CN113481218A - 巨型病毒或巨型噬菌体来源氨酰tRNA合成酶/tRNA正交体系构建方法及正交体系 - Google Patents

巨型病毒或巨型噬菌体来源氨酰tRNA合成酶/tRNA正交体系构建方法及正交体系 Download PDF

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Abstract

本发明涉及巨型病毒或巨型噬菌体来源的氨酰tRNA合成酶/tRNA正交体系构建方法以及正交体系。该构建方法包括：对现有巨型病毒及巨型噬菌体的基因组进行分析并选择一组候选氨酰tRNA合成酶；搜寻原核细胞内候选配对tRNA，或者搜寻真核细胞内候选配对tRNA；在预设原核宿主中将候选氨酰tRNA合成酶与原核细胞内候选配对tRNA分别配对检测正交性，获得原核正交体系；或者，在预设真核宿主中将候选氨酰tRNA合成酶与真核细胞内候选配对tRNA分别配对检测正交性，获得真核正交体系。本发明构建方法能构建获得巨型病毒或巨型噬菌体来源的氨酰tRNA合成酶/tRNA正交体系，可作为引入非天然氨基酸的工具。

Description

巨型病毒或巨型噬菌体来源氨酰tRNA合成酶/tRNA正交体系 构建方法及正交体系
技术领域
本发明涉及一种巨型病毒或巨型噬菌体来源的氨酰tRNA合成酶/tRNA正交体系构建方法，以及由其构建获得的正交体系，该正交体系可用于向目标蛋白中引入非天然氨基酸，属于生物化学技术领域。
背景技术
随着基因密码的扩展，许多非天然氨基酸(ncAAs)可通过利用氨酰tRNA合成酶/tRNA正交体系(以下简称为aa-RS对或aaRS/tRNA对，其中aa可以是某个具体的氨基酸)被引入到目标蛋白质中。在过去20年中，人们发现的aaRS/tRNA对数量有限。原核翻译系统中使用的正交对是来自古细菌的Glu-RS对、Leu-RS对、Lys-RS对、Pyl-RS对、Sep-RS对、Tyr-RS对、His-RS对、Arg-RS和Gln-RS对，以及来自酵母的Asp-RS对、Gln-RS对、Phe-RS对、Trp-RS对；在大肠杆菌中使用最多的是古生菌詹氏甲烷球菌的Tyr-RS/tRNATyr对和Mazei产甲烷杆菌的Pyl-RS/tRNApyl对；在真核翻译系统中使用的正交对是来自古生菌的Pyl-RS对和细菌的Leu-RS对、Gln-RS对、Tyr-RS对、Trp-RS对；在哺乳动物细胞中使用最多的是来自M.maze/M.bark的Tyr-RS(E.coli)/tRNATyr和Pyl-RS/tRNAPyl对。
因为在物种差异方面，古细菌和真核生物的aaRS和tRNA具有一定的相似性，且在原核生物中具有很强的正交性。原核生物的aaRS和tRNA则在真核生物中是正交的。目前发现的aaRS/tRNA对来源均为古生、原核生物和真核生物。因此从非古生物、非原核生物和非真核生物中发现新的tRNA合成酶/tRNA正交体系的新方法是一个很大的挑战。
病毒是一种体积小、细胞结构不完整、核酸类型单一的非细胞微生物，必须寄生在活的细菌或细胞中进行复制。它使用宿主的全套翻译系统(包括aaRS、tRNA和核糖体翻译机器)来产生蛋白质。在很长一段时间里，人们一直认为病毒不含aaRS，直到2003年发现巨型病毒Mimivirus；基因组测序数据显示，有4个aaRS基因残留在Mimivirus中。迄今为止已分离出100多株巨型病毒，且通过基因组序列测定从中发现了许多aaRS。巨型噬菌体则于1975年因发现巨大芽孢杆菌噬菌体G而被首次发现，其基因组中未发现aaRS；之后，在2017年分离发表了93个巨型噬菌体，2020年又有351个新的巨型噬菌体基因组被测序，发现其中一些具有部分的aaRS。这类巨型病毒及巨型噬菌体的来源仍在研究探讨中，目前系统发育和比较基因组学分析表明，它们与超界古生菌、细菌和真核生物一起代表着各自不同的超群，并且，巨型噬菌体与细菌和古细菌的关系相对更为密切，而巨型病毒与真核生物的进化关系更为密切。不幸的是，在巨型病毒及巨型噬菌体的进化过程中，相应的tRNA总是缺失，亟待研发出巨型病毒或巨型噬菌体来源的氨酰tRNA合成酶/tRNA正交体系构建方法，并构建获得相应的正交体系，可以为大量引入不同结构的非天然氨基酸提供工具。
发明内容
本发明的目的在于：根据发明人最新的研究成果，提出一种巨型病毒或巨型噬菌体来源的氨酰tRNA合成酶/tRNA正交体系构建方法，并提出由该方法获得的正交体系。
本发明解决其技术问题的技术方案如下：
一种巨型病毒或巨型噬菌体来源的氨酰tRNA合成酶/tRNA正交体系构建方法，其特征是，包括以下步骤：
第一步、对现有巨型病毒及巨型噬菌体的基因组进行分析，并从中选择一组来源于巨型病毒或巨型噬菌体的候选氨酰tRNA合成酶；
第二步、搜寻原核细胞内候选配对tRNA，或者搜寻真核细胞内候选配对tRNA；
第三步、在预设原核宿主中，将候选氨酰tRNA合成酶与原核细胞内候选配对tRNA分别配对，检测其正交性，并获得原核正交体系；或者，在预设真核宿主中，将候选氨酰tRNA合成酶与真核细胞内候选配对tRNA分别配对，检测其正交性，并获得真核正交体系。
采用该方法能构建获得巨型病毒或巨型噬菌体来源的氨酰tRNA合成酶/tRNA正交体系，可用于原核细胞或真核细胞，作为引入非天然氨基酸的工具。
本发明构建方法进一步完善的技术方案如下：
优选地，所述候选氨酰tRNA合成酶为酪氨酰tRNA合成酶；所述候选配对tRNA为与酪氨酰tRNA合成酶对应的Tyr-tRNA。
采用该优选方案，可进一步限定氨酰tRNA合成酶/tRNA的具体类型。
优选地，第二步中，在搜寻前，根据第一步所得候选氨酰tRNA合成酶的多肽序列构建生物进化树，并判断是否有候选氨酰tRNA合成酶接近真核生物或古生菌、或者接近细菌；
若有候选氨酰tRNA合成酶接近真核生物或古生菌，则判断该候选氨酰tRNA合成酶在原核细胞中具有正交可能性；
若有候选氨酰tRNA合成酶接近细菌，则判断该候选氨酰tRNA合成酶在真核细胞中具有正交可能性。
更优选地，第二步中，在搜寻原核细胞内候选配对tRNA时，搜寻目标包括：第一步涉及的所有或部分巨型病毒、或者所有或部分巨型噬菌体，所述部分巨型病毒或部分巨型噬菌体的宿主或潜在宿主，含有与预定候选氨酰tRNA合成酶序列类似的氨酰tRNA合成酶的微生物；
其中，所述部分巨型病毒为含有候选氨酰tRNA合成酶、且该候选氨酰tRNA合成酶在原核细胞中具有正交可能性的巨型病毒；所述部分巨型噬菌体为含有候选氨酰tRNA合成酶、且该候选氨酰tRNA合成酶在原核细胞中具有正交可能性的巨型噬菌体；
所述预定候选氨酰tRNA合成酶有至少一个，且选自在原核细胞中具有正交可能性的候选氨酰tRNA合成酶；
在判断氨酰tRNA合成酶是否与预定候选氨酰tRNA合成酶序列类似时，采用生物大分子序列比对搜索工具BLAST进行比对并按预设条件进行鉴别；
搜寻过程包括：在搜寻目标的基因组数据中搜寻并获取与候选氨酰tRNA合成酶对应的候选配对tRNA。
更优选地，第二步中，在搜寻真核细胞内候选配对tRNA时，搜寻目标包括：第一步涉及的所有或部分巨型病毒、或者所有或部分巨型噬菌体，所述部分巨型病毒或部分巨型噬菌体的宿主或潜在宿主，含有与预定候选氨酰tRNA合成酶序列类似的氨酰tRNA合成酶的微生物；
其中，所述部分巨型病毒为含有候选氨酰tRNA合成酶、且该候选氨酰tRNA合成酶在真核细胞中具有正交可能性的巨型病毒；所述部分巨型噬菌体为含有候选氨酰tRNA合成酶、且该候选氨酰tRNA合成酶在真核细胞中具有正交可能性的巨型噬菌体；
所述预定候选氨酰tRNA合成酶有至少一个，且选自在真核细胞中具有正交可能性的候选氨酰tRNA合成酶；
在判断氨酰tRNA合成酶是否与预定候选氨酰tRNA合成酶序列类似时，采用生物大分子序列比对搜索工具BLAST进行比对并按预设条件进行鉴别；
搜寻过程包括：在搜寻目标的基因组数据中搜寻并获取与候选氨酰tRNA合成酶对应的候选配对tRNA。
采用以上优选方案，可进一步优化第二步的具体搜寻过程，其中对于正交可能性的判断可大幅提升搜寻效率。
更优选地，在搜寻原核细胞内候选配对tRNA时，将现有技术中用于原核生物的氨酰tRNA合成酶/tRNA正交体系中与候选氨酰tRNA合成酶对应的tRNA列入原核细胞内候选配对tRNA中；或者，在搜寻真核细胞内候选配对tRNA时，将现有技术中用于真核生物的氨酰tRNA合成酶/tRNA正交体系中与候选氨酰tRNA合成酶对应的tRNA列入真核细胞内候选配对tRNA中。
采用该优选方案，可进一步扩大原核/真核细胞内候选配对tRNA的可选范围，以提高构建成功率。
优选地，第三步中，在预设原核宿主中检测正交性的过程包括：
S1、先判断各原核细胞内候选配对tRNA是否在现有技术中已确定在原核生物中具有正交性，若是则保留该原核细胞内候选配对tRNA，若否则在预设原核宿主中检测原核细胞内候选配对tRNA相对于该宿主内源性氨酰tRNA合成酶的正交性，并保留具有正交性的原核细胞内候选配对tRNA；
S2、将候选氨酰tRNA合成酶与S1所得原核细胞内候选配对tRNA分别配对，在预设原核宿主中检测各配对的活性，并保留具有活性的配对，此即原核正交体系；
在预设真核宿主中检测正交性的过程包括：
T1、先判断各真核细胞内候选配对tRNA是否在现有技术中已确定在真核生物中具有正交性，若是则保留该真核细胞内候选配对tRNA，若否则在预设真核宿主中检测真核细胞内候选配对tRNA相对于该宿主内源性氨酰tRNA合成酶的正交性，并保留具有正交性的真核细胞内候选配对tRNA；
T2、将候选氨酰tRNA合成酶与T1所得真核细胞内候选配对tRNA分别配对，在预设真核宿主中检测各配对的活性，并保留具有活性的配对，此即真核正交体系。
采用以上优选方案，可进一步优化第三步的具体过程。
更优选地，第三步中，在预设原核宿主中检测正交性的过程还包括：
S3、在S1所得原核细胞内候选配对tRNA中选择来源于巨型病毒或巨型噬菌体的tRNA，将其与现有技术中用于原核生物的氨酰tRNA合成酶/tRNA正交体系中的氨酰tRNA合成酶分别配对，在预设原核宿主中检测各配对的活性，保留具有活性的配对，并列入原核正交体系；
或者，第三步中，在预设真核宿主中检测正交性的过程还包括：
T3、在T1所得真核细胞内候选配对tRNA中选择来源于巨型病毒或巨型噬菌体的tRNA，将其与现有技术中用于真核生物的氨酰tRNA合成酶/tRNA正交体系中的氨酰tRNA合成酶分别配对，在预设真核宿主中检测各配对的活性，保留具有活性的配对，并列入真核正交体系；
或者，第三步在预设原核宿主中检测正交性的过程的S2中：在配对前，将在真核细胞中具有正交可能性的候选氨酰tRNA合成酶剔除；若有候选氨酰tRNA合成酶经配对并在预设真核宿主中检测具有活性，则将该候选氨酰tRNA合成酶剔除；剔除的候选氨酰tRNA合成酶不予配对并在预设原核宿主中检测正交性；
或者，第三步在预设真核宿主中检测正交性的过程的T2中：在配对前，将在原核细胞中具有正交可能性的候选氨酰tRNA合成酶剔除；若有候选氨酰tRNA合成酶经配对并在预设原核宿主中检测具有活性，则将该候选氨酰tRNA合成酶剔除；剔除的候选氨酰tRNA合成酶不予配对并在预设真核宿主中检测正交性。
采用以上优选方案，一方面可进一步扩大原核/真核细胞内候选氨酰tRNA合成酶的可选范围，以提高构建成功率；另一方面可通过针对性的筛选剔除候选氨酰tRNA合成酶，提高构建效率。
本发明还提出：
由前文所述巨型病毒或巨型噬菌体来源的氨酰tRNA合成酶/tRNA正交体系构建方法获得的氨酰tRNA合成酶/tRNA正交体系。
优选地，所述氨酰tRNA合成酶/tRNA正交体系为原核正交体系，且选自：KSRS/TV2tRNA、KSRS/TV3tRNA、CTRS/TV2tRNA、CTRS/TV3tRNA、OPRS/TV2tRNA、OPRS/TV3tRNA、HKRS/TV2tRNA、HKRS/TV3tRNA、TPRS/TV2tRNA、TPRS/TV3tRNA、MGRS/TV2tRNA、MGRS/TV3tRNA、MORS/TV2tRNA、MORS/TV3tRNA、PDDRS/TV2tRNA、PDDRS/TV3tRNA、TTRS/TV2tRNA、TTRS/TV3tRNA、MVRS/TV3tRNA、3523RS/TV3tRNA、KSRS/MjtRNA、CTRS/MjtRNA、OPRS/MjtRNA、HKRS/MjtRNA、TPRS/MjtRNA、MGRS/MjtRNA、MORS/MjtRNA、PDDRS/MjtRNA、TTRS/MjtRNA、MVRS/MjtRNA、MJRS/TV2tRNA、MJRS/TV3tRNA；其中，KSRS序列如SEQ ID No.1所示，CTRS序列如SEQ ID No.2所示，OPRS序列如SEQ ID No.3所示，HKRS序列如SEQ ID No.4所示，TPRS序列如SEQ ID No.5所示，MGRS序列如SEQ ID No.6所示，MORS序列如SEQ ID No.7所示，PDDRS序列如SEQ ID No.8所示，TTRS序列如SEQ ID No.9所示，MVRS序列如SEQ ID No.10所示，3523RS序列如SEQ ID No.11所示，MJRS序列如SEQ ID No.12所示；TV2tRNA序列如SEQ IDNo.13所示，TV3tRNA序列如SEQ ID No.14所示，MjtRNA序列如SEQ ID No.15或SEQ IDNo.16所示；
所述氨酰tRNA合成酶/tRNA正交体系为真核正交体系，且选自：3401RS/GTGtRNA、3401RS/PS17tRNA、3401RS/SI19tRNA；其中，3401RS序列如SEQ ID No.17所示，GTGtRNA序列如SEQ ID No.18所示，PS17tRNA序列如SEQ ID No.19所示，SI19tRNA序列如SEQ ID No.20所示。
此外，本发明还提出：
前文所述氨酰tRNA合成酶/tRNA正交体系的用途，其特征是，所述用途为向目标多肽或蛋白引入非天然氨基酸。
含有前文所述氨酰tRNA合成酶/tRNA正交体系的翻译系统。
与现有技术相比，本发明构建方法能构建获得巨型病毒或巨型噬菌体来源的氨酰tRNA合成酶/tRNA正交体系，可用于原核细胞或真核细胞，作为引入非天然氨基酸的工具。
附图说明
图1为本发明实施例3中原核细胞内候选配对Tyr-tRNA的检测结果图。
图2为本发明实施例3原核宿主内各Tyr-RS与TV2tRNA/TV3tRNA配对检测结果图。
图3为本发明实施例3中原核宿主内各Tyr-RS与MjtRNA配对的检测结果图。
图4为本发明实施例3中原核宿主内MJRS与TV2tRNA、TV3tRNA配对检测结果图。
图5为本发明实施例3中真核细胞内候选配对Tyr-tRNA的检测结果图。其中，A图为荧光观测图，B图为流式细胞仪检测图。
图6为本发明实施例3中真核宿主内3401RS与各Tyr-tRNA配对的检测结果图。其中，A图为荧光观测图，B图为流式细胞仪检测图。
具体实施方式
在具体实施时，本发明的巨型病毒或巨型噬菌体来源的氨酰tRNA合成酶/tRNA正交体系构建方法，包括以下步骤：
第一步、对现有巨型病毒及巨型噬菌体的基因组进行分析，并从中选择一组来源于巨型病毒或巨型噬菌体的候选氨酰tRNA合成酶。
第二步、搜寻原核细胞内候选配对tRNA或者搜寻真核细胞内候选配对tRNA；其中，
在搜寻前，根据第一步所得候选氨酰tRNA合成酶的多肽序列构建生物进化树，并判断是否有候选氨酰tRNA合成酶接近真核生物或古生菌、或者接近细菌；若有候选氨酰tRNA合成酶接近真核生物或古生菌，则判断该候选氨酰tRNA合成酶在原核细胞中具有正交可能性；若有候选氨酰tRNA合成酶接近细菌，则判断该候选氨酰tRNA合成酶在真核细胞中具有正交可能性。
在搜寻原核细胞内候选配对tRNA时，搜寻目标包括：第一步涉及的所有或部分巨型病毒、或者所有或部分巨型噬菌体，部分巨型病毒或部分巨型噬菌体的宿主或潜在宿主，含有与预定候选氨酰tRNA合成酶序列类似的氨酰tRNA合成酶的微生物；其中，部分巨型病毒为含有候选氨酰tRNA合成酶、且该候选氨酰tRNA合成酶在原核细胞中具有正交可能性的巨型病毒；部分巨型噬菌体为含有候选氨酰tRNA合成酶、且该候选氨酰tRNA合成酶在原核细胞中具有正交可能性的巨型噬菌体；预定候选氨酰tRNA合成酶有至少一个，且选自在原核细胞中具有正交可能性的候选氨酰tRNA合成酶；在判断氨酰tRNA合成酶是否与预定候选氨酰tRNA合成酶序列类似时，采用生物大分子序列比对搜索工具BLAST进行比对并按预设条件进行鉴别；搜寻过程包括：在搜寻目标的基因组数据中搜寻并获取与候选氨酰tRNA合成酶对应的候选配对tRNA。
在搜寻真核细胞内候选配对tRNA时，搜寻目标包括：第一步涉及的所有或部分巨型病毒、或者所有或部分巨型噬菌体，部分巨型病毒或部分巨型噬菌体的宿主或潜在宿主，含有与预定候选氨酰tRNA合成酶序列类似的氨酰tRNA合成酶的微生物；其中，部分巨型病毒为含有候选氨酰tRNA合成酶、且该候选氨酰tRNA合成酶在真核细胞中具有正交可能性的巨型病毒；部分巨型噬菌体为含有候选氨酰tRNA合成酶、且该候选氨酰tRNA合成酶在真核细胞中具有正交可能性的巨型噬菌体；预定候选氨酰tRNA合成酶有至少一个，且选自在真核细胞中具有正交可能性的候选氨酰tRNA合成酶；在判断氨酰tRNA合成酶是否与预定候选氨酰tRNA合成酶序列类似时，采用生物大分子序列比对搜索工具BLAST进行比对并按预设条件进行鉴别；搜寻过程包括：在搜寻目标的基因组数据中搜寻并获取与候选氨酰tRNA合成酶对应的候选配对tRNA。
此外，在搜寻原核细胞内候选配对tRNA时，将现有技术中用于原核生物的氨酰tRNA合成酶/tRNA正交体系中与候选氨酰tRNA合成酶对应的tRNA列入原核细胞内候选配对tRNA中；或者，在搜寻真核细胞内候选配对tRNA时，将现有技术中用于真核生物的氨酰tRNA合成酶/tRNA正交体系中与候选氨酰tRNA合成酶对应的tRNA列入真核细胞内候选配对tRNA中。
第三步、在预设原核宿主中，将候选氨酰tRNA合成酶与原核细胞内候选配对tRNA分别配对，检测其正交性，并获得原核正交体系；或者，在预设真核宿主中，将候选氨酰tRNA合成酶与真核细胞内候选配对tRNA分别配对，检测其正交性，并获得真核正交体系。其中，
在预设原核宿主中检测正交性的过程包括：
S1、先判断各原核细胞内候选配对tRNA是否在现有技术中已确定在原核生物中具有正交性，若是则保留该原核细胞内候选配对tRNA，若否则在预设原核宿主中检测原核细胞内候选配对tRNA相对于该宿主内源性氨酰tRNA合成酶的正交性，并保留具有正交性的原核细胞内候选配对tRNA。
S2、将候选氨酰tRNA合成酶与S1所得原核细胞内候选配对tRNA分别配对，在预设原核宿主中检测各配对的活性，并保留具有活性的配对，此即原核正交体系。本步骤的可选方案为：在配对前，将在真核细胞中具有正交可能性的候选氨酰tRNA合成酶剔除；若有候选氨酰tRNA合成酶经配对并在预设真核宿主中检测具有活性，则将该候选氨酰tRNA合成酶剔除；剔除的候选氨酰tRNA合成酶不予配对并在预设原核宿主中检测正交性。
可选步骤：S3、在S1所得原核细胞内候选配对tRNA中选择来源于巨型病毒或巨型噬菌体的tRNA，将其与现有技术中用于原核生物的氨酰tRNA合成酶/tRNA正交体系中的氨酰tRNA合成酶分别配对，在预设原核宿主中检测各配对的活性，保留具有活性的配对，并列入原核正交体系。
在预设真核宿主中检测正交性的过程包括：
T1、先判断各真核细胞内候选配对tRNA是否在现有技术中已确定在真核生物中具有正交性，若是则保留该真核细胞内候选配对tRNA，若否则在预设真核宿主中检测真核细胞内候选配对tRNA相对于该宿主内源性氨酰tRNA合成酶的正交性，并保留具有正交性的真核细胞内候选配对tRNA。
T2、将候选氨酰tRNA合成酶与T1所得真核细胞内候选配对tRNA分别配对，在预设真核宿主中检测各配对的活性，并保留具有活性的配对，此即真核正交体系。本步骤的可选方案为：在配对前，将在原核细胞中具有正交可能性的候选氨酰tRNA合成酶剔除；若有候选氨酰tRNA合成酶经配对并在预设原核宿主中检测具有活性，则将该候选氨酰tRNA合成酶剔除；剔除的候选氨酰tRNA合成酶不予配对并在预设真核宿主中检测正交性。
可选步骤：T3、在T1所得真核细胞内候选配对tRNA中选择来源于巨型病毒或巨型噬菌体的tRNA，将其与现有技术中用于真核生物的氨酰tRNA合成酶/tRNA正交体系中的氨酰tRNA合成酶分别配对，在预设真核宿主中检测各配对的活性，保留具有活性的配对，并列入真核正交体系。
具体而言，候选氨酰tRNA合成酶为酪氨酰tRNA合成酶(即Tyr-RS)；候选配对tRNA为与酪氨酰tRNA合成酶对应的Tyr-tRNA。
下面参照附图并结合实施例对本发明作进一步详细描述。但是本发明不限于所给出的例子。各实施例中，所用方法如无特别说明均为常规方法，所用试剂和材料如无特别说明均为市售品。
实施例1
本实施例为本发明在具体实施时的第一步，基本内容如前文所述。
本实施例具体内容如下：
通过对数据库中报道的所有巨型病毒及巨型噬菌体基因组进行分析，合并相似的Tyr-RS蛋白质序列，并选取了14种典型巨型病毒及巨型噬菌体不同来源类型的Tyr-RS。其中，11种Tyr-RS来源于巨型病毒，具体包括：拟菌病毒科(Mimiviridae)：Acanthamoebapolyphaga mimivirus、Acanthamoeba polyphaga moumouvirus、Tupanvirus、klosneuvirus、Catovirus CTV1、Hokovirus；巨大病毒科(Megavirus)：Megaviruschiliensis；藻类脱氧核糖核酸病毒科(Phycodnaviridae)：Orpheovirus IHΜMI-LCC2；潘多拉病毒科(Pandoraviridae)：Pandoravirus dμLcis、Pandoravirus salinus；未分类的拟病毒科(Unclassified Mimiviridae)：Terrestrivirus sp。另外3种TyrRS来源于巨型噬菌体：Phage3523、Phage2715和Phage3401。以上14种Tyr-RS的命名缩写如下表所示。
Figure BDA0003113887870000091
以上14种Tyr-RS即为候选氨酰tRNA合成酶Tyr-RS。
实施例2
本实施例为本发明在具体实施时的第二步，基本内容如前文所述。本实施例基于实施例1。
本实施例具体内容如下：
(一)对实施例1的14种TyrRS的蛋白序列构建生物进化树，TyrRS巨型病毒则分为三个类群，其中Pandoravirus salinus分支分化较早，Catovirus、Moumouvirus、Megavirus、Mimivirus则显示为相对独立真核及古生菌进化，Tupanvirus、Klonsneuvirus、Hokovirus、Orpheovirus、Pandoravirus dμLcis、Terrestrivirus相对接近真核酵母，但并没有巨型病毒来源的TyrRS接近细菌，因此可以推断这些巨型病毒来源的TyrRS在原核细胞内具有正交可能性。同时，从进化树中也发现巨型噬菌体Phage2715和Phage3401来源的TyrRS接近细菌，但Phage3523来源的TyrRS同样显示为真核及古生菌进化，因此可以推断Phage2715和Phage3401来源的TyrRS在真核细胞内具有正交可能性，Phage3523来源的TyrRS在原核细胞内具有正交可能性。
(二)搜寻原核细胞内TyrRS配对Tyr-tRNA。因巨型病毒及巨型噬菌体的酪氨酸tRNA在部分基因组上缺失，首先我们使用tRNA-Scan软件(http://lowelab.ucsc.edu/ tRNAscan-SE/)对所选的50种巨型病毒全基因组进行tRNA扫描，发现只有Tupanvirus，Klonsneuvirus这两种病毒携带了Tyr-tRNA。其中，Tupanvirus携带4个Tyr-tRNAs，Klonsneuvirus携带有一个tRNA。其次我们假设病毒入侵宿主会先翻译出TyrRS，TyrRS则可能会劫持宿主tRNA参与翻译的过程；经统计，从巨型病毒的宿主(或潜在宿主)Parachlamydia acanthamoebae，Tritrichomonas foetus，Entamoeba histolytica，Ostreococcus tauri基因组数据中分别获取Tyr-tRNAs；同时，巨型噬菌体只有测序数据，并没有指明明确宿主(或潜在宿主)。此外，对在原核细胞中具有正交可能性的TyrRS序列进行Blast，寻找较类似的TyrRS所对应的tRNA，其中搜寻到Thermoplasmata archaeon，PyrodictiμM delaneyi，Thermoprotei archaeon中含有与TyrRS对应的Tyr-tRNA。此外，将现有技术中用于原核生物的古生菌詹氏甲烷球菌Methanococcus jannaschii的Tyr-RS/tRNATyr对之中的Tyr-tRNA也列入候选。
综上，共有12个原核细胞内候选配对Tyr-tRNAs，命名如下表所示。之后，将这些tRNA构建在ProK启动子和rrnc终止子之间，进行组成型的表达。
Figure BDA0003113887870000101
Figure BDA0003113887870000111
(三)搜寻真核细胞内TyrRS配对Tyr-tRNA。真核细胞内TyrRS配对Tyr-tRNA搜寻原则与前述原核细胞配对原则一致。对Phage2715，Phage3401的全基因组分析，并没有发现其中携带有Tyr-tRNA，同时只有基因组测序数据也没有标注宿主(或潜在宿主)。最后，对在真核细胞中具有正交可能性的TyrRS序列进行Blast，一共搜寻到10个不同细菌的TyrRS，并搜寻其基因组中的Tyr-tRNAs，命名如下表所示。之后，将这些tRNA构建在Human U6启动子和SV40终止子之间，进行组成型的表达。
Figure BDA0003113887870000112
实施例3
本实施例为本发明在具体实施时的第三步，基本内容如前文所述。本实施例基于实施例2。
本实施例具体内容如下：
(一)在原核宿主中检测正交性。
(1)在大肠杆菌中利用GFP琥珀抑制效率评价原核细胞内候选配对Tyr-tRNA相对内源性氨酰tRNA合成酶的正交性。
注：采用绿色荧光蛋白GFP作为报告基因，其中在149的位点突变为TAG，用于在琥珀密码子插入非天然氨基酸，通过荧光的变化指示氨基酸插入的情况。下同。
将实施例2的原核细胞内候选配对Tyr-tRNA分别构建于pBAD-GFP(149TAG)中，共转感受态细胞DH10B成功后于-20℃保存。注：由于Methanococcus jannaschii的Tyr-tRNA本身属于现有技术已确定在原核生物中具有正交性，因此本实施例中没有检测其正交性，直接予以保留。
将各pBAD-EGFP(149TAG)-tRNAs-DH10B菌株活化，分别接种到3mL 100μg/mL Amp抗性的LB培养基中37℃/220rpm恒温振荡器中培养过夜，次日分别以1:100接种到20mL Amp抗性的LB培养基中37℃/220rpm培养3h左右，酶标仪检测菌生长状态OD600至0.8，加入终浓度为0.15％阿拉伯糖继续诱导培养10h，每个Tyr-tRNAs都设置不加诱导剂的空白组。次日分别取800μL菌液至1.5mL EP管中，剩余菌液取200μL测OD600。12000rpm离心2min弃上清加入200μL
Figure BDA0003113887870000121
蛋白提取试剂充分混匀室温静置放置20min后再加入600μL PBS缓冲溶液，分别取200μL至96孔黑板每个样品做三个复孔，用多功能酶标仪检测荧光强度，激发波长480nm、发射波长530nm，所有检测实验均重复三次。
通过以上检测，结果如图1所示，该结果表明：
Blank组为pBAD-EGFP(149TAG)质粒不携带任何tRNA。
巨型病毒宿主来源的
Figure BDA0003113887870000122
以及巨型病毒TyrRS蛋白序列同源性比对而来
Figure BDA0003113887870000123
四组荧光值相较于Blank组有明显的升高，说明这4个tRNAs被大肠杆菌内源性的氨酰tRNA合成酶识别不具有正交性，不能用于后续配对实验。
其余7组
Figure BDA0003113887870000124
Figure BDA0003113887870000125
相较于Blank组荧光值相近，说明这7个Tyr-tRNAs不被大肠杆菌内源性的氨酰tRNA合成酶识别，在原核细胞中具有正交性，可以用于后续新酶对配对实验。
(2)实施例1的部分候选氨酰tRNA合成酶与
Figure BDA0003113887870000126
大肠杆菌内活性配对研究，利用GFP琥珀抑制效率评价各Tyr-RS对
Figure BDA0003113887870000127
识别。
将实施例1的部分候选氨酰tRNA合成酶Tyr-RS：MV-TyrRS(即MVRS)、MO-TyrRS(即MORS)、MG-TyrRS(即MGRS)、KS-TyrRS(即KSRS)、CT-TyrRS(即CTRS)、HK-TyrRS(即HKRS)、OP-TyrRS(即OPRS)、PDD-TyrRS(即PDDRS)、TT-TyrRS(即TTRS)、TP-TyrRS(即TPRS)、HP3523-TyrRS(即3523RS)分别与
Figure BDA0003113887870000131
两两配对，共转感受态细胞DH10B成功后于-20℃保存。之后采用与本实施例(一)(1)相同的操作过程进行检测，观察菌体荧光值，如果诱导后有荧光则表示配对成功。
结果如图2所示，该结果表明成功筛选到20个活性配对即原核正交体系：KSRS/TV2tRNA、KSRS/TV3tRNA、CTRS/TV2tRNA、CTRS/TV3tRNA、OPRS/TV2tRNA、OPRS/TV3tRNA、HKRS/TV2tRNA、HKRS/TV3tRNA、TPRS/TV2tRNA、TPRS/TV3tRNA、MGRS/TV2tRNA、MGRS/TV3tRNA、MORS/TV2tRNA、MORS/TV3tRNA、PDDRS/TV2tRNA、PDDRS/TV3tRNA、TTRS/TV2tRNA、TTRS/TV3tRNA、MVRS/TV3tRNA、3523RS/TV3tRNA。
其中，KSRS序列如SEQ ID No.1所示，CTRS序列如SEQ ID No.2所示，OPRS序列如SEQ ID No.3所示，HKRS序列如SEQ ID No.4所示，TPRS序列如SEQ ID No.5所示，MGRS序列如SEQ ID No.6所示，MORS序列如SEQ ID No.7所示，PDDRS序列如SEQ ID No.8所示，TTRS序列如SEQ ID No.9所示，MVRS序列如SEQ ID No.10所示，3523RS序列如SEQ ID No.11所示，TV2tRNA序列如SEQ ID No.13所示，TV3tRNA序列如SEQ ID No.14所示。
注：(1)由于3401RS、2715RS在真核细胞中具有正交可能性，所以上述内容中已将其剔除，不予配对及在预设原核宿主中检测正交性；(2)由于PDSRS经分别与
Figure BDA0003113887870000132
配对后检测无活性，所以上述内容中未将其列入配对范围。
(3)实施例1的部分候选氨酰tRNA合成酶与
Figure BDA0003113887870000133
大肠杆菌内活性配对研究，利用GFP琥珀抑制效率评价各Tyr-RS对
Figure BDA0003113887870000134
识别。
将实施例1的部分候选氨酰tRNA合成酶Tyr-RS：MV-TyrRS(即MVRS)、MO-TyrRS(即MORS)、MG-TyrRS(即MGRS)、KS-TyrRS(即KSRS)、CT-TyrRS(即CTRS)、HK-TyrRS(即HKRS)、OP-TyrRS(即OPRS)、PDD-TyrRS(即PDDRS)、TT-TyrRS(即TTRS)、TP-TyrRS(即TPRS)、HP3523-TyrRS(即3523RS)分别与
Figure BDA0003113887870000135
两两配对，共转感受态细胞DH10B成功后于-20℃保存。
之后采用与本实施例(一)(1)相同的操作过程进行检测，观察菌体荧光值，如果诱导后有荧光则表示配对成功。
结果如图3所示，该结果表明成功筛选到10个活性配对即原核正交体系：KSRS/MjtRNA、CTRS/MjtRNA、OPRS/MjtRNA、HKRS/MjtRNA、TPRS/MjtRNA、MGRS/MjtRNA、MORS/MjtRNA、PDDRS/MjtRNA、TTRS/MjtRNA、MVRS/MjtRNA。
其中，各Tyr-RS序列如前文所述，此处采用的MjtRNA为2001年Wang等研究者通过人工进化而来的Mj-u-tRNA，序列如SEQ ID No.16所示。注：采用序列如SEQ ID No.15所示的、2009年Guo等研究者通过人工进化而来的Mj-s-tRNA时，其结果与Mj-u-tRNA相同，受本文篇幅限制，不再赘述其具体实验数据。
(4)詹氏甲烷球菌氨酰tRNA合成酶Tyr-RS与
Figure BDA0003113887870000141
大肠杆菌内活性配对研究，利用GFP琥珀抑制效率评价合成酶对
Figure BDA0003113887870000142
识别。
詹氏甲烷球菌氨酰tRNA合成酶Tyr-RS属于现有技术中用于原核生物的氨酰tRNA合成酶/tRNA正交体系中的氨酰tRNA合成酶。
将詹氏甲烷球菌氨酰tRNA合成酶Tyr-RS分别与
Figure BDA0003113887870000143
两两配对，共转感受态细胞DH10B成功后于-20℃保存。之后采用与本实施例(一)(1)相同的操作过程进行检测，观察菌体荧光值，如果诱导后有荧光则表示配对成功。
结果如图4所示，该结果表明成功筛选到2个活性配对即原核正交体系：MJRS/TV2tRNA、MJRS/TV3tRNA。
其中，MJRS序列如SEQ ID No.12所示，各tRNA如前文所述。
(二)在真核宿主中检测正交性。
(1)在真核细胞中利用GFP琥珀抑制效率评价真核细胞内候选配对Tyr-tRNA相对内源性氨酰tRNA合成酶的正交性。
将实施例2的真核细胞内候选配对Tyr-tRNA分别构建于pCMV-EGFP(39TAG)中，共转感受态细胞HEK293T成功后于-20℃保存。
将各pCMV-EGFP(39TAG)-tRNAs-HEK293T菌株分别接种到20mL 100μg/mL Amp抗性的LB培养基中，放置37℃/220rpm恒温振荡器中培养过夜提取pCMV-EGFP(39TAG)-tRNAs无内毒素质粒。HEK293T细胞铺板48孔细胞平板，每孔细胞加入250μL DMEM完全培养基，放入37℃、5％CO2培养箱中培养24h。细胞密度达到70％左右，利用脂质体转染试剂分别转入10个pCMV-EGFP(39TAG)-tRNAs，同时设置空白组。继续培养48h后荧光显微镜下观察细胞是否有绿色EGFP表达。同时利用流式细胞术检测表达EGFP细胞比例，①吸取细胞上清后加入100μL胰蛋白酶溶液消化30s，加入500μL DMEM完全培养终止消化，转移至1.5mL EP管中350g离心5min弃上清；②用800μL PBS重悬细胞350g离心5min弃上清重复用PBS洗两次，最后用500μLPBS重悬细胞并用70μM筛网过滤上机检测，以上实验均重复三次。
通过以上检测，结果如图5的A图和B图所示，该结果表明：
Figure BDA0003113887870000151
这5个Tyr-tRNAs在真核细胞中具有正交性，可以用于后续配对实验。
其余5个
Figure BDA0003113887870000152
Figure BDA0003113887870000153
的荧光图片中能观察到发绿色荧光的细胞和流式结果检测到细胞群，以上结果说明这5个Tyr-tRNAs在真核细胞内被内源性Tyr-RS识别，不可用于后续配对实验。
(2)实施例1的候选氨酰tRNA合成酶3401TyrRS与
Figure BDA0003113887870000154
Figure BDA0003113887870000155
分别共转染入HEK293T，利用GFP琥珀抑制效率评价合成酶对各tRNA识别。
将实施例1的候选氨酰tRNA合成酶3401TyrRS分别与
Figure BDA0003113887870000156
Figure BDA0003113887870000157
两两配对，共转感受态细胞HEK293T成功后于-20℃保存。之后采用与本实施例(二)(1)相同操作过程进行检测。
结果如图6所示，该结果表明成功筛选到3个活性配对即真核正交体系：3401RS/GTGtRNA、3401RS/PS17tRNA、3401RS/SI19tRNA；其中，3401RS序列如SEQ ID No.17所示，GTGtRNA序列如SEQ ID No.18所示，PS17tRNA序列如SEQ ID No.19所示，SI19tRNA序列如SEQ ID No.20所示。
注：(1)上述内容中，不仅剔除了在原核细胞中具有正交可能性的候选氨酰tRNA合成酶，还剔除了前文中经配对并在预设原核宿主中检测具有活性的候选氨酰tRNA合成酶；(2)由于PDSRS、2715RS经分别与上述内容中各tRNA配对后检测无活性，所以上述内容中未将其列入配对范围。
实施例4
采用实施例3获得的各原核正交体系、各真核正交体系分别作为翻译系统导入相应宿主细胞后，向目标多肽或蛋白引入非天然氨基酸，结果表明，以上各原核正交体系、各真核正交体系均具备向目标多肽或蛋白引入非天然氨基酸的功能(受篇幅所限，本文不再列入相应具体数据)。
除上述实施例外，本发明还可以有其他实施方式。凡采用等同替换或等效变换形成的技术方案，均落在本发明要求的保护范围。
序列表
<110> 中国药科大学
<120> 巨型病毒或巨型噬菌体来源氨酰tRNA合成酶/tRNA正交体系构建方法及正交体系
<160> 20
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 358
<212> PRT
<213> Klosneuvirus
<400> 1
Met Glu Leu Ser Val Asp Glu Lys Phe Asn Leu Ile Thr Arg Asn Leu
1 5 10 15
Gln Glu Thr Ile Leu Asp Glu Val Ile Met Lys Lys Ile Ile Ala Ala
20 25 30
Arg Pro Leu Lys Val Tyr Trp Gly Thr Ala Pro Thr Ser Ala Pro Ser
35 40 45
Val Ala Tyr Phe Val Pro Met Met Lys Ile Arg Asp Leu Val Met Ala
50 55 60
Gly Cys Glu Val Thr Ile Leu Ile Ala Asp Leu His Ala Ile Leu Asp
65 70 75 80
Asn Leu Lys Ser Thr Phe Glu Gln Val Gly His Arg Ser Glu Tyr Tyr
85 90 95
Ile Thr Met Ile Lys Ala Leu Leu Thr Ser Leu Asn Ile Asp Val Asn
100 105 110
Lys Ile Lys Phe Val Lys Gly Thr Glu Phe Gln Leu Ser Lys Glu Tyr
115 120 125
Thr Leu Asp Met Tyr Lys Ala His Ser Leu Ile Thr Val Asn Glu Ala
130 135 140
Lys His Ala Gly Ala Glu Val Val Lys Gln Ala Glu His Pro Lys Met
145 150 155 160
Thr Gly Leu Met Tyr Pro Thr Leu Gln Ala Leu Asp Glu Gln Tyr Leu
165 170 175
Gly Ala Asp Val Glu Ile Gly Gly Ile Asp Gln Arg Lys Leu Phe Met
180 185 190
His Ala Arg Asn Ile Met Pro Gln Leu Gly Tyr Lys Lys Arg Met Tyr
195 200 205
Leu Met Asn Lys Met Ile Ser Gly Leu Arg Thr Gln Lys Gln Glu Pro
210 215 220
Lys Glu Gly Glu Asn Ile Gln Asp Gln Lys Met Ser Ser Ser Asn Gln
225 230 235 240
Asp Ser Lys Ile Asp Leu Leu Asp Ser Lys Asn Gln Leu Lys Ala Lys
245 250 255
Ile Asn Lys Ala Tyr Cys Phe Pro Gly Asp Ile Asn Asp Asn Cys Leu
260 265 270
Leu Glu Met Leu Glu Asn Leu Val Phe Pro Ile Leu His Ile Lys Gly
275 280 285
Leu Asn Phe Val Ile Glu Arg Lys Glu Glu Tyr Gly Gly Asn Ile Thr
290 295 300
Tyr Asn Asn Ile Asp Asn Val Lys Asn Asp Phe Lys Ser Glu Lys Leu
305 310 315 320
His Pro Met Asp Leu Lys Gln Gly Met Ile Asn Asn Leu Asp Leu Ile
325 330 335
Leu Asp Ser Ile Arg Lys Thr Phe Glu Thr Pro Glu Met Lys Lys Leu
340 345 350
Ile Lys Met Ala Tyr Ser
355
<210> 2
<211> 389
<212> PRT
<213> Catovirus
<400> 2
Met Asn Ile Gln Glu Asn Ile Lys Thr Ile Lys Ser Ile Gly Glu Glu
1 5 10 15
Ile Ile Gly Gly Asp Ser Leu Glu Arg Leu Leu Thr His Lys Gln Arg
20 25 30
Val Tyr Ala Tyr Asp Gly Phe Glu Pro Ser Gly Arg Met His Ile Ala
35 40 45
Gln Gly Leu Leu Arg Thr His Asn Val Asn Lys Phe Ile Asp Ser Gly
50 55 60
Val His Phe Lys Phe Trp Val Ala Asp Trp Phe Ala Leu Met Asn Leu
65 70 75 80
Lys Leu Gly Gly Asp Ile Lys Lys Ile Gln Gln Ala Gly Lys Asp Met
85 90 95
Ile Leu Met Trp Lys Ala Cys Asp Met Asn Leu Asp Lys Val Asp Lys
100 105 110
Asp Gly Asn Lys Met Ile Glu Phe Leu Trp Ser Ser Glu Glu Ile Asn
115 120 125
Lys Arg Pro Asp Glu Tyr Trp Lys Leu Val Leu Asp Ile Ala Thr Lys
130 135 140
Phe Ser Leu Asn Arg Ile Lys Lys Cys Thr Gln Ile Met Gly Arg Lys
145 150 155 160
Glu Glu Asp Glu Ile Phe Asn Thr Ile Leu Asp Leu Asn Asp Lys Ile
165 170 175
Val Asp Leu Phe Asn Asn Cys Asp Phe Glu Gln Lys Lys Lys Asp Asp
180 185 190
Ile Leu Gly Leu Leu Lys Lys Leu Leu Asp Thr Lys Leu Asp Glu Leu
195 200 205
Ala Ala Ser Gln Ile Phe Tyr Pro Val Met Gln Cys Ala Asp Val Phe
210 215 220
Phe Leu Gly Ile Asp Ile Ala Ser Leu Gly Met Asp Gln Arg Lys Val
225 230 235 240
Asn Thr Leu Ala Leu Glu Tyr Cys Asp Lys Ile Lys Arg Lys Asn Lys
245 250 255
Pro Ile Ile Ile Ser His His Met Leu Lys Gly Leu Asp Gly Ser Asp
260 265 270
Lys Met Ser Lys Ser Asn Pro Asp Asn Thr Ile Phe Met Asp Asp Ser
275 280 285
Glu Thr Glu Ile Ile Arg Lys Ile Lys Lys Ser Phe Cys Glu Pro Gly
290 295 300
Asn Ile Asp Lys Asn Pro Leu Leu Asp Trp Ile Glu His Leu Ile Leu
305 310 315 320
Pro Ile Lys Lys Thr Ile Val Ile Lys Thr Lys Asn Asp Ile Gly Glu
325 330 335
Glu Ile Asp Met Ser Phe Asp Asn Ala Asn Leu Ile Ala Asp Lys Phe
340 345 350
Lys Asn Gly Tyr Ile His Pro Lys Cys Leu Lys Asn Ala Val Thr Thr
355 360 365
Val Leu Val Asn Thr Leu Ile Pro Ile Gln Gln Lys Tyr Ile Ala Leu
370 375 380
Lys Lys Asn Asp Asn
385
<210> 3
<211> 357
<212> PRT
<213> Orpheovirus
<400> 3
Met Asn Thr Tyr Asn Leu Ile Thr Arg Asn Leu Gln Glu Val Val Gly
1 5 10 15
Asn Asp Glu Leu Leu Lys Lys Ile Asp Asn Gly Glu Asp Ile Lys Val
20 25 30
Tyr Trp Gly Thr Ala Ile Thr Gly Asn Pro His Leu Gly Tyr Phe Val
35 40 45
Pro Ile Leu Lys Ile Ala Asp Leu Leu Asn Ala Gly Cys Lys Val Thr
50 55 60
Ile Leu Leu Ala Asp Leu His Gly Tyr Leu Asp Asn Leu Lys Thr Asp
65 70 75 80
Trp Asp Leu Leu Ser Leu Arg Ile Glu Trp Tyr Glu Leu Ile Ile Lys
85 90 95
Glu Met Leu Lys Arg Val Gly Val Ser Leu Glu Asn Leu Lys Phe Val
100 105 110
Thr Gly Ser Thr Phe Gln Leu Ser Lys Glu Tyr Thr Leu Asp Met Tyr
115 120 125
Lys Leu Ser Ala Leu Val Thr Thr Thr Ala Met Gln His Ala Ser Ala
130 135 140
Glu Val Val Lys Gln Ser Lys Asn Pro Leu Leu Ser Gly Leu Leu Tyr
145 150 155 160
Pro Ile Leu Gln Ala Leu Asp Glu Lys Tyr Leu Gly Val Asn Val Gln
165 170 175
Leu Gly Gly Ile Asp Gln Arg Lys Ile Phe Met Phe Ala Arg Glu Ile
180 185 190
Leu Ser Glu Val Asp Tyr Pro Lys Ser Ile His Leu Met Asn Pro Leu
195 200 205
Val Pro Gly Leu Gly Lys Pro Val Lys Gly Asn Lys Gly Lys Asn Glu
210 215 220
Gly Asn Asp Ile Glu Gly Lys Met Ser Ser Ser Asp Lys Asn Ser Lys
225 230 235 240
Ile Asp Phe Ser Asp Ser Asp Glu Val Ile Lys Asp Lys Met Lys Lys
245 250 255
Ala Tyr Ser Val Asp Gly Gln Val Glu Gly Asn Cys Leu Met Ser Met
260 265 270
Cys Lys Leu Ile Leu Phe Pro Phe Leu Glu Leu Glu Gly Arg Lys Phe
275 280 285
Val Val Glu Arg Glu Glu Lys Tyr Gly Gly Asp Val His Phe Asp Asn
290 295 300
Tyr Asn Ser Ile Glu Glu Thr Phe Gly Lys Lys Glu Leu Ala Ser Met
305 310 315 320
Asp Leu Lys Val Ala Ile Ala Lys Glu Ile Ile Lys Leu Val Asn Pro
325 330 335
Ile Arg Lys Ile Val Asn Asp Asn Val Glu Leu Met Lys Ser Ala Tyr
340 345 350
Pro Thr Glu Lys Asn
355
<210> 4
<211> 389
<212> PRT
<213> Hokovirus
<400> 4
Met Asn Lys Leu Thr Ile Asp Glu Lys Arg Glu Leu Ile Thr Lys Asn
1 5 10 15
Leu Gln Glu Ile Leu Gly Lys Gln Glu Leu Asp Asn Leu Leu Leu Gln
20 25 30
Glu Glu Ile Lys Ile Tyr Trp Gly Thr Ala Pro Thr Gly Arg Ile His
35 40 45
Ile Gly Tyr Phe Ile Gln Phe Leu Lys Ile Val Asp Tyr Ile Lys Ala
50 55 60
Gly Cys Lys Val Lys Ile Leu Ile Ala Asp Leu His Ala Val Leu Asp
65 70 75 80
Asn Leu Lys Thr Ser Met Glu Leu Leu Asn Ala Arg Thr Glu Tyr Tyr
85 90 95
Ile Thr Met Ile Lys Glu Val Leu Leu Ser Leu Asn Val Asp Leu Asp
100 105 110
Leu Ile Glu Phe Val Lys Gly Ser Asp Tyr Gln Leu Ser Gln Asn Tyr
115 120 125
Thr Leu Asp Val Tyr Lys Leu Asn Ser Lys Ile Ser Tyr Gln Glu Ala
130 135 140
Lys His Ala Gly Ala Glu Val Val Lys Gln Thr Gln Asn Pro Thr Met
145 150 155 160
Thr Gly Leu Leu Tyr Pro Ser Leu Gln Ala Leu Asp Glu His Tyr Leu
165 170 175
Asp Val His Ile Gln Ser Gly Gly Ile Asp Gln Arg Lys Ile Phe Thr
180 185 190
Phe Ala Arg Ser Asn Leu Asn Leu Leu Gly Tyr Lys Lys Ser Ile His
195 200 205
Leu Met Thr Pro Met Val Gln Gly Leu Arg Phe Asn Lys Lys Glu Ile
210 215 220
Lys Asn Val Ile Thr Lys Glu Glu Lys Leu Lys Leu Leu Asn Ile Asp
225 230 235 240
Phe Asp Leu Pro Asp Asn Tyr Val Asp Thr Leu Tyr Lys Lys Tyr Ile
245 250 255
Asn Asn Asp Thr Ile Lys Asp Asp Lys Met Ser Ser Ser Asn Asn Asp
260 265 270
Ser Lys Ile Asp Leu Leu Asp Thr Lys Asn Glu Ile Lys Lys Lys Ile
275 280 285
Asn Lys Ser Tyr Cys Leu Pro Cys Asp Val Glu Asp Asn Cys Leu Met
290 295 300
Asp Leu Leu Glu Lys Val Ile Phe Pro Val Leu Ser Tyr Lys Asn Gln
305 310 315 320
Gln Phe Ile Ile Asn Arg Lys Glu Lys Phe Gly Gly Ile Ile Ile Tyr
325 330 335
Asp Ser Phe Asp Asn Ile Lys Asn Asp Phe Ala Leu Gly Lys Leu His
340 345 350
Pro Gln Asp Phe Lys Leu Gly Ile Thr Asp Ser Leu Asn Tyr Ile Leu
355 360 365
Glu Pro Ile Arg Asn Ser Phe Glu Thr Lys Glu Arg Lys Leu Leu Leu
370 375 380
Lys Lys Ala Tyr Asn
385
<210> 5
<211> 357
<212> PRT
<213> Tupanvirus
<400> 5
Met Glu Val Val Gln Asp Lys Ile Ser Leu Ile Thr Ser Arg Leu Gln
1 5 10 15
Glu Val Ile Gly Ile Asp Glu Leu Gln Asn Ile Ile Lys Ser Arg Pro
20 25 30
Leu Lys Ile Tyr Trp Gly Thr Ala Pro Thr Gly Lys Val His Ile Gly
35 40 45
Tyr Leu Val Pro Leu Leu Lys Ile Ala Asp Phe Leu Lys Ser Gly Cys
50 55 60
Glu Val Lys Ile Leu Phe Ala Asp Leu His Ala Val Leu Asp Asn Leu
65 70 75 80
Lys Ser Thr Ser Gln Gln Val Glu Tyr Arg Thr Ile Tyr Tyr Glu Lys
85 90 95
Met Ile Lys Ala Ile Leu Lys Asn Leu Asn Val Ser Leu Glu Lys Leu
100 105 110
Thr Phe Val Lys Gly Ser Ser Phe Gln Leu Thr Gln Ser Tyr Thr Met
115 120 125
Asp Met Tyr Lys Ile Ser Thr Leu Ala Thr Leu His Asp Ala Lys Lys
130 135 140
Ala Gly Ala Glu Val Val Lys Gln Thr Asp Asn Pro Lys Met Ser Gly
145 150 155 160
Leu Leu Tyr Pro Ile Leu Gln Ala Leu Asp Glu Gln Tyr Leu Asp Val
165 170 175
Asp Ala Gln Phe Gly Gly Ile Asp Gln Arg Lys Leu Phe Thr Phe Ala
180 185 190
Ala Asp Val Leu Pro Leu Ile Gly Tyr Asn Lys Arg Ile His Leu Met
195 200 205
Asn Pro Met Leu Thr Ala Ile Asn Ala Met Pro Lys Asn Ile Asn Glu
210 215 220
Asp Thr Asn Leu Ser Glu Val Lys Met Ser Ser Ser Asp Leu Asn Ser
225 230 235 240
Lys Ile Asp Met Met Asp Ser Lys Asn Glu Val Lys Lys Lys Ile Asn
245 250 255
Arg Ala Tyr Cys Leu Glu Gly Asp Leu Ser Phe Asn Pro Leu Met Glu
260 265 270
Leu Met Lys Leu Val Ile Phe Pro Leu Leu Asp Asn Cys Asn Ile Asn
275 280 285
Ile Phe Thr Ile Asn Arg His Glu Lys Tyr Gly Gly Pro Leu Asn Tyr
290 295 300
Ser Asn Phe Glu Glu Leu Glu Lys Asp Phe Val Gln Lys Thr Leu His
305 310 315 320
Pro Gln Asp Leu Lys Met Gly Ile Ile Asp Cys Leu Asn Asn Phe Met
325 330 335
Asp Pro Ile Arg Gln Glu Phe Ser Asp Lys Glu Thr Gln Gln Leu Ile
340 345 350
Lys Lys Ala Tyr Asn
355
<210> 6
<211> 424
<212> PRT
<213> Megavirus chiliensis
<400> 6
Met Asn Gln Phe Lys Glu Leu Leu Thr Asn Val Glu Asn Ile Ser Leu
1 5 10 15
Ile Tyr Asn Asp Ser Asp Asn Arg Val Met Phe Thr Met Lys Ser His
20 25 30
Leu Leu Tyr Phe Leu Thr Arg Phe Lys Asn Ser Asp Ile Val Lys Ile
35 40 45
Ile Glu Lys Asp Asn Leu Lys Tyr Phe Met Leu Asp Glu Ile Ser Ser
50 55 60
Asp Asn Tyr Leu Asp Ile Tyr Asp Lys Phe Ile Lys Glu Tyr Gln Ile
65 70 75 80
Tyr Asp Leu Asp Tyr Asp Asn Phe Ile Asp Gln Arg Val Gln Asn Leu
85 90 95
Leu Ser Ile Ser Glu Glu Cys Asp Thr Ile Asp Arg Leu Lys Glu Leu
100 105 110
Val Glu Ser Phe Lys Asn Phe Thr Ala Tyr Asn Gly Phe Glu Pro Ser
115 120 125
Gly Arg Ile His Ile Ala Gln Ala Leu Ile Thr Val Met Asn Thr Asn
130 135 140
Thr Ile Ile Gln Asn Gly Gly Ser Met Ile Ile Tyr Ile Ala Asp Trp
145 150 155 160
Phe Ala Gln Met Asn His Lys Met Gly Gly Asp Leu Glu Lys Ile Arg
165 170 175
Asp Val Gly Lys Tyr Phe Ile Glu Val Phe Lys Ala Cys Gly Ile Asn
180 185 190
Met Ser Gly Thr Lys Phe Ile Trp Ala Ser Glu Phe Phe Asn Asp Asn
195 200 205
Ala Thr Lys Tyr Phe Glu Arg Met Leu His Ile Ala Asn Gln Thr Ser
210 215 220
Leu Ala Arg Ala Lys Arg Cys Cys Gln Ile Met Gly Arg Arg Glu Gly
225 230 235 240
Asp Glu Leu Ser Ser Ser Gln Ile Ile Tyr Pro Cys Met Gln Val Ala
245 250 255
Asp Ile Phe Glu Leu Asn Pro Asn Gly Ile Asp Ile Cys Gln Leu Gly
260 265 270
Val Asp Gln Arg Lys Val Asn Met Leu Ala Ile Glu Tyr Ala Lys Arg
275 280 285
Asn Asn Leu Lys Thr Pro Ile Ile Leu Ser His His Met Leu Met Gly
290 295 300
Leu Lys Gly Ser Lys Asn Lys Met Ser Lys Ser Asp Pro Glu Asn Ala
305 310 315 320
Ile Phe Met Glu Asp Ser Arg Glu Asp Ile Phe Lys Lys Ile His Lys
325 330 335
Ala Tyr Cys Thr Asp Glu Ile Ile Asp Asn Pro Ile Tyr Glu Tyr Ile
340 345 350
Lys Tyr Ile Leu Leu Arg Trp Phe Gly Thr Ile Thr Leu Cys Gly Gln
355 360 365
Lys Tyr Asn Asn Ile Asp Asp Ile Asn Lys Asn Phe Ala Thr Met Leu
370 375 380
Lys Lys Asp Leu Lys Asn Asp Val Ala Asp Tyr Ile Asp Tyr Ile Leu
385 390 395 400
Glu Pro Val Arg Arg His Phe Gln Asp Pro Gln Met Ala Glu Leu Tyr
405 410 415
Ser Arg Val Arg Ser Tyr Thr Asn
420
<210> 7
<211> 345
<212> PRT
<213> Moumouvirus
<400> 7
Met Glu Gln Gln Ile Leu Ser Thr Glu Glu Lys Ile Thr Arg Leu Ile
1 5 10 15
Ser Ile Cys Glu Glu Cys Glu Thr Pro Asp Arg Leu Glu Glu Leu Ile
20 25 30
Lys Ser Gly Lys Lys Phe Thr Ala Tyr Asn Gly Phe Glu Pro Ser Gly
35 40 45
Arg Ile His Ile Ala Gln Ala Leu Ile Thr Val Met Asn Thr Asn Glu
50 55 60
Ile Ile Ser Cys Gly Gly Arg Met Ile Ile Tyr Ile Ala Asp Leu Phe
65 70 75 80
Ala Lys Met Asn Lys Lys Met Asp Ser Asp Leu Asp Lys Ile Lys Asp
85 90 95
Val Gly Leu Tyr Phe Ile Glu Val Phe Lys Ala Cys Gly Ile Asn Met
100 105 110
Ser Glu Thr Lys Phe Ile Trp Ser Ser Asp Leu Phe Asn Lys Asn Pro
115 120 125
Glu Lys Tyr Phe Thr Arg Leu Leu Asp Ile Ser Glu Glu Thr Ser Leu
130 135 140
Ser Arg Ser Lys Arg Cys Cys Gln Ile Met Gly Arg Lys Asp Gly Asp
145 150 155 160
Glu Leu Ser Val Ser Gln Ile Ile Tyr Pro Cys Met Gln Val Ala Asp
165 170 175
Ile Phe Glu Leu Glu Pro Glu Gly Ile Asp Ile Cys Gln Leu Gly Val
180 185 190
Asp Gln Arg Lys Val Asn Met Leu Ala Leu Glu Tyr Ala Lys Lys Asn
195 200 205
Gly Leu Lys Val Pro Val Ile Leu Ser His His Met Leu Met Gly Leu
210 215 220
Gly Gly Pro Lys Asn Lys Met Ser Lys Ser Asp Pro Lys Ser Ala Ile
225 230 235 240
Phe Met Glu Asp Ser Tyr Glu Glu Ile Lys Glu Lys Ile Leu Arg Ala
245 250 255
Phe Cys Thr Asp Asp Ile Asn Glu Asn Pro Ile Phe Glu Tyr Ile Lys
260 265 270
His Ile Leu Phe Arg Trp Tyr Gly Lys Leu Glu Leu Cys Gly Lys Asn
275 280 285
Tyr Asp Asn Met Ser Asp Ile Glu Lys Asp Phe Cys Asp Met Asn Lys
290 295 300
Arg Glu Leu Lys Asn Asn Val Ala Glu Tyr Ile Asn Lys Ile Ile Glu
305 310 315 320
Pro Val Arg Ile His Phe Gln Gln Pro His Leu Lys Asn Leu Leu Asp
325 330 335
Lys Val Ser Ser Tyr Arg Val Thr Lys
340 345
<210> 8
<211> 380
<212> PRT
<213> Pandoravirus dulcis
<400> 8
Met Ile Ser Asp Asp Gly Asp Asp Asn Ser Gly Gly Lys Glu Ala Ala
1 5 10 15
His Leu Pro Val Gly Asn Ile Asp Pro Asp Gln Gly Asp Val Glu Gln
20 25 30
Arg Tyr Ala Leu Val Val Arg Asp Leu Asp Glu Val Ile Gly Asp Pro
35 40 45
Ala Glu Ile Lys Ala Ile Met Ala Glu Arg Pro Leu Ile Ile Tyr Trp
50 55 60
Gly Thr Ala Pro Thr Gly Asn Pro His Leu Gly Tyr Phe Val Pro Ile
65 70 75 80
Phe Lys Leu Ala Asp Phe Leu Gln Ala Gly Cys Arg Val Lys Ile Leu
85 90 95
Phe Ala Asp Val His Ala His Leu Asp Asn Gly Lys Thr Pro Trp Asp
100 105 110
Leu Val Glu His Arg Cys Arg Trp Tyr Glu Phe Ala Ile Lys Ala Met
115 120 125
Leu Gln His Ile Gly Val Pro Leu Gly Gly Leu Glu Phe Val Arg Gly
130 135 140
Thr Glu Tyr Gln Cys Gly Gly Ala Tyr Ala Leu Asp Leu Tyr Arg Leu
145 150 155 160
Ala Ala His Val Arg Thr Gly Thr Ala Gln Lys Ala Ala Ala Gln Val
165 170 175
Val Lys Met Asp Arg Asn Pro Leu Leu Ser Asn Val Leu Tyr Pro Leu
180 185 190
Met Gln Ala Leu Asp Glu Gln His Leu Asp Val Asp Ala Gln Phe Gly
195 200 205
Gly Arg Asp Gln Arg Lys Ile Phe Ala Phe Ala Arg Asp His Leu Pro
210 215 220
Val Leu Gly Tyr Arg Lys Arg Phe His Leu Leu Asn Pro Leu Val Pro
225 230 235 240
Gly Leu Thr Glu Ser Gly Lys Met Ser Ala Ser Glu Ala Ala Ser Lys
245 250 255
Ile Gly Leu Asp Asp Pro Asp Glu Val Ile Arg Ala Lys Ile Arg Arg
260 265 270
Ala Tyr Ser Val Asp Gly Cys Ala Glu Gly Asn Gly Leu Leu Ala Ile
275 280 285
Leu Arg Phe Val Leu Trp Arg Trp Leu Glu Pro Ala Gly Leu Pro Phe
290 295 300
Val Val Thr Arg Pro Ser Glu Tyr Gly Gly Pro Gln Thr Phe Ala Thr
305 310 315 320
Tyr Ala Glu Val Glu Ala Ala Phe Val Arg Ala Gly Val Pro Leu Val
325 330 335
Glu Gly Gly Gly Glu Arg Leu Phe Ser Val Asp Leu Lys Pro Ala Val
340 345 350
Ala Asp Leu Leu Cys Glu Phe Leu Ala Pro Leu Arg Gly Val Leu Ala
355 360 365
Ala Arg Ala Asp Leu Phe Ala Ala Ala Tyr Pro Val
370 375 380
<210> 9
<211> 360
<212> PRT
<213> Terrestrivirus
<400> 9
Met Asn Pro Gln Glu Gln Tyr Asp Leu Ile Ser His Arg Ile Ser Pro
1 5 10 15
Asp Asp Ile Val Gly Lys Ser Tyr Leu Met Glu Lys Leu Gln Ala Gly
20 25 30
Lys Gln Leu Lys Gly Tyr Val Gly Phe Ala Pro Thr Gly Arg Cys His
35 40 45
Ile Gly Tyr Ala Ser Leu Leu Leu Lys Val Ala Gln Cys Leu Asp Ala
50 55 60
Gly Cys Glu Ile Ile Ile Leu Leu Ala Asp Val His Ala Phe Leu Asp
65 70 75 80
Ala Arg Lys Ser Gly Leu Glu Asp Glu Ala Lys Thr Glu Tyr Tyr Lys
85 90 95
Gln Met Ile Thr Glu Leu Leu Arg Leu Leu Asn Ala Asp Leu Ser Lys
100 105 110
Val Lys Phe Val Lys Gly Ser Glu Tyr Gln Tyr Ser Lys Pro Tyr Met
115 120 125
Gln Asp Leu Leu Arg Leu Leu Asn Thr Ile Ser Ile Ser Lys Ala Lys
130 135 140
His Ala Gly Ala Asp Val Val Lys Gln Ala Glu Asp Pro Leu Leu Ser
145 150 155 160
Ser Leu Val Tyr Pro Leu Met Gln Ser Leu Asp Glu Thr His Leu Asp
165 170 175
Pro Asp Leu Asp Phe Glu Leu Ser Gly Thr Asp Gln Arg His Ile Phe
180 185 190
Met Phe Ser Val Asp Tyr Val Asn Lys Ser Lys Asn Lys Lys Met Thr
195 200 205
Tyr Ile Met Asn Gln Leu Val Pro Gly Leu Ser Lys Glu Ser Leu Arg
210 215 220
Asn Pro Glu Thr Lys Val Val Thr Ser Gln Lys Met Ser Ser Ser Asp
225 230 235 240
Ser Val Gly Lys Leu Asp Leu Leu Asp Thr Pro Lys Glu Ile Leu Asn
245 250 255
Lys Leu Lys Lys Ala Tyr Cys Leu Glu Gly Asp Ala Glu Asp Asn Thr
260 265 270
Val Leu Val Met Cys Lys His Ile Ile Phe Pro Val Leu Glu Arg Leu
275 280 285
Asn Lys Gln Phe Val Ile Ala Arg Asp Glu Lys Tyr Gly Gly Asn Leu
290 295 300
Val Ile Asn Ser His Asp Glu Leu Tyr Ala Leu Phe Ala Asp Lys Ser
305 310 315 320
Ile His Pro Ser Asp Leu Lys Lys Ser Val Ala Asn Ile Ile Thr Asp
325 330 335
Leu Phe Glu Pro Ile Arg Gln His Phe Ser Thr Asn Asp Met Val Lys
340 345 350
Leu Leu Glu Gln Ala Tyr Gly Lys
355 360
<210> 10
<211> 346
<212> PRT
<213> Acanthamoeba polyphaga mimivirus
<400> 10
Met Glu Asn Thr Asp His Thr Asn Asn Glu His Arg Leu Thr Gln Leu
1 5 10 15
Leu Ser Ile Ala Glu Glu Cys Glu Thr Leu Asp Arg Leu Lys Gln Leu
20 25 30
Val Asp Ser Gly Arg Ile Phe Thr Ala Tyr Asn Gly Phe Glu Pro Ser
35 40 45
Gly Arg Ile His Ile Ala Gln Ala Leu Ile Thr Val Met Asn Thr Asn
50 55 60
Asn Ile Ile Glu Cys Gly Gly Gln Met Ile Ile Tyr Ile Ala Asp Trp
65 70 75 80
Phe Ala Lys Met Asn Leu Lys Met Asn Gly Asp Ile Asn Lys Ile Arg
85 90 95
Glu Leu Gly Arg Tyr Phe Ile Glu Val Phe Lys Ala Cys Gly Ile Asn
100 105 110
Leu Asp Gly Thr Arg Phe Ile Trp Ala Ser Glu Phe Ile Ala Ser Asn
115 120 125
Pro Ser Tyr Ile Glu Arg Met Leu Asp Ile Ala Glu Phe Ser Thr Ile
130 135 140
Ser Arg Val Lys Arg Cys Cys Gln Ile Met Gly Arg Asn Glu Ser Asp
145 150 155 160
Cys Leu Lys Ala Ser Gln Ile Phe Tyr Pro Cys Met Gln Ala Ala Asp
165 170 175
Val Phe Glu Leu Val Pro Glu Gly Ile Asp Ile Cys Gln Leu Gly Ile
180 185 190
Asp Gln Arg Lys Val Asn Met Leu Ala Ile Glu Tyr Ala Asn Asp Arg
195 200 205
Gly Leu Lys Ile Pro Ile Ser Leu Ser His His Met Leu Met Ser Leu
210 215 220
Ser Gly Pro Lys Lys Lys Met Ser Lys Ser Asp Pro Gln Gly Ala Ile
225 230 235 240
Phe Met Asp Asp Thr Glu Gln Glu Val Ser Glu Lys Ile Ser Arg Ala
245 250 255
Tyr Cys Thr Asp Glu Thr Phe Asp Asn Pro Ile Phe Glu Tyr Ile Lys
260 265 270
Tyr Leu Leu Leu Arg Trp Phe Gly Thr Leu Asn Leu Cys Gly Lys Ile
275 280 285
Tyr Thr Asp Ile Glu Ser Ile Gln Glu Asp Phe Ser Ser Met Asn Lys
290 295 300
Arg Glu Leu Lys Thr Asp Val Ala Asn Tyr Ile Asn Thr Ile Ile Asp
305 310 315 320
Leu Val Arg Glu His Phe Lys Lys Pro Glu Leu Ser Glu Leu Leu Ser
325 330 335
Asn Val Lys Ser Tyr Gln Gln Pro Ser Lys
340 345
<210> 11
<211> 323
<212> PRT
<213> Phage3523
<400> 11
Leu Ile His Ile Asn Thr Glu Lys Ile Cys Ser Gly Thr Val Glu Val
1 5 10 15
Val Thr Lys Lys Glu Leu Gln Asp Ile Phe Asp Ser Gly Lys Arg Arg
20 25 30
Ala Tyr Ile Gly Phe Glu Pro Ser Gly Lys Gly His Ile Gly Trp Leu
35 40 45
Ile Leu Ala Lys Lys Ile Arg Asp Leu Asn Glu Ser Gly Phe Ser Val
50 55 60
Asp Ile Leu Leu Ala Asp Thr His Ala Lys Ile Asn Asp Lys Leu Gly
65 70 75 80
Gly Asp Glu Lys Arg Ile Glu Glu Ala Gly Asn Tyr Leu Val Glu Thr
85 90 95
Phe Asn Arg Leu Gly Ser Lys Phe Asn Val Val Lys Ala Ser Asp Phe
100 105 110
Ile Ser Thr Glu Gly Tyr Val Lys Thr Leu Leu Lys Val Cys Lys Ser
115 120 125
Val Asn Pro Ala Arg Ile Arg Arg Ala Met Asp Ile Met Gly Arg Ser
130 135 140
Gly Glu Asp Glu Ser Leu Asp Phe Ala Lys Met Leu Tyr Pro Ala Met
145 150 155 160
Gln Val Ala Asp Ile Phe His Asn Asp Trp Gln Val Cys Leu Gly Gly
165 170 175
Leu Asp Gln Arg His Ala His Met Leu Ala Arg Asp Val Ala Val Gln
180 185 190
Asn Asn Trp Lys Pro Pro Val Ala Ile His Thr Pro Leu Ile Pro Ser
195 200 205
Leu Asn Gly Ala Gly Arg Met Asn Pro Val Asp Lys Met Gly Lys Ser
210 215 220
Asn Ile Ala Gly Ser Ile Phe Leu Ser Asp Ser Arg Gln Glu Ile Glu
225 230 235 240
Gln Lys Ile Lys Ser Ala Leu Phe Pro Pro Lys Asp Thr Asp Asn Ala
245 250 255
Ile Val Ser Ile Ala Val Asn Ile Leu Phe Gly Val Asn Asn Tyr Lys
260 265 270
Met Lys Ile Glu Arg Pro Ile Lys Tyr Gly Gly Asp Ile Glu Ile Ser
275 280 285
Ala Val Asp Glu Phe Leu Gly Leu Val Arg Ser Gly Lys Leu His Pro
290 295 300
Thr Asp Val Lys Leu Thr Val Ser Lys Asp Leu His Ser Val Ile Ile
305 310 315 320
Asn Ala Thr
<210> 12
<211> 306
<212> PRT
<213> Methanococcus jannaschii
<400> 12
Met Asp Glu Phe Glu Met Ile Lys Arg Asn Thr Ser Glu Ile Ile Ser
1 5 10 15
Glu Glu Glu Leu Arg Glu Val Leu Lys Lys Asp Glu Lys Ser Ala Tyr
20 25 30
Ile Gly Phe Glu Pro Ser Gly Lys Ile His Leu Gly His Tyr Leu Gln
35 40 45
Ile Lys Lys Met Ile Asp Leu Gln Asn Ala Gly Phe Asp Ile Ile Ile
50 55 60
Leu Leu Ala Asp Leu His Ala Tyr Leu Asn Gln Lys Gly Glu Leu Asp
65 70 75 80
Glu Ile Arg Lys Ile Gly Asp Tyr Asn Lys Lys Val Phe Glu Ala Met
85 90 95
Gly Leu Lys Ala Lys Tyr Val Tyr Gly Ser Glu Phe Gln Leu Asp Lys
100 105 110
Asp Tyr Thr Leu Asn Val Tyr Arg Leu Ala Leu Lys Thr Thr Leu Lys
115 120 125
Arg Ala Arg Arg Ser Met Glu Leu Ile Ala Arg Glu Asp Glu Asn Pro
130 135 140
Lys Val Ala Glu Val Ile Tyr Pro Ile Met Gln Val Asn Asp Ile His
145 150 155 160
Tyr Leu Gly Val Asp Val Ala Val Gly Gly Met Glu Gln Arg Lys Ile
165 170 175
His Met Leu Ala Arg Glu Leu Leu Pro Lys Lys Val Val Cys Ile His
180 185 190
Asn Pro Val Leu Thr Gly Leu Asp Gly Glu Gly Lys Met Ser Ser Ser
195 200 205
Lys Gly Asn Phe Ile Ala Val Asp Asp Ser Pro Glu Glu Ile Arg Ala
210 215 220
Lys Ile Lys Lys Ala Tyr Cys Pro Ala Gly Val Val Glu Gly Asn Pro
225 230 235 240
Ile Met Glu Ile Ala Lys Tyr Phe Leu Glu Tyr Pro Leu Thr Ile Lys
245 250 255
Arg Pro Glu Lys Phe Gly Gly Asp Leu Thr Val Asn Ser Tyr Glu Glu
260 265 270
Leu Glu Ser Leu Phe Lys Asn Lys Glu Leu His Pro Met Asp Leu Lys
275 280 285
Asn Ala Val Ala Glu Glu Leu Ile Lys Ile Leu Glu Pro Ile Arg Lys
290 295 300
Arg Leu
305
<210> 13
<211> 74
<212> DNA/RNA
<213> Tupanvirus
<400> 13
ctctgcttag ttcaacggta gaacatcggg ctctaaaccc gagaatgtgt gttcgactca 60
cacagcagag gcca 74
<210> 14
<211> 74
<212> DNA/RNA
<213> Tupanvirus
<400> 14
cctgggttag tttaatggta aaacgaaagg ctctaaacct tttgatactg gttcgattcc 60
agtacctggg acca 74
<210> 15
<211> 77
<212> DNA/RNA
<213> Methanococcus jannaschi-si
<400> 15
ccggcggtag ttcagcaggg cagaacggcg gactctaaat ccgcatggca ggggttcaaa 60
tcccctccgc cggacca 77
<210> 16
<211> 77
<212> DNA/RNA
<213> Methanococcus jannaschii-u
<400> 16
ccggcggtag ttcagcaggg cagaacggcg gactctaaat ccgcatggcg ctggttcaaa 60
tccggcccgc cggacca 77
<210> 17
<211> 447
<212> PRT
<213> Phage3401
<400> 17
Met Val Asp Ser Lys Ala Leu Ile Asn Glu Leu Lys Glu Arg Gly Phe
1 5 10 15
Glu Gly Thr Val Leu Gly Asn Val Lys Glu Ala Leu Asp Ser Gly Ser
20 25 30
Ser Val Tyr Ile Gly Thr Asp Pro Ser Ser Ile Lys Ala Glu Asn Arg
35 40 45
Asn Pro Lys Phe Pro Asn Ile Thr Ser Ser Leu His Val Gly His Leu
50 55 60
Ser Ala Phe Met Ala Ala Lys Ile Phe Ala Lys Tyr Gly Val Lys Val
65 70 75 80
Ile Val Leu Val Gly Gly Cys Thr Ala Lys Met Gly Asp Pro Ser Gly
85 90 95
Lys Thr Ser Asp Arg Ala Leu Leu Ser Tyr Asp Glu Ile Asp Asn Asn
100 105 110
Ala Lys Cys Ile Lys Asn Gln Leu Ser Lys Leu Phe Asp Phe Asp Asn
115 120 125
Gly Lys Glu Asn Ser Pro Ile Ile Val Asn Asn Asn Asp Trp Met Asp
130 135 140
Asp Tyr Ser Phe Val Asn Phe Ala Arg Asn Val Gly Lys Phe Leu Thr
145 150 155 160
Val Asn Tyr Leu Met Ala Lys Asp Ser Ile Lys Ser Arg Phe Glu Arg
165 170 175
Asp Gly Asn Gly Ile Ser Val Leu Glu Phe Leu Tyr Gln Leu Val Gln
180 185 190
Ala Asn Asp Phe Leu Tyr Leu Arg Glu Lys Tyr Asn Cys Lys Ile Gln
195 200 205
Leu Cys Gly Met Asp Gln Ile Gly Asn Ala Thr Thr Gly Gln Glu Leu
210 215 220
Ala Arg Lys Ser Lys Gly Leu Thr Asp Leu Cys Gly Tyr Phe Ile Pro
225 230 235 240
Leu Val Cys Asp Glu Asn Gly Asn Lys Phe Gly Lys Ser Glu Asn Gly
245 250 255
Lys Ala Val Phe Leu Asp Ala Ala Leu Thr Thr Pro Tyr Glu Phe Tyr
260 265 270
Gln Phe Trp Leu Asn Gln Ser Asp Ser Met Ala Glu Gln Leu Ile Lys
275 280 285
Lys Phe Thr Met Leu Glu Leu Asp Glu Ile Asn Ser Met Ile Glu Glu
290 295 300
His Lys Lys Asn Pro Ala Asn Arg Leu Leu Gln Lys Glu Leu Ala Lys
305 310 315 320
Tyr Met Thr Ile Met Ile His Gly Glu Glu Glu Tyr Asn Lys Ala Ile
325 330 335
Asn Ala Ser Asn Ile Leu Phe Gly Lys Gly Thr Lys Glu Gln Leu Ser
340 345 350
Ser Ile Asp Glu Asn Thr Leu Leu Ser Val Met Ser Gly Val Asn Lys
355 360 365
Val Thr Leu Asn Lys Ser Glu Leu Asp Asp Gly Ile Gly Val Ile Asp
370 375 380
Ile Ala Val Lys His Asp Lys Ile Pro Ser Lys Gly Glu Ala Arg Lys
385 390 395 400
Leu Ile Lys Ala Asn Gly Phe Ser Ile Asn Lys Glu Lys Val Ser Asn
405 410 415
Glu Lys Ala Ile Ile Asn Ser Ser Asn Leu Ile Gly Gly Lys Tyr Leu
420 425 430
Leu Leu Gln Lys Gly Lys Lys Asp Tyr Thr Leu Ala Ile Ala Asn
435 440 445
<210> 18
<211> 82
<212> DNA/RNA
<213> Geobacillus_thermoglucosidasius
<400> 18
ggtggggtag cgaagtggcc aaacgccgcg gactctaaat ccgctccctt tgggttcggc 60
ggttcgaatc cgtcccccac ca 82
<210> 19
<211> 83
<212> DNA/RNA
<213> Prolixibacter sp. NT017
<400> 19
ggggagatac caaagtggcc aactggggca gactctaaat ctgctggctt atgccttcgt 60
aggttcgaat cctgctctcc cca 83
<210> 20
<211> 85
<212> DNA/RNA
<213> Streptobacillus sp. IHIT1603-19
<400> 20
ggcgagatac ccgagtggcc aaagggagca gactctaaat ctgccggctc agccttcgaa 60
ggttcgaatc cttctctcgc cacca 85

Claims (12)

1.一种巨型病毒或巨型噬菌体来源的氨酰tRNA合成酶/tRNA正交体系构建方法，其特征是，包括以下步骤：
第一步、对现有巨型病毒及巨型噬菌体的基因组进行分析，并从中选择一组来源于巨型病毒或巨型噬菌体的候选氨酰tRNA合成酶；
第二步、搜寻原核细胞内候选配对tRNA，或者搜寻真核细胞内候选配对tRNA；
第三步、在预设原核宿主中，将候选氨酰tRNA合成酶与原核细胞内候选配对tRNA分别配对，检测其正交性，并获得原核正交体系；或者，在预设真核宿主中，将候选氨酰tRNA合成酶与真核细胞内候选配对tRNA分别配对，检测其正交性，并获得真核正交体系。
2.根据权利要求1所述的巨型病毒或巨型噬菌体来源的氨酰tRNA合成酶/tRNA正交体系构建方法，其特征是，所述候选氨酰tRNA合成酶为酪氨酰tRNA合成酶；所述候选配对tRNA为与酪氨酰tRNA合成酶对应的Tyr-tRNA。
3.根据权利要求1所述的巨型病毒或巨型噬菌体来源的氨酰tRNA合成酶/tRNA正交体系构建方法，其特征是，第二步中，在搜寻前，根据第一步所得候选氨酰tRNA合成酶的多肽序列构建生物进化树，并判断是否有候选氨酰tRNA合成酶接近真核生物或古生菌、或者接近细菌；
若有候选氨酰tRNA合成酶接近真核生物或古生菌，则判断该候选氨酰tRNA合成酶在原核细胞中具有正交可能性；
若有候选氨酰tRNA合成酶接近细菌，则判断该候选氨酰tRNA合成酶在真核细胞中具有正交可能性。
4.根据权利要求3所述的巨型病毒或巨型噬菌体来源的氨酰tRNA合成酶/tRNA正交体系构建方法，其特征是，第二步中，在搜寻原核细胞内候选配对tRNA时，搜寻目标包括：第一步涉及的所有或部分巨型病毒、或者所有或部分巨型噬菌体，所述部分巨型病毒或部分巨型噬菌体的宿主或潜在宿主，含有与预定候选氨酰tRNA合成酶序列类似的氨酰tRNA合成酶的微生物；
其中，所述部分巨型病毒为含有候选氨酰tRNA合成酶、且该候选氨酰tRNA合成酶在原核细胞中具有正交可能性的巨型病毒；
所述部分巨型噬菌体为含有候选氨酰tRNA合成酶、且该候选氨酰tRNA合成酶在原核细胞中具有正交可能性的巨型噬菌体；
所述预定候选氨酰tRNA合成酶有至少一个，且选自在原核细胞中具有正交可能性的候选氨酰tRNA合成酶；
在判断氨酰tRNA合成酶是否与预定候选氨酰tRNA合成酶序列类似时，采用生物大分子序列比对搜索工具BLAST进行比对并按预设条件进行鉴别；
搜寻过程包括：在搜寻目标的基因组数据中搜寻并获取与候选氨酰tRNA合成酶对应的候选配对tRNA。
5.根据权利要求3所述的巨型病毒或巨型噬菌体来源的氨酰tRNA合成酶/tRNA正交体系构建方法，其特征是，第二步中，在搜寻真核细胞内候选配对tRNA时，搜寻目标包括：第一步涉及的所有或部分巨型病毒、或者所有或部分巨型噬菌体，所述部分巨型病毒或部分巨型噬菌体的宿主或潜在宿主，含有与预定候选氨酰tRNA合成酶序列类似的氨酰tRNA合成酶的微生物；
其中，所述部分巨型病毒为含有候选氨酰tRNA合成酶、且该候选氨酰tRNA合成酶在真核细胞中具有正交可能性的巨型病毒；
所述部分巨型噬菌体为含有候选氨酰tRNA合成酶、且该候选氨酰tRNA合成酶在真核细胞中具有正交可能性的巨型噬菌体；
所述预定候选氨酰tRNA合成酶有至少一个，且选自在真核细胞中具有正交可能性的候选氨酰tRNA合成酶；
在判断氨酰tRNA合成酶是否与预定候选氨酰tRNA合成酶序列类似时，采用生物大分子序列比对搜索工具BLAST进行比对并按预设条件进行鉴别；
搜寻过程包括：在搜寻目标的基因组数据中搜寻并获取与候选氨酰tRNA合成酶对应的候选配对tRNA。
6.根据权利要求3所述的巨型病毒或巨型噬菌体来源的氨酰tRNA合成酶/tRNA正交体系构建方法，其特征是，在搜寻原核细胞内候选配对tRNA时，将现有技术中用于原核生物的氨酰tRNA合成酶/tRNA正交体系中与候选氨酰tRNA合成酶对应的tRNA列入原核细胞内候选配对tRNA中；或者，在搜寻真核细胞内候选配对tRNA时，将现有技术中用于真核生物的氨酰tRNA合成酶/tRNA正交体系中与候选氨酰tRNA合成酶对应的tRNA列入真核细胞内候选配对tRNA中。
7.根据权利要求1所述的巨型病毒或巨型噬菌体来源的氨酰tRNA合成酶/tRNA正交体系构建方法，其特征是，第三步中，在预设原核宿主中检测正交性的过程包括：
S1、先判断各原核细胞内候选配对tRNA是否在现有技术中已确定在原核生物中具有正交性，若是则保留该原核细胞内候选配对tRNA，若否则在预设原核宿主中检测原核细胞内候选配对tRNA相对于该宿主内源性氨酰tRNA合成酶的正交性，并保留具有正交性的原核细胞内候选配对tRNA；
S2、将候选氨酰tRNA合成酶与S1所得原核细胞内候选配对tRNA分别配对，在预设原核宿主中检测各配对的活性，并保留具有活性的配对，此即原核正交体系；
在预设真核宿主中检测正交性的过程包括：
T1、先判断各真核细胞内候选配对tRNA是否在现有技术中已确定在真核生物中具有正交性，若是则保留该真核细胞内候选配对tRNA，若否则在预设真核宿主中检测真核细胞内候选配对tRNA相对于该宿主内源性氨酰tRNA合成酶的正交性，并保留具有正交性的真核细胞内候选配对tRNA；
T2、将候选氨酰tRNA合成酶与T1所得真核细胞内候选配对tRNA分别配对，在预设真核宿主中检测各配对的活性，并保留具有活性的配对，此即真核正交体系。
8.根据权利要求7所述的巨型病毒或巨型噬菌体来源的氨酰tRNA合成酶/tRNA正交体系构建方法，其特征是，第三步中，在预设原核宿主中检测正交性的过程还包括：
S3、在S1所得原核细胞内候选配对tRNA中选择来源于巨型病毒或巨型噬菌体的tRNA，将其与现有技术中用于原核生物的氨酰tRNA合成酶/tRNA正交体系中的氨酰tRNA合成酶分别配对，在预设原核宿主中检测各配对的活性，保留具有活性的配对，并列入原核正交体系；
或者，第三步中，在预设真核宿主中检测正交性的过程还包括：
T3、在T1所得真核细胞内候选配对tRNA中选择来源于巨型病毒或巨型噬菌体的tRNA，将其与现有技术中用于真核生物的氨酰tRNA合成酶/tRNA正交体系中的氨酰tRNA合成酶分别配对，在预设真核宿主中检测各配对的活性，保留具有活性的配对，并列入真核正交体系；
或者，第三步在预设原核宿主中检测正交性的过程的S2中：在配对前，将在真核细胞中具有正交可能性的候选氨酰tRNA合成酶剔除；若有候选氨酰tRNA合成酶经配对并在预设真核宿主中检测具有活性，则将该候选氨酰tRNA合成酶剔除；剔除的候选氨酰tRNA合成酶不予配对并在预设原核宿主中检测正交性；
或者，第三步在预设真核宿主中检测正交性的过程的T2中：在配对前，将在原核细胞中具有正交可能性的候选氨酰tRNA合成酶剔除；若有候选氨酰tRNA合成酶经配对并在预设原核宿主中检测具有活性，则将该候选氨酰tRNA合成酶剔除；剔除的候选氨酰tRNA合成酶不予配对并在预设真核宿主中检测正交性。
9.由权利要求1至8任一项所述巨型病毒或巨型噬菌体来源的氨酰tRNA合成酶/tRNA正交体系构建方法获得的氨酰tRNA合成酶/tRNA正交体系。
10.根据权利要求9所述的氨酰tRNA合成酶/tRNA正交体系，其特征是，所述氨酰tRNA合成酶/tRNA正交体系为原核正交体系，且选自：KSRS/TV2tRNA、KSRS/TV3tRNA、CTRS/TV2tRNA、CTRS/TV3tRNA、OPRS/TV2tRNA、OPRS/TV3tRNA、HKRS/TV2tRNA、HKRS/TV3tRNA、TPRS/TV2tRNA、TPRS/TV3tRNA、MGRS/TV2tRNA、MGRS/TV3tRNA、MORS/TV2tRNA、MORS/TV3tRNA、PDDRS/TV2tRNA、PDDRS/TV3tRNA、TTRS/TV2tRNA、TTRS/TV3tRNA、MVRS/TV3tRNA、3523RS/TV3tRNA、KSRS/MjtRNA、CTRS/MjtRNA、OPRS/MjtRNA、HKRS/MjtRNA、TPRS/MjtRNA、MGRS/MjtRNA、MORS/MjtRNA、PDDRS/MjtRNA、TTRS/MjtRNA、MVRS/MjtRNA、MJRS/TV2tRNA、MJRS/TV3tRNA；其中，KSRS序列如SEQ ID No.1所示，CTRS序列如SEQ ID No.2所示，OPRS序列如SEQ ID No.3所示，HKRS序列如SEQ ID No.4所示，TPRS序列如SEQ ID No.5所示，MGRS序列如SEQ ID No.6所示，MORS序列如SEQ ID No.7所示，PDDRS序列如SEQ ID No.8所示，TTRS序列如SEQ ID No.9所示，MVRS序列如SEQ ID No.10所示，3523RS序列如SEQ ID No.11所示，MJRS序列如SEQ ID No.12所示；TV2tRNA序列如SEQ ID No.13所示，TV3tRNA序列如SEQ ID No.14所示，MjtRNA序列如SEQ ID No.15或SEQ ID No.16所示；
所述氨酰tRNA合成酶/tRNA正交体系为真核正交体系，且选自：3401RS/GTGtRNA、3401RS/PS17tRNA、3401RS/SI19tRNA；其中，3401RS序列如SEQ ID No.17所示，GTGtRNA序列如SEQ ID No.18所示，PS17tRNA序列如SEQ ID No.19所示，SI19tRNA序列如SEQ ID No.20所示。
11.权利要求9或10所述氨酰tRNA合成酶/tRNA正交体系的用途，其特征是，所述用途为向目标多肽或蛋白引入非天然氨基酸。
12.含有权利要求9或10所述氨酰tRNA合成酶/tRNA正交体系的翻译系统。
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