KR20230013268A - 트랜스글루타미나제를 사용한 글리코실화 단일클론 항체의 부위-특이적 접합 - Google Patents

트랜스글루타미나제를 사용한 글리코실화 단일클론 항체의 부위-특이적 접합 Download PDF

Info

Publication number
KR20230013268A
KR20230013268A KR1020227044507A KR20227044507A KR20230013268A KR 20230013268 A KR20230013268 A KR 20230013268A KR 1020227044507 A KR1020227044507 A KR 1020227044507A KR 20227044507 A KR20227044507 A KR 20227044507A KR 20230013268 A KR20230013268 A KR 20230013268A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
ser
val
thr
leu
pro
Prior art date
Application number
KR1020227044507A
Other languages
English (en)
Inventor
바딤 더킨
샬롬 골드버그
마이클 제이. 맥컬리
크리스틴 와일리
레베카 위스너
Original Assignee
얀센 바이오테크 인코포레이티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 얀센 바이오테크 인코포레이티드 filed Critical 얀센 바이오테크 인코포레이티드
Publication of KR20230013268A publication Critical patent/KR20230013268A/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/68031—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being an auristatin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6849—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6855—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell the tumour determinant being from breast cancer cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6869—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell the tumour determinant being from a cell of the reproductive system: ovaria, uterus, testes, prostate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6889—Conjugates wherein the antibody being the modifying agent and wherein the linker, binder or spacer confers particular properties to the conjugates, e.g. peptidic enzyme-labile linkers or acid-labile linkers, providing for an acid-labile immuno conjugate wherein the drug may be released from its antibody conjugated part in an acidic, e.g. tumoural or environment
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2863—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for growth factors, growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3069—Reproductive system, e.g. ovaria, uterus, testes, prostate
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/32—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against translation products of oncogenes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1025—Acyltransferases (2.3)
    • C12N9/104—Aminoacyltransferases (2.3.2)
    • C12N9/1044—Protein-glutamine gamma-glutamyltransferase (2.3.2.13), i.e. transglutaminase or factor XIII
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/005—Glycopeptides, glycoproteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/32—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency specific for a neo-epitope on a complex, e.g. antibody-antigen or ligand-receptor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/40—Immunoglobulins specific features characterized by post-translational modification
    • C07K2317/41—Glycosylation, sialylation, or fucosylation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/51—Complete heavy chain or Fd fragment, i.e. VH + CH1
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/524—CH2 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y203/00—Acyltransferases (2.3)
    • C12Y203/02—Aminoacyltransferases (2.3.2)
    • C12Y203/02013—Protein-glutamine gamma-glutamyltransferase (2.3.2.13), i.e. transglutaminase or factor XIII

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Gynecology & Obstetrics (AREA)
  • Pregnancy & Childbirth (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

트랜스글루타미나제에 의한 부위-특이적 접합에 유용한 조작된 항체(engineered antibody)가 기재된다. 항체의 부위-특이적 접합 방법, 부위-특이적으로 접합된 항체, 및 부위-특이적으로 접합된 항체와 관련된 약제학적 조성물 및 용도가 또한 기재된다.

Description

트랜스글루타미나제를 사용한 글리코실화 단일클론 항체의 부위-특이적 접합
관련 출원과의 상호 참조
본 출원은 2020년 5월 20일자로 출원된 미국 가출원 제63/027,396호의 이익을 주장한다. 상기 언급된 출원의 전체 내용은 본 명세서에 전체적으로 참고로 포함된다.
기술분야
본 발명은 글리코실화 항체의 부위-특이적 접합에 관한 것이다. 구체적으로는, 본 발명은 트랜스글루타미나제를 사용한 부위-특이적 접합에 유용한 조작된 항체에 관한 것이다. 본 발명은 또한 항체의 부위-특이적 접합 방법, 부위-특이적으로 접합된 항체, 및 부위-특이적으로 접합된 항체와 관련된 약제학적 조성물 및 용도에 관한 것이다.
전자적으로 제출된 서열 목록에 대한 참조
본 출원은 파일명이 "JBI6302WOPCT1_SeqListing.txt"이고, 작성일이 2021년 4월 19일이며, 크기가 225 kb인 ASCII 포맷 서열 목록으로서 EFS-웹을 통해 전자적으로 제출된 서열 목록을 포함한다. EFS-웹을 통해 제출된 서열 목록은 본 명세서의 일부이며, 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다.
부위-특이적 접합 - 큰 단백질, 예컨대 단일클론 항체(mAb) 상의 특정 부위에 대한 분자의 공유 부착 - 은 중요성이 증가하고 있는 기술이다. 부위-특이적 접합에 사용되는 치료적 플랫폼, 예컨대 항체-약물 접합체는 점점 더 많이 임상 개발에 들어가고 있다. 결과적으로, 기존 접근법을 보완하거나 대체하는 신규한 방법이 큰 가치를 갖는다.
기재된 부위-특이적 접합에 대한 한 가지 접근법은 트랜스글루타미나제(TGase) 효소를 이용한다. 트랜스글루타미나제는 미생물뿐만 아니라 더 고등한 유기체에서 대표적인 효소들의 큰 부류이다(문헌[Savoca et al., 2018, Micromachines (Basel) 9(11)]). 이들 효소는 단백질의 라이신 측쇄의 ε-아미노 기와 글루타민 측쇄의 γ-카르복스아미드 기 사이의 공유 결합 형성을 촉매하여 아이소펩티드 결합을 가져온다. TGase는 혈액 응고, 세포외 기질 조립체, 및 포자 형성을 포함한 다수의 생물학적 과정에서 역할을 한다. 고유 기능에 더하여, 일부 TGase는 글루타민 또는 라이신 측쇄 대신에 각각 다른 아미드 또는 아민을 사용할 수 있으며, 그럼으로써 단백질에 대한 소분자 기질의 공유 접합을 촉매한다. 예를 들어, 이들은 약물 상의 1차 아민을 단백질/펩티드 결합된 글루타민 잔기의 측쇄 카르복시아미드 기에 결합할 수 있으며, 그럼으로써 약물과 단백질/펩티드 사이에 아이소펩티드 결합을 형성할 수 있다.
S. 모바라엔시스(S. mobaraensis) 유래의 미생물 TGase(MTG)는 단백질 측쇄에 대한 소분자의 공유 접합에 특히 유용한 것으로 입증되어 있다. MTG는, 글루타민 측쇄에 접합하기 위해 아민-변형된 PEG를 사용하거나, 또는 라이신 측쇄에 접합하기 위해 Gln-함유 다이펩티드로 변형된 PEG를 사용하여, 재조합 인간 IL2(문헌[Sato, 2002, Advanced drug delivery reviews 54(4): 487-504]), 인터페론(문헌[Spolaore et al., 2016, Bioconjugate chemistry 27(11): 2695-2706]), 및 인간 성장 호르몬(문헌[Mero et al., 2011, J Control Release 154(1): 27-34])을 포함한 다양한 단백질에 대한 폴리에틸렌 글리콜(PEG)의 추가를 촉매하는 것으로 밝혀졌다. 각각의 경우에, PEG를 Gln 또는 Lys 측쇄 중 단지 하나 또는 작은 하위세트에 선택적으로 부가하였다. 그러나, S. 모바라엔시스 미생물 TGase(MTG)의 기질 특이성은 충분히 해명되어 있지 않다. 다양한 연구는 글루타민 기질에 대한 어느 정도의 서열 선택성(문헌[Sugimura et al., 2008, Arch Biochem Biophys 477(2):379-383])뿐만 아니라 2차 구조에 대한 어느 정도의 의존성을 보여주고 있다(문헌[Mero et al., 2011, 상기 참조]; 문헌[Spolaore et al., 2012, Biochemistry 51(43):8679-8689]). 현재, MTG가 특정 단백질의 선택적 접합에 사용될 수 있는지를 결정하기 위해 경험적 접근법이 전형적으로 사용된다.
MTG는 소분자를 단일클론 항체 부위에 선택적으로 접합하는 데 사용되어 왔다. 2가지 상이한 접근법이 mAb 상의 Gln 측쇄에 대한 아민-함유 페이로드(payload)의 접합에 대해 입증되어 있는데, 하나는 태깅 접근법을 사용하는 것이고, 두 번째 것은 특정 Gln 잔기가 소정 조건 하에서 우수한 MTG 기질일 수 있다는 예기치 않은 발견을 사용하는 것이다. 태그-기반 접근법은 또한 라이신 측쇄에 대한 Gln-함유 페이로드의 접합에 대해 기재되어 있다.
Jeger et al.은 MTG에 의한 mAb의 변형의 속도가 위치 297에서의 N-연결된 글리칸이 온전하다면 탈글리코실화 항체의 경우 훨씬 더 빠르다는 것(문헌[Jeger et al., 2010, Angewandte Chemie 49(51):9995-9997])과 그러한 변형은 mAb 상의 하나의 Gln 부위에 대해 매우 특이적이었음을 입증하였다. 접합 부위는, 모든 인간 IgG 동종형(isotype)에 걸쳐 보존되고 글리코실화 부위로부터 2개의 잔기가 떨어져 있는 CH2 도메인 내의 위치인 Gln295인 것으로 결정되었다. 이러한 접근법 - 탈글리코실화 이후 Gln295에 대한 MTG-촉매된 접합 - 은 항체-방사성 접합체, 항체-약물 접합체, 및 다른 분자를 제조하는 데 사용되어 왔다. 상기 방법은 mAb의 조작을 필요로 하지 않지만, 그것은 글리칸의 제거를 필요로 하는데, 이는 Fc 수용체에 대한 결합이 소실되기 때문에 면역학적 특성에 대한 영향을 가져오고, 열안정성 - 여기서는, 최대 7 내지 8℃까지의 CH2 도메인의 용융 온도의 감소가 관찰될 수 있음 - 과 같은 생물물리학적 특성에 대한 영향을 가져온다.
트랜스글루타미나제를 사용한 부위-선택적 mAb 접합을 위한 태그-기반 방법이 또한 입증되어 있다. mAb 내의 소정 위치에서 "Q-태그" - 짧은 Gln-함유 펩티드, 예컨대 LLQG - 를 부가하거나 삽입하는 것은 탈글리코실화에 대한 필요성 없이 태그에서의 선택적 접합을 가능하게 한다는 것을 보여주었다(문헌[Strop et al., 2013, Chem Biol 20(2):161-167]). Q-태그 접근법은 mAb 경쇄 및 중쇄의 C-말단에서 주로 사용되어 왔으며, 외인성 펩티드 서열의 사용을 필요로 한다. c-myc 태그를 사용하는 유사한 접근법이 기재되어 있다(문헌[Dennler et al., 2015, Chembiochem 16(5):861-867]).
부위-특이성은 항체-약물 접합체(ADC) 분야에서 핵심 중점 영역이 되어 왔는데(문헌[Agarwal and Bertozzi, 2015, Bioconjug Chem 26(2):176-92]), 이는, 랜덤 접합과 비교하여 부위-특이적 방법으로 ADC의 효능 및 안전성 둘 모두가 증가될 수 있음이 입증되어 있기 때문이다.
항체의 부위-특이적 접합의 효율적인 방법에 대한 필요성이 당업계에 남아 있다.
본 발명은, 탈글리코실화에 대한 필요성 없이, 트랜스글루타미나제를 사용하여 아민-함유 페이로드에 부위-특이적으로 접합될 수 있는 조작된 항체를 제공함으로써 이러한 요구를 충족시킨다.
본 발명의 조작된 항체는, 적어도 하나의 아미노산 치환이 존재할 때, 항체 글리칸을 제거하지 않고서 트랜스글루타미나제-촉매된 접합에 사용될 수 있는 내인성 중쇄 Q295를 포함할 수 있다. 본 발명의 조작된 항체는, 적어도 하나의 추가의 아미노산 치환이 존재할 때, 항체 글리칸을 제거하지 않고서 트랜스글루타미나제-촉매된 접합에 사용될 수 있는 중쇄 잔기에서의 아미노산 치환을 포함할 수 있다.
일반적인 일 태양에서, 본 발명은 항체의 중쇄 불변 영역 CH2에서 중쇄 위치 302에서의 아미노산 치환을 포함하는 조작된 항체에 관한 것이다. 그러한 치환은, 예를 들어 V302S, V302A, V302I, V302L, V302M, V302T, V302F, 및 V302Y, 바람직하게는 아미노산 치환 V302A 및 V302S일 수 있으며, 여기서 아미노산 넘버링은 카바트(Kabat)의 EU 인덱스에 따른다. 특정 실시 형태에서, 위치 302에서의 아미노산 치환은 V302A이다. 다른 실시 형태에서, 위치 302에서의 아미노산 치환은 V302S이다. 바람직하게는, 조작된 항체는 또한 항체의 중쇄 불변 영역 CH2에서, 위치 300에서의 아미노산 치환을 함유한다. 특정 실시 형태에서, 위치 300에서의 아미노산 치환은 Y300L이다.
일부 실시 형태에서, 본 발명의 조작된 항체는 중쇄 위치 286, 287, 288, 289, 290, 293 또는 294에서의 글루타민 치환, 예컨대 아미노산 치환 N286Q, A287Q, K288Q, T289Q, K290Q, E293Q 또는 E294Q, 및/또는 중쇄 위치 241, 243, 294 또는 301에서의 알라닌 치환, 예컨대 F241A, F243A, E294A 또는 R301A를 추가로 포함한다.
일부 실시 형태에서, 조작된 항체는 중쇄 위치 288에서의 글루타민 치환, 예컨대 아미노산 치환 K288Q를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 조작된 항체는 중쇄 위치 293에서의 글루타민 치환, 예컨대 아미노산 치환 E293Q를 포함한다. 특정 실시 형태에서, 조작된 항체는 중쇄 위치 294에서의 글루타민 치환, 예컨대 아미노산 치환 E294Q를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 조작된 항체는 중쇄 위치 241에서의 알라닌, 예컨대 아미노산 치환 F241A를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 조작된 항체는 중쇄 위치 243에서의 알라닌, 예컨대 아미노산 치환 F243A를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 조작된 항체는 중쇄 위치 301에서의 알라닌, 예컨대 아미노산 치환 R301A를 포함한다. 특정 실시 형태에서, 조작된 항체는 중쇄 위치 294에서의 알라닌, 예컨대 아미노산 치환 E294A를 포함한다. 특정 실시 형태에서, 조작된 항체는 중쇄 위치 288에서의 글루타민 치환, 예컨대 아미노산 치환 K288Q, 및 중쇄 위치 294에서의 알라닌, 예컨대 아미노산 치환 E294A를 포함한다.
본 발명의 조작된 항체는, 적어도 하나의 아미노산 치환이 존재할 때, 항체 글리칸을 제거하지 않고서 트랜스글루타미나제-촉매된 접합에 사용될 수 있는 내인성 중쇄 Q295 및 잔기 286, 287, 288, 289, 290, 293 또는 294에서의 글루타민을 포함할 수 있다. 특정 실시 형태에서, 본 발명의 조작된 항체는 내인성 중쇄 Q295 및 잔기 293에서의 글루타민을 포함한다. 특정 실시 형태에서, 본 발명의 조작된 항체는 내인성 중쇄 Q295 및 잔기 294에서의 글루타민을 포함한다.
일 실시 형태에서, 조작된 항체는 아미노산 치환 V302A 또는 V302S, 선택적으로 Y300L을 포함하며, 중쇄 위치 286, 287, 288, 289, 290, 293 또는 294에서의 글루타민 치환, 바람직하게는 아미노산 치환 N286Q, A287Q, K288Q, T289Q, K290Q, E293Q 또는 E294Q를 추가로 포함하며, 여기서 아미노산 넘버링은 카바트의 EU 인덱스에 따른다. 일부 실시 형태에서, 조작된 항체는 중쇄 위치 302에서의 아미노산 치환, 예컨대 아미노산 치환 V302A 또는 V302S, 및 중쇄 위치 293에서의 아미노산 치환, 예컨대 아미노산 치환 E293Q를 포함하며, 선택적으로 중쇄 위치 300에서의 아미노산 치환, 예컨대 아미노산 치환 Y300L을 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 조작된 항체는 중쇄 위치 302에서의 아미노산 치환, 예컨대 아미노산 치환 V302A 또는 V302S, 및 중쇄 위치 294에서의 아미노산 치환, 예컨대 아미노산 치환 E294Q를 포함하며, 선택적으로 중쇄 위치 300에서의 아미노산 치환, 예컨대 아미노산 치환 Y300L을 추가로 포함한다. 특정 실시 형태에서, 조작된 항체는 아미노산 치환 V302A 및 E293Q를 포함하며, 선택적으로 Y300L을 추가로 포함한다. 특정 실시 형태에서, 조작된 항체는 아미노산 치환 V302S 및 E293Q를 포함하며, 선택적으로 Y300L을 추가로 포함한다. 특정 실시 형태에서, 조작된 항체는 아미노산 치환 V302A 및 E294Q를 포함하며, 선택적으로 Y300L을 추가로 포함한다. 특정 실시 형태에서, 조작된 항체는 아미노산 치환 V302A 및 E294Q를 포함하며, 선택적으로 Y300L을 추가로 포함한다.
다른 일반적인 태양에서, 본 발명의 조작된 항체는 항체의 중쇄 위치 294에서의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 아미노산 치환은 알라닌 치환이다. 일부 실시 형태에서, 아미노산 치환은 E294A 또는 E294Q이며, 여기서 아미노산 넘버링은 카바트의 EU 인덱스에 따른다. 일부 실시 형태에서, 항체의 중쇄 위치 294에서의 아미노산 치환은 메티오닌 치환, 페닐알라닌 치환, 라이신 치환, 류신 치환, 아르기닌 치환, 발린 치환 또는 티로신 치환이다. 일부 실시 형태에서, 아미노산 치환은 E294A이다. 일부 실시 형태에서, 아미노산 치환은 E294F이다. 일부 실시 형태에서, 아미노산 치환은 E294K이다. 일부 실시 형태에서, 아미노산 치환은 E294L이다. 일부 실시 형태에서, 아미노산 치환은 E294R이다. 일부 실시 형태에서, 아미노산 치환은 E294V이다. 일부 실시 형태에서, 아미노산 치환은 E294Y이다. 특정 실시 형태에서, 아미노산 치환은 E294M이다.
일부 실시 형태에서, 조작된 항체는 중쇄 위치 302에서의 아미노산 치환을 추가로 포함하며, 바람직하게는 아미노산 치환은 V302S, V302A, V302I, V302L, V302M, V302T, V302F, 및 V302Y로 이루어진 군으로부터 선택되며, 더 바람직하게는 V302A 또는 V302S이다. 더 바람직하게는, 조작된 항체는 중쇄 위치 300에서의 아미노산 치환, 바람직하게는 류신 치환, 예컨대 아미노산 치환 Y300L을 추가로 포함한다.
소정 실시 형태에서, 조작된 항체는 아미노산 치환 V302A 또는 V302S 및 아미노산 치환 E293Q 및 E294Q 중 적어도 하나를 포함하며, 여기서 아미노산 넘버링은 카바트의 EU 인덱스에 따른다. 조작된 항체는 아미노산 치환 Y300L을 추가로 포함할 수 있다.
다른 일반적인 태양에서, 본 발명의 조작된 항체는 중쇄 위치 294 및 295에서의 아미노산 치환을 포함하며, 여기서 아미노산 넘버링은 카바트의 EU 인덱스에 따른다. 특정 실시 형태에서, 중쇄 위치 294에서의 아미노산 치환은 글루타민 치환, 예컨대 아미노산 치환 E294Q이다. 일부 실시 형태에서, 중쇄 위치 295에서의 아미노산 치환은 알라닌 치환, 예컨대 아미노산 치환 Q295A이다. 일부 실시 형태에서, 중쇄 위치 295에서의 아미노산 치환은 글루타메이트 치환, 예컨대 아미노산 치환 Q295E이다.
일부 실시 형태에서, 중쇄 위치 295에서의 아미노산 치환은 아스파라긴 치환, 예컨대 아미노산 치환 Q295N이다. 특정 실시 형태에서, 조작된 항체는 아미노산 치환 E294Q 및 Q295A를 포함한다. 특정 실시 형태에서, 조작된 항체는 아미노산 치환 E294Q 및 Q295E를 포함한다. 특정 실시 형태에서, 조작된 항체는 아미노산 치환 E294Q 및 Q295N을 포함한다.
본 명세서에 개시된 조작된 항체는, 탈글리코실화에 대한 필요성 없이, WT mAb에 비하여 트랜스글루타미나제를 사용한 아민-함유 페이로드의 부위-특이적 접합의 개선된 효율을 제공한다. 일부 실시 형태에서, 조작된 항체는, 탈글리코실화에 대한 필요성 없이, WT mAb에 비하여 특정 시간프레임 내에서 아민-함유 페이로드에 의한 증가된 표지화 정도(degree of labeling, DOL)를 나타낸다. 특정 실시 형태에서, 조작된 항체는, 탈글리코실화에 대한 필요성 없이, 탈글리코실화된 WT mAb에 비하여 특정 시간프레임 내에서 아민-함유 페이로드에 의한 증가된 표지화 정도(DOL)를 나타낸다. 특정 실시 형태에서, 본 명세서에 개시된 조작된 항체는, 탈글리코실화에 대한 필요성 없이, WT mAb에 비하여 더 짧은 시간프레임 내에서 완전한 표지화(예를 들어, DAR=2 또는 DAR=4)를 달성한다. 일부 실시 형태에서, 조작된 항체는 WT mAb에 비하여 (CH2 도메인의 용융에 상응하는) 유사하거나 더 높은 Tm을 갖는다. 특정 실시 형태에서, 조작된 항체는 WT mAb에 비하여 세포 사멸 검정에서 동등하거나 개선된 활성을 나타내는 항체-페이로드 접합체를 생성하는 데 사용될 수 있다. 본 명세서에 기재된 치환이 또한 특히 유용한데, 그 이유는, 이들은 다양한 항체 백그라운드, 예를 들어 상이한 동종형들, 특히 IgG1, IgG2 및 IgG4의 인간, 인간화 및 키메라 IgG에 사용될 수 있기 때문이다. 더욱이, 본 명세서에 기재된 치환은 다양한 아민-함유 기질과 함께 사용될 수 있다.
소정 실시 형태에서, 본 발명의 조작된 항체는 인간 IgG 항체, 바람직하게는 인간 IgG1 항체이다. 일부 실시 형태에서, 본 발명의 조작된 항체는 인간화 항체이다. 일부 실시 형태에서, 본 발명의 조작된 항체는 키메라 항체, 예를 들어 마우스-인간 키메라 항체이다. 특정 실시 형태에서, 조작된 항체는 키메라 IgG1 항체이다. 일부 실시 형태에서, 본 발명의 조작된 항체는 인간 IgG2 항체이다. 일부 실시 형태에서, 본 발명의 조작된 항체는 인간 IgG4 항체이다.
다른 실시 형태에서, 본 발명의 조작된 항체는 글리코실화되어, 항체 글리칸을 함유한다. 따라서, 본 명세서에 개시된 조작된 항체는 아민-함유 항체-페이로드 접합체의 (예를 들어, DAR=2 또는 DAR=4로의) 개선된 제조 효율 및/또는 ADC에서의 (예를 들어, DAR=4로의) 증가된 페이로드 대 항체 비를 가능하게 하면서, Fc 수용체에 대한 WT 결합의 보유 및 WT 생물물리학적 특성, 예를 들어 열안정성을 가능하게 할 수 있다.
본 발명의 조작된 항체는 항체 글리칸의 존재 하에서 항체의 내인성 중쇄 Q295 잔기에서 트랜스글루타미나제에 의해 항체가 아민-함유 페이로드에 접합될 수 있게 하는 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함할 수 있으며, 여기서 아미노산 넘버링은 카바트의 EU 인덱스에 따른다. 바람직하게는, 적어도 하나의 아미노산 치환은 글리칸-상호작용 부위에서 이루어지며, 이로써 내인성 Q295 잔기는 항체 글리칸을 제거하지 않고서 트랜스글루타미나제-촉매된 접합에 사용될 수 있게 된다.
본 발명의 조작된 항체는 항체 글리칸의 존재 하에서 항체의 중쇄 위치 294에서의 글루타민 잔기에서 트랜스글루타미나제에 의해 항체가 아민-함유 페이로드에 접합될 수 있게 하는 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함할 수 있으며, 여기서 아미노산 넘버링은 카바트의 EU 인덱스에 따른다.
본 발명은 또한 항체-페이로드 접합체에 관한 것으로, 상기 항체-페이로드 접합체는 페이로드에 접합된 본 발명의 조작된 항체를 포함한다. 바람직하게는, 페이로드는 세포독성제, 세포증식억제제, 화학요법제, 독소, 방사성 핵종, DNA, RNA, siRNA, 마이크로RNA, 펩티드 핵산, 비천연 아미노산, 펩티드, 효소, 형광 태그, 비오틴, 및 제1 클릭 반응 파트너로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 포함한다. 특정 실시 형태에서, 페이로드는 아민-함유 페이로드이다. 일부 실시 형태에서, 페이로드는 항체의 내인성 중쇄 Q295 잔기에서 조작된 항체에 접합된다. 다른 실시 형태에서, 페이로드는 조작된 항체의 중쇄 위치 286, 287, 288, 289, 290, 293 또는 294의 글루타민 잔기에서 조작된 항체에 접합된다. 특정 실시 형태에서, 페이로드는 조작된 항체의 중쇄 위치 293의 글루타민 잔기에서 조작된 항체에 접합된다. 특정 실시 형태에서, 페이로드는 조작된 항체의 중쇄 위치 294의 글루타민 잔기에서 조작된 항체에 접합된다. 임의의 적합한 페이로드가 조작된 항체에 접합될 수 있다. 소정 실시 형태에서, 페이로드는 Q295 및 중쇄 위치 293 및 294의 글루타민 잔기 중 적어도 하나에서 조작된 항체에 접합된다. 따라서, 특정 실시 형태에서, 페이로드는 Q295 및 중쇄 위치 293의 글루타민 잔기에서 조작된 항체에 접합된다. 특정 실시 형태에서, 페이로드는 Q295 및 중쇄 위치 294의 글루타민 잔기에서 조작된 항체에 접합된다. 바람직하게는, 본 발명의 항체-페이로드 접합체는 1 내지 4, 바람직하게는 2 내지 4, 가장 바람직하게는 2 또는 4의 약물 항체 비(DAR)를 갖는다.
다른 일반적인 태양에서, 본 발명은 항체-페이로드 접합체를 생성하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은
a. 본 발명의 조작된 항체를 제공하는 단계;
b. 아민-함유 페이로드를 제공하는 단계; 및
c. 상기 조작된 항체 및 상기 아민-함유 페이로드를, 중쇄 위치 286, 287, 288, 289, 290, 293 또는 294의 조작된 글루타민(Q) 잔기에서 그리고/또는 내인성 중쇄 Q295에서 상기 페이로드에 접합된 상기 조작된 항체를 포함하는 상기 항체-페이로드 접합체를 생성하는 조건 하에서 트랜스글루타미나제와 접촉시키는 단계를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항체-페이로드 접합체를 생성하는 방법은 조작된 항체의 항체 글리칸을 제거하지 않고서 수행된다.
다른 일반적인 태양에서, 본 발명은 본 발명의 조작된 항체 또는 본 발명의 항체-페이로드 접합체 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
다른 일반적인 태양에서, 본 발명은 배합물(combination) 또는 키트에 관한 것으로, 상기 배합물 및 키트는
a. 본 발명의 조작된 항체; 및
b. 트랜스글루타미나제를 포함하며,
상기 배합물 또는 키트는 항체를 아민-함유 페이로드로 표지하는 데 사용되고자 한다.
전술한 요약뿐만 아니라 본 발명의 하기의 상세한 설명도 첨부 도면과 함께 읽을 때 더 잘 이해될 것이다. 본 발명은 도면에 나타낸 정확한 실시 형태로 제한되지 않음이 이해되어야 한다.
도면에서,
도 1a는 NLDC-145 mAb(상부) vs. 3-APA로 변형된 NLDC-145(하부)의 펩티드 맵핑을 나타내고; 3-APA의 부가와 함께 Gln295 및 Gln288을 함유하는 변형된 펩티드는 화살표로 표시된 바와 같이 트랜스글루타미나제-반응된 샘플에서 확인되었다.
도 1b는 MTG를 사용하여 변형된 온전한 NLDC-145의 감소된 질량 LC/MS를 나타내고; Man5 글리칸(49917 Da)을 갖는 중쇄는 3-APA의 2개의 분자의 부가를 나타내는 반면, G0F 글리칸(50143 Da)을 갖는 중쇄는 0개의 3-APA 분자 및 1개의 3-APA 분자의 부가의 혼합물을 생성한다.
도 2는 트라스투주맙 변이체에 대한 3-APA의 MTG-촉매된 접합의 속도를 나타내며; 특히, WT 온전한 트라스투주맙이 WT 탈글리코실화, Y300L/V302S, 및 V302S와 비교되어 있으며, 중쇄당 표지화 정도(DOL)가 시간의 함수로서 나타나 있다.
도 3은 확립된 트랜스글루타미나제 방법을 통해 WT 트라스투주맙을 사용하여 생성되거나 또는 글리칸-온전한 V302S 변이체를 사용하여 생성된 트라스투주맙-MMAF 약물 접합체의 활성의 비교를 나타낸다. 두 ADC의 경우, 약물 페이로드는 DAR=2로 절단가능한 Val-Cit-PABC 링커(linker)를 통해 부착된 MMAF이다. SK-BR3 세포를 72시간 동안 접합체의 변동하는 농도로 처리하고, Cell Titer Glo 검정에 의해 세포 사멸을 결정하였다.
도 4a는 트라스투주맙 변이체에 대한 3-APA의 MTG-촉매된 접합의 속도를 나타내며; 특히, WT 온전한 트라스투주맙이 WT 탈글리코실화, K288Q/Y300L/V302S, E293Q/Y300L/V302S 및 E294Q/Y300L/V302S와 비교되어 있으며, 표지화 정도(DOL)가 시간의 함수로서 나타나 있다.
도 4b는 E294Q/Y300L/V302S, E294Q/ V302S, 및 E294Q에 대한 반응 속도의 비교를 나타낸다.
도 4c는 변이체로부터 생성된 DAR=4 트라스투주맙-MMAF 약물 접합체와, 탈글리코실화 및 MTG-촉매된 접합에 의해 생성된 접합체의 활성의 비교를 나타낸다. WT 트라스투주맙은 확립된 트랜스글루타미나제 방법을 통해 DAR=2로 접합하였고, 변이체는 글리칸을 제거하지 않고서 DAR=4로 접합하였다. 모든 ADC의 경우, 약물 페이로드는 절단가능한 Val-Cit-PABC 링커를 통해 부착된 MMAF이다. SK-BR3 세포를 72시간 동안 접합체의 변동하는 농도로 처리하고, Cell Titer Glo 검정에 의해 세포 사멸을 결정하였다.
도 5는 트라스투주맙 변이체에 대한 3-APA의 MTG-촉매된 접합의 속도를 나타내며; 특히, WT 온전한 트라스투주맙이 글리칸-온전한 E294Q/Q295A, E294Q/Q295E, E294Q/Q295N 및 탈글리코실화 WT 트라스투주맙과 비교되어 있으며, 표지화 정도(DOL)가 시간의 함수로서 나타나 있다.
도 6a는 트라스투주맙 변이체에 대한 3-APA의 MTG-촉매된 접합의 속도를 나타내며; 특히, WT 온전한 트라스투주맙이 E294A 및 K288Q/E294A 및 탈글리코실화 WT 트라스투주맙과 비교되어 있으며, 표지화 정도(DOL)가 시간의 함수로서 나타나 있다.
도 6b는 WT 트라스투주맙과 비교하여 K288Q/E294A 변이체의 용융 온도(상부 그래프) 및 응집 온도(하부 그래프)를 나타낸다.
도 6c는 확립된 트랜스글루타미나제 방법을 통해 WT 트라스투주맙을 사용하여 생성되거나 또는 글리칸-온전한 E294A 및 K288Q/E294A 변이체를 사용하여 생성된 트라스투주맙-MMAF 약물 접합체의 활성의 비교를 나타낸다. 모든 ADC의 경우, 약물 페이로드는 DAR=2로 절단가능한 Val-Cit-PABC 링커를 통해 부착된 MMAF이다. SK-BR3 세포를 72시간 동안 접합체의 변동하는 농도로 처리하고, Cell Titer Glo 검정에 의해 세포 사멸을 결정하였다.
다양한 간행물, 논문, 및 특허가 배경기술에 그리고 본 명세서 전체에 걸쳐 인용되어 있거나 기재되어 있으며; 이들 참고문헌 각각은 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다. 본 명세서에 포함된 문헌, 행동, 재료, 장치, 물품 등에 대한 논의는 본 발명에 대한 상황을 제공하는 것을 목적으로 한다. 그러한 논의는 이들 대상 중 임의의 것 또는 모든 것이 개시되거나 청구된 임의의 발명에 대하여 종래 기술의 일부를 형성하는 것을 인정하는 것은 아니다.
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술 용어 및 과학 용어는 당업자가 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 그렇지 않으면, 본 명세서에 언급된 소정의 용어는 본 명세서에 제시된 바와 같은 의미를 갖는다. 본 명세서에 인용된 모든 특허, 공개된 특허 출원 및 간행물은 마치 본 명세서에 완전히 기재되어 있는 것처럼 참고로 포함된다.
본 명세서 및 첨부된 청구범위에서 사용되는 바와 같이, 단수 형태(부정 관사 및 정관사)는, 문맥이 명확하게 달리 지시하지 않으면, 복수의 지시 대상을 포함한다는 것에 유의해야 한다.
본 명세서 및 후술되는 청구범위 전체에 걸쳐, 문맥상 달리 필요로 하지 않는 한, 단어 "포함하다" 및 변형 형태, 예컨대 "포함한다" 및 "포함하는"은 언급된 정수 또는 단계 또는 정수들 또는 단계들의 군을 포함하지만, 어떠한 다른 정수 또는 단계 또는 정수 또는 단계의 군을 배제하지는 않음을 내포하는 것으로 이해될 것이다. 본 명세서에서 사용될 때, 용어 "포함하는"은 용어 "함유하는" 또는 "구비하는"으로 치환될 수 있거나, 경우에 따라서는 본 명세서에 사용될 때 용어 "갖는"으로 치환될 수 있다.
본 명세서에서 사용될 때, "~로 이루어진"은 청구범위 요소에 명시되지 않은 임의의 요소, 단계, 또는 구성성분을 배제한다. 본 명세서에서 사용될 때, "~로 본질적으로 이루어진"은 청구항의 기본적이고 신규한 특징에 실질적으로 영향을 주지 않는 재료 또는 단계를 배제하지 않는다. 본 발명의 태양 또는 실시 형태와 관련하여 본 명세서에 사용되는 모든 경우에, 임의의 전술한 용어 "포함하는", "함유하는", "구비하는" 및 "갖는"은 본 발명의 범주를 변동시키기 위해 용어 "~로 이루어진" 또는 "~로 본질적으로 이루어진"으로 대체될 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 다수의 언급된 요소들 사이의 접속 용어 "및/또는"은 개별 선택지 및 조합된 선택지 둘 모두를 포함하는 것으로 이해된다. 예를 들어, 2개의 요소들이 "및/또는"에 의해 결합되는 경우, 제1 선택지는 제2 요소 없이 제1 요소의 적용가능성을 지칭한다. 제2 선택지는 제1 요소 없이 제2 요소의 적용가능성을 지칭한다. 제3 선택지는 제1 요소와 제2 요소가 함께 적용가능함을 지칭한다. 이들 선택지 중 어느 것이든 하나는 이 의미 내에 속하는 것으로 이해되며, 이에 따라 본 명세서에 사용되는 바와 같이 용어 "및/또는"의 요건을 충족시킨다. 이들 선택지 중 하나 초과의 동시 적용가능성 또한 이 의미 내에 속하는 것으로 이해되며, 이에 따라 용어 "및/또는"의 요건을 충족시킨다.
본 출원의 독자를 돕기 위한 시도로, 다양한 단락 또는 섹션으로 설명이 분리되어 있거나 본 출원의 다양한 실시 형태로 설명되고 있다. 이들 분리는 단락 또는 섹션 또는 실시 형태의 요지를 다른 단락 또는 섹션 또는 실시 형태의 요지로부터 분리하는 것으로 간주되어서는 안 된다. 반대로, 당업자는 발명의 상세한 설명이 넓은 응용을 가지며, 고려될 수 있는 다양한 섹션, 단락, 및 문장의 모든 조합을 포함한다는 것을 이해할 것이다. 임의의 실시예의 논의는 단지 예시적인 것으로 의도되며, 청구범위를 포함하는 본 개시 내용의 범주가 이들 실시예로 제한됨을 시사하고자 의도되지 않는다.
조작된 항체
알려진 절차와 대조적으로, 본 발명의 조작된 항체는 항체 글리칸을 제거하기 위한 탈글리코실화에 대한 필요성 없이 트랜스글루타미나제를 사용한 아민-함유 페이로드와의 항체의 부위-특이적 접합을 가능하게 한다.
일반적인 일 태양에서, 본 발명은 조작된 항체 또는 이의 단편에 관한 것으로, 상기 항체는 항체 글리칸을 제거하지 않고서 트랜스글루타미나제에 의한 접합에 유용한 글루타민 부위를 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "항체" 또는 "면역글로불린"은 넓은 의미로 사용되며, 다중클론 항체, 뮤린(murine), 인간, 인간-적응화, 인간화 및 키메라 단일클론 항체를 포함한 단일클론 항체, 및 이들의 항원-결합 단편을 포함하는 면역글로불린 또는 항체 분자를 포함한다.
일반적으로, 항체는 본 명세서에서 "표적"으로 지칭되는 특정 항원에 대해 결합 특이성을 나타내는 단백질 또는 펩티드 사슬이다. 항체 구조는 잘 알려져 있다. 온전한 "항체"는 이황화물 결합에 의해 상호연결된 적어도 2개의 중쇄(H 사슬) 및 2개의 경쇄(L 사슬)를 포함한다. 전반적으로, 문헌[Fundamental Immunology, Ch. 7 (Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N.Y. (1989))]을 참조한다(모든 목적상 전체적으로 참고로 포함됨). 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역(HCVR 또는 VH) 및 중쇄 불변 영역(CH)으로 구성된다. 중쇄 불변 영역은 CH1, CH2 및 CH3의 3개의 도메인으로 구성된다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역(LCVR 또는 VL) 및 경쇄 불변 영역으로 구성된다. 경쇄 불변 영역은 CL의 1개의 도메인으로 구성된다. 인간에서는, 2가지 유형의 경쇄, 즉, 카파(κ) 및 람다(λ)가 존재하며, 이로써 이들 2가지 유형의 경쇄의 불변 영역은 각각 Cκ 및 Cλ로 지정되게 된다. VH 및 VL 영역은, 프레임워크 영역(FR)으로 명명되는 더 보존된 영역이 산재된, 상보성 결정 영역(CDR)으로 명명되는 초가변성의 영역으로 추가로 세분될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 3개의 CDR 및 4개의 FR로 구성되며, 아미노-말단부터 카르복실-말단까지 하기의 순서대로 배열된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 각각의 도메인에 대한 아미노산의 배정은 카바트의 문헌[Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 and 1991))]), 또는 초티아 및 레스크(Chothia & Lesk)의 문헌[J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987); Chothia et al., Nature 342:878-883 (1989)]에 따른다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "조작된 항체"는 적어도 하나의 조작된 불변 영역, 예를 들어 조작된 Fc 영역, 조작된 Cκ 영역 및/또는 조작된 Cλ 영역을 포함하는 항체 또는 이의 단편을 지칭한다.
면역글로불린은 중쇄 불변 도메인 아미노산 서열에 따라, 5개의 주요 분류, 즉, IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM으로 정해질 수 있다. IgA 및 IgG는 동종형 IgA1, IgA2, IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4로 추가로 하위분류된다. 따라서, 본 발명의 항체는 5개의 주요 부류 또는 상응하는 하위부류 중 임의의 것일 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 항체는 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4이다. 임의의 척추동물 종의 항체 경쇄는 그의 불변 도메인의 아미노산 서열에 기초하여, 2개의 명확하게 구별되는 유형, 즉 카파 및 람다 중 하나로 정해질 수 있다. 따라서, 본 발명의 항체는 카파 또는 람다 경쇄 불변 도메인을 함유할 수 있다. 특정 실시 형태에 따르면, 본 발명의 항체는 마우스 항체 또는 인간 항체로부터의 중쇄 및/또는 경쇄 불변 영역을 포함한다. 4개의 IgG 하위부류 각각은 이펙터 기능으로 알려진 상이한 생물학적 기능을 갖는다. 이들 이펙터 기능은 일반적으로 Fc 수용체(FcγR)와의 상호작용을 통해 또는 C1q 결합 및 보체 결합에 의해 매개된다. FcγR에 대한 결합은 항체 의존성 세포 매개 세포용해로 이어질 수 있으며, 한편 보체 인자에 대한 결합은 보체 매개 세포 용해로 이어질 수 있다. 본 발명에 유용한 항체는 이펙터 기능을 갖지 않거나 최소한으로 가질 수 있지만, FcRn에 결합하는 그의 능력을 보유할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 어구 "트랜스글루타미나제에 의한 접합에 유용한"은 트랜스글루타미나제의 존재 하에서 아민 공여체 작용제(amine donor agent)에 대해 반응성인 글루타민 잔기를 지칭하며, 여기서 글루타민 잔기는 항체 조작에 의해 도입되고/되거나 항체 조작에 의해 반응성이 되게 한 내인성 글루타민이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "항체 글리칸"은 항체 중쇄의 Fc 영역 내의 위치 297에서 N-연결된 글리칸을 지칭하며, 여기서 아미노산 넘버링은 카바트의 EU 인덱스에 따른다.
일반적인 태양에서, 본 발명은 조작된 항체에 관한 것으로, 상기 조작된 항체는 상기 항체의 중쇄 위치에서의 아미노산 치환을 포함하며, 이로써 상기 조작된 항체는, 탈글리코실화에 대한 필요성 없이, 트랜스글루타미나제를 사용하여 아민-함유 페이로드에 부위-특이적으로 접합될 수 있게 된다.
일 태양에 따르면, 본 발명은 항체의 중쇄 불변 영역 CH2에서 중쇄 위치 302에서의 아미노산 치환을 포함하는 조작된 항체에 관한 것으로, 여기서 아미노산 넘버링은 카바트의 EU 인덱스에 따른다.
일 태양에 따르면, 본 발명은 중쇄 위치 294에서의 아미노산 치환을 포함하며, 여기서 아미노산 넘버링은 카바트의 EU 인덱스에 따른다.
일 태양에 따르면, 본 발명은 조작된 항체에 관한 것으로, 상기 조작된 항체는, 적어도 하나의 추가의 아미노산 치환이 존재할 때, 항체 글리칸을 제거하지 않고서 트랜스글루타미나제-촉매된 접합에 사용될 수 있는 중쇄 잔기에서의 아미노산 치환을 포함한다.
특정 실시 형태에 따르면, 아미노산 치환은 20개의 천연 발생 아미노산(또는 '표준' 아미노산) 또는 이들의 변이체, 또는 단백질에서 천연적으로 발견되지 않는 임의의 변이체들 중 임의의 것으로의 아미노산 잔기의 치환일 수 있다.
표준 아미노산들은 이들의 특성에 기초하여 몇몇 군으로 나누어질 수 있다. 중요한 인자는 전하, 친수성 또는 소수성, 크기 및 작용기이다. 이들 특성은 단백질 구조 및 단백질-단백질 상호작용에 중요하다. 일부 아미노산은 특별한 특성을 갖는데, 예를 들어 시스테인은 다른 시스테인 잔기에 대한 공유 이황화물 결합(또는 이황화물 가교)을 형성할 수 있고, 프롤린은 폴리펩티드 골격에 대해 고리를 형성하고, 글리신은 다른 아미노산보다 더 가요성이다. 표 1은 표준 아미노산의 약어 및 특성을 나타낸다.
[표 1]
Figure pct00001
특정 실시 형태에 따르면, 조작된 항체는 중쇄 위치 302에서의 아미노산 치환을 포함하며, 여기서 아미노산 넘버링은 카바트의 EU 인덱스에 따른다. 특정 실시 형태에 따르면, 조작된 항체는 V302S, V302A, V302I, V302L, V302M, V302T, V302F, 및 V302Y로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 치환을 포함한다. 특정 실시 형태에 따르면, 잔기 302에서의 발린은 세린으로 치환된다(V302S). 다른 특정 실시 형태에서, 잔기 302에서의 발린은 알라닌으로 치환된다(V302A).
특정 실시 형태에 따르면, 조작된 항체는 중쇄 위치 300에서의 아미노산 치환을 추가로 포함한다. 특정 실시 형태에 따르면, 잔기 300에서의 티로신은 류신으로 치환된다(Y300L).
일부 실시 형태에서, 조작된 항체는 중쇄 위치 300에서의 아미노산 치환 및 중쇄 위치 302에서의 아미노산 치환을 함유한다. 일부 실시 형태에서, 중쇄 위치 300에서의 아미노산 치환은 Y300L이고, 중쇄 위치 302에서의 아미노산 치환은 V302A이다. 특정 실시 형태에서, 중쇄 위치 300에서의 아미노산 치환은 Y300L이고, 중쇄 위치 302에서의 아미노산 치환은 V302S이다.
특정 실시 형태에 따르면, 조작된 항체는 중쇄 위치 294에서의 아미노산 치환을 추가로 포함한다. 특정 실시 형태에 따르면, 잔기 294에서의 글루탐산은 알라닌으로 치환된다(E294A).
특정 실시 형태에 따르면, 조작된 항체는 중쇄 위치 286, 287, 288, 289, 290, 293 또는 294에서의 아미노산 치환을 추가로 포함한다. 특정 실시 형태에 따르면, 잔기 286에서의 아스파라긴은 글루타민으로 치환되고(N286Q), 잔기 287에서의 알라닌은 글루타민으로 치환되고(A287Q), 잔기 288에서의 라이신은 글루타민으로 치환되고(K288Q), 잔기 289에서의 트레오닌은 글루타민으로 치환되고(T289Q), 잔기 290에서의 라이신은 글루타민으로 치환되고(K290Q), 잔기 293에서의 글루탐산은 글루타민으로 치환되고(E293Q), 또는 잔기 294에서의 글루탐산은 글루타민으로 치환된다(E294Q).
일부 실시 형태에서, 조작된 항체는 중쇄 위치 302에서의 아미노산 치환, 예컨대 아미노산 치환 V302A 또는 V302S, 및 중쇄 위치 285에서의 아미노산 치환, 예컨대 아미노산 치환 H285Q를 포함하며, 선택적으로 중쇄 위치 300에서의 아미노산 치환, 예컨대 아미노산 치환 Y300L을 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 조작된 항체는 중쇄 위치 302 및 285에서의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 조작된 항체는 아미노산 치환 V302A 및 H285Q를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 조작된 항체는 아미노산 치환 V302S 및 H285Q를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 조작된 항체는 중쇄 위치 302, 285 및 300에서의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 조작된 항체는 아미노산 치환 V302A, H285Q 및 Y300L을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 조작된 항체는 아미노산 치환 V302S, H285Q 및 Y300L을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 조작된 항체는 중쇄 위치 302에서의 아미노산 치환, 예컨대 아미노산 치환 V302A 또는 V302S, 및 중쇄 위치 286에서의 아미노산 치환, 예컨대 아미노산 치환 N286Q를 포함하며, 선택적으로 중쇄 위치 300에서의 아미노산 치환, 예컨대 아미노산 치환 Y300L을 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 조작된 항체는 중쇄 위치 302 및 286에서의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 조작된 항체는 아미노산 치환 V302A 및 N286Q를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 조작된 항체는 아미노산 치환 V302S 및 N286Q를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 조작된 항체는 중쇄 위치 302, 286 및 300에서의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 조작된 항체는 아미노산 치환 V302A, N286Q 및 Y300L을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 조작된 항체는 아미노산 치환 V302S, N286Q 및 Y300L을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 조작된 항체는 중쇄 위치 302에서의 아미노산 치환, 예컨대 아미노산 치환 V302A 또는 V302S, 및 중쇄 위치 287에서의 아미노산 치환, 예컨대 아미노산 치환 A287Q를 포함하며, 선택적으로 중쇄 위치 300에서의 아미노산 치환, 예컨대 아미노산 치환 Y300L을 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 조작된 항체는 중쇄 위치 302 및 287에서의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 조작된 항체는 아미노산 치환 V302A 및 A287Q를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 조작된 항체는 아미노산 치환 V302S 및 A287Q를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 조작된 항체는 중쇄 위치 302, 287 및 300에서의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 조작된 항체는 아미노산 치환 V302A, A287Q 및 Y300L을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 조작된 항체는 아미노산 치환 V302S, A287Q 및 Y300L을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 조작된 항체는 중쇄 위치 302에서의 아미노산 치환, 예컨대 아미노산 치환 V302A 또는 V302S, 및 중쇄 위치 288에서의 아미노산 치환, 예컨대 아미노산 치환 K288Q를 포함하며, 선택적으로 중쇄 위치 300에서의 아미노산 치환, 예컨대 아미노산 치환 Y300L을 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 조작된 항체는 중쇄 위치 302 및 288에서의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 조작된 항체는 아미노산 치환 V302A 및 K288Q를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 조작된 항체는 아미노산 치환 V302S 및 K288Q를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 조작된 항체는 중쇄 위치 302, 288 및 300에서의 아미노산 치환을 포함한다. 특정 실시 형태에서, 조작된 항체는 아미노산 치환 V302A, K288Q 및 Y300L을 포함한다. 특정 실시 형태에서, 조작된 항체는 아미노산 치환 V302S, K288Q 및 Y300L을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 조작된 항체는 중쇄 위치 302에서의 아미노산 치환, 예컨대 아미노산 치환 V302A 또는 V302S, 및 중쇄 위치 289에서의 아미노산 치환, 예컨대 아미노산 치환 T289Q를 포함하며, 선택적으로 중쇄 위치 300에서의 아미노산 치환, 예컨대 아미노산 치환 Y300L을 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 조작된 항체는 중쇄 위치 302 및 289에서의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 조작된 항체는 아미노산 치환 V302A 및 T289Q를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 조작된 항체는 아미노산 치환 V302S 및 T289Q를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 조작된 항체는 중쇄 위치 302, 289 및 300에서의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 조작된 항체는 아미노산 치환 V302A, T289Q 및 Y300L을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 조작된 항체는 아미노산 치환 V302S, T289Q 및 Y300L을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 조작된 항체는 중쇄 위치 302에서의 아미노산 치환, 예컨대 아미노산 치환 V302A 또는 V302S, 및 중쇄 위치 290에서의 아미노산 치환, 예컨대 아미노산 치환 K290Q를 포함하며, 선택적으로 중쇄 위치 300에서의 아미노산 치환, 예컨대 아미노산 치환 Y300L을 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 조작된 항체는 중쇄 위치 302 및 290에서의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 조작된 항체는 아미노산 치환 V302A 및 K290Q를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 조작된 항체는 아미노산 치환 V302S 및 K290Q를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 조작된 항체는 중쇄 위치 302, 290 및 300에서의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 조작된 항체는 아미노산 치환 V302A, K290Q 및 Y300L을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 조작된 항체는 아미노산 치환 V302S, K290Q 및 Y300L을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 조작된 항체는 중쇄 위치 302에서의 아미노산 치환, 예컨대 아미노산 치환 V302A 또는 V302S, 및 중쇄 위치 293에서의 아미노산 치환, 예컨대 아미노산 치환 E293Q를 포함하며, 선택적으로 중쇄 위치 300에서의 아미노산 치환, 예컨대 아미노산 치환 Y300L을 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 조작된 항체는 중쇄 위치 302 및 293에서의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 조작된 항체는 아미노산 치환 V302A 및 E293Q를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 조작된 항체는 아미노산 치환 V302S 및 E293Q를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 조작된 항체는 중쇄 위치 302, 293 및 300에서의 아미노산 치환을 포함한다. 특정 실시 형태에서, 조작된 항체는 아미노산 치환 V302A, E293Q 및 Y300L을 포함한다. 특정 실시 형태에서, 조작된 항체는 아미노산 치환 V302S, E293Q 및 Y300L을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 조작된 항체는 중쇄 위치 302에서의 아미노산 치환, 예컨대 아미노산 치환 V302A 또는 V302S, 및 중쇄 위치 294에서의 아미노산 치환, 예컨대 아미노산 치환 E294Q를 포함하며, 선택적으로 중쇄 위치 300에서의 아미노산 치환, 예컨대 아미노산 치환 Y300L을 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 조작된 항체는 중쇄 위치 302 및 294에서의 아미노산 치환을 포함한다. 특정 실시 형태에서, 조작된 항체는 아미노산 치환 V302A 및 E294Q를 포함한다. 특정 실시 형태에서, 조작된 항체는 아미노산 치환 V302S 및 E294Q를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 조작된 항체는 중쇄 위치 302, 294 및 300에서의 아미노산 치환을 포함한다. 특정 실시 형태에서, 조작된 항체는 아미노산 치환 V302A, E294Q 및 Y300L을 포함한다. 특정 실시 형태에서, 조작된 항체는 아미노산 치환 V302S, E294Q 및 Y300L을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 조작된 항체는 2의 DAR을 갖는, 온전한 글리칸을 갖는 항체-페이로드 접합체를 제공한다. 특정 실시 형태에서, 조작된 항체는 4의 DAR을 갖는, 온전한 글리칸을 갖는 항체-페이로드 접합체를 제공한다. 일부 실시 형태에서, 온전한 글리칸을 갖는 조작된 항체는 WT mAb보다 더 짧은 시간스케일에서 트랜스글루타미나제를 사용한, 아민-함유 페이로드로의 완전한 표지화(예를 들어, DAR=2 또는 DAR=4)를 나타낸다. 일부 실시 형태에서, 온전한 글리칸을 갖는 조작된 항체는 아민-함유 페이로드 접합 검정 후 0.5시간, 1시간, 1.5시간, 2시간, 2.5시간, 3시간, 3,5시간, 4시간, 4.5시간 또는 5시간 이내에 WT mAb에 비해 증가된 DOL을 나타낸다. 특정 실시 형태에서, 온전한 글리칸을 갖는 조작된 항체는 아민-함유 페이로드 접합 검정 후 0.5시간, 1시간, 1.5시간, 2시간, 2.5시간, 3시간, 3,5시간, 4시간, 4.5시간 또는 5시간 이내에 탈글리코실화 WT mAb에 비해 증가된 DOL을 나타낸다.
다른 태양에 따르면, 본 발명은 조작된 항체 또는 이의 단편에 관한 것으로, 상기 항체는 글리칸-상호작용 부위에 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함한다.
특정 실시 형태에 따르면, 아미노산 치환은 20개의 천연 발생 아미노산(또는 '표준' 아미노산) 또는 이들의 변이체, 또는 단백질에서 천연적으로 발견되지 않는 임의의 변이체들 중 임의의 것으로의 아미노산 잔기의 치환일 수 있다.
특정 실시 형태에 따르면, 아미노산 치환은 중쇄 위치 301, 241 또는 243에 존재한다. 특정 실시 형태에 따르면, 잔기 301에서의 아르기닌은 알라닌으로 치환된다(R301A). 특정 실시 형태에 따르면, 잔기 241에서의 페닐알라닌은 알라닌으로 치환된다(F241A). 특정 실시 형태에 따르면, 잔기 243에서의 페닐알라닌은 알라닌으로 치환된다(F243A).
특정 실시 형태에 따르면, 본 발명의 조작된 항체는 항체의 중쇄 위치 294에서의 아미노산 치환을 포함하며, 여기서 아미노산 넘버링은 카바트의 EU 인덱스에 따른다.
일부 실시 형태에서, 항체의 중쇄 위치 294에서의 아미노산 치환은 알라닌 치환, 메티오닌 치환, 페닐알라닌 치환, 라이신 치환, 류신 치환, 아르기닌 치환, 발린 치환 또는 티로신 치환이다. 일부 실시 형태에서, 아미노산 치환은 E294A이다. 일부 실시 형태에서, 아미노산 치환은 E294F이다. 일부 실시 형태에서, 아미노산 치환은 E294K이다. 일부 실시 형태에서, 아미노산 치환은 E294L이다. 일부 실시 형태에서, 아미노산 치환은 E294R이다. 일부 실시 형태에서, 아미노산 치환은 E294V이다. 일부 실시 형태에서, 아미노산 치환은 E294Y이다. 특정 실시 형태에서, 아미노산 치환은 E294M이다.
특정 실시 형태에서, 조작된 항체는 중쇄 위치 294에서의 알라닌, 예컨대 아미노산 치환 E294A 및 중쇄 위치 288에서의 글루타민 치환, 예컨대 아미노산 치환 K288Q를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 단독으로의 또는 추가의 치환(예를 들어, K288Q)과 조합된 294에서의 치환은 WT mAb에 비하여 특정 시간프레임 이내에 아민-함유 페이로드 접합 검정에서 증가된 표지화 정도(DOL)를 나타내는, 온전한 글리칸을 갖는 조작된 항체를 제공한다. 특정 실시 형태에서, 조작된 항체는 WT mAb와 비교하여 세포 세포독성 검정에서 동일하게 효과적이다.
일부 실시 형태에서, 294에서의 치환은, WT mAb와 동등하거나 그에 비해 개선된 열안정성을 갖는 조작된 항체를 제공한다. 특정 실시 형태에서, 조작된 항체는 WT mAb와 동등하거나 그에 비해 개선된 Tm을 나타낸다. 일부 실시 형태에서, 조작된 항체의 Tm은 WT mAb보다 적어도 약 0.5℃, 1℃, 1.5℃, 2℃, 2.5℃, 3℃, 3.5℃, 4℃, 4.5℃ 또는 5℃ 더 높다.
특정 실시 형태에서, 294에서의 치환, 예를 들어 E294M은 WT mAb에 비하여 특정 시간프레임 이내에 아민-함유 페이로드 접합 검정에서 증가된 표지화 정도(DOL)를 나타내고, WT mAb와 동등하거나 그에 비해 개선된 Tm을 나타내는, 온전한 글리칸을 갖는 조작된 항체를 제공한다.
일부 실시 형태에서, 본 발명의 조작된 항체는 항체의 중쇄 위치 293에서의 아미노산 치환을 포함하며, 여기서 아미노산 넘버링은 카바트의 EU 인덱스에 따른다. 일부 실시 형태에서, 항체의 중쇄 위치 293에서의 아미노산 치환은 알라닌 치환, 메티오닌 치환, 페닐알라닌 치환, 라이신 치환, 류신 치환, 아르기닌 치환, 발린 치환 또는 티로신 치환이다. 특정 실시 형태에서, 아미노산 치환은 E293M이다.
본 발명의 조작된 항체는 항체의 중쇄 위치 295에서의 아미노산 치환을 포함할 수 있으며, 여기서 아미노산 넘버링은 카바트의 EU 인덱스에 따른다. 일부 실시 형태에서, 본 발명의 조작된 항체는 중쇄 위치 294 및 295에서의 아미노산 치환을 포함한다. 특정 실시 형태에서, 중쇄 위치 294에서의 아미노산 치환은 글루타민 치환, 예컨대 아미노산 치환 E294Q이다. 일부 실시 형태에서, 중쇄 위치 295에서의 아미노산 치환은 알라닌 치환, 예컨대 아미노산 치환 Q295A이다. 일부 실시 형태에서, 중쇄 위치 295에서의 아미노산 치환은 글루타메이트 치환, 예컨대 아미노산 치환 Q295E이다. 일부 실시 형태에서, 중쇄 위치 295에서의 아미노산 치환은 아스파라긴 치환, 예컨대 아미노산 치환 Q295N이다. 특정 실시 형태에서, 조작된 항체는 아미노산 치환 E294Q 및 Q295A를 포함한다. 특정 실시 형태에서, 조작된 항체는 아미노산 치환 E294Q 및 Q295E를 포함한다. 특정 실시 형태에서, 조작된 항체는 아미노산 치환 E294Q 및 Q295N을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 294에서의 치환과 조합된 295에서의 치환은 WT mAb에 비하여 특정 시간프레임 이내에 아민-함유 페이로드 접합 검정에서 증가된 표지화 정도(DOL)를 나타내는, 온전한 글리칸을 갖는 조작된 항체를 제공한다. 일부 실시 형태에서, 294에서의 치환과 조합된 295에서의 치환은 탈글리코실화 WT mAb에 비하여 특정 시간프레임 이내에 아민-함유 페이로드 접합 검정에서 증가된 표지화 정도(DOL)를 나타내는, 온전한 글리칸을 갖는 조작된 항체를 제공한다.
일부 실시 형태에서, 온전한 글리칸을 갖는 본 명세서에 개시된 조작된 항체는 WT mAb 또는 탈글리코실화 WT mAb에 비하여 특정 시간프레임 이내에, 예를 들어 아민-함유 페이로드 접합 검정을 수행한지 0.5시간, 1시간, 1.5시간, 2시간, 2.5시간, 3시간, 3.5시간, 4시간, 4.5시간 또는 5시간(예를 들어, 0.5시간) 이내에 아민-함유 페이로드 접합 검정에서 증가된 표지화 정도(DOL)를 나타낸다. 일부 실시 형태에서, DOL은 22 내지 37℃에서 트랜스글루타미나제(예를 들어, MTG) 및 아민 페이로드 접합체(예를 들어, 3-아지도 프로필아민(3-APA))와의 조작된 항체의 특정 인큐베이션 기간 후에 결정된다. 일부 실시 형태에서, DOL은, 예를 들어 Agilent G6224 MS-TOF 질량 분석계 상에서 질량 분석(MS), 예컨대 액체 크로마토그래피 MS(LC-MS)를 사용하여 결정된다. 일부 실시 형태에서, 본 명세서에 개시된 조작된 항체는 WT mAb와 동등하거나 그에 비해 개선된 Tm을 나타낸다. 일부 실시 형태에서, 조작된 항체의 Tm은 WT mAb보다 적어도 약 0.5℃, 1℃, 1.5℃, 2℃, 2.5℃, 3℃, 3.5℃, 4℃, 4.5℃ 또는 5℃ 더 높다. 일부 실시 형태에서, Tm은 20℃부터 95℃까지의 열 스캐닝 시에 330 및 350 nm에서의 형광 강도의 변화를 모니터링함으로써 결정될 수 있다. 특정 실시 형태에서, 본 명세서에 개시된 조작된 항체는, 탈글리코실화를 필요로 하지 않고서, 탈글리코실화 WT mAb에 비하여 특정 시간프레임 이내에 아민-함유 페이로드 접합 검정에서 증가된 표지화 정도(DOL)를 나타내고, WT mAb와 동등하거나 그에 비해 개선된 Tm을 나타낸다.
일부 실시 형태에서, 본 발명의 조작된 항체는 세포 세포독성 검정에서 효과적이다. 특정 실시 형태에서, 조작된 항체는 WT mAb와 비교하여 세포 세포독성 검정에서 동일하게 효과적이다. 특정 실시 형태에서, 세포 세포독성 검정은 본 발명의 조작된 항체를 포함하는 ADC의 변동하는 농도에 의한 암 세포주(예를 들어, SKBR3)의 처리 및 처리의 종료 시점에서 (예를 들어, Cell Titer Glo를 사용한) 세포 생존력의 결정을 필요로 한다. 일부 실시 형태에서, 처리는 37℃에서 72시간 동안 행해진다.
다른 태양에 따르면, 본 발명은 항체-페이로드 접합체에 관한 것으로, 상기 항체-페이로드 접합체는 내인성 중쇄 Q295 잔기에서, 선택적으로 링커를 통해 페이로드에 접합된 본 발명의 조작된 항체를 포함한다.
다른 태양에 따르면, 본 발명은 내인성 중쇄 Q295 잔기에서 그리고 중쇄 위치 286, 287, 288, 289, 290, 293 또는 294의 조작된 글루타민(Q) 잔기에서, 선택적으로 링커를 통해 페이로드에 접합된 본 발명의 조작된 항체를 포함하는 항체-페이로드 접합체에 관한 것이다. 특정 실시 형태에서, 항체-페이로드 접합체는 내인성 중쇄 Q295 잔기에서 그리고 중쇄 위치 293의 조작된 글루타민(Q) 잔기에서, 선택적으로 링커를 통해 페이로드에 접합된다. 특정 실시 형태에서, 항체-페이로드 접합체는 내인성 중쇄 Q295 잔기에서 그리고 중쇄 위치 294의 조작된 글루타민(Q) 잔기에서, 선택적으로 링커를 통해 페이로드에 접합된다.
다른 태양에 따르면, 본 발명은 항체-페이로드 접합체에 관한 것으로, 상기 항체-페이로드 접합체는 중쇄 위치 294 단독의 조작된 글루타민(Q) 잔기에서, 선택적으로 링커를 통해 페이로드에 접합된 본 발명의 조작된 항체를 포함한다.
다른 태양에 따르면, 본 발명은 항체-페이로드 접합체에 관한 것으로, 상기 항체-페이로드 접합체는, 선택적으로 링커를 통해 하나 이상의 페이로드에 접합된 본 발명의 조작된 항체를 포함한다. 특정 실시 형태에서, 항체-페이로드 접합체는 (예를 들어, 조작된 항체의 각각의 중쇄 상의) 중쇄 위치 294의 조작된 글루타민(Q) 잔기 및 (예를 들어, 조작된 항체의 각각의 중쇄 상의) 중쇄 위치 295의 글루타민(Q) 잔기에서, 선택적으로 링커를 통해 페이로드에 접합된 본 발명의 조작된 항체를 포함한다.
특정 실시 형태에서, 본 발명의 조작된 항체는 글리코실화되어, 항체 글리칸을 함유한다. 따라서, 일부 실시 형태에서, 조작된 항체는, 온전한 글리칸을 보유하면서, (온전한 또는 탈글리코실화) WT 대조군에 비하여 특정 시간프레임 이내에, 아미노-함유 페이로드 접합 검정에서 증가된 표지화 정도를 나타낸다. 일부 실시 형태에서, 조작된 항체는, 온전한 글리칸을 보유하면서, 2의 DAR을 갖는 항체-페이로드 접합체를 제공한다. 일부 실시 형태에서, 조작된 항체는, 온전한 글리칸을 보유하면서, 4의 DAR을 갖는 항체-페이로드 접합체를 제공한다. 특정 실시 형태에서, 조작된 항체는, 온전한 글리칸을 보유하면서, (온전한 또는 탈글리코실화) WT 대조군에 비하여 특정 시간프레임 이내에, 아미노-함유 페이로드 접합 검정에서 증가된 표지화 정도를 나타내고, 4의 DAR을 갖는 항체-페이로드 접합체를 제공한다. 따라서, 본 발명의 조작된 항체는, Fc 수용체에 대한 WT 결합 및 WT 생물물리학적 특성, 예를 들어 열안정성을 보유하면서, 항체-페이로드 접합체의 더 효율적인 제조를 가능하게 할 수 있고/있거나 ADC에서 증가된 페이로드 대 항체 비를 가능하게 할 수 있다. 특정 실시 형태에서, 본 발명의 조작된 항체는 WT mAb와 비교하여 세포 세포독성 검정에서 동일하게 효과적이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "항체-페이로드 접합체"는 본 명세서에서 "페이로드"로 지칭되는 분자에 공유 연결된 항체를 지칭한다. "항체-약물 접합체"는 세포독성 또는 사이토졸 약물/작용제에 공유 연결된 "항체-페이로드 접합체"이며, 여기서 약물/작용제는 본 명세서에서 "페이로드"로도 지칭된다.
본 명세서를 고려하여 당업자에게 알려진 임의의 적합한 페이로드가 본 발명에 사용될 수 있다. 페이로드는, 예를 들어 약물/작용제, 링커, 클릭 반응 파트너 등일 수 있다. 특정 실시 형태에 따르면, 페이로드는, 예를 들어 세포독성제, 세포증식억제제, 화학요법제, 독소, 방사성 핵종, DNA, RNA, siRNA, 마이크로RNA, 펩티드 핵산, 비천연 아미노산, 펩티드, 효소, 형광 태그, 비오틴, 링커, 또는 제1 클릭 반응 파트너일 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "공유 연결된"은 페이로드가 적어도 하나의 공유 결합을 통해 항체에 부착됨을 의미한다. 결합은 직접적이거나(즉, 링커 없이) 간접적일 수 있다(즉, 링커를 통해).
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "링커"는 2개의 분자를 결합하는 화학적 모이어티(chemical moiety)를 지칭한다. 본 명세서를 고려하여 당업자에게 알려진 임의의 적합한 링커가 본 발명에 사용될 수 있다. 링커는, 예를 들어 단일 공유 결합, 치환 또는 비치환된 알킬 모이어티, 치환 또는 비치환된 헤테로알킬 모이어티, 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 링커, 펩티드 링커, 당-기반 링커, 또는 절단가능한 링커, 예컨대 이황화물 결합 또는 프로테아제 절단 부위, 예컨대 발린-시트룰린-PAB일 수 있다.
특정 태양에 따르면, 조작된 항체는 제1 클릭 반응 파트너에 접합된다. 특정 태양에 따르면, 항체-페이로드 접합체는 세포독성제, 세포증식억제제, 화학요법제, 독소, 방사성 핵종, DNA, RNA, siRNA, 마이크로RNA, 펩티드 핵산, 비천연 아미노산, 펩티드, 효소, 형광 태그, 및 비오틴 중 하나 이상을 포함하는 제2 클릭 반응 파트너와 추가로 반응되며, 그럼으로써 제2 항체-페이로드 접합체를 얻는다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "클릭 화학"은 샤플리스(Sharpless)에 의해 도입된 화학 철학을 지칭하는 것으로, 이는, 반응성 기를 포함하는 작은 단위들을 함께 결합시킴으로써 공유 결합을 신속하고 신뢰성 있게 생성하도록 조정된 화학을 설명한다(문헌[Kolb, et al., Angew Chem Int Ed Engl. 2001 Jun 1;40(11):2004-2021] 참조). 클릭 화학은 특정 반응을 지칭하는 것이 아니라, 자연에서 발견되는 반응을 모방하는 반응을 포함하지만 이로 한정되지 않는 개념을 지칭한다. 일부 실시 형태에서, 클릭 화학 반응은 모듈식이고/이거나, 범주가 넓고/넓거나, 높은 화학적 수율을 제공하고/하거나, 무해한 부산물을 생성하고/하거나, 입체특이적이고/이거나, 단일 반응 생성물과의 반응을 유리하게 하는 큰 열역학적 구동력을 나타내고/나타내거나, 생리학적 조건 하에서 실행될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 클릭 화학 반응은 높은 원자 경제를 나타내고/나타내거나, 단순한 반응 조건 하에서 실행될 수 있고/있거나, 용이하게 입수가능한 출발 물질 및 시약을 사용하고/하거나, 독성 용매를 사용하지 않거나 물과 같이 무해하거나 용이하게 제거되는 용매를 사용하고/하거나, 비-크로마토그래피 방법, 예컨대 결정화 또는 증류에 의한 단순한 생성물 단리를 제공한다. 소정 실시 형태에서, 클릭 화학 반응은 1,2,4-트라이아졸 링커를 형성하기 위한 아지드(-N3)와 알킨, 또는 알킨 모이어티 사이의 웨스겐 부가환화(Huisgen cycloaddition) 또는 1,3-쌍극성 부가환화이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "클릭 반응 파트너" 또는 "클릭 화학 핸들"은 클릭 화학 반응에 참여할 수 있는 반응물 또는 반응성 기를 지칭한다. 클릭 반응 파트너는 천연 발생 생체분자에서 거의 발견되지 않고 생체분자에 대해 화학적으로 불활성인 모이어티일 수 있지만, 예를 들어 아지드-반응성 또는 알킨-반응성 기와 반응할 경우, 반응은 생물학적 관련 조건 하에서, 예를 들어 세포 배양 조건에서, 예컨대 과량의 열 또는 가혹한 반응물의 부재 하에서 효율적으로 일어날 수 있다. 일반적으로, 클릭 화학 반응은 서로 반응할 수 있는 클릭 반응 파트너들을 포함하는 2개 이상의 분자를 필요로 한다. 서로 반응성인 그러한 클릭 반응 파트너들은 때때로 본 명세서에서 클릭 화학 핸들 쌍, 또는 클릭 화학 쌍으로 지칭된다. 일부 실시 형태에서, 클릭 반응 파트너들은 아지드와 변형된(strained) 알킨, 예를 들어 사이클로옥틴, 또는 임의의 다른 알킨이다. 다른 실시 형태에서, 클릭 반응 파트너들은 반응성 다이엔과 적합한 테트라진 친다이엔체(dienophile)이다. 예를 들어, 트랜스-사이클로옥텐, 노르보르넨, 또는 비스사이클로노넨은 클릭 반응 쌍으로서 적합한 테트라진 친다이엔체와 쌍을 이룰 수 있다. 또 다른 실시 형태에서, 테트라졸은, "광-클릭" 반응 쌍으로 지칭되는 클릭 반응 쌍을 생성하기 위해 자외광의 존재 하에서 비활성화된 알켄과 쌍을 이룰 수 있는 니트릴 이민의 잠재적 공급원으로서 작용할 수 있다. 다른 실시 형태에서, 클릭 반응 파트너들은 시스테인과 말레이미드이다. 예를 들어, 펩티드(예를 들어, GGGC)로부터의 시스테인은 킬레이트제(예를 들어, NOTA)와 회합된 말레이미드와 반응될 수 있다. 다른 적합한 클릭 화학 핸들이 당업자에게 알려져 있다(예를 들어, 문헌[Spicer et al., "Selective chemical protein modification." Nature Communications. 2014; 5:4740] 참조). 다른 실시 형태에서, 클릭 반응 파트너들은 스타우딩거 라이게이션(Staudinger ligation) 성분, 예컨대 포스핀과 아지드이다. 다른 실시 형태에서, 클릭 반응 파트너는 딜스-알더(Diels-Alder) 반응 성분, 예컨대 다이엔, 예컨대 테트라진과, 알켄, 예컨대 트랜스-사이클로옥텐(TCO) 또는 노르보르넨이다. 예시적인 클릭 반응 파트너들이 미국 특허 제20130266512호 및 국제 특허 출원 공개 WO2015073746호에 기재되어 있으며, 이들 둘 모두에서의 클릭 반응 파트너들에 대한 관련 설명은 본 명세서에 참고로 포함된다. 바람직한 실시 형태에 따르면, 제1 및 제2 클릭 반응 파트너 중 하나는 알킨 기를 포함하고, 다른 하나의 클릭 반응 파트너는 아지드를 포함한다. 다른 바람직한 실시 형태에 따르면, 제1 및 제2 클릭 반응 파트너 중 하나는 알켄 기를 포함하고, 다른 하나의 클릭 반응 파트너는 다이엔을 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "알킨", "알킨 기", 또는 "알킨 모이어티"는 탄소-탄소 삼중 결합을 포함하는 작용기를 지칭한다. 알킨 모이어티는 말단 알킨 및 사이클릭 알킨, 바람직하게는 아지드 기와 반응성인 말단 알킨 및 사이클릭 알킨을 포함한다. 말단 알킨은 삼중 결합된 탄소 원자에 결합된 적어도 하나의 수소 원자를 갖는다. 사이클릭 알킨은 하나 이상의 삼중 결합을 포함하는 사이클로알킬 고리이다. 사이클릭 알킨의 예에는 사이클로옥틴 및 사이클로옥틴 유도체, 예컨대 바이사이클로노닌(BCN), 다이플루오르화 사이클로옥틴(DIFO), 다이벤조사이클로옥틴(DIBO), 케토-DIBO, 바이아릴아자사이클로옥티논(BARAC), 다이벤조아자사이클로옥틴(DIBAC), 다이메톡시아자사이클로옥틴(DIMAC), 다이벤지오사이클로옥틴(DBCO), 다이플루오로벤조사이클로옥틴(DIFBO), 모노벤조사이클로옥틴(MOBO), 및 테트라메톡시 DIBO(TMDIBO)가 포함되지만 이로 한정되지 않는다.
바람직한 실시 형태에 따르면, 제1 클릭 반응 파트너는 3-아지도-1-프로필아민이다. 바람직한 실시 형태에 따르면, 제2 클릭 반응 파트너는 다이벤조사이클로옥틴-테트라에틸렌 글리콜-발린-시트룰린-파라아미노벤질 카르바메이트-모노메틸 오리스타틴 F(DBCO-val-cit-MMAF 또는 DBCO-vcMMAF) 또는 다이벤조사이클로옥틴-테트라에틸렌 글리콜-모노메틸 오리스타틴 F(DBCO-MMAF)이다.
본 발명의 조작된 항체는 각종 다양한 기질에 접합되어, 접합된 항체 페이로드를 형성할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 기질은 절단가능하거나 절단 불가능한 링커를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 기질은 3-아지도프로필아민이다. 일부 실시 형태에서, 기질은 짧은 PEG 링커를 갖는 아지드-함유 아민, 예컨대 비오틴-연결된 아민 펜틸아미노비오틴이다. 일부 실시 형태에서, 기질은 NH2-PEG4-MMAF이다. 일부 실시 형태에서, 기질은 NH2-PEG4-Val-Cit-PABC-MMAF이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "다이엔"은 2개의 탄소-대-탄소 이중 결합을 갖는 화합물을 지칭하며, 여기서 이들 이중 결합은 1,3-위치에서 컨쥬게이트된다. 다이엔의 이중 결합은 시스 또는 트랜스일 수 있다. 다이엔의 예에는 테트라진 또는 테트라졸 기가 포함되지만 이로 한정되지 않는다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "알켄", "알켄 기", 또는 "알켄 모이어티"는 탄소-탄소 이중 결합을 포함하는 불포화 탄화수소 분자를 지칭한다. 특정 실시 형태에 따르면, 알켄은 2 내지 100개의 탄소 원자를 포함할 수 있다. 알켄의 예에는 노르보르넨 및 트랜스-사이클로옥텐(TCO)이 포함되지만 이로 한정되지 않는다. 다른 바람직한 실시 형태에 따르면, 제1 및 제2 클릭 반응 파트너 중 하나는 알켄 기, 바람직하게는 노르보르넨 또는 TCO를 포함한다. 바람직한 실시 형태에 따르면, 다른 하나의 클릭 반응 파트너는 다이엔, 바람직하게는 테트라진 또는 테트라졸 기를 포함한다.
클릭 화학 반응을 실행하기 위한 조건은 당업계에 알려져 있으며, 본 명세서를 고려하여 당업자에게 알려진 클릭 화학 반응을 실행하기 위한 임의의 조건이 본 발명에 사용될 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "약물-대-항체 비"라고도 불리는 용어 "DAR"은 항체-페이로드 접합체에서 항체에 연결된 페이로드의 수를 지칭한다. DAR은 다양할 수 있으며, 페이로드가 접합될 수 있는 항체 상의 이용가능한 부위의 수에 의해 제한될 것이다. 일부 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 항체-페이로드 접합체는 1 내지 4, 예컨대 1, 2, 3 또는 4의 DAR을 갖는다. 항체-페이로드 접합체들의 집단(또는 배치(batch))에 대한 DAR은 분광광도 측정을 사용하여 실험적으로 결정될 수 있다. 이러한 집단은 약물 부하가 상이한 항체-페이로드 접합체들의 혼합물을 함유할 수 있다. 따라서, 항체-페이로드 접합체들의 집단에 대한 DAR은 전형적으로 집단 내의 항체-페이로드 접합체들의 평균 DAR을 나타내며, 이는 1, 2, 3, 4, 또는 이들 사이의 임의의 값일 수 있다.
일 실시 형태에서, 본 출원의 항체-페이로드 접합체는 1 내지 4, 바람직하게는 2 내지 4, 더 바람직하게는 4의 DAR을 갖는다. 더 바람직하게는, 항체-페이로드 접합체 내의 조작된 항체는 글리코실화되어, 항체 글리칸을 함유한다. 가장 바람직하게는, 본 출원의 항체-페이로드 접합체는 페이로드에 접합된 본 발명의 글리코실화된 조작된 항체를 포함하며, 항체-페이로드 접합체는 2 내지 4, 바람직하게는 약 4의 DAR을 갖는다.
다른 일반적인 태양에서, 본 발명은 항체-페이로드 접합체를 생성하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은
a. 본 발명의 조작된 항체를 제공하는 단계;
b. 아민-함유 페이로드를 제공하는 단계; 및
c. 상기 조작된 항체 및 상기 아민-함유 페이로드를, 내인성 중쇄 Q295에서, 또는 내인성 중쇄 Q295에서 그리고 중쇄 위치 286, 287, 288, 289, 290, 293 또는 294의 조작된 글루타민(Q) 잔기에서 상기 페이로드에 접합된 상기 조작된 항체를 포함하는 상기 항체-페이로드 접합체를 생성하는 조건 하에서 트랜스글루타미나제와 접촉시키는 단계를 포함한다.
특정 실시 형태에서, 단계 c.의 조작된 항체는 내인성 중쇄 Q295에서 그리고 중쇄 위치 293의 조작된 글루타민(Q) 잔기에서 페이로드에 접합된다. 다른 실시 형태에서, 단계 c.의 조작된 항체는 내인성 중쇄 Q295에서 그리고 중쇄 위치 294의 조작된 글루타민(Q) 잔기에서 페이로드에 접합된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "부위-특이적"은 특정 부위에서(예를 들어, 내인성 Q295에서 또는 N286Q, A287Q, K288Q, T289Q, K290Q, E293Q 또는 E294Q 치환에서) 항체에 대한 아민-함유 페이로드의 특이적 접합 또는 가교결합을 지칭한다. 부위 특이성은 질량 분석(예를 들어, 매트릭스-보조 레이저-탈착 이온화 질량 분석(MALDI-MS), 전기분무 이온화 질량 분석(ESI-MS), 탠덤 질량 분석(MS-MS), 및 비행 시간 질량 분석(TOF-MS), 소수성 상호작용 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 부위-지정 돌연변이유발, 형광-표지화, 크기 배제 크로마토그래피, 및 X-선 결정구조해석을 포함하지만 이로 한정되지 않는 다양한 기법에 의해 측정될 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "아민-함유 페이로드"는 하나 이상의 반응성 아민(예를 들어, 1차 아민)을 함유하는 페이로드를 지칭한다. 예를 들어, 아민-함유 페이로드는 아민 공여체 단위(예를 들어, 1차 아민 NH2), 링커(예를 들어, 아민 공여체 단위에 연결되고 페이로드, 예컨대 소분자, 폴리펩티드, 또는 생체적합성 중합체에 대한 부착을 위한 추가의 작용기를 함유하는 분자), 및 작용제 모이어티(예를 들어, 페이로드, 예컨대 세포독성제, 세포증식억제제, 화학요법제, 독소, 방사성 핵종, DNA, RNA, siRNA, 마이크로RNA, 펩티드 핵산, 비천연 아미노산, 펩티드, 효소, 형광 태그, 비오틴, 링커 또는 제1 클릭 반응 파트너)를 포함할 수 있다. 아민-함유 페이로드는 또한 폴리펩티드(예를 들어, 항체), 또는 하나 이상의 반응성 라이신, N-말단, 또는 반응성 아민을 함유하는 생체적합성 중합체일 수 있다.
본 명세서에 기재된 내인성 Q295 및 N286Q, A287Q, K288Q, T289Q, K290Q, E293Q 및 E294Q 치환 둘 모두는 트랜스글루타미나제에 대한 기질이며, 글루타민과 아민-함유 페이로드 사이의 결합은 화학식 CO-NH-를 가지며, 여기서 NH-는 링커 및 페이로드 모이어티에 연결된다.
트랜스글루타미나제는 단백질-글루타민 γ- 글루타밀트랜스퍼라제(EC 2.3.2.13)이며, 이는 전형적으로 라이신 잔기에 의한 글루타민 잔기의 pH-의존성 아미노 기 전이(transamidation)를 촉매한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "트랜스글루타미나제"는 페이로드 상의 유리 아민 기와 항체 내의 글루타민 잔기의 측쇄 상의 아실 기 사이의 아이소펩티드 결합의 형성을 촉매하는 효소를 지칭한다. 트랜스글루타미나제의 예에는 미생물 트랜스글루타미나제(mTG), 인간 트랜스글루타미나제, 조직 트랜스글루타미나제(tTG), 및 인자 XIII이 포함되지만 이로 한정되지 않는다. 인간 트랜스글루타미나제의 예에는 각질세포 트랜스글루타미나제(Uniprot P22735), 조직 트랜스글루타미나제(UniProt P21980), 표피 트랜스글루타미나제 및 전립선 트랜스글루타미나제가 포함되지만 이로 한정되지 않는다. 이들 효소는 천연 공급원 또는 재조합 공급원으로부터 유래될 수 있다. 펩티드 또는 폴리펩티드 내의 글루타민 및 라이신 아미노산은 트랜스글루타미나제 가교결합을 위한 기질일 수 있다. 예를 들어, 페이로드는 라이신을 포함하는 링커에 연결될 수 있다.
본 명세서에 기재된 본 발명에 사용되는 트랜스글루타미나제는 다양한 공급원으로부터 입수되거나 제조될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 트랜스글루타미나제는 효소 입체형태 변화를 유도하고 효소 활성을 가능하게 하는 데 칼슘을 필요로 하는 칼슘 의존성 트랜스글루타미나제이다. 예를 들어, 트랜스글루타미나제는 기니피그 간으로부터 유래되고 상업적 공급원(예를 들어, Sigma-Aldrich(미국 미주리주 세인트 루이스 소재) 및 MP Biomedicals(미국 캘리포니아주 어바인 소재))을 통해 입수될 수 있다.
일부 실시 형태에서, 트랜스글루타미나제는 진균 단백질(예를 들어, 오미세테스(Oomycetes), 악티노미세테스(Actinomycetes), 사카로미세스(Saccharomyces), 칸디다(Candida), 크립토콕쿠스(Cryptococcus), 모나스쿠스(Monascus), 또는 리조푸스(Rhizopus) 트랜스글루타미나제)로부터 유래된다. 일부 실시 형태에서, 트랜스글루타미나제 폴리펩티드는 믹소미세테스(Myxomycetes)로부터 유래된다(예를 들어, 피사룸 폴리세팔룸(Physarum polycephalum) 트랜스글루타미나제). 일부 실시 형태에서, mTGase 폴리펩티드는 세균 단백질로부터 유래되며, 예컨대 스트렙토베르티실리움 종(Streptoverticillium sp.) 또는 스트렙토미세스 종(Streptomyces sp.)(예를 들어, 스트렙토미세스 모바렌시스(Streptomyces mobarensis) 또는 스트렙토베르티실리움 모바렌시스(Streptoverticillium mobarensis))으로부터 유래되는 트랜스글루타미나제이다. 일부 실시 형태에서, 트랜스글루타미나제 폴리펩티드는 세균 단백질로부터 유래되며, 예컨대 비제한적으로, 스트렙토베르티실리움 모바렌시스, 스트렙토베르티실리움 그리세오카메움(Streptoverticillium griseocameum), 스트렙토베르티실리움 라다카툼(Streptoverticillium ladakanum), 스트렙토미세스 모바렌시스, 스트렙토미세스 비리디스(Streptomyces viridis), 스트렙토미세스 라다카눔(Streptomyces ladakanum), 스트렙토미세스 카니페루스(Streptomyces caniferus), 스트렙토미세스 플라텐시스(Streptomyces platensis), 스트렙토미세스 히그로스코피우스(Streptomyces hygroscopius), 스트렙토미세스 네트롭시스(Streptomyces netropsis), 스트렙토미세스 프라디아이(Streptomyces fradiae), 스트렙토미세스 로세오베르티빌라투스(Streptomyces roseovertivillatus), 스트렙토미세스 신나마오네오우스(Streptomyces cinnamaoneous), 스트렙토미세스 그리세오카메움(Streptomyces griseocameum), 스트렙토미세스 라벤둘라이(Streptomyces lavendulae), 스트렙토미세스 리비단스(Streptomyces lividans), 스트렙토미세스 리디쿠스(Streptomyces lydicus), 스트렙토미세스 시오얀시스(Streptomyces sioyansis), 악티노마두라 종(Actinomadura sp.), 바실루스(Bacillus)(예를 들어, 바실루스 시르쿨란스(Bacillus circulans), 바실루스 수브틸리스(Bacillus subtilis) 등), 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes), 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum), 클로스트리디움(Clostridium), 엔테로박테르 종(Enterobacter sp.), 미크로콕쿠스(Micrococcus), 프로비덴시아 종(Providencia sp.), 또는 이들의 분리주로부터 유래되는 트랜스글루타미나제이다. 일부 실시 형태에서, 트랜스글루타미나제는 효소 입체형태 변화를 유도하고 효소 활성을 가능하게 하는 데 칼슘을 필요로 하지 않는 칼슘 비의존성 트랜스글루타미나제이다. 일부 실시 형태에서, 트랜스글루타미나제 폴리펩티드는 S. 모바렌시스로부터 유래된다.
구매가능한 칼슘 비의존성 트랜스글루타미나제, 예컨대 ACTIVA(Ajinomoto, 일본 소재)가 또한 본 발명에 적합하다.
일부 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 본 발명에 사용되는 트랜스글루타미나제는 또한 당업자에게 알려진 재조합 기법을 사용하여 생성된 재조합 단백질일 수 있다. 일부 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 본 발명에 사용되는 트랜스글루타미나제는 정제된 단백질일 수 있다.
트랜스글루타미나제 접합 반응을 실행하기 위한 조건은 당업계에 알려져 있으며, 본 명세서를 고려하여 당업자에게 알려진 트랜스글루타미나제 접합 반응을 실행하기 위한 임의의 조건이 본 발명에 사용될 수 있다.
바람직한 실시 형태에서, 본 발명의 조작된 항체는, 그것이 항체-페이로드 접합체를 생성하기 위해 아민-함유 페이로드 및 트랜스글루타미나제와 접촉되기 전에, 탈글리코실화되지 않는다.
다른 일반적인 태양에서 본 발명은 본 발명의 조작된 항체 또는 이의 단편을 인코딩하는 핵산에 관한 것이다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "핵산"은 폴리뉴클레오티드, 예컨대 데옥시리보핵산(DNA) 또는 리보핵산(RNA)을 지칭한다. 이 용어는 단일 가닥 핵산, 이중 가닥 핵산, 및 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드 유사체로부터 제조된 RNA 및 DNA를 포함하는 데 사용된다.
다른 일반적인 태양에서, 본 발명은 본 발명의 핵산을 포함하는 벡터에 관한 것이다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "벡터"는 제2 핵산 분자를 세포 내로 수송하는 데 사용될 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 일 실시 형태에서, 벡터는 벡터 내로 삽입된 DNA 서열의 복제를 가능하게 한다. 벡터는 적어도 일부 숙주 세포에서 핵산 분자의 발현을 향상시키기 위해 프로모터를 포함할 수 있다. 벡터는 자율적으로(염색체외) 복제될 수 있거나, 또는 숙주 세포 염색체에 통합될 수 있다. 일 실시 형태에서, 벡터는 벡터 내로 삽입된 핵산 서열의 적어도 일부로부터 유래되는 단백질을 생성할 수 있는 발현 벡터를 포함할 수 있다.
다른 일반적인 태양에서, 본 발명은 본 발명의 핵산 또는 벡터를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "숙주 세포"는, 본 발명에 따라 배양 시에 성장되어 관심 단백질 또는 폴리펩티드를 생성하는 세포를 지칭한다. 소정 실시 형태에서, 숙주 세포는 포유류 세포이다.
다른 일반적인 태양에서, 본 발명은 본 발명의 조작된 항체를 생성하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 상기 항체 또는 이의 단편을 발현시키기에 적합한 조건 하에서 본 발명의 숙주 세포를 인큐베이션하는 단계, 및 상기 항체 또는 이의 단편을 단리하는 단계를 포함한다.
약제학적 조성물 및 치료 방법
다른 일반적인 태양에서, 본 발명은 본 발명의 조작된 항체 또는 본 발명의 항체-페이로드 접합체 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "담체"는 임의의 부형제, 희석제, 충전제, 염, 완충제, 안정제, 가용화제, 오일, 지질, 지질 함유 베시클, 미소구체, 리포좀 캡슐화, 또는 약제학적 제형에 사용하기 위한 당업계에 잘 알려진 다른 물질을 지칭한다. 담체, 부형제, 또는 희석제의 특성은 특정 응용을 위한 투여 경로에 좌우될 것임이 이해될 것이다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "약제학적으로 허용되는 담체"는 본 발명에 따른 조성물의 유효성 또는 본 발명에 따른 조성물의 생물학적 활성을 방해하지 않는 비독성 물질을 지칭한다. 특정 실시 형태에 따르면, 본 명세서를 고려하여, 항체-기반 약제학적 조성물에 사용하기에 적합한 임의의 약제학적으로 허용되는 담체가 본 발명에 사용될 수 있다.
특정 실시 형태에 따르면, 본 명세서에 기재된 조성물은 대상체에 대한 의도된 투여 경로에 적합하도록 제형화된다. 예를 들어, 본 명세서에 기재된 조성물은 정맥내, 피하, 근육내, 또는 종양내 투여에 적합하도록 제형화될 수 있다.
다른 일반적인 태양에서, 본 발명은 질병 또는 장애의 치료를 필요로 하는 대상체에서 상기 질병 또는 장애를 치료하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 본 발명의 약제학적 조성물을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 특정 실시 형태에 따르면, 질병 또는 장애는 종양, 예컨대 고형 종양 또는 혈액 매개성 종양이며, 특히 종양은 암이다.
특정 실시 형태에 따르면, 본 발명의 방법은 본 발명의 약제학적 조성물의 치료적 유효 용량을 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 조성물은 질병 또는 장애와 관련된 세포를 표적화하기 위한 항체-약물 접합체를 포함하며, 이로써, 표적화 시에, 약물은 표적화된 세포에 전달되고 그에 대해 효과를 야기하게 되며, 그럼으로써 질병 또는 장애를 치료하게 된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "치료적 유효량"은 대상체에서 원하는 생물학적 또는 의학적 반응을 도출하는 활성 성분 또는 성분의 양을 지칭한다. 특정 유효 용량의 선택은 치료 또는 예방될 질병, 수반되는 증상, 환자의 체중, 환자의 면역 상태 및 당업자에게 알려진 다른 인자를 포함한 몇몇 인자의 고려에 기초하여 당업자에 의해 (예를 들어, 임상 시험 및/또는 전임상 검정을 통해) 결정될 수 있다. 제형에 사용되는 정확한 용량은 또한 투여 경로, 및 질병의 중증도에 좌우될 것이며, 전문의의 판단 및 각각의 환자의 상황에 따라 결정되어야 한다. 일부 경우에, 유효 용량은 시험관내 또는 동물 모델 시험 시스템으로부터 도출되는 용량-반응 곡선으로부터 외삽될 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "치료하다", "치료하는", 및 "치료"는 모두, 항체-약물 접합체의 투여가 이익이 되는 질병, 장애, 또는 질환과 관련된 하나 이상의 측정가능한 물리적 파라미터의 개선 또는 역전을 지칭하고자 하는 것이며, 이는 반드시 대상체에서 식별가능하지는 않지만, 대상체에서 식별가능할 수도 있다. 용어 "치료하다", "치료하는", 및 "치료"는 또한, 퇴행을 야기하거나, 진행을 예방하거나, 적어도 질병, 장애 또는 질환의 진행을 둔화시키는 것을 지칭할 수 있다. 특정 실시 형태에서, "치료하다", "치료하는", 및 "치료"는 항체-약물 접합체의 투여가 이익이 되는 질병, 장애, 또는 질환의 경감, 발생 또는 발병의 예방, 또는 하나 이상의 증상의 지속기간의 감소를 지칭한다. 특정 실시 형태에서, "치료하다", "치료하는", 및 "치료"는 질병, 장애 또는 질환의 재발의 예방을 지칭한다. 특정 실시 형태에서, "치료하다", "치료하는", 및 "치료"는 질병, 장애 또는 질환을 갖는 대상체의 생존율의 증가를 지칭한다. 특정 실시 형태에서, "치료하다", "치료하는", 및 "치료"는 대상체에서 질병, 장애 또는 질환의 제거를 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "대상체"는 동물, 바람직하게는 포유류를 지칭한다. 특정 실시 형태에 따르면, 대상체는 비-영장류(예를 들어, 낙타, 당나귀, 얼룩말, 소, 돼지, 말, 염소, 양, 고양이, 개, 래트, 토끼, 기니 피그, 마모셋 또는 마우스) 또는 영장류(예를 들어, 원숭이, 침팬지, 또는 인간)를 포함하는 포유류이다. 특정 실시 형태에서, 대상체는 인간이다.
특정 실시 형태에 따르면, 질병 또는 장애의 치료에 사용되는 조성물은 관련 질병 또는 장애의 치료에 효과적인 다른 작용제와 병용하여 사용될 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 대상체에 대한 2가지 이상의 요법의 투여와 관련하여 용어 "병용하여"는 하나 초과의 요법의 사용을 지칭한다. 용어 "병용하여"의 사용은 요법이 대상체에게 투여되는 순서를 제한하지 않는다.
배합물 및 키트
배합물 또는 키트가 본 명세서에 제공되며, 상기 배합물 또는 키트는
a. 본 발명의 조작된 항체; 및
b. 트랜스글루타미나제를 포함하며,
상기 배합물 또는 키트는 항체를 아민-함유 페이로드로 표지하는 데 사용되고자 한다.
특정 실시 형태에 따르면, 본 발명의 배합물은 항체를 페이로드와 접합하는 데 사용되는 반응 혼합물이다. 선택적으로, 의약품 또는 생물학적 제품의 제조, 사용, 또는 판매를 규제하는 정부 기관에 의해 규정된 형태의 고지 또는 설명서가 배합물과 연계될 수 있으며, 이러한 고지는 인간 투여를 위한 제조, 사용, 또는 판매에 관한 기관에 의한 승인을 반영한다. 본 명세서에 포함된 배합물은 항체를 페이로드와 접합하는 상기 방법에 사용되거나, 또는 질병 또는 장애의 치료를 필요로 하는 대상체에서 질병 또는 장애를 치료하는 상기 방법에 사용될 수 있다.
실시 형태
실시 형태 1은 조작된 항체로서, 상기 조작된 항체는 상기 항체의 중쇄 위치 302에서의 아미노산 치환을 포함하며, 여기서 상기 아미노산 넘버링은 카바트의 EU 인덱스에 따른다.
실시 형태 2는, 실시 형태 1에 있어서, 상기 아미노산 치환은 V302S, V302A, V302I, V302L, V302M, V302T, V302F, 및 V302Y로 이루어진 군으로부터 선택되는, 조작된 항체이다.
실시 형태 2a는, 실시 형태 2에 있어서, 상기 아미노산 치환은 V302S인, 조작된 항체이다.
실시 형태 2b는, 실시 형태 2에 있어서, 상기 아미노산 치환은 V302A인, 조작된 항체이다.
실시 형태 3은, 실시 형태 1, 실시 형태 2 또는 실시 형태 2a에 있어서, 중쇄 위치 286, 287, 288, 289, 290, 293 또는 294에서의 글루타민 치환을 추가로 포함하는, 조작된 항체이다.
실시 형태 3a는, 실시 형태 3에 있어서, 상기 글루타민 치환은 중쇄 위치 293에 존재하는, 조작된 항체이다.
실시 형태 3b는, 실시 형태 3에 있어서, 상기 글루타민 치환은 중쇄 위치 294에 존재하는, 조작된 항체이다.
실시 형태 4는, 실시 형태 3에 있어서, 상기 글루타민 치환은 N286Q, A287Q, K288Q, T289Q, K290Q, E293Q 또는 E294Q인, 조작된 항체이다.
실시 형태 5는, 실시 형태 4에 있어서, 상기 글루타민 치환은 E294Q인, 조작된 항체이다.
실시 형태 5a는, 실시 형태 4에 있어서, 상기 글루타민 치환은 E293Q인, 조작된 항체이다.
실시 형태 6은, 실시 형태 1 내지 실시 형태 5a 중 어느 하나에 있어서, 중쇄 위치 241, 243, 294 또는 301에서의 알라닌 치환을 추가로 포함하는, 조작된 항체이다.
실시 형태 7은, 실시 형태 6에 있어서, 상기 알라닌 치환은 F241A, F243A, E294A 또는 R301A인, 조작된 항체이다.
실시 형태 8은, 실시 형태 1 내지 실시 형태 7 중 어느 하나에 있어서, 중쇄 위치 300에서의 아미노산 치환을 추가로 포함하는, 조작된 항체이다.
실시 형태 9는, 실시 형태 8에 있어서, 상기 중쇄 위치 300에서의 아미노산 치환은 Y300L인, 조작된 항체이다.
실시 형태 10은 조작된 항체로서, 상기 조작된 항체는 상기 항체의 중쇄 위치 294에서의 아미노산 치환을 포함하며, 여기서 상기 아미노산 넘버링은 카바트의 EU 인덱스에 따른다.
실시 형태 11은, 실시 형태 10에 있어서, 상기 중쇄 위치 294에서의 아미노산 치환은 글루타민 치환인, 조작된 항체이다.
실시 형태 11a는, 실시 형태 11에 있어서, 상기 글루타민 치환은 E294Q인, 조작된 항체이다.
실시 형태 12는, 실시 형태 10에 있어서, 상기 중쇄 위치 294에서의 아미노산 치환은 알라닌 치환인, 조작된 항체이다.
실시 형태 12a는, 실시 형태 12에 있어서, 상기 알라닌 치환은 E294A인, 조작된 항체이다.
실시 형태 13은, 실시 형태 10에 있어서, 상기 중쇄 위치 294에서의 아미노산 치환은 메티오닌 치환인, 조작된 항체이다.
실시 형태 13a는, 실시 형태 13에 있어서, 상기 메티오닌 치환은 E294M인, 조작된 항체이다.
실시 형태 14는, 실시 형태 10에 있어서, 상기 중쇄 위치 294에서의 아미노산 치환은 페닐알라닌 치환인, 조작된 항체이다.
실시 형태 14a는, 실시 형태 14에 있어서, 상기 페닐알라닌 치환은 E294F인, 조작된 항체이다.
실시 형태 15는, 실시 형태 10에 있어서, 상기 중쇄 위치 294에서의 아미노산 치환은 라이신 치환인, 조작된 항체이다.
실시 형태 15a는, 실시 형태 15에 있어서, 상기 라이신 치환은 E294K인, 조작된 항체이다.
실시 형태 16은, 실시 형태 10에 있어서, 상기 중쇄 위치 294에서의 아미노산 치환은 류신 치환인, 조작된 항체이다.
실시 형태 16a는, 실시 형태 16에 있어서, 상기 류신 치환은 E294L인, 조작된 항체이다.
실시 형태 17은, 실시 형태 10에 있어서, 상기 중쇄 위치 294에서의 아미노산 치환은 아르기닌 치환인, 조작된 항체이다.
실시 형태 17a는, 실시 형태 17에 있어서, 상기 아르기닌 치환은 E294R인, 조작된 항체이다.
실시 형태 18은, 실시 형태 10에 있어서, 상기 중쇄 위치 294에서의 아미노산 치환은 발린 치환인, 조작된 항체이다.
실시 형태 18a는, 실시 형태 18에 있어서, 상기 발린 치환은 E294V인, 조작된 항체이다.
실시 형태 19는, 실시 형태 10에 있어서, 상기 중쇄 위치 294에서의 아미노산 치환은 티로신 치환인, 조작된 항체이다.
실시 형태 19a는, 실시 형태 19에 있어서, 상기 티로신 치환은 E294Y인, 조작된 항체이다.
실시 형태 20은, 실시 형태 11 또는 실시 형태 11a에 있어서, 중쇄 위치 295에서의 아미노산 치환을 추가로 포함하는, 조작된 항체이다.
실시 형태 20a는, 실시 형태 20에 있어서, 상기 중쇄 위치 295에서의 아미노산 치환은 Q295A인, 조작된 항체이다.
실시 형태 20b는, 실시 형태 20에 있어서, 상기 중쇄 위치 295에서의 아미노산 치환은 Q295E인, 조작된 항체이다.
실시 형태 20c는, 실시 형태 20에 있어서, 상기 중쇄 위치 295에서의 아미노산 치환은 Q295N인, 조작된 항체이다.
실시 형태 21은, 실시 형태 12 또는 실시 형태 12a에 있어서, 중쇄 위치 288에서의 아미노산 치환을 추가로 포함하는, 조작된 항체이다.
실시 형태 21a는, 실시 형태 21에 있어서, 상기 중쇄 위치 288에서의 아미노산 치환은 K288Q인, 조작된 항체이다.
실시 형태 22는, 실시 형태 10 내지 실시 형태 12a 중 어느 하나에 있어서, 중쇄 위치 302에서의 아미노산 치환을 추가로 포함하는, 조작된 항체이다.
실시 형태 23은, 실시 형태 22에 있어서, 상기 중쇄 위치 302에서의 아미노산 치환은 V302S, V302A, V302I, V302L, V302M, V302T, V302F, 또는 V302Y인, 조작된 항체이다.
실시 형태 23a는, 실시 형태 23에 있어서, 상기 중쇄 위치 302에서의 아미노산 치환은 V302S인, 조작된 항체이다.
실시 형태 23b는, 실시 형태 23에 있어서, 상기 중쇄 위치 302에서의 아미노산 치환은 V302A인, 조작된 항체이다.
실시 형태 24는, 실시 형태 10 내지 실시 형태 12a 및 실시 형태 22 내지 실시 형태 23b 중 어느 하나에 있어서, 중쇄 위치 300에서의 아미노산 치환을 추가로 포함하는, 조작된 항체이다.
실시 형태 25는, 실시 형태 24에 있어서, 상기 중쇄 위치 300에서의 아미노산 치환은 Y300L인, 조작된 항체이다.
실시 형태 26은 조작된 항체로서, 상기 조작된 항체는 중쇄 위치 302에서의 아미노산 치환 및 중쇄 위치 293에서의 아미노산 치환을 포함하며, 여기서 상기 아미노산 넘버링은 카바트의 EU 인덱스에 따른다.
실시 형태 27은 조작된 항체로서, 상기 조작된 항체는 중쇄 위치 302에서의 아미노산 치환 및 중쇄 위치 294에서의 아미노산 치환을 포함하며, 여기서 상기 아미노산 넘버링은 카바트의 EU 인덱스에 따른다.
실시 형태 28은 조작된 항체로서, 상기 조작된 항체는 아미노산 치환 V302S 및 아미노산 치환 E293Q 및 E294Q 중 적어도 하나를 포함하며, 여기서 상기 아미노산 넘버링은 카바트의 EU 인덱스에 따른다.
실시 형태 29는 조작된 항체로서, 상기 조작된 항체는 아미노산 치환 V302S 및 아미노산 치환 E293Q를 포함하며, 여기서 상기 아미노산 넘버링은 카바트의 EU 인덱스에 따른다.
실시 형태 30은 조작된 항체로서, 상기 조작된 항체는 아미노산 치환 V302A 및 아미노산 치환 E293Q를 포함하며, 여기서 상기 아미노산 넘버링은 카바트의 EU 인덱스에 따른다.
실시 형태 31은 조작된 항체로서, 상기 조작된 항체는 아미노산 치환 V302S 및 아미노산 치환 E294Q를 포함하며, 여기서 상기 아미노산 넘버링은 카바트의 EU 인덱스에 따른다.
실시 형태 32는 조작된 항체로서, 상기 조작된 항체는 아미노산 치환 V302A 및 아미노산 치환 E294Q를 포함하며, 여기서 상기 아미노산 넘버링은 카바트의 EU 인덱스에 따른다.
실시 형태 33은, 실시 형태 26 내지 실시 형태 32 중 어느 하나에 있어서, 중쇄 위치 300에서의 아미노산 치환을 추가로 포함하는, 조작된 항체이다.
실시 형태 33a는, 실시 형태 33에 있어서, 상기 중쇄 위치 300에서의 아미노산 치환은 Y300L인, 조작된 항체이다.
실시 형태 34는, 실시 형태 1 내지 실시 형태 33 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체는 인간 IgG 항체인, 조작된 항체이다.
실시 형태 34a는, 실시 형태 34에 있어서, 상기 인간 IgG 항체는 인간 IgG1 항체인, 조작된 항체이다.
실시 형태 34b는, 실시 형태 34에 있어서, 상기 인간 IgG 항체는 인간 IgG2 항체인, 조작된 항체이다.
실시 형태 34c는, 실시 형태 34에 있어서, 상기 인간 IgG 항체는 인간 IgG4 항체인, 조작된 항체이다.
실시 형태 35는, 실시 형태 1 내지 실시 형태 34c 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체는 글리코실화된, 조작된 항체이다.
실시 형태 35a는, 실시 형태 1 내지 실시 형태 34c 중 어느 하나에 있어서, 상기 조작된 항체의 항체 글리칸은 제거되지 않은, 조직된 항체이다.
실시 형태 36은 항체-페이로드 접합체로서, 상기 항체-페이로드 접합체는 실시 형태 1 내지 실시 형태 35a 중 어느 하나의 조작된 항체를 포함한다.
실시 형태 37은, 실시 형태 36에 있어서, 상기 페이로드는 세포독성제, 세포증식억제제, 화학요법제, 독소, 방사성 핵종, DNA, RNA, siRNA, 마이크로RNA, 펩티드 핵산, 비천연 아미노산, 펩티드, 효소, 형광 태그, 비오틴, 및 제1 클릭 반응 파트너로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 포함하는, 항체-페이로드 접합체이다.
실시 형태 38은, 실시 형태 36 또는 실시 형태 37에 있어서, 상기 페이로드는 상기 항체의 내인성 중쇄 Q295 잔기에서 상기 조작된 항체에 접합되는, 항체-페이로드 접합체이다.
실시 형태 39는, 실시 형태 36, 실시 형태 37 또는 실시 형태 38에 있어서, 상기 페이로드는 상기 조작된 항체의 중쇄 위치 286, 287, 288, 289, 290, 293 또는 294의 글루타민 잔기에서 상기 조작된 항체에 접합되는, 항체-페이로드 접합체이다.
실시 형태 40은, 실시 형태 36 내지 실시 형태 39 중 어느 하나에 있어서, 상기 페이로드는 Q295 및 상기 중쇄 위치 293 및 294의 글루타민 잔기 중 적어도 하나에서 상기 조작된 항체에 접합되는, 항체-페이로드 접합체이다.
실시 형태 40a는, 실시 형태 40에 있어서, 상기 페이로드는 Q295에서 그리고 상기 중쇄 위치 293의 글루타민 잔기에서 상기 조작된 항체에 접합되는, 항체-페이로드 접합체이다.
실시 형태 40b는, 실시 형태 40에 있어서, 상기 페이로드는 Q295에서 그리고 상기 중쇄 위치 294의 글루타민 잔기에서 상기 조작된 항체에 접합되는, 항체-페이로드 접합체이다.
실시 형태 41은, 실시 형태 36 내지 실시 형태 40b 중 어느 하나에 있어서, 1 내지 4의 약물 항체 비(DAR)를 갖는, 항체-페이로드 접합체이다.
실시 형태 41a는, 실시 형태 41에 있어서, 2 내지 4의 DAR을 갖는, 항체-페이로드 접합체이다.
실시 형태 42는, 실시 형태 36 내지 실시 형태 41 중 어느 하나에 있어서, 2의 DAR을 갖는, 항체-페이로드 접합체이다.
실시 형태 43은, 실시 형태 36 내지 실시 형태 41 중 어느 하나에 있어서, 4의 DAR을 갖는, 항체-페이로드 접합체이다.
실시 형태 44는 항체-페이로드 접합체를 생성하는 방법으로서, 상기 방법은 실시 형태 1 내지 실시 형태 35a 중 어느 하나의 조작된 항체 및 아민-함유 페이로드를 상기 페이로드에 접합된 상기 조작된 항체를 포함하는 상기 항체-페이로드 접합체를 생성하는 조건 하에서 트랜스글루타미나제와 접촉시키는 단계를 포함한다.
실시 형태 45는, 실시 형태 44에 있어서, 상기 방법은 상기 조작된 항체의 항체 글리칸을 제거하는 단계를 포함하지 않는, 방법이다.
실시 형태 46은, 실시 형태 44 또는 실시 형태 45에 있어서, 상기 아민-함유 페이로드는 세포독성제, 세포증식억제제, 화학요법제, 독소, 방사성 핵종, DNA, RNA, siRNA, 마이크로RNA, 펩티드 핵산, 비천연 아미노산, 펩티드, 효소, 형광 태그, 비오틴, 및 제1 클릭 반응 파트너 중 하나 이상을 포함하는, 방법이다.
실시 형태 47은, 실시 형태 44 내지 실시 형태 46 중 어느 하나에 있어서, 상기 아민-함유 페이로드는 제1 클릭 반응 파트너를 포함하는, 방법이다.
실시 형태 48은, 실시 형태 47에 있어서, 상기 방법은 상기 항체-페이로드 접합체를 제2 클릭 반응 파트너와 반응시켜 제2 항체-페이로드 접합체를 얻는 단계를 추가로 포함하며, 여기서 상기 제2 클릭 반응 파트너는 세포독성제, 세포증식억제제, 화학요법제, 독소, 방사성 핵종, DNA, RNA, siRNA, 마이크로RNA, 펩티드 핵산, 비천연 아미노산, 펩티드, 효소, 형광 태그, 및 비오틴 중 하나 이상을 포함하는, 방법이다.
실시 형태 49는, 실시 형태 47 또는 실시 형태 48에 있어서, 상기 제1 클릭 반응 파트너는 3-아지도-1-프로필아민이고, 상기 제2 클릭 반응 파트너는 다이벤조사이클로옥틴-테트라에틸렌 글리콜-발린-시트룰린-파라아미노벤질 카르바메이트-모노메틸 오리스타틴 F(DBCO-val-cit-MMAF) 또는 다이벤조사이클로옥틴-테트라에틸렌 글리콜-모노메틸 오리스타틴 F(DBCO-MMAF)인, 방법이다.
실시 형태 50은, 실시 형태 4 내지 실시 형태 49 중 어느 하나에 있어서, 상기 조작된 항체는 그것이 상기 페이로드에 접합되기 전에 탈글리코실화를 거치지 않은, 방법이다.
실시 형태 51은 실시 형태 1 내지 실시 형태 35a 중 어느 하나의 조작된 항체 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물이다.
실시 형태 52는 실시 형태 36 내지 실시 형태 43 중 어느 하나의 항체-페이로드 접합체 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물이다.
실시 형태 53은 질병 또는 장애의 치료를 필요로 하는 대상체에서 상기 질병 또는 장애를 치료하는 방법으로서, 상기 방법은 실시 형태 51 또는 실시 형태 52의 약제학적 조성물을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
실시 형태 54는, 실시 형태 53에 있어서, 상기 질병 또는 장애는 종양, 예컨대 고형 종양 또는 혈액 매개성 종양이며, 특히 상기 종양은 암인, 방법이다.
실시 형태 55는 실시 형태 1 내지 실시 형태 35a 중 어느 하나의 조작된 항체를 인코딩하는 핵산이다.
실시 형태 56은 실시 형태 55의 핵산을 포함하는 숙주 세포이다.
실시 형태 57은 조작된 항체를 생성하기 위한 방법으로서, 상기 방법은 상기 조작된 항체를 발현시키기에 적합한 조건 하에서 실시 형태 56의 숙주 세포를 인큐베이션하는 단계를 포함하는, 방법이다.
실시 형태 57a는, 실시 형태 57에 있어서, 상기 조작된 항체를 단리하는 단계를 추가로 포함하는, 방법이다.
실시 형태 58은 키트로서, 상기 키트는 (a) 실시 형태 1 내지 실시 형태 35a 중 어느 하나의 조작된 항체; 및 (B) 트랜스글루타미나제를 포함한다.
실시예
본 발명의 하기 실시예는 본 발명의 성질을 추가로 예시하기 위한 것이다. 하기 실시예는 본 발명을 제한하지 않으며, 본 발명의 범주는 첨부된 청구범위에 의해 결정됨이 이해되어야 한다.
실시예 1: 설치류 IgG는 CH2 도메인 내에 추가의 트랜스글루타미나제-촉매된 변형 부위를 갖는다
탈글리코실화 방법(문헌[Jeger et al., 상기 참조])을 사용하여 3-아지도 프로필아민(3-APA)을 뮤린 DEC205를 표적화하는 래트 IgG2a mAb인 NLDC-145에 접합시켰지만, 3-APA는 탈글리코실화 mAb당 4개(단량체당 2개)의 위치에서 접합되었으며, 인간 IgG에서 (위치 Gln295에서) 관찰된 바와 같이 2개가 아니었다. 3-APA의 4개의 분자를 초과하여 추가의 부가는 관찰되지 않았는데, 이는, 이 mAb에서 단량체당 2개의 별개의 접합 부위가 존재함을 시사한다. 접합된, 탈글리코실화 NLDC-145의 펩티드 맵핑은 예상된 부착 부위, Gln295, 및 Gln288인 것으로 결정된 추가의 부위를 확인시켜 주었다(도 1a).
온전한 글리칸을 갖는 NLDC-145와 3-APA 및 MTG의 반응 시에, 접합이 여전히 관찰되었으며, mAb당 0 내지 4개 범위의 3-APA 분자의 종들의 혼합물을 생성하였다. 이 접합체의 펩티드 맵핑은 1차 변형 부위가 Gln295이고, Gln288의 약간의 변형을 가졌음을 보여주었다. 감소된 MS는 mAb 글리칸 구조가 MTG에 대한 반응성에서 역할을 하였음을 보여주었는데, 그 이유는, Man5 글리칸을 갖는 mAb는 Gln295 및 Gln288 둘 모두에서 변형된 것으로 확인된 반면, G0F 글리칸을 갖는 mAb는 중쇄당 1 미만의 변형을 가졌기 때문이다(도 1b). 고-만노스 글리칸을 갖는 mAb의 CH2 도메인의 용융 온도는 G0F 글리칸을 갖는 동일한 도메인보다 4.3℃ 더 낮은데(문헌[Wada et al., 2019, MAbs 11(2): 350-372]), 이는 G0F 당이 CH2 도메인에 대한 추가의 안정화를 제공하는 방식으로 단백질과 접촉한다는 것을 시사한다. 글리칸을 변형시키는 대신에 특정 점 돌연변이를 mAb 내로 도입함으로써 이러한 단백질-당 상호작용을 변경시키는 것은 또한 Gln295에서의 효율적인 MTG 변형을 가능하게 할 수 있는 것으로 여겨졌다 - 심지어, 온전한 글리칸을 갖는 경우에도, 그리고 글리칸 구조에 관계없이.
실시예 2: 트랜스글루타미나제를 사용한 글리코실화 단일클론 항체의 부위-특이적 접합
mAb 조작 전략이 인간 IgG의 MTG-촉매된 접합을 가능하게 할 수 있는지를 결정하기 위하여, 인간화 IgG1 mAb 트라스투주맙의 일련의 변이체(예를 들어, 문헌[Nahta and Esteva, 2007, Oncogene 26(25):3637-43] 참조)를 생성하였다. 이들 변이체는 CH2 도메인의 구조를 기반으로 하여, 위치 295 및 그것이 위치된 베타-시트에 근접한 위치 및/또는 mAb 글리칸과 접촉하는 위치에 초점을 두었다. 많은 경우에, 변이체는 래트 IgG2a의 상응하는 서열의 생착(engrafting)을 기반으로 하였다. 이들 변이체를 트랜스글루타미나제 및 3-APA와 반응시키고, 질량 분석으로 분석하였다.
이들 mAb를 CHO 세포에서 발현시키고, 표준 방법을 사용하여 단백질 A 크로마토그래피로 정제하였다. 감소된 mAb들을 LC-MS로 분석하여 존재하는 글리칸들의 분포를 결정하였으며, 모든 경우에 G0F가 주요 종이었다. 다른 글리칸에 상응하는 소량(10% 미만)의 질량이 일부 mAb에서 관찰되었으며, K288Q/Y300L/V302S 변이체는 유의한 비율을 가졌는데, 이는 G1F 글리칸에 상응하였다.
MTG-촉매된 접합에 대한 mAb 변이체의 적합성을 평가하기 위하여, 온전한 mAb(1 mg/mL)를 22 내지 37℃에서 30분 내지 하룻밤 동안 PBS 완충액 중에서 3-아지도 프로필아민(3-APA; 20 내지 100배 몰 과량) 및 MTG(Activa TI, 5 내지 20% w/v 또는 Zedira, 5 내지 20개의 단위/mg mAb)와 반응시켰다. MTG 차단제(Zedira)를 100 μM로 첨가하여 반응을 정지하고, LC-MS로 분석한 후, PNGase F를 사용하여 탈글리코실화하고 다이티오트레이톨을 사용하여 환원시켰다. 표지화 정도(DOL)를 질량 분석으로 결정하였다.
LC-MS는 Agilent G6224 MS-TOF 질량 분석계에 연결된 Agilent 1260 HPLC 시스템 상에서 수행하였다. LC는 이동상: (A) 물 중 0.1% 포름산 및 (B) 아세토니트릴 중 0.1% 포름산(Sigma-Aldrich Cat# 34688) 및 20% B(0 내지 2분), 20 내지 60% B(2 내지 3분), 60 내지 80% B(3 내지 5.5분)의 구배를 사용하여 1 mL/분의 유량으로 Agilent RP-mAb C4 컬럼(2.1 x 50 mm, 3.5 마이크로미터) 상에서 전개하였다. 기기를 양이온 전기분무 이온화 모드에서 작동시키고, m/z 600부터 6000까지 스캐닝하였다. 질량 대 전하 스펙트럼을 최대 엔트로피(Maximum Entropy) 알고리즘을 사용하여 디콘볼류션하였으며(deconvoluted), 83 Da(3-APA에 상응함)의 배수의 가산과 함께, 온전한 mAb(온전한 질량의 경우) 또는 mAb 중쇄(감소된 질량의 경우)에 상응하는 디콘볼류션된 질량의 상대 강도를 사용하여 DOL을 추정하였다.
기기 설정치는 하기를 포함하였다: 모세관 전압 3500 V; 프래그멘터(fragmentor) 175V; 스키머(skimmer) 65 V; 가스 온도 325℃; 건조 가스 유량 5.0 L/분; 네뷸라이저 압력 30 psig; 0.42 스캔 속도로의 획득 모드 범위 100 내지 7000.
[표 2]
Figure pct00002
다수의 조합이 인간 IgG에 대한 MTG-촉매 3-APA 접합의 반응 속도를 어느 정도 증가시키는 것으로 확인되었다(표 2). 특히, K288Q와 함께 Y300L 및 V302S를 생착시킨 변이체(서열 번호 5)가 신속히 변형되었으며, 시간스케일에서 완전한 변형(DAR=2)에 도달하여 완전히 탈글리코실화된 WT mAb에 접근하였다(표 2). 이어서, 이들 돌연변이 중 단지 1개 또는 2개만을 갖는 추가의 변이체를 작제하였으며, Y300L/V302S가 삼중 돌연변이체와 비견되는 것으로 결정되었다(도 2 및 표 2). V302S는 접합 효율에 대해 Y300L보다 더 큰 효과를 갖는 것으로 확인되었다.
트라스투주맙의 추가의 변이체를 Val302 위치에서 돌연변이를 갖도록 작제하였다: V302A, V302I, V302L, V302M, V302T, V302F, 및 V302Y. 이들 변이체와 MTG의 반응성을 평가하여 V302S 변이체에 비해 유사한 특성 또는 개선된 특성 어느 것을 갖는지를 결정하였다.
[표 3]
Figure pct00003
실시예 3: 트라스투주맙 변이체의 용융 및 응집 온도
트라스투주맙 돌연변이체 V302A, V302S 및 이중 돌연변이체 Y300L/V302S("LS")를 더 충분히 특성화하여, 접합 접근법의 폭넓은 응용성을 입증하고 mAb에 대한 돌연변이의 영향을 평가하였다. 용융 온도(Tm) 및 응집 온도(Tagg)를 Nanotemper로부터의 nanoDSF 기기를 사용하여 시차 주사 형광측정법에 의해 결정하였다. Tm은 20℃부터 95℃까지 열 스캐닝 시에 330 및 350 nm에서 형광 강도의 변화를 모니터링함으로써 결정되었으며, Tagg는 산란을 모니터링함으로써 결정되었다. Tagg는 WT 트라스투주맙(78 내지 79℃)과 비교하여 모든 돌연변이에 대해 본질적으로 변하지 않았다. CH2 도메인의 용융에 상응하는 첫 번째 Tm은 LS 변이체에 대해 62.3℃였는데, 이는 온전한 WT 트라스투주맙에 비해 약 8℃만큼 감소된 값이고, 완전히 탈글리코실화된 mAb의 첫 번째 Tm과 유사한 값이다. V302S 단일 돌연변이체는 첫 번째 Tm이 64.4℃ - 이는 WT mAb에 비해 6℃ 감소된 값임 - 이고, 완전히 탈글리코실화된 mAb의 CH2 도메인에 비해 약 2℃만큼 열안정성을 증가시켰다. V302A 변이체는 첫 번째 Tm이 67.3℃였는데, 이는 V302S에 비해 약 3℃ 증가된 값이다.
추가의 특성화를 수행하여, 트라스투주맙 변이체를 WT mAb와 비교하고, 3APA-접합된 변이체를 3APA-접합된 WT mAb와 비교하였다. 이들 검정은 하기를 포함한다: DSF 및/또는 DSC에 의한 Tm/Tagg의 결정; 장기간 안정성 검정; 비특이적 결합 검정; 자가-상호작용 및 교차-상호작용; 및 FcRn 및 Fc 수용체에 대한 결합.
DSF에 대해서는, 풀림 온도(Tm) 및 응집 온도(Tagg)를 Nanotemper로부터의 Prometheus nanoDSF 기기를 사용하여 시차 주사 형광측정법에 의해 PBS 중에서 결정하였다. Tm은 20℃부터 95℃까지 열 스캐닝 시에 330 및 350 nm에서 형광 강도의 변화를 모니터링함으로써 결정되었으며, Tagg는 산란을 모니터링함으로써 결정되었다.
장기간 안정성에 대해서는, mAb 및 접합체를 PBS 또는 다른 관련 완충액 중에서 최대 4주 동안 4℃ 또는 40℃에서 인큐베이션하였다. 지정된 시점에서, 샘플의 분취물을 취출하고, 분석용 SEC 및 LC-MS에 의해 안정성을 평가하였다.
비특이적 결합은 Biacore 8K 기기를 사용하여 SPR-기반 검정에서 결정하였다. 아민 커플링에 의해 CM5 칩(GE) 상에 상이한 단백질들(대두 트립신 억제제, 데펜신-3, 인간 IgG, 라이소자임, 인테그린 알파-4 베타-7, IL-13)을 고정화함으로써 상이한 특성을 갖는 표면들의 패널을 발생시켰다. 샘플들을 상이한 표면들 위로 이동시키고, 각각에 대해 반응 단위(RU)를 결정함으로써 비특이적 결합을 추정하였다. 자가-상호작용은, 본질적으로 기재된 바와 같이 친화성 포획 자가 상호작용 나노입자 분광법(AC-SINS)에 의해 측정하였다(문헌[Liu et al. mAbs 2014:483]). 교차 상호작용은, 본질적으로 기재된 바와 같이 교차-상호작용 크로마토그래피(CIC)에 의해 측정하였다(문헌[Bethea et al. Prot Eng Des Sel 2012:531]). FcRn 결합은 FcRn 컬럼이 구비된 Agilent HPLC를 사용하여 평가하였다(문헌[Mackness et al. mAbs 2019:1276]). 샘플을 주입하고, pH 구배(5.5 내지 9.5)를 실시하였다. 체류 시간을 상이한 샘플들에 대해 비교하여 FcRn 결합을 추정하였다. Fc 수용체 결합은 SPR에 의해 또는 ELISA에 의해 비교하였다.
실시예 4: 트라스투주맙 V302S를 갖도록 작제된 ADC의 세포-기반 활성 검정
V302S 변이체를 3-APA로 변형시켜 아지드-변형된 mAb를 생성하였다. 아지도-mAb를 단백질 A 친화성 크로마토그래피로 정제하고, 이어서 DBCO-val-cit-MMAF 또는 DBCO-MMAF와 반응시켜 DAR=2인 항체 약물 접합체를 생성하였다. 탈글리코실화/Gln295 접합 방법을 사용하여 WT 트라스투주맙 및 이들 페이로드를 갖도록 ADC를 또한 작제하였다. 관련 대조군과 함께 ADC를 세포 검정에서 평가하였으며, 활성은 접합 방법에 관계없이 유사한 것으로 확인되었다(도 3). 높은 Her2 발현을 갖는 세포주인 SKBR3 세포를 37℃에서 72시간 동안 다양한 농도의 ADC로 처리하였다. Cell Titer Glo를 사용하여 처리 종료 시점에서 세포 생존력을 결정하였다. 따라서, 접합 효율을 향상시키기 위해 항체의 중쇄에서 특정 치환을 사용하는 것은 생성된 항체-페이로드 접합체의 세포독성 활성에 영향을 미치지 않는다.
실시예 5: V302S 돌연변이와 조합하여, 위치 288에서의 또는 베타-시트 상의 다른 위치에서의 Gln의 생착은 DAR=2(글리칸을 가짐) 또는 DAR=4(글리칸을 갖지 않음)로 접합될 수 있는 mAb를 제공한다
래트 IgG2a 서열에 기반하여 생착된 Y300L/V302S/K288Q 또는 V302S/K288Q 돌연변이를 갖도록 트라스투주맙 변이체를 작제하고, 전술된 바와 같이 발현시키고 정제하였다. 이들 변이체는 표준 조건 하에서 3-APA와의 반응 시에 MTG에 의해 신속히 변형되어 2의 DAR에 도달하였다(도 4a). 접합 부위의 맵핑은 3-APA의 대부분은 Gln295에 부가되고, 극히 일부분은 Gln288에 부가된다는 것을 결정하였다. mAb가 반응 전에 탈글리코실화되었을 때, 접합체는 표준 조건 하에서 4의 DAR에 도달하였는데(도 4b), 이는 NLDC-145 래트 IgG2a mAb와 유사하다.
Y300L 및 V302S 돌연변이는 유지하는 반면, 추가의 Gln의 위치는 285와 위치 294 사이에서 이동되는 추가의 변이체를 작제하였다. 이들 변이체 중 다수는 Y300L/V302S/K288Q 변이체 및 래트 IgG2a와 유사한 프로파일을 가져서, 글리칸을 갖는 경우 DAR=2에, 그리고 글리칸이 없는 경우 DAR=4에 도달하도록 3-APA에 접합하였다. 예외는 R292Q 변이체 - 이는 감소된 반응성을 가짐 -, 및 E293Q 및 E294Q 변이체를 포함하는데, 이들은 하기 실시예 6에 더 상세히 기재된 바와 같다.
표 4는 37℃에서 TGase 및 3-APA와의 인큐베이션 후에 mAb당 표지화 정도(DOL)를 나타낸다. DOL은 mAb 중쇄의 MS 분석에 의해 결정되었으며; 경쇄에서는 변형이 관찰되지 않았다. DOL은 완전한 mAb에 대해 보고되어 있으며, 이는 중쇄의 MS에 의해 관찰된 DOL의 2배이다.
[표 4]
Figure pct00004
실시예 6: E293Q 및 E294Q 돌연변이는 글리칸 제거 없이 DAR=4로의 접합을 가능하게 한다
놀랍게도 본 출원의 발명자들은 중쇄 위치 302에서의 돌연변이, 예컨대 V302S와 295 부근의 위치에서의 추가의 Gln 잔기의 조합은 mAb로부터 글리칸의 제거 없이 DAR=4에 도달하도록 접합될 수 있는 mAb를 생성한다는 것을 알아내었다. 바람직하게는, mAb는 중쇄 300에서의 돌연변이, 예컨대 Y300L을 추가로 함유하여, 접합을 추가로 개선할 수 있다. 트라스투주맙 변이체 E293Q/Y300L/V302S 및 E294Q/Y300L/V302S를 작제하고, MTG 및 3-APA와의 반응에서 시험하였다. 두 경우 모두에서, mAb당 4개의 3-APA 분자의 신속한 부가가 관찰되었으며; 반응은 단지 1.25 U/mg의 Zedira MTG의 사용으로 4 내지 5시간 만에 완료되었다(도 4a).
Y300L/V302S/E294Q 변이체를 추가로 특성화하였다. Y300L/V302S/E294Q 돌연변이의 하위세트를 갖도록 추가의 변이체를 작제하여, DAR=4 접합체를 생성하는 데 있어서의 각각의 역할을 결정하였다. 트라스투주맙의 이중 돌연변이체 V302S/E294Q 및 단일 돌연변이체 E294Q를 생성하고, MTG 및 3-APA와의 반응성을 시험하였다(도 4b). 표준 반응 조건(1 mg/mL mAb, 690 uM 3-APA, 10 U/mg Zedira MTG, PBS 완충액, 37℃) 하에서, E294Q/Y300L/V302S 변이체는 매우 신속하게 DAR=4에 도달하였으며, 60분 이내에 본질적으로 완료되었다. E294Q/V302S 변이체는 더 느렸으며, DAR=4에 도달하는 데 약 150분을 필요로 하였다. E294Q 돌연변이를 단독으로 갖는 변이체는 또한 상당히 신속한 접합을 보여주었는데, 60분 만에 DAR=2를 초과하였고 3시간 만에 DAR=3에 도달하였다. 37℃에서 하룻밤 인큐베이션한 후에, E294Q 변이체는 또한 완전한 DAR=4에 도달하였다.
E294Q, E294Q/V302S, 및 E294Q/Y300L/V302S 변이체는 또한 약물 페이로드 vcMMAF에 DAR=4로 접합되었으며, 표준 탈글리코실화 방법에 의해 제조된 ADC와 비교하였다(도 4c). 모든 경우에, 변이체는 세포 검정에서, 표준 방법에 의해 접합된 WT 트라스투주맙과 비견되거나 그보다 더 강력한 활성을 나타내었다.
따라서, 단독으로의 또는 다른 치환(예를 들어, 위치 302 및 300에서)과 조합된, 위치 E293 또는 E294에서의 글루타민에 대한 치환은 온전한 글리칸을 갖는 조작된 항체를 제공하는데, 이러한 조작된 항체는 WT mAb에 비해 안정성 및 세포독성 활성을 보유하거나 개선하면서, WT mAb보다 더 효율적으로 증가된 약물 대 항체 비로(예를 들어, DAR=4로) 페이로드에 접합될 수 있다.
실시예 7: Gln295의 돌연변이와 E294Q의 조합은 온전한 글리칸 mAb에 의한 매우 신속한 접합을 가능하게 한다
상기 실시예 6에 기재된 바와 같이 DAR 4에 도달하기까지의 E294Q-함유 mAb의 신속한 접합 속도를 주목한 후에, 위치 295에서의 아미노산을 변경시키는 돌연변이와 함께 E294Q를 갖는 mAb는, 글리칸-온전한 mAb에 의한 DAR=2로의 매우 신속한 접합을 가능하게 할 수 있을 것으로 제안하였다. 트라스투주맙의 3개의 그러한 변이체를 작제하였다: E294Q/Q295A, E294Q/Q295E, 및 E294Q/Q295N. 이들 변이체를 전술된 표준 조건 하에서 MTG 및 3-APA와 반응시키고, WT mAb 및 탈글리코실화 WT mAb와 비교하였다. 표 5는 37℃에서 TGase 및 3-APA와의 1시간 인큐베이션 후에 mAb당 DOL을 나타낸다. DOL은 mAb 중쇄의 MS 분석에 의해 결정되었으며; 경쇄에서는 변형이 관찰되지 않았다. DOL은 완전한 mAb에 대해 보고되어 있으며, 이는 중쇄의 MS에 의해 관찰된 DOL의 2배이다.
[표 5]
Figure pct00005
이중 돌연변이체는 MTG에 의해 매우 신속하게 변형되어, 본질적으로 1시간 무렵에 완료에 도달하였다. 온전한 글리칸을 갖는 돌연변이체는 1시간 시점에서 약 1.4의 DOL에 도달한 WT 탈글리코실화 트라스투주맙보다 훨씬 더 신속하게 반응하는 것으로 나타난다. 이중 돌연변이체 대 WT 탈글리코실화 mAb의 반응 속도를 추가로 비교하기 위하여, 더 낮은 효소 및 기질 농도를 함유하는 반응에서 시간 경과에 따라 접합을 모니터링하였다. 1 mg/mL의 항체(WT 트라스투주맙, WT 탈글리코실화, QA, QE, QN 변이체)를 5 U/mg Zedira MTG 및 345 μM 3-APA와 배합하고, 37℃에서 인큐베이션하였다. 샘플을 매 15분마다 취출하고, MTG 차단제를 100 μM로 첨가하여 켄칭하였다. 샘플을 Rapid PNGase(25 μL 샘플당 1 μL, 50℃, 20분)를 사용하여 탈글리코실화하고, 25 mM의 DTT를 사용하여 환원시키고, LC-MS로 분석하였다. 이들 조건 하에서, WT 탈글리코실화 mAb는 2시간의 반응 후에 약 75%에 도달한다. 대조적으로, 변이체는 30분 또는 45분 시점 무렵에 본질적으로 완료되었다(도 5).
용융 온도(Tm) 및 응집 온도(Tagg)를 Nanotemper로부터의 nanoDSF 기기를 사용하여 시차 주사 형광측정법에 의해 결정하였다. Tagg는 WT 트라스투주맙(78 내지 79℃)과 비교하여 모든 돌연변이에 대해 본질적으로 변하지 않았다. CH2 도메인의 용융에 상응하는 첫 번째 Tm은 QA 변이체의 경우 68.1℃있는데, 이는 온전한 WT 트라스투주맙의 약 2℃ 이내의 값이었다. QE 변이체는 66.1℃인 반면, QN 변이체는 67.3℃였다.
실시예 8: 글리칸과 상호작용하는 위치에서의 돌연변이는 Gln295에서의 접합 속도를 증가시킨다
단백질-당 접촉의 제거가 단백질 골격의 국부 가요성을 증가시켜 글리칸을 변형시키지 않고서 Gln295에서의 접합을 가능하게 할 수 있다는 가설에 기초하여, 아미노산 측쇄가 글리칸과 접촉하는 위치에서 트라스투주맙 점 돌연변이체를 작제하였다. Phe241 및 Phe243은 글리칸 코어와의 소수성 접촉을 형성하는 반면, Arg301은 Fc 도메인의 상이한 결정 구조들 내의 Man 또는 GlcNac 당 상의 OH 기와 극성 접촉을 형성하는 것으로 나타난다. 이들 잔기 중 하나가 알라닌으로 돌연변이된(F241A, F243A, R301A) 트라스투주맙 변이체를 작제하였다. 이들 변이체는 더 불균질한 글리칸 프로파일을 나타내었으며, 이때 몇몇은 더 높은 MW 글리칸인 것으로 확인되었는데, 이는 이전에 F241A 및 F243A에 대해 기재된 바와 같았다(문헌[Ahmed et al., 2014, J Mol Biol 426(18):3166-3179]).
이들 3개의 변이체와 3-APA MTG의 반응은 이들이 모두 표준 반응 조건 하에서 효율적으로 변형되었음을 입증하였다(표 2).
실시예 9: Glu294Ala 변이체는 용융 온도에 영향을 미치지 않고서 증가된 반응 속도를 제공한다
Glu294는 Gln295에 인접하고, 인간 IgG 구조에서 이것은 His268의 측쇄에 대한 수소 결합을 형성한다. Gln295의 MTG에 대한 접근을 증가시키기 위하여, Glu294를 Ala로 돌연변이시켜 H-결합을 파괴하고 구조적 요소의 가요성을 증가시켰다. E294A에 더하여 K288Q 돌연변이를 갖는 다른 변이체를 또한 평가하였다. Glu294 변이체는 전술된 표준 반응 조건(1 mg/mL mAb, 690 uM 3-APA, 10 U/mg Zedira MTG, PBS, 37℃) 하에서 3-APA 및 MTG와의 반응성이 약 1.5배 증가되었음을 보여주었으며, K288Q/E294A는 WT mAb에 비해 약간 더, 약 2배 신속하였다(도 6a). E294A 변이체 및 K288Q/E294A 변이체 둘 모두는 하룻밤 인큐베이션 후에 완전한 DAR=2에 도달하거나 접근한 반면, WT mAb는 단지 약 1.3의 DAR에 도달하였다. K288Q/E294A 변이체에서의 CH2 도메인의 Tm을 시차 주사 형광측정법에 의해 평가하였으며, WT mAb로부터 본질적으로 변하지 않은 것으로 확인되었다(도 6b). 따라서, 이들 변이체는 MTG에 대한 증가된 반응성을 가지면서 WT mAb와 유사한 생물물리학적 특성을 나타내며, 이는 그들을 특히 흥미롭게 한다.
약물 페이로드 vcMMAF와 함께 트라스투주맙 E294A 및 K288Q/E294A 변이체를 갖도록 항체-약물 접합체를 작제하고, WT 트라스투주맙으로 제조된 ADC와 비교하였다. mAb를 3-APA 및 MTG와 반응시켜 아지드-변형된 mAb를 생성하였는데, 이때 WT mAb의 경우에는 PNGase F를 사용하여 사전 탈글리코실화를 수행하고, E294A 변이체에 대해서는 탈글리코실화를 수행하지 않았다. 아지도-mAb를 단백질 A 친화성 크로마토그래피로 정제하고, 이어서 DBCO-val-cit-MMAF와 반응시켜 DAR=2인 항체 약물 접합체를 생성하였다. 관련 대조군과 함께 ADC를 세포 검정에서 평가하였으며, 활성은 접합 방법에 관계없이 유사한 것으로 확인되었다(도 6c). 높은 Her2 발현을 갖는 세포주인 SKBR3 세포를 37℃에서 72시간 동안 다양한 농도의 ADC로 처리하였다. Cell Titer Glo를 사용하여 처리 종료 시점에서 세포 생존력을 결정하였다.
실시예 10: 위치 294에서의 변이체는 MTG와의 광범위한 반응성을 갖는다
트라스투주맙의 추가의 변이체를 Glu294 위치에서 돌연변이를 갖도록 작제하였다: E294D, E294F, E294G, E294H, E294K, E294L, E294M, E294N, E294R, E294S, E294T, E294V, 및 E294Y. 이들 변이체와 MTG의 반응성뿐만 아니라 Tm/Tagg를 평가하여 그들의 특성을 E294A 변이체와 비교하였다. 이들 변이체를 전술된 표준 조건 하에서 MTG 및 3-APA와 반응시키고, WT mAb 및 탈글리코실화 WT mAb와 비교하였다. 표 6은 37℃에서 TGase 및 3-APA와의 인큐베이션 후에 mAb당 DOL을 나타낸다. DOL은 mAb 중쇄의 MS 분석에 의해 결정되었으며; 경쇄에서는 변형이 관찰되지 않았다. DOL은 완전한 mAb에 대해 보고되어 있으며, 이는 중쇄의 MS에 의해 관찰된 DOL의 2배이다.
[표 6]
Figure pct00006
이들 변이체 중 다수의 Tm은 WT mAb와 유사하거나 그보다 훨씬 더 높다(E294F, E294H, E294K, E294L, E294M, E294R, E294V, E294Y). 이들 중, 몇몇은 또한 WT mAb보다 MTG와의 더 신속한 반응을 보여준다(E294F, E294K, E294L, E294M, E294R, E294V, 및 E294Y). 특히, E294M 변이체가 두드러진데, 이는 WT mAb보다 약 2℃ 더 높은 Tm을 가지며, 시험된 어떠한 변이체 중에서도 최고의 DOL을 갖는다.
실시예 11: YTE 돌연변이는 접합 속도를 증가시키지 않는다
삼중 돌연변이체 M252Y/S254T/T256E(YTE)는 FcRn에 대한 IgG의 친화성을 증가시킨다(문헌[Dall'Acqua et al., 2006, J Biol Chem 281(33):23514-23524]). YTE 돌연변이는 CH2 도메인에 위치하고, 이들은 CH2 도메인의 Tm을 약 6.5℃만큼 감소시킨다(문헌[Majumdar et al., 2015, MAbs 7(1):84-95]). YTE 돌연변이를 갖는 트라스투주맙 변이체를 작제하고 MTG 반응에서 시험하여, CH2 도메인의 열안정성을 감소시키는 것이 위치 Gln295에서의 증가된 반응성을 제공하는 데 충분한지를 결정하였다. YTE 돌연변이체의 반응 속도는 WT mAb와 비견되었는데, 이는, 단지 CH2 도메인 불안정화가 아닌, 본 명세서에 기재된 다양한 돌연변이들의 특별한 성질이 향상된 반응성을 제공한다는 것을 입증한다.
실시예 12: 상이한 IgG 백그라운드에서의 V302A, V302S, 및 E294Q 변이체의 특성화
상이한 mAb 백그라운드에서 전술된 돌연변이를 함유하는 일련의 변이체(V302A, V302S, E294Q, E294Q/V302A, 및 E294A)를 작제하였다. 세툭시맙은 EGFR에 결합하는 임상적으로 입증된 마우스-인간 IgG1 키메라 mAb이다. 파니투무맙은 EGFR에 결합하는 임상적으로 입증된 인간 IgG2 mAb이다. 페르투주맙은 Her2에 결합하는 임상적으로 입증된 인간 IgG1 mAb이다. PSMB127은 국제 특허 출원 공개 WO2019224718A2호에 기재된 전립선-특이적 막 항원(PSMA)에 결합하는 인간 IgG4 mAb이다. 이들 변이체를 전술된 표준 조건 하에서 MTG 및 3-APA와 반응시키고, 적절한 WT mAb 및 탈글리코실화 WT mAb와 비교하였다. 표 7은 37℃에서 TGase 및 3-APA와의 인큐베이션 후에 mAb당 DOL을 나타낸다. DOL은 mAb 중쇄의 MS 분석에 의해 결정되었으며; 경쇄에서는 변형이 관찰되지 않았다. DOL은 완전한 mAb에 대해 보고되어 있으며, 이는 중쇄의 MS에 의해 관찰된 DOL의 2배이다.
[표 7]
Figure pct00007
이러한 일련의 항체에서의 돌연변이는 트라스투주맙에서 작제된 동일한 돌연변이와 유사한 효과를 생성하였는데, 이는 다양한 인간 항체 및 IgG 동종형에 대한 이러한 전략의 폭넓은 응용성을 입증한다. 게다가, 상기 실시예 6에서의 관찰과 일치하게, 단일(예를 들어, E294Q) 및 이중(예를 들어, E294Q/V302A) 돌연변이체들 중 다수는, 온전한 글리칸을 보유하면서, 항체-페이로드 접합 검정의 완료 무렵에 DAR=4를 달성하였다.
실시예 13: 상이한 아민 기질들과의 변이체들의 반응
MTG를 사용한 접합을 위하여 일련의 아민-함유 기질을 입수하였다. 짧은 PEG 링커를 갖는 추가의 아지드-함유 아민; 비오틴-연결된 아민 펜틸아미노비오틴; 및 절단가능한 링커 또는 절단 불가능한 링커를 갖는 2개의 MMAF-연결된 아민. 기질은 표 8에 기재되어 있다:
[표 8]
Figure pct00008
기질을 WT 트라스투주맙 및 변이체 V302S, E294M, E294Q/Q295A, 및 E294Q/V302A와 반응시켰다.
성분들을 PBS 중 항체 1 mg/mL, 기질 690 uM, 및 Zedira MTG 10 U/mg의 최종 농도로 반응 혼합물 중에서 배합하였다. 반응물을 37℃에서 18시간 동안 인큐베이션하였다. 분석을 위하여, MTG 차단제를 첨가하여 MTG를 불활성화하고, mAb를 50℃에서 20분 동안 Rapid PNGase F(1% v/v)를 사용하여 탈글리코실화하고, 20 mM로 DTT를 사용하여 환원시킨 후, LC-MS를 수행하여 DOL을 결정하였다.
일반적으로, WT 탈글리코실화 mAb에서 관찰된 기질 선택성은 변이체와 유사하였다(표 9). 3-APA, 아지도-PEG3-아민, 및 펜틸아미노비오틴 반응은 시험된 모든 변이체에 대해 본질적으로 완료되었다. MMAF 분자와의 반응은 더 큰 가변성을 나타내었다. 대부분의 경우에, NH2-vcMMAF 반응은, E294Q/Q295A 변이체를 제외하고, NH2-MMAF보다 더 높은 DOL을 제공하였다. 반면에, V302S 변이체는 탈글리코실화 WT와 NH2-vcMMAF의 반응성과 비견되는 반응성을 가졌지만, NH2-MMAF에 대해서는 매우 적은 반응이 관찰되었다.
[표 9]
Figure pct00009
본 발명의 실시 형태는 단순히 예시적인 것으로 의도되며, 당업자는 본 발명의 특이적 절차에 대한 다수의 등가물을 인식하거나, 일상적인 것에 불과한 실험을 사용하여 확인할 수 있을 것이다. 모든 그러한 등가물은 본 발명의 범주 내에 있는 것으로 간주되며, 하기 청구범위에 의해 포함된다.
본 명세서에 인용된 모든 참고문헌(특허 출원, 특허, 또는 간행물을 포함함)은 각각의 개별적인 간행물 또는 특허 또는 특허 출원이 모든 목적을 위해 전체적으로 참고로 포함되는 것으로 구체적이고 개별적으로 표시된 것처럼 동일한 정도로 모든 목적을 위해 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다.
서열
Figure pct00010
Figure pct00011
Figure pct00012
Figure pct00013
Figure pct00014
Figure pct00015
Figure pct00016
Figure pct00017
Figure pct00018
Figure pct00019
Figure pct00020
Figure pct00021
Figure pct00022
Figure pct00023
Figure pct00024
Figure pct00025
Figure pct00026
Figure pct00027
SEQUENCE LISTING <110> JANSSEN BIOTECH, INC. <120> SITE-SPECIFIC CONJUGATION OF GLYCOSYLATED MONOCLONAL ANTIBODIES WITH TRANSGLUTAMINASE <130> JBI6302WOPCT1 <140> PCT/IB2021/054308 <141> 2021-05-19 <150> 63/027,396 <151> 2020-05-20 <160> 97 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <220> <221> source <223> /note="Trastuzumab light chain" <400> 1 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 2 <211> 450 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <220> <221> source <223> /note="Trastuzumab heavy chain" <400> 2 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 225 230 235 240 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 245 250 255 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 260 265 270 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 290 295 300 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 325 330 335 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 340 345 350 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 370 375 380 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 400 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 Gly Lys 450 <210> 3 <211> 450 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <220> <221> source <223> /note="K288Q" <400> 3 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 225 230 235 240 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 245 250 255 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 260 265 270 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285 Asn Ala Gln Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 290 295 300 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 325 330 335 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 340 345 350 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 370 375 380 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 400 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 Gly Lys 450 <210> 4 <211> 450 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <220> <221> source <223> /note="K288Q/P291A/ R292P" <400> 4 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 225 230 235 240 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 245 250 255 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 260 265 270 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285 Asn Ala Gln Thr Lys Ala Pro Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 290 295 300 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 325 330 335 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 340 345 350 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 370 375 380 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 400 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 Gly Lys 450 <210> 5 <211> 450 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <220> <221> source <223> /note="K288Q/Y300L/ V302S" <400> 5 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 225 230 235 240 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 245 250 255 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 260 265 270 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285 Asn Ala Gln Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Leu Arg 290 295 300 Ser Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 325 330 335 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 340 345 350 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 370 375 380 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 400 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 Gly Lys 450 <210> 6 <211> 450 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <220> <221> source <223> /note="K288Q/P291A/ R292P/Y300L/ V302S" <400> 6 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 225 230 235 240 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 245 250 255 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 260 265 270 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285 Asn Ala Gln Thr Lys Ala Pro Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Leu Arg 290 295 300 Ser Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 325 330 335 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 340 345 350 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 370 375 380 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 400 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 Gly Lys 450 <210> 7 <211> 450 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <220> <221> source <223> /note="K288Q/K290H" <400> 7 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 225 230 235 240 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 245 250 255 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 260 265 270 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285 Asn Ala Gln Thr His Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 290 295 300 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 325 330 335 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 340 345 350 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 370 375 380 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 400 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 Gly Lys 450 <210> 8 <211> 450 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <220> <221> source <223> /note="K288Q/V305E" <400> 8 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 225 230 235 240 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 245 250 255 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 260 265 270 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285 Asn Ala Gln Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 290 295 300 Val Val Ser Glu Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 325 330 335 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 340 345 350 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 370 375 380 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 400 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 Gly Lys 450 <210> 9 <211> 450 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <220> <221> source <223> /note="K288Q/E258K" <400> 9 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 225 230 235 240 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 245 250 255 Ser Arg Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 260 265 270 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285 Asn Ala Gln Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 290 295 300 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 325 330 335 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 340 345 350 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 370 375 380 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 400 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 Gly Lys 450 <210> 10 <211> 450 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <220> <221> source <223> /note="K288Q/K290H/ V305E" <400> 10 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 225 230 235 240 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 245 250 255 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 260 265 270 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285 Asn Ala Gln Thr His Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 290 295 300 Val Val Ser Glu Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 325 330 335 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 340 345 350 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 370 375 380 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 400 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 Gly Lys 450 <210> 11 <211> 450 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <220> <221> source <223> /note="K288Q/K290H/ V305E/E258K" <400> 11 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 225 230 235 240 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 245 250 255 Ser Arg Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 260 265 270 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285 Asn Ala Gln Thr His Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 290 295 300 Val Val Ser Glu Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 325 330 335 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 340 345 350 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 370 375 380 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 400 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 Gly Lys 450 <210> 12 <211> 450 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <220> <221> source <223> /note="C'/D strand" <400> 12 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 225 230 235 240 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 245 250 255 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 260 265 270 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285 Thr Ala Gln Thr His Ala Pro Glu Lys Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 290 295 300 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 325 330 335 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 340 345 350 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 370 375 380 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 400 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 Gly Lys 450 <210> 13 <211> 450 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <220> <221> source <223> /note="C'/D-E strands" <400> 13 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 225 230 235 240 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 245 250 255 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 260 265 270 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285 Thr Ala Gln Thr His Ala Pro Glu Lys Gln Ser Asn Ser Thr Leu Arg 290 295 300 Ser Val Ser Glu Leu Pro Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 325 330 335 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 340 345 350 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 370 375 380 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 400 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 Gly Lys 450 <210> 14 <211> 450 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <220> <221> source <223> /note="C'/D-E strands + E258K" <400> 14 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 225 230 235 240 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 245 250 255 Ser Arg Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 260 265 270 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285 Thr Ala Gln Thr His Ala Pro Glu Lys Gln Ser Asn Ser Thr Leu Arg 290 295 300 Ser Val Ser Glu Leu Pro Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 325 330 335 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 340 345 350 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 370 375 380 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 400 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 Gly Lys 450 <210> 15 <211> 450 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <220> <221> source <223> /note="K288Q + PR->AP; YRV->LRS; K290H, V305E, E258K" <400> 15 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 225 230 235 240 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 245 250 255 Ser Arg Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 260 265 270 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285 Asn Ala Gln Thr His Ala Pro Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Leu Arg 290 295 300 Ser Val Ser Glu Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 325 330 335 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 340 345 350 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 370 375 380 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 400 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 Gly Lys 450 <210> 16 <211> 450 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <220> <221> source <223> /note="Graft entire CH2 domain" <400> 16 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 225 230 235 240 Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Thr Lys Asp Val Leu Thr Ile 245 250 255 Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser Gln Asn 260 265 270 Asp Pro Glu Val Arg Phe Ser Trp Phe Ile Asp Asp Val Glu Val His 275 280 285 Thr Ala Gln Thr His Ala Pro Glu Lys Gln Ser Asn Ser Thr Leu Arg 290 295 300 Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Val His Arg Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320 Thr Phe Lys Cys Lys Val Asn Ser Gly Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu 325 330 335 Lys Ser Ile Ser Lys Pro Glu Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 340 345 350 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 370 375 380 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 400 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 Gly Lys 450 <210> 17 <211> 450 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <220> <221> source <223> /note="R301A" <400> 17 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 225 230 235 240 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 245 250 255 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 260 265 270 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Ala 290 295 300 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 325 330 335 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 340 345 350 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 370 375 380 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 400 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 Gly Lys 450 <210> 18 <211> 450 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <220> <221> source <223> /note="F241A" <400> 18 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 225 230 235 240 Pro Ser Val Ala Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 245 250 255 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 260 265 270 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 290 295 300 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 325 330 335 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 340 345 350 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 370 375 380 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 400 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 Gly Lys 450 <210> 19 <211> 450 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <220> <221> source <223> /note="F243A" <400> 19 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 225 230 235 240 Pro Ser Val Phe Leu Ala Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 245 250 255 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 260 265 270 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 290 295 300 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 325 330 335 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 340 345 350 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 370 375 380 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 400 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 Gly Lys 450 <210> 20 <211> 450 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <220> <221> source <223> /note="K288Q/Y300L" <400> 20 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 225 230 235 240 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 245 250 255 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 260 265 270 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285 Asn Ala Gln Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Leu Arg 290 295 300 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 325 330 335 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 340 345 350 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 370 375 380 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 400 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 Gly Lys 450 <210> 21 <211> 450 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <220> <221> source <223> /note="K288Q/V302S" <400> 21 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 225 230 235 240 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 245 250 255 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 260 265 270 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285 Asn Ala Gln Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 290 295 300 Ser Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 325 330 335 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 340 345 350 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 370 375 380 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 400 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 Gly Lys 450 <210> 22 <211> 450 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <220> <221> source <223> /note="Y300L/V302S" <400> 22 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 225 230 235 240 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 245 250 255 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 260 265 270 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Leu Arg 290 295 300 Ser Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 325 330 335 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 340 345 350 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 370 375 380 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 400 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 Gly Lys 450 <210> 23 <211> 450 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <220> <221> source <223> /note="Y300L" <400> 23 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 225 230 235 240 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 245 250 255 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 260 265 270 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Leu Arg 290 295 300 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 325 330 335 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 340 345 350 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 370 375 380 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 400 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 Gly Lys 450 <210> 24 <211> 450 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <220> <221> source <223> /note="V302S" <400> 24 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 225 230 235 240 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 245 250 255 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 260 265 270 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 290 295 300 Ser Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 325 330 335 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 340 345 350 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 370 375 380 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 400 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 Gly Lys 450 <210> 25 <211> 450 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <220> <221> source <223> /note="K288Q/E294A" <400> 25 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 225 230 235 240 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 245 250 255 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 260 265 270 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285 Asn Ala Gln Thr Lys Pro Arg Glu Ala Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 290 295 300 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 325 330 335 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 340 345 350 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 370 375 380 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 400 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 Gly Lys 450 <210> 26 <211> 450 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <220> <221> source <223> /note="H285Q/Y300L/ V302S" <400> 26 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 225 230 235 240 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 245 250 255 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 260 265 270 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val Gln 275 280 285 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Leu Arg 290 295 300 Ser Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 325 330 335 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 340 345 350 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 370 375 380 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 400 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 Gly Lys 450 <210> 27 <211> 450 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <220> <221> source <223> /note="N286Q/Y300L/ V302S" <400> 27 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 225 230 235 240 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 245 250 255 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 260 265 270 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285 Gln Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Leu Arg 290 295 300 Ser Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 325 330 335 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 340 345 350 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 370 375 380 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 400 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 Gly Lys 450 <210> 28 <211> 450 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <220> <221> source <223> /note="A287Q/Y300L/ V302S" <400> 28 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 225 230 235 240 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 245 250 255 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 260 265 270 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285 Asn Gln Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Leu Arg 290 295 300 Ser Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 325 330 335 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 340 345 350 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 370 375 380 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 400 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 Gly Lys 450 <210> 29 <211> 450 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <220> <221> source <223> /note="T289Q/Y300L/ V302S" <400> 29 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 225 230 235 240 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 245 250 255 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 260 265 270 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285 Asn Ala Lys Gln Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Leu Arg 290 295 300 Ser Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 325 330 335 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 340 345 350 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 370 375 380 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 400 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 Gly Lys 450 <210> 30 <211> 450 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <220> <221> source <223> /note="K290Q/Y300L/ V302S" <400> 30 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 225 230 235 240 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 245 250 255 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 260 265 270 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285 Asn Ala Lys Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Leu Arg 290 295 300 Ser Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 325 330 335 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 340 345 350 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 370 375 380 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 400 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 Gly Lys 450 <210> 31 <211> 450 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <220> <221> source <223> /note="R292Q/Y300L/ V302S" <400> 31 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 225 230 235 240 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 245 250 255 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 260 265 270 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Gln Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Leu Arg 290 295 300 Ser Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 325 330 335 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 340 345 350 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 370 375 380 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 400 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 Gly Lys 450 <210> 32 <211> 450 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <220> <221> source <223> /note="E293Q/Y300L/ V302S" <400> 32 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 225 230 235 240 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 245 250 255 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 260 265 270 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Gln Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Leu Arg 290 295 300 Ser Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 325 330 335 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 340 345 350 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 370 375 380 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 400 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 Gly Lys 450 <210> 33 <211> 450 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <220> <221> source <223> /note="E294Q/Y300L/ V302S" <400> 33 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 225 230 235 240 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 245 250 255 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 260 265 270 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Gln Gln Tyr Asn Ser Thr Leu Arg 290 295 300 Ser Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 325 330 335 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 340 345 350 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 370 375 380 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 400 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 Gly Lys 450 <210> 34 <211> 450 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <220> <221> source <223> /note="K288Q YTE" <400> 34 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 225 230 235 240 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Tyr Ile 245 250 255 Thr Arg Glu Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 260 265 270 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285 Asn Ala Gln Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 290 295 300 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 325 330 335 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 340 345 350 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 370 375 380 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 400 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 Gly Lys 450 <210> 35 <211> 450 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <220> <221> source <223> /note="V302A" <400> 35 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 225 230 235 240 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 245 250 255 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 260 265 270 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 290 295 300 Ala Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 325 330 335 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 340 345 350 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 370 375 380 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 400 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 Gly Lys 450 <210> 36 <211> 450 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <220> <221> source <223> /note="V302I" <400> 36 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 225 230 235 240 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 245 250 255 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 260 265 270 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 290 295 300 Ile Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 325 330 335 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 340 345 350 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 370 375 380 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 400 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 Gly Lys 450 <210> 37 <211> 450 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <220> <221> source <223> /note="V302L" <400> 37 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 225 230 235 240 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 245 250 255 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 260 265 270 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 290 295 300 Leu Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 325 330 335 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 340 345 350 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 370 375 380 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 400 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 Gly Lys 450 <210> 38 <211> 450 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <220> <221> source <223> /note="V302M" <400> 38 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 225 230 235 240 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 245 250 255 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 260 265 270 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 290 295 300 Met Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 325 330 335 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 340 345 350 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 370 375 380 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 400 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 Gly Lys 450 <210> 39 <211> 450 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <220> <221> source <223> /note="V302T" <400> 39 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 225 230 235 240 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 245 250 255 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 260 265 270 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 290 295 300 Thr Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 325 330 335 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 340 345 350 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 370 375 380 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 400 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 Gly Lys 450 <210> 40 <211> 450 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <220> <221> source <223> /note="V302F" <400> 40 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 225 230 235 240 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 245 250 255 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 260 265 270 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 290 295 300 Phe Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 325 330 335 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 340 345 350 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 370 375 380 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 400 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 Gly Lys 450 <210> 41 <211> 450 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <220> <221> source <223> /note="V302Y" <400> 41 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 225 230 235 240 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 245 250 255 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 260 265 270 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 290 295 300 Tyr Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 325 330 335 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 340 345 350 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 370 375 380 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 400 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 Gly Lys 450 <210> 42 <211> 450 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <220> <221> source <223> /note="E294Q" <400> 42 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 225 230 235 240 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 245 250 255 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 260 265 270 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Gln Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 290 295 300 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 325 330 335 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 340 345 350 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 370 375 380 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 400 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 Gly Lys 450 <210> 43 <211> 450 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <220> <221> source <223> /note="E293Q" <400> 43 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 225 230 235 240 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 245 250 255 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 260 265 270 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Gln Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 290 295 300 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 325 330 335 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 340 345 350 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 370 375 380 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 400 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 Gly Lys 450 <210> 44 <211> 450 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <220> <221> source <223> /note="V302S/E294Q" <400> 44 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 225 230 235 240 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 245 250 255 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 260 265 270 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Gln Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 290 295 300 Ser Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 325 330 335 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 340 345 350 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 370 375 380 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 400 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 Gly Lys 450 <210> 45 <211> 450 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <220> <221> source <223> /note="V302S/E293Q" <400> 45 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 225 230 235 240 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 245 250 255 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 260 265 270 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Gln Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 290 295 300 Ser Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 325 330 335 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 340 345 350 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 370 375 380 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 400 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 Gly Lys 450 <210> 46 <211> 450 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <220> <221> source <223> /note="E294A" <400> 46 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 225 230 235 240 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 245 250 255 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 260 265 270 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Ala Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 290 295 300 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 325 330 335 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 340 345 350 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 370 375 380 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 400 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 Gly Lys 450 <210> 47 <211> 450 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <220> <221> source <223> /note="E294D" <400> 47 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 225 230 235 240 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 245 250 255 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 260 265 270 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Asp Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 290 295 300 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 325 330 335 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 340 345 350 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 370 375 380 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 400 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 Gly Lys 450 <210> 48 <211> 450 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <220> <221> source <223> /note="E294F" <400> 48 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 225 230 235 240 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 245 250 255 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 260 265 270 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Phe Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 290 295 300 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 325 330 335 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 340 345 350 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 370 375 380 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 400 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 Gly Lys 450 <210> 49 <211> 450 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <220> <221> source <223> /note="E294G" <400> 49 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 225 230 235 240 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 245 250 255 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 260 265 270 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Gly Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 290 295 300 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 325 330 335 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 340 345 350 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 370 375 380 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 400 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 Gly Lys 450 <210> 50 <211> 450 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <220> <221> source <223> /note="E294H" <400> 50 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 225 230 235 240 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 245 250 255 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 260 265 270 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu His Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 290 295 300 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 325 330 335 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 340 345 350 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 370 375 380 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 400 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 Gly Lys 450 <210> 51 <211> 450 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <220> <221> source <223> /note="E294K" <400> 51 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 225 230 235 240 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 245 250 255 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 260 265 270 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Lys Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 290 295 300 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 325 330 335 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 340 345 350 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 370 375 380 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 400 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 Gly Lys 450 <210> 52 <211> 450 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <220> <221> source <223> /note="E294L" <400> 52 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 225 230 235 240 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 245 250 255 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 260 265 270 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Leu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 290 295 300 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 325 330 335 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 340 345 350 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 370 375 380 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 400 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 Gly Lys 450 <210> 53 <211> 450 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <220> <221> source <223> /note="E294M" <400> 53 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 225 230 235 240 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 245 250 255 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 260 265 270 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Met Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 290 295 300 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 325 330 335 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 340 345 350 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 370 375 380 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 400 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 Gly Lys 450 <210> 54 <211> 450 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <220> <221> source <223> /note="E294N" <400> 54 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 225 230 235 240 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 245 250 255 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 260 265 270 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Asn Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 290 295 300 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 325 330 335 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 340 345 350 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 370 375 380 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 400 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 Gly Lys 450 <210> 55 <211> 450 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <220> <221> source <223> /note="E294R" <400> 55 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 225 230 235 240 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 245 250 255 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 260 265 270 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Arg Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 290 295 300 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 325 330 335 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 340 345 350 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 370 375 380 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 400 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 Gly Lys 450 <210> 56 <211> 450 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <220> <221> source <223> /note="E294S" <400> 56 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 225 230 235 240 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 245 250 255 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 260 265 270 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Ser Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 290 295 300 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 325 330 335 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 340 345 350 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 370 375 380 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 400 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 Gly Lys 450 <210> 57 <211> 450 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <220> <221> source <223> /note="E294T" <400> 57 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 225 230 235 240 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 245 250 255 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 260 265 270 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Thr Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 290 295 300 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 325 330 335 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 340 345 350 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 370 375 380 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 400 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 Gly Lys 450 <210> 58 <211> 450 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <220> <221> source <223> /note="E294V" <400> 58 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 225 230 235 240 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 245 250 255 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 260 265 270 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Val Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 290 295 300 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 325 330 335 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 340 345 350 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 370 375 380 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 400 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 Gly Lys 450 <210> 59 <211> 450 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <220> <221> source <223> /note="E294Y" <400> 59 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 225 230 235 240 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 245 250 255 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 260 265 270 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Tyr Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 290 295 300 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 325 330 335 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 340 345 350 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 370 375 380 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 400 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 Gly Lys 450 <210> 60 <211> 450 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <220> <221> source <223> /note="E294Q/Q295A" <400> 60 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 225 230 235 240 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 245 250 255 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 260 265 270 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Gln Ala Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 290 295 300 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 325 330 335 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 340 345 350 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 370 375 380 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 400 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 Gly Lys 450 <210> 61 <211> 450 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <220> <221> source <223> /note="E294Q/Q295E" <400> 61 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 225 230 235 240 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 245 250 255 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 260 265 270 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Gln Glu Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 290 295 300 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 325 330 335 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 340 345 350 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 370 375 380 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 400 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 Gly Lys 450 <210> 62 <211> 450 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <220> <221> source <223> /note="E294Q/Q295N" <400> 62 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 225 230 235 240 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 245 250 255 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 260 265 270 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Gln Asn Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 290 295 300 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 325 330 335 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 340 345 350 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 370 375 380 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 400 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 Gly Lys 450 <210> 63 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <220> <221> source <223> /note="Cetuximab LC" <400> 63 Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Val Ile Leu Ser Val Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Asn 20 25 30 Ile His Trp Tyr Gln Gln Arg Thr Asn Gly Ser Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Ser 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn Asn Trp Pro Thr 85 90 95 Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 64 <211> 449 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <220> <221> source <223> /note="Cetuximab HC" <400> 64 Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln 1 5 10 15 Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr 20 25 30 Gly Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr 50 55 60 Ser Arg Leu Ser Ile Asn Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe 65 70 75 80 Lys Met Asn Ser Leu Gln Ser Asn Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Ala Leu Thr Tyr Tyr Asp Tyr Glu Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 115 120 125 Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu 130 135 140 Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp 145 150 155 160 Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 165 170 175 Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser 180 185 190 Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro 195 200 205 Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys 210 215 220 Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro 225 230 235 240 Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser 245 250 255 Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp 260 265 270 Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn 275 280 285 Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val 290 295 300 Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 305 310 315 320 Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys 325 330 335 Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr 340 345 350 Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr 355 360 365 Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu 370 375 380 Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu 385 390 395 400 Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys 405 410 415 Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu 420 425 430 Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 435 440 445 Lys <210> 65 <211> 449 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <220> <221> source <223> /note="Cetuximab V302S" <400> 65 Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln 1 5 10 15 Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr 20 25 30 Gly Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr 50 55 60 Ser Arg Leu Ser Ile Asn Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe 65 70 75 80 Lys Met Asn Ser Leu Gln Ser Asn Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Ala Leu Thr Tyr Tyr Asp Tyr Glu Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 115 120 125 Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu 130 135 140 Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp 145 150 155 160 Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 165 170 175 Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser 180 185 190 Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro 195 200 205 Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys 210 215 220 Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro 225 230 235 240 Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser 245 250 255 Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp 260 265 270 Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn 275 280 285 Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Ser 290 295 300 Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 305 310 315 320 Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys 325 330 335 Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr 340 345 350 Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr 355 360 365 Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu 370 375 380 Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu 385 390 395 400 Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys 405 410 415 Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu 420 425 430 Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 435 440 445 Lys <210> 66 <211> 449 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <220> <221> source <223> /note="Cetuximab V302A" <400> 66 Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln 1 5 10 15 Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr 20 25 30 Gly Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr 50 55 60 Ser Arg Leu Ser Ile Asn Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe 65 70 75 80 Lys Met Asn Ser Leu Gln Ser Asn Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Ala Leu Thr Tyr Tyr Asp Tyr Glu Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 115 120 125 Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu 130 135 140 Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp 145 150 155 160 Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 165 170 175 Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser 180 185 190 Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro 195 200 205 Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys 210 215 220 Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro 225 230 235 240 Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser 245 250 255 Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp 260 265 270 Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn 275 280 285 Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Ala 290 295 300 Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 305 310 315 320 Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys 325 330 335 Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr 340 345 350 Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr 355 360 365 Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu 370 375 380 Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu 385 390 395 400 Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys 405 410 415 Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu 420 425 430 Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 435 440 445 Lys <210> 67 <211> 449 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <220> <221> source <223> /note="Cetuximab E294Q/V302A" <400> 67 Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln 1 5 10 15 Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr 20 25 30 Gly Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr 50 55 60 Ser Arg Leu Ser Ile Asn Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe 65 70 75 80 Lys Met Asn Ser Leu Gln Ser Asn Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Ala Leu Thr Tyr Tyr Asp Tyr Glu Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 115 120 125 Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu 130 135 140 Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp 145 150 155 160 Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 165 170 175 Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser 180 185 190 Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro 195 200 205 Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys 210 215 220 Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro 225 230 235 240 Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser 245 250 255 Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp 260 265 270 Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn 275 280 285 Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Gln Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Ala 290 295 300 Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 305 310 315 320 Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys 325 330 335 Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr 340 345 350 Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr 355 360 365 Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu 370 375 380 Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu 385 390 395 400 Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys 405 410 415 Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu 420 425 430 Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 435 440 445 Lys <210> 68 <211> 449 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <220> <221> source <223> /note="Cetuximab E294Q" <400> 68 Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln 1 5 10 15 Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr 20 25 30 Gly Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr 50 55 60 Ser Arg Leu Ser Ile Asn Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe 65 70 75 80 Lys Met Asn Ser Leu Gln Ser Asn Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Ala Leu Thr Tyr Tyr Asp Tyr Glu Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 115 120 125 Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu 130 135 140 Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp 145 150 155 160 Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 165 170 175 Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser 180 185 190 Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro 195 200 205 Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys 210 215 220 Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro 225 230 235 240 Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser 245 250 255 Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp 260 265 270 Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn 275 280 285 Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Gln Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val 290 295 300 Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 305 310 315 320 Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys 325 330 335 Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr 340 345 350 Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr 355 360 365 Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu 370 375 380 Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu 385 390 395 400 Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys 405 410 415 Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu 420 425 430 Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 435 440 445 Lys <210> 69 <211> 449 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <220> <221> source <223> /note="Cetuximab E294A" <400> 69 Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln 1 5 10 15 Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr 20 25 30 Gly Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr 50 55 60 Ser Arg Leu Ser Ile Asn Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe 65 70 75 80 Lys Met Asn Ser Leu Gln Ser Asn Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Ala Leu Thr Tyr Tyr Asp Tyr Glu Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 115 120 125 Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu 130 135 140 Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp 145 150 155 160 Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 165 170 175 Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser 180 185 190 Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro 195 200 205 Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys 210 215 220 Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro 225 230 235 240 Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser 245 250 255 Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp 260 265 270 Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn 275 280 285 Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Ala Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val 290 295 300 Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 305 310 315 320 Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys 325 330 335 Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr 340 345 350 Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr 355 360 365 Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu 370 375 380 Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu 385 390 395 400 Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys 405 410 415 Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu 420 425 430 Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 435 440 445 Lys <210> 70 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <220> <221> source <223> /note="Panitumumab LC" <400> 70 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln His Phe Asp His Leu Pro Leu 85 90 95 Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 71 <211> 445 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <220> <221> source <223> /note="Panitumumab HC" <400> 71 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Val Ser Ser Gly 20 25 30 Asp Tyr Tyr Trp Thr Trp Ile Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Ile Gly His Ile Tyr Tyr Ser Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Pro Ser 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Ile Asp Thr Ser Lys Thr Gln Phe 65 70 75 80 Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr 85 90 95 Cys Val Arg Asp Arg Val Thr Gly Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 115 120 125 Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu 130 135 140 Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp 145 150 155 160 Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 165 170 175 Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser 180 185 190 Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro 195 200 205 Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu 210 215 220 Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu 225 230 235 240 Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu 245 250 255 Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln 260 265 270 Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys 275 280 285 Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu 290 295 300 Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys 305 310 315 320 Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys 325 330 335 Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser 340 345 350 Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys 355 360 365 Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln 370 375 380 Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly 385 390 395 400 Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln 405 410 415 Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn 420 425 430 His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445 <210> 72 <211> 445 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <220> <221> source <223> /note="Panitumumab V302S" <400> 72 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Val Ser Ser Gly 20 25 30 Asp Tyr Tyr Trp Thr Trp Ile Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Ile Gly His Ile Tyr Tyr Ser Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Pro Ser 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Ile Asp Thr Ser Lys Thr Gln Phe 65 70 75 80 Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr 85 90 95 Cys Val Arg Asp Arg Val Thr Gly Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 115 120 125 Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu 130 135 140 Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp 145 150 155 160 Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 165 170 175 Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser 180 185 190 Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro 195 200 205 Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu 210 215 220 Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu 225 230 235 240 Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu 245 250 255 Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln 260 265 270 Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys 275 280 285 Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Val Leu 290 295 300 Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys 305 310 315 320 Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys 325 330 335 Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser 340 345 350 Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys 355 360 365 Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln 370 375 380 Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly 385 390 395 400 Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln 405 410 415 Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn 420 425 430 His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445 <210> 73 <211> 445 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <220> <221> source <223> /note="Panitumumab V302A" <400> 73 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Val Ser Ser Gly 20 25 30 Asp Tyr Tyr Trp Thr Trp Ile Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Ile Gly His Ile Tyr Tyr Ser Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Pro Ser 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Ile Asp Thr Ser Lys Thr Gln Phe 65 70 75 80 Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr 85 90 95 Cys Val Arg Asp Arg Val Thr Gly Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 115 120 125 Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu 130 135 140 Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp 145 150 155 160 Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 165 170 175 Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser 180 185 190 Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro 195 200 205 Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu 210 215 220 Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu 225 230 235 240 Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu 245 250 255 Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln 260 265 270 Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys 275 280 285 Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ala Val Ser Val Leu 290 295 300 Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys 305 310 315 320 Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys 325 330 335 Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser 340 345 350 Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys 355 360 365 Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln 370 375 380 Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly 385 390 395 400 Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln 405 410 415 Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn 420 425 430 His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445 <210> 74 <211> 445 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <220> <221> source <223> /note="Panitumumab E294Q/V302A" <400> 74 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Val Ser Ser Gly 20 25 30 Asp Tyr Tyr Trp Thr Trp Ile Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Ile Gly His Ile Tyr Tyr Ser Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Pro Ser 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Ile Asp Thr Ser Lys Thr Gln Phe 65 70 75 80 Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr 85 90 95 Cys Val Arg Asp Arg Val Thr Gly Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 115 120 125 Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu 130 135 140 Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp 145 150 155 160 Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 165 170 175 Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser 180 185 190 Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro 195 200 205 Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu 210 215 220 Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu 225 230 235 240 Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu 245 250 255 Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln 260 265 270 Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys 275 280 285 Pro Arg Glu Gln Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ala Val Ser Val Leu 290 295 300 Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys 305 310 315 320 Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys 325 330 335 Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser 340 345 350 Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys 355 360 365 Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln 370 375 380 Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly 385 390 395 400 Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln 405 410 415 Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn 420 425 430 His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445 <210> 75 <211> 445 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <220> <221> source <223> /note="Panitumumab E294Q" <400> 75 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Val Ser Ser Gly 20 25 30 Asp Tyr Tyr Trp Thr Trp Ile Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Ile Gly His Ile Tyr Tyr Ser Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Pro Ser 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Ile Asp Thr Ser Lys Thr Gln Phe 65 70 75 80 Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr 85 90 95 Cys Val Arg Asp Arg Val Thr Gly Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 115 120 125 Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu 130 135 140 Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp 145 150 155 160 Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 165 170 175 Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser 180 185 190 Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro 195 200 205 Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu 210 215 220 Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu 225 230 235 240 Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu 245 250 255 Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln 260 265 270 Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys 275 280 285 Pro Arg Glu Gln Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu 290 295 300 Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys 305 310 315 320 Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys 325 330 335 Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser 340 345 350 Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys 355 360 365 Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln 370 375 380 Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly 385 390 395 400 Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln 405 410 415 Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn 420 425 430 His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445 <210> 76 <211> 445 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <220> <221> source <223> /note="Panitumumab E294A" <400> 76 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Val Ser Ser Gly 20 25 30 Asp Tyr Tyr Trp Thr Trp Ile Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Ile Gly His Ile Tyr Tyr Ser Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Pro Ser 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Ile Asp Thr Ser Lys Thr Gln Phe 65 70 75 80 Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr 85 90 95 Cys Val Arg Asp Arg Val Thr Gly Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 115 120 125 Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu 130 135 140 Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp 145 150 155 160 Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 165 170 175 Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser 180 185 190 Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro 195 200 205 Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu 210 215 220 Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu 225 230 235 240 Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu 245 250 255 Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln 260 265 270 Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys 275 280 285 Pro Arg Glu Ala Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu 290 295 300 Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys 305 310 315 320 Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys 325 330 335 Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser 340 345 350 Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys 355 360 365 Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln 370 375 380 Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly 385 390 395 400 Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln 405 410 415 Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn 420 425 430 His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445 <210> 77 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <220> <221> source <223> /note="Pertuzumab LC" <400> 77 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Ile Gly 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ile Tyr Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 78 <211> 448 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <220> <221> source <223> /note="Pertuzumab HC" <400> 78 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Thr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Gln Arg Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Val Asp Arg Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 115 120 125 Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu 130 135 140 Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp 145 150 155 160 Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 165 170 175 Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser 180 185 190 Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro 195 200 205 Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys 210 215 220 Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro 225 230 235 240 Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser 245 250 255 Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp 260 265 270 Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn 275 280 285 Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val 290 295 300 Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 305 310 315 320 Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys 325 330 335 Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr 340 345 350 Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr 355 360 365 Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu 370 375 380 Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu 385 390 395 400 Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys 405 410 415 Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu 420 425 430 Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 435 440 445 <210> 79 <211> 448 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <220> <221> source <223> /note="Pertuzumab V302S" <400> 79 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Thr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Gln Arg Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Val Asp Arg Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 115 120 125 Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu 130 135 140 Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp 145 150 155 160 Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 165 170 175 Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser 180 185 190 Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro 195 200 205 Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys 210 215 220 Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro 225 230 235 240 Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser 245 250 255 Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp 260 265 270 Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn 275 280 285 Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Ser 290 295 300 Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 305 310 315 320 Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys 325 330 335 Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr 340 345 350 Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr 355 360 365 Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu 370 375 380 Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu 385 390 395 400 Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys 405 410 415 Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu 420 425 430 Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 435 440 445 <210> 80 <211> 448 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <220> <221> source <223> /note="Pertuzumab V302A" <400> 80 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Thr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Gln Arg Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Val Asp Arg Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 115 120 125 Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu 130 135 140 Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp 145 150 155 160 Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 165 170 175 Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser 180 185 190 Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro 195 200 205 Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys 210 215 220 Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro 225 230 235 240 Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser 245 250 255 Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp 260 265 270 Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn 275 280 285 Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Ala 290 295 300 Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 305 310 315 320 Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys 325 330 335 Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr 340 345 350 Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr 355 360 365 Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu 370 375 380 Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu 385 390 395 400 Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys 405 410 415 Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu 420 425 430 Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 435 440 445 <210> 81 <211> 448 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <220> <221> source <223> /note="Pertuzumab E294Q/V302A" <400> 81 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Thr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Gln Arg Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Val Asp Arg Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 115 120 125 Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu 130 135 140 Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp 145 150 155 160 Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 165 170 175 Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser 180 185 190 Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro 195 200 205 Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys 210 215 220 Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro 225 230 235 240 Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser 245 250 255 Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp 260 265 270 Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn 275 280 285 Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Gln Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Ala 290 295 300 Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 305 310 315 320 Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys 325 330 335 Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr 340 345 350 Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr 355 360 365 Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu 370 375 380 Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu 385 390 395 400 Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys 405 410 415 Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu 420 425 430 Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 435 440 445 <210> 82 <211> 448 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <220> <221> source <223> /note="Pertuzumab E294Q" <400> 82 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Thr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Gln Arg Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Val Asp Arg Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 115 120 125 Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu 130 135 140 Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp 145 150 155 160 Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 165 170 175 Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser 180 185 190 Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro 195 200 205 Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys 210 215 220 Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro 225 230 235 240 Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser 245 250 255 Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp 260 265 270 Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn 275 280 285 Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Gln Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val 290 295 300 Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 305 310 315 320 Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys 325 330 335 Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr 340 345 350 Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr 355 360 365 Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu 370 375 380 Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu 385 390 395 400 Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys 405 410 415 Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu 420 425 430 Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 435 440 445 <210> 83 <211> 448 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <220> <221> source <223> /note="Pertuzumab E294A" <400> 83 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Thr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Gln Arg Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Val Asp Arg Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 115 120 125 Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu 130 135 140 Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp 145 150 155 160 Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 165 170 175 Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser 180 185 190 Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro 195 200 205 Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys 210 215 220 Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro 225 230 235 240 Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser 245 250 255 Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp 260 265 270 Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn 275 280 285 Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Ala Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val 290 295 300 Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 305 310 315 320 Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys 325 330 335 Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr 340 345 350 Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr 355 360 365 Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu 370 375 380 Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu 385 390 395 400 Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys 405 410 415 Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu 420 425 430 Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 435 440 445 <210> 84 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <220> <221> source <223> /note="PSMB127 LC" <400> 84 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 85 <211> 451 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <220> <221> source <223> /note="PSMB127 HC" <400> 85 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Lys Ser Asp 20 25 30 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Glu Ile Ser Gly Ser Gly Gly Tyr Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Ser Tyr Asp Ser Ser Leu Tyr Val Gly Asp Tyr Phe Asp 100 105 110 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys 115 120 125 Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu 130 135 140 Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro 145 150 155 160 Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr 165 170 175 Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val 180 185 190 Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn 195 200 205 Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser 210 215 220 Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly 225 230 235 240 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 245 250 255 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln 260 265 270 Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 275 280 285 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr 290 295 300 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 305 310 315 320 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile 325 330 335 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 340 345 350 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser 355 360 365 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 370 375 380 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 385 390 395 400 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val 405 410 415 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 420 425 430 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 435 440 445 Leu Gly Lys 450 <210> 86 <211> 451 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <220> <221> source <223> /note="PSMB127 V302S" <400> 86 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Lys Ser Asp 20 25 30 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Glu Ile Ser Gly Ser Gly Gly Tyr Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Ser Tyr Asp Ser Ser Leu Tyr Val Gly Asp Tyr Phe Asp 100 105 110 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys 115 120 125 Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu 130 135 140 Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro 145 150 155 160 Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr 165 170 175 Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val 180 185 190 Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn 195 200 205 Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser 210 215 220 Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly 225 230 235 240 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 245 250 255 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln 260 265 270 Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 275 280 285 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr 290 295 300 Arg Ser Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 305 310 315 320 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile 325 330 335 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 340 345 350 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser 355 360 365 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 370 375 380 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 385 390 395 400 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val 405 410 415 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 420 425 430 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 435 440 445 Leu Gly Lys 450 <210> 87 <211> 451 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <220> <221> source <223> /note="PSMB127 V302A" <400> 87 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Lys Ser Asp 20 25 30 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Glu Ile Ser Gly Ser Gly Gly Tyr Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Ser Tyr Asp Ser Ser Leu Tyr Val Gly Asp Tyr Phe Asp 100 105 110 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys 115 120 125 Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu 130 135 140 Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro 145 150 155 160 Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr 165 170 175 Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val 180 185 190 Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn 195 200 205 Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser 210 215 220 Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly 225 230 235 240 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 245 250 255 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln 260 265 270 Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 275 280 285 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr 290 295 300 Arg Ala Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 305 310 315 320 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile 325 330 335 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 340 345 350 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser 355 360 365 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 370 375 380 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 385 390 395 400 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val 405 410 415 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 420 425 430 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 435 440 445 Leu Gly Lys 450 <210> 88 <211> 451 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <220> <221> source <223> /note="PSMB127 E294Q/V302A" <400> 88 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Lys Ser Asp 20 25 30 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Glu Ile Ser Gly Ser Gly Gly Tyr Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Ser Tyr Asp Ser Ser Leu Tyr Val Gly Asp Tyr Phe Asp 100 105 110 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys 115 120 125 Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu 130 135 140 Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro 145 150 155 160 Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr 165 170 175 Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val 180 185 190 Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn 195 200 205 Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser 210 215 220 Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly 225 230 235 240 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 245 250 255 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln 260 265 270 Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 275 280 285 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Gln Gln Phe Asn Ser Thr Tyr 290 295 300 Arg Ala Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 305 310 315 320 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile 325 330 335 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 340 345 350 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser 355 360 365 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 370 375 380 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 385 390 395 400 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val 405 410 415 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 420 425 430 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 435 440 445 Leu Gly Lys 450 <210> 89 <211> 451 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <220> <221> source <223> /note="PSMB127 E294Q" <400> 89 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Lys Ser Asp 20 25 30 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Glu Ile Ser Gly Ser Gly Gly Tyr Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Ser Tyr Asp Ser Ser Leu Tyr Val Gly Asp Tyr Phe Asp 100 105 110 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys 115 120 125 Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu 130 135 140 Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro 145 150 155 160 Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr 165 170 175 Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val 180 185 190 Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn 195 200 205 Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser 210 215 220 Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly 225 230 235 240 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 245 250 255 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln 260 265 270 Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 275 280 285 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Gln Gln Phe Asn Ser Thr Tyr 290 295 300 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 305 310 315 320 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile 325 330 335 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 340 345 350 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser 355 360 365 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 370 375 380 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 385 390 395 400 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val 405 410 415 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 420 425 430 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 435 440 445 Leu Gly Lys 450 <210> 90 <211> 451 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <220> <221> source <223> /note="PSMB127 E294A" <400> 90 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Lys Ser Asp 20 25 30 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Glu Ile Ser Gly Ser Gly Gly Tyr Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Ser Tyr Asp Ser Ser Leu Tyr Val Gly Asp Tyr Phe Asp 100 105 110 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys 115 120 125 Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu 130 135 140 Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro 145 150 155 160 Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr 165 170 175 Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val 180 185 190 Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn 195 200 205 Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser 210 215 220 Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly 225 230 235 240 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 245 250 255 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln 260 265 270 Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 275 280 285 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Ala Gln Phe Asn Ser Thr Tyr 290 295 300 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 305 310 315 320 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile 325 330 335 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 340 345 350 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser 355 360 365 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 370 375 380 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 385 390 395 400 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val 405 410 415 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 420 425 430 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 435 440 445 Leu Gly Lys 450 <210> 91 <211> 450 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <220> <221> source <223> /note="Trastuzumab HC E294Q/V302A" <400> 91 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 225 230 235 240 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 245 250 255 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 260 265 270 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Gln Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 290 295 300 Ala Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 325 330 335 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 340 345 350 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 370 375 380 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 400 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 Gly Lys 450 <210> 92 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 92 Leu Leu Gln Gly 1 <210> 93 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 93 Gly Gly Gly Cys 1 <210> 94 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 94 Gln Ser Asp Ser Thr Leu Arg 1 5 <210> 95 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 95 Phe Ser Trp Phe Ile Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr His 1 5 10 15 Ala Pro Glu Lys 20 <210> 96 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 96 Gln Ser Asp Ser Thr Leu Arg 1 5 <210> 97 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 97 Phe Ser Trp Phe Ile Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln 1 5 10

Claims (58)

  1. 조작된 항체(engineered antibody)로서,
    상기 항체의 중쇄 위치 302에서의 아미노산 치환을 포함하며, 여기서 상기 아미노산 넘버링은 카바트(Kabat)의 EU 인덱스에 따르는, 조작된 항체.
  2. 제1항에 있어서, 상기 중쇄 위치 302에서의 아미노산 치환은 V302A인, 조작된 항체.
  3. 제1항에 있어서, 상기 중쇄 위치 302에서의 아미노산 치환은 V302S인, 조작된 항체.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 중쇄 위치 286, 287, 288, 289, 290, 293 또는 294에서의 글루타민 치환; 및/또는 중쇄 위치 241, 243, 294 또는 301에서의 알라닌 치환을 추가로 포함하는, 조작된 항체.
  5. 제4항에 있어서, 상기 중쇄 위치 293에서의 글루타민 치환을 포함하는, 조작된 항체.
  6. 제4항에 있어서, 상기 중쇄 위치 294에서의 글루타민 치환을 포함하는, 조작된 항체.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 중쇄 위치 300에서의 아미노산 치환을 추가로 포함하며, 예를 들어 상기 중쇄 위치 300에서의 아미노산 치환은 Y300L인, 조작된 항체.
  8. 조작된 항체로서,
    상기 항체의 중쇄 위치 294에서의 아미노산 치환을 포함하며, 여기서 상기 아미노산 넘버링은 카바트의 EU 인덱스에 따르는, 조작된 항체.
  9. 제8항에 있어서, 상기 중쇄 위치 294에서의 아미노산 치환은 E294Q인, 조작된 항체.
  10. 제9항에 있어서, 중쇄 위치 295에서의 아미노산 치환을 추가로 포함하는, 조작된 항체.
  11. 제10항에 있어서, 상기 중쇄 위치 295에서의 아미노산 치환은 Q295A인, 조작된 항체.
  12. 제10항에 있어서, 상기 중쇄 위치 295에서의 아미노산 치환은 Q295E인, 조작된 항체.
  13. 제10항에 있어서, 상기 중쇄 위치 295에서의 아미노산 치환은 Q295N인, 조작된 항체.
  14. 제8항에 있어서, 중쇄 위치 302에서의 아미노산 치환을 추가로 포함하는, 조작된 항체.
  15. 제14항에 있어서, 상기 중쇄 위치 302에서의 아미노산 치환은 V302A인, 조작된 항체.
  16. 제14항에 있어서, 상기 중쇄 위치 302에서의 아미노산 치환은 V302S인, 조작된 항체.
  17. 제8항 및 제14항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 중쇄 위치 300에서의 아미노산 치환을 추가로 포함하는, 조작된 항체.
  18. 제17항에 있어서, 상기 중쇄 위치 300에서의 아미노산 치환은 Y300L인, 조작된 항체.
  19. 조작된 항체로서,
    아미노산 치환 V302S 및 아미노산 치환 E293Q 및 E294Q 중 적어도 하나를 포함하며, 여기서 상기 아미노산 넘버링은 카바트의 EU 인덱스에 따르는, 조작된 항체.
  20. 조작된 항체로서,
    아미노산 치환 V302S 및 아미노산 치환 E293Q를 포함하며, 여기서 상기 아미노산 넘버링은 카바트의 EU 인덱스에 따르는, 조작된 항체.
  21. 조작된 항체로서,
    아미노산 치환 V302A 및 아미노산 치환 E293Q를 포함하며, 여기서 상기 아미노산 넘버링은 카바트의 EU 인덱스에 따르는, 조작된 항체.
  22. 조작된 항체로서,
    아미노산 치환 V302S 및 아미노산 치환 E294Q를 포함하며, 여기서 상기 아미노산 넘버링은 카바트의 EU 인덱스에 따르는, 조작된 항체.
  23. 조작된 항체로서,
    아미노산 치환 V302A 및 아미노산 치환 E294Q를 포함하며, 여기서 상기 아미노산 넘버링은 카바트의 EU 인덱스에 따르는, 조작된 항체.
  24. 제19항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 아미노산 치환 Y300L을 추가로 포함하는, 조작된 항체.
  25. 제8항에 있어서, 상기 중쇄 위치 294에서의 아미노산 치환은 알라닌 치환, 선택적으로 E294A인, 조작된 항체.
  26. 제25항에 있어서, 중쇄 위치 288에서의 아미노산 치환을 추가로 포함하는, 조작된 항체.
  27. 제26항에 있어서, 상기 중쇄 위치 288에서의 아미노산 치환은 K288Q인, 조작된 항체.
  28. 제8항에 있어서, 상기 중쇄 위치 294에서의 아미노산 치환은 메티오닌 치환, 선택적으로 E294M인, 조작된 항체.
  29. 제8항에 있어서, 상기 중쇄 위치 294에서의 아미노산 치환은 페닐알라닌 치환, 선택적으로 E294F인, 조작된 항체.
  30. 제8항에 있어서, 상기 중쇄 위치 294에서의 아미노산 치환은 라이신 치환, 선택적으로 E294K인, 조작된 항체.
  31. 제8항에 있어서, 상기 중쇄 위치 294에서의 아미노산 치환은 류신 치환, 선택적으로 E294L인, 조작된 항체.
  32. 제8항에 있어서, 상기 중쇄 위치 294에서의 아미노산 치환은 아르기닌 치환, 선택적으로 E294R인, 조작된 항체.
  33. 제8항에 있어서, 상기 중쇄 위치 294에서의 아미노산 치환은 발린 치환, 선택적으로 E294V인, 조작된 항체.
  34. 제8항에 있어서, 상기 중쇄 위치 294에서의 아미노산 치환은 티로신 치환, 선택적으로 E294Y인, 조작된 항체.
  35. 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 인간 IgG 항체인, 조작된 항체.
  36. 제35항에 있어서, 상기 항체는 인간 IgG1 항체인, 조작된 항체.
  37. 제35항에 있어서, 상기 항체는 인간 IgG2 항체인, 조작된 항체.
  38. 제35항에 있어서, 상기 항체는 인간 IgG4 항체인, 조작된 항체.
  39. 제1항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 글리코실화된, 조작된 항체.
  40. 항체-페이로드(payload) 접합체로서,
    페이로드에 접합된 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항의 조작된 항체를 포함하는, 항체-페이로드 접합체.
  41. 제40항에 있어서, 상기 페이로드는 상기 항체의 중쇄 Q295 잔기에서 상기 조작된 항체에 접합되는, 항체-페이로드 접합체.
  42. 제40항 또는 제41항에 있어서, 상기 페이로드는 상기 조작된 항체의 중쇄 위치 286, 287, 288, 289, 290, 293 또는 294의 글루타민 잔기에서 상기 조작된 항체에 접합되는, 항체-페이로드 접합체.
  43. 제40항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 페이로드는 Q295 및 상기 중쇄 위치 293 및 294의 글루타민 잔기 중 적어도 하나에서 상기 조작된 항체에 접합되는, 항체-페이로드 접합체.
  44. 제43항에 있어서, 상기 페이로드는 Q295 및 상기 중쇄 위치 293의 글루타민 잔기에서 상기 조작된 항체에 접합되는, 항체-페이로드 접합체.
  45. 제43항에 있어서, 상기 페이로드는 Q295 및 상기 중쇄 위치 294의 글루타민 잔기에서 상기 조작된 항체에 접합되는, 항체-페이로드 접합체.
  46. 제40항에 있어서, 상기 페이로드는 상기 중쇄 위치 294의 글루타민 잔기에서 상기 조작된 항체에 접합되고, 페이로드는 중쇄 위치 295에서 상기 조작된 항체에 접합되지 않는, 항체-페이로드 접합체.
  47. 제40항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 1 내지 4의 약물 항체 비(DAR)를 갖는, 항체-페이로드 접합체.
  48. 항체-페이로드 접합체를 생성하는 방법으로서,
    제1항 내지 제39항 중 어느 한 항의 조작된 항체 및 아민-함유 페이로드를 상기 페이로드에 접합된 상기 조작된 항체를 포함하는 상기 항체-페이로드 접합체를 생성하는 조건 하에서 트랜스글루타미나제와 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법.
  49. 제48항에 있어서, 상기 아민-함유 페이로드는 세포독성제, 세포증식억제제, 화학요법제, 독소, 방사성 핵종, DNA, RNA, siRNA, 마이크로RNA, 펩티드 핵산, 비천연 아미노산, 펩티드, 효소, 형광 태그, 비오틴, 및 제1 클릭 반응 파트너 중 하나 이상을 포함하는, 방법.
  50. 제48항 또는 제49항에 있어서, 상기 아민-함유 페이로드는 제1 클릭 반응 파트너를 포함하는, 방법.
  51. 제50항에 있어서, 상기 제1 클릭 반응 파트너는 3-아지도-1-프로필아민이고, 상기 제2 클릭 반응 파트너는 다이벤조사이클로옥틴-테트라에틸렌 글리콜-발린-시트룰린-파라아미노벤질 카르바메이트-모노메틸 오리스타틴 F(DBCO-val-cit-MMAF) 또는 다이벤조사이클로옥틴-테트라에틸렌 글리콜-모노메틸 오리스타틴 F(DBCO-MMAF)인, 방법.
  52. 제48항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조작된 항체는 그것이 상기 페이로드에 접합되기 전에 탈글리코실화를 거치지 않은, 방법.
  53. 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항의 조작된 항체, 또는 제40항 내지 제47항 중 어느 한 항의 항체-페이로드 접합체, 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
  54. 암의 치료를 필요로 하는 대상체에서 상기 암을 치료하는 방법으로서,
    제53항의 약제학적 조성물을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  55. 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항의 조작된 항체를 인코딩하는 핵산.
  56. 제55항의 핵산을 포함하는 숙주 세포.
  57. 조작된 항체를 얻기 위한 방법으로서,
    상기 조작된 항체를 발현시키기에 적합한 조건 하에서 제56항의 숙주 세포를 인큐베이션하는 단계, 및 상기 조작된 항체를 단리하는 단계를 포함하는, 방법.
  58. 키트로서,
    a. 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항의 조작된 항체; 및
    b. 트랜스글루타미나제를 포함하는, 키트.
KR1020227044507A 2020-05-20 2021-05-19 트랜스글루타미나제를 사용한 글리코실화 단일클론 항체의 부위-특이적 접합 KR20230013268A (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US202063027396P 2020-05-20 2020-05-20
US63/027,396 2020-05-20
PCT/IB2021/054308 WO2021234592A2 (en) 2020-05-20 2021-05-19 Site-specific conjugation of glycosylated monoclonal antibodies with transglutaminase

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20230013268A true KR20230013268A (ko) 2023-01-26

Family

ID=76355543

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020227044507A KR20230013268A (ko) 2020-05-20 2021-05-19 트랜스글루타미나제를 사용한 글리코실화 단일클론 항체의 부위-특이적 접합

Country Status (11)

Country Link
US (1) US20210388085A1 (ko)
EP (1) EP4153619A2 (ko)
JP (1) JP2023526102A (ko)
KR (1) KR20230013268A (ko)
CN (1) CN115667293A (ko)
AU (1) AU2021275632A1 (ko)
BR (1) BR112022023515A2 (ko)
CA (1) CA3183689A1 (ko)
IL (1) IL298342A (ko)
MX (1) MX2022014513A (ko)
WO (1) WO2021234592A2 (ko)

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012012612A2 (en) 2010-07-23 2012-01-26 University Of Delaware Tetrazine-trans-cyclooctene ligation for the rapid construction of radionuclide labeled probes
US10556024B2 (en) 2013-11-13 2020-02-11 Whitehead Institute For Biomedical Research 18F labeling of proteins using sortases
MX2017012102A (es) * 2015-03-20 2018-01-12 Pfizer Agentes citotoxicos bifuncionales que contienen el farmacoforo de cti.
FR3053688A1 (fr) * 2016-07-06 2018-01-12 Laboratoire Francais Du Fractionnement Et Des Biotechnologies Mutants fc a activite fonctionnelle amelioree
SG11202011633SA (en) 2018-05-24 2020-12-30 Janssen Biotech Inc Psma binding agents and uses thereof

Also Published As

Publication number Publication date
CN115667293A (zh) 2023-01-31
BR112022023515A2 (pt) 2022-12-20
IL298342A (en) 2023-01-01
WO2021234592A3 (en) 2022-01-13
MX2022014513A (es) 2023-03-10
AU2021275632A1 (en) 2023-02-02
CA3183689A1 (en) 2021-11-25
WO2021234592A2 (en) 2021-11-25
EP4153619A2 (en) 2023-03-29
US20210388085A1 (en) 2021-12-16
JP2023526102A (ja) 2023-06-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20220088212A1 (en) C-terminal lysine conjugated immunoglobulins
US11753669B2 (en) Lysine conjugated immunoglobulins
CA3188138A1 (en) Ccr8 antibodies for therapeutic applications
JP2018520143A (ja) 目的に合わせた親和性を有する抗トランスフェリンレセプター抗体
US20210388085A1 (en) Site-specific conjugation of glycosylated monoclonal antibodies with transglutaminase
US20210363177A1 (en) METHODS FOR SITE SPECIFIC CONJUGATION OF PROTEINS CONTAINING GLYCOSYLATED Fc DOMAINS
NL2022013B1 (en) Polypeptide Conjugates
WO2023065137A1 (en) Site-specific glycoprotein conjugates and methods for making the same
WO2022037665A1 (en) Site-specific antibody conjugates and the methods for preparation of the same
EP4310096A1 (en) Complex or salt thereof, and method for manufacturing same
EP4292609A1 (en) Compositions comprising antibodies that bind gamma-delta t cell receptors
RU2776302C2 (ru) Полипептидный линкер для получения мультиспецифических антител
Liu-Shin Cysteine-Linked IgG2 Antibody-Drug Conjugates: How Antibody Structure Affects Conjugation Locations and Stability
IL295958A (en) Molecules processed by protease

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination