CN113481228A - 微生物非天然氨基酸引入体系及构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及微生物非天然氨基酸引入体系及构建方法，尤其是基于巨型病毒或巨型噬菌体来源氨酰tRNA合成酶的微生物非天然氨基酸引入体系的构建方法，及其构建所得的正交体系。该构建方法包括：选择由野生型氨酰tRNA合成酶和相应tRNA构成的正交对；在野生型氨酰tRNA合成酶的氨基酸序列中选择至少一个氨基酸残基作为突变位点，并以此构建突变文库；采用目标非天然氨基酸对突变文库进行筛选并获得突变型氨酰tRNA合成酶；突变型氨酰tRNA合成酶与相应tRNA构成的正交对即针对目标非天然氨基酸的微生物非天然氨基酸引入体系。本发明构建方法能获得针对目标非天然氨基酸的突变正交对作为引入目标非天然氨基酸的工具。
Description
技术领域
本发明涉及微生物非天然氨基酸引入体系及构建方法，尤其是基于巨型病毒或巨型噬菌体来源氨酰tRNA合成酶的微生物非天然氨基酸引入体系的构建方法，其构建所得的正交体系可用于引入目标非天然氨基酸，属于生物化学技术领域。
背景技术
遗传密码子扩增技术(GCE)是将非天然氨基酸(ncAAs)定点引入到蛋白质中、丰富对蛋白质结构功能改造和研究的工具，该技术的核心是相对细胞内源性翻译系统正交的氨酰tRNA合成酶对(aaRS/tRNA)的开发。
尽管经过二十年的研究发展，科研工作者从古生菌、原核生物、真核生物中发现了一系列的正交酶对如GluRS/tRNA、LeuRS/tRNA、LysRS/tRNA、PylRS/tRNA、SepRS/tRNA、TyrRS/tRNA、GlnRS/tRNA、AspRS/tRNA，但多数酶对因为正交性和活性的问题实际应用性较差。目前常用的酶对只有古生菌詹氏甲烷球菌Methanococcus jannaschii来源的TyrRS/tRNA酶对和甲烷八叠球菌Methanosarcina来源的PylRS/tRNA酶对两种酶对，因此开发全新高活性和正交性的酶对十分重要。
近几年伴随大量巨型病毒和巨型噬菌体基因组测序结果公布，发明人课题组发现部分巨型病毒和巨型噬菌体基因组中携带有aaRS及tRNA的碎片，并经进一步研究构建出含多种巨型病毒/巨型噬菌体来源氨酰tRNA合成酶的正交对(即aaRS/tRNA)，该研究成果已申请了发明专利。在该研究成果的基础上，发明人课题组经进一步研究获得了新的研究成果，并以此申报本发明专利。
发明内容
本发明的目的在于：根据发明人最新的研究成果，提出一种基于巨型病毒或巨型噬菌体来源氨酰tRNA合成酶的微生物非天然氨基酸引入体系的构建方法，并提出由该方法构建获得的正交体系。
本发明解决其技术问题的技术方案如下：
一种基于巨型病毒或巨型噬菌体来源氨酰tRNA合成酶的微生物非天然氨基酸引入体系的构建方法，其特征是，包括以下步骤：
第一步、选择由野生型氨酰tRNA合成酶和相应tRNA构成的正交对；所述野生型氨酰tRNA合成酶来源于巨型病毒或巨型噬菌体；
第二步、在野生型氨酰tRNA合成酶的氨基酸序列中选择至少一个氨基酸残基作为突变位点，并以此构建突变文库；
第三步、采用目标非天然氨基酸对突变文库进行筛选并获得突变型氨酰tRNA合成酶；所述突变型氨酰tRNA合成酶与相应tRNA构成的正交对即针对目标非天然氨基酸的微生物非天然氨基酸引入体系。
该方法在含巨型病毒或巨型噬菌体来源氨酰tRNA合成酶的正交对基础上，能获得针对目标非天然氨基酸的突变正交对，作为引入目标非天然氨基酸的工具。
本发明构建方法进一步完善的技术方案如下：
优选地，第一步中，所述野生型氨酰tRNA合成酶为酪氨酰tRNA合成酶；所述tRNA为与酪氨酰tRNA合成酶相应的Tyr-tRNA。
采用该优选方案，可进一步优化氨酰tRNA合成酶/tRNA的具体类型。
优选地，第二步中，选择的氨基酸残基选自：野生型氨酰tRNA合成酶氨基酸序列中与相应酶底物相互作用的氨基酸残基。
采用该优选方案，可进一步优化突变位点的具体选择范围。
优选地，第三步中，筛选过程包括至少一轮正向筛选和至少一轮负向筛选；筛选后通过活性检测即获得突变型氨酰tRNA合成酶。
采用该优选方案，可进一步优化具体筛选过程。
更优选地，第一步中，所述酪氨酰tRNA合成酶为序列如SEQ ID No.1所示的MVRS，所述Tyr-tRNA为序列如SEQ ID No.2所示的TV3tRNA；第二步中，所述酶底物为酪氨酸，选择的氨基酸残基为MVRS中与酪氨酸相互作用的5个氨基酸残基42Y、76Y、176D、177V、180L，以这些突变位点构建MVRS的突变文库；第三步中，筛选前将MVRS突变文库分别构建于卡那霉素抗性的质粒中，正向筛选时先将构建好的质粒或上一轮筛选所得质粒电转至pET11a-TetR-CmR-TV3tRNA-DH10B电转感受态细胞中、再进行培养筛选，负向筛选时先将构建好的质粒或上一轮筛选所得质粒电转至pET11a-Amp-Barnase-TV3tRNA-DH10B电转感受态细胞中、再进行培养筛选；所述目标非天然氨基酸为4-甲砜苯丙氨酸、3-甲氧基苯丙氨酸、4-乙基苯丙氨酸、4-乙氧基苯丙氨酸、3-氯-4-氟苯丙氨酸、3-氟-4-氯苯丙氨酸、4-三氟甲氧基苯丙氨酸、4-甲硫基苯丙氨酸、3-氰基苯丙氨酸、4-氰基苯丙氨酸、3-溴-4-甲氧基苯丙氨酸、4-氯苯丙氨酸、3-氯苯丙氨酸、4-碘苯丙氨酸、4-溴苯丙氨酸、3-溴苯丙氨酸、4-甲基苯丙氨酸、3-甲基苯丙氨酸、4-炔丙氧基苯丙氨酸、3-硝基-4-炔丙氧基苯丙氨酸、4-叠氮苯丙氨酸、4-甲氧基苯丙氨酸、对二苯甲酮丙氨酸、对苄氧基苯丙氨酸、4-异丙氧基苯丙氨酸、4-三氟甲基苯丙氨酸、4-苯基苯丙氨酸、4-异丙基苯丙氨酸、O-叔丁基苯丙氨酸之一；所述微生物为原核生物。
采用该优选方案，可进一步优化各步骤中更具体的细节特征。其中，MVRS为巨型病毒Acanthamoeba polyphaga mimivirus来源的酪氨酰tRNA合成酶，TV3tRNA是琥珀抑制型tRNA；42Y、76Y、176D、177V、180L依次指42位Tyr、76位Tyr、176位Asp、177位Val、180位Leu；此外，Tet指四环素，Cm指氯霉素，Amp指氨苄西林，Barnase指核糖核酸酶，卡那霉素的缩写为Kan。
本发明还提出：
由前文所述构建方法获得的针对目标非天然氨基酸的氨酰tRNA合成酶/tRNA正交体系。
优选地，所述氨酰tRNA合成酶/tRNA正交体系为：1号或2号突变型MVRS/TV3tRNA，1号突变型MVRS序列如SEQ ID No.3所示，2号突变型MVRS序列如SEQ ID No.4所示，TV3tRNA序列如SEQ ID No.2所示，且针对的目标非天然氨基酸为4-甲砜苯丙氨酸、3-甲氧基苯丙氨酸、4-乙基苯丙氨酸、4-乙氧基苯丙氨酸、3-氯-4-氟苯丙氨酸、3-氟-4-氯苯丙氨酸、4-三氟甲氧基苯丙氨酸、4-甲硫基苯丙氨酸、3-氰基苯丙氨酸、4-氰基苯丙氨酸、3-溴-4-甲氧基苯丙氨酸、4-氯苯丙氨酸、3-氯苯丙氨酸、4-碘苯丙氨酸、4-溴苯丙氨酸、3-溴苯丙氨酸、4-甲基苯丙氨酸、3-甲基苯丙氨酸、4-炔丙氧基苯丙氨酸、4-叠氮苯丙氨酸、4-甲氧基苯丙氨酸、对二苯甲酮丙氨酸、对苄氧基苯丙氨酸、4-异丙氧基苯丙氨酸、4-三氟甲基苯丙氨酸、4-异丙基苯丙氨酸之一；
或者，所述氨酰tRNA合成酶/tRNA正交体系为：3号或4号或5号突变型MVRS/TV3tRNA，3号突变型MVRS序列如SEQ ID No.5所示，4号突变型MVRS序列如SEQ ID No.6所示，5号突变型MVRS序列如SEQ ID No.7所示，TV3tRNA序列如SEQ ID No.2所示，且针对的目标非天然氨基酸为4-甲砜苯丙氨酸、3-甲氧基苯丙氨酸、4-乙基苯丙氨酸、4-乙氧基苯丙氨酸、3-氯-4-氟苯丙氨酸、3-氟-4-氯苯丙氨酸、4-三氟甲氧基苯丙氨酸、4-甲硫基苯丙氨酸、3-氰基苯丙氨酸、4-氰基苯丙氨酸、3-溴-4-甲氧基苯丙氨酸、4-氯苯丙氨酸、3-氯苯丙氨酸、4-碘苯丙氨酸、4-溴苯丙氨酸、3-溴苯丙氨酸、4-甲基苯丙氨酸、3-甲基苯丙氨酸、4-炔丙氧基苯丙氨酸、3-硝基-4-炔丙氧基苯丙氨酸、4-叠氮苯丙氨酸、4-甲氧基苯丙氨酸、对二苯甲酮丙氨酸、对苄氧基苯丙氨酸、4-异丙氧基苯丙氨酸、4-三氟甲基苯丙氨酸、4-异丙基苯丙氨酸之一；
或者，所述氨酰tRNA合成酶/tRNA正交体系为：6号突变型MVRS/TV3tRNA，6号突变型MVRS序列如SEQ ID No.8所示，TV3tRNA序列如SEQ ID No.2所示，且针对的目标非天然氨基酸为4-甲砜苯丙氨酸、3-甲氧基苯丙氨酸、4-乙基苯丙氨酸、4-乙氧基苯丙氨酸、3-氯-4-氟苯丙氨酸、3-氟-4-氯苯丙氨酸、4-三氟甲氧基苯丙氨酸、4-甲硫基苯丙氨酸、4-氰基苯丙氨酸、3-溴-4-甲氧基苯丙氨酸、4-氯苯丙氨酸、4-碘苯丙氨酸、4-溴苯丙氨酸、4-甲基苯丙氨酸、3-甲基苯丙氨酸、4-炔丙氧基苯丙氨酸、4-叠氮苯丙氨酸、4-甲氧基苯丙氨酸、对二苯甲酮丙氨酸、对苄氧基苯丙氨酸、4-异丙氧基苯丙氨酸、4-三氟甲基苯丙氨酸、4-苯基苯丙氨酸、4-异丙基苯丙氨酸、O-叔丁基苯丙氨酸之一；
或者，所述氨酰tRNA合成酶/tRNA正交体系为：7号突变型MVRS/TV3tRNA，7号突变型MVRS序列如SEQ ID No.9所示，TV3tRNA序列如SEQ ID No.2所示，且针对的目标非天然氨基酸为4-甲砜苯丙氨酸、3-甲氧基苯丙氨酸、4-乙氧基苯丙氨酸、4-三氟甲氧基苯丙氨酸、4-甲硫基苯丙氨酸、3-氰基苯丙氨酸、3-溴-4-甲氧基苯丙氨酸、3-甲基苯丙氨酸、3-硝基-4-炔丙氧基苯丙氨酸、4-甲氧基苯丙氨酸、对二苯甲酮丙氨酸、对苄氧基苯丙氨酸、4-异丙氧基苯丙氨酸、4-异丙基苯丙氨酸、O-叔丁基苯丙氨酸之一；
或者，所述氨酰tRNA合成酶/tRNA正交体系为：8号突变型MVRS/TV3tRNA，8号突变型MVRS序列如SEQ ID No.10所示，TV3tRNA序列如SEQ ID No.2所示，且针对的目标非天然氨基酸为4-炔丙氧基苯丙氨酸、对二苯甲酮丙氨酸、对苄氧基苯丙氨酸、4-苯基苯丙氨酸、O-叔丁基苯丙氨酸之一。
上述正交体系可将29种苯丙氨基衍生物正交性且高引入效率定点插入到目标蛋白(如增强型绿色荧光蛋白eGFP等)中至少一个位点。
此外，本发明还提出：
前文所述氨酰tRNA合成酶/tRNA正交体系的用途，其特征是，所述用途为向目标多肽或蛋白引入非天然氨基酸。
含有前文所述氨酰tRNA合成酶/tRNA正交体系的翻译系统。
含有前文所述翻译系统的宿主细胞。
与现有技术相比，本发明构建方法在含巨型病毒或巨型噬菌体来源氨酰tRNA合成酶的正交对基础上，能获得针对目标非天然氨基酸的突变正交对作为引入目标非天然氨基酸的工具，尤其是所得MVRS突变正交对，不识别天然苯丙氨酸和酪氨酸，可以直接在LB培养基中正交性引入大量不同结构苯丙氨酸衍生物，这也为以非天然氨基酸为砌块的酶定向进化奠定了基础。
附图说明
图1为本发明具体实施时涉及的目标非天然氨基酸结构图。
图2、图3分别为本发明实施例1活性检测的相应结果图。
图4至图11分别为本发明实施例2各MVRS突变株的检测结果图。
具体实施方式
在具体实施时，本发明基于巨型病毒或巨型噬菌体来源氨酰tRNA合成酶的微生物非天然氨基酸引入体系的构建方法，包括以下步骤：
第一步、选择由野生型氨酰tRNA合成酶和相应tRNA构成的正交对；野生型氨酰tRNA合成酶来源于巨型病毒或巨型噬菌体。
其中，野生型氨酰tRNA合成酶为酪氨酰tRNA合成酶；tRNA为与酪氨酰tRNA合成酶相应的Tyr-tRNA。
例如：酪氨酰tRNA合成酶为序列如SEQ ID No.1所示的MVRS，Tyr-tRNA为序列如SEQ ID No.2所示的TV3tRNA。
第二步、在野生型氨酰tRNA合成酶的氨基酸序列中选择至少一个氨基酸残基作为突变位点，并以此构建突变文库。
其中，选择的氨基酸残基选自：野生型氨酰tRNA合成酶氨基酸序列中与相应酶底物相互作用的氨基酸残基。
例如：酶底物为酪氨酸，选择的氨基酸残基为MVRS中与酪氨酸相互作用的5个氨基酸残基42Y、76Y、176D、177V、180L，以这些突变位点构建MVRS的突变文库。
第三步、采用目标非天然氨基酸对突变文库进行筛选并获得突变型氨酰tRNA合成酶；突变型氨酰tRNA合成酶与相应tRNA构成的正交对即针对目标非天然氨基酸的微生物非天然氨基酸引入体系。
其中，筛选过程包括至少一轮正向筛选和至少一轮负向筛选；筛选后通过活性检测即获得突变型氨酰tRNA合成酶。
例如：筛选前将MVRS突变文库分别构建于卡那霉素抗性的质粒中，正向筛选时先将构建好的质粒或上一轮筛选所得质粒电转至pET11a-TetR-CmR-TV3tRNA-DH10B电转感受态细胞中、再进行培养筛选，负向筛选时先将构建好的质粒或上一轮筛选所得质粒电转至pET11a-Amp-Barnase-TV3tRNA-DH10B电转感受态细胞中、再进行培养筛选。
例如：目标非天然氨基酸为4-甲砜苯丙氨酸、3-甲氧基苯丙氨酸、4-乙基苯丙氨酸、4-乙氧基苯丙氨酸、3-氯-4-氟苯丙氨酸、3-氟-4-氯苯丙氨酸、4-三氟甲氧基苯丙氨酸、4-甲硫基苯丙氨酸、3-氰基苯丙氨酸、4-氰基苯丙氨酸、3-溴-4-甲氧基苯丙氨酸、4-氯苯丙氨酸、3-氯苯丙氨酸、4-碘苯丙氨酸、4-溴苯丙氨酸、3-溴苯丙氨酸、4-甲基苯丙氨酸、3-甲基苯丙氨酸、4-炔丙氧基苯丙氨酸、3-硝基-4-炔丙氧基苯丙氨酸、4-叠氮苯丙氨酸、4-甲氧基苯丙氨酸、对二苯甲酮丙氨酸、对苄氧基苯丙氨酸、4-异丙氧基苯丙氨酸、4-三氟甲基苯丙氨酸、4-苯基苯丙氨酸、4-异丙基苯丙氨酸、O-叔丁基苯丙氨酸之一。这些苯丙氨酸衍生物(共29个)具体结构图如图1所示。
例如：微生物为原核生物。
下面参照附图并结合实施例对本发明作进一步详细描述。但是本发明不限于所给出的例子。各实施例中，所用方法如无特别说明均为常规方法，所用试剂和材料如无特别说明均为市售品。
实施例1
本实施例为构建获得针对目标非天然氨基酸：4-甲氧基苯丙氨酸(下称O-CH3-Phe)的微生物非天然氨基酸引入体系。
本实施例基本内容与前文所述本发明具体实施的技术方案一致。
本实施例具体内容如下：
第一步，选择的正交对为：
其中，MVRS为巨型病毒Acanthamoeba polyphaga mimivirus来源的酪氨酰tRNA合成酶、且序列如SEQ ID No.1所示，
来源于Tupanvirus且为琥珀抑制型tRNA、且序列如SEQ ID No.2所示。
第二步，由PDB蛋白数据(数据来源为http://www1.rcsb.org/)获得利用MVRS晶体结构数据(2J5B)，对MVRS合成酶活性位点Tyr底物对位芳香环周围
的氨基酸残基进行分析，选择与底物Tyr芳香环有相互作用的5个氨基酸残基42Y、76Y、176D、177V、180L作为突变位点，并以此构建突变文库。本实施例中突变为随机突变。
第三步，先将MVRS突变文库分别构建于卡那霉素抗性的质粒中，然后进行共五轮的正负筛选，依次为：正向筛选-负向筛选-正向筛选-负向筛选-正向筛选。
正向筛选：将pEvolve-MVRS(库)-Kan文库质粒电转到
电转感受态细胞，均匀涂布在直径15cm LB固体培养皿中。LB固体培养基筛选抗生素及其它主要添加物分别为10μg/mL Tet、50μg/mL Kan、60μg/mL Cm、2mM O-CH3-Phe和0.2％阿拉伯糖，当平板内固体培养基全部吸收后倒扣放置37℃恒温培养箱中培养36h。将平板内的菌体用LB培养基洗下来并全部转移到100mL含10μg/mL Tet、50μg/mLKan、60μg/mL Cm、2mM O-CH3-Phe和0.2％阿拉伯糖的LB培养基中，放置恒温振荡器中37℃/220rpm培养过夜，次日用质粒大提试剂盒提取质粒。
负向筛选：将上一轮阳性筛选pEvolve-MVRS-Kan文库质粒电转到
电转感受态细胞中。均匀涂布在直径15cm LB固体培养基中，LB固体培养基筛选抗生素及其它主要添加物分别为100μg/mL Amp、50μgμg/mL Kan和0.2％阿拉伯糖，当平板内固体培养基全部吸收后倒扣放置37℃恒温培养箱中培养24h。将平板内的菌体用LB培养基洗下来并全部转移到含100μg/mL Amp、50μg/mL Kan、和0.2％阿拉伯糖的LB培养基中，放置恒温振荡器中37℃/220rpm培养过夜，次日用质粒大提试剂盒提取质粒。
MVRS突变文库经过上述三轮正向筛选(也称阳性筛选)和两轮负向筛选(也称阴性筛选)，最后在第三轮正向筛选所得各平板上共挑取164个不同的单克隆分别与
共转DH10B，获得164株MVRS突变体和pBAD-EGFP(149TAG)-TV3tRNA的共转细胞株。
活性检测：将上述164个共转细胞株按编号1至164号分别取100μL加入到96深孔平板中，其中0编号为对照组MVRS野生型与
共转DH10B。96孔深孔平板放入放置恒温振荡器中37℃/220rpm培养3h后，每孔加入100μL预混20％阿拉伯糖8μL和100mM O-CH3-Phe 8μL的LB培养基。同时每块96深孔板都有对应对照组和阴性组，其中，对照组加入阿拉伯糖诱导剂、但不添加O-CH3-Phe，阴性组既不添加阿拉伯糖诱导剂、也不添加O-CH3-Phe。所有平板放置恒温振荡器中37℃/220rpm培养过夜，其中，阴性组用于种子液保存，次日加入终浓度为10％甘油混匀放-80℃保存备用。次日用排枪从96孔深孔平板每孔吸取150μL菌液，对应加入到96孔圆底的细胞平板配平后放入离心机4000rpm离心10min，离心完成后迅速倒扣弃上清。96孔圆底的细胞平板放入凝胶成像仪中，选择荧光模式为蓝光过滤片，曝光时间120ms，保存图片数据用于后续分析(如图2所示)。经此初步筛选获得7个MVRS突变株。
注：图2中：(1)受96孔板孔位数量限制，分两块板进行筛选操作，A图和C图为板1(plate1)，B图和D图为板2(plate2)；(2)A图和B图为两块板添加O-CH3-Phe前的检测结果，C图和D图为添加O-CH3-Phe后的检测结果；(3)各图左上角顶点处为对照组(即未添加O-CH3-Phe的对照组)；(4)C图中有7个箭头所指位点在对应Blank板(A图)中未见到光斑，且在加入O-CH3-Phe后出现光斑，说明这些酶突变株能识别筛选O-CH3-Phe。
将上述初步筛选到的7个MVRS突变株，分别1:100接种到20mL Amp/Kan抗性的LB培养基中37℃/220rpm培养3h左右，测菌生长状态OD600至0.8时，加入终浓度为1mM O-CH3-Phe和0.15％阿拉伯糖，同时设置对照组加入阿拉伯糖诱导剂、但不添加O-CH3-Phe，并继续诱导培养10h。次日用多功能酶标仪检测各组荧光强度(激发波长480nm、发射波长530nm)，所有检测实验均重复三次。结果如图3所示。该结果表明：这7个MVRS突变株均能识别O-CH3-Phe，因此，这7个突变型MVRS分别与
构成的正交对即针对目标非天然氨基酸O-CH3-Phe的微生物非天然氨基酸引入体系。将这7个突变型MVRS依次记作1号至7号突变型MVRS，其序列依次如SEQ ID No.3至SEQ ID No.9所示。
实施例2
本实施例为构建获得针对图1中其它目标非天然氨基酸(苯丙氨酸衍生物)的微生物非天然氨基酸引入体系。
本实施例直接采用实施例1中经过共五轮的正负筛选后获得的164株MVRS突变体和pBAD-EGFP(149TAG)-TV3tRNA的共转细胞株，按照实施例1的活性检测方法，直接检测其是否能识别图1中其它目标非天然氨基酸(苯丙氨酸衍生物)。检测时，仅将目标非天然氨基酸进行替换，其余条件均不变。
将最终所得结果与实施例1合并后得知，共筛选获得8个MVRS突变株共同覆盖识别图1中的29种苯丙氨酸衍生物。具体结果如下。
(1)1号、2号MVRS突变株分别能将26种系列苯丙氨酸衍生物氨酰化对应
在大肠杆菌细胞内编码目标蛋白的核酸，这26种系列苯丙氨酸衍生物分别为：图1中的1-19号、21-26号、28号，即：
4-甲砜苯丙氨酸、3-甲氧基苯丙氨酸、4-乙基苯丙氨酸、4-乙氧基苯丙氨酸、3-氯-4-氟苯丙氨酸、3-氟-4-氯苯丙氨酸、4-三氟甲氧基苯丙氨酸、4-甲硫基苯丙氨酸、3-氰基苯丙氨酸、4-氰基苯丙氨酸、3-溴-4-甲氧基苯丙氨酸、4-氯苯丙氨酸、3-氯苯丙氨酸、4-碘苯丙氨酸、4-溴苯丙氨酸、3-溴苯丙氨酸、4-甲基苯丙氨酸、3-甲基苯丙氨酸、4-炔丙氧基苯丙氨酸、4-叠氮苯丙氨酸、4-甲氧基苯丙氨酸、对二苯甲酮丙氨酸、对苄氧基苯丙氨酸、4-异丙氧基苯丙氨酸、4-三氟甲基苯丙氨酸、4-异丙基苯丙氨酸。
检测结果如图4、图5所示。
1号突变型MVRS序列如SEQ ID No.3所示，2号突变型MVRS序列如SEQ ID No.4所示。
(2)3号、4号、5号MVRS突变株分别能将27种系列苯丙氨酸衍生物氨酰化对应
在大肠杆菌细胞内编码目标蛋白的核酸，这27种系列苯丙氨酸衍生物分别为：图1中的1-26号、28号，即：
4-甲砜苯丙氨酸、3-甲氧基苯丙氨酸、4-乙基苯丙氨酸、4-乙氧基苯丙氨酸、3-氯-4-氟苯丙氨酸、3-氟-4-氯苯丙氨酸、4-三氟甲氧基苯丙氨酸、4-甲硫基苯丙氨酸、3-氰基苯丙氨酸、4-氰基苯丙氨酸、3-溴-4-甲氧基苯丙氨酸、4-氯苯丙氨酸、3-氯苯丙氨酸、4-碘苯丙氨酸、4-溴苯丙氨酸、3-溴苯丙氨酸、4-甲基苯丙氨酸、3-甲基苯丙氨酸、4-炔丙氧基苯丙氨酸、3-硝基-4-炔丙氧基苯丙氨酸、4-叠氮苯丙氨酸、4-甲氧基苯丙氨酸、对二苯甲酮丙氨酸、对苄氧基苯丙氨酸、4-异丙氧基苯丙氨酸、4-三氟甲基苯丙氨酸、4-异丙基苯丙氨酸。
检测结果如图6、图7、图8所示。
3号突变型MVRS序列如SEQ ID No.5所示，4号突变型MVRS序列如SEQ ID No.6所示，5号突变型MVRS序列如SEQ ID No.7所示。
(3)6号MVRS突变株能将25种系列苯丙氨酸衍生物氨酰化对应
在大肠杆菌细胞内编码目标蛋白的核酸，这25种系列苯丙氨酸衍生物分别为：图1中的1-8号、10-12号、14-15号、17-19号、21-29号，即：
4-甲砜苯丙氨酸、3-甲氧基苯丙氨酸、4-乙基苯丙氨酸、4-乙氧基苯丙氨酸、3-氯-4-氟苯丙氨酸、3-氟-4-氯苯丙氨酸、4-三氟甲氧基苯丙氨酸、4-甲硫基苯丙氨酸、4-氰基苯丙氨酸、3-溴-4-甲氧基苯丙氨酸、4-氯苯丙氨酸、4-碘苯丙氨酸、4-溴苯丙氨酸、4-甲基苯丙氨酸、3-甲基苯丙氨酸、4-炔丙氧基苯丙氨酸、4-叠氮苯丙氨酸、4-甲氧基苯丙氨酸、对二苯甲酮丙氨酸、对苄氧基苯丙氨酸、4-异丙氧基苯丙氨酸、4-三氟甲基苯丙氨酸、4-苯基苯丙氨酸、4-异丙基苯丙氨酸、O-叔丁基苯丙氨酸。
检测结果如图9所示。
6号突变型MVRS序列如SEQ ID No.8所示。
(4)7号MVRS突变株能将15种系列苯丙氨酸衍生物氨酰化对应
在大肠杆菌细胞内编码目标蛋白的核酸，这15种系列苯丙氨酸衍生物分别为：图1中的1、2、4、7、8、9、11、18、20、22、23、24、25、28、29号，即：
4-甲砜苯丙氨酸、3-甲氧基苯丙氨酸、4-乙氧基苯丙氨酸、4-三氟甲氧基苯丙氨酸、4-甲硫基苯丙氨酸、3-氰基苯丙氨酸、3-溴-4-甲氧基苯丙氨酸、3-甲基苯丙氨酸、3-硝基-4-炔丙氧基苯丙氨酸、4-甲氧基苯丙氨酸、对二苯甲酮丙氨酸、对苄氧基苯丙氨酸、4-异丙氧基苯丙氨酸、4-异丙基苯丙氨酸、O-叔丁基苯丙氨酸。
检测结果如图10所示。
7号突变型MVRS序列如SEQ ID No.9所示。
(5)8号MVRS突变株能将5种系列苯丙氨酸衍生物氨酰化对应
在大肠杆菌细胞内编码目标蛋白的核酸，这5种系列苯丙氨酸衍生物分别为：图1中的19、23、24、27、29号，即：
4-炔丙氧基苯丙氨酸、对二苯甲酮丙氨酸、对苄氧基苯丙氨酸、4-苯基苯丙氨酸、O-叔丁基苯丙氨酸。
检测结果如图11所示。
8号突变型MVRS序列如SEQ ID No.10所示。
综合以上内容可知，本实施例构建的各正交体系可将共29种苯丙氨基衍生物正交性且高引入效率定点插入到目标蛋白(如增强型绿色荧光蛋白eGFP等)中至少一个位点，即具备向目标多肽或蛋白引入非天然氨基酸的功能。
除上述实施例外，本发明还可以有其他实施方式。凡采用等同替换或等效变换形成的技术方案，均落在本发明要求的保护范围。
序列表
<110> 中国药科大学
<120> 微生物非天然氨基酸引入体系及构建方法
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 346
<212> PRT
<213> Acanthamoeba polyphaga mimivirus
<400> 1
Met Glu Asn Thr Asp His Thr Asn Asn Glu His Arg Leu Thr Gln Leu
1 5 10 15
Leu Ser Ile Ala Glu Glu Cys Glu Thr Leu Asp Arg Leu Lys Gln Leu
20 25 30
Val Asp Ser Gly Arg Ile Phe Thr Ala Tyr Asn Gly Phe Glu Pro Ser
35 40 45
Gly Arg Ile His Ile Ala Gln Ala Leu Ile Thr Val Met Asn Thr Asn
50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
Glu Leu Gly Arg Tyr Phe Ile Glu Val Phe Lys Ala Cys Gly Ile Asn
100 105 110
Leu Asp Gly Thr Arg Phe Ile Trp Ala Ser Glu Phe Ile Ala Ser Asn
115 120 125
Pro Ser Tyr Ile Glu Arg Met Leu Asp Ile Ala Glu Phe Ser Thr Ile
130 135 140
Ser Arg Val Lys Arg Cys Cys Gln Ile Met Gly Arg Asn Glu Ser Asp
145 150 155 160
Cys Leu Lys Ala Ser Gln Ile Phe Tyr Pro Cys Met Gln Ala Ala Asp
165 170 175
Val Phe Glu Leu Val Pro Glu Gly Ile Asp Ile Cys Gln Leu Gly Ile
180 185 190
Asp Gln Arg Lys Val Asn Met Leu Ala Ile Glu Tyr Ala Asn Asp Arg
195 200 205
Gly Leu Lys Ile Pro Ile Ser Leu Ser His His Met Leu Met Ser Leu
210 215 220
Ser Gly Pro Lys Lys Lys Met Ser Lys Ser Asp Pro Gln Gly Ala Ile
225 230 235 240
Phe Met Asp Asp Thr Glu Gln Glu Val Ser Glu Lys Ile Ser Arg Ala
245 250 255
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260 265 270
Tyr Leu Leu Leu Arg Trp Phe Gly Thr Leu Asn Leu Cys Gly Lys Ile
275 280 285
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290 295 300
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305 310 315 320
Leu Val Arg Glu His Phe Lys Lys Pro Glu Leu Ser Glu Leu Leu Ser
325 330 335
Asn Val Lys Ser Tyr Gln Gln Pro Ser Lys
340 345
<210> 2
<211> 74
<212> DNA/RNA
<213> Tupanvirus
<400> 2
cctgggttag tttaatggta aaacgaaagg ctctaaacct tttgatactg gttcgattcc 60
agtacctggg acca 74
<210> 3
<211> 346
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Met Glu Asn Thr Asp His Thr Asn Asn Glu His Arg Leu Thr Gln Leu
1 5 10 15
Leu Ser Ile Ala Glu Glu Cys Glu Thr Leu Asp Arg Leu Lys Gln Leu
20 25 30
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35 40 45
Gly Arg Ile His Ile Ala Gln Ala Leu Ile Thr Val Met Asn Thr Asn
50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
Ser Arg Val Lys Arg Cys Cys Gln Ile Met Gly Arg Asn Glu Ser Asp
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Cys Leu Lys Ala Ser Gln Ile Phe Tyr Pro Cys Met Gln Ala Ala Ser
165 170 175
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180 185 190
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195 200 205
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210 215 220
Ser Gly Pro Lys Lys Lys Met Ser Lys Ser Asp Pro Gln Gly Ala Ile
225 230 235 240
Phe Met Asp Asp Thr Glu Gln Glu Val Ser Glu Lys Ile Ser Arg Ala
245 250 255
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260 265 270
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275 280 285
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305 310 315 320
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325 330 335
Asn Val Lys Ser Tyr Gln Gln Pro Ser Lys
340 345
<210> 4
<211> 346
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Met Glu Asn Thr Asp His Thr Asn Asn Glu His Arg Leu Thr Gln Leu
1 5 10 15
Leu Ser Ile Ala Glu Glu Cys Glu Thr Leu Asp Arg Leu Lys Gln Leu
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35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
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145 150 155 160
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165 170 175
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180 185 190
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195 200 205
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210 215 220
Ser Gly Pro Lys Lys Lys Met Ser Lys Ser Asp Pro Gln Gly Ala Ile
225 230 235 240
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245 250 255
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260 265 270
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340 345
<210> 5
<211> 346
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Met Glu Asn Thr Asp His Thr Asn Asn Glu His Arg Leu Thr Gln Leu
1 5 10 15
Leu Ser Ile Ala Glu Glu Cys Glu Thr Leu Asp Arg Leu Lys Gln Leu
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50 55 60
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65 70 75 80
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225 230 235 240
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245 250 255
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260 265 270
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275 280 285
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290 295 300
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305 310 315 320
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325 330 335
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340 345
<210> 6
<211> 346
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
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65 70 75 80
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225 230 235 240
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245 250 255
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260 265 270
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340 345
<210> 7
<211> 346
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
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1 5 10 15
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65 70 75 80
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115 120 125
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<210> 8
<211> 346
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
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1 5 10 15
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340 345
<210> 9
<211> 346
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
Met Glu Asn Thr Asp His Thr Asn Asn Glu His Arg Leu Thr Gln Leu
1 5 10 15
Leu Ser Ile Ala Glu Glu Cys Glu Thr Leu Asp Arg Leu Lys Gln Leu
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<210> 10
<211> 346
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
Met Glu Asn Thr Asp His Thr Asn Asn Glu His Arg Leu Thr Gln Leu
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100 105 110
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115 120 125
Pro Ser Tyr Ile Glu Arg Met Leu Asp Ile Ala Glu Phe Ser Thr Ile
130 135 140
Ser Arg Val Lys Arg Cys Cys Gln Ile Met Gly Arg Asn Glu Ser Asp
145 150 155 160
Cys Leu Lys Ala Ser Gln Ile Phe Tyr Pro Cys Met Gln Ala Ala Gly
165 170 175
Val Phe Glu Ser Val Pro Glu Gly Ile Asp Ile Cys Gln Leu Gly Ile
180 185 190
Asp Gln Arg Lys Val Asn Met Leu Ala Ile Glu Tyr Ala Asn Asp Arg
195 200 205
Gly Leu Lys Ile Pro Ile Ser Leu Ser His His Met Leu Met Ser Leu
210 215 220
Ser Gly Pro Lys Lys Lys Met Ser Lys Ser Asp Pro Gln Gly Ala Ile
225 230 235 240
Phe Met Asp Asp Thr Glu Gln Glu Val Ser Glu Lys Ile Ser Arg Ala
245 250 255
Tyr Cys Thr Asp Glu Thr Phe Asp Asn Pro Ile Phe Glu Tyr Ile Lys
260 265 270
Tyr Leu Leu Leu Arg Trp Phe Gly Thr Leu Asn Leu Cys Gly Lys Ile
275 280 285
Tyr Thr Asp Ile Glu Ser Ile Gln Glu Asp Phe Ser Ser Met Asn Lys
290 295 300
Arg Glu Leu Lys Thr Asp Val Ala Asn Tyr Ile Asn Thr Ile Ile Asp
305 310 315 320
Leu Val Arg Glu His Phe Lys Lys Pro Glu Leu Ser Glu Leu Leu Ser
325 330 335
Asn Val Lys Ser Tyr Gln Gln Pro Ser Lys
340 345
Claims (10)
1.一种基于巨型病毒或巨型噬菌体来源氨酰tRNA合成酶的微生物非天然氨基酸引入体系的构建方法，其特征是，包括以下步骤：
第一步、选择由野生型氨酰tRNA合成酶和相应tRNA构成的正交对；所述野生型氨酰tRNA合成酶来源于巨型病毒或巨型噬菌体；
第二步、在野生型氨酰tRNA合成酶的氨基酸序列中选择至少一个氨基酸残基作为突变位点，并以此构建突变文库；
第三步、采用目标非天然氨基酸对突变文库进行筛选并获得突变型氨酰tRNA合成酶；所述突变型氨酰tRNA合成酶与相应tRNA构成的正交对即针对目标非天然氨基酸的微生物非天然氨基酸引入体系。
2.根据权利要求1所述的基于巨型病毒或巨型噬菌体来源氨酰tRNA合成酶的微生物非天然氨基酸引入体系的构建方法，其特征是，第一步中，所述野生型氨酰tRNA合成酶为酪氨酰tRNA合成酶；所述tRNA为与酪氨酰tRNA合成酶相应的Tyr-tRNA。
3.根据权利要求2所述的基于巨型病毒或巨型噬菌体来源氨酰tRNA合成酶的微生物非天然氨基酸引入体系的构建方法，其特征是，第二步中，选择的氨基酸残基选自：野生型氨酰tRNA合成酶氨基酸序列中与相应酶底物相互作用的氨基酸残基。
4.根据权利要求3所述的基于巨型病毒或巨型噬菌体来源氨酰tRNA合成酶的微生物非天然氨基酸引入体系的构建方法，其特征是，第三步中，筛选过程包括至少一轮正向筛选和至少一轮负向筛选；筛选后通过活性检测即获得突变型氨酰tRNA合成酶。
5.根据权利要求4所述的基于巨型病毒或巨型噬菌体来源氨酰tRNA合成酶的微生物非天然氨基酸引入体系的构建方法，其特征是，第一步中，所述酪氨酰tRNA合成酶为序列如SEQ ID No.1所示的MVRS，所述Tyr-tRNA为序列如SEQ ID No.2所示的TV3tRNA；第二步中，所述酶底物为酪氨酸，选择的氨基酸残基为MVRS中与酪氨酸相互作用的5个氨基酸残基42Y、76Y、176D、177V、180L，以这些突变位点构建MVRS的突变文库；第三步中，筛选前将MVRS突变文库分别构建于卡那霉素抗性的质粒中，正向筛选时先将构建好的质粒或上一轮筛选所得质粒电转至pET11a-TetR-CmR-TV3tRNA-DH10B电转感受态细胞中、再进行培养筛选，负向筛选时先将构建好的质粒或上一轮筛选所得质粒电转至pET11a-Amp-Barnase-TV3tRNA-DH10B电转感受态细胞中、再进行培养筛选；所述目标非天然氨基酸为4-甲砜苯丙氨酸、3-甲氧基苯丙氨酸、4-乙基苯丙氨酸、4-乙氧基苯丙氨酸、3-氯-4-氟苯丙氨酸、3-氟-4-氯苯丙氨酸、4-三氟甲氧基苯丙氨酸、4-甲硫基苯丙氨酸、3-氰基苯丙氨酸、4-氰基苯丙氨酸、3-溴-4-甲氧基苯丙氨酸、4-氯苯丙氨酸、3-氯苯丙氨酸、4-碘苯丙氨酸、4-溴苯丙氨酸、3-溴苯丙氨酸、4-甲基苯丙氨酸、3-甲基苯丙氨酸、4-炔丙氧基苯丙氨酸、3-硝基-4-炔丙氧基苯丙氨酸、4-叠氮苯丙氨酸、4-甲氧基苯丙氨酸、对二苯甲酮丙氨酸、对苄氧基苯丙氨酸、4-异丙氧基苯丙氨酸、4-三氟甲基苯丙氨酸、4-苯基苯丙氨酸、4-异丙基苯丙氨酸、O-叔丁基苯丙氨酸之一；所述微生物为原核生物。
6.由权利要求1至5任一项所述构建方法获得的针对目标非天然氨基酸的氨酰tRNA合成酶/tRNA正交体系。
7.根据权利要求6所述的针对目标非天然氨基酸的氨酰tRNA合成酶/tRNA正交体系，其特征是，所述氨酰tRNA合成酶/tRNA正交体系为：1号或2号突变型MVRS/TV3tRNA，1号突变型MVRS序列如SEQ ID No.3所示，2号突变型MVRS序列如SEQ ID No.4所示，TV3tRNA序列如SEQID No.2所示，且针对的目标非天然氨基酸为4-甲砜苯丙氨酸、3-甲氧基苯丙氨酸、4-乙基苯丙氨酸、4-乙氧基苯丙氨酸、3-氯-4-氟苯丙氨酸、3-氟-4-氯苯丙氨酸、4-三氟甲氧基苯丙氨酸、4-甲硫基苯丙氨酸、3-氰基苯丙氨酸、4-氰基苯丙氨酸、3-溴-4-甲氧基苯丙氨酸、4-氯苯丙氨酸、3-氯苯丙氨酸、4-碘苯丙氨酸、4-溴苯丙氨酸、3-溴苯丙氨酸、4-甲基苯丙氨酸、3-甲基苯丙氨酸、4-炔丙氧基苯丙氨酸、4-叠氮苯丙氨酸、4-甲氧基苯丙氨酸、对二苯甲酮丙氨酸、对苄氧基苯丙氨酸、4-异丙氧基苯丙氨酸、4-三氟甲基苯丙氨酸、4-异丙基苯丙氨酸之一；
或者，所述氨酰tRNA合成酶/tRNA正交体系为：3号或4号或5号突变型MVRS/TV3tRNA，3号突变型MVRS序列如SEQ ID No.5所示，4号突变型MVRS序列如SEQ ID No.6所示，5号突变型MVRS序列如SEQ ID No.7所示，TV3tRNA序列如SEQ ID No.2所示，且针对的目标非天然氨基酸为4-甲砜苯丙氨酸、3-甲氧基苯丙氨酸、4-乙基苯丙氨酸、4-乙氧基苯丙氨酸、3-氯-4-氟苯丙氨酸、3-氟-4-氯苯丙氨酸、4-三氟甲氧基苯丙氨酸、4-甲硫基苯丙氨酸、3-氰基苯丙氨酸、4-氰基苯丙氨酸、3-溴-4-甲氧基苯丙氨酸、4-氯苯丙氨酸、3-氯苯丙氨酸、4-碘苯丙氨酸、4-溴苯丙氨酸、3-溴苯丙氨酸、4-甲基苯丙氨酸、3-甲基苯丙氨酸、4-炔丙氧基苯丙氨酸、3-硝基-4-炔丙氧基苯丙氨酸、4-叠氮苯丙氨酸、4-甲氧基苯丙氨酸、对二苯甲酮丙氨酸、对苄氧基苯丙氨酸、4-异丙氧基苯丙氨酸、4-三氟甲基苯丙氨酸、4-异丙基苯丙氨酸之一；
或者，所述氨酰tRNA合成酶/tRNA正交体系为：6号突变型MVRS/TV3tRNA，6号突变型MVRS序列如SEQ ID No.8所示，TV3tRNA序列如SEQ ID No.2所示，且针对的目标非天然氨基酸为4-甲砜苯丙氨酸、3-甲氧基苯丙氨酸、4-乙基苯丙氨酸、4-乙氧基苯丙氨酸、3-氯-4-氟苯丙氨酸、3-氟-4-氯苯丙氨酸、4-三氟甲氧基苯丙氨酸、4-甲硫基苯丙氨酸、4-氰基苯丙氨酸、3-溴-4-甲氧基苯丙氨酸、4-氯苯丙氨酸、4-碘苯丙氨酸、4-溴苯丙氨酸、4-甲基苯丙氨酸、3-甲基苯丙氨酸、4-炔丙氧基苯丙氨酸、4-叠氮苯丙氨酸、4-甲氧基苯丙氨酸、对二苯甲酮丙氨酸、对苄氧基苯丙氨酸、4-异丙氧基苯丙氨酸、4-三氟甲基苯丙氨酸、4-苯基苯丙氨酸、4-异丙基苯丙氨酸、O-叔丁基苯丙氨酸之一；
或者，所述氨酰tRNA合成酶/tRNA正交体系为：7号突变型MVRS/TV3tRNA，7号突变型MVRS序列如SEQ ID No.9所示，TV3tRNA序列如SEQ ID No.2所示，且针对的目标非天然氨基酸为4-甲砜苯丙氨酸、3-甲氧基苯丙氨酸、4-乙氧基苯丙氨酸、4-三氟甲氧基苯丙氨酸、4-甲硫基苯丙氨酸、3-氰基苯丙氨酸、3-溴-4-甲氧基苯丙氨酸、3-甲基苯丙氨酸、3-硝基-4-炔丙氧基苯丙氨酸、4-甲氧基苯丙氨酸、对二苯甲酮丙氨酸、对苄氧基苯丙氨酸、4-异丙氧基苯丙氨酸、4-异丙基苯丙氨酸、O-叔丁基苯丙氨酸之一；
或者，所述氨酰tRNA合成酶/tRNA正交体系为：8号突变型MVRS/TV3tRNA，8号突变型MVRS序列如SEQ ID No.10所示，TV3tRNA序列如SEQ ID No.2所示，且针对的目标非天然氨基酸为4-炔丙氧基苯丙氨酸、对二苯甲酮丙氨酸、对苄氧基苯丙氨酸、4-苯基苯丙氨酸、O-叔丁基苯丙氨酸之一。
8.权利要求6或7所述氨酰tRNA合成酶/tRNA正交体系的用途，其特征是，所述用途为向目标多肽或蛋白引入非天然氨基酸。
9.含有权利要求6或7所述氨酰tRNA合成酶/tRNA正交体系的翻译系统。
10.含有权利要求9所述翻译系统的宿主细胞。
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114657156A (zh) * | 2022-03-11 | 2022-06-24 | 南京中医药大学 | 吡咯赖氨酸氨酰-tRNA合成酶突变体及其筛选系统和应用 |
| CN114672524A (zh) * | 2022-03-30 | 2022-06-28 | 吉林大学 | 一种双功能血红素蛋白催化非天然氨基酸衍生物的方法 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101223272A (zh) * | 2003-04-17 | 2008-07-16 | 斯克利普斯研究院 | 扩展真核生物遗传密码 |
-
2021
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Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101223272A (zh) * | 2003-04-17 | 2008-07-16 | 斯克利普斯研究院 | 扩展真核生物遗传密码 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| BASEM 等: "Clades of huge phages from across Earth’s Ecosystems", NATURE, vol. 578 * |
| JÔNATAS ABRAHÃO 等: "Tailed giant Tupanvirus possesses the most complete translational apparatus of the known virosphere", NATURE COMMUNICATIONS, vol. 9, pages 2 * |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114657156A (zh) * | 2022-03-11 | 2022-06-24 | 南京中医药大学 | 吡咯赖氨酸氨酰-tRNA合成酶突变体及其筛选系统和应用 |
| CN114672524A (zh) * | 2022-03-30 | 2022-06-28 | 吉林大学 | 一种双功能血红素蛋白催化非天然氨基酸衍生物的方法 |
| CN114672524B (zh) * | 2022-03-30 | 2024-01-26 | 吉林大学 | 一种催化非天然氨基酸衍生物的双功能血红素蛋白 |
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