CN115667293A - 使用转谷氨酰胺酶的糖基化单克隆抗体的位点特异性缀合 - Google Patents

使用转谷氨酰胺酶的糖基化单克隆抗体的位点特异性缀合 Download PDF

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Abstract

本发明描述了可用于通过转谷氨酰胺酶来进行位点特异性缀合的工程化抗体。还描述了抗体、位点特异性缀合的抗体和药物组合物的位点特异性缀合的方法，以及涉及该位点特异性缀合的抗体的用途。

Description

使用转谷氨酰胺酶的糖基化单克隆抗体的位点特异性缀合
相关申请的交叉引用
本申请要求于2020年5月20日提交的美国临时申请序列号63/027,396的权益。上述申请的全部内容全文以引用方式并入本文。
技术领域
本发明涉及糖基化抗体的位点特异性缀合。特别地，本发明涉及可用于使用转谷氨酰胺酶的位点特异性缀合的工程化抗体。本发明还涉及抗体、位点特异性缀合的抗体和药物组合物的位点特异性缀合的方法，以及涉及位点特异性缀合的抗体的用途。
以电子方式提交的序列表参考
本申请包含序列表，该序列表作为ASCII格式的序列表经由EFS-Web以电子方式提交，文件名为“JBI6302WOPCT1_SeqListing.txt”并且创建日期为2021年4月19日，并且大小为225kb。经由EFS-Web提交的该序列表是本说明书的一部分并且全文以引用方式并入本文。
背景技术
位点特异性缀合，即，分子与大蛋白(诸如单克隆抗体(mAb))上的特定位点的共价连接，是重要性日益增加的技术。越来越多的利用位点特异性缀合的治疗平台(诸如抗体-药物缀合物)正在进入临床开发。因此，补充或替换现有方法的新型方法具有很大的价值。
已经经过描述的位点特异性缀合的一种方法利用转谷氨酰胺酶(TGase)。转谷氨酰胺酶为一大类酶，在微生物以及高等生物体中都有这类酶的代表(Savoca等人，2018,Micromachines(Basel)9(11))。这些酶催化赖氨酸的ε-氨基基团与蛋白质的谷氨酰胺侧链的γ-甲酰胺基团之间的共价键形成，从而形成异肽键。TGase在包括血液凝结、细胞外基质组装和孢子形成的多种生物过程中起作用。除了其天然功能之外，一些TGase可以分别使用其他酰胺或胺取代谷氨酰胺或赖氨酸侧链，并由此催化小分子底物与蛋白质的共价缀合。例如，这些TGase可以将在药物上的伯胺连接至蛋白质/肽结合的谷氨酰胺残基的侧链羧基酰胺基团，从而在药物与蛋白质/肽之间形成异肽键。
来自茂原链霉菌(S.mobarensis)的微生物TGase(MTG)已经被证实对于小分子与蛋白质侧链的共价缀合特别有用。MTG被示出使用胺修饰的PEG催化将聚乙二醇(PEG)添加至多种蛋白质(包括重组人IL2(Sato,2002,Advanced drug delivery reviews 54(4):487-504)、干扰素(Spolaore等人，2016,Bioconjugate chemistry 27(11):2695-2706)和人类生长激素(Mero等人，2011,J Control Release 154(1):27-34))的过程以缀合至谷氨酰胺侧链，或使用用含Gln的二肽修饰的PEG进行该催化以缀合至赖氨酸侧链。在每种情况下，将PEG选择性地添加至仅一个Gln或Lys侧链或Gln或Lys侧链的小子集。然而，茂原链霉菌(S.mobaraensis)微生物TGase(MTG)的底物特异性还不是很清楚。不同的研究已经示出了对于谷氨酰胺底物的某种程度的序列选择性(Sugimura等人，2008,Arch BiochemBiophys 477(2):379-383)以及对二级结构的某种程度的依赖性(Mero等人，2011,id.；Spolaore等人，2012,Biochemistry 51(43):8679-8689)。当前，通常使用经验性方法以确定MTG是否可以用于特定蛋白质的选择性缀合。
MTG已经用于将小分子位点选择性地缀合至单克隆抗体。已经证明了用于将含胺有效载荷缀合至mAb上的Gln侧链的两种不同的方法，一种方法使用标记方法，并且第二方法利用如下偶然发现：在某些条件下，特定Gln残基可以是良好MTG底物。还描述了用于将含有Gln的有效载荷缀合至赖氨酸侧链的基于标签的方法。
Jeger等人证明：相比于在位置297处的N-键合的聚糖是完整的情况，如果使用去糖基化抗体，则用MTG修饰mAb的速率要快得多(Jeger等人，2010,Angewandte Chemie 49(51):9995-9997)；并且该修饰对于在mAb上的一个Gln位点具有高度特异性。缀合位点被确定为Gln295，该Gln295为在CH2结构域中的位置，该位置跨所有人IgG同种型皆为保守的并且距离糖基化位点两个残基。该方法(去糖基化，随后为MTG催化的与Gln295的缀合)已经用于制备抗体-放射性缀合物、抗体-药物缀合物和其他分子。该方法不需要对mAb进行工程化，但确实需要去除聚糖，这对免疫学特性产生影响(因为与Fc受体的结合被消除)，并且对生物物理特性(诸如热稳定性)产生影响，其中可以观察到CH2结构域的熔融温度降低至多7℃至8℃。
也已经证明了用于位点选择性mAb缀合(通过转谷氨酰胺酶进行缀合)的基于标签的方法。在mAb中的某些位置处附加或插入“Q-标签”(一种短的含Gln的肽，诸如LLQG)被示出允许在标签处的选择性缀合，而无需去糖基化(Strop等人，2013,Chem Biol 20(2):161-167)。Q-标签方法已经主要在mAb轻链和重链的C末端处使用，并且需要使用外源肽序列。已经使用c-myc标签描述了类似的方法(Dennler等人，2015,Chembiochem 16(5):861-867)。
位点特异性已成为抗体-药物缀合物(ADC)领域中的关键聚焦区域(Agarwal和Bertozzi，2015,Bioconjug Chem 26(2):176-92)，因为已证明，与随机缀合相比，用位点特异性方法可增加ADC的功效和安全性两者。
本领域仍然需要抗体的位点特异性缀合的有效方法。
发明内容
本发明通过提供工程化抗体来满足该需求，该工程化抗体可以使用转谷氨酰胺酶来位点特异性缀合至含胺有效载荷而无需去糖基化。
本发明的工程化抗体可以包含内源性重链Q295，当存在至少一个氨基酸取代时，该工程化抗体可以用于转谷氨酰胺酶催化的缀合而无需去除抗体聚糖。本发明的工程化抗体可以包含在重链残基处的氨基酸取代，当存在至少一个另外的氨基酸取代时，该工程化抗体可以用于转谷氨酰胺酶催化的缀合而无需去除抗体聚糖。
在一个总体方面，本发明涉及一种工程化抗体，该工程化抗体在抗体的重链恒定区CH2中包含在重链位置302处的氨基酸取代。此类取代可以为例如V302S、V302A、V302I、V302L、V302M、V302T、V302F和V302Y，优选地氨基酸取代V302A和V302S，其中氨基酸编号是根据Kabat的EU索引。在一个特定实施方案中，在位置302处的氨基酸取代为V302A。在另一个实施方案中，在位置302处的氨基酸取代为V302S。优选地，工程化抗体在抗体的重链恒定区CH2中还含有在位置300处的氨基酸取代。在一个特定实施方案中，在位置300处的氨基酸取代为Y300L。
在一些实施方案中，本发明的工程化抗体还包含在重链位置286、287、288、289、290、293或294处的谷氨酰胺取代，诸如氨基酸取代N286Q、A287Q、K288Q、T289Q、K290Q、E293Q或E294Q，和/或在重链位置241、243、294或301处的丙氨酸取代，诸如F241A、F243A、E294A或R301A。
在一些实施方案中，工程化抗体包含在重链位置288处的谷氨酰胺取代，诸如氨基酸取代K288Q。在一些实施方案中，工程化抗体包含在重链位置293处的谷氨酰胺取代，诸如氨基酸取代E293Q。在特定实施方案中，工程化抗体包含在重链位置294处的谷氨酰胺取代，诸如氨基酸取代E294Q。在一些实施方案中，工程化抗体包含在重链位置241处的丙氨酸，诸如氨基酸取代F241A。在一些实施方案中，工程化抗体包含在重链位置243处的丙氨酸，诸如氨基酸取代F243A。在一些实施方案中，工程化抗体包含在重链位置301处的丙氨酸，诸如氨基酸取代R301A。在特定实施方案中，工程化抗体包含在重链位置294处的丙氨酸，诸如氨基酸取代E294A。在特定实施方案中，工程化抗体包含在重链位置288处的谷氨酰胺取代，诸如氨基酸取代K288Q以及在重链位置294处的丙氨酸，诸如氨基酸取代E294A。
本发明的工程化抗体可以包含内源性重链Q295以及在残基286、287、288、289、290、293或294处的谷氨酰胺，当存在至少一个氨基酸取代时，该内源性重链以及谷氨酰胺可以用于转谷氨酰胺酶催化的缀合而无需去除抗体聚糖。在一个特定实施方案中，本发明的工程化抗体包含内源性重链Q295以及在残基293处的谷氨酰胺。在一个特定实施方案中，本发明的工程化抗体包含内源性重链Q295以及在残基294处的谷氨酰胺。
在一个实施方案中，工程化抗体包含氨基酸取代V302A或V302S，任选地Y300L，并且还包含在重链位置286、287、288、289、290、293或294处的谷氨酰胺取代，优选地氨基酸取代N286Q、A287Q、K288Q、T289Q、K290Q、E293Q或E294Q，其中氨基酸编号是根据Kabat的EU索引。在一些实施方案中，工程化抗体包含在重链位置302处的氨基酸取代，诸如氨基酸取代V302A或V302S以及在重链位置293处的氨基酸取代，诸如氨基酸取代E293Q，任选地还包含在重链位置300处的氨基酸取代，诸如氨基酸取代Y300L。在一些实施方案中，工程化抗体包含在重链位置302处的氨基酸取代，诸如氨基酸取代V302A或V302S以及在重链位置294处的氨基酸取代，诸如氨基酸取代E294Q，任选地还包含在重链位置300处的氨基酸取代，诸如氨基酸取代Y300L。在特定实施方案中，工程化抗体包含氨基酸取代V302A和E293Q，任选地还包含Y300L。在特定实施方案中，工程化抗体包含氨基酸取代V302S和E293Q，任选地还包含Y300L。在特定实施方案中，工程化抗体包含氨基酸取代V302A和E294Q，任选地还包含Y300L。在特定实施方案中，工程化抗体包含氨基酸取代V302A和E294Q，任选地还包含Y300L。
在另一个总体方面，本发明的工程化抗体包含在抗体的重链位置294处的氨基酸取代。在一些实施方案中，氨基酸取代为丙氨酸取代。在一些实施方案中，氨基酸取代为E294A或E294Q，其中氨基酸编号是根据Kabat的EU索引。在一些实施方案中，在抗体的重链位置294处的氨基酸取代为甲硫氨酸取代、苯丙氨酸取代、赖氨酸取代、亮氨酸取代、精氨酸取代、缬氨酸取代或酪氨酸取代。在一些实施方案中，氨基酸取代为E294A。在一些实施方案中，氨基酸取代为E294F。在一些实施方案中，氨基酸取代为E294K。在一些实施方案中，氨基酸取代为E294L。在一些实施方案中，氨基酸取代为E294R。在一些实施方案中，氨基酸取代为E294V。在一些实施方案中，氨基酸取代为E294Y。在一个特定实施方案中，氨基酸取代为E294M。
在一些实施方案中，工程化抗体还包含在重链位置302处的氨基酸取代，优选地，氨基酸取代选自由以下项组成的组：V302S、V302A、V302I、V302L、V302M、V302T、V302F和V302Y，更优选地V302A或V302S。更优选地，工程化抗体还包含在重链位置300处的氨基酸取代，优选地亮氨酸取代，诸如氨基酸取代Y300L。
在某些实施方案中，工程化抗体包含氨基酸取代V302A或V302S，以及氨基酸取代E293Q和E294Q中的至少一者，其中氨基酸编号是根据Kabat的EU索引。工程化抗体还可以包含氨基酸取代Y300L。
在另一个总体方面，本发明的工程化抗体包含在重链位置294和295处的氨基酸取代，其中氨基酸编号是根据Kabat的EU索引。在特定实施方案中，在重链位置294处的氨基酸取代为谷氨酰胺取代，诸如氨基酸取代E294Q。在一些实施方案中，在重链位置295处的氨基酸取代为丙氨酸取代，诸如氨基酸取代Q295A。在一些实施方案中，在重链位置295处的氨基酸取代为谷氨酸盐取代，诸如氨基酸取代Q295E。在一些实施方案中，在重链位置295处的氨基酸取代为天冬酰胺取代，诸如氨基酸取代Q295N。在特定实施方案中，工程化抗体包含氨基酸取代E294Q和Q295A。在特定实施方案中，工程化抗体包含氨基酸取代E294Q和Q295E。在特定实施方案中，工程化抗体包含氨基酸取代E294Q和Q295N。
与WT mAb相比，本文所公开的工程化抗体提供了使用转谷氨酰胺酶的含胺有效载荷的位点特异性缀合的经改善的效率，而无需去糖基化。在一些实施方案中，与WT mAb相比，工程化抗体显示出在特定时间范围内用含胺有效载荷的增加的标记度(DOL)，而无需去糖基化。在特定实施方案中，与去糖基化WT mAb相比，工程化抗体显示出在特定时间范围内用含胺有效载荷的增加的标记度(DOL)，而无需去糖基化。在特定实施方案中，与WT mAb相比，本文所公开的工程化抗体实现在更短时间范围内的完整标记(例如，DAR＝2或DAR＝4)，而无需去糖基化。在一些实施方案中，与WT mAb相比，工程化抗体具有类似或更高的Tm(对应于CH2结构域的熔融)。在特定实施方案中，与WT mAb相比，工程化抗体可以用于生成在细胞杀伤测定中显示出等效或经改善的活性的抗体-有效载荷缀合物。本文所述的取代也特别有用，因为这些取代可以用于一系列抗体背景，例如不同同种型的人、人源化和嵌合IgG，特别是IgG1、IgG2和IgG4。此外，本文所述的取代可以与一系列含胺底物一起使用。
在某些实施方案中，本发明的工程化抗体为人IgG抗体，优选地人IgG1抗体。在一些实施方案中，本发明的工程化抗体为人源化抗体。在一些实施方案中，本发明的工程化抗体为嵌合抗体，例如小鼠-人嵌合抗体。在特定实施方案中，工程化抗体为嵌合IgG1抗体。在一些实施方案中，本发明的工程化抗体为人IgG2抗体。在一些实施方案中，本发明的工程化抗体为人IgG4抗体。
在另一个实施方案中，本发明的工程化抗体被糖基化，该工程化抗体含有抗体聚糖。因此，本文所公开的工程化抗体可以能够保持WT与Fc受体的结合和WT生物物理特性，例如热稳定性，同时能够改善含胺抗体-有效载荷缀合物的制造效率(例如，至DAR＝2或DAR＝4)和/或增加ADC中有效载荷与抗体的比率(例如，至DAR＝4)。
本发明的工程化抗体可以包含至少一个氨基酸取代，该至少一个氨基酸取代使得在抗体聚糖的存在下，抗体能够在抗体的内源性重链Q295残基处通过转谷氨酰胺酶来缀合至含胺有效载荷，其中氨基酸编号是根据Kabat的EU索引。优选地，该至少一个氨基酸取代处于聚糖相互作用位点处，使得内源性Q295残基可以用于转谷氨酰胺酶催化的缀合而无需去除抗体聚糖。
本发明的工程化抗体可以包含至少一个氨基酸取代，该至少一个氨基酸取代使得在抗体聚糖的存在下，抗体能够通过在位于抗体的重链位置294处的谷氨酰胺残基处的转谷氨酰胺酶来缀合至含胺有效载荷，其中氨基酸编号是根据Kabat的EU索引。
本发明还涉及一种抗体-有效载荷缀合物，该抗体-有效载荷缀合物包含缀合至有效载荷的本发明的工程化抗体。优选地，有效载荷包含选自由以下项组成的组中的一者或多者：细胞毒性剂、细胞抑制剂、化学治疗剂、毒素、放射性核素、DNA、RNA、siRNA、微RNA、肽核酸、非天然氨基酸、肽、酶、荧光标签、生物素和第一点击反应配偶体。在特定实施方案中，有效载荷为含胺有效载荷。在一些实施方案中，有效载荷在抗体的内源性重链Q295残基处缀合至工程化抗体。在其他实施方案中，有效载荷在位于工程化抗体的重链位置286、287、288、289、290、293或294处的谷氨酰胺残基处缀合至工程化抗体。在特定实施方案中，有效载荷在位于工程化抗体的重链位置293处的谷氨酰胺残基处缀合至工程化抗体。在特定实施方案中，有效载荷在位于工程化抗体的重链位置294处的谷氨酰胺残基处缀合至工程化抗体。任何合适的有效载荷可以缀合至工程化抗体。在某些实施方案中，有效载荷在Q295处以及在位于重链位置293和294处的谷氨酰胺残基中的至少一个谷氨酰胺残基处缀合至工程化抗体。因此，在特定实施方案中，有效载荷在Q295处以及在位于重链位置293处的谷氨酰胺残基处缀合至工程化抗体。在特定实施方案中，有效载荷在Q295处以及在位于重链位置294处的谷氨酰胺残基处缀合至工程化抗体。优选地，本发明的抗体-有效载荷缀合物具有1至4，优选地2至4，最优选地2或4的药物抗体比率(DAR)。
在另一个总体方面，本发明涉及一种生成抗体-有效载荷缀合物的方法，该方法包括：
a.提供本发明的工程化抗体；
b.提供含胺有效载荷；以及
c.在一定条件下使工程化抗体和含胺有效载荷与转谷氨酰胺酶接触，以生成抗体-有效载荷缀合物，该抗体-有效载荷缀合物包含在位于重链位置286、287、288、289、290、293或294处的工程化谷氨酰胺(Q)残基处，和/或在内源性重链Q295处缀合至有效载荷的工程化抗体。
在一些实施方案中，在不去除工程化抗体的抗体聚糖的情况下，进行生成抗体-有效载荷缀合物的方法。
在另一个总体方面，本发明涉及一种药物组合物，该药物组合物包含本发明的工程化抗体、或本发明的抗体-有效载荷缀合物和药学上可接受的载体。
在另一个总体方面，本发明涉及一种组合或试剂盒，所述组合或试剂盒包含：
a.本发明的工程化抗体；以及
b.转谷氨酰胺酶；
其中该组合或试剂盒将用于用含胺有效载荷来标记抗体。
附图说明
当结合附图阅读时，将更好地理解上述发明内容以及下文本发明的详细描述。应当理解，本发明不限于附图中示出的精确实施方案。
在附图中：
图1a示出了NLDC-145mAb(顶部)与用3-APA修饰的NLDC-145(底部)的肽谱；如箭头所指示，在转谷氨酰胺酶反应的样本中识别出含有Gln295和Gln288、添加有3-APA的经修饰的肽；
图1b示出了用MTG修饰的完整NLDC-145的经还原的质量LC/MS；带有Man5聚糖(49917Da)的重链示出添加两个3-APA分子，而带有G0F聚糖(50143Da)的重链产生添加零和一个3-APA分子的混合物；
图2示出了3-APA与曲妥珠单抗变体的MTG催化的缀合的速率；特别地，将WT完整曲妥珠单抗与WT去糖基化、Y300L/V302S和V302S进行比较，并且每个重链的标记度(DOL)显示为时间函数；
图3示出了曲妥珠单抗-MMAF药物缀合物的活性的比较，该缀合物是用WT曲妥珠单抗经由已确立的转谷氨酰胺酶方法产生的或者是使用聚糖完整的V302S变体产生的。对于两种ADC，药物有效载荷为经由DAR＝2的可裂解Val-Cit-PABC连接基来连接的MMAF。用不同浓度的缀合物处理SK-BR3细胞72小时，并且通过Cell Titer Glo测定来确定细胞杀伤；
图4a示出3-APA与曲妥珠单抗变体的MTG催化的缀合的速率；特别地，将WT完整曲妥珠单抗与K288Q/Y300L/V302S、E293Q/Y300L/V302S和E294Q/Y300L/V302S进行比较，并且标记度(DOL)示出为时间函数；
图4b示出与E294Q/Y300L/V302S、E294Q/V302S和E294Q的反应速率的比较。
图4c示出由变体产生的DAR＝4曲妥珠单抗-MMAF药物缀合物与通过去糖基化和MTG催化的缀合而产生的缀合物的活性的比较。WT曲妥珠单抗经由已确立的转谷氨酰胺酶方法缀合至DAR＝2，并且变体在不去除聚糖的情况下缀合至DAR＝4。对于所有ADC，药物有效载荷为经由可裂解Val-Cit-PABC连接基连接的MMAF。用不同浓度的缀合物处理SK-BR3细胞72小时，并且通过Cell Titer Glo测定来确定细胞杀伤；
图5示出3-APA与曲妥珠单抗变体的MTG催化的缀合的速率；特别地，将WT完整曲妥珠单抗与聚糖完整的E294Q/Q295A、E294Q/Q295E、E294Q/Q295N和去糖基化WT曲妥珠单抗进行比较，并且标记度(DOL)示出为时间函数；
图6a示出3-APA与曲妥珠单抗变体的MTG催化的缀合的速率；特别地，将WT完整曲妥珠单抗与E294A和K288Q/E294A和去糖基化WT曲妥珠单抗进行比较，并且标记度(DOL)示出为时间函数；
图6b示出与WT曲妥珠单抗相比，K288Q/E294A变体的熔融温度(顶部图)和聚集温度(底部图)；
图6c示出曲妥珠单抗-MMAF药物缀合物的活性的比较，这些缀合物是用WT曲妥珠单抗经由已确立的转谷氨酰胺酶方法产生的或者是使用聚糖完整的E294A和K288Q/E294A变体产生的。对于所有ADC，药物有效载荷为经由DAR＝2的可裂解Val-Cit-PABC连接基连接的MMAF。用不同浓度的缀合物处理SK-BR3细胞72小时，并且通过Cell Titer Glo测定来确定细胞杀伤。
具体实施方式
背景以及说明书全篇中引用或描述了各种出版物、文章和专利；这些参考文献中的每一者全文均以引用方式并入本文。本说明书中包括的对文件、行为、材料、装置、文章等的讨论旨在为本发明提供上下文。此类讨论并不是承认这些事项中的任一事项或全部事项均相对于所公开或受权利要求书保护的任何发明形成现有技术的一部分。
除非另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语均具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。否则，本文引用的某些术语具有本说明书中所述的含义。本文引用的所有专利、公布的专利申请和出版物均以引用方式并入本文，如同在本文中进行了充分阐述。
应该注意的是，除非上下文清楚地指明，否则如本文和所附权利要求中所用的单数形式“一个/一种”和“所述/该”包括复数引用物。
贯穿本说明书和随后的权利要求书，除非上下文另有要求，否则词语“包括”以及诸如“包含”和“含有”的变型形式将被理解为暗示包括所陈述的整数或步骤或者整数或步骤的组，但不排除任何其他整数或步骤或者整数或步骤的组。当在本文使用时，术语“包含”可用术语“含有”或“包括”替代，或者有时在本文使用时用术语“具有”替代。
当在本文使用时，“由……组成”排除权利要求要素中未指定的任何要素、步骤或成分。当在本文使用时，“基本上由……组成”不排除没有实质上影响权利要求的基本和新颖特征的材料或步骤。每当在本文中用于本发明的一个方面或实施方案的情境时，任何前述术语“包含”、“含有”、“包括”和“具有”均可用术语“由……组成”或“基本上由……组成”替代以改变本公开的范围。
如本文所用，多个列举的要素之间的连接术语“和/或”被理解为包含单个选项和组合选项两者。例如，在两个要素由“和/或”连接的情况下，第一种选项是指在没有第二个要素的情况下适用第一个要素。第二种选项是指在没有第一个要素的情况下适用第二个要素。第三种选项是指适合一起使用第一要素和第二要素。这些选项中的任一种均被理解为落在含义内，并且因此满足如本文所用的术语“和/或”的要求。多于一种选项的并行适用性也被理解为落在含义内，并且因此满足术语“和/或”的要求。
为了帮助本申请的读者，已将说明书分成各个段落或章节，或者涉及本申请的各个实施方案。这些分割不应被认为是将段落或章节或实施方案的实质与另一段落或章节或实施方案的实质拆开。相反，本领域技术人员将理解，本说明书具有广泛的应用，并且涵盖可设想到的各个章节、段落和句子的所有组合。对任何实施方案的讨论仅意图是示例性的，并且不旨在表明本公开(包括权利要求书)的范围限于这些示例。
工程化抗体
与已知工序相比，本发明的工程化抗体允许用使用转谷氨酰胺酶的含胺有效载荷来进行抗体的位点特异性缀合，而无需去糖基化以去除抗体聚糖。
在一个总体方面，本发明涉及一种工程化抗体或其片段，其中抗体包含可用于通过转谷氨酰胺酶来进行缀合的谷氨酰胺位点，而无需去除抗体聚糖。
如本文所用，术语“抗体”或“免疫球蛋白”广义地使用并且包括免疫球蛋白或抗体分子，包括多克隆抗体、单克隆抗体(包括鼠科、人、人适应的(human-adapted)、人源化和嵌合单克隆抗体)及其抗原结合片段。
一般来讲，抗体是对特定抗原(在本文中称为“靶”)表现出结合特异性的蛋白质或肽链，。抗体结构是众所周知的。完整“抗体”包含由二硫键互相连接的至少两条重(H)链和两条轻(L)链。通常参见Fundamental Immunology，第7章(Paul,W.编辑，第2版，RavenPress,N.Y.(1989))(出于所有目的其全文以引用的方式并入)。每条重链由重链可变区(HCVR或VH)和重链恒定区(CH)构成。重链恒定区由三种结构域CH1、CH2和CH3构成。每条轻链由轻链可变区(LCVR或VL)和轻链恒定区构成。轻链恒定区包含一个结构域CL。在人类中，存在两种类型的轻链，kappa(κ)和lambda(λ)，使得这两种类型的轻链的恒定区分别命名为Cκ和Cλ。VH区和VL区可进一步细分为超变区，该超变区称为互补决定区(CDR)，间插有更保守的、称为框架区(FR)的区。各个VH和VL由三个CDR和四个FR构成，该三个CDR和四个FR从氨基末端至羧基末端按以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。对每个结构域的氨基酸分配是根据Kabat的定义、Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1987和1991))或Chothia&Lesk,J.Mol.Biol.196:901-917(1987)；Chothia等人，Nature 342:878-883(1989)。
如本文所用，术语“工程化抗体”是指包含至少一个工程化恒定区(例如工程化Fc区、工程化Cκ区和/或工程化Cλ区)的抗体或其片段。
根据重链恒定域氨基酸序列，可将免疫球蛋白指定为五种主要种类，即IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。IgA和IgG进一步亚分类为同种型IgA1、IgA2、IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。因此，本发明的抗体可为五种主要种类或对应的亚类中的任一种。优选地，本发明的抗体为IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。基于该抗体恒定结构域的氨基酸序列，可将任何脊椎物种的抗体轻链指定为两种完全不同的类型即κ和λ中的一种。因此，本发明的抗体可含有κ或λ轻链恒定域。根据特定实施方案，本发明的抗体包括来自小鼠抗体或人抗体的重链和/或轻链恒定区。四种IgG亚类中的每一种具有不同的生物功能，这些生物功能被称为效应子功能。这些效应子功能通常通过与Fc受体(FcγR)的相互作用或者通过结合C1q并固定补体来介导。结合FcγR可导致抗体依赖性细胞介导的细胞溶解，而结合补体因子可导致补体介导的细胞裂解。可用于本发明的抗体可不具有效应子功能或具有最小效应子功能，但保留该抗体结合FcRn的能力。
如本文所用，短语“可用于通过转谷氨酰胺酶来进行缀合”是指在转谷氨酰胺酶的存在下对胺供体剂具有反应性的谷氨酰胺残基，其中谷氨酰胺残基由抗体工程引入和/或为由抗体工程使内源性谷氨酰胺具有反应性的内源性谷氨酰胺。
如本文所用，术语“抗体聚糖”是指在抗体重链的Fc区内位置297处的N-键合的聚糖，其中氨基酸编号是根据Kabat的EU索引。
在总体方面，本发明涉及一种工程化抗体，该工程化抗体包含在抗体的重链位置处的氨基酸取代，使得工程化抗体可以使用转谷氨酰胺酶来位点特异性缀合至含胺有效载荷，而无需去糖基化。
根据一个方面，本发明涉及一种工程化抗体，该工程化抗体在抗体的重链恒定区CH2中包含在重链位置302处的氨基酸取代，其中氨基酸编号是根据Kabat的EU索引。
根据一个方面，本发明涉及一种工程化抗体，该工程化抗体包含在重链位置294处的氨基酸取代，其中氨基酸编号是根据Kabat的EU索引。
根据一个方面，本发明涉及一种工程化抗体，该工程化抗体包含在重链残基处的氨基酸取代，当存在至少一个其他氨基酸取代时，该氨基酸取代可以用于转谷氨酰胺酶催化的缀合而无需去除抗体聚糖。
根据特定实施方案，氨基酸取代可以为用二十种天然存在的氨基酸(或‘标准’氨基酸)或其变体中的任一者或者并非在蛋白质中天然存在的任何变体对氨基酸残基的取代。
标准氨基酸可以基于其特性而分到若干组中。重要因素为电荷、亲水性或疏水性、尺寸和官能团。这些特性对于蛋白质结构和蛋白质-蛋白质相互作用十分重要。一些氨基酸具有特殊特性，诸如半胱氨酸，该半胱氨酸可以与其他半胱氨酸残基形成共价二硫键(或二硫桥)；脯氨酸，该脯氨酸与多肽主链形成循环；和甘氨酸，该甘氨酸比其他氨基酸更柔性。表1示出了标准氨基酸的缩写和特性。
表1.标准氨基酸、缩写和特性
Figure BDA0003949907720000131
根据特定实施方案，工程化抗体包含在重链位置302处的氨基酸取代，其中氨基酸编号是根据Kabat的EU索引。根据特定实施方案，工程化抗体包含选自由以下项组成的组的氨基酸取代：V302S、V302A、V302I、V302L、V302M、V302T、V302F和V302Y。根据特定实施方案，在残基302处的缬氨酸用丝氨酸(V302S)进行取代。在另一个特定实施方案中，在残基302处的缬氨酸用丙氨酸(V302A)进行取代。
根据特定实施方案，工程化抗体还包含在重链位置300处的氨基酸取代。根据特定实施方案，在残基300处的酪氨酸用亮氨酸(Y300L)进行取代。
在一些实施方案中，工程化抗体含有在重链位置300处的氨基酸取代以及在重链位置302处的氨基酸取代。在一些实施方案中，在重链位置300处的氨基酸取代为Y300L以及在重链位置302处的氨基酸取代为V302A。在一个特定实施方案中，在重链位置300处的氨基酸取代为Y300L以及在重链位置302处的氨基酸取代为V302S。
根据特定实施方案，工程化抗体还包含在重链位置294处的氨基酸取代。根据特定实施方案，在残基294处的谷氨酸用丙氨酸(E294A)进行取代。
根据特定实施方案，工程化抗体还包含在重链位置286、287、288、289、290、293或294处的氨基酸取代。根据特定实施方案，在残基286处的天冬酰胺用谷氨酰胺(N286Q)进行取代，在残基287处的丙氨酸用谷氨酰胺(A287Q)进行取代，在残基288处的赖氨酸用谷氨酰胺(K288Q)进行取代，在残基289处的苏氨酸用谷氨酰胺(T289Q)进行取代，在残基290处的赖氨酸用谷氨酰胺(K290Q)进行取代，在残基293处的谷氨酸用谷氨酰胺(E293Q)进行取代，或在残基294处的谷氨酸用谷氨酰胺(E294Q)进行取代。
在一些实施方案中，工程化抗体包含在重链位置302处的氨基酸取代，诸如氨基酸取代V302A或V302S以及在重链位置285处的氨基酸取代，诸如氨基酸取代H285Q，任选地还包含在重链位置300处的氨基酸取代，诸如氨基酸取代Y300L。在一些实施方案中，工程化抗体包含在重链位置302和285处的氨基酸取代。在一些实施方案中，工程化抗体包含氨基酸取代V302A和H285Q。在一些实施方案中，工程化抗体包含氨基酸取代V302S和H285Q。在一些实施方案中，工程化抗体包含在重链位置302、285和300处的氨基酸取代。在一些实施方案中，工程化抗体包含氨基酸取代V302A、H285Q和Y300L。在一些实施方案中，工程化抗体包含氨基酸取代V302S、H285Q和Y300L。
在一些实施方案中，工程化抗体包含在重链位置302处的氨基酸取代，诸如氨基酸取代V302A或V302S以及在重链位置286处的氨基酸取代，诸如氨基酸取代N286Q，任选地还包含在重链位置300处的氨基酸取代，诸如氨基酸取代Y300L。在一些实施方案中，工程化抗体包含在重链位置302和286处的氨基酸取代。在一些实施方案中，工程化抗体包含氨基酸取代V302A和N286Q。在一些实施方案中，工程化抗体包含氨基酸取代V302S和N286Q。在一些实施方案中，工程化抗体包含在重链位置302、286和300处的氨基酸取代。在一些实施方案中，工程化抗体包含氨基酸取代V302A、N286Q和Y300L。在一些实施方案中，工程化抗体包含氨基酸取代V302S、N286Q和Y300L。
在一些实施方案中，工程化抗体包含在重链位置302处的氨基酸取代，诸如氨基酸取代V302A或V302S以及在重链位置287处的氨基酸取代，诸如氨基酸取代A287Q，任选地还包含在重链位置300处的氨基酸取代，诸如氨基酸取代Y300L。在一些实施方案中，工程化抗体包含在重链位置302和287处的氨基酸取代。在一些实施方案中，工程化抗体包含氨基酸取代V302A和A287Q。在一些实施方案中，工程化抗体包含氨基酸取代V302S和A287Q。在一些实施方案中，工程化抗体包含在重链位置302、287和300处的氨基酸取代。在一些实施方案中，工程化抗体包含氨基酸取代V302A、A287Q和Y300L。在一些实施方案中，工程化抗体包含氨基酸取代V302S、A287Q和Y300L。
在一些实施方案中，工程化抗体包含在重链位置302处的氨基酸取代，诸如氨基酸取代V302A或V302S以及在重链位置288处的氨基酸取代，诸如氨基酸取代K288Q，任选地还包含在重链位置300处的氨基酸取代，诸如氨基酸取代Y300L。在一些实施方案中，工程化抗体包含在重链位置302和288处的氨基酸取代。在一些实施方案中，工程化抗体包含氨基酸取代V302A和K288Q。在一些实施方案中，工程化抗体包含氨基酸取代V302S和K288Q。在一些实施方案中，工程化抗体包含在重链位置302、288和300处的氨基酸取代。在特定实施方案中，工程化抗体包含氨基酸取代V302A、K288Q和Y300L。在特定实施方案中，工程化抗体包含氨基酸取代V302S、K288Q和Y300L。
在一些实施方案中，工程化抗体包含在重链位置302处的氨基酸取代，诸如氨基酸取代V302A或V302S以及在重链位置289处的氨基酸取代，诸如氨基酸取代T289Q，任选地还包含在重链位置300处的氨基酸取代，诸如氨基酸取代Y300L。在一些实施方案中，工程化抗体包含在重链位置302和289处的氨基酸取代。在一些实施方案中，工程化抗体包含氨基酸取代V302A和T289Q。在一些实施方案中，工程化抗体包含氨基酸取代V302S和T289Q。在一些实施方案中，工程化抗体包含在重链位置302、289和300处的氨基酸取代。在一些实施方案中，工程化抗体包含氨基酸取代V302A、T289Q和Y300L。在一些实施方案中，工程化抗体包含氨基酸取代V302S、T289Q和Y300L。
在一些实施方案中，工程化抗体包含在重链位置302处的氨基酸取代，诸如氨基酸取代V302A或V302S以及在重链位置290处的氨基酸取代，诸如氨基酸取代K290Q，任选地还包含在重链位置300处的氨基酸取代，诸如氨基酸取代Y300L。在一些实施方案中，工程化抗体包含在重链位置302和290处的氨基酸取代。在一些实施方案中，工程化抗体包含氨基酸取代V302A和K290Q。在一些实施方案中，工程化抗体包含氨基酸取代V302S和K290Q。在一些实施方案中，工程化抗体包含在重链位置302、290和300处的氨基酸取代。在一些实施方案中，工程化抗体包含氨基酸取代V302A、K290Q和Y300L。在一些实施方案中，工程化抗体包含氨基酸取代V302S、K290Q和Y300L。
在一些实施方案中，工程化抗体包含在重链位置302处的氨基酸取代，诸如氨基酸取代V302A或V302S以及在重链位置293处的氨基酸取代，诸如氨基酸取代E293Q，任选地还包含在重链位置300处的氨基酸取代，诸如氨基酸取代Y300L。在一些实施方案中，工程化抗体包含在重链位置302和293处的氨基酸取代。在一些实施方案中，工程化抗体包含氨基酸取代V302A和E293Q。在一些实施方案中，工程化抗体包含氨基酸取代V302S和E293Q。在一些实施方案中，工程化抗体包含在重链位置302、293和300处的氨基酸取代。在特定实施方案中，工程化抗体包含氨基酸取代V302A、E293Q和Y300L。在特定实施方案中，工程化抗体包含氨基酸取代V302S、E293Q和Y300L。
在一些实施方案中，工程化抗体包含在重链位置302处的氨基酸取代，诸如氨基酸取代V302A或V302S以及在重链位置294处的氨基酸取代，诸如氨基酸取代E294Q，任选地还包含在重链位置300处的氨基酸取代，诸如氨基酸取代Y300L。在一些实施方案中，工程化抗体包含在重链位置302和294处的氨基酸取代。在特定实施方案中，工程化抗体包含氨基酸取代V302A和E294Q。在特定实施方案中，工程化抗体包含氨基酸取代V302S和E294Q。在一些实施方案中，工程化抗体包含在重链位置302、294和300处的氨基酸取代。在特定实施方案中，工程化抗体包含氨基酸取代V302A、E294Q和Y300L。在特定实施方案中，工程化抗体包含氨基酸取代V302S、E294Q和Y300L。
在一些实施方案中，工程化抗体提供带有完整聚糖的抗体-有效载荷缀合物，具有的DAR为2。在特定实施方案中，工程化抗体提供带有完整聚糖的抗体-有效载荷缀合物，具有的DAR为4。在一些实施方案中，带有完整聚糖的工程化抗体显示出完整标记(例如，DAR＝2或DAR＝4)，该工程化抗体用使用转谷氨酰胺酶的含胺有效载荷，时间尺度比WT mAb更短。在一些实施方案中，与WT mAb相比，在含胺有效载荷缀合测定的0.5小时、1小时、1.5小时、2小时、2.5小时、3小时、3,5小时、4小时、4.5小时或5小时内，带有完整聚糖的工程化抗体显示出增加的DOL。在特定实施方案中，与去糖基化WT mAb相比，在含胺有效载荷缀合测定的0.5小时、1小时、1.5小时、2小时、2.5小时、3小时、3,5小时、4小时、4.5小时或5小时内，带有完整聚糖的工程化抗体显示出增加的DOL。
根据另一方面，本发明涉及一种工程化抗体或其片段，其中抗体包含在聚糖相互作用位点处的至少一个氨基酸取代。
根据特定实施方案，氨基酸取代可以为用二十种天然存在的氨基酸(或‘标准’氨基酸)或其变体中的任一者或者并非在蛋白质中天然存在的任何变体对氨基酸残基的取代。
根据特定实施方案，氨基酸取代在重链位置301、241或243处。根据特定实施方案，在残基301处的精氨酸用丙氨酸(R301A)进行取代。根据特定实施方案，在残基241处的苯丙氨酸用丙氨酸(F241A)进行取代。根据特定实施方案，在残基243处的苯丙氨酸用丙氨酸(F243A)进行取代。
根据特定实施方案，本发明的工程化抗体包含在抗体的重链位置294处的氨基酸取代，其中氨基酸编号是根据Kabat的EU索引。
在一些实施方案中，在抗体的重链位置294处的氨基酸取代为丙氨酸取代、甲硫氨酸取代、苯丙氨酸取代、赖氨酸取代、亮氨酸取代、精氨酸取代、缬氨酸取代或酪氨酸取代。在一些实施方案中，氨基酸取代为E294A。在一些实施方案中，氨基酸取代为E294F。在一些实施方案中，氨基酸取代为E294K。在一些实施方案中，氨基酸取代为E294L。在一些实施方案中，氨基酸取代为E294R。在一些实施方案中，氨基酸取代为E294V。在一些实施方案中，氨基酸取代为E294Y。在一个特定实施方案中，氨基酸取代为E294M。
在特定实施方案中，工程化抗体包含在重链位置294处的丙氨酸，诸如氨基酸取代E294A以及在重链位置288处的谷氨酰胺取代，诸如氨基酸取代K288Q。
在一些实施方案中，在294处单独的或与附加取代(例如，K288Q)结合的取代提供了带有完整聚糖的工程化抗体，与WT mAb相比，在特定时间范围内，该工程化抗体在含胺有效载荷缀合测定中显示出增加的标记度(DOL)。在特定实施方案中，与WT mAb相比，工程化抗体在细胞毒性测定法中同样有效。
在一些实施方案中，在294处的取代提供了工程化抗体，与WT mAb相比，该工程化抗体的热稳定性等同或经改善。在特定实施方案中，与WT mAb相比，工程化抗体显示出等同或经改善的Tm。在一些实施方案中，工程化抗体的Tm比WT mAb高至少约0.5℃、1℃、1.5℃、2℃、2.5℃、3℃、3.5℃、4℃、4.5℃或5℃。
在特定实施方案中，在294处的取代，例如E294M，提供了带有完整聚糖的工程化抗体，与WT mAb相比，在特定时间范围内，该工程化抗体在含胺有效载荷缀合测定中显示出增加的标记度(DOL)，并且与WT mAb相比，该工程化抗体显示出等同或经改善的Tm。
在一些实施方案中，本发明的工程化抗体包含在抗体的重链位置293处的氨基酸取代，其中氨基酸编号是根据Kabat的EU索引。在一些实施方案中，在抗体的重链位置293处的氨基酸取代为丙氨酸取代、甲硫氨酸取代、苯丙氨酸取代、赖氨酸取代、亮氨酸取代、精氨酸取代、缬氨酸取代或酪氨酸取代。在特定实施方案中，氨基酸取代为E293M。
本发明的工程化抗体可以包含在抗体的重链位置295处的氨基酸取代，其中氨基酸编号是根据Kabat的EU索引。在一些实施方案中，本发明的工程化抗体包含在重链位置294和295处的氨基酸取代。在特定实施方案中，在重链位置294处的氨基酸取代为谷氨酰胺取代，诸如氨基酸取代E294Q。在一些实施方案中，在重链位置295处的氨基酸取代为丙氨酸取代，诸如氨基酸取代Q295A。在一些实施方案中，在重链位置295处的氨基酸取代为谷氨酸盐取代，诸如氨基酸取代Q295E。在一些实施方案中，在重链位置295处的氨基酸取代为天冬酰胺取代，诸如氨基酸取代Q295N。在特定实施方案中，工程化抗体包含氨基酸取代E294Q和Q295A。在特定实施方案中，工程化抗体包含氨基酸取代E294Q和Q295E。在特定实施方案中，工程化抗体包含氨基酸取代E294Q和Q295N。
在一些实施方案中，与在294处的取代结合的在295处的取代提供了带有完整聚糖的工程化抗体，与WT mAb相比，在特定时间范围内，该工程化抗体在含胺有效载荷缀合测定中显示出增加的标记度(DOL)。在一些实施方案中，与在294处的取代结合的在295处的取代提供了带有完整聚糖的工程化抗体，与去糖基化WT mAb相比，在特定时间范围内，该工程化抗体在含胺有效载荷缀合测定中显示出增加的标记度(DOL)。
在一些实施方案中，与WT mAb或去糖基化WT mAb相比，在特定时间范围内，例如在含胺有效载荷缀合测定的0.5小时、1小时、1.5小时、2小时、2.5小时、3小时、3.5小时、4小时、4.5小时或5小时(例如0.5小时)内，本文所公开的带有完整聚糖的工程化抗体在含胺有效载荷缀合测定中显示出增加的标记度(DOL)。在一些实施方案中，在22℃至37℃下，在使用转谷氨酰胺酶(例如MTG)的工程化抗体和胺有效载荷缀合物(例如3-叠氮基丙胺(3-APA))的特定温育周期之后，确定DOL。在一些实施方案中，例如在Agilent G6224 MS-TOF质谱仪上，使用质谱(MS)(诸如液相色谱MS(LC-MS))来确定DOL。在一些实施方案中，与WT mAb相比，本文所公开的工程化抗体显示出等同或经改善的Tm。在一些实施方案中，工程化抗体的Tm比WT mAb高至少约0.5℃、1℃、1.5℃、2℃、2.5℃、3℃、3.5℃、4℃、4.5℃或5℃。在一些实施方案中，Tm可以通过在20℃至95℃的热扫描下，监测330nm和350nm处的荧光强度变化来进行确定。在特定实施方案中，与去糖基化WT mAb相比，在特定时间范围内，本文所公开的工程化抗体在含胺有效载荷缀合测定中显示出增加的标记度(DOL)，而无需去糖基化，并且与WT mAb相比，该工程化抗体显示出等同或经改善的Tm。
在一些实施方案中，本发明的工程化抗体在细胞毒性测定法中是有效的。在特定实施方案中，与WT mAb相比，工程化抗体在细胞毒性测定法中同样有效。在特定实施方案中，细胞毒性测定法需要用包含本发明的工程化抗体的不同浓度的ADC来处理癌细胞系(例如SKBR3)，并且在处理结束时确定细胞活力(例如使用Cell Titer Glo)。在一些实施方案中，处理在37℃下持续72小时。
根据另一方面，本发明涉及一种抗体-有效载荷缀合物，该抗体-有效载荷缀合物包含在内源性重链Q295残基处(任选地通过连接基)缀合至有效载荷的本发明的工程化抗体。
根据另一方面，本发明涉及一种抗体-有效载荷缀合物，该抗体-有效载荷缀合物包含在内源性重链Q295残基处以及在位于重链位置286、287、288、289、290、293或294处的工程化谷氨酰胺(Q)残基处(任选地通过连接基)缀合至有效载荷的本发明的工程化抗体。在特定实施方案中，抗体-有效载荷缀合物在内源性重链Q295残基处以及在位于重链位置293处的工程化谷氨酰胺(Q)残基处(任选地通过连接基)缀合至有效载荷。在特定实施方案中，抗体-有效载荷缀合物在内源性重链Q295残基处以及在位于重链位置294处的工程化谷氨酰胺(Q)残基处(任选地通过连接基)缀合至有效载荷。
根据另一方面，本发明涉及一种抗体-有效载荷缀合物，该抗体-有效载荷缀合物包含在位于单独的重链位置294处的工程化谷氨酰胺(Q)残基处(任选地通过连接基)缀合至有效载荷的本发明的工程化抗体。
根据另一方面，本发明涉及一种抗体-有效载荷缀合物，该抗体-有效载荷缀合物包含(任选地通过连接基)缀合至一种或多种有效载荷的本发明的工程化抗体。在一个特定实施方案中，抗体-有效载荷缀合物包含在位于重链位置294处的工程化谷氨酰胺(Q)残基(例如在工程化抗体的每条重链上)处和在位于重链位置295处的谷氨酰胺(Q)残基(例如在工程化抗体的每条重链上)处(任选地通过连接基)缀合至有效载荷的本发明的工程化抗体。
在特定实施方案中，本发明的工程化抗体被糖基化，该工程化抗体含有抗体聚糖。因此，在一些实施方案中，与WT(完整或去糖基化)对照相比，在特定时间范围内，工程化抗体在含氨基的有效载荷缀合测定中显示出增加的标记度，同时保持完整聚糖。在一些实施方案中，工程化抗体提供具有的DAR为2的抗体-有效载荷缀合物，同时保持完整聚糖。在一些实施方案中，工程化抗体提供具有的DAR为4的抗体-有效载荷缀合物，同时保持完整聚糖。在特定实施方案中，与WT(完整或去糖基化)对照相比，在特定时间范围内，工程化抗体在含氨基的有效载荷缀合测定中显示出增加的标记度，并且提供具有的DAR为4的抗体-有效载荷缀合物，同时保持完整聚糖。因此，本发明的工程化抗体可以能够更有效地制造抗体-有效载荷缀合物和/或能够增加ADC中有效载荷与抗体的比率，同时保持WT与Fc受体的结合和WT生物物理特性，例如热稳定性。在特定实施方案中，与WT mAb相比，本发明的工程化抗体在细胞毒性测定法中同样有效。
如本文所用，术语“抗体-有效载荷缀合物”是指共价连接至在本文中称为“有效载荷”的分子的抗体。“抗体-药物缀合物”是共价连接至胞毒或胞质药物/药剂的“抗体-有效载荷缀合物”，其中药物/药剂在本文中也称为“有效载荷”。
根据本公开，本领域技术人员已知的任何合适的有效载荷可用于本发明中。有效载荷可以为例如药物/药剂、连接基、点击反应配偶体等。根据特定实施方案，有效载荷可以为例如细胞毒性剂、细胞抑制剂、化学治疗剂、毒素、放射性核素、DNA、RNA、siRNA、微RNA、肽核酸、非天然氨基酸、肽、酶、荧光标签、生物素、连接基或第一点击反应配偶体。
如本文所用，术语“共价连接的”意指有效载荷经由至少一个共价键来连接至抗体。键联可为直接的，即没有连接基，或间接的，即经由连接基。
如本文所用，术语“连接基”是指连接两个分子的化学部分。根据本公开，本领域技术人员已知的任何合适的连接基可用于本发明中。连接基可为例如单个共价键、取代或未取代的烷基部分、取代或未取代的杂烷基部分、聚乙二醇(PEG)连接基、肽连接基、基于糖的连接基或可裂解的连接基，诸如二硫键或蛋白酶裂解位点，诸如缬氨酸-瓜氨酸-PAB。
根据特定方面，工程化抗体缀合至第一点击反应配偶体。根据特定方面，抗体-有效载荷缀合物与第二点击反应配偶体进一步反应，该第二点击反应配偶体包含细胞毒性剂、细胞抑制剂、化学治疗剂、毒素、放射性核素、DNA、RNA、siRNA、微RNA、肽核酸、非天然氨基酸、肽、酶、荧光标签和生物素中的一者或多者，从而获得第二抗体-有效载荷缀合物。
如本文所用，术语“点击化学”是指由Sharpless引入的化学理念，该化学理念描述了通过将包含反应性基团的小单元连接在一起而被调制为快速且可靠地生成共价键的化学(参见Kolb等人，Angew Chem Int Ed Engl.2001年6月1日；40(11):2004-2021)。点击化学不是指特定反应，而是指包括但不限于模拟自然界中存在的反应的反应的概念。在一些实施方案中，点击化学反应是模块化的，范围广泛，给出高化学收率，生成无害的副产物，是立体特异性的，表现出大的热力学驱动力以有助于与单一反应产物反应，和/或可在生理条件下进行。在一些实施方案中，点击化学反应表现出高原子经济性，可在简单的反应条件下进行，使用易得的起始材料和试剂，不使用毒性溶剂或者使用良性或易于去除的溶剂，诸如水，和/或通过非色谱方法诸如结晶或蒸馏提供简单的产物分离。在某些实施方案中，点击化学反应是叠氮化物(-N3)与炔烃或炔烃部分之间的Huisgen环加成或1,3-偶极环加成，以形成1,2,4-三唑连接基。
如本文所用，术语“点击反应配偶体”或“点击化学柄”是指可参与点击化学反应的反应物或反应性基团。点击反应配偶体可为很少存在于天然存在的生物分子中并且对生物分子呈化学惰性的部分，但是，例如当与叠氮化物反应性或炔烃反应性基团反应时，该反应可在生物相关条件下，例如在细胞培养条件下，诸如在不存在过量的热或苛刻的反应物的情况下有效地发生。一般来讲，点击化学反应需要至少两个包含可彼此反应的点击反应配偶体的分子。彼此反应的此类点击反应配偶体有时在本文中称为点击化学柄对或点击化学对。在一些实施方案中，点击反应配偶体是叠氮化物和应变炔烃，例如环辛炔或任何其他炔烃。在其他实施方案中，点击反应配偶体是反应性二烯和合适的四嗪亲双烯体。例如，反式环辛烯、降冰片烯或双环壬烯可与合适的四嗪亲双烯体配对作为点击反应对。在其他实施方案中，四唑可充当腈亚胺的潜在来源，该四唑可在紫外光的存在下与未活化的烯烃配对以产生点击反应对，称为“光点击”反应对。在其他实施方案中，点击反应配偶体是半胱氨酸和马来酰亚胺。例如，来自肽(例如，GGGC)的半胱氨酸可与和螯合剂(例如，NOTA)缔合的马来酰亚胺反应。其他合适的点击化学柄是本领域技术人员已知的(参见，例如，Spicer等人，“Selective chemical protein modification.”Nature Communications.2014；5:4740)。在其他实施方案中，点击反应配偶体是施陶丁格连接(Staudinger ligation)组分，诸如膦和叠氮化物。在其他实施方案中，点击反应配偶体是狄尔斯-阿尔德反应组分，诸如二烯，诸如四嗪，以及烯烃，诸如反式环辛烯(TCO)或降冰片烯。示例性点击反应配偶体描述于US20130266512和WO2015073746中，两者中对于点击反应配偶体的相关描述均以引用方式并入本文。根据优选的实施方案，第一点击反应配偶体和第二点击反应配偶体中的一个包含炔烃基团，并且另一个点击反应配偶体包含叠氮化物。根据其他优选的实施方案，第一点击反应配偶体和第二点击反应配偶体中的一个包含烯烃基团，并且另一个点击反应配偶体包含二烯。
如本文所用，术语“炔烃”、“炔烃基团”或“炔烃部分”是指包含碳-碳三键的官能团。炔烃部分包括末端炔烃和环状炔烃，优选地与叠氮基团反应的末端炔烃和环状炔烃。末端炔烃具有至少一个结合到三键碳原子的氢原子。环状炔烃是包含一个或多个三键的环烷基环。环状炔烃的示例包括但不限于环辛炔和环辛炔衍生物，诸如双环壬炔(BCN)、二氟化环辛炔(DIFO)、二苯并环辛炔(DIBO)、酮基-DIBO、二芳基氮杂环辛酮(BARAC)、二苯并氮杂环辛炔(DIBAC)、二甲氧基氮杂环辛炔(DIMAC)、二苄基环辛炔(DBCO)、二氟苯并环辛炔(DIFBO)、单苯并环辛炔(MOBO)和四甲氧基DIBO(TMDIBO)。
根据优选的实施方案，第一点击反应配偶体为3-叠氮基-1-丙胺。根据优选的实施方案，第二点击反应配偶体为二苯并环辛炔-四乙二醇-缬氨酸-瓜氨酸-对氨基苄基氨基甲酸酯-一甲基澳瑞他汀F(DBCO-val-cit-MMAF或DBCO-vcMMAF)或二苯并环辛炔-四乙二醇-一甲基澳瑞他汀F(DBCO-MMAF)。
本发明的工程化抗体可以缀合至一系列不同的底物以形成经缀合的抗体有效载荷。在一些实施方案中，底物包含可裂解的或不可裂解的连接基。在一些实施方案中，底物为3-叠氮基丙胺。在一些实施方案中，底物为带有短PEG连接基的含叠氮化物的胺，诸如生物素连接的胺戊基氨基生物素。在一些实施方案中，底物为NH2-PEG4-MMAF。在一些实施方案中，底物为NH2-PEG4-Val-Cit-PABC-MMAF。
如本文所用，术语“二烯”是指具有两个碳-碳双键的化合物，其中这些双键在1,3-位置共轭。二烯的双键可为顺式或反式的。二烯的示例包括但不限于四嗪或四唑基团。
如本文所用，术语“烯烃”、“烯烃基团”或“烯烃部分”是指包含碳-碳双键的不饱和烃分子。根据特定实施方案，烯烃可包含2至100个碳原子。烯烃的示例包括但不限于降冰片烯和反式环辛烯(TCO)。根据其他优选的实施方案，第一点击反应配偶体和第二点击反应配偶体中的一个包含烯烃基团，优选地降冰片烯或TCO。根据优选的实施方案，另一个点击反应配偶体包含二烯，优选地四嗪或四唑基团。
用于进行点击化学反应的条件是本领域中已知的，并且根据本公开，本领域技术人员已知的用于进行点击化学反应的任何条件可用于本发明中。
如本文所用，术语“DAR”也称为“药物与抗体比率”，是指连接至抗体-有效载荷缀合物中的抗体的有效载荷数量。DAR可以变化，并且将由抗体上可用位点的数量进行限制，其中有效载荷可以缀合至该抗体。在一些实施方案中，本文所述的抗体-有效载荷缀合物具有的DAR为1至4，诸如1、2、3或4。抗体-有效载荷缀合物的群体(或批次)的DAR可以使用分光光度测量凭经验来进行确定。该群体可以含有在药物载荷方面不同的多种抗体-有效载荷缀合物的混合物。因此，抗体-有效载荷缀合物的群体的DAR通常表示群体内抗体-有效载荷缀合物的平均DAR，该平均DAR可以为1、2、3、4或其间的任何值。
在一个实施方案中，本申请的抗体-有效载荷缀合物具有的DAR为1至4，优选地2至4，更优选地4。更优选地，抗体-有效载荷缀合物中的工程化抗体被糖基化，含有抗体聚糖。最优选地，本申请的抗体-有效载荷缀合物包含缀合至有效载荷的本发明的糖基化工程化抗体，并且抗体-有效载荷缀合物具有的DAR为2至4，优选地约4。
在另一个总体方面，本发明涉及一种生成抗体-有效载荷缀合物的方法，该方法包括：
a.提供本发明的工程化抗体；
b.提供含胺有效载荷；以及
c.在一定条件下使工程化抗体和含胺有效载荷与转谷氨酰胺酶接触，以生成抗体-有效载荷缀合物，该抗体-有效载荷缀合物包含在内源性重链Q295处或者在内源性重链Q295处以及在位于重链位置286、287、288、289、290、293或294处的工程化谷氨酰胺(Q)残基处缀合至有效载荷的工程化抗体。
在一个特定实施方案中，步骤c.的工程化抗体在内源性重链Q295处以及在位于重链位置293处的工程化谷氨酰胺(Q)残基处缀合至有效载荷。在另一个特定实施方案中，步骤c.的工程化抗体在内源性重链Q295处以及在位于重链位置294处的工程化谷氨酰胺(Q)残基处缀合至有效载荷。
如本文所用，术语“位点特异性”是指含胺有效载荷在特定位点处(例如，在内源性Q295处或在N286Q、A287Q、K288Q、T289Q、K290Q、E293Q或E294Q取代处)特异性缀合或交联至抗体。位点特异性可以通过各种技术测量，包括但不限于质谱法(例如，基质辅助激光解吸电离质谱法(MALDI-MS)、电喷雾电离质谱法(ESI-MS)、串联质谱法(MS-MS)和飞行时间质谱法(TOF-MS)、疏水相互作用色谱法、离子交换色谱法、定点诱变、荧光标记、尺寸排阻色谱法和X-射线晶体学。
如本文所用，术语“含胺有效载荷”是指含有一种或多种反应性胺(例如，伯胺)的有效载荷。例如，含胺有效载荷可以包含胺供体单元(例如，伯胺NH2)、连接基(例如，连接至胺供体单元并且含有用于连接至有效载荷(诸如小分子、多肽或生物相容性聚合物)的附加功能性的分子)和药剂部分(例如，有效载荷，诸如细胞毒性剂、细胞抑制剂、化学治疗剂、毒素、放射性核素、DNA、RNA、siRNA、微RNA、肽核酸、非天然氨基酸、肽、酶、荧光标签、生物素、连接基或第一点击反应配偶体)。含胺有效载荷还可以为多肽(例如，抗体)或者含有一个或多个反应性赖氨酸、N-末端或反应性胺的生物相容性聚合物。
本文所述的内源性Q295和N286Q、A287Q、K288Q、T289Q、K290Q、E293Q和E294Q取代两者均为转谷氨酰胺酶的底物，并且谷氨酰胺与含胺有效载荷之间的键联具有式CO-NH-，其中NH-连接至连接基和有效载荷部分。
转谷氨酰胺酶为蛋白质-谷氨酰胺γ-谷氨酰基转移酶(EC 2.3.2.13)，该蛋白质-谷氨酰胺γ-谷氨酰基转移酶通常催化赖氨酸残基与谷氨酰胺残基的pH依赖性转酰胺基作用。如本文所用，术语“转谷氨酰胺酶”是指催化在有效载荷上的游离胺基团与抗体中的谷氨酰胺残基的侧链上的酰基基团之间形成异肽键的酶。转谷氨酰胺酶的示例包括但不限于微生物转谷氨酰胺酶(mTG)、人转谷氨酰胺酶、组织转谷氨酰胺酶(tTG)和因子XIII。人转谷氨酰胺酶的示例包括但不限于角质细胞转谷氨酰胺酶(Uniprot P22735)、组织转谷氨酰胺酶(UniProt P21980)、表皮转谷氨酰胺酶和前列腺转谷氨酰胺酶。这些酶可以来自天然来源或重组来源。肽或多肽中的谷氨酰胺氨基酸和赖氨酸氨基酸可以为用于转谷氨酰胺酶交联的底物。例如，有效载荷可以连接至包含赖氨酸的连接基。
本文所述的本发明中使用的转谷氨酰胺酶可以由多种来源获得或制备。在一些实施方案中，转谷氨酰胺酶为钙依赖性转谷氨酰胺酶，该钙依赖性转谷氨酰胺酶需要钙以诱导酶构象变化并且允许酶活性。例如，转谷氨酰胺酶可以衍生自豚鼠肝脏并且通过商业来源获得(例如，Sigma-Aldrich(St Louis,MO)和MP Biomedicals(Irvine,CA))。
在一些实施方案中，转谷氨酰胺酶衍生自真菌蛋白(例如卵菌、放线菌、酵母、假丝酵母、隐球菌、红曲霉或根霉转谷氨酰胺酶)。在一些实施方案中，转谷氨酰胺酶多肽衍生自粘菌(例如，多头绒泡菌(Physarum polycephalum)转谷氨酰胺酶)。在一些实施方案中，mTGase多肽衍生自细菌蛋白，诸如来自链轮丝菌属(Streptoverticillium sp.)或链霉菌属(Streptomyces sp.)(例如，茂原链霉菌(Streptomyces mobarensis)或茂原链轮丝菌(Streptoverticillium mobarensis))的转谷氨酰胺酶。在一些实施方案中，转谷氨酰胺酶多肽衍生自细菌蛋白，诸如来自(但不限于)以下项的转谷氨酰胺酶：茂原链轮丝菌(Streptoverticillium mobarensis)、灰轮丝链轮丝菌(Streptoverticilliumgriseocameum)、拉达卡链轮丝菌(Streptoverticillium ladakanum)、茂原链霉菌(Streptomyces mobarensis)、绿色链霉菌(Streptomyces viridis)、拉达卡链霉菌(Streptomyces ladakanum)、生暗灰链霉菌(Streptomyces caniferus)、普拉特链霉菌(Streptomyces platensis)、吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopius)、纺锤链霉菌(Streptomyces netropsis)、弗氏链霉菌(Streptomyces fradiae)、玫瑰轮丝链霉菌(Streptomyces roseovertivillatus)、肉桂地链霉菌(Streptomyces cinnamaoneous)、灰轮丝链霉菌(Streptomyces griseocameum)、淡紫灰链霉菌(Streptomyces lavendulae)、变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)、利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)、盐屋链霉菌(Streptomyces sioyansis)、马杜拉放线菌(Actinomadura sp.)、芽孢杆菌属(例如，环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)等)、产氨短杆菌(Corynebacterium ammonia genes)、谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)、梭菌属、肠杆菌属、微球菌属、普罗威登斯菌属，或其分离物。在一些实施方案中，转谷氨酰胺酶为不依赖钙的转谷氨酰胺酶，该不依赖钙的转谷氨酰胺酶不需要钙以诱导酶构象变化并且允许酶活性。在一些实施方案中，转谷氨酰胺酶多肽衍生自茂原链霉菌(S.mobarensis)。
可商购获得的不依赖钙的转谷氨酰胺酶，诸如ACTIVA(Ajinomoto,Japan)也适用于本发明。
在一些实施方案中，本文所述的本发明中使用的转谷氨酰胺酶还可以为使用本领域技术人员已知的重组技术产生的重组蛋白。在一些实施方案中，本文所述的本发明中使用的转谷氨酰胺酶可以为经纯化的蛋白质。
用于进行转谷氨酰胺酶缀合反应的条件是本领域中已知的，并且根据本公开，本领域技术人员已知的用于进行转谷氨酰胺酶缀合反应的任何条件可用于本发明中。
在一个优选的实施方案中，本发明的工程化抗体在与含胺有效载荷和转谷氨酰胺酶接触之前不进行去糖基化，以产生抗体-有效载荷缀合物。
在另一个总体方面，本发明涉及编码本发明的工程化抗体或其片段的核酸。如本文所用，术语“核酸”是指多核苷酸，诸如脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)。该术语用于包括单链核酸、双链核酸以及由核苷酸或核苷类似物制备的RNA和DNA。
在另一个总体方面，本发明涉及包含本发明的核酸的载体。如本文所用，术语“载体”是指可以用于将第二核酸分子运输至细胞中的核酸分子。在一个实施方案中，载体允许插入载体中的DNA序列的复制。载体可以包含启动子以增强至少一些宿主细胞中的核酸分子的表达。载体可以自主复制(染色体外)或可以整合至宿主细胞染色体中。在一个实施方案中，载体可以包含能够产生蛋白质的表达载体，该蛋白质衍生自插入载体中的核酸序列的至少一部分。
在另一个总体方面，本发明涉及包含本发明的核酸或载体的宿主细胞。如本文所用，术语“宿主细胞”是指在根据本发明的培养物中生长以产生感兴趣的蛋白质或多肽的细胞。在某些实施方案中，宿主细胞为哺乳动物细胞。
在另一个总体方面，本发明涉及产生本发明的工程化抗体的方法，该方法包括在用于表达抗体或其片段的合适条件下温育本发明的宿主细胞，以及分离抗体或其片段。
药物组合物和治疗方法
在另一个总体方面，本发明涉及一种药物组合物，该药物组合物包含本发明的工程化抗体、或本发明的抗体-有效载荷缀合物和药学上可接受的载体。
如本文所用，术语“载剂”是指任何赋形剂、稀释剂、填充剂、盐、缓冲剂、稳定剂、增溶剂、油、类脂、含脂质囊泡、微球体、脂质体包囊、或本领域公知的用于在药物制剂中使用的其他材料。应当理解，载剂、赋形剂或稀释剂的特征将取决于具体应用的施用途径。如本文所用，术语“药学上可接受的载剂”是指不干扰根据本发明的组合物的效果或根据本发明的组合物的生物活性的非毒性材料。根据本公开，根据特定实施方案，适用于基于抗体的药物组合物的任何药学上可接受的载体均可用于本发明。
根据特定实施方案，本文所述的组合物被配制成适于施用于受试者的预期途径。例如，本文所述的组合物可被配制成适于静脉内、皮下、肌内或瘤内施用。
在另一个总体方面，本发明涉及一种在对该组合物有需要的受试者中治疗疾病或障碍的方法，该方法包括向受治疗者施用本发明的药物组合物。根据特定实施方案，疾病或障碍为肿瘤，诸如实体瘤或血液传播肿瘤，特别地肿瘤为癌症。
根据特定实施方案，本发明的方法包括施用治疗有效剂量的本发明的药物组合物，其中组合物包含用于靶向与疾病或障碍相关的细胞的抗体-药物缀合物，使得在靶向时，药物被递送到靶向细胞并对该靶向细胞产生效应，从而治疗疾病或障碍。
如本文所用，术语“治疗有效量”是指在受试者中引起期望的生物学或药物学响应的活性成分或组分的量。基于若干因素的考虑，包括要治疗或预防的疾病、所涉及的症状、患者的体重、患者的免疫状态以及技术人员已知的其他因素，本领域技术人员可以确定具体有效剂量的选择(例如，经由临床试验和/或临床前测定)。在制剂中待采用的精确剂量也将取决于施用途径以及疾病的严重程度，并且应该根据医生的判断和每个患者的情况来决定。在一些情况下，有效剂量可以通过衍生自体外或动物模型测试体系的剂量反应曲线来推导。
如本文所用，术语“处理”和“治疗”(“treat”、“treating”和“treatment”)均旨在是指与其中抗体-药物缀合物的施用将会有益的疾病、障碍或病症有关的至少一种可测量物理参数的改善或逆转，该至少一种可测量物理参数不一定是在受试者中可识别的，但可能是在受试者中可识别的。术语“处理”和“治疗”也可指导致消退，预防发展，或至少延缓疾病、障碍或病症的发展。在特定实施方案中，“处理”和“治疗”是指减轻与其中抗体-药物缀合物的施用将会有益的疾病、障碍或病症相关的一种或多种症状，预防该一种或多种症状的发展或发作，或者缩短该一种或多种症状的持续时间。在特定实施方案中，“处理”和“治疗”是指预防疾病、障碍或病症的复发。在特定实施方案中，“处理”和“治疗”是指患有疾病、障碍或病症的受试者的存活提高。在特定实施方案中，“处理”和“治疗”是指受试者中疾病、障碍或病症的消除。
如本文所用，术语“受试者”是指动物，并且优选地指哺乳动物。根据特定实施方案，受治疗者是哺乳动物，包括非灵长类(例如骆驼、驴、斑马、牛、猪、马、山羊、绵羊、猫、犬、大鼠、兔子、豚鼠、绒猴或小鼠)或灵长类(例如猴、黑猩猩或人)。在特定实施方案中，受治疗者是人。
根据特定实施方案，用于治疗疾病或障碍的组合物可以与有效治疗相关疾病或障碍的其他药剂结合使用。
如本文所用，在将两种或更多种疗法施用于受试者的上下文中，术语“联合”是指使用多于一种疗法。术语“联合”的使用并不限制疗法施用于受试者的次序。
组合和试剂盒
本文提供了一种组合或试剂盒，该组合或试剂盒包含：
a.本发明的工程化抗体；以及
b.转谷氨酰胺酶；
其中该组合或试剂盒将用于用含胺有效载荷来标记抗体。
根据特定实施方案，本发明的组合为用于将抗体与有效载荷缀合的反应混合物。该组合可以任选地随附呈管理药物或生物产品的制造、使用或销售的政府部门规定的形式的通知或说明书，该通知或说明书反映了管理部门批准用于人类施用的制造、使用或销售。本文所涵盖的组合可以用于将抗体与有效载荷缀合或者在对该组合有需要的受试者中治疗疾病或障碍的上述方法中。
实施方案
实施方案1为一种工程化抗体，该工程化抗体包含在抗体的重链位置302处的氨基酸取代，其中氨基酸编号是根据Kabat的EU索引。
实施方案2为根据实施方案1所述的工程化抗体，其中氨基酸取代选自由以下项组成的组：V302S、V302A、V302I、V302L、V302M、V302T、V302F和V302Y。
实施方案2a为根据实施方案2所述的工程化抗体，其中氨基酸取代为V302S。
实施方案2b为根据实施方案2所述的工程化抗体，其中氨基酸取代为V302A。
实施方案3为根据实施方案1、2或2a所述的工程化抗体，该工程化抗体还包含在重链位置286、287、288、289、290、293或294处的谷氨酰胺取代。
实施方案3a为根据实施方案3所述的工程化抗体，其中谷氨酰胺取代在重链位置293处。
实施方案3b为根据实施方案3所述的工程化抗体，其中谷氨酰胺取代在重链位置294处。
实施方案4为根据实施方案3所述的工程化抗体，其中谷氨酰胺取代为N286Q、A287Q、K288Q、T289Q、K290Q、E293Q或E294Q。
实施方案5为根据实施方案4所述的工程化抗体，其中谷氨酰胺取代为E294Q。
实施方案5a为根据实施方案4所述的工程化抗体，其中谷氨酰胺取代为E293Q。
实施方案6为根据实施方案1至5a中任一项所述的工程化抗体，该工程化抗体还包含在重链位置241、243、294或301处的丙氨酸取代。
实施方案7为根据实施方案6所述的工程化抗体，其中丙氨酸取代为F241A、F243A、E294A或R301A。
实施方案8为根据实施方案1至7中任一项所述的工程化抗体，该工程化抗体还包含在重链位置300处的氨基酸取代。
实施方案9为根据实施方案8所述的工程化抗体，其中在重链位置300处的氨基酸取代为Y300L。
实施方案10为一种工程化抗体，该工程化抗体包含在抗体的重链位置294处的氨基酸取代，其中氨基酸编号是根据Kabat的EU索引。
实施方案11为根据实施方案10所述的工程化抗体，其中在重链位置294处的氨基酸取代为谷氨酰胺取代。
实施方案11a为根据实施方案11所述的工程化抗体，其中谷氨酰胺取代为E294Q。
实施方案12为根据实施方案10所述的工程化抗体，其中在重链位置294处的氨基酸取代为丙氨酸取代。
实施方案12a为根据实施方案12所述的工程化抗体，其中丙氨酸取代为E294A。
实施方案13为根据实施方案10所述的工程化抗体，其中在重链位置294处的氨基酸取代为甲硫氨酸取代。
实施方案13a为根据实施方案13所述的工程化抗体，其中甲硫氨酸取代为E294M。
实施方案14为根据实施方案10所述的工程化抗体，其中在重链位置294处的氨基酸取代为苯丙氨酸取代。
实施方案14a为根据实施方案14所述的工程化抗体，其中苯丙氨酸取代为E294F。
实施方案15为根据实施方案10所述的工程化抗体，其中在重链位置294处的氨基酸取代为赖氨酸取代。
实施方案15a为根据实施方案15所述的工程化抗体，其中赖氨酸取代为E294K。
实施方案16为根据实施方案10所述的工程化抗体，其中在重链位置294处的氨基酸取代为亮氨酸取代。
实施方案16a为根据实施方案16所述的工程化抗体，其中亮氨酸取代为E294L。
实施方案17为根据实施方案10所述的工程化抗体，其中在重链位置294处的氨基酸取代为精氨酸取代。
实施方案17a为根据实施方案17所述的工程化抗体，其中精氨酸取代为E294R。
实施方案18为根据实施方案10所述的工程化抗体，其中在重链位置294处的氨基酸取代为缬氨酸取代。
实施方案18a为根据实施方案18所述的工程化抗体，其中缬氨酸取代为E294V。
实施方案19为根据实施方案10所述的工程化抗体，其中在重链位置294处的氨基酸取代为酪氨酸取代。
实施方案19a为根据实施方案19所述的工程化抗体，其中酪氨酸取代为E294Y。
实施方案20为根据实施方案11或11a所述的工程化抗体，该工程化抗体还包含在重链位置295处的氨基酸取代。
实施方案20a为根据实施方案20所述的工程化抗体，其中在重链位置295处的氨基酸取代为Q295A。
实施方案20b为根据实施方案20所述的工程化抗体，其中在重链位置295处的氨基酸取代为Q295E。
实施方案20c为根据实施方案20所述的工程化抗体，其中在重链位置295处的氨基酸取代为Q295N。
实施方案21为根据实施方案12或12a所述的工程化抗体，该工程化抗体还包含在重链位置288处的氨基酸取代。
实施方案21a为根据实施方案21所述的工程化抗体，其中在重链位置288处的氨基酸取代为K288Q。
实施方案22为根据实施方案10至12a中任一项所述的工程化抗体，该工程化抗体还包含在重链位置302处的氨基酸取代。
实施方案23为根据实施方案22所述的工程化抗体，其中在重链位置302处的氨基酸取代为V302S、V302A、V302I、V302L、V302M、V302T、V302F或V302Y。
实施方案23a为根据实施方案23所述的工程化抗体，其中在重链位置302处的氨基酸取代为V302S。
实施方案23b为根据实施方案23所述的工程化抗体，其中在重链位置302处的氨基酸取代为V302A。
实施方案24为根据实施方案10至12a和22至23b中任一项所述的工程化抗体，该工程化抗体还包含在重链位置300处的氨基酸取代。
实施方案25为根据实施方案24所述的工程化抗体，其中在重链位置300处的氨基酸取代为Y300L。
实施方案26为一种工程化抗体，该工程化抗体包含在重链位置302处的氨基酸取代和在重链位置293处的氨基酸取代，其中氨基酸编号是根据Kabat的EU索引。
实施方案27为一种工程化抗体，该工程化抗体包含在重链位置302处的氨基酸取代和在重链位置294处的氨基酸取代，其中氨基酸编号是根据Kabat的EU索引。
实施方案28为一种工程化抗体，该工程化抗体包含氨基酸取代V302S，以及氨基酸取代E293Q和E294Q中的至少一者，其中氨基酸编号是根据Kabat的EU索引。
实施方案29为一种工程化抗体，该工程化抗体包含氨基酸取代V302S和氨基酸取代E293Q，其中氨基酸编号是根据Kabat的EU索引。
实施方案30为一种工程化抗体，该工程化抗体包含氨基酸取代V302A和氨基酸取代E293Q，其中氨基酸编号是根据Kabat的EU索引。
实施方案31为一种工程化抗体，该工程化抗体包含氨基酸取代V302S和氨基酸取代E294Q，其中氨基酸编号是根据Kabat的EU索引。
实施方案32为一种工程化抗体，该工程化抗体包含氨基酸取代V302A和氨基酸取代E294Q，其中氨基酸编号是根据Kabat的EU索引。
实施方案33为根据实施方案26至32中任一项所述的工程化抗体，该工程化抗体还包含在重链位置300处的氨基酸取代。
实施方案33a为根据实施方案33所述的工程化抗体，其中在重链位置300处的氨基酸取代为Y300L。
实施方案34为根据实施方案1至33中任一项所述的工程化抗体，其中抗体为人IgG抗体。
实施方案34a为根据实施方案34所述的工程化抗体，其中人IgG抗体为人IgG1抗体。
实施方案34b为根据实施方案34所述的工程化抗体，其中人IgG抗体为人IgG2抗体。
实施方案34c为根据实施方案34所述的工程化抗体，其中人IgG抗体为人IgG4抗体。
实施方案35为根据实施方案1至34c中任一项所述的工程化抗体，其中抗体被糖基化。
实施方案35a为根据实施方案1至34c中任一项所述的工程化抗体，其中不去除工程化抗体的抗体聚糖。
实施方案36为一种抗体-有效载荷缀合物，该抗体-有效载荷缀合物包含根据实施方案1至35a中任一项所述的工程化抗体。
实施方案37为根据实施方案36所述的抗体-有效载荷缀合物，其中有效载荷包含选自由以下项组成的组中的一者或多者：细胞毒性剂、细胞抑制剂、化学治疗剂、毒素、放射性核素、DNA、RNA、siRNA、微RNA、肽核酸、非天然氨基酸、肽、酶、荧光标签、生物素和第一点击反应配偶体。
实施方案38为根据实施方案36或37所述的抗体-有效载荷缀合物，其中有效载荷在抗体的内源性重链Q295残基处缀合至工程化抗体。
实施方案39为根据实施方案36、37或38所述的抗体-有效载荷缀合物，其中有效载荷在位于工程化抗体的重链位置286、287、288、289、290、293或294处的谷氨酰胺残基处缀合至工程化抗体。
实施方案40为根据实施方案36至39中任一项所述的抗体-有效载荷缀合物，其中有效载荷在Q295处以及在位于重链位置293和294处的谷氨酰胺残基中的至少一个谷氨酰胺残基处缀合至工程化抗体。
实施方案40a为根据实施方案40所述的抗体-有效载荷缀合物，其中有效载荷在Q295处以及在位于重链位置293处的谷氨酰胺残基处缀合至工程化抗体。
实施方案40b为根据实施方案40所述的抗体-有效载荷缀合物，其中有效载荷在Q295处以及在位于重链位置294处的谷氨酰胺残基处缀合至工程化抗体。
实施方案41为根据实施方案36至40b中任一项所述的抗体-有效载荷缀合物，该抗体-有效载荷缀合物具有1至4的药物抗体比率(DAR)。
实施方案41a为根据实施方案41所述的抗体-有效载荷缀合物，该抗体-有效载荷缀合物具有2至4的DAR。
实施方案42为根据实施方案36至41中任一项所述的抗体-有效载荷缀合物，该抗体-有效载荷缀合物具有的DAR为2。
实施方案43为根据实施方案36至41中任一项所述的抗体-有效载荷缀合物，该抗体-有效载荷缀合物具有的DAR为4。
实施方案44为一种生成抗体-有效载荷缀合物的方法，该方法包括：在一定条件下使根据实施方案1至35a中任一项所述的工程化抗体和含胺有效载荷与转谷氨酰胺酶接触，以生成抗体-有效载荷缀合物，该抗体-有效载荷缀合物包含缀合至有效载荷的工程化抗体。
实施方案45为根据实施方案44所述的方法，其中该方法不包括去除工程化抗体的抗体聚糖。
实施方案46为根据实施方案44或45所述的方法，其中含胺有效载荷包含细胞毒性剂、细胞抑制剂、化学治疗剂、毒素、放射性核素、DNA、RNA、siRNA、微RNA、肽核酸、非天然氨基酸、肽、酶、荧光标签、生物素和第一点击反应配偶体中的一者或多者。
实施方案47为根据实施方案44至46中任一项所述的方法，其中含胺有效载荷包含第一点击反应配偶体。
实施方案48为根据实施方案47所述的方法，其中该方法还包括使抗体-有效载荷缀合物与第二点击反应配偶体反应，该第二点击反应配偶体包含细胞毒性剂、细胞抑制剂、化学治疗剂、毒素、放射性核素、DNA、RNA、siRNA、微RNA、肽核酸、非天然氨基酸、肽、酶、荧光标签和生物素中的一者或多者，以获得第二抗体-有效载荷缀合物。
实施方案49为根据实施方案47或48所述的方法，其中第一点击反应配偶体为3-叠氮基-1-丙胺，并且第二点击反应配偶体为二苯并环辛炔-四乙二醇-缬氨酸-瓜氨酸-对氨基苄基氨基甲酸酯-一甲基澳瑞他汀F(DBCO-val-cit-MMAF)或二苯并环辛炔-四乙二醇-一甲基澳瑞他汀F(DBCO-MMAF)。
实施方案50为根据实施方案4至49中任一项所述的方法，其中工程化抗体在其缀合至有效载荷之前尚未受到去糖基化。
实施方案51为一种药物组合物，该药物组合物包含根据实施方案1至35a中任一项所述的工程化抗体以及药学上可接受的载体。
实施方案52为一种药物组合物，该药物组合物包含根据实施方案36至43中任一项所述的抗体-有效载荷缀合物以及药学上可接受的载体。
实施方案53为一种在有需要的受试者中治疗疾病或障碍的方法，该方法包括向受试者施用根据实施方案51或52所述的药物组合物。
实施方案54为根据实施方案53所述的方法，其中疾病或障碍为肿瘤，诸如实体瘤或血液传播肿瘤，特别地肿瘤为癌症。
实施方案55为一种核酸，该核酸编码根据实施方案1至35a中任一项所述的工程化抗体。
实施方案56为一种宿主细胞，该宿主细胞包含根据实施方案55所述的核酸。
实施方案57为一种用于产生工程化抗体的方法，该方法包括在用于表达工程化抗体的合适条件下温育根据实施方案56所述的宿主细胞。
实施方案57a为根据实施方案57所述的方法，该方法还包括分离工程化抗体。
实施方案58为一种试剂盒，该试剂盒包含(a)根据实施方案1至35a中任一项所述的工程化抗体；和(B)转谷氨酰胺酶。
实施例
本发明的以下实施例旨在进一步说明本发明的性质。应当理解，以下实施例不限制本发明，并且本发明的范围由所附权利要求书确定。
实施例1：啮齿动物IgG在CH2结构域中具有附加的转谷氨酰胺酶催化的修饰位点
在使用去糖基化方法(Jeger等人，Id.)将3-叠氮基丙胺(3-APA)缀合至NLDC-145(靶向鼠DEC205的大鼠IgG2a mAb)的同时，观察到3-APA缀合在每个去糖基化mAb的四个位置处(每个单体两个位置)而并非在人IgGs中观察到的两个位置(在位置Gln295处)。在四个3-APA分子后未观察到进一步增加，这表明该mAb中每个单体存在两个离散的缀合位点。经缀合的去糖基化NLDC-145的肽谱识别出预期的连接位点Gln295以及被确定为Gln288的附加位点(图1a)。
在将带有完整聚糖的NLDC-145与3-APA和MTG反应后，仍然观察到缀合，该缀合产生在每个mAb零至四个3-APA分子的范围内的物种的混合物。缀合物的肽谱示出主要修饰位点为Gln295，以及Gln288的一些修饰。经还原的MS示出mAb聚糖结构在对MTG的反应性中起作用，因为人们发现带有Man5聚糖的mAb在Gln295和Gln288两处经过修饰，而带有G0F聚糖的mAb具有每个重链<1的修饰(图1b)。带有高甘露糖聚糖的mAb的CH2结构域的熔融温度比带有G0F聚糖的相同结构域低4.3℃(Wada等人，2019,MAbs 11(2):350-372)，这表明G0F糖以向CH2结构域提供附加稳定性的方式接触蛋白质。人们认为，通过将特异性点突变引入mAb而不是修饰聚糖来改变该蛋白质-糖相互作用，也可以允许在Gln295处进行有效MTG修饰，即使带有完整聚糖并且无论聚糖结构如何。
实施例2：使用转谷氨酰胺酶的糖基化单克隆抗体的位点特异性缀合
为了确定mAb工程策略是否可以允许人IgG的MTG催化的缀合，产生了人源化IgG1mAb曲妥珠单抗的一系列变体(参见例如，Nahta和Esteva,2007,Oncogene 26(25):3637-43)。变体基于CH2结构域的结构，聚焦在接近位置295和其定位所在的β-折叠的位置上和/或接触mAb聚糖的位置上。在许多情况下，变体基于对大鼠IgG2a的对应序列进行嫁接。使变体与转谷氨酰胺酶和3-APA进行反应并且通过质谱法来进行分析。
mAb在CHO细胞中表达并且使用标准方法通过蛋白A色谱法来进行纯化。通过LC-MS来分析经还原的mAb以确定存在的聚糖的分布，并且在所有情况下，G0F为主要物种。在一些mAb中观察到对应于其他聚糖的少量(<10％)质量，并且K288Q/Y300L/V302S变体具有对应于G1F聚糖的显著比例。
为了估计mAb变体对MTG催化的缀合的适用性，将完整mAb(1mg/mL)与3-叠氮基丙胺(3-APA；20倍至100倍摩尔过量)和MTG(Activa TI，5-20％w/v或Zedira，5单位/mg至20单位/mg的mAb)于22℃至37℃下在PBS缓冲液中反应30min至过夜。通过将MTG阻断剂(Zedira)添加至100μM来停止反应，并且在用PNGase F进行去糖基化和用二硫苏糖醇进行还原后，通过LC-MS来分析该反应。通过质谱法来确定标记度(DOL)。
在连接至Agilent G6224 MS-TOF质谱仪的Agilent 1260HPLC系统上执行LC-MS。LC在Agilent RP-mAb C4柱(2.1×50mm，3.5微米)上以1mL/min的流速运行，其中移动相为0.1％甲酸在水中的溶液(A)和0.1％甲酸在乙腈中的溶液(Sigma-Aldrich Cat#34688)(B)并且梯度为20％B(0-2min)、20-60％B(2-3min)、60-80％B(3-5.5min)。仪器在正电喷雾电离模式下进行操作，并且从m/z 600至6000扫描。使用最大熵算法来对质荷谱进行解卷积，并且使用对应于完整mAb(用于完整质量)或mAb重链(用于经还原的质量)的解卷积质量的相对强度来估计DOL，其中添加83Da的倍数(对应于3-APA)。
仪器设定包括：毛细管电压3500V；碎裂电压175V；锥孔体电压65V；气体温度325C；干燥气体流速5.0L/min；喷雾器压力30psig；采集模式范围100至7000，其中扫描速率0.42。
表2.在37℃下与MTG和3-APA温育4小时之后的糖基化mAb的标记度(DOL)。通过经 还原的MS分析来确定DOL。在这些反应条件下，在所有mAb(包括WT)的重链上观察到存在一 些缀合；在轻链上未观察到修饰。报告了完整mAb的DOL，该完整mAb的DOL为通过重链的MS观 察到的DOL的2倍。
Figure BDA0003949907720000391
人们发现增加MTG催化的3-APA与人IgG的缀合的反应速率的多个组合(表2)。特别地，将Y300L和V302S连同K288Q(SEQ ID NO:5)一起嫁接的变体被快速修饰，并且在接近完全去糖基化WT mAb的时间尺度上达到完全修饰(DAR＝2)(表2)。然后构造仅带有这些突变中的一个或两个突变的附加变体，并且确定Y300L/V302S与三重突变体相当(图2和表2)。人们发现V302S在缀合效率上具有比Y300L更大的效果。
曲妥珠单抗的附加变体在Val302位置处用如下突变来进行构造：V302A、V302I、V302L、V302M、V302T、V302F和V302Y。评估了这些变体与MTG的反应性，以确定哪些变体相对于V302S变体具有类似或经改善的特性。
表3.Val 302突变体的反应性。在37℃下与MTG和3-APA温育之后，通过以30min至 高达150min的间隔进行的经还原的MS分析来确定糖基化mAb的标记度(DOL)。报告了完整 mAb的DOL，该完整mAb的DOL为通过重链的MS观察到的DOL的2倍。
Figure BDA0003949907720000401
V302A变体具有能与V302S相比的反应速率。与WT mAb相比，V302T变体也显著增强，尽管该变体似乎慢于V302A和V302S。
实施例3：曲妥珠单抗变体的熔融和聚集温度
曲妥珠单抗突变体V302A、V302S和双突变体Y300L/V302S(“LS”)被更充分地表征为证明缀合方法的广泛适用性并且估计突变对mAb的影响。熔融温度(Tm)和聚集温度(Tagg)通过使用来自Nanotemper的nanoDSF仪器的差示扫描荧光法来进行确定。Tm通过在20℃至95℃的热扫描下监测330nm和350nm处的荧光强度变化来进行确定，并且Tagg通过监测散射来进行确定。与WT曲妥珠单抗(78℃至79℃)相比，对于所有突变体Tagg基本上不变。对于LS变体，对应于CH2结构域的熔融的第一Tm为62.3℃，该第一Tm相对于完整WT曲妥珠单抗减少了约8℃并且类似于完全去糖基化的mAb的第一Tm。V302S单突变体具有的第一Tm为64.4℃，该第一Tm相对于WT mAb减少6℃，并且与完全去糖基化的mAb的CH2结构域相比，该V302S单突变体的热稳定性增加约2℃。V302A变体具有的第一Tm为67.3℃，该第一Tm相对于V302S增加约3℃。
执行附加的表征，以将曲妥珠单抗变体与WT mAb以及3APA缀合的变体与3APA缀合的WT mAb进行比较。这些测定包括：通过DSF和/或DSC来确定Tm/Tagg；长期稳定性测定；非特异性结合测定；自相互作用和交叉相互作用；以及与FcRn和Fc受体的结合。
对于DSF，展开温度(Tm)和聚集温度(Tagg)通过使用来自Nanotemper的Prometheus nanoDSF仪器的差示扫描荧光法在PBS中进行确定。Tm通过在20℃至95℃的热扫描下监测330nm和350nm处的荧光强度变化来进行确定，并且Tagg通过监测散射来进行确定。
为了长期稳定性，将mAb和缀合物于4℃或40℃下在PBS或其他相关缓冲液中温育高达4周。在指定的时间点，去除样本的等分试样，并且通过分析性SEC和LC-MS来估计稳定性。
在使用Biacore 8K仪器的基于SPR的测定中确定非特异性结合。通过将不同的蛋白质(大豆胰蛋白酶抑制剂、防御素-3、人IgG、溶菌酶、整联蛋白α-4β-7、IL-13)通过胺偶联固定至CM5芯片(GE)上，生成带有不同特征的面板。样本在不同表面上方运行，并且通过确定每者的共振单位(RU)来估计非特异性结合。通过亲和捕获自相互作用纳米颗粒光谱法(AC-SINS)来测量自相互作用，基本上如下所述(Liu等人，mAbs2014:483)。通过交叉相互作用色谱(CIC)来测量交叉相互作用，基本上如下所述(Bethea等人Prot Eng Des Sel 2012:531)。使用配备有FcRn柱的Agilent HPLC来估计FcRn结合(Mackness等人，mAbs 2019:1276)。注射样本并且运行pH梯度(5.5至9.5)。比较不同样本的保留时间以估计FcRn结合。通过SPR或通过ELISA来比较Fc受体结合。
实施例4：用曲妥珠单抗V302S构造的ADC的基于细胞的活性测定
用3-APA修饰V302S变体以产生叠氮化物修饰的mAb。通过蛋白A亲和色谱法来纯化叠氮基-mAb，然后与DBCO-val-cit-MMAF或DBCO-MMAF反应，以产生DAR＝2的抗体药物缀合物。还使用去糖基化/Gln295缀合方法，用WT曲妥珠单抗和这些有效载荷来构造ADC。在细胞测定中将ADC连同相关对照一起进行评估，并且发现活性类似，无论缀合方法如何(图3)。在37℃下，用不同浓度的ADC处理SKBR3细胞(具有高Her2表达的细胞系)72小时。Cell TiterGlo用于在处理结束时确定细胞活力。因此，在抗体的重链中使用特异性取代(以便增强缀合效率)并不影响所得抗体-有效载荷缀合物的细胞毒性活性。
实施例5：在位置288处或在β-折叠上的其他位置处的Gln与V302S突变结合的嫁 接，提供可以缀合至DAR＝2(带有聚糖)或DAR＝4(无聚糖)的mAb
用基于大鼠IgG2a序列嫁接的Y300L/V302S/K288Q或V302S/K288Q突变来构造曲妥珠单抗变体，并且如上所述进行表达和纯化。在与3-APA反应时，这些变体由MTG快速修饰，以在标准条件下达到DAR为二(图4a)。缀合位点的图谱确定在Gln295处添加大部分3-APA，其中小部分在Gln288处。当mAb在反应之前被去糖基化时，缀合物在标准条件下达到DAR为四(图4b)，类似于NLDC-145大鼠IgG2a mAb。
构造附加的变体，其中保持Y300L和V302S突变，而附加的Gln的位置在位置285与294之间移位。这些变体中的许多变体带有与Y300L/V302S/K288Q变体和大鼠IgG2a类似的图谱，缀合至3-APA以在带有聚糖的情况下达到DAR＝2并且在无聚糖的情况下达到DAR＝4。例外包括R292Q变体(其具有降低的反应性)以及E293Q和E294Q变体，如以下实施例6中更详细地描述的。
表4示出在37℃下与TGase和3-APA温育之后，每个mAb的标记度(DOL)。通过mAb重链的MS分析来确定DOL；在轻链上未观察到修饰。报告了完整mAb的DOL，该完整mAb的DOL为通过重链的MS观察到的DOL的2倍。
表4.在37℃下与MTG和3-APA温育4.5小时
Figure BDA0003949907720000422
或1.5小时(*)之后，mAb的标记度 (DOL)。报告了完整mAb的DOL，该完整mAb的DOL为通过重链的MS观察到的DOL的2倍。
Figure BDA0003949907720000421
Figure BDA0003949907720000431
实施例6：E293Q和E294Q突变允许在未去除聚糖的情况下缀合至DAR＝4
本申请的发明人惊讶地发现，将在重链位置302处的突变(诸如V302S)与在靠近295的位置处的附加的Gln残基进行结合，产生了可以在未从mAb去除聚糖的情况下进行缀合以达到DAR＝4的mAb。优选地，mAb可以进一步含有突变和重链300，诸如Y300L，以进一步改善缀合。对曲妥珠单抗变体E293Q/Y300L/V302S和E294Q/Y300L/V302S进行构造，并且在与MTG和3-APA的反应中进行测试。在这两种情况下，观察到每个mAb快速添加4个3-APA分子；仅用1.25U/mg的Zedira MTG，反应在4小时至5小时内完成(图4a)。
Y300L/V302S/E294Q变体被进一步表征。用Y300L/V302S/E294Q突变的子集来构造附加的变体，以确定每种突变在产生DAR＝4缀合物中的作用。产生曲妥珠单抗的双突变体V302S/E294Q和单突变体E294Q，并且用MTG和3-APA来测试反应性(图4b)。在标准反应条件下(1mg/mL mAb，690uM 3-APA，10U/mg Zedira MTG，PBS缓冲液，37C)，E294Q/Y300L/V302S变体非常快速地达到DAR＝4，并且在60分钟内基本上完成。E294Q/V302S变体较慢并且需要约150min以达到DAR＝4。单独带有E294Q突变的变体也示出相当快速的缀合，在60分钟内超过DAR＝2，并且在3小时内达到DAR＝3。在37℃下温育过夜之后，E294Q变体也达到完全DAR＝4。
E294Q、E294Q/V302S和E294Q/Y300L/V302S变体也缀合至药物有效载荷vcMMAF到DAR＝4，并且与通过标准去糖基化方法制备的ADC进行比较(图4c)。在所有情况下，变体在细胞测定中示出与通过标准方法缀合的WT曲妥珠单抗相当或更有效的活性。
因此，单独或与其他取代组合(例如，在位置302和300处)的在位置E293或E294处的谷氨酰胺取代提供了带有完整聚糖的工程化抗体，该工程化抗体可以缀合至有效载荷，以便比WT mAb更有效地增加药物与抗体的比率(例如，至DAR＝4)，同时与WT mAb相比保持或改善稳定性和细胞毒性活性。
实施例7：E294Q的与Gln295的突变的组合使得能够与完整聚糖mAb非常快速地缀 合
在注意到如上文实施例6中所述的含E294Q的mAb的缀合达到DAR 4的快速速率之后，提出了带有E294Q以及改变位置295处的氨基酸的突变的mAb可以使得能够用聚糖完整的mAb来非常快速缀合至DAR＝2。3对曲妥珠单抗的此类变体进行构造：E294Q/Q295A、E294Q/Q295E和E294Q/Q295N。这些变体在上述标准条件下与MTG和3-APA反应并且与WT mAb和去糖基化WT mAb进行比较。表5示出在37℃下与TGase和3-APA温育1小时之后，每个mAb的(DOL)。通过mAb重链的MS分析来确定DOL；在轻链上未观察到修饰。报告了完整mAb的DOL，该完整mAb的DOL为通过重链的MS观察到的DOL的2倍。
表5.在37℃下与MTG和3-APA温育1小时之后，mAb的标记度(DOL)。报告了完整mAb 的DOL，该完整mAb的DOL为通过重链的MS观察到的DOL的2倍。
SEQID 突变 DOL
2 0.5
2(去糖基化) 1.4
60 E294Q/Q295A 1.8
61 E294Q/Q295E 1.9
62 E294Q/Q295N 1.8
通过MTG来非常快速地修饰双突变体，1小时内基本上达到完成。带有完整聚糖的突变体似乎甚至比在1小时时间点处达到约1.4的DOL的WT去糖基化曲妥珠单抗反应更快。为了进一步比较双突变体与WT去糖基化的mAb的反应速率，在含有较低酶和底物浓度的反应中随时间推移监测缀合。将1mg/mL的抗体(WT曲妥珠单抗、WT去糖基化、QA、QE、QN变体)与5U/mg Zedira MTG和345μM 3-APA结合并且在37℃下温育。每15分钟去除样本，并且通过添加MTG阻断剂至100μM来进行淬灭。样本用Rapid PNGase来进行去糖基化(每25μL样本1μL，50℃，20min)用25mM的DTT还原，并且通过LC-MS来进行分析。在这些条件下，在反应2小时之后，WT去糖基化mAb达到约75％。相比之下，变体基本上在30分钟或45分钟的时间点上完成了。(图5)。
熔融温度(Tm)和聚集温度(Tagg)通过使用来自Nanotemper的nanoDSF仪器的差示扫描荧光法来进行确定。与WT曲妥珠单抗(78℃至79℃)相比，对于所有突变体Tagg基本上不变。对于QA变体，对应于CH2结构域的熔融的第一Tm为68.1℃，该第一Tm与完整WT曲妥珠单抗相差约2℃。QE变体为66.1℃，而QN变体为67.3℃。
实施例8：在与聚糖相互作用的位置处的突变增加Gln295处的缀合速率
曲妥珠单抗点突变在氨基酸侧链接触聚糖的位置处进行构造，此事基于如下假设：去除蛋白质-糖接触可以增加蛋白质主链的局部柔韧性以允许在Gln295处进行缀合而无需修饰聚糖。Phe241和Phe243与聚糖核进行疏水性接触，而Arg301似乎在Fc结构域的不同晶体结构中对Man或GlcNac糖上的OH基团进行极性接触。构造曲妥珠单抗变体，其中这些残基中的一个残基突变为丙氨酸(F241A、F243A、R301A)。变体示出更异质的聚糖图谱，其中若干较高MW聚糖被识别，如先前针对F241A和F243A所述(Ahmed等人，2014,J Mol Biol 426(18):3166-3179)。
三种变体与3-APA MTG的反应证明这些变体在标准反应条件下均有效地进行修饰(表2)。
实施例9：Glu294Ala变体提供增加的反应速率，而不影响熔融温度
Glu294与Gln295相邻，并且在人IgG结构中，该Glu294与His268的侧链形成氢键。为了增加Gln295与MTG的接入，Glu294突变为Ala以破坏H键并且增加结构元件的柔韧性。还评估了另一种变体，该变体除E294A之外具有K288Q突变。在上述标准反应条件下(1mg/mLmAb，690uM 3-APA，10U/mg Zedira MTG，PBS，37℃)，Glu294变体与3-APA和MTG示出约1.5倍的增加的反应性，并且K288Q/E294A相对于WT mAb略微更快，约2倍(图6a)。在过夜温育之后，E294A和K288Q/E294A变体两者均达到或接近完全DAR＝2，而WT mAb的DAR仅达到约1.3。通过差示扫描荧光法来评估K288Q/E294A变体中CH2结构域的Tm，并且发现该Tm与WT mAb相比基本上不变(图6b)。因此，这些变体示出类似于WT mAb的生物物理特性，该变体具有增加的对MTG的反应性，这使该变体让人特别感兴趣。
抗体-药物缀合物用曲妥珠单抗E294A和K288Q/E294A变体与药物有效载荷vcMMAF一起来进行构造，并且与用WT曲妥珠单抗制备的ADC进行比较。mAb与3-APA和MTG反应以产生叠氮化物修饰的mAb，在使用WT mAb的情况下事先用PNGase F进行去糖基化，并且无需对E294A变体进行去糖基化。通过蛋白A亲和色谱法来纯化叠氮基mAb，然后与DBCO-val-cit-MMAF反应，以产生DAR＝2的抗体药物缀合物。在细胞测定中将ADC连同相关对照一起进行评估，并且发现活性类似，无论缀合方法如何(图6c)。在37℃下，用不同浓度的ADC处理SKBR3细胞(具有高Her2表达的细胞系)72小时。Cell Titer Glo用于在处理结束时确定细胞活力。
实施例10：在位置294处的变体具有一系列与MTG的反应性
曲妥珠单抗的附加变体在Glu294位置处用如下突变来进行构造：E294D、E294F、E294G、E294H、E294K、E294L、E294M、E294N、E294R、E294S、E294T、E294V和E294Y。评估这些变体与MTG的反应性以及Tm/Tagg，以将这些变体的特性与E294A变体进行比较。这些变体在上述标准条件下与MTG和3-APA反应并且与WT mAb和去糖基化WT mAb进行比较。表6示出在37℃下与TGase和3-APA温育之后，每个mAb的(DOL)。通过mAb重链的MS分析来确定DOL；在轻链上未观察到修饰。报告了完整mAb的DOL，该完整mAb的DOL为通过重链的MS观察到的DOL的2倍。
表6.在37℃下与MTG和3-APA温育之后，mAb的标记度(DOL)。报告了完整mAb的DOL， 该完整mAb的DOL为通过重链的MS观察到的DOL的2倍。
Figure BDA0003949907720000461
Figure BDA0003949907720000471
变体中的许多变体具有类似于或甚至高于WT mAb的Tm(E294F、E294H、E294K、E294L、E294M、E294R、E294V、E294Y)。在这些变体中，若干变体也示出比WT mAb更快的与MTG的反应(E294F、E294K、E294L、E294M、E294R、E294V和E294Y)。特别地，E294M变体脱颖而出，因为其Tm比WT mAb高约2℃并且其DOL在所测试的变体中的任何一种变体中为最高的。
实施例11：YTE突变不增加缀合速率
三重突变体M252Y/S254T/T256E(YTE)增加IgG对FcRn的亲和力(Dall'Acqua等人，2006,J Biol Chem 281(33):23514-23524)。YTE突变定位于CH2结构域中，并且这些突变降低CH2结构域的Tm约6.5℃(Majumdar等人，2015,MAbs 7(1):84-95)。构造了具有YTE突变的曲妥珠单抗变体，并且在MTG反应中测试该曲妥珠单抗变体，以确定CH2结构域的热稳定性降低是否足以在位置Gln295处提供增加的反应性。YTE突变体的反应速率与WT mAb相当，从而证明该反应速率为本文所述的各种突变的特定性质，而不仅仅是CH2结构域去稳定化，该特定性质提供增强的反应性。
实施例12：不同IgG背景中的V302A、V302S和E294Q变体的表征
构造了不同mAb背景中的含有上述突变(V302A、V302S、E294Q、E294Q/V302A和E294A)的一系列变体。西妥昔单抗为结合至EGFR的临床批准的小鼠-人IgG1嵌合mAb。帕尼单抗为结合至EGFR的临床批准的人IgG2 mAb。帕妥珠单抗为结合至Her2的临床批准的人IgG1 mAb。PSMB127为结合至WO2019224718A2中所述的前列腺特异性膜抗原(PSMA)的人IgG4 mAb。这些变体在上述标准条件下与MTG和3-APA反应并且与适当的WT mAb和去糖基化WT mAb进行比较。表7示出在37℃下与TGase和3-APA温育之后，每个mAb的(DOL)。通过mAb重链的MS分析来确定DOL；在轻链上未观察到修饰。报告了完整mAb的DOL，该完整mAb的DOL为通过重链的MS观察到的DOL的2倍。
表7.在37℃下与MTG和3-APA温育之后，mAb的标记度(DOL)。报告了完整mAb的DOL， 该完整mAb的DOL为通过重链的MS观察到的DOL的2倍。
Figure BDA0003949907720000481
Figure BDA0003949907720000491
该系列抗体中的突变产生与在曲妥珠单抗中构造的相同突变类似的效果，从而证明该策略对多种人抗体和IgG同种型的广泛适用性。此外，与上述实施例6中的观察结果一致，单突变体(例如E294Q)和双突变体(例如E294Q/V302A)中的多者通过完成抗体-有效载荷缀合测定来实现DAR＝4，同时保持完整聚糖。
实施例13：变体与不同胺底物的反应
获得一系列含胺底物以用于与MTG缀合。带有短PEG连接基的附加含叠氮化物的胺；生物素连接的胺戊基氨基生物素；以及两个MMAF连接的胺，该胺带有可裂解或不可裂解的连接基。底物描述于表8中：
表8.在MTG催化的缀合中测试的胺底物。将底物在所示溶剂中在50mM下溶解。
Figure BDA0003949907720000492
将底物与WT曲妥珠单抗和变体V302S、E294M、E294Q/Q295A和E294Q/V302A反应。
在PBS中，将组分在反应混合物中与1mg/mL的抗体最终浓度、690uM的底物和10U/mg的Zedira MTG组合。将反应在37℃下温育18小时。对于分析，通过添加MTG阻断剂来使MTG失活，并且在50℃下用Rapid PNGase F(1％v/v)将mAb去糖基化，持续20min，并且用DTT还原至20mM，然后进行LC-MS以确定DOL。
一般来讲，用WT去糖基化mAb观察到的底物选择性类似于变体(表9)。对于所有所测试的变体，3-APA、叠氮基-PEG3-胺和戊基氨基生物素反应基本上均完成了。与MMAF分子的反应示出更多的变化。在大多数情况下，除E294Q/Q295A变体之外，NH2-vcMMAF反应给出比NH2-MMAF更高的DOL。同时，V302S变体具有与使用NH2-vcMMAF的去糖基化WT相当的反应性，但是用NH2-MMAF观察到极少反应。
表9：在37℃下反应18小时之后的DOL。报告了完整mAb的DOL，该完整mAb的DOL为通 过重链的MS观察到的DOL的2倍。
Figure BDA0003949907720000501
本发明的实施方案旨在仅为示例性的，并且本领域技术人员将认识到或能够使用不超过常规实验来确定本发明的特定程序的许多等同形式。所有此类等同形式被认为是在本发明的范围内并且由以下权利要求书涵盖。
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序列
Figure BDA0003949907720000502
Figure BDA0003949907720000511
Figure BDA0003949907720000521
Figure BDA0003949907720000531
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Figure BDA0003949907720000551
Figure BDA0003949907720000561
Figure BDA0003949907720000571
Figure BDA0003949907720000581
Figure BDA0003949907720000591
Figure BDA0003949907720000601
Figure BDA0003949907720000611
Figure BDA0003949907720000621
Figure BDA0003949907720000631
Figure BDA0003949907720000641
Figure BDA0003949907720000651
Figure BDA0003949907720000661
Figure BDA0003949907720000671
Figure BDA0003949907720000681
Figure BDA0003949907720000691
Figure BDA0003949907720000701
Figure BDA0003949907720000711
Figure BDA0003949907720000721
<110> Janssen Biotech, Inc.
<120> 使用转谷氨酰胺酶的糖基化单克隆抗体的位点特异性缀合
<130> JBI6302WOPCT1
<150> 63/027396
<151> 2020-05-20
<160> 59
<170> PatentIn版本3.5
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<212> PRT
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<400> 1
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala
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Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
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Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
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Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
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Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
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Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
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Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
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Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
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Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
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Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
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Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
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Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
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Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
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Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
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Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
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Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
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Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
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Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
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Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
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Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
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Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
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Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val
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Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
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Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
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Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
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Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
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Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
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Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
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Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
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Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
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Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
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Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
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Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
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Gly Lys
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Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
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Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
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Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
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Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
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Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
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Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
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Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
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Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
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Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
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Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
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Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
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Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
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Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
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Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Thr Ala Gln Thr His Ala Pro Glu Lys Gln Ser Asn Ser Thr Leu Arg
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Ser Val Ser Glu Leu Pro Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Lys
450
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<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C'/D-E链 + E258K
<400> 14
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
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Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
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Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
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Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
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Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
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Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
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Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
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Ser Arg Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
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Ser Val Ser Glu Leu Pro Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Lys
450
<210> 15
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> K288Q + PR->AP; YRV->LRS; K290H, V305E, E258K
<400> 15
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
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65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Gln Thr His Ala Pro Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Leu Arg
290 295 300
Ser Val Ser Glu Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Lys
450
<210> 16
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接枝整个CH2结构域
<400> 16
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
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65 70 75 80
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Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
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195 200 205
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Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
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Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
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Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
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Gly Lys
450
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<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
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20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
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Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
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Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
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Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
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Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
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Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
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Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
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Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
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420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Lys
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Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
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Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
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370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
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Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
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Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
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Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
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Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
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Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
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Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
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Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
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Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
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Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
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Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
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Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
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Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
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Gly Lys
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<211> 450
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Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
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Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
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Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
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165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
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Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
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Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
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Ser Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
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Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
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Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
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Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
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Gly Lys
450
<210> 31
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<212> PRT
<213> 人工序列
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Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
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Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
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Ser Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
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Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
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Gly Lys
450
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<213> 人工序列
<220>
<223> E293Q/Y300L/V302S
<400> 32
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
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Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
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130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
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165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225 230 235 240
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245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Gln Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Leu Arg
290 295 300
Ser Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
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325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
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355 360 365
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Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
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405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Lys
450
<210> 33
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> E294Q/Y300L/V302S
<400> 33
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1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
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Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
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Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
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Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
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Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
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Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
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Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
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Gly Lys
450
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35 40 45
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Gly Lys
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Gly Lys
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Gly Lys
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Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
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Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
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Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
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Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
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Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
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Gly Lys
450
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> V302T
<400> 39
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Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
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Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
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Gly Lys
450
<210> 40
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325 330 335
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355 360 365
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Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
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Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Lys
450
<210> 41
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> V302Y
<400> 41
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
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Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
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Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
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Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
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Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
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Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
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Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
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Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
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Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
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Gly Lys
450
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Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> E294T
<400> 57
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Val Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
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385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
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Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
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Gly Lys
450
<210> 59
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> E294Y
<400> 59
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1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
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35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
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Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
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420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Lys
450

Claims (58)

1.一种工程化抗体，所述工程化抗体包含在所述抗体的重链位置302处的氨基酸取代，其中氨基酸编号是根据Kabat的EU索引。
2.根据权利要求1所述的工程化抗体，其中在重链位置302处的所述氨基酸取代为V302A。
3.根据权利要求1所述的工程化抗体，其中在重链位置302处的所述氨基酸取代为V302S。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的工程化抗体，所述工程化抗体还包含在重链位置286、287、288、289、290、293或294处的谷氨酰胺取代；和/或在重链位置241、243、294或301处的丙氨酸取代。
5.根据权利要求4所述的工程化抗体，所述工程化抗体包含在重链位置293处的所述谷氨酰胺取代。
6.根据权利要求4所述的工程化抗体，所述工程化抗体包含在重链位置294处的所述谷氨酰胺取代。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的工程化抗体，所述工程化抗体还包含在重链位置300处的氨基酸取代，例如其中在重链位置300处的所述氨基酸取代为Y300L。
8.一种工程化抗体，所述工程化抗体包含在所述抗体的重链位置294处的氨基酸取代，其中氨基酸编号是根据Kabat的EU索引。
9.根据权利要求8所述的工程化抗体，其中在重链位置294处的所述氨基酸取代为E294Q。
10.根据权利要求9所述的工程化抗体，所述工程化抗体还包含在重链位置295处的氨基酸取代。
11.根据权利要求10所述的工程化抗体，其中在重链位置295处的所述氨基酸取代为Q295A。
12.根据权利要求10所述的工程化抗体，其中在重链位置295处的所述氨基酸取代为Q295E。
13.根据权利要求10所述的工程化抗体，其中在重链位置295处的所述氨基酸取代为Q295N。
14.根据权利要求8所述的工程化抗体，所述工程化抗体还包含在重链位置302处的氨基酸取代。
15.根据权利要求14所述的工程化抗体，其中在重链位置302处的所述氨基酸取代为V302A。
16.根据权利要求14所述的工程化抗体，其中在重链位置302处的所述氨基酸取代为V302S。
17.根据权利要求8和14至16中任一项所述的工程化抗体，所述工程化抗体还包含在重链位置300处的氨基酸取代。
18.根据权利要求17所述的工程化抗体，其中在重链位置300处的所述氨基酸取代为Y300L。
19.一种工程化抗体，所述工程化抗体包含氨基酸取代V302S，以及氨基酸取代E293Q和E294Q中的至少一者，其中氨基酸编号是根据Kabat的EU索引。
20.一种工程化抗体，所述工程化抗体包含氨基酸取代V302S和氨基酸取代E293Q，其中氨基酸编号是根据Kabat的EU索引。
21.一种工程化抗体，所述工程化抗体包含氨基酸取代V302A和氨基酸取代E293Q，其中氨基酸编号是根据Kabat的EU索引。
22.一种工程化抗体，所述工程化抗体包含氨基酸取代V302S和氨基酸取代E294Q，其中氨基酸编号是根据Kabat的EU索引。
23.一种工程化抗体，所述工程化抗体包含氨基酸取代V302A和氨基酸取代E294Q，其中氨基酸编号是根据Kabat的EU索引。
24.根据权利要求19至23中任一项所述的工程化抗体，所述工程化抗体还包含氨基酸取代Y300L。
25.根据权利要求8所述的工程化抗体，其中在重链位置294处的所述氨基酸取代为丙氨酸取代，任选地为E294A。
26.根据权利要求25所述的工程化抗体，所述工程化抗体还包含在重链位置288处的氨基酸取代。
27.根据权利要求26所述的工程化抗体，其中在重链位置288处的所述氨基酸取代为K288Q。
28.根据权利要求8所述的工程化抗体，其中在重链位置294处的所述氨基酸取代为甲硫氨酸取代，任选地为E294M。
29.根据权利要求8所述的工程化抗体，其中在重链位置294处的所述氨基酸取代为苯丙氨酸取代，任选地为E294F。
30.根据权利要求8所述的工程化抗体，其中在重链位置294处的所述氨基酸取代为赖氨酸取代，任选地为E294K。
31.根据权利要求8所述的工程化抗体，其中在重链位置294处的所述氨基酸取代为亮氨酸取代，任选地为E294L。
32.根据权利要求8所述的工程化抗体，其中在重链位置294处的所述氨基酸取代为精氨酸取代，任选地为E294R。
33.根据权利要求8所述的工程化抗体，其中在重链位置294处的所述氨基酸取代为缬氨酸取代，任选地为E294V。
34.根据权利要求8所述的工程化抗体，其中在重链位置294处的所述氨基酸取代为酪氨酸取代，任选地为E294Y。
35.根据权利要求1至34中任一项所述的工程化抗体，其中所述抗体为人IgG抗体。
36.根据权利要求35所述的工程化抗体，其中所述抗体为人IgG1抗体。
37.根据权利要求35所述的工程化抗体，其中所述抗体为人IgG2抗体。
38.根据权利要求35所述的工程化抗体，其中所述抗体为人IgG4抗体。
39.根据权利要求1至38中任一项所述的工程化抗体，所述工程化抗体被糖基化。
40.一种抗体-有效载荷缀合物，所述抗体-有效载荷缀合物包含缀合至有效载荷的根据权利要求1至39中任一项所述的工程化抗体。
41.根据权利要求40所述的抗体-有效载荷缀合物，其中所述有效载荷在所述抗体的重链Q295残基处缀合至所述工程化抗体。
42.根据权利要求40或41所述的抗体-有效载荷缀合物，其中所述有效载荷在位于所述工程化抗体的重链位置286、287、288、289、290、293或294处的谷氨酰胺残基处缀合至所述工程化抗体。
43.根据权利要求40至42中任一项所述的抗体-有效载荷缀合物，其中所述有效载荷在Q295处以及在位于重链位置293和294处的所述谷氨酰胺残基中的至少一个谷氨酰胺残基处缀合至所述工程化抗体。
44.根据权利要求43所述的抗体-有效载荷缀合物，其中所述有效载荷在Q295处以及在位于重链位置293处的所述谷氨酰胺残基处缀合至所述工程化抗体。
45.根据权利要求43所述的抗体-有效载荷缀合物，其中所述有效载荷在Q295处以及在位于重链位置294处的所述谷氨酰胺残基处缀合至所述工程化抗体。
46.根据权利要求40所述的抗体-有效载荷缀合物，其中所述有效载荷在位于重链位置294处的所述谷氨酰胺残基处缀合至所述工程化抗体，并且有效载荷不在重链位置295处缀合至所述工程化抗体。
47.根据权利要求40至46中任一项所述的抗体-有效载荷缀合物，所述抗体-有效载荷缀合物具有1至4的药物抗体比率(DAR)。
48.一种生成抗体-有效载荷缀合物的方法，所述方法包括：在一定条件下使根据权利要求1至39中任一项所述的工程化抗体和含胺有效载荷与转谷氨酰胺酶接触，以生成包含缀合至所述有效载荷的所述工程化抗体的所述抗体-有效载荷缀合物。
49.根据权利要求48所述的方法，其中所述含胺有效载荷包括细胞毒性剂、细胞抑制剂、化学治疗剂、毒素、放射性核素、DNA、RNA、siRNA、微RNA、肽核酸、非天然氨基酸、肽、酶、荧光标签、生物素和第一点击反应配偶体中的一者或多者。
50.根据权利要求48或49所述的方法，其中所述含胺有效载荷包括第一点击反应配偶体。
51.根据权利要求50所述的方法，其中所述第一点击反应配偶体为3-叠氮基-1-丙胺，并且第二点击反应配偶体为二苯并环辛炔-四乙二醇-缬氨酸-瓜氨酸-对氨基苄基氨基甲酸酯-一甲基澳瑞他汀F(DBCO-val-cit-MMAF)或二苯并环辛炔-四乙二醇-一甲基澳瑞他汀F(DBCO-MMAF)。
52.根据权利要求48至51中任一项所述的方法，其中所述工程化抗体在其缀合至所述有效载荷之前尚未受到去糖基化。
53.一种药物组合物，所述药物组合物包含：根据权利要求1至39中任一项所述的工程化抗体，或根据权利要求40至47中任一项所述的抗体-有效载荷缀合物，和药学上可接受的载体。
54.一种在有需要的受试者中治疗癌症的方法，所述方法包括将根据权利要求53所述的药物组合物施用于所述受试者。
55.一种核酸，所述核酸编码根据权利要求1至39中任一项所述的工程化抗体。
56.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含根据权利要求55所述的核酸。
57.一种用于获得工程化抗体的方法，所述方法包括在合适条件下温育根据权利要求56所述的宿主细胞以表达所述工程化抗体，以及分离所述工程化抗体。
58.一种试剂盒，所述试剂盒包括：
a.根据权利要求1至39中任一项所述的工程化抗体；和
b.转谷氨酰胺酶。
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