TW202207988A - 用於酪胺酸酶媒介的位點特異性蛋白質結合的系統及方法 - Google Patents
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Abstract
本公開提供生物分子與官能化的反式環辛烯 (TCO) 的生物結合。
Description
本公開提供生物分子與官能化的反式環辛烯 (TCO) 的生物結合。
對天然胺基酸的位點特異性生物結合仍然是對化學家的挑戰。通常很難用化學試劑從類似的鄰近物識別如離胺酸、天冬胺酸及麩胺酸等表面豐富的胺基酸；除了在極少數情況下，胺基酸側鏈的官能基團壓倒了空間或電子局部環境中任何可導致單個位點的反應動力學增強的細微變化。相反地，在蛋白質表面上安裝很少發現的胺基酸（特別為半胱胺酸）可提供位點選擇性，其可以用於位點特異性化學反應。
藉由酶達到類似的特異性，其已進化為在獨特的空間和電子環境中分離官能基團。許多酶與胺基酸側鏈反應。它們可用於安裝或移除如磷酸鹽、聚醣或脂質等轉譯後修飾。對於生物結合而言，這些酶中有用的亞型是用於組織交聯者，因為其是胺基酸序列特異性的。蛋白質化學家在轉麩醯胺酸酶 (TG)、甲醯甘胺酸生成酶 (FGE)、轉肽酶、磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶 (PPTase) 及漆酶等情況下利用了此特性。通過重組安裝藉由酶識別的胺基酸可實現位點特異性反應。酪胺酸酶也屬於此類酶。
酪胺酸酶將酪胺酸分兩步驟氧化為二羥苯丙胺酸
(DOPA)，接著氧化為 DOPA 的鄰醌（多巴醌）。在自然界中，多巴醌既是真黑色素 (eumelanin) 的前驅物，亦是與半胱胺酸、黑色素 (pheomelanin)、芳香族皮膚及毛髮色素聚合物結合使用的前驅物；在實驗室中，科學家可利用這種反應來修飾重組蛋白。酪胺酸酶僅識別酪胺酸的酚側鏈，並且能將其轉化為鄰醌，而無需側翼胺基酸的特異性。重要的是，酪胺酸很少見於蛋白質表面；在這種少數情況下，其側鏈往往會被疏水性堆積所阻塞。這造成使酚充分地延伸以到達酪胺酸酶的活性位點的酪胺酸殘基很少。對此，有安裝酪胺酸殘基並實現位點特異性蛋白質修飾的可能。此方法已用於多種實例，包括藉由 Diels-Alder 環加成反應對細胞毒性貨物進行結合、對 Cas9 進行蛋白質-蛋白質結合以及對苯胺的氧化偶聯進行分析。
儘管在結合方面取得了這些進展，但是產率和結合產物的穩定性仍然是生物分子結合中的問題。本公開提供滿足這些和其他需求的實施例。
在實施例中，提供了包括官能化的反式環辛烯 (TCO) 與鄰醌的環加合物的組成物，其中鄰醌存在於生物分子中。
在實施例中，提供了式 (I) 的組成物：
(I)
其中 P 為蛋白質或胜肽，且 R 包含第二蛋白質、第二胜肽、藥物、核酸、寡醣、聚合物、寡聚物、樹枝狀聚合物、標記或基材表面，其中任何者視情況通過連接子附接。
在實施例中，提供了以下方法，方法包含將官能化的反式環辛烯 (TCO) 加入生物分子中存在的鄰醌，從而形成官能化的 TCO 與鄰醌的環加合物。
在實施例中，提供了以下方法，方法包含提供官能化的反式環辛烯 (TCO)、將包含酚類部分的蛋白質或胜肽加入官能化的 TCO；以及從該酚類部分生成鄰醌，其中該官能化的 TCO 是被容許與鄰醌反應以形成環加合物。
在實施例中，提供了以下抗體結合體，其是在官能化的反式環辛烯 (TCO) 存在下藉由酪胺酸酶對抗體中酚類殘基的作用而形成，其中該抗體結合體在 37℃ 於磷酸鹽緩衝生理食鹽水中可穩定至少一個月。
在實施例中，提供了以下蛋白質結合體，其是在官能化的反式環辛烯 (TCO) 存在下藉由酪胺酸酶對蛋白質中酚類殘基的作用而形成，其中該蛋白質結合體在 37℃ 於磷酸鹽緩衝生理食鹽水中可穩定至少一個月。
在實施例中，提供了包含具有酚類部分的生物分子、酪胺酸酶及官能化的反式環辛烯的混合物。
相關申請案的交叉引用
本申請主張 2020 年 5 月 5 日遞交之美國臨時申請 63/020,405 的優先權，並且將其整體內容通過引用併入本申請案。I. 一般
本公開涉及生物結合反應，其藉由從酪胺酸殘基或相似的酚類部分以酶促生成反應性鄰醌中間體來提供蛋白質的位點特異性修飾。如本文所公開的，酶促生成的鄰醌與如環辛炔和環辛烯的親二烯體快速地反應。儘管結合加合物的產率和結合體在生理 pH 及溫度下的穩定性可變動，但本實施例已經找到了瞬態鄰醌的可用反應配對物 (partner)，其提供良好的結合體產率，且在生理條件下長時間穩定。II. 定義
除非另有具體表示，否則本文所用之全部技術及科學術語係與具有本發明所屬領域之普通技術人員通常理解者相同含義。另外，與本文描述的方法或材料相似或等同的任何方法或材料都可以用於本發明的實施中。為了本發明的目的，定義以下術語。
如本文所使用的「一個」、「一種」或「該」不僅包括具有一個成員的方面，而且還包括具有一個以上成員的方面。例如，除非上下文另外明確指示，否則單數形式「一 (a、an)」及「該 (the)」包括複數個提及物。因此，例如，對「一個細胞」的提及包括多個此類細胞，而對「藥劑」的提及包括對本領域技術人員已知的一種或多種藥劑的提及，以此類推。
「烷基」是指具有所示碳原子數的直鏈或支鏈的飽和脂族基團。烷基可以包括任何數量的碳，例如 C1‑2
、C1‑3
、C1‑4
、C1‑5
、C1‑6
、C1‑7
、C1‑8
、C1‑9
、C1‑10
、C2‑3
、C2‑4
、C2‑5
、C2‑6
、C3‑4
、C3‑5
、C3‑6
、C4‑5
、C4‑6
及 C5‑6
。例如，C1‑6
烷基包括但不限於甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、二級‑丁基、三級‑丁基、戊基、異戊基、己基等。烷基也可以指具有高達 20 個碳原子的烷基基團，例如但不限於庚基、辛基、壬基、癸基等。烷基基團可為取代的或未取代的。
「伸烷基 (Alkylene)」是指具有所示碳原子數（即 C1-6
表示 1 個至 6 個碳原子）的直鍊或支鏈的飽和脂族基團，並且連接至少兩個其他基團，即二價烴基團。連接至伸烷基的兩個部分可連接至伸烷基基團的相同原子或不同原子。例如，直鏈伸烷基可為 ‑(CH2
)n
‑
的二價基團，其中 n 為 1、2、3、4、5 或 6。代表性的 C1-4
伸烯基 (alkenylene) 基團包括但不限於亞甲基、伸乙基、伸丙基、異伸丙基、伸丁基、異伸丁基及仲‑伸丁基。
「烯基 (Alkenyl)」是指具有至少 2 個碳原子及至少一個雙鍵的直鍊或支鏈烴。烯基可包括任何數量的碳，例如 C2
、C2‑3
、C2‑4
、C2‑5
、C2‑6
、C2‑7
、C2‑8
、C2‑9
、C2‑10
、C3
、C3‑4
、C3‑5
、C3‑6
、C4
、C4‑5
、C4‑6
、C5
、C5‑6
及 C6
。烯基基團可具有任何合適數量的雙鍵，包括但不限於 1 個、2 個、3 個、4 個、5 個或更多。烯基基團的實例包括但不限於乙烯基 (vinyl)（乙烯基 (ethenyl)）、正丙烯基、異丙烯基、1‑丁烯基、2‑丁烯基、異丁烯基、丁二烯基、1‑戊烯基、2‑戊烯基、異戊烯基，1,3‑戊二烯基、1,4‑戊二烯基、1‑己烯基、2‑己烯基、3‑己烯基、1,3‑己二烯基、1,4‑己二烯基、1,5‑己二烯基、2,4‑己二烯基或 1,3,5‑己三烯基。烯基基團可為取代的或未取代的。
「炔基 (Alkynyl)」是指具有至少 2 個碳原子及至少一個三鍵的直鍊或支鏈烴。炔基可包含任何數量的碳，例如 C2
、C2‑3
、C2‑4
、C2‑5
、C2‑6
、C2‑7
、C2‑8
、C2‑9
、C2‑10
、C3
、C3‑4
、C3‑5
、C3‑6
、C4
、C4‑5
、C4‑6
、C5
、C5‑6
及 C6
。炔基基團的實例包括但不限於乙炔基、丙炔基、1‑丁炔基、2‑丁炔基、丁二炔基、1‑戊炔基、2‑戊炔基、異戊炔基、1,3‑戊二炔基、1,4‑戊二炔基、1‑己炔基、2‑己炔基、3‑己炔基、1,3‑己二炔基、1,4‑己二炔基、1,5‑己二炔基、2,4‑己二炔基或 1,3,5‑己三炔基。炔基基團可為取代的或未取代的。
「烷氧基 (Alkoxy)」是指具有氧原子的烷基基團，該氧原子將烷基基團連接到附接點：烷基 -O-。作為烷基基團，烷氧基基團可具有任何合適數量的碳原子，例如 C1‑6
。烷氧基基團包括例如甲氧基、乙氧基、正丙氧基、異‑丙氧基、正丁氧基、2‑丁氧基、異‑丁氧基、仲‑丁氧基、叔‑丁氧基、戊氧基、己氧基等。烷氧基基團可進一步被其中所述的各種取代基取代。烷氧基基團可為取代的或未取代的。
「烷氧基-烷基 (Alkoxy-alkyl)」是指具有烷基成分及烷氧基成分的基團，其中烷基成分將烷氧基成分連接至附接點。烷基成分如上文所定義，不同之處在於烷基成分為至少二價的伸烷基，以連接至烷氧基成分及附接點。烷基成分可包括任何數量的碳，例如 C1‑6
、C1‑2
、C1‑3
、C1‑4
、C1‑5
、C1‑6
、C2‑3
、C2‑4
、C2‑5
、C2‑6
、C3‑4
、C3‑5
、C3‑6
、C4‑5
、C4‑6
及 C5‑6
。在某些實例中，可不存在烷基成分。烷氧基成分如上文所定義。烷基-烷氧基基團的實例包括但不限於 2-乙氧基-乙基及甲氧基甲基。
「羥烷基 (Hydroxyalkyl)」或「烷羥基 (alkylhydroxy)」是指如上所定義的烷基基團，其中至少一個氫原子被羥基基團取代。作為烷基基團，羥烷基或烷羥基基團可具有任何合適數量的碳原子，例如 C1
-6
。示例性的 C1-4
羥烷基基團包括但不限於羥甲基、羥乙基（其中羥基位於 1‑位或 2‑位）、羥丙基（其中羥基位於 1‑位、2‑位或 3‑位）、羥丁基（其中羥基位於1‑位、2‑位、3‑位或 4‑位）、1,2‑二羥乙基等。
「鹵素 (Halogen)」是指氟、氯、溴及碘。
「鹵代烷基 (Haloalkyl)」是指如上所定義的烷基的其中一些或全部氫原子被鹵素原子取代。作為烷基，鹵代烷基基團可具有任何合適數量的碳原子，例如 C1‑6
。例如，鹵代烷基包括三氟甲基、氟甲基等。在某些實例中，術語「全氟 (perfluoro)」可用於定義其中所有氫均被氟取代的化合物或基團。例如，全氟甲基是指 1,1,1‑三氟甲基。
「鹵代烷氧基 (Haloalkoxy)」是指其中一些或全部氫原子被鹵素原子取代的烷氧基基團。作為烷基基團，鹵代烷氧基基團可具有任何合適數量的碳原子，例如 C1‑6
。烷氧基基團可被 1 個、2 個、3 個或更多個鹵素取代。當所有氫被鹵素，例如被氟取代時，化合物被全‑取代，例如全氟化。鹵代烷氧基包括但不限於三氟甲氧基、2,2,2‑三氟乙氧基、全氟乙氧基等。
「胺基 (Amino)」是指 ‑N(R)2
基團，其中 R 基團可為氫、烷基、烯基、炔基、環烷基、雜環烷基、芳基或雜芳基等。R 基團可以為相同或不同。胺基基團可以為一級（每個 R 都是氫）、二級（一個 R 是氫）或三級基（每個 R 都不是氫）。
「烷基胺 (Alkylamine)」是指如本文所定義的具有一個或多個胺基基團的烷基基團。胺基基團可為一級、二級或三級。烷基胺可進一步被羥基基團取代以形成胺基-羥基基團。可用於本發明的烷基胺包括但不限於乙胺、丙胺、異丙胺、乙二胺及乙醇胺。胺基基團可將烷基胺與化合物剩餘部分的附接點連接，可在烷基基團的亞米茄 (omega) 位置，或可將烷基基團的至少兩個碳原子連接在一起。本領域技術人員將理解，其他烷基胺可用於本發明。
「雜烷基 (Heteroalkyl)」是指任何具合適的長度並且具有 1 個至 3 個雜原子如 N、O 及 S 的烷基基團。雜烷基基團具有所示的碳原子數量，其中至少一個非端末碳被雜原子代替。其他雜原子也可為有用的，包括但不限於 B、Al、Si 及 P。雜原子也可以被氧化，例如但不限於 ‑S(O)‑ 及 ‑S(O)2
‑。例如，雜烷基可包括醚、硫醚及烷基‑胺。雜烷基基團不包括過氧化物 (-O-O-) 或其他連續地連接的雜原子。雜烷基的雜原子部分可以取代烷基基團的氫以形成羥基、硫基或胺基基團。可選地，雜原子部分可以連接原子，或被插入兩個碳原子之間。
「環烷基 (Cycloalkyl)」是指含有 3 個至 12 個環原子或所示原子數的飽和或部分不飽和的單環、稠合雙環或橋聯多環的環組合。環烷基可包括任何數量的碳，例如 C3‑6
、C4‑6
、C5‑6
、C3‑8
、C4‑8
、C5‑8
、C6‑8
、C3‑9
、C3‑10
、C3‑11
及 C3‑12
。飽和的單環環烷基環包括例如環丙基、環丁基、環戊基、環己基及環辛基。飽和的雙環及多環環烷基環包括例如降莰烷、[2.2.2] 雙環辛烷、十氫萘及金剛烷。環烷基基團也可為部分不飽和的，在環中具有一個或多個雙鍵或三鍵。部分不飽和的代表性環烷基包括但不限於環丁烯、環戊烯、環己烯、環己二烯（1,3- 及 1,4-異構物）、環庚烯、環庚二烯、環辛烯、環辛二烯（1,3-、1,4- 及 1,5-異構物）、降莰烯及降莰二烯。當環烷基是飽和的單環 C3‑8
環烷基時，示例性基團包括但不限於環丙基、環丁基、環戊基、環己基、環庚基及環辛基。當環烷基是飽和的單環 C3‑6
環烷基時，示例性基團包括但不限於環丙基、環丁基、環戊基及環己基。環烷基可為取代的或未取代的。
「烷基-環烷基 (Alkyl-cycloalkyl)」是指具有烷基成分及環烷基成分的基團，其中烷基成分將環烷基成分連接至附接點。烷基成分如上文所定義，不同之處在於烷基成分為至少二價的伸烷基，以連接至環烷基成分及附接點。在某些實例中，可不存在烷基成分。烷基成分可包括任何數量的碳，例如 C1‑6
、C1‑2
、C1‑3
、C1‑4
、C1‑5
、C2‑3
、C2‑4
、C2‑5
、C2‑6
、C3‑4
、C3‑5
、C3‑6
、C4‑5
、C4‑6
及 C5‑6
。環烷基成分如其中所定義。示例性的烷基-環烷基包括但不限於甲基-環丙基、甲基-環丁基、甲基-環戊基及甲基-環己基。
「雜環烷基 (Heterocycloalkyl)」是指具有 3 個至 12 個環成員及 1 個至 5 個 N、O 及 S 雜原子的飽和環系統。雜原子也可以被氧化，例如但不限於 ‑S(O)‑ 及 ‑S(O)2
‑。雜環烷基可包含任意數量的環原子，例如 3 個至 6 個、4 個至 6 個、5 個至 6 個、3 個至 8 個、4 個至 8 個、5 個至 8 個、6 個至 8 個、3 個至 9 個、3 個至 10 個、3 個至 11 個或 3 個到 12 個環成員。雜環烷基中可包括任何合適數量的雜原子，例如 1 個、2 個、3 個、4 個或 5 個、或 1 個至 2 個、1 個至 3 個、1 個至 4 個、1 個至 5 個、2 個至 3 個、2 個至 4 個、2 個至 5 個、3 個至 4 個或 3 個至 5 個。雜環烷基可包括任何數量的碳，例如 C3‑6
, C4‑6
、C5‑6
、C3‑8
、C4‑8
、C5‑8
、C6‑8
、C3‑9
、C3‑10
、C3‑11
及 C3‑12
。雜環烷基可包括諸如氮丙啶、吖呾、吡咯啶、哌啶、吖𠰢、二吖𠰢 (diazepane)、七甲亞胺 (azocane)、口昆啶、吡唑啶、咪唑啶、哌𠯤（1,2-、1,3- 及 1,4-異構物）、環氧乙烷、氧呾、四氫呋喃、環氧乙烷 (oxane)（四氫哌喃）、環氧己烷 (oxepane)、硫環丙烷、硫環丁烷，噻吩 (thiolane)（四氫噻吩 (tetrahydrothiophene)）、硫化環戊烷 (thiane)（硫化環戊烷 (tetrahydrothiopyran)）、㗁唑啶、異㗁唑啶、四氫噻唑、異四氫噻唑 (isothiazolidine)、二氧戊環 (dioxolane)、二噻𠷬、嗎啉 (morpholine)、硫代嗎啉 (thiomorpholine)、二㗁烷 (dioxane) 或二硫環己烷。雜環烷基也可與芳香族或非芳香族環系統稠合以形成成員，成員包括但不限於二氫吲哚、二氮雜雙環庚烷 (diazabicycloheptane)、二氮雜雙環辛烷 (diazabicyclooctane)、二氮雜螺辛烷 (diazaspirooctane)或二氮雜螺乙酮 (diazaspirononane)。雜環烷基可為未取代的或取代的。例如，雜環烷基可被 C1‑6
烷基或側氧基 (=O) 等取代。雜環烷基還可包括雙鍵或三鍵，例如但不限於二氫吡啶 (dihydropyridine) 或 1,2,3,6-四氫吡啶。
雜環烷基可以經由環上的任何位置連接。例如，氮丙啶可為 1- 或 2-氮丙啶，吖呾可為 1- 或 2-吖呾，吡咯啶可為 1-、2- 或 3-吡咯啶，哌啶可為 1-、2-、3- 或 4-哌啶，吡唑啶可為 1-、2-、3- 或 4-吡唑啶，咪唑啶可為 1-、2-、3- 或 4-咪唑啶，哌𠯤可為 1-、2-、3- 或 4-哌𠯤，四氫呋喃可為 1- 或 2-四氫呋喃，㗁唑啶可為 2-、3-、4- 或 5-㗁唑啶，異㗁唑啶可為 2-、3-、4- 或 5-㗁唑啶，四氫噻唑可為 2-、3-、4- 或 5-四氫噻唑，異四氫噻唑可為 2-、3-、4- 或 5-四氫噻唑，嗎啉可為 2-、3- 或 4-嗎啉。
當雜環烷基包含 3 個至 8 個環成員及 1 個至 3 個雜原子時，代表性的成員包括但不限於吡咯啶、哌啶、四氫呋喃、環氧乙烷、四氫噻吩、噻吩、吡唑啶、咪唑啶、哌𠯤、㗁唑啶，異㗁唑啶、四氫噻唑、異四氫噻唑、嗎啉、硫代嗎啉、二㗁烷及二硫環己烷。雜環烷基還可形成具有 5 個至 6 個環成員及 1 個至 2 個雜原子的環，代表性的成員包括但不限於吡咯啶、哌啶、四氫呋喃、四氫噻吩、吡唑啶、咪唑啶、哌𠯤、㗁唑啶、異㗁唑啶、四氫噻唑、異四氫噻唑及嗎啉。
「芳基 (Aryl)」是指具有任何合適數量的環原子和任何合適數量的環的芳香族環系統。芳基可包括任何合適數量的環原子，例如 6 個、7 個、8 個、9 個、10 個、11 個、12 個、13 個、14 個、15 個或 16 個環原子，以及 6 個至 10 個、6 個至 12 個或 6 個至 14 個環成員。芳基可為單環的、稠合形成雙環或三環的基團或藉由鍵連接以形成聯芳基。代表性的芳基包括苯基、萘基及聯苯基。其他芳基包括具有亞甲基連接物基團的芐基。一些芳基具有 6 個至 12 個環成員，例如苯基，萘基或聯苯基。其他芳基具有 6 個至 10 個環成員，例如苯基或萘基。一些其他的芳基具有 6 個環成員，例如苯基。芳基可為取代的或未取代的。
「雜芳基 (Heteroaryl)」是指含有 5 個至 16 個環原子的單環或稠合的雙環或三環芳族環組合，其中 1 個至 5 個環原子是例如 N、O 或 S 的雜原子。雜原子也可以被氧化，例如但不限於 ‑S(O)‑ 及 ‑S(O)2
‑。雜芳基可包括任意數量的環原子，例如 5 個至 6 個、3 個至 8 個、4 個至 8 個、5 個至 8 個、6 個至 8 個、3 個至 9 個、3 個至 10 個、3 個至 11 個或 3 個至 12 個環成員。雜芳基中可包括任何合適數量的雜原子，例如 1 個、2 個、3 個、4 個或 5 個、或 1 個至 2 個、1 個至 3 個、1 個至 4 個、1 個至 5 個、2 個至 3 個、2 個至 4 個、2 個至 5 個、3 個至 4 個或 3 個至 5 個。雜芳基可具有 5 個至 8 個環成員及 1 個至 4 個雜原子、或 5 個至 8 個環成員及 1 個至 3 個雜原子、或 5 個至 6 個環成員及 1 個至 4 個雜原子或 5 個至 6 個環成員及 1 個至 3 個雜原子。雜芳基可包括如以下的基團：吡咯、吡啶、咪唑、吡唑、三唑、四唑、吡𠯤、嘧啶、嗒𠯤、三𠯤的基團（1,2,3-、1,2,4- 及 1,3,5-異構物）、噻吩、呋喃、噻唑、異噻唑、㗁唑及異㗁唑。雜芳基也可以稠合到芳香族環系統例如苯環上，以形成包括但不限於苯駢吡咯例如吲哚及異吲哚、苯并吡啶例如喹啉及異喹啉、苯并吡𠯤（喹㗁啉）、苯并嘧啶（喹唑啉）、苯并嗒𠯤例如呔𠯤及㖕啉、苯并噻吩及苯并呋喃。其他雜芳基包括通過鍵連接的雜芳環，例如聯吡啶。雜芳基可為取代的或未取代的。
雜芳基可經由環上的任何位置連接。例如，吡咯包括 1-、2- 及 3-吡咯，吡啶包括 2-、3- 及 4-吡啶，咪唑包括 1-、2-、4- 及 5-咪唑，吡唑包括 1-、3-、4- 及 5-吡唑，三唑包括 1-、4- 及 5-三唑，四唑包括 1- 及 5-四唑，嘧啶包括 2-、4-、5- 及 6-嘧啶，嗒𠯤包括 3- 及 4-嗒𠯤，1,2,3-三𠯤包括 4- 及 5-三𠯤，1,2,4-三𠯤包括 3-、5- 及 6-三𠯤，1,3,5-三𠯤包括 2-三𠯤，噻吩包括 2- 及 3-噻吩，呋喃包括 2- 及 3-呋喃，噻唑包括 2-、4- 及 5-噻唑，異噻唑包括 3-、4- 及 5-異噻唑，㗁唑包括 2-、4- 及 5-㗁唑，異㗁唑包括 3-、4- 及 5-異㗁唑，吲哚包括 1-、2- 及 3-吲哚，異吲哚包括 1- 及 2-異吲哚，喹啉包括 2-、3- 及 4-喹啉，異喹啉包括 1-、3- 及 4-異喹啉，喹唑啉包括 2- 及 4-喹唑啉，㖕啉包括 3- 及 4-㖕啉，苯并噻吩包括 2- 及 3-苯并噻吩，苯并呋喃包括 2- 及 3-苯并呋喃。
一些雜芳基包括具有 5 個至 10 個環成員及 1 個至 3 個包括 N、O 或 S 的環原子者，例如吡咯、吡啶、咪唑、吡唑、三唑、吡𠯤，嘧啶，嗒𠯤、三𠯤（1,2,3-、1,2,4- 及 1,3,5-異構物）、噻吩、呋喃、噻唑、異噻唑、㗁唑、異㗁唑、吲哚、異吲哚、喹啉、異喹啉、喹㗁啉、喹唑啉、呔𠯤、㖕啉、苯并噻吩和苯并呋喃。其他雜芳基包括具有 5 個至 8 個環成員及 1 個至 3 個雜原子者，例如吡咯、吡啶、咪唑、吡唑、三唑、吡𠯤、嘧啶、嗒𠯤、三𠯤（1,2,3-、1,2,4- 及 1,3,5-異構物）、噻吩、呋喃、噻唑、異噻唑、㗁唑及異㗁唑。一些其他雜芳基包括具有 9 個至 12 個環成員及 1 個至 3 個雜原子者，例如吲哚、異吲哚、喹啉、異喹啉、喹㗁啉、喹唑啉、呔𠯤、㖕啉、苯并噻吩、苯并呋喃和聯吡啶。其他雜芳基包括具有 5 個至 6 個環成員及具有 1 個至 2 個包括包括 N、O 或 S 的環原子者，例如吡咯、吡啶、咪唑、吡唑、吡𠯤、嘧啶、嗒𠯤、噻吩、呋喃、噻唑、異噻唑、㗁唑及異㗁唑。
術語「多肽 (polypeptide)」、「胜肽 (peptide)」及「蛋白質 (protein)」在本文可互換使用以指胺基酸殘基的聚合物，其中該聚合物可在實施例中與不由胺基酸組成的部分結合。該等術語適用於胺基酸聚合物，其一個或多個胺基酸殘基是對應天然存在的胺基酸的人工化學模擬物，以及天然存在的胺基酸聚合物和非天然存在的胺基酸聚合物。「融合蛋白」涉及編碼兩個或更多個分開的蛋白序列的嵌合蛋白，該等兩個或更多個分開的蛋白序列重組表現為單個部分。
術語「胺基酸 (amino acid)」是指天然地存在及合成的胺基酸，以及以類似於天然存在的胺基酸的方式作用的胺基酸類似物及胺基酸擬物。天然存在的胺基酸是藉由基因密碼編碼的胺基酸，以及後續經修飾的那些胺基酸，例如羥脯胺酸、γ-羧基穀氨酸及 O-磷絲胺酸。胺基酸類似物是指具有與天然存在的胺基酸相同的基本化學結構的化合物，亦即，與氫、羧基、胺基及 R 基團（例如高絲胺酸、正白胺酸、甲硫胺酸硫氧化物、磺酸甲基甲硫胺酸）結合的 α 碳。此類類似物具有經修飾的 R 基團（例如正白胺酸）或經修飾的胜肽主鏈，但是保留了與天然存在的胺基酸相同的基本化學結構。胺基酸模擬物涉及具有與胺基酸一般化學結構不同的結構但以相似天然存在的胺基酸的方式作用的化合物。術語「非天然存在的胺基酸」和「非天然胺基酸」涉及在自然界中不存在的胺基酸類似物、合成胺基酸和胺基酸模擬物。
如本文所用，術語「抗體 (antibody)」是指由免疫球蛋白基因或其功能性片段編碼的多肽，其特異性地結合並識別抗原。公認的免疫球蛋白基因包括 κ(kappa)、λ(lambda)、α(alpha)、γ(gamma)、δ(delta)、ε(epsilon)及μ(mu) 恆定區基因，以及無數的免疫球蛋白變異區基因。輕鏈分為 κ 或 λ。重鏈被分類為 γ、μ、α、δ 或 ε，其依次分別定義了免疫球蛋白類別，IgG、IgM、IgA、IgD 及 IgE。
當短語「特異性地（或選擇性地）結合」至抗體或「特異性地（或選擇性地）與其發生免疫反應」指蛋白質或胜肽時，是指確定蛋白質存在的結合反應，通常是在蛋白質和其他生物製劑的異質群體。因此，在指定的免疫測定條件下，指定的抗體與特定蛋白質的結合至少是背景的兩倍，更通常是背景的 10 到 100 倍以上。在此類條件下與抗體的特異性結合需要選擇針對特定蛋白質具有特異性的抗體。例如，可選擇多克隆抗體以僅獲得與所選抗原而非其他蛋白質發生特異性免疫反應的抗體的子集。該選擇可通過減去與其他分子交叉反應的抗體來實現。可使用各種免疫測定形式來選擇與特定蛋白質發生特異性免疫反應的抗體。例如，常規地，使用固相 ELISA 免疫測定來選擇與蛋白質發生特異性免疫反應的抗體（請參閱例如 Harlow & Lane, Using Antibodies, A Laboratory Manual (1998) 之可用於確定特異性免疫反應性的免疫測定形式及條件的描述）。
如本文所用，術語「抗體片段 (antibody fragment)」是指抗體的一部分。抗體功能性片段的實例包括但不限於完整抗體分子、抗體片段，例如 Fv、單鏈 Fv (scFv)、互補決定區 (CDR)、VL（輕鏈變異區）、VH（重鏈變異區）、Fab、F(ab)2’ 以及能夠結合靶抗原的免疫球蛋白肽者或任何其他功能性部分的任何組合（參閱，例如，FUNDAMENTAL IMMUNOLOGY (Paul ed., 4th ed. 2001)）。如本領域技術人員所理解的，可藉由各種方法獲得各種抗體片段，例如，用如胃蛋白酶的酶消化完整的抗體；或從頭合成 (de novo) 等。抗體片段通常是化學地或利用重組 DNA 方法學從頭合成的。因此，如本文所用，術語「抗體」包括藉由完整抗體的修飾生成的抗體片段、或使用重組 DNA 方法學（例如單鏈 Fv）從頭合成者、或使用噬菌體顯示資料庫鑑定者（McCafferty et al. 等人, (1990) Nature 348:552）。術語「抗體 (antibody)」還包括二價或雙特異性分子、雙鏈抗體 (diabodies)、三鏈抗體 (triabodies) 及四鏈抗體 (tetrabodies)。二價和雙特異性分子描述於例如 Kostelny 等人 (1992) J. Immunol. 148:1547, Pack and Pluckthun (1992) Biochemistry 31:1579, Hollinger 等人 (1993), PNAS.USA 90:6444, Gruber 等人 (1994) J Immunol. 152:5368, Zhu 等人 (1997) Protein Sci. 6:781, Hu 等人 (1996) Cancer Res. 56:3055, Adams 等人 (1993) Cancer Res. 53:4026, and McCartney, 等人 (1995) Protein Eng. 8:301。
如本文所用，術語「環加合物 (cycloadduct)」是指所公開的瞬態鄰醌及官能化的 TCO 親二烯體捕獲劑之間的 [4 + 2] Diels-Alder 反應的產物。
如本文所用，術語「官能化的反式環辛烯 (functionalizedtrans
-cycloöctene)」或「官能化的 TCO」是指帶有功能性部分的任何 TCO，其可包括有機官能基對象 (handle)、連接子、目標有機化合物及其組合。官能化的 TCO 包括包含 PEG 連接子者，儘管可使用任何連接子。官能化的 TCO 可以商業地購得（例如 Broadpharm, Click Chemistry Tools, Jena Bioscience）或通過合成製備。
如本文所用，術語「生物分子 (biomolecule)」是指胺基酸、蛋白質、胜肽、寡醣、單醣、胺基酸、包括 RNA 及 DNA 的核酸中的任何一種。
如本文所用，術語「經修飾的 DNA 或 RNA」是指包含修飾以結合入 (incorporate) 酚類殘基從而允許與酪胺酸酶反應的任何核酸。
如本文所用，術語「連接子 (linker)」是指將本文所公開之 TCO 與目標化合物連接以如本文所公開之與酪胺酸酶生成的鄰醌偶聯的任何有機片段。在實施例中，連接子是親水的，儘管不限於此。連接子可包括具有一個或多個被雜原子如 O、N 或 S 取代的碳原子的烷基鏈。連接子可包括本文上述定義的任何有機官能基。
如本文所用，術語「核酸 (nucleic acid)」是指核苷酸單體的單股及雙股聚合物，包括藉由核苷酸間磷酸二酯鍵連接或核苷酸間類似物連接的 2'-去氧核糖核苷酸 (DNA) 及核糖核苷酸 (RNA)，以及相關的相對離子例如 H+
、NH4 +
、三烷基銨、四烷基銨、Mg2+
、Na+
等。核酸包括多核苷酸及寡核苷酸。核酸可完全由去氧核糖核苷酸、完全由核糖核苷酸或其嵌合混合物組成。核苷酸單體單元可包括天然地存在的核苷酸及核苷酸類似物。核酸的大小範圍可從幾個單體單元（例如 5-40）至數千個單體核苷酸單元。核酸包括但不限於基因體 DNA、cDNA、hnRNA、mRNA、rRNA、tRNA、RNAi、反義核酸、片段化核酸、從亞細胞器如線粒體或葉綠體獲得的核酸、以及從可能存在於生物樣品上或生物樣品中的微生物或 DNA 病毒或 RNA 病毒獲得的核酸。III. 結合體
在實施例中，提供了包含官能化的反式環辛烯 (TCO) 與鄰醌的環加合物的組成物，其中鄰醌存在於生物分子中。在實施例中，藉由以下化學方程式 (I) 提供通用反應：
(I)
在方程式 (I) 中，A 是在任何生物分子的框架內的鄰醌（鄰醌 (o
-quinone)），如下文所述。瞬態中間體 A 與官能化的 TCO B 反應形成環加合物 C。在實施例中，中間體 A 藉由酪胺酸酶對生物分子中含酚殘基的作用而形成。在實施例中，含酚殘基可為胺基酸酪胺酸。在實施例中，含酚殘基可為兒茶酚。在實施例中，瞬態鄰醌 A 也可以藉由化學反應代替酶促氧化生成。該化學反應包括但不限於碘醯基苯甲酸、氧化銀、弗氏鹽 (Fremy’s salt)、K3
Fe(CN)6
、過碘酸鈉等的氧化。如化學方程式 (I) 中所示，該化學反應通常旨在通過該 [4+2] 環加成反應，亦即 Diels Alder 反應，將任何兩個成分偶聯。
在實施例中，生物分子可以包括脂質、碳水化合物、核酸、蛋白質或任何其他生物材料。
在實施例中，生物分子是脂質，其可包括例如磷脂、神經脂質、甘油脂如三酸甘油酯、游離脂肪酸、脂肪醇、固醇等。儘管脂質結構有所變化，但其通常都包含足夠的官能基對象 (handle) 以用於附接 4-羥芐醚基團，以生成可從其生成鄰醌的偶聯配對物。在必需的酚類前驅物如脂質的極性首基 (polar head) 處附著的情況下，可在脂質和酚之間使用連接子。該連接子可具有與極性首基相同的一般化學特徵（亦即，通常是親水的）。此類連接子可包括例如小的聚乙二醇單元。
在實施例中，生物分子是碳水化合物，例如糖、澱粉或纖維素材料。在實施例中，碳水化合物可為例如單醣或寡醣。在實施例中，此類基於糖的受質可終止於含酚的醣苷。舉例而言，此類寡醣可由以下式 A 表示：
A
其中「糖」是任何單醣或寡醣（此處通常用葡萄糖單元繪製，但旨在表示任何單醣或寡醣）； X 為 O 或 NH；且 R1
及 R2
獨立地選自羧酸、酯、烷基及氫。在實施例中，R1
及 R2
兩者皆為氫。在實施例中，R1
為氫且 R2
為羧酸或其酯類。在實施例中，生物分子為寡醣，該寡醣在其還原端具有含酚部分。在實施例中，單醣或寡醣不必限於在還原糖端末附接。因此，在實施例中，可將糖的任何期望位置上的任何 4-羥芐醚（或兒茶酚同樣地）作為安裝鄰醌前驅物的目標。示例性的寡醣可包括但不限於透明質酸、藻酸鹽、肝素及硫酸肝素 (heparain sulfate)。
在實施例中，生物分子為核酸，例如，經修飾的或未經修飾的 DNA 或 RNA。此類經修飾的結構之組態可以結合入酚類殘基。結合入可包括使用可從多個供應商處商業地購得的顯示 5’ 或 3’ 胺基的核酸，並使用水性醯胺偶聯條件以 3-（4-羥苯基）丙酸官能化。在實施例中，經修飾的 DNA 或 RNA 可為雙股或單股的。
在實施例中，生物分子為胜肽或蛋白質。例如，作為非限制性實例，胜肽或蛋白質可為酶、細胞表面蛋白、細胞介素、趨化介素、蛋白質毒素或激素。在實施例中，生物分子可為抗體或抗體片段。在實施例中，抗體可為單克隆或多克隆抗體。在實施例中，抗體為單克隆抗體。
在實施例中，鄰醌可衍生自含酚部分。在實施例中，含酚部分是酪胺酸。在實施例中，含酚部分是兒茶酚。在實施例中，含酚部分是 4-羥烷酚 (4-hydroxyalkyl phenol) 殘基。在實施例中，含酚部分可由以下式 (B) 表示：
B
其中「生物分子 (biomolecule)」為如本文所定義；X 為 O 或 NH； Y 為 H 或 OH；R1
及 R2
獨立地選自羧酸、酯、烷基及氫。
在實施例中，位點特異性地將酪胺酸工程處理入蛋白質中。在實施例中，可藉由使用促進溶解度的相鄰胺基酸殘基使酪胺酸可用於（可及）溶液中的試劑。為此目的之非限制性實例可包括小的、可撓性的及親水性的胺基酸，包括甘胺酸、絲胺酸、麩胺酸、天冬胺酸且精胺酸為相容的。
官能化的 TCO 可攜帶任何分子或多個目標分子，其中例如採用支鏈的連接子。在實施例中，官能化的 TCO 包含蛋白質、第二胜肽、藥物、核酸、寡醣、聚合物、寡聚物、樹枝狀聚合物、標記、診斷劑、雙功能治療診斷劑或基材表面，其中的任一個或多個視情況通過連接子附接，其中該連接子視情況為支鏈的。
在實施例中，官能化的 TCO 攜帶多於一個目標分子。在一些此類實施例中，連接子為支鏈的，且攜帶蛋白質、胜肽、藥物、核酸、寡醣、聚合物、寡聚物、樹枝狀聚合物、標記、診斷劑、雙功能治療診斷劑或基材表面中的兩個或多個。在實施例中，支鏈的連接子可包含 PABA 釋放部分。
在實施例中，官能化的 TCO 在實施例中，核酸為 RNAi 或反義寡核苷酸。
在實施例中，標記為螢光團、放射性標記、化學發光標記、DNA 條碼、RNA 條碼或胜肽標籤。
在實施例中，基材表面是聚合物珠、孔盤的孔底部或聚合物載片表面。
在實施例中，提供了式 (I) 的組成物：
(I)
其中 P 為蛋白質或胜肽；並且
R 包含第二蛋白質、第二胜肽、藥物、核酸、寡醣、聚合物、寡聚物、樹枝狀聚合物、標記或基材表面，其中任一者視情況通過連接子附接。
在實施例中，P 為抗體或抗體片段。在實施例中，P為治療性抗體。在實施例中，作為非限制性實例，抗體或抗體片段可為曲司珠單抗 (trastuzumab)、布倫妥昔單抗 (brentuximab)、恩妥單抗 (enfortumab)、吉妥珠單抗 (gemtuzumab)、奧英妥珠單抗 (inotuzumab)、維泊妥組單抗 (polatuzumab)。其他包括阿昔單抗 (abciximab)、雷尼單抗 (ranibizumab)、塞妥珠單抗 (certolizumab)、阿達木單抗 (adalimumab)、阿法西普 (alefacept)、阿崙單抗 (alemtuzumab)、巴厘昔單抗 (basiliximab)、貝利木單抗 (belimumab)、貝司洛托珠單抗 (bezlotoxumab)、卡那基單抗 (canakinumab)、塞妥珠單抗聚乙二醇 (certolizumab pegol)、西妥昔單抗 (cetuximab)、達利珠單抗 (daclizumab)、地諾單抗 (denosumab)、依法珠單抗 (efalizumab)、戈利木單抗依諾單抗 (golimumab)、inflectra，伊匹單抗 (ipilimumab)、伊凱珠單抗 (ixekizumab)、那他珠單抗 (natalizumab)、納武單抗 (nivolumab)、奧拉木單抗 (olaratumab)、奧馬珠單抗 (omalizumab)、帕利珠單抗 (palivzumab)、帕尼單抗 (panitumumab)、派姆單抗 (pembrolizumab)、利妥昔單抗 (rituximab)、托珠單抗 (tocilizumab)、蘇金單抗 (secukinumab)、優特克單抗 (ustekinymab)。其他還包括阿杜卡人單抗 (aducanumab)、替利珠單抗 (teplizumab)、多塔利單抗 (dostarlimab)、他尼珠單抗 (tanezumab)、馬吉妥昔單抗 (margetuximab)、那昔妥單抗 (naxitamab)、貝蘭妥單抗 (belantamab)、莫奧珠單抗 (oportuzumab monatox)、REGNEB3、納索利單抗 (narsoplimab)、坦昔妥單抗 (tafasitamab)、薩特利珠單抗 (satralizumab)、伊奈利組單抗 (inebilizumab)、樂利單抗 (leronlimab)、沙西妥組單抗 (sacituzumab)、替妥木單抗 (teprotumumab)、艾沙妥昔單抗 (isatuximab)、艾普奈組單抗 (eptinezumab)、維恩妥人單抗 (enfortumab)、克利組單抗 (crizanlizumab)、布西組單抗 (brolucizumab)、利生奇組單抗 (risankizumab)、羅莫組單抗 (romosozumab)、卡拉西組單抗 (caplacizumab)、瑞利珠單抗 (ravulizumab)、伊馬利人單抗 (emapalumab)、西普利單抗 (cemiplimab)、夫瑞奈組單抗 (fremanezumab)、派克莫單抗 (moxetumomab)、伽奈珠單抗 (galcanezumab)、拉那蘆人單抗 (lanadelumab)、莫加木珠單抗 (mogamuizumab)、埃崙單抗(erenumab)、替拉珠單抗(tildrakizumab)、伊巴珠單抗 (ibalizumab)、布羅索人單抗 (burosumab)、度伐利尤單抗 (duravalumab)、艾美賽珠單抗 (emicizumab)、貝那利珠單抗 (benralizumab)、奧瑞珠單抗 (ocrelizumab)、古賽庫人單抗 (guselkumab)、奧英妥珠單抗 (inotuzumab)、薩瑞魯單抗 (sarilumab)、杜比單抗 (dupilumab)、阿維魯單抗 (avelumab)、布羅達單抗 (brodalumab)、阿妥珠單抗 (atezolizumab)、貝司洛托珠單抗 (bezlotoxumab)、奧拉木單抗 (olaratumab)、瑞利珠單抗 (reslizumab)、奧必托昔單抗 (obiltoxaximab)、伊凱珠單抗 (ixekizumab)、達拉他單抗 (daratumumab)、依洛珠單抗 (elotuzumab)、耐昔妥珠單抗 (necitumumab)、伊達組單抗 (idarucizumab)、阿利羅庫單抗 (alirocumab)、美泊珠單抗 (mepolizumab)、伊伏洛單抗 (evolocumab)、達妥昔單抗 (dinutuximab)、納武單抗 (nivolumab)、蘭妥莫單抗 (blinatumomab)、派姆單抗 (pembrolizumab)、雷莫昔單抗 (ramucirumab)、維多珠單抗 (vedolizumab)、西妥昔單抗 (siltuximab)、奧比妥珠單抗 (obinutuzumab)、雷昔庫單抗 (raxibacumab)、帕妥珠單抗 (pertuzumab)、阿多曲妥珠單抗 (adotrastuzumab)、布倫妥昔單抗 (brentuximab) 及貝利木單抗 (belimumab)。
在本實施例中，抗體或抗體片段可用於攜帶藥物有效載荷，其中藥物有效載荷通過本文公開的方法結合。在實施例中，抗體或抗體片段可與促進檢測的標記偶聯，例如熒光標記、放射性標記、化學發光標記、DNA 條碼、RNA 條碼、胜肽標籤等。
在實施例中，P 為酶。在實施例中，P 為細胞表面蛋白。在實施例中，P 為細胞介素。在實施例中，P 為趨化介素。在實施例中，P 為蛋白質毒素。在實施例中，P 為激素。
在實施例中，R 可包括多種不同的分子、部分及化合物。例如，抗體、抗體片段、靶向分子、治療劑、癌症化學療法、免疫療法、標記、糖、聚合物、聚合物珠表面、感測器表面等。
在實施例中，R 可包括靶向分子。靶向分子可包括用於任何生物受體（包括細胞表面受體）的任何小分子配體。靶向分子可包括例如 RNA、DNA 及胜肽。
在實施例中，R 包含治療劑。此類試劑包括但不限於化學治療劑、免疫治療劑例如免疫促效劑、細胞介素和趨化介素以及此類試劑的任何混合物。化學治療劑可包括抗癌劑。治療劑還包括抗體、抗體片段、融合蛋白等。
在實施例中，R 可包含允許檢測的標記。在實施例中，R 包括放射性標記。在實施例中，R 包括螢光標記。在實施例中，R 包括磷光標記。在實施例中，R 包括染料。
在實施例中，R 可包含生物分子附著於其上所需的任何表面。在實施例中，R 可包含聚合物珠。在實施例中，R 可包括矽表面或塗覆的矽表面。在實施例中，R 可包括玻璃表面。在實施例中，R 可包括感測器表面。表面化學在本領域中是眾所周知的，並且包括使用胺基矽烷，例如是作為官能基對象。具有適於與常規的表面官能化化學物質結合之官能基對象（包括醇、羧酸、胺等）的市售 TCO 是易於獲得的。
在實施例中，R 包括連接子。在實施例中，連接子可包含聚乙二醇 (PEG) 單元。在實施例中，PEG 單元的數量可在 1 個至約 50 個、或約 1 個至 20 個，或約 1 個至 10 個之間變化。根據需要，也可根據生物結合中偶聯的實際偶聯配對物 P 及 R 的性質使用更長的 PEG 基。在實施例中，連接子可為任何親水性連接子。在實施例中，連接子可包含聚合物。在實施例中，連接子可包含胜肽。原則上，連接子可為在期望之固定靶與 TCO 之間允許連接性的任何基團。選擇合適連接子的因素可包括但不限於空間要求、水溶性及親水性。
在實施例中，提供了具有式 (II) 結構的生物結合組成物：
(II)；
其中 L 為連接子或鍵結，且 X 為 O、S 或 NH，並且 P 及 R 如上述所定義。
[0079]
在實施例中，提供了具有式 (III) 結構的生物結合組成物：
(III)；
其中 L 為連接子或鍵結，且 X 為 O、S 或 NH，並且 P 及 R 如上述所定義。
連接子 L 可包括將所需有機部分連接至 TCO 的有機基團的任何排列。通常，連接子可包含 1 個至 20 個碳原子，其中任一可被例如 O、NH 或 S 的雜原子取代。在實施例中，可將任何有機官能基結合到連接子中，包括上述所定義的有機官能基。非限制性實例包括胺甲酸酯、醯胺、側氧基、脲等。在實施例中，連接子可以分支一次、兩次或任何期望的次數，以增加經由 TCO 片段附接者的價數 (valency)。例如，可使用支鏈的連接子附接多個同樣的寡醣或藥物。在實施例中，支鏈的連接子可用以經由 TCO 偶聯配對物遞送兩個、三個或四個不同的有機部分。
在實施例中，提供了以下抗體結合體，其是在官能化的反式環辛烯 (TCO) 存在下藉由酪胺酸酶對抗體中酚類殘基的作用而形成，其中該抗體結合體在 37℃ 於磷酸鹽緩衝生理食鹽水中可穩定至少一個月。
在實施例中，抗體包含酚類殘基，其為酪胺酸。可藉由任何方法將酪胺酸結合入抗體，包括例如位點選擇工程、天然化學連接、轉肽酶媒介的胜肽連接、轉麩醯胺酸酶媒介的胜肽生物結合、體外轉譯、體內轉譯等。例如，參考美國專利第 8,030,074 號；第 8,980,581 號；及第 9,102,932 號；其每篇均全文引入本文作為參考，包括其中的所有方法、試劑、組成物及教示。
在實施例中，可將抗體偶聯至包含螢光標記、放射性標記等之標記的官能化的 TCO。
在實施例中，抗體可與包含藥物或其他治療劑之官能化的 TCO 偶聯，所述藥物或其他治療劑包括化學治療劑、免疫治療劑及其組合。
在實施例中，提供了以下蛋白質結合體，其是在官能化的反式環辛烯 (TCO) 存在下藉由酪胺酸酶對蛋白質中酚類殘基的作用而形成，其中該蛋白質結合體在 37℃ 於水溶液中可穩定至少一個月。在實施例中，水溶液是磷酸鹽緩衝生理食鹽水。
在實施例中，蛋白質包含酚類殘基，其為酪胺酸。
在實施例中，將蛋白質與包含螢光標記、放射性標記或類似部分之官能化的 TCO 偶聯，以提供對該蛋白質的檢測。
在實施例中，將蛋白質與包含藥物或其他治療劑之官能化的 TCO 偶聯，所述藥物或其他治療劑包括化學治療劑、免疫治療劑及其組合。
在實施例中，將蛋白質與包含寡醣的官能化之 TCO 偶聯，以獲得醣蛋白結構。
在實施例中，提供了包含具有酚類部分的生物分子、酪胺酸酶及官能化的反式環辛烯的混合物。在一些實施例中，混合物包含緩衝液。在實施例中，此類混合物可提供作為實質上含水的混合物。在實施例中，混合物可包含混合的水性 / 有機溶劑系統。
在實施例中，提供了包含酪胺酸酶及官能化的 TCO 的套組，以及將官能化的 TCO 結合至生物分子的指示。IV. 結合方法
在實施例中，提供了以下方法，方法包含將官能化的反式環辛烯 (TCO) 加入生物分子中存在的鄰醌，從而形成官能化的 TCO 與鄰醌的環加合物。
在實施例中，提供了以下方法，方法包含提供官能化的反式環辛烯 (TCO)、將包含酚類部分的蛋白質或胜肽加入官能化的 TCO；以及從該酚類部分生成鄰醌，其中該官能化的 TCO 是被容許與鄰醌反應以形成環加合物。
在實施例中，方法包括藉由酪胺酸酶的作用生成鄰醌。在實施例中，方法可包含經由化學氧化生成鄰醌。
如本文以下實施例中所述，令人驚訝地顯示出 TCO 是最有效的瞬態鄰醌捕獲劑，其在不存在親二烯體捕獲劑的情況下易於發生二聚作用。在實施例中，該官能化的 TCO 以相對於該蛋白質或胜肽至少約 5 倍莫耳過剩的形式使用。在實施例中，該官能化的 TCO 以相對於該蛋白質或胜肽至少約 10 倍莫耳過剩的形式使用。在實施例中，該官能化的 TCO 以相對於該蛋白質或胜肽 10 倍至 50 倍莫耳過剩的形式使用。在實施例中，該官能化的 TCO 以相對於該蛋白質或胜肽 5 倍至 10 倍莫耳過剩的形式使用。在實施例中，該官能化的 TCO 以相對於該蛋白質或胜肽約 5 倍莫耳過剩的形式使用。
可將任何已知的連接子策略與官能化的 TCO 一起使用，以攜帶官能化的 TCO 貨物。有許多可商業地購入的產品在 TCO 上建置了連接子，尤其是聚乙二醇 (PEG) 連接子。在實施例中，可使用包含 TCO-PEG-酸的官能化的 TCO 進行該方法，該酸連接至本文所述的任何所需的 R 部分。
在實施例中，可使用包含 TCO-醇的官能化的 TCO 進行該方法，該醇連接至本文所述的任何所需的 R 部分。
在實施例中，可使用包含 TCO-PEG-胺的官能化的 TCO 進行該方法，該胺連接至本文所述的任何所需的 R 部分。
在實施例中，可使用包含 TCO-硫醇或 TCO-PEG-硫醇的官能化的 TCO 進行該方法。
在實施例中，可使用包含 TCO-PEG-順丁烯二醯亞胺的官能化的 TCO 進行該方法。
在實施例中，可使用包含 TCO-PEG-OH 的官能化的 TCO 進行該方法。
在實施例中，可使用衍生自酪胺酸部分的鄰醌進行該方法，該鄰醌是藉由酪胺酸酶的作用而生成的。
在實施例中，可在蛋白質的 C-端末以酪胺酸進行該方法。
在實施例中，可在蛋白質的 N-端末以酪胺酸進行該方法。
在實施例中，酪胺酸位於蛋白質序列中可及的內部位置。在實施例中，可進一步結合入其他胺基酸以提供酪胺酸酶對酪胺酸殘基的可及性。
無論酪胺酸在蛋白質中的位置為何，都可採用位點選擇性結合入技術。在實施例中，方法可進一步包括以位點特異性酪胺酸殘基工程處理蛋白質。在實施例中，工程處理步驟採用定點誘變。在實施例中，可採用半合成方法將酪胺酸結合入包括抗體的蛋白質中。也可使用本文所述的其他技術。
在實施例中，該方法可與作為抗體片段的蛋白質偶聯。
在實施例中，該方法可與作為單結構域抗體的蛋白質偶聯。V. 實例 一般製程
所有起始材料及溶劑均可從商業來源獲得或根據文獻引證進行製備。將蒸餾水（內部設施生成）去離子 (18 MQ)。蘑菇中的酪胺酸酶 (T3824) 購自Sigma-Aldrich，按收到的原樣使用。DBCO-PEG4
-酸 (BP-23760)，內-BCN-PEG8
-酸 (BP-23768) 及 TCO-PEG3
-酸 (BP-22420) 購自 Broadpharm，並按收到的原樣使用。使用先前描述的表現及純化方法在大腸桿菌中生成抗體片段。Tesar 等人“ Protein engineering to increase the potential of a therapeutic antibody Fab for long-acting delivery to the eye”。MAbs
2017, 9 (8), 1297-1305.實例 1
該實施例顯示了在室溫下用酪胺酸酶在 pH 6 緩衝液中處理含有工程處理過的酪胺酸的人類 IgG1 Fab，導致快速、瞬態地觀察到 14 Da 質量位移，其表明存在鄰醌。
已經表明人 IgG1 框架抗體不含有充分暴露以與酪胺酸酶反應的酪胺酸殘基。本實施例採用抗體片段 (Fab) 作為生物結合的測試受質。首先研究在沒有任何配對物試劑的情況下酪胺酸酶媒介的鄰醌生成機轉。如圖 1 所示，將 1 mg/mL 含有與 C220 (EU 編號) 相鄰的 Fab 的酪胺酸在與 在 pH 6 的 5% mol-1
的蘑菇酪胺酸酶下培養，得到 Fab 的質量偏移為 14 Da，且在 480 nm 處出現明顯的 UV 帶，該帶被分配給鄰醌。反應迅速，且在 30 分鐘內轉化率超過 80%。在相同條件下，含有以白胺酸代替酪胺酸的對照受質不會導致質量或 UV 光譜發生任何變化。藉由測量質量及 UV 光譜的變化，發現在 pH 5–7.5 形成多巴醌是有效的，這與過去關於酪胺酸酶活性的報告一致。
鄰醌產物的形成與兩個顯著的副反應競爭。首先，發現含多巴醌的 Fab 形成共價二聚體。二聚體的質量與兩個含鄰醌的 Fab 的偶聯一致，表明該反應取決於殘留的未反應醌。此外，二聚體的 UV 光譜從瞬態多巴醌 (480-500 nm) 發生了藍移（至 410-420 nm），這表明醌向更像烷基的結合體消耗。
其次，檢測到 Fab 斷裂成較低分子量。片段的質量與在 Tyr 位點的 N-端側的醯胺主鏈上的裂解一致。在較高的 pH 值下，片段化速度更快，暗示發生去質子化及進行重新排列以消除新的 C-端。如以下另外的實施例中所指出的，可通過包括配對物試劑以勝過副產物形成以避免該兩個反應。實例 2
根據本文的實施例，此實例顯示了用變形 (strained) 的親二烯體捕獲瞬態鄰醌。
標準反應條件為 50-100 µM 酪胺醯-Fab，3-10 mol equiv. 的酪胺酸的親二烯體 mol-1
，以及 pH 6，1% mol-1
的酪胺酸酶。一個具體實例如下：在 1.5 mL 錐形離心管中的 Fab-GGY（在 20 mM，pH 5.0 乙酸鈉中在 4.4 mg/mL 時，5 mg，1.14 mL）中添加緩衝液（MES，pH 6.0，在 0.5 M 時 133 µL）、水 (7 µL)、TCO-PEG4
-酸（在水中，50 mM 時 10.6 µL）及酪胺酸酶（在 5 mg/mL 時 46.2 µL），從而得到 Fab 的反應組成物 (3.75 mg/mL，79.7 µM)，5 mol. equiv.。TCO (398 µM)、緩衝液 (50 mM) 及酪胺酸酶 (3.98 µM，1% mol-1
)。將管密封並在 25℃ 下培養，同時以 500 RPM 渦旋。1.5 小時後，按照製造商的步驟方案藉由 KappaSelect 層析法純化溶液，濃縮至 1.0 mL，並用 pH 7.4(200 vol. equiv.) 的 PBS 透析。Fab [M]：起始材料 47066.7（計算得出）；47066.9（得到）。產物 47498.18（計算得出）；得到 47498.24。
在上述條件下，以反式環辛烯 (TCO)、雙環壬烷 (BCN) 及二苯並環辛炔 (DBCO) 作為親二烯體捕獲劑進行反應。TCO、BCN 及 DBCO 試劑對原位生成的多巴醌的產物形成時程如圖 2 所示。如圖 2 所示，發現基於 TCO 的試劑是捕獲鄰醌的優良的親二烯體。即使在高濃度的替代性親二烯體試劑中，產物的產率也不與基於 TCO 的試劑的產率相匹配。此外，BCN 及 DBCO 試劑會造成依大部分的未反應鄰醌（圖 2B 列），從而導致 Fab 二聚體的形成（圖 2C 列）；只需 50 mol 當量的 TCO 足夠迅速地反應以避免這種副產物。對於與瞬態生成的鄰醌快速地未充分反應的親二烯體，除了所需的產物外，還有很大一部分的二聚體或未反應的醌。
圖 3 的從上至下的光譜呈現：起始材料（含有 C 端“DRY”胜肽標籤的 Fab）；在反應時間一小時後的反應混合物，其呈現在 M+432 Da 處（對應於 +O、–H2
的 14 Da 及 TCO-PEG4
-COOH 試劑的 428 Da）形成結合產物；在反應時間 16 小時後的反應混合物，其展示產率約為 91%，從 KappaSelect 親和性管柱以 pH 2.7 洗脫後的純化池，及在 PBS 中配製的最終產物。
親和性層析後，配製每種結合體，並在單純的水溶液系統 (PBS pH 7.4, 37℃) 中施加應力。在游離 Fab 及任何釋放的小分子之後，藉由 LCMS 監測解除結合來確定穩定性。在這些溫和條件下，TCO 試劑的結合體似乎是無限穩定的。在長達 90 天的任何時間點都未觀察到基於 TCO 的結合體的後續修飾或解除結合。圖圖 4A-B 呈現了由酪胺酸酶媒介的生物結合形成的 Diels-Alder 環加合物在數個月的過程中對在 pH 7.4、37℃的 PBS 中經工程處理顯示 C 端胜肽標籤之 Fab 的三個變體的穩定性，該標籤為：DRY、DRGY 及 GGY。在每種情況下，結合體均由對應於O
原子增加 (16 Da)、H2
損失 (–2 Da) 及 TCO 親二烯體（TCO-PEG4
-羧酸，417.5）的質量增加的質量位移組成；計算出的總質量位移為 431.5 Da。對於 Fab–GGY，發現 M+431.5；對於 Fab-DRY，發現 M+431.6；對於 Fab-DRGY，發現 431.7。每種 Fab–TCO-PEG4
-COOH 結合體均以 PBS 配製為 5 mg/mL，並藉由 0.22 μm 的注射器過濾器在組織培養台中滅菌。將容器在環境條件下密封，並在 37℃ 下保存。在每個指定的時間點，從容器中取出一份等分試樣，並藉由 LCMS 分析其解除結合。剩餘的結合體量計算為解卷積質量峰豐度的百分比。左窗格（圖 4A）呈現了為 Fab-DRY 蛋白質記錄的 LCMS 譜。結合 MW 及 Fab 起始材料 MW 的峰豐度基本保持不變，但是 Fab 片段的豐度增加約 1%，與失去 C 端 Tyr 殘基相對應（計算為 M-163.5，發現 M-163.6）。右窗格（圖 4B）是三個經工程處理之結合的 Fab 在每個時間點剩餘的結合體量的總整理。
圖 5 呈現了基於圖 4 的試劑生成的時程：近端 Arg 導致更快的初始速率（1小時）及更高的總產率。這樣可將結合效率從 77% 提高到 92.5%。
結合反應規模較大，在 1 mol% 酪胺酸酶，5 mol equiv TCO，80 uM 酪胺酸 (Fab) 反應條件下觀察到良好的效能。令人驚訝的是，具有相鄰 (DRY) 或緊密 (DRGY) 精胺酸的標籤提供了更高的結合效率。不受理論的束縛，Arg 可能活化 / 穩定化瞬態鄰醌，從而導致更高的產率。GGY、DRGY 及 DRY 各自的 t=1 h 及 t=16 h 的並排時點表明速率 / 產率趨勢保持不變。因此，在實施例中，任何蛋白質（否則為抗體）可在酪胺酸殘基之相鄰或附近摻入精胺酸以提高產率。
儘管出於清楚理解的目的已經通過圖示和實施例的方式對前述發明進行了詳細描述，但是本領域的技術人員將理解，可以在所附請求項的範圍內進行某些改變和修改。另外，本文提供的每個參考文獻通過引用整體併入本文，其程度與每個參考文獻通過引用單獨併入的程度相同。在本申請與本文提供的參考文獻之間存在衝突的情況下，以本申請為準。
圖 1 呈現了在不同時間解析的質譜圖，其表示出在經過工程處理以顯示含有酪胺酸殘基的 C 端胜肽標籤的人類 IgG1 Fab 中瞬態生成多巴醌。缺少酪胺酸的同一 Fab 導致不會修飾。
圖 2A-C 呈現了親二烯體與原位多巴醌的結合：在圖 2A 列中呈現了產物形成時程，頂部窗格呈現親二烯體 TCO，中間窗格呈現親二烯體 BCN 且底部窗格呈現 DBCO，每種試劑均作為用於含有原位生成多巴醌的 Fab 的捕獲劑。還呈現瞬態地生成的鄰醌（圖
2B 列）及反應過程中生成的副產物 Fab-Fab 二聚體（圖 C 列）的相同時程。
圖 3 呈現了典型反應及純化過程的解卷積 LCMS 譜，其展示了環加合物連接與標準實驗室程序的相容性。從上至下的光譜呈現：起始材料（含有 C 端“DRY”胜肽標籤的 Fab）；在反應時間 1 小時後的反應，其呈現在 M+432 Da 處（對應於 +O、–H2
的 14 Da 及 TCO-PEG4
-COOH 試劑的 428 Da）形成結合產物；在反應時間 16 小時後的反應，其展示產率約為 91%，從 KappaSelect 親和性管柱以 pH 2.7 洗脫後的純化池，及在 PBS 中配製的最終產物。
圖 4A-B 呈現了由酪胺酸酶媒介的生物結合形成的 Diels-Alder 環加合物在數個月的過程中對在 pH 7.4、37℃ 的 PBS 中經工程處理顯示 C 端胜肽標籤之 Fab 的三個變體的穩定性，該標籤為：DRY、DRGY 及 GGY。在每種情況下，結合體均由對應於O
原子增加 (16 Da)、H2
損失 (–2 Da) 及 TCO 親二烯體（TCO-PEG4
-羧酸，417.5）的質量增加的質量位移組成；計算出的總質量位移為 431.5 Da。對於 Fab–GGY，發現 M+431.5；對於 Fab-DRY，發現 M+431.6；對於 Fab-DRGY，發現 431.7。每種 Fab–TCO-PEG4
-COOH 結合體均以 PBS 配製為 5 mg/mL，並藉由 0.22 μm 的注射器過濾器在組織培養台中滅菌。將容器在環境條件下密封，並在 37 ℃ 下保存。在每個指定的時間點，從容器中取出一份等分試樣，並藉由 LCMS 分析其解除結合。剩餘的結合體量計算為解卷積質量峰豐度的百分比。左窗格（圖 4A）呈現了為 Fab-DRY 蛋白質記錄的 LCMS 譜。結合 MW 及 Fab 起始材料 MW 的峰豐度基本保持不變，但是 Fab 片段的豐度增加約 1%，與失去 C 端 Tyr 殘基相對應（計算為 M-163.5，發現 M-163.6）。右窗格（圖 4B）是三個經工程處理之結合的 Fabs 在每個時間點剩餘的結合體量的總整理。
圖 5 呈現了基於圖 4 的試劑生成的時程：近端 Arg 導致更快的初始速率（1小時）及更高的總產率。這樣可將結合效率從 77% 提高到 92.5%。
Claims (68)
- 一種組成物，其包含官能化的反式環辛烯(TCO)與鄰醌的環加合物，其中該鄰醌存在於生物分子中。
- 如請求項1之組成物，其中該生物分子為蛋白質或胜肽。
- 如請求項1之組成物，其中該生物分子為寡醣。
- 如請求項1之組成物，其中該生物分子為經修飾的DNA或RNA。
- 如請求項1至4中任一項之組成物，其中該鄰醌衍生自含酚部分。
- 如請求項5之組成物，其中該含酚部分為酪胺酸。
- 如請求項6之組成物，其中將該酪胺酸位點特異性地工程處理入蛋白質中。
- 如請求項5之組成物，其中該含酚部分為兒茶酚。
- 如請求項5之組成物，其中當該生物分子為寡醣時，該寡醣在其還原端具有含酚部分。
- 如請求項1之組成物，其中該官能化的TCO包含蛋白質、第二胜肽、藥物、核酸、寡醣、聚合物、寡聚物、樹枝狀聚合物、標記、診斷劑、雙功能治療診斷劑或基材表面，其中的任一者或多者視情況通過連接子附接，其中該連接子視情況為支鏈的。
- 如請求項10之組成物，其中該連接子為支鏈的，且攜帶蛋白質、胜肽、藥物、核酸、寡醣、聚合物、寡聚物、樹枝狀聚合物、標記、診斷劑、雙功能治療診斷劑或基材表面中的兩者或多者。
- 如請求項10之組成物，其中該核酸為RNAi或反義寡核苷酸。
- 如請求項10之組成物，其中該標記為螢光團、放射性標記、化學發光標記、DNA條碼、RNA條碼或胜肽標籤。
- 如請求項10之組成物，其中該基材表面為聚合物珠、孔盤的孔底部或聚合物載片表面。
- 一種式(I)之組成物：(I) 其中P為蛋白質或胜肽；並且 R包含第二蛋白質、第二胜肽、藥物、核酸、寡醣、聚合物、寡聚物、樹枝狀聚合物、標記或基材表面，其中任一者視情況通過連接子附接。
- 如請求項15之組成物，其中P為抗體。
- 如請求項15之組成物，其中P為抗體片段。
- 如請求項15之組成物，其中P為酶。
- 如請求項15之組成物，其中P為細胞表面蛋白。
- 如請求項15之組成物，其中P為細胞介素。
- 如請求項15之組成物，其中P為趨化介素。
- 如請求項15之組成物，其中P為蛋白質毒素。
- 如請求項15之組成物，其中P為激素。
- 如請求項15至23中任一項之組成物，其中R包含抗體。
- 如請求項15至23中任一項之組成物，其中R包含靶向分子。
- 如請求項15至23中任一項之組成物，其中R包含治療劑。
- 如請求項15至23中任一項之組成物，其中R包含放射性標記。
- 如請求項15至23中任一項之組成物，其中R包含螢光標記。
- 如請求項15至23中任一項之組成物，其中R包含磷光標記。
- 如請求項15至23中任一項之組成物，其中R包含染料。
- 如請求項15至23中任一項之組成物，其中R包含聚合物珠。
- 如請求項15至23中任一項之組成物，其中R包含感測器表面。
- 如請求項15至32中任一項之組成物，其中R包含連接子。
- 如請求項33之組成物，其中該組成物具有式(II)的結構：(II)； 其中L為連接子或鍵結，且X為O、S或NH。
- 如請求項33之組成物，其中該組成物具有式(III)的結構：(III)； 其中L為連接子或鍵結，且X為O、S或NH。
- 一種方法，其包含： 將官能化的反式環辛烯(TCO)加入存在於生物分子中的鄰醌，從而形成該官能化的TCO與該鄰醌的環加合物。
- 一種方法，其包含： 提供官能化的反式環辛烯(TCO)； 將包含酚類部分的蛋白質或胜肽加入該官能化的TCO；以及 從該酚類部分生成鄰醌，其中該官能化的TCO被容許與該鄰醌反應以形成環加合物。
- 如請求項36或37之方法，其中該鄰醌是藉由酪胺酸酶的作用而生成的。
- 如請求項36至38中任一項之方法，其中該官能化的TCO以相對於該蛋白質或胜肽至少約10倍莫耳過剩的形式使用。
- 如請求項36至38中任一項之方法，其中該官能化的TCO以相對於該蛋白質或胜肽10倍至50倍莫耳過剩的形式使用。
- 如請求項36至40中任一項之方法，其中該官能化的TCO包含TCO-PEG-酸。
- 如請求項36至40中任一項之方法，其中該官能化的TCO包含TCO-醇。
- 如請求項36至40中任一項之方法，其中該官能化的TCO包含TCO-PEG-胺。
- 如請求項36至40中任一項之方法，其中該官能化的TCO包含TCO-胺。
- 如請求項36至40中任一項之方法，其中該官能化的TCO包含TCO-硫醇或TCO-PEG-硫醇。
- 如請求項36至40中任一項之方法，其中該官能化的TCO包含TCO-PEG-順丁烯二醯亞胺。
- 如請求項36至40中任一項之方法，其中該官能化的TCO包含TCO-PEG-OH。
- 如請求項36至47中任一項之方法，其中該鄰醌衍生自酪胺酸部分。
- 如請求項36至48中任一項之方法，其進一步包含以位點特異性酪胺酸殘基工程處理蛋白質。
- 如請求項49之方法，其中該工程處理步驟採用定點誘變。
- 如請求項48或50之方法，其中進一步結合入胺基酸以藉由該酪胺酸酶提供對該酪胺酸殘基的可及性。
- 如請求項37至51中任一項之方法，其中該酪胺酸位於該蛋白質的C-端末。
- 如請求項37至51中任一項之方法，其中該酪胺酸位於該蛋白質的N-端末。
- 如請求項37至51中任一項之方法，其中該酪胺酸位於蛋白質序列中可及的內部位置。
- 如請求項37至53中任一項之方法，其中該蛋白質為抗體片段。
- 如請求項37至53中任一項之方法，其中該蛋白質為單結構域抗體。
- 一種抗體結合體，其是在官能化的反式環辛烯(TCO)存在下藉由酪胺酸酶對抗體中酚類殘基的作用而形成，其中該抗體結合體在37℃於磷酸鹽緩衝生理食鹽水中可穩定至少一個月。
- 如請求項57之抗體結合體，其中該酚類殘基為酪胺酸。
- 如請求項57或58之抗體結合體，其中該官能化的TCO包含螢光標記。
- 如請求項57或58之抗體結合體，其中該官能化的TCO包含放射性標記。
- 如請求項57或58之抗體結合體，其中該官能化的TCO包含藥物。
- 一種蛋白質結合體，其是在官能化的反式環辛烯(TCO)存在下藉由酪胺酸酶對蛋白質中酚類殘基的作用而形成，其中該蛋白質結合體在37℃於磷酸鹽緩衝生理食鹽水中可穩定至少一個月。
- 如請求項62之蛋白質結合體，其中該酚類殘基為酪胺酸。
- 如請求項62或63之蛋白質結合體，其中該官能化的TCO包含螢光標記。
- 如請求項62或63之蛋白質結合體，其中該官能化的TCO包含放射性標記。
- 如請求項62或63之蛋白質結合體，其中該官能化的TCO包含藥物。
- 如請求項62或63之蛋白質結合體，其中該官能化的TCO包含寡醣。
- 一種混合物，其包含： 具有酚類部分的生物分子； 酪胺酸酶；以及 官能化的反式環辛烯。
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