CN115551875A - 用于酪氨酸酶介导的位点特异性蛋白质缀合的系统和方法 - Google Patents
用于酪氨酸酶介导的位点特异性蛋白质缀合的系统和方法 Download PDFInfo
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Abstract
本公开提供生物分子与官能化反式环辛烯(TCO)的生物缀合。
Description
相关申请案的交叉引用
本申请主张2020年5月5日递交的美国临时申请63/020,405的优先权，并且将其整体内容通过引用并入本申请案。
背景技术
对天然氨基酸的位点特异性生物缀合仍然是化学家面临的挑战。通常很难用化学试剂从类似的邻近物识别如赖氨酸、天冬氨酸和谷氨酸等表面丰富的氨基酸；除了在极少数情况下，氨基酸侧链的官能团压倒了空间或电子局部环境中任何可导致单个位点的反应动力学增强的细微变化。相反地，在蛋白质表面上安装不常见的氨基酸(特别是半胱氨酸)可提供位点选择性，该位点选择性可以用于位点特异性化学反应。
通过酶实现了类似的特异性，该酶已进化为在独特的空间和电子环境中分离官能团。许多酶与氨基酸侧链反应。它们可用于安装或移除如磷酸盐、聚糖或脂质等翻译后修饰。对于生物缀合而言，这些酶中有用的亚类是用于组织交联者，因为该亚类是氨基酸序列特异性的。蛋白质化学家在转谷氨酰胺酶(TG)、甲酰甘氨酸生成酶(FGE)、分选酶、磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶(PPTase)及漆酶等情况下利用了此特性。通过重组安装通过酶识别的氨基酸可实现位点特异性反应。酪氨酸酶也属于此类酶。
酪氨酸酶将酪氨酸分两步骤氧化为二羟苯丙氨酸(DOPA)，接着氧化为DOPA的邻醌(多巴醌)。在自然界中，多巴醌既是真黑色素(eumelanin)的前体，也是与半胱氨酸、褐黑素(pheomelanin)、芳香族皮肤和毛发色素聚合物缀合使用的前体；在实验室中，科学家可利用这种反应来修饰重组蛋白。酪氨酸酶仅识别酪氨酸的酚侧链，并且能将其转化为邻醌，而无需侧翼氨基酸的特异性。重要的是，酪氨酸很少见于蛋白质表面；在这种少数情况下，其侧链往往会被疏水性堆积所阻塞。这导致非常少的酪氨酸残基，对于这些残基，酚充分地延伸以到达酪氨酸酶的活性位点。对此，有安装酪氨酸残基并实现位点特异性蛋白质修饰的可能。此方法已用于多种实例，包括通过Diels-Alder环加成反应对细胞毒性货物进行缀合、对Cas9进行蛋白质-蛋白质缀合以及对苯胺的氧化偶联进行分析。
尽管在缀合方面取得了这些进展，但是产率和缀合产物的稳定性仍然是生物分子缀合中的问题。本公开提供满足这些和其他需求的实施例。
发明内容
在实施例中，提供了包括官能化反式环辛烯(TCO)与邻醌的环加合物的组合物，其中邻醌存在于生物分子中。
在实施例中，提供了式(I)的组合物：
其中P为蛋白质或肽，且R包含第二蛋白质、第二肽、药物、核酸、寡糖、聚合物、寡聚体、树枝状聚合物、标记物或基质表面，它们任选地通过接头连接。
在实施例中，提供了以下方法，这些方法包括将官能化反式环辛烯(TCO)加入生物分子中存在的邻醌，从而形成官能化TCO与邻醌的环加合物。
在实施例中，提供了以下方法，这些方法包括提供官能化反式环辛烯(TCO)、将包含酚类部分的蛋白质或肽加入官能化TCO；以及从该酚类部分生成邻醌，其中允许该官能化TCO与邻醌反应以形成环加合物。
在实施例中，提供了以下抗体缀合物，其是在官能化反式环辛烯(TCO)存在下通过酪氨酸酶对抗体中酚类残基的作用而形成，其中该抗体缀合物在37℃在磷酸盐缓冲盐水中稳定至少一个月。
在实施例中，提供了以下蛋白质缀合物，其是在官能化反式环辛烯(TCO)存在下通过酪氨酸酶对蛋白质中酚类残基的作用而形成，其中该蛋白质缀合物在37℃在磷酸盐缓冲盐水中稳定至少一个月。
在实施例中，提供了包含具有酚类部分的生物分子、酪氨酸酶和官能化反式环辛烯的混合物。
附图说明
图1示出了在不同时间解析的质谱图，该质谱图表示出在经过工程化改造以显示含有酪氨酸残基的C末端肽标签的人IgG1 Fab中瞬态生成多巴醌。缺少酪氨酸的相同Fab不会导致修饰。
图2A-C示出了亲二烯体与原位多巴醌的缀合：在图2A列中示出了产物形成时间过程，顶部窗格示出了亲二烯体TCO，中间窗格显示亲二烯体BCN且底部窗格显示DBCO，每种试剂均作为用于含有原位生成多巴醌的Fab的捕获剂。还示出了瞬态地生成的邻醌(图2B列)及反应过程中生成的副产物Fab-Fab二聚体(图C列)的相同时间过程。
图3示出了典型反应及纯化过程的解卷积LCMS光谱，其展示了环加合物连接与标准实验室程序的兼容性。从上至下的光谱呈现：起始材料(含有C末端“DRY”肽标签的Fab)；在反应时间1小时后的反应，其呈现在M+432Da处(对应于+O、–H2的14Da和TCO-PEG4-COOH试剂的428Da)形成缀合产物；在反应时间16小时后的反应，其展示产率约为91％，从KappaSelect亲和性柱以pH 2.7洗脱后的纯化池，及在PBS中配制的最终产物。
图4A-B示出了由酪氨酸酶介导的生物缀合形成的Diels-Alder环加合物在数个月的过程中对在pH 7.4、37℃的PBS中经工程化改造显示C末端肽标签的Fab的三个变体的稳定性，该标签为：DRY、DRGY和GGY。在每种情况下，缀合物均由对应于O原子增加(16Da)、H2损失(–2Da)和TCO亲二烯体(TCO-PEG4-羧酸，417.5)的质量增加的质量位移组成；计算出的总质量位移为431.5Da。对于Fab–GGY，发现M+431.5；对于Fab-DRY，发现M+431.6；对于Fab-DRGY，发现431.7。每种Fab–TCO-PEG4-COOH缀合物均以PBS配制为5mg/mL，并通过0.22μm的注射器式过滤器在组织培养罩中灭菌。将容器在环境条件下密封，并在37℃下保存。在每个指定的时间点，从容器中取出一份等分样品，并通过LCMS分析其解除缀合。剩余的缀合物量计算为解卷积质量峰丰度的百分比。左窗格(图4A)示出了为Fab-DRY蛋白质记录的LCMS光谱。缀合MW和Fab起始材料MW的峰丰度基本保持不变，但是Fab片段的丰度增加约1％，与失去C末端Tyr残基相对应(计算为M-163.5，发现M-163.6)。右窗格(图4B)是三个经工程化改造的缀合的Fabs在每个时间点剩余的缀合物量的总结。
图5示出了基于图4的试剂生成的时间过程：近端Arg导致更快的初始速率(1小时)和更高的总产率。这样可将缀合效率从77％提高到92.5％。
具体实施方式
I.一般
本公开涉及生物缀合反应，其通过从酪氨酸残基或相似的酚类部分以酶促生成反应性邻醌中间体来提供蛋白质的位点特异性修饰。如本文所公开的，酶促生成的邻醌与如环辛炔和环辛烯的亲二烯体快速地反应。尽管缀合加合物的产率和缀合物在生理pH和温度下的稳定性可变动，但本实施例已经找到了瞬态邻醌的可用反应伴侣(partner)，其提供良好的缀合物产率，且在生理条件下长时间稳定。
II.定义
除非另有具体说明，否则本文所用的全部技术及科学术语是具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解相同的含义。另外，与本文描述的方法或材料相似或等同的任何方法或材料都可以用于本发明的实施中。为了本发明的目的，定义以下术语。
如本文所使用的“一个”、“一种”或“该”不仅包括具有一个成员的方面，而且还包括具有一个以上成员的方面。例如，除非上下文另外明确指示，否则单数形式“一(a、an)”和“该(the)”包括复数个指代物。因此，例如，对“一个细胞”的提及包括多个此类细胞，而对“药剂”的提及包括对本领域技术人员已知的一种或多种药剂的提及，以此类推。
“烷基”是指具有所示碳原子数的直链或支链的饱和脂族基团。烷基可以包括任何数量的碳，例如C1-2、C1-3、C1-4、C1-5、C1-6、C1-7、C1-8、C1-9、C1-10、C2-3、C2-4、C2-5、C2-6、C3-4、C3-5、C3-6、C4-5、C4-6和C5-6。例如，C1-6烷基包括但不限于甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲-丁基、叔-丁基、戊基、异戊基、己基等。烷基也可以指具有高达20个碳原子的烷基基团，例如但不限于庚基、辛基、壬基、癸基等。烷基基团可为取代的或未取代的。
“亚烷基(Alkylene)”是指具有所示碳原子数(即C1-6表示1个至6个碳原子)的直链或支链的饱和脂族基团，并且连接至少两个其他基团，即二价烃基团。连接至亚烷基的两个部分可连接至亚烷基基团的相同原子或不同原子。例如，直链亚烷基可为-(CH2)n-的二价基团，其中n为1、2、3、4、5或6。代表性的C1-4亚烯基(alkenylene)基团包括但不限于亚甲基、亚乙基、亚丙基、亚异丙基、丁烯、异丁烯及仲-丁烯。
“烯基(Alkenyl)”是指具有至少2个碳原子和至少一个双键的直链或支链烃。烯基可包括任何数量的碳，例如C2、C2-3、C2-4、C2-5、C2-6、C2-7、C2-8、C2-9、C2-10、C3、C3-4、C3-5、C3-6、C4、C4-5、C4-6、C5、C5-6和C6。烯基基团可具有任何合适数量的双键，包括但不限于1个、2个、3个、4个、5个或更多。烯基基团的实例包括但不限于乙烯基(vinyl)(乙烯基(ethenyl))、丙烯基、异丙烯基、1-丁烯基、2-丁烯基、异丁烯基、丁二烯基、1-戊烯基、2-戊烯基、异戊烯基，1,3-戊二烯基、1,4-戊二烯基、1-己烯基、2-己烯基、3-己烯基、1,3-己二烯基、1,4-己二烯基、1,5-己二烯基、2,4-己二烯基或1,3,5-己三烯基。烯基基团可为取代的或未取代的。
“炔基(Alkynyl)”是指具有至少2个碳原子和至少一个三键的直链或支链烃。炔基可包含任何数量的碳，例如C2、C2-3、C2-4、C2-5、C2-6、C2-7、C2-8、C2-9、C2-10、C3、C3-4、C3-5、C3-6、C4、C4-5、C4-6、C5、C5-6和C6。炔基基团的实例包括但不限于乙炔基、丙炔基、1-丁炔基、2-丁炔基、丁二炔基、1-戊炔基、2-戊炔基、异戊炔基、1,3-戊二炔基、1,4-戊二炔基、1-己炔基、2-己炔基、3-己炔基、1,3-己二炔基、1,4-己二炔基、1,5-己二炔基、2,4-己二炔基或1,3,5-己三炔基。炔基基团可为取代的或未取代的。
“烷氧基(Alkoxy)”是指具有氧原子的烷基基团，该氧原子将烷基基团连接到附接点：烷基-O-。作为烷基基团，烷氧基基团可具有任何合适数量的碳原子，例如C1-6。烷氧基基团包括例如甲氧基、乙氧基、丙氧基、异-丙氧基、丁氧基、2-丁氧基、异-丁氧基、仲-丁氧基、叔-丁氧基、戊氧基、己氧基等。烷氧基基团可进一步被其中所述的各种取代基取代。烷氧基基团可为取代的或未取代的。
“烷氧基-烷基(Alkoxy-alkyl)”是指具有烷基组分和烷氧基组分的基团，其中烷基组分将烷氧基组分连接至附接点。烷基组分如上文所定义，不同之处在于烷基组分为至少二价的亚烷基，以连接至烷氧基组分和附接点。烷基组分可包括任何数量的碳，例如C1-6、C1-2、C1-3、C1-4、C1-5、C1-6、C2-3、C2-4、C2-5、C2-6、C3-4、C3-5、C3-6、C4-5、C4-6和C5-6。在某些实例中，可不存在烷基组分。烷氧基组分如上文所定义。烷基-烷氧基基团的实例包括但不限于2-乙氧基-乙基和甲氧基甲基。
“羟烷基(Hydroxyalkyl)”或“烷羟基(alkylhydroxy)”是指如上所定义的烷基基团，其中至少一个氢原子被羟基基团取代。作为烷基基团，羟烷基或烷羟基基团可具有任何合适数量的碳原子，例如C1-6。示例性的C1-4羟烷基基团包括但不限于羟甲基、羟乙基(其中羟基位于1-位或2-位)、羟丙基(其中羟基位于1-位、2-位或3-位)、羟丁基(其中羟基位于1-位、2-位、3-位或4-位)、1,2-二羟乙基等。
“卤素(Halogen)”是指氟、氯、溴和碘。
“卤代烷基(Haloalkyl)”是指如上所定义的烷基的其中一些或全部氢原子被卤素原子取代。作为烷基，卤代烷基基团可具有任何合适数量的碳原子，例如C1-6。例如，卤代烷基包括三氟甲基、氟甲基等。在某些实例中，术语“全氟(perfluoro)”可用于定义其中所有氢均被氟取代的化合物或基团。例如，全氟甲基是指1,1,1-三氟甲基。
“卤代烷氧基(Haloalkoxy)”是指其中一些或全部氢原子被卤素原子取代的烷氧基基团。作为烷基基团，卤代烷氧基基团可具有任何合适数量的碳原子，例如C1-6。烷氧基基团可被1个、2个、3个或更多个卤素取代。当所有氢被卤素，例如被氟取代时，化合物被全-取代，例如全氟化。卤代烷氧基包括但不限于三氟甲氧基、2,2,2-三氟乙氧基、全氟乙氧基等。
“氨基(Amino)”是指-N(R)2基团，其中R基团可为氢、烷基、烯基、炔基、环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基等。R基团可以为相同或不同。氨基基团可以为伯氨基(每个R都是氢)、仲氨基(一个R是氢)或叔氨基(每个R都不是氢)。
“烷基胺(Alkylamine)”是指如本文所定义的具有一个或多个氨基基团的烷基基团。氨基基团可为伯、仲或叔氨基。烷基胺可进一步被羟基基团取代以形成氨基-羟基基团。可用于本发明的烷基胺包括但不限于乙胺、丙胺、异丙胺、乙二胺和乙醇胺。氨基基团可将烷基胺与化合物剩余部分的附接点连接，可在烷基基团的欧米茄(omega)位置，或可将烷基基团的至少两个碳原子连接在一起。本领域技术人员将理解，其他烷基胺可用于本发明。
“杂烷基(Heteroalkyl)”是指任何具合适的长度并且具有1个至3个杂原子如N、O和S的烷基基团。杂烷基基团具有所示的碳原子数量，其中至少一个非末端碳被杂原子代替。其他杂原子也可为有用的，包括但不限于B、Al、Si和P。杂原子也可以被氧化，例如但不限于-S(O)-和-S(O)2-。例如，杂烷基可包括醚、硫醚和烷基-胺。杂烷基基团不包括过氧化物(-O-O-)或其他连续地连接的杂原子。杂烷基的杂原子部分可以取代烷基基团的氢以形成羟基、硫基或氨基基团。可选地，杂原子部分可以连接原子，或被插入两个碳原子之间。
“环烷基(Cycloalkyl)”是指含有3个至12个环原子或所示原子数的饱和或部分不饱和的单环、稠合双环或桥连多环的环组合。环烷基可包括任何数量的碳，例如C3-6、C4-6、C5-6、C3-8、C4-8、C5-8、C6-8、C3-9、C3-10、C3-11和C3-12。饱和的单环环烷基环包括例如环丙基、环丁基、环戊基、环己基和环辛基。饱和的双环和多环环烷基环包括例如降冰片烷、[2.2.2]双环辛烷、十氢萘和金刚烷。环烷基基团也可为部分不饱和的，在环中具有一个或多个双键或三键。部分不饱和的代表性环烷基包括但不限于环丁烯、环戊烯、环己烯、环己二烯(1,3-和1,4-异构体)、环庚烯、环庚二烯、环辛烯、环辛二烯(1,3-、1,4-和1,5-异构体)、降冰片烯和降冰片二烯。当环烷基是饱和的单环C3-8环烷基时，示例性基团包括但不限于环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基和环辛基。当环烷基是饱和的单环C3-6环烷基时，示例性基团包括但不限于环丙基、环丁基、环戊基和环己基。环烷基可为取代的或未取代的。
“烷基-环烷基(Alkyl-cycloalkyl)”是指具有烷基组分和环烷基组分的基团，其中烷基组分将环烷基组分连接至附接点。烷基组分如上文所定义，不同之处在于烷基组分为至少二价的亚烷基，以连接至环烷基组分和附接点。在某些实例中，可不存在烷基组分。烷基组分可包括任何数量的碳，例如C1-6、C1-2、C1-3、C1-4、C1-5、C2-3、C2-4、C2-5、C2-6、C3-4、C3-5、C3-6、C4-5、C4-6和C5-6。环烷基组分如其中所定义。示例性的烷基-环烷基包括但不限于甲基-环丙基、甲基-环丁基、甲基-环戊基和甲基-环己基。
“杂环烷基(Heterocycloalkyl)”是指具有3个至12个环成员及1个至5个N、O和S杂原子的饱和环系统。杂原子也可以被氧化，例如但不限于-S(O)-和-S(O)2-。杂环烷基可包含任意数量的环原子，例如3个至6个、4个至6个、5个至6个、3个至8个、4个至8个、5个至8个、6个至8个、3个至9个、3个至10个、3个至11个或3个到12个环成员。杂环烷基中可包括任何合适数量的杂原子，例如1个、2个、3个、4个或5个、或1个至2个、1个至3个、1个至4个、1个至5个、2个至3个、2个至4个、2个至5个、3个至4个或3个至5个。杂环烷基可包括任何数量的碳，例如C3-6、C4-6、C5-6、C3-8、C4-8、C5-8、C6-8、C3-9、C3-10、C3-11和C3-12。杂环烷基可包括诸如氮丙啶、氮杂环丁烷、吡咯烷、哌啶、氮杂环庚烷、二氮杂环庚烷(diazepane)、氮杂环辛烷(azocane)、奎宁环、吡唑烷、咪唑烷、哌嗪(1,2-、1,3-和1,4-异构体)、环氧乙烷、氧杂环丁烷、四氢呋喃、噁烷(四氢吡喃)、环氧己烷、环硫乙烷、硫杂环丁烷、噻吩(四氢噻吩)、噻烷(四氢噻喃)、噁唑烷、异噁唑烷、噻唑烷、异噻唑烷、二氧戊环、二硫戊环(dithiolane)、吗啉、硫代吗啉、二氧六环或二噻烷(dithiane)等基团。杂环烷基也可与芳香族或非芳香族环系统稠合以形成成员，成员包括但不限于吲哚啉、二氮杂双环庚烷(diazabicycloheptane)、二氮杂双环辛烷(diazabicyclooctane)、二氮杂螺辛烷(diazaspirooctane)或二氮杂螺壬烷(diazaspirononane)。杂环烷基可为未取代的或取代的。例如，杂环烷基可被C1-6烷基或氧代(＝O)等取代。杂环烷基还可包括双键或三键，例如但不限于二氢吡啶(dihydropyridine)或1,2,3,6-四氢吡啶。
杂环烷基可以经由环上的任何位置连接。例如，氮丙啶可为1-或2-氮丙啶，氮杂环丁烷可为1-或2-氮杂环丁烷，吡咯烷可为1-、2-或3-吡咯烷，哌啶可为1-、2-、3-或4-哌啶，吡唑烷可为1-、2-、3-或4-吡唑烷，咪唑烷可为1-、2-、3-或4-咪唑烷，哌嗪可为1-、2-、3-或4-哌嗪，四氢呋喃可为1-或2-四氢呋喃，噁唑烷可为2-、3-、4-或5-噁唑烷，异噁唑烷可为2-、3-、4-或5-异噁唑烷，噻唑烷可为2-、3-、4-或5-噻唑烷，异噻唑烷可为2-、3-、4-或5-异噻唑烷，吗啉可为2-、3-或4-吗啉。
当杂环烷基包含3个至8个环成员和1个至3个杂原子时，代表性的成员包括但不限于吡咯烷、哌啶、四氢呋喃、噁烷、四氢噻吩、噻烷、吡唑烷、咪唑烷、哌嗪、噁唑烷，异噁唑烷、噻唑烷、异噻唑烷、吗啉、硫代吗啉、二氧六环和二噻烷。杂环烷基还可形成具有5个至6个环成员和1个至2个杂原子的环，代表性的成员包括但不限于吡咯烷、哌啶、四氢呋喃、四氢噻吩、吡唑烷、咪唑烷、哌嗪、噁唑烷、异噁唑烷、噻唑烷、异噻唑烷和吗啉。
“芳基(Aryl)”是指具有任何合适数量的环原子和任何合适数量的环的芳香族环系统。芳基可包括任何合适数量的环原子，例如6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个或16个环原子，以及6个至10个、6个至12个或6个至14个环成员。芳基可为单环的、稠合形成双环或三环的基团或通过键连接以形成联芳基。代表性的芳基包括苯基、萘基和联苯基。其他芳基包括具有亚甲基连接物基团的芐基。一些芳基具有6个至12个环成员，例如苯基，萘基或联苯基。其他芳基具有6个至10个环成员，例如苯基或萘基。一些其他的芳基具有6个环成员，例如苯基。芳基可为取代的或未取代的。
“杂芳基(Heteroaryl)”是指含有5个至16个环原子的单环或稠合的双环或三环芳族环组合，其中1个至5个环原子是例如N、O或S的杂原子。杂原子也可以被氧化，例如但不限于-S(O)-和-S(O)2-。杂芳基可包括任意数量的环原子，例如5个至6个、3个至8个、4个至8个、5个至8个、6个至8个、3个至9个、3个至10个、3个至11个或3个至12个环成员。杂芳基中可包括任何合适数量的杂原子，例如1个、2个、3个、4个或5个、或1个至2个、1个至3个、1个至4个、1个至5个、2个至3个、2个至4个、2个至5个、3个至4个或3个至5个。杂芳基可具有5个至8个环成员和1个至4个杂原子、或5个至8个环成员和1个至3个杂原子、或5个至6个环成员和1个至4个杂原子或5个至6个环成员和1个至3个杂原子。杂芳基可包括如以下的基团：吡咯、吡啶、咪唑、吡唑、三唑、四唑、吡嗪、嘧啶、哒嗪、三嗪的基团(1,2,3-、1,2,4-及1,3,5-异构体)、噻烷、呋喃、噻唑、异噻唑、噁唑和异噁唑。杂芳基也可以稠合到芳香族环系统例如苯环上，以形成包括但不限于苯并吡咯例如吲哚和异吲哚、苯并吡啶例如喹啉和异喹啉、苯并吡嗪(喹噁啉)、苯并嘧啶(喹唑啉)、苯并哒嗪例如酞嗪和噌啉、苯并噻吩和苯并呋喃。其他杂芳基包括通过键连接的杂芳环，例如联吡啶。杂芳基可为取代的或未取代的。
杂芳基可经由环上的任何位置连接。例如，吡咯包括1-、2-和3-吡咯，吡啶包括2-、3-和4-吡啶，咪唑包括1-、2-、4-和5-咪唑，吡唑包括1-、3-、4-和5-吡唑，三唑包括1-、4-和5-三唑，四唑包括1-和5-四唑，嘧啶包括2-、4-、5-和6-嘧啶，哒嗪包括3-和4-哒嗪，1,2,3-三嗪包括4-和5-三嗪，1,2,4-三嗪包括3-、5-和6-三嗪，1,3,5-三嗪包括2-三嗪，噻吩包括2-和3-噻吩，呋喃包括2-和3-呋喃，噻唑包括2-、4-和5-噻唑，异噻唑包括3-、4-和5-异噻唑，噁唑包括2-、4-和5-噁唑，异噁唑包括3-、4-和5-异噁唑，吲哚包括1-、2-和3-吲哚，异吲哚包括1-和2-异吲哚，喹啉包括2-、3-和4-喹啉，异喹啉包括1-、3-和4-异喹啉，喹唑啉包括2-和4-喹唑啉，噌啉包括3-和4-噌啉，苯并噻吩包括2-和3-苯并噻吩，苯并呋喃包括2-和3-苯并呋喃。
一些杂芳基包括具有5个至10个环成员和1个至3个包括N、O或S的环原子，例如吡咯、吡啶、咪唑、吡唑、三唑、吡嗪，嘧啶，嗒嗪、三嗪(1,2,3-、1,2,4-和1,3,5-异构体)、噻吩、呋喃、噻唑、异噻唑、噁唑、异噁唑、吲哚、异吲哚、喹啉、异喹啉、喹
啉、喹唑啉、酞嗪、噌啉、苯并噻吩和苯并呋喃。其他杂芳基包括具有5个至8个环成员和1个至3个杂原子者，例如吡咯、吡啶、咪唑、吡唑、三唑、吡嗪、嘧啶、嗒嗪、三嗪(1,2,3-、1,2,4-和1,3,5-异构体)、噻烷、呋喃、噻唑、异噻唑、噁唑和异噁唑。一些其他杂芳基包括具有9个至12个环成员和1个至3个杂原子者，例如吲哚、异吲哚、喹啉、异喹啉、喹
啉、喹唑啉、酞嗪、噌啉、苯并噻吩、苯并呋喃和联吡啶。其他杂芳基包括具有5个至6个环成员和具有1个至2个包括包括N、O或S的环原子，例如吡咯、吡啶、咪唑、吡唑、吡嗪、嘧啶、哒嗪、噻吩、呋喃、噻唑、异噻唑、噁唑和异噁唑。
术语“多肽(polypeptide)”、“肽(peptide)”和“蛋白质(protein)”在本文可互换使用以指氨基酸残基的聚合物，其中该聚合物可在实施例中与不由氨基酸组成的部分缀合。这些术语适用于氨基酸聚合物，其一个或多个氨基酸残基是对应天然存在的氨基酸的人工化学模拟物，以及天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。“融合蛋白”涉及编码两个或更多个分开的蛋白序列的嵌合蛋白，所述的两个或更多个分离的蛋白序列重组表达为单个部分。
术语“氨基酸(amino acid)”是指天然地存在和合成的氨基酸，以及以类似于天然存在的氨基酸的方式作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸是通过基因密码编码的氨基酸，以及后续经修饰的那些氨基酸，例如羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和O-磷丝氨酸。氨基酸类似物是指具有与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构的化合物，即，与氢、羧基、氨基和R基团(例如高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸硫氧化物、甲硫氨酸甲基锍)缀合的α碳。此类类似物具有经修饰的R基团(例如正亮氨酸)或经修饰的肽主链，但是保留了与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。氨基酸模拟物涉及具有与氨基酸一般化学结构不同的结构但以相似天然存在的氨基酸的方式作用的化合物。术语“非天然存在的氨基酸”和“非天然氨基酸”涉及在自然界中不存在的氨基酸类似物、合成氨基酸和氨基酸模拟物。
如本文所用，术语“抗体(antibody)”是指由免疫球蛋白基因或其功能性片段编码的多肽，其特异性地缀合并识别抗原。公认的免疫球蛋白基因包括κ(kappa)、λ(lambda)、α(alpha)、γ(gamma)、δ(delta)、ε(epsilon)及μ(mu)恒定区基因，以及无数的免疫球蛋白可变区基因。轻链分为κ或λ。重链被分类为γ、μ、α、δ或ε，其依次分别定义了免疫球蛋白类别，IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。
当短语“特异性地(或选择性地)缀合”至抗体或“特异性地(或选择性地)与其发生免疫反应”指蛋白质或肽时，是指确定蛋白质存在的缀合反应，通常是在蛋白质和其他生物制剂的异质群体。因此，在指定的免疫测定条件下，指定的抗体与特定蛋白质的缀合至少是背景的两倍，更通常是背景的10到100倍以上。在此类条件下与抗体的特异性缀合需要选择针对特定蛋白质具有特异性的抗体。例如，可选择多克隆抗体以仅获得与所选抗原而非其他蛋白质发生特异性免疫反应的抗体的子集。该选择可通过减去与其他分子交叉反应的抗体来实现。可使用各种免疫测定形式来选择与特定蛋白质发生特异性免疫反应的抗体。例如，常规地，使用固相ELISA免疫测定来选择与蛋白质发生特异性免疫反应的抗体(请参阅例如Harlow&Lane,Using Antibodies,A Laboratory Manual(1998)的可用于确定特异性免疫反应性的免疫测定形式和条件的描述)。
如本文所用，术语“抗体片段(antibody fragment)”是指抗体的一部分。抗体功能性片段的实例包括但不限于完整抗体分子、抗体片段，例如Fv、单链Fv(scFv)、互补决定区(CDR)、VL(轻链可变区)、VH(重链可变区)、Fab、F(ab)2’以及能够缀合靶抗原的免疫球蛋白肽或任何其他功能性部分的任何组合(参阅，例如，FUNDAMENTAL IMMUNOLOGY(Paul ed.,4th ed.2001))。如本领域技术人员所理解的，可通过各种方法获得各种抗体片段，例如，用如胃蛋白酶的酶消化完整的抗体；或从头合成(de novo)等。抗体片段通常是化学地或利用重组DNA方法学从头合成的。因此，如本文所用，术语“抗体”包括通过完整抗体的修饰生成的抗体片段、或使用重组DNA方法学(例如单链Fv)从头合成的抗体片段、或使用噬菌体显示数据库鉴定的抗体片段(McCafferty et al.等人,(1990)Nature348:552)。术语“抗体(antibody)”还包括二价或双特异性分子、双体抗体(diabodies)、三体抗体(triabodies)和四体抗体(tetrabodies)。二价和双特异性分子描述于例如Kostelny等人(1992)J.Immunol.148:1547,Pack and Pluckthun(1992)Biochemistry 31:1579,Hollinger等人(1993),PNAS.USA90:6444,Gruber等人(1994)J Immunol.152:5368,Zhu等人(1997)Protein Sci.6:781,Hu等人(1996)Cancer Res.56:3055,Adams等人(1993)CancerRes.53:4026,and McCartney,等人(1995)Protein Eng.8:301。
如本文所用，术语“环加合物(cycloadduct)”是指所公开的瞬态邻醌和官能化TCO亲二烯体捕获剂之间的[4+2]Diels-Alder反应的产物。
如本文所用，术语“官能化反式环辛烯(functionalized trans-
)”或“官能化TCO”是指带有功能性部分的任何TCO，其可包括有机官能团对象(handle)、接头、目标有机化合物及其组合。官能化TCO包括包含PEG接头的TCO，尽管可使用任何接头。官能化TCO可以是市售的(例如Broadpharm,Click Chemistry Tools,Jena Bioscience)或通过合成制备。
如本文所用，术语“生物分子(biomolecule)”是指氨基酸、蛋白质、肽、寡糖、单糖、氨基酸、包括RNA和DNA的核酸中的任何一种。
如本文所用，术语“经修饰的DNA或RNA”是指包含修饰以掺入(incorporate)酚类残基从而允许与酪氨酸酶反应的任何核酸。
如本文所用，术语“接头(linker)”是指将本文所公开的TCO与目标化合物连接以如本文所公开的与酪氨酸酶生成的邻醌偶联的任何有机片段。在实施例中，接头是亲水的，尽管不限于此。接头可包括具有一个或多个被杂原子如O、N或S取代的碳原子的烷基链。接头可包括本文上述定义的任何有机官能团。
如本文所用，术语“核酸(nucleic acid)”是指核苷酸单体的单链和双链聚合物，包括通过核苷酸间磷酸二酯键连接或核苷酸间类似物连接的2'-脱氧核糖核苷酸(DNA)和核糖核苷酸(RNA)，以及相关的反离子例如H+、NH4 +、三烷基铵、四烷基铵、Mg2+、Na+等。核酸包括多核苷酸和寡核苷酸。核酸可完全由脱氧核糖核苷酸、完全由核糖核苷酸或其嵌合混合物组成。核苷酸单体单元可包括天然地存在的核苷酸和核苷酸类似物。核酸的大小范围可从几个单体单元(例如5-40)至数千个单体核苷酸单元。核酸包括但不限于基因组DNA、cDNA、hnRNA、mRNA、rRNA、tRNA、RNAi、反义核酸、片段化核酸、从亚细胞器如线粒体或叶绿体获得的核酸、以及从可能存在于生物样品上或生物样品中的微生物或DNA病毒或RNA病毒获得的核酸。
III.缀合物
在实施例中，提供了包含官能化反式环辛烯(TCO)与邻醌的环加合物的组合物，其中邻醌存在于生物分子中。在实施例中，通过以下化学方程式(I)提供通用反应：
在方程式(I)中，A是在任何生物分子的框架内的邻醌(邻醌(o-quinone))，如下文所述。瞬态中间体A与官能化TCO B反应形成环加合物C。在实施例中，中间体A通过酪氨酸酶对生物分子中含酚残基的作用而形成。在实施例中，含酚残基可为氨基酸酪氨酸。在实施例中，含酚残基可为儿茶酚。在实施例中，瞬态邻醌A也可以通过化学反应代替酶促氧化生成。该化学反应包括但不限于碘酰基苯甲酸、氧化银、弗雷米盐(Fremy’s salt)、K3Fe(CN)6、过碘酸钠等的氧化。如化学方程式(I)中所示，该化学反应通常旨在通过该[4+2]环加成反应，即Diels Alder反应，将任何两个组分偶联。
在实施例中，生物分子可以包括脂质、碳水化合物、核酸、蛋白质或任何其他生物材料。
在实施例中，生物分子是脂质，其可包括例如磷脂、神经脂质、甘油脂如甘油三酯、游离脂肪酸、脂肪醇、固醇等。尽管脂质结构有所变化，但其通常都包含足够的官能团对象(handle)以用于附接4-羟芐醚基团，以生成可从其生成邻醌的偶联伴侣。在必需的酚类前体如脂质的极性首基(polar head)处附着的情况下，可在脂质和酚之间使用接头。该接头可具有与极性首基相同的一般化学特征(即，通常是亲水的)。此类接头可包括例如小的聚乙二醇单元。
在实施例中，生物分子是碳水化合物，例如糖、淀粉或纤维素材料。在实施例中，碳水化合物可为例如单糖或寡糖。在实施例中，此类基于糖的底物可终止于含酚的糖苷。举例而言，此类寡糖可由以下式A表示：
其中“糖”是任何单糖或寡糖(此处通常用葡萄糖单元绘制，但旨在表示任何单糖或寡糖)；X为O或NH；且R1和R2独立地选自羧酸、酯、烷基和氢。在实施例中，R1和R2两者皆为氢。在实施例中，R1为氢且R2为羧酸或其酯类。在实施例中，生物分子为寡糖，该寡糖在其还原端具有含酚部分。在实施例中，单糖或寡糖不必限于在还原糖末端附接。因此，在实施例中，可将糖的任何期望位置上的任何4-羟芐醚(或儿茶酚等价物)作为安装邻醌前体的目标。示例性的寡糖可包括但不限于透明质酸、藻酸盐、肝素和硫酸肝素(heparainsulfate)。
在实施例中，生物分子为核酸，例如，经修饰的或未经修饰的DNA或RNA。此类经修饰的结构被配置成可以掺入酚类残基。掺入可包括使用可从多个供货商处商业地购得的显示5’或3’氨基的核酸，并使用水性酰胺偶联条件以3-(4-羟苯基)丙酸官能化。在实施例中，经修饰的DNA或RNA可为双链或单链的。
在实施例中，生物分子为肽或蛋白质。例如，作为非限制性实例，肽或蛋白质可为酶、细胞表面蛋白、细胞因子、趋化因子、蛋白质毒素或激素。在实施例中，生物分子可为抗体或抗体片段。在实施例中，抗体可为单克隆或多克隆抗体。在实施例中，抗体为单克隆抗体。
在实施例中，邻醌可来源于含酚部分。在实施例中，含酚部分是酪氨酸。在实施例中，含酚部分是儿茶酚。在实施例中，含酚部分是4-羟烷酚(4-hydroxyalkyl phenol)残基。在实施例中，含酚部分可由以下式(B)表示：
其中“生物分子(biomolecule)”为如本文所定义；X为O或NH；Y为H或OH；R1和R2独立地选自羧酸、酯、烷基和氢。
在实施例中，位点特异性地将酪氨酸工程化改造入蛋白质中。在实施例中，可通过使用促进溶解度的相邻氨基酸残基使酪氨酸可用于(可及)溶液中的试剂。为此目的的非限制性实例可包括小的、柔性的和亲水性的氨基酸，包括甘氨酸、丝氨酸、谷氨酸、天冬氨酸且精氨酸为相容的。
官能化TCO可携带任何分子或多个目标分子，其中例如采用支链的接头。在实施例中，官能化TCO包含蛋白质、第二肽、药物、核酸、寡糖、聚合物、寡聚物、树枝状聚合物、标记物、诊断剂、双功能治疗诊断剂或基质表面，它们中的任一个或多个任选地通过接头附接，其中该接头任选地为支链的。
在实施例中，官能化TCO携带多于一个目标分子。在一些此类实施例中，接头为支链的，且携带蛋白质、肽、药物、核酸、寡糖、聚合物、寡聚物、树枝状聚合物、标记物、诊断剂、双功能治疗诊断剂或基质表面中的两个或多个。在实施例中，支链的接头可包含PABA释放部分。
在实施例中，官能化TCO在实施例中，核酸为RNAi或反义寡核苷酸。
在实施例中，标记物为荧光团、放射性标记物、化学发光标记物、DNA条形码、RNA条形码或肽标签。
在实施例中，基质表面是聚合物珠粒、孔盘的孔底部或聚合物载玻片表面。
在实施例中，提供了式(I)的组合物：
其中P为蛋白质或肽；并且
R包含第二蛋白质、第二肽、药物、核酸、寡糖、聚合物、寡聚体、树枝状聚合物、标记物或基质表面，其中任一者任选地通过接头附接。
在实施例中，P为抗体或抗体片段。在实施例中，P为治疗性抗体。在实施例中，作为非限制性实例，抗体或抗体片段可为曲妥珠单抗(trastuzumab)、维布妥昔单抗(brentuximab)、恩诺单抗(enfortumab)、吉妥珠单抗(gemtuzumab)、奥英妥珠单抗(inotuzumab)、波妥珠单抗(polatuzumab)。其他包括阿昔单抗(abciximab)、雷珠单抗(ranibizumab)、塞妥珠单抗(certolizumab)、阿达木单抗(adalimumab)、阿法西普(alefacept)、阿仑单抗(alemtuzumab)、巴利昔单抗(basiliximab)、贝利尤单抗(belimumab)、贝洛托舒单抗(bezlotoxumab)、卡那单抗(canakinumab)、培塞利珠单抗(certolizumab pegol)、西妥昔单抗(cetuximab)、达利珠单抗(daclizumab)、地诺单抗(denosumab)、依法珠单抗(efalizumab)、戈利木单抗依诺单抗(golimumab)、英夫利昔单抗(inflectra)，伊匹单抗(ipilimumab)、依奇珠单抗(ixekizumab)、那他珠单抗(natalizumab)、纳武单抗(nivolumab)、奥拉单抗(olaratumab)、奥马珠单抗(omalizumab)、帕利珠单抗(palivzumab)、帕尼单抗(panitumumab)、派姆单抗(pembrolizumab)、利妥昔单抗(rituximab)、托珠单抗(tocilizumab)、苏金单抗(secukinumab)、优特克单抗(ustekinymab)。其他还包括阿杜那单抗(aducanumab)、替利组单抗(teplizumab)、多塔利单抗(dostarlimab)、他尼组单抗(tanezumab)、马吉妥昔单抗(margetuximab)、那昔妥单抗(naxitamab)、贝兰妥单抗(belantamab)、莫妥组单抗(oportuzumab monatox)、REGNEB3、纳索利单抗(narsoplimab)、坦昔妥单抗(tafasitamab)、萨特利珠单抗(satralizumab)、伊奈利组单抗(inebilizumab)、乐利单抗(leronlimab)、赛妥珠单抗(sacituzumab)、替妥木单抗(teprotumumab)、艾萨妥昔单抗(isatuximab)、依替尼珠单抗(eptinezumab)、恩诺单抗(enfortumab)、克利组单抗(crizanlizumab)、布洛赛珠单抗(brolucizumab)、瑞莎珠单抗(risankizumab)、罗莫单抗(romosozumab)、卡普赛珠单抗(caplacizumab)、依库珠单抗(ravulizumab)、依帕伐单抗(emapalumab)、西米普利单抗(cemiplimab)、瑞马奈珠单抗(fremanezumab)、帕克莫单抗(moxetumomab)、伽奈珠单抗(galcanezumab)、拉那鲁单抗(lanadelumab)、莫格利珠单抗(mogamuizumab)、厄瑞努单抗(erenumab)、替拉珠单抗(tildrakizumab)、伊巴珠单抗(ibalizumab)、布洛舒单抗(burosumab)、度伐利尤单抗(duravalumab)、艾米珠单抗(emicizumab)、贝那利珠单抗(benralizumab)、奥克立珠单抗(ocrelizumab)、古塞奇尤单抗(guselkumab)、奥英妥珠单抗(inotuzumab)、萨瑞鲁单抗(sarilumab)、度普利尤单抗(dupilumab)、阿维鲁单抗(avelumab)、柏达鲁单抗(brodalumab)、阿替利珠单抗(atezolizumab)、贝洛托舒单抗(bezlotoxumab)、奥拉单抗(olaratumab)、瑞替珠单抗(reslizumab)、奥托萨昔单抗(obiltoxaximab)、伊奇珠单抗(ixekizumab)、达雷妥尤单抗(daratumumab)、埃罗妥珠单抗(elotuzumab)、耐昔妥珠单抗(necitumumab)、艾达赛珠单抗(idarucizumab)、阿莫罗布单抗(alirocumab)、美泊利单抗(mepolizumab)、依洛尤单抗(evolocumab)、地努图希单抗(dinutuximab)、纳武单抗(nivolumab)、博纳吐单抗(blinatumomab)、派姆单抗(pembrolizumab)、雷莫芦单抗(ramucirumab)、维多珠单抗(vedolizumab)、司妥昔单抗(siltuximab)、奥妥珠单抗(obinutuzumab)、雷昔库单抗(raxibacumab)、帕妥珠单抗(pertuzumab)、曲妥珠单抗(adotrastuzumab)、维布妥昔单抗(brentuximab)及贝利尤单抗(belimumab)。
在本实施例中，抗体或抗体片段可用于携带药物有效载荷，其中药物有效载荷通过本文公开的方法缀合。在实施例中，抗体或抗体片段可与促进检测的标记物偶联，例如荧光标记物、放射性标记物、化学发光标记物、DNA条形码、RNA条形码、肽标记物等。
在实施例中，P为酶。在实施例中，P为细胞表面蛋白。在实施例中，P为细胞因子。在实施例中，P为趋化因子。在实施例中，P为蛋白质毒素。在实施例中，P为激素。
在实施例中，R可包括多种不同的分子、部分和化合物。例如，抗体、抗体片段、靶向分子、治疗剂、癌症化学疗法、免疫疗法、标记物、糖、聚合物、聚合物珠粒表面、传感器表面等。
在实施例中，R可包括靶向分子。靶向分子可包括用于任何生物受体(包括细胞表面受体)的任何小分子配体。靶向分子可包括例如RNA、DNA和肽。
在实施例中，R包含治疗剂。此类试剂包括但不限于化学治疗剂、免疫治疗剂例如免疫促效剂、细胞因子和趋化因子以及此类试剂的任何混合物。化学治疗剂可包括抗癌剂。治疗剂还包括抗体、抗体片段、融合蛋白等。
在实施例中，R可包含允许检测的标记物。在实施例中，R包括放射性标记物。在实施例中，R包括荧光标记物。在实施例中，R包括磷光标记物。在实施例中，R包括染料。
在实施例中，R可包含生物分子附着于其上所需的任何表面。在实施例中，R可包含聚合物珠粒。在实施例中，R可包括硅表面或涂覆的硅表面。在实施例中，R可包括玻璃表面。在实施例中，R可包括传感器表面。表面化学在本领域中是众所周知的，并且包括使用氨基硅烷，例如是作为官能团对象。具有适于与常规的表面官能化化学物质缀合的官能团对象(包括醇、羧酸、胺等)的市售TCO是易于获得的。
在实施例中，R包括接头。在实施例中，接头可包含聚乙二醇(PEG)单元。在实施例中，PEG单元的数量可在1个至约50个、或约1个至20个，或约1个至10个之间变化。根据需要，也可根据生物缀合中偶联的实际偶联伴侣P和R的性质使用更长的PEG基。在实施例中，接头可为任何亲水性接头。在实施例中，接头可包含聚合物。在实施例中，接头可包含肽。原则上，接头可为在期望的固定靶与TCO之间允许连接性的任何基团。选择合适接头的因素可包括但不限于空间要求、水溶性和亲水性。
在实施例中，提供了具有式(II)结构的生物缀合组合物：
其中L为接头或键，且X为O、S或NH，并且P和R如上述所定义。
在实施例中，提供了具有式(III)结构的生物缀合组合物：
其中L为接头或键，且X为O、S或NH，并且P和R如上述所定义。
接头L可包括将所需有机部分连接至TCO的有机基团的任何排列。通常，接头可包含1个至20个碳原子，其中任一可被例如O、NH或S的杂原子取代。在实施例中，可将任何有机官能团缀合到接头中，包括上述所定义的有机官能团。非限制性实例包括氨基甲酸酯、酰胺、氧代、脲等。在实施例中，接头可以分支一次、两次或任何期望的次数，以增加经由TCO片段附接的价数(valency)。例如，可使用支链的接头附接多个同样的寡糖或药物。在实施例中，支链的接头可用以经由TCO偶联伴侣递送两个、三个或四个不同的有机部分。
在实施例中，提供了以下抗体缀合物，其是在官能化反式环辛烯(TCO)存在下通过酪氨酸酶对抗体中酚类残基的作用而形成，其中该抗体缀合物在37℃在磷酸盐缓冲盐水中稳定至少一个月。
在实施例中，抗体包含酚类残基，其为酪氨酸。可通过任何方法将酪氨酸掺入抗体，包括例如位点选择工程、天然化学连接、分选酶介导的肽连接、转谷氨酰胺酶介导的肽生物缀合、体外翻译、体内翻译等。例如，参考美国专利第8,030,074号；第8,980,581号；及第9,102,932号；其每篇均全文引入本文作为参考，包括其中的所有方法、试剂、组合物和教导。
在实施例中，可将抗体偶联至包含荧光标记物、放射性标记物等的标记物的官能化TCO。
在实施例中，抗体可与包含药物或其他治疗剂的官能化TCO偶联，所述药物或其他治疗剂包括化学治疗剂、免疫治疗剂及其组合。
在实施例中，提供了以下蛋白质缀合物，其是在官能化反式环辛烯(TCO)存在下通过酪氨酸酶对蛋白质中酚类残基的作用而形成，其中该蛋白质缀合物在37℃于水溶液中稳定至少一个月。在实施例中，水溶液是磷酸盐缓冲盐水。
在实施例中，蛋白质包含酚类残基，其为酪氨酸。
在实施例中，将蛋白质与包含荧光标记物、放射性标记物或类似部分的官能化TCO偶联，以提供对该蛋白质的检测。
在实施例中，将蛋白质与包含药物或其他治疗剂的官能化TCO偶联，所述药物或其他治疗剂包括化学治疗剂、免疫治疗剂及其组合。
在实施例中，将蛋白质与包含寡糖的官能化TCO偶联，以获得糖蛋白结构。
在实施例中，提供了包含具有酚类部分的生物分子、酪氨酸酶和官能化反式环辛烯的混合物。在一些实施例中，混合物包含缓冲液。在实施例中，此类混合物可提供作为实质上含水的混合物。在实施例中，混合物可包含混合的水性/有机溶剂系统。
在实施例中，提供了包含酪氨酸酶和官能化TCO的试剂盒，以及将官能化TCO缀合至生物分子的指示。
IV.缀合方法
在实施例中，提供了以下方法，这些方法包括将官能化反式环辛烯(TCO)加入生物分子中存在的邻醌，从而形成官能化TCO与邻醌的环加合物。
在实施例中，提供了以下方法，这些方法包括提供官能化反式环辛烯(TCO)、将包含酚类部分的蛋白质或肽加入官能化TCO；以及从该酚类部分生成邻醌，其中允许该官能化TCO与邻醌反应以形成环加合物。
在实施例中，方法包括通过酪氨酸酶的作用生成邻醌。在实施例中，方法可包括经由化学氧化生成邻醌。
如本文以下实施例中所述，令人惊讶地显示出TCO是最有效的瞬态邻醌捕获剂，其在不存在亲二烯体捕获剂的情况下易于发生二聚化。在实施例中，该官能化TCO以相对于该蛋白质或肽至少约5倍摩尔过量来使用。在实施例中，该官能化TCO以相对于该蛋白质或肽至少约10倍摩尔过量来使用。在实施例中，该官能化TCO以相对于该蛋白质或肽10倍至50倍摩尔过量来使用。在实施例中，该官能化TCO以相对于该蛋白质或肽5倍至10倍摩尔过量来使用。在实施例中，该官能化TCO以相对于该蛋白质或肽约5倍摩尔过量来使用。
可将任何已知的接头策略与官能化TCO一起使用，以携带官能化TCO货物。有许多可商业地购入的产品在TCO上内置了接头，尤其是聚乙二醇(PEG)接头。在实施例中，可使用包含TCO-PEG-酸的官能化TCO进行该方法，该酸连接至本文所述的任何所需的R部分。
在实施例中，可使用包含TCO-醇的官能化TCO进行该方法，该醇连接至本文所述的任何所需的R部分。
在实施例中，可使用包含TCO-PEG-胺的官能化TCO进行该方法，该胺连接至本文所述的任何所需的R部分。
在实施例中，可使用包含TCO-硫醇或TCO-PEG-硫醇的官能化TCO进行该方法。
在实施例中，可使用包含TCO-PEG-马来酰亚胺的官能化TCO进行该方法。
在实施例中，可使用包含TCO-PEG-OH的官能化TCO进行该方法。
在实施例中，可使用衍生自酪氨酸部分的邻醌进行该方法，该邻醌是通过酪氨酸酶的作用而产生的。
在实施例中，可在蛋白质的C-末端以酪氨酸进行该方法。
在实施例中，可在蛋白质的N-末端以酪氨酸进行该方法。
在实施例中，酪氨酸位于蛋白质序列中可及的内部位置。在实施例中，可掺入额外的氨基酸以提供酪氨酸酶对酪氨酸残基的可及性。
无论酪氨酸在蛋白质中的位置为何，都可采用位点选择性掺入技术。在实施例中，方法可进一步包括以位点特异性酪氨酸残基来工程化改造蛋白质。在实施例中，工程化改造步骤采用定点诱变。在实施例中，可采用半合成方法将酪氨酸掺入包括抗体的蛋白质中。也可使用本文所述的其他技术。
在实施例中，该方法可与作为抗体片段的蛋白质偶联。
在实施例中，该方法可与作为单结构域抗体的蛋白质偶联。
V.实例
一般制程
所有起始材料和溶剂均可从商业来源获得或根据文献引证进行制备。将蒸馏水(内部设施生成)去离子(18MQ)。蘑菇中的酪氨酸酶(T3824)购自Sigma-Aldrich，按收到的原样使用。DBCO-PEG4-酸(BP-23760)，内-BCN-PEG8-酸(BP-23768)和TCO-PEG3-酸(BP-22420)购自Broadpharm，并按收到的原样使用。使用先前描述的表达及纯化方法在大肠杆菌中生成抗体片段。Tesar等人“Protein engineering to increase the potential ofatherapeutic antibody Fab for long-acting delivery to the eye”。MAbs 2017,9(8),1297-1305.
实例1
该实施例示出了在室温下用酪氨酸酶在pH 6缓冲液中处理含有工程化改造过的酪氨酸的人IgG1 Fab，导致快速、瞬态地观察到14Da质量位移，其表明存在邻醌。
已经表明人IgG1框架抗体不含有充分暴露以与酪氨酸酶反应的酪氨酸残基。本实施例采用抗体片段(Fab)作为生物缀合的测试底物。首先研究在没有任何伴侣试剂的情况下酪氨酸酶介导的邻醌生成机制。如图1所示，将1mg/mL含有与C220(EU编号)相邻的Fab的酪氨酸在与在pH 6的5％mol-1的蘑菇酪氨酸酶下培养，得到Fab的质量偏移为14Da，且在480nm处出现明显的UV带，该带被分配给邻醌。反应迅速，且在30分钟内转化率超过80％。在相同条件下，含有以亮氨酸代替酪氨酸的对照底物不会导致质量或UV光谱发生任何变化。通过测量质量和UV光谱的变化，发现在pH 5–7.5形成多巴醌是有效的，这与过去关于酪氨酸酶活性的报告一致。
邻醌产物的形成与两个显著的副反应竞争。首先，发现含多巴醌的Fab形成共价二聚体。二聚体的质量与两个含邻醌的Fab的偶联一致，表明该反应取决于残留的未反应醌。此外，二聚体的UV光谱从瞬态多巴醌(480-500nm)发生了蓝移(至410-420nm)，这表明醌向更像烷基的缀合物消耗。
其次，检测到Fab断裂成较低分子量。片段的质量与在Tyr位点的N-末端侧的酰胺主链上的裂解一致。在较高的pH值下，片段化速度更快，暗示发生去质子化及进行重新排列以消除新的C-末端。如以下另外的实施例中所指出的，可通过包括伴侣试剂以胜过副产物形成以避免该两个反应。
实例2
根据本文的实施例，此实例示出了用应变(strained)的亲二烯体捕获瞬态邻醌。
标准反应条件为50-100μM酪胺酰-Fab，3-10mol equiv.的酪氨酸的亲二烯体mol-1，以及pH 6，1％mol-1的酪氨酸酶。一个具体实例如下：在1.5mL锥形离心管中的Fab-GGY(在20mM，pH 5.0乙酸钠中在4.4mg/mL时，5mg，1.14mL)中添加缓冲液(MES，pH 6.0，在0.5M时133μL)、水(7μL)、TCO-PEG4-酸(在水中，50mM时10.6μL)和酪氨酸酶(在5mg/mL时46.2μL)，从而得到Fab的反应组合物(3.75mg/mL，79.7μM)，5mol.equiv.。TCO(398μM)、缓冲液(50mM)和酪氨酸酶(3.98μM，1％mol-1)。将管密封并在25℃下培养，同时以500RPM涡旋。1.5小时后，按照制造商的步骤方案通过KappaSelect色谱法纯化溶液，浓缩至1.0mL，并用pH7.4(200vol.equiv.)的PBS透析。Fab[M]：起始材料47066.7(计算得出)；47066.9(得到)。产物47498.18(计算得出)；得到47498.24。
在上述条件下，以反式环辛烯(TCO)、双环壬烷(BCN)和二苯并环辛炔(DBCO)作为亲二烯体捕获剂进行反应。TCO、BCN和DBCO试剂对原位生成的多巴醌的产物形成时间过程如图2所示。如图2所示，发现基于TCO的试剂是捕获邻醌的优良的亲二烯体。即使在高浓度的替代性亲二烯体试剂中，产物的产率也不与基于TCO的试剂的产率相匹配。此外，BCN和DBCO试剂会造成大部分的未反应邻醌(图2B列)，从而导致Fab二聚体的形成(图2C列)；只需50mol当量的TCO足够迅速地反应以避免这种副产物。对于与瞬态生成的邻醌快速地未充分反应的亲二烯体，除了所需的产物外，还有很大一部分的二聚体或未反应的醌。
图3的从上至下的光谱呈现：起始材料(含有C末端“DRY”肽标签的Fab)；在反应时间一小时后的反应混合物，其呈现在M+432Da处(对应于+O、–H2的14Da及TCO-PEG4-COOH试剂的428Da)形成缀合产物；在反应时间16小时后的反应混合物，其展示产率约为91％，从KappaSelect亲和性管柱以pH 2.7洗脱后的纯化池，及在PBS中配制的最终产物。
亲和性层析后，配制每种缀合物，并在单纯的水溶液系统(PBS pH 7.4,37℃)中施加应力。在游离Fab和任何释放的小分子之后，通过LCMS监测解除缀合来确定稳定性。在这些温和条件下，TCO试剂的缀合物似乎是无限稳定的。在长达90天的任何时间点都未观察到基于TCO的缀合物的后续修饰或解除缀合。图4A-B呈现了由酪氨酸酶介导的生物缀合形成的Diels-Alder环加合物在数个月的过程中对在pH 7.4、37℃的PBS中经工程化改造显示C末端肽卷标的Fab的三个变体的稳定性，该标签为：DRY、DRGY和GGY。在每种情况下，缀合物均由对应于O原子增加(16Da)、H2损失(–2Da)和TCO亲二烯体(TCO-PEG4-羧酸，417.5)的质量增加的质量位移组成；计算出的总质量位移为431.5Da。对于Fab–GGY，发现M+431.5；对于Fab-DRY，发现M+431.6；对于Fab-DRGY，发现431.7。每种Fab–TCO-PEG4-COOH缀合物均以PBS配制为5mg/mL，并通过0.22μm的注射器式过滤器在组织培养罩中灭菌。将容器在环境条件下密封，并在37℃下保存。在每个指定的时间点，从容器中取出一份等分样品，并通过LCMS分析其解除缀合。剩余的缀合物量计算为解卷积质量峰丰度的百分比。左窗格(图4A)示出了为Fab-DRY蛋白质记录的LCMS光谱。缀合MW和Fab起始材料MW的峰丰度基本保持不变，但是Fab片段的丰度增加约1％，与失去C末端Tyr残基相对应(计算为M-163.5，发现M-163.6)。右窗格(图4B)是三个经工程化改造的缀合的Fab在每个时间点剩余的缀合物量的总整理。
图5示出了基于图4的试剂生成的时间过程：近端Arg导致更快的初始速率(1小时)和更高的总产率。这样可将缀合效率从77％提高到92.5％。
缀合反应规模较大，在1mol％酪氨酸酶，5mol equiv TCO，80uM酪氨酸(Fab)反应条件下观察到良好的效能。令人惊讶的是，具有相邻(DRY)或紧密(DRGY)精氨酸的标签提供了更高的缀合效率。不受理论的束缚，Arg可能活化/稳定化瞬态邻醌，从而导致更高的产率。GGY、DRGY和DRY各自的t＝1h和t＝16h的并排时点表明速率/产率趋势保持不变。因此，在实施例中，任何蛋白质(否则为抗体)可在酪氨酸残基的相邻或附近掺入精氨酸以提高产率。
尽管出于清楚理解的目的已经通过图示和实施例的方式对前述发明进行了详细描述，但是本领域的技术人员将理解，可以在所附权利要求的范围内进行某些改变和修改。另外，本文提供的每个参考文献通过引用整体并入本文，其程度与每个参考文献通过引用单独并入的程度相同。在本申请与本文提供的参考文献之间存在冲突的情况下，以本申请为准。
Claims (68)
1.一种组合物，其包含官能化反式环辛烯(TCO)与邻醌的环加合物，其中所述邻醌存在于生物分子中。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述生物分子为蛋白质或肽。
3.根据权利要求1所述的组合物，其中所述生物分子为寡糖。
4.根据权利要求1所述的组合物，其中所述生物分子为经修饰的DNA或RNA。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的组合物，其中所述邻醌来源于含酚部分。
6.根据权利要求5所述的组合物，其中所述含酚部分为酪氨酸。
7.根据权利要求6所述的组合物，其中将所述酪氨酸位点特异性地工程化改造至蛋白质中。
8.根据权利要求5所述的组合物，其中所述含酚部分为儿茶酚。
9.根据权利要求5所述的组合物，其中当所述生物分子为寡糖时，所述寡糖在其还原末端具有含酚部分。
10.根据权利要求1所述的组合物，其中所述官能化TCO包含蛋白质、第二肽、药物、核酸、寡糖、聚合物、寡聚物、树枝状聚合物、标记物、诊断剂、双功能治疗诊断剂或基质表面，它们中的任何一种或多种任选地通过接头附接，其中所述接头任选地为支链的。
11.根据权利要求10所述的组合物，其中所述接头为支链的，且携带蛋白质、肽、药物、核酸、寡糖、聚合物、寡聚物、树枝状聚合物、标记物、诊断剂、双功能治疗诊断剂或基质表面中的两者或更多者。
12.根据权利要求10所述的组合物，其中所述核酸为RNAi或反义寡核苷酸。
13.根据权利要求10所述的组合物，其中所述标记物为荧光团、放射性标记物、化学发光标记物、DNA条形码、RNA条形码或肽标签。
14.根据权利要求10所述的组合物，其中所述基质表面为聚合物珠粒、孔盘的孔底部或聚合物载玻片表面。
15.一种式(I)的组合物：
其中P为蛋白质或肽；并且
R包含第二蛋白质、第二肽、药物、核酸、寡糖、聚合物、寡聚物、树枝状聚合物、标记物或基质表面，它们中的任何一种任选地通过接头附接。
16.根据权利要求15所述的组合物，其中P为抗体。
17.根据权利要求15所述的组合物，其中P为抗体片段。
18.根据权利要求15所述的组合物，其中P为酶。
19.根据权利要求15所述的组合物，其中P为细胞表面蛋白。
20.根据权利要求15所述的组合物，其中P为细胞因子。
21.根据权利要求15所述的组合物，其中P为趋化因子。
22.根据权利要求15所述的组合物，其中P为蛋白质毒素。
23.根据权利要求15所述的组合物，其中P为激素。
24.根据权利要求15至23中任一项所述的组合物，其中R包含抗体。
25.根据权利要求15至23中任一项所述的组合物，其中R包含靶向分子。
26.根据权利要求15至23中任一项所述的组合物，其中R包含治疗剂。
27.根据权利要求15至23中任一项所述的组合物，其中R包含放射性标记物。
28.根据权利要求15至23中任一项所述的组合物，其中R包含荧光标记物。
29.根据权利要求15至23中任一项所述的组合物，其中R包含磷光标记物。
30.根据权利要求15至23中任一项所述的组合物，其中R包含染料。
31.根据权利要求15至23中任一项所述的组合物，其中R包含聚合物珠粒。
32.根据权利要求15至23中任一项所述的组合物，其中R包含传感器表面。
33.根据权利要求15至32中任一项所述的组合物，其中R包含接头。
34.根据权利要求33所述的组合物，其中所述组合物具有式(II)的结构：
其中L为接头或键，且X为O、S或NH。
35.根据权利要求33所述的组合物，其中所述组合物具有式(III)的结构：
其中L为接头或键，且X为O、S或NH。
36.一种方法，其包括：
将官能化反式环辛烯(TCO)加至存在于生物分子中的邻醌，从而形成所述官能化TCO与所述邻醌的环加合物。
37.一种方法，其包括：
提供官能化反式环辛烯(TCO)；
将包含酚类部分的蛋白质或肽加至所述官能化TCO；以及
由所述酚类部分生成邻醌，其中允许所述官能化TCO与所述邻醌反应以形成环加合物。
38.根据权利要求36或37所述的方法，其中所述邻醌是通过酪氨酸酶的作用而产生的。
39.根据权利要求36至38中任一项所述的方法，其中所述官能化TCO以相对于所述蛋白质或肽至少约10倍摩尔过量来使用。
40.根据权利要求36至38中任一项所述的方法，其中所述官能化TCO以相对于所述蛋白质或肽10倍至50倍摩尔过量来使用。
41.根据权利要求36至40中任一项所述的方法，其中所述官能化TCO包含TCO-PEG-酸。
42.根据权利要求36至40中任一项所述的方法，其中所述官能化TCO包含TCO-醇。
43.根据权利要求36至40中任一项所述的方法，其中所述官能化TCO包含TCO-PEG-胺。
44.根据权利要求36至40中任一项所述的方法，其中所述官能化TCO包含TCO-胺。
45.根据权利要求36至40中任一项所述的方法，其中所述官能化TCO包含TCO-硫醇或TCO-PEG-硫醇。
46.根据权利要求36至40中任一项所述的方法，其中所述官能化TCO包含TCO-PEG-马来酰亚胺。
47.根据权利要求36至40中任一项所述的方法，其中所述官能化TCO包含TCO-PEG-OH。
48.根据权利要求36至47中任一项所述的方法，其中所述邻醌来源于酪氨酸部分。
49.根据权利要求36至48中任一项所述的方法，其进一步包括将蛋白质工程化改造为具有位点特异性酪氨酸残基。
50.根据权利要求49所述的方法，其中工程化改造步骤采用定点诱变。
51.根据权利要求48或50所述的方法，其中掺入额外的氨基酸以通过所述酪氨酸酶提供对所述酪氨酸残基的可及性。
52.根据权利要求37至51中任一项所述的方法，其中所述酪氨酸在所述蛋白质的C-末端。
53.根据权利要求37至51中任一项所述的方法，其中所述酪氨酸在所述蛋白质的N-末端。
54.根据权利要求37至51中任一项所述的方法，其中所述酪氨酸位于蛋白质序列中可及的内部位置。
55.根据权利要求37至53中任一项所述的方法，其中所述蛋白质为抗体片段。
56.根据权利要求37至53中任一项所述的方法，其中所述蛋白质为单结构域抗体。
57.一种抗体缀合物，其是在官能化反式环辛烯(TCO)存在下通过酪氨酸酶对抗体中酚类残基的作用而形成，其中所述抗体缀合物在37℃在磷酸盐缓冲盐水中稳定至少一个月。
58.根据权利要求57所述的抗体缀合物，其中所述酚类残基为酪氨酸。
59.根据权利要求57或58所述的抗体缀合物，其中所述官能化TCO包含荧光标记物。
60.根据权利要求57或58所述的抗体缀合物，其中所述官能化TCO包含放射性标记物。
61.根据权利要求57或58所述的抗体缀合物，其中所述官能化TCO包含药物。
62.一种蛋白质缀合物，其是在官能化反式环辛烯(TCO)存在下通过酪氨酸酶对蛋白质中酚类残基的作用而形成，其中所述蛋白质缀合物在37℃在磷酸盐缓冲盐水中稳定至少一个月。
63.根据权利要求62所述的蛋白质缀合物，其中所述酚类残基为酪氨酸。
64.根据权利要求62或63所述的蛋白质缀合物，其中所述官能化TCO包含荧光标记物。
65.根据权利要求62或63所述的蛋白质缀合物，其中所述官能化TCO包含放射性标记物。
66.根据权利要求62或63所述的蛋白质缀合物，其中所述官能化TCO包含药物。
67.根据权利要求62或63所述的蛋白质缀合物，其中所述官能化TCO包含寡糖。
68.一种混合物，其包含：
具有酚类部分的生物分子；
酪氨酸酶；以及
官能化反式环辛烯。
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