子(例えばラベルや色素)及び/又は生体分子との架橋をはじめとする多様な修飾の任意のもののターゲットとして利用することができる。これらの修飾により、非天然アミノ酸の組込みの結果、治療用蛋白質を改善することができ、更に酵素の触媒機能を改変又は改善するために使用することもできる。所定側面では、非天然アミノ酸の蛋白質組込みとその後の修飾は蛋白質構造、他の蛋白質との相互作用等の研究を助長することができる。
光調節及びフォトケージング
例えば酵素、受容体、イオンチャネル等の活性を直接調節するか、又は各種シグナル伝達分子の細胞内濃度を調節することにより、光調節型アミノ酸(例えばフォトクロミック、光分解性、光異性化可能等)を使用して各種生体プロセスを空間的及び時間的に制御することができる。例えばShigeriら,Pharmacol.Therapeut.,2001,91:85;Curleyら,Pharmacol.Therapeut.,1999,82:347;Curleyら,Curr.Op.Chem.Bio.,1999,3:84;“Caged Compounds”Methods in Enzymology,Marriott,G.,Ed,Academic Press,NY,1998,V.291;Adamsら,Annu.Rev.Physiol,1993,55:755+;及びBochetら,J.Chem.Soc,Perkin 1,2002,125参照。本発明の各種態様では、組成物及び方法は光調節型アミノ酸を含む。例えば、本発明は光調節型非天然アミノ酸であるo−ニトロベンジル−セリンとO−(2−ニトロベンジル)−L−チロシンの組込み用直交翻訳系を提供する(図1、並びに実施例8及び9参照)。
「光調節型アミノ酸」は一般に例えば感光性アミノ酸である。光調節型アミノ酸は一般に所定方法で光(例えばUV、IR等)により制御されるアミノ酸である。従って、例えば、光調節型アミノ酸が生体活性をもつペプチドに含まれる場合には、照射によりアミノ酸を改変することにより、ペプチドの生体活性を変化させることができる。光調節型アミノ酸には、「フォトケージドアミノ酸」、「感光性アミノ酸」、「フォトレービルアミノ酸」、「光異性化可能なアミノ酸」等も含まれる。ケージドアミノ酸やケージドペプチド等の「ケージド種」は大きな部分(例えば分子)の内側にトラップされ、特定照射を受けると遊離する種である。例えばAdamsら,Annu.Rev.Physiol,1993,55:755−784参照。アミノ酸の「ケージング」基は(例えばターゲット分子との相互作用を通常は安定化させる結合を切断するか、特定側鎖の疎水性又はイオン特性を変化させるか、あるいは立体障害等により)分子(例えばこのようなアミノ酸を含むペプチド)内の生体活性を阻害又は隠蔽することができる。「光異性化可能な」アミノ酸は露光により異性体形に転換することができる。このようなアミノ酸の各種異性体が組込まれると、蛋白質の他の側鎖との相互作用が変化する。実施例2参照。こうして光調節型アミノ酸はそれらが組込まれたペプチドの生体活性を(活性化、部分活性化、不活化、部分不活化、変形活性化等により)制御することができる。光調節型アミノ酸及び分子の詳細な定義と例についてはAdams前出と本セクションの他の引用文献参照。
多数の光調節型アミノ酸が当業者に公知であり、多数のものが市販されている。光調節分子をアミノ酸と結合及び/又は会合する方法も公知である。このような光調節型アミノ酸は一般に本発明の各種態様に利用可能である。当然のことながら、本明細書には考えられる多数の光調節部分(例えばフォトケージング基等)と多数の光調節型アミノ酸を挙げるが、これらの例は限定的であるとみなすべきではない。従って、本発明は本明細書に具体的に記載しない光調節部分及び光調節型アミノ酸にも利用可能である。
上記のように、光調節型アミノ酸を作製するために場合により多数の方法が適用可能である。例えば、光調節型アミノ酸(例えばフォトケージドアミノ酸)はそのα−アミノ基をBOC(ブチルカルボニル)等の化合物で保護し、α−カルボキシル基をt−ブチルエステル等の化合物で保護することにより作製することができる。このような保護後にクロロギ酸2−ニトロベンジル、臭化α−カルボキシル2−ニトロベンジルメチルエステル、又は2−ニトロベンジルジアゾエタン等の反応形の2−ニトロベンジル等のフォトレービルケージング基とアミノ酸側鎖を反応させることができる。フォトレービルケージ基を付加した後に標準手順により保護基を除去することができる。例えばUSPN5,998,580参照。
別例として、クロロギ酸2−ニトロベンジルを使用してリジン残基をケージングし、ε−リジンアミノ基を修飾し、正電荷を除去することもできる。あるいは、α−カルボキシ2−ニトロベンジルオキシカルボニルケージング基の使用により(このようなリジンをもつ)ペプチドに負電荷を導入することによりリジンをケージングすることもできる。更に、ホスホアミノ酸又はホスホペプチドを1(2−ニトロベンジル)ジアゾエタンで処理することによりホスホセリンとホスホスレオニンをケージングすることができる。例えばWalkerら,Meth Enzymol.172:288−301,1989参照。例えばセリン、スレオニン、ヒスチジン、グルタミン、アスパラギン、アスパラギン酸及びグルタミン酸等の他の多数のアミノ酸も容易に標準ケージング化学に適用可能である。例えばWilcoxら,J.Org.Chem.55:1585−1589,1990参照。この場合も当然のことながら、特定光調節型(アミノ酸及び/又は光調節形に変換可能なアミノ酸)の記載は必ずしも限定的とみなすべきではない。
アミノ酸残基は他の方法で光調節型(例えば感光性又はフォトレービル)にすることもできる。例えば、特定アミノ酸残基をもつペプチド主鎖が放射線照射により開裂するような所定アミノ酸残基を作製することができる。例えば、フォトレービルグリシンである2−ニトロフェニルグリシンはこのように機能することができる。例えばDavisら,1973,J.Med.Chem.,16:1043−1045参照。2−ニトロフェニルグリシンを組込んだペプチドに放射線を照射すると、2−ニトロフェニルグリシンのα炭素とα−アミノ基の間のペプチド主鎖は開裂する。2−ニトロベンジル基をα炭素とα−アミノ基の間に挿入するならば、グリシン以外のアミノ酸にもこのような開裂ストラテジーを一般に適用することができる。
このような基を他の分子(例えばアミノ酸)と共有結合させるために使用される多数の光調節基(例えばケージング基)と多数の反応性化合物が当分野で周知である。光調節(例えばフォトレービル、ケージング)基の例としては限定されないが、o−ニトロベンジル−セリン、O−(2−ニトロベンジル)−L−チロシン、ニトロインドリン;N−アシル−7−ニトロインドリン;フェナシル;ヒドロキシフェナシル;臭素化7−ヒドロキシクマリン−4−イルメチル(例えばBhc);ベンゾインエステル;ジメトキシベンゾイン;メタフェノール;2−ニトロベンジル;1−(4,5−ジメトキシ−2−ニトロフェニル)エチル(DMNPE);4,5−ジメトキシ−2−ニトロベンジル(DMNB);α−カルボキシ−2−ニトロベンジル(CNB);1−(2−ニトロフェニル)エチル(NPE);5−カルボキシメトキシ−2−ニトロベンジル(CMNB);(5−カルボキシメトキシ−2−ニトロベンジル)オキシ)カルボニル;(4,5−ジメトキシ−2−ニトロベンジル)オキシ)カルボニル;デオキシベンゾイニル等が挙げられる。例えばUSPN5,635,608(Haugland and Gee)(1997年6月3日)、発明の名称「α−カルボキシケージド化合物(α−carboxy caged compounds)」Neuro 19,465(1997);J Physiol 508.3,801(1998);Proc Natl Acad Sci USA 1988 Sep,85(17):6571−5;J Biol Chem 1997 Feb 14,272(7):4172−8;Neuron 20,619−624,1998;Nature Genetics,vol.28:2001:317−325;Nature,vol.392,1998:936−941;Pan,P.,and Bayley,H.“Caged cysteine and thiophosphoryl peptides”FEBS Letters 405:81−85(1997);Pettitら(1997)“Chemical two−photon uncaging:a novel approach to mapping glutamate receptors”Neuron 19:465−471;Furutaら(1999)“Brominated 7−hydroxycoumarin−4−ylmethyls:novel photolabile protecting groups with biologically useful cross−sections for two photon photolysis”Proc.Natl.Acad.Sci.96(4):1193−1200;Zouら“Catalytic subunit of protein kinase A caged at the activating phosphothreonine”J.Amer.Chem.Soc.(2002)124:8220−8229;Zouら“Caged Thiophosphotyrosine Peptides”Angew.Chem.Int.Ed.(2001)40:3049−3051;Conrad IIら“p−Hydroxyphenacyl Phototriggers:The reactive Excited State of Phosphate Photorelease”J.Am.Chem.Soc.(2000)122:9346−9347;Conrad IIら“New Phototriggers 10:Extending the π,π* Absorption to Release Peptides in Biological Media”Org.Lett.(2000)2:1545−1547;Givensら“A New Phototriggers 9:p−Hydroxyphenacyl as a C−Terminus Photoremovable Protecting Group for Oligopeptides”J.Am.Chem.Soc.(2000)122:2687−2697;Bishopら“40−Aminomethyl−2,20−bipyridyl−4−carboxylic Acid(Abc)and Related Derivatives:Novel Bipyridine Amino Acids for the Solid−Phase Incorporation of a Metal Coordination Site Within a Peptide Backbone”Tetrahedron(2000)56:4629−4638;Chingら“Polymers As Surface−Based Tethers with Photolytic triggers Enabling Laser−Induced Release/Desorption of Covalently Bound Molecules”Bioconjugate Chemistry(1996)7:525−8;BioProbes Handbook,2002,Molecular Probes,Inc.;及びHandbook of Fluorescent Probes and Research Products,Ninth Edition又はWeb Edition,Molecular Probes,Inc、並びにその引用文献参照。各種分子のケージング用の多数の化合物、キット等が例えばMolecular Probes,Inc.から市販されている。その他の情報は例えばMerrifield,Science 232:341(1986)及びCorrie,J.E.T.and Trentham,D.R.(1993)In:Biological Applications of Photochemical Switches,ed.,Morrison,H.,John Wiley and Sons,Inc.New York,pp.243−305に記載されている。適切な感光性ケージング基の例としては限定されないが、2−ニトロベンジル、ベンゾインエステル、N−アシル−7−ニトロインドリン、メタフェノール、及びフェナシルが挙げられる。
所定態様では、光調節(例えばケージング)基は第2の結合部分と結合することができる第1の結合部分を場合により含むことができる。例えば、市販ケージドホスホロアミダイト[1−N−(4,4’−ジメトキシトリチル)−5−(6−ビオチンアミドカプロアミドメチル)−1−(2−ニトロフェニル)−エチル]−2−シアノエチル−(N,N−ジイソプロピル)−ホスホロアミダイト(Glen Research Corp.,www.glenres.com製品PC Biotin Phosphoramadite)はフォトレービル基とビオチン(第1の結合部分)を含む。従って、第2の結合部分(例えばストレプトアビジン又はアビジン)をケージング基と結合することができ、その嵩とケージング効力を増すことができる。所定態様では、ケージド成分は第1の結合部分を各々含む2個以上のケージング基を含み、第2の結合部分は2個以上の第1の結合部分と同時に結合することができる。例えば、ケージド成分は少なくとも2個のビオチン化ケージング基を含むことができ、ストレプトアビジンが複数のケージド成分分子上の複数のビオチン部分と結合すると、ケージド成分は相互に結合して大きな網状構造とする。ビオチンを前記成分と結合するフォトレービル基が開裂すると、網状構造は解離する。
ケージドポリペプチド(例えば抗体や転写因子等のペプチド基質及び蛋白質を含む)を作製する「従来」方法としては、例えばポリペプチドをケージング化合物と反応させる方法や、ポリペプチドの合成中にケージドアミノ酸を組込む方法がある。例えば米国特許第5,998,580号(Fayら)(1999年12月7日)発明の名称「感光性ケージド巨大分子(Photosensitive caged macromolecules)」;Kosselら(2001)PNAS 98:14702−14707;Trends Plant Sci(1999)4:330−334;PNAS(1998)95:1568−1573;J.Am.Chem.Soc.(2002)124:8220−8229;Pharmacology & Therapeutics(2001)91:85−92;及びAngew.Chem.Int.Ed.Engl.(2001)40:3049−3051参照。(例えば蛋白質形質導入ドメイン及びセンサー等を結合するための)フォトレービルポリペプチドリンカーは例えば米国特許第5,998,580号に記載されているもの等のフォトレービルアミノ酸を含むことができる。
光を照射すると、例えばこのようなアミノ酸を含むペプチドの活性に重要なアミノ酸の側鎖残基を遊離させることができる。更に、所定態様では、ケージ解除したアミノ酸はアミノ酸を含むペプチドのペプチド主鎖を開裂し、従って、例えば環状ペプチドを開環し、別の生物学的性質等をもつ線状ペプチドとすることができる。
ケージドペプチドの活性化は当業者に公知の任意標準方法により光調節型アミノ酸上の感光性ケージング基の破壊により実施することができる。例えば、感光性アミノ酸は(例えばUV域又は赤外域で発光する)レーザー等の適切な慣用光源に暴露することによりケージ解除又は活性化することができる。本発明で使用するもの等の光調節型アミノ酸と併用するために適用可能な適切な波長及びエネルギーのその他の多数のレーザー並びに適切な適用プロトコール(例えば照射時間等)が当業者に自明である。光調節型ケージドアミノ酸の遊離はこのようなアミノ酸を含むペプチドの制御を可能にする。このような制御は位置と時間の両面で可能である。例えば、集束レーザー照射は他の位置のアミノ酸をケージ解除せずに、ある位置のアミノ酸をケージ解除することができる。
当業者に自明のとおり、光調節型アミノ酸の活性を評価するためには各種アッセイ(例えば下記実施例に記載するアッセイ)を使用することができる。光調節型アミノ酸を組込んだペプチドを細胞又は組織に導入する前後と、光調節型分子の遊離後に多様な例えば細胞機能、組織機能等をアッセイすることができる。
本発明の組成物及び方法は多数の側面で利用することができる。例えば、光調節型アミノ酸の遊離又は活性化/不活化/等は標的光照射等により局在化することができるので、(例えばペプチド中の)光調節型アミノ酸は治療用組成物を身体の個別位置に送達することができる。同様に当然のことながら、本発明の方法、構造、及び組成物は光調節型天然アミノ酸(例えば光調節部分を結合/会合したアミノ酸)の組込み/使用にも適用可能である。
酵素(例えばWestmarkら,J.Am.Chem.Soc.1993,115:3416−19及びHohsakaら,J.Am.Chem.Soc.1994,116:413−4参照)、受容体(例えばBartelsら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1971,68:1820−3;Lesterら,Nature 1977,266:373−4:Cruzら,J.Am.Chem.Soc,2000,122:8777−8;及びPollittら,Angew.Chem.Int.Ed.Engl,1998,37:2104−7参照)、又はイオンチャネル(例えばLienら,J.Am.Chem.Soc.1996,118:12222−3;Borisenkoら,J.Am.Chem.Soc.2000,122:6364−70;及びBanghartら,Nat.Neurosci.2004,7:1381−6参照)の活性を直接調節するか、あるいは各種シグナル伝達分子の細胞内濃度(例えばAdamsら,Annu.Rev.Physiol.1993,55:755−84参照)を調節することにより、フォトクロミック及び光分解性基を使用して各種生体プロセスを空間的及び時間的に制御することができる。一般に、このためには蛋白質又は小分子をアゾベンゼン又はニトロベンジル基等の光反応性リガンドで化学的に修飾する必要がある。光反応性アミノ酸を生体の蛋白質の規定部位に直接遺伝的に組込むことができるならば、この技術の範囲は有意に拡大すると思われる。例えばWuら,J.Am.Chem.Soc.2004,126:14306−7参照。
キット
キットも本発明の特徴である。例えば、少なくとも1種の非天然アミノ酸を組込んだ蛋白質を細胞で生産するためのキットが提供され、前記キットはO−tRNAをコードするポリヌクレオチド配列、及び/又はO−tRNA、及び/又はO−RSをコードするポリヌクレオチド配列、及び/又はO−RSを収容する容器を含む。1態様では、キットは更にp−エチルチオカルボニル−L−フェニルアラニン、p−(3−オキソブタノイル)−L−フェニルアラニン、1,5−ダンシルアラニン、7−アミノ−クマリンアラニン、7−ヒドロキシ−クマリンアラニン、o−ニトロベンジル−セリン、O−(2−ニトロベンジル)−L−チロシン、p−カルボキシメチル−L−フェニルアラニン、p−シアノ−L−フェニルアラニン、m−シアノ−L−フェニルアラニン、ビフェニルアラニン、3−アミノ−L−チロシン、ビピリジルアラニン、p−(2−アミノ−1−ヒドロキシエチル)−L−フェニルアラニン、p−イソプロピルチオカルボニル−L−フェニルアラニン、3−ニトロ−L−チロシン又はp−ニトロ−L−フェニルアラニン等の非天然アミノ酸を含む。別の態様では、キットは更に蛋白質を生産するための説明書を含む。
以下、実施例により本発明を例証するが、これらの実施例により本発明を限定するものではない。本発明の範囲から逸脱せずに変更可能な種々の非必須パラメーターが当業者に自明である。