CN103189522B - 新型人工翻译合成系统 - Google Patents
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Abstract
一种新型的人工翻译合成系统,其将结合了特殊氨基酸的tRNA添加到体外翻译系统,基于双重遗传密码表和人工密码子框分割,合成导入了特殊氨基酸的肽。
Description
技术领域
本发明涉及基于双重遗传密码表和人工密码子框((codonbox))分割的新型人工翻译合成系统。本发明人等将该方法命名为“柔性体外翻译系统(FlexibleIn-vitroTranslationsystem,FIT系统)”。
背景技术
1.翻译合成系统的优点、及其技术上的限制
翻译是生物体内普遍进行的蛋白质合成系统,其以编码遗传信息的mRNA作为设计图、由核糖体将20种蛋白质氨基酸依次连接起来,从而准确地合成蛋白质。能够像这样在精确的序列控制下将多种构件(buildingblock)聚合的系统的其它例子并不存在,可以说翻译是我们能够利用的最好的化合物精密合成系统。尤其是,在用于构建肽文库、从其中分离功能性肽的用途时,翻译合成与现有化学合成法相比具有多种优点。
翻译反应由于是mRNA序列依赖性的模板合成,因此在由具有随机序列的mRNA(或相应的DNA)进行翻译反应时,可以一气呵成地构建随机肽文库。进而,mRNA能够利用分子生物学方法进行扩增、序列的读取,因此还具有文库化合物的再合成、重叠合(deconvolution)(本技术中,是指对由随机肽文库浓缩的活性肽组进行分组,并对各序列进行测序)也容易的优点。进而,通过与以mRNA展示法为代表的体外展示技术组合,可以直接对作为翻译产物的各个肽用作为其模板的mRNA进行标记。即,对文库中的各肽分子添加能够扩增、读取的标签。由该文库中仅选择与靶蛋白质结合的活性种,通过RT-PCR扩增相应的mRNA再进行翻译,通过重复该操作,能够进行无法利用通常的化学合成文库实施的对进化分子工程的活性肽的选择和分离。
综上,在翻译系统中进行肽文库构建的优点可以列举:
1)容易获得丰富的多样性(~1013或其以上)、2)重叠合容易、3)能够进行文库的扩增、4)能够进行利用体外展示技术的分选法,等。
如上所述,核糖体翻译系统能够高效地构建高功能化的肽文库,但另一方面由于其为特化为制造天然蛋白质、肽的机构,因此具有通常仅能合成由20种蛋白质氨基酸构成的多肽这一致命弱点。即,含有在结构、官能团方面具有进一步变化(variation)的“特殊氨基酸”的肽,基本上是无法翻译合成的。本说明书中,“特殊氨基酸”是指所有的与蛋白质中常见的蛋白质氨基酸的结构不同的氨基酸。即,包括蛋白质氨基酸的侧链结构的一部分进行了化学上的变更、修饰而成的非蛋白质氨基酸、人工氨基酸、D型氨基酸、N-甲基氨基酸、N-酰基氨基酸、β-氨基酸等的全部。
2.目前为止所报道的改变遗传密码的方法
为了克服仅能够合成由20种蛋白质氨基酸构成的肽这样的、核糖体翻译系统的致命弱点,截至目前已经报道了几种改变遗传密码的方法。翻译中的密码子-氨基酸的对应关系即遗传密码是已知的,20种氨基酸的利用受到严格的限定。其概念如下:通过人工改变该对应关系从而能够利用20种以外的氨基酸。
被称为遗传密码扩展的方法中,利用天然翻译系统中未被指定氨基酸的终止密码子、人工4碱基密码子,给这些密码子分配蛋白质氨基酸以外的“21号氨基酸”,从而能够进行含有蛋白质氨基酸以外的氨基酸的蛋白质、肽的合成。但是终止密码子、能够利用的4碱基密码子数量有限,因此能够同时利用的非蛋白质氨基酸的数量存在上限(迄今为止所报道的例子中最多为3种,通常为2种或1种)。另一方面,2000年以后,开发了给从系统中去除蛋白质氨基酸而制作的空密码子分配非蛋白质氨基酸的遗传密码重编程法(geneticcodereprogrammingmethod)(基于初始化的改写),该方法能够利用4种以上非蛋白质氨基酸(非专利文献1~3)。但是遗传密码的重编程法也需要去除几种蛋白质氨基酸,因此减少了能够利用的蛋白质氨基酸的种类,具有无法利用全部20种蛋白质氨基酸的缺点。即,现有的改变遗传密码的方法在能够利用的非蛋白质氨基酸或蛋白质氨基酸的数量方面存在限制,仍不能说是可以自由利用所期望的氨基酸的合成系统。
此外,就与天然L-α-氨基酸结构相去甚远的特殊氨基酸(例如D型氨基酸、N-甲基氨基酸)而言,即使利用上述方法分配给空密码子也无法作为底物被翻译系统接受,在肽合成中通常无法引入。即,特殊氨基酸是在通常的翻译系统或现有的改变翻译系统中一般不被引入或极难引入肽链的氨基酸。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1:Forester、A.C.etal.:Proc.Natl.Acad.Sci.USA、Vol.100、p.6353-6357(2003)
非专利文献2:Josephson、K.、Hartman、M.C.、Szostak、J.W.:J.Am.Chem.Soc.、Vol.127、p.11727-11735(2005)
非专利文献3:Murakami、H.etal.:Nat.Mathods、Vol.3、p.357-359(2006)
发明内容
发明要解决的问题
现有的遗传密码的重编程中,通过去除部分蛋白质氨基酸而制作空密码子、分配特殊氨基酸,因此无法使用被去除的蛋白质氨基酸。
本发明的课题在于,提供在全部的蛋白质氨基酸的基础上能够同时利用多个特殊氨基酸的翻译合成系统。
用于解决问题的方案
本发明人等通过在改变遗传密码方面创新地提出并建立二个新概念,从而完成了原理上能够同时利用40种以上氨基酸的新型人工翻译合成系统(FIT系统)。以下依次说明(1)双重遗传密码、和(2)密码子框的人工分割的概念。
1.双重遗传密码
天然通用遗传密码表中。一个密码子仅定义1种氨基酸。但是,作为例外,在原核生物的翻译中,AUG密码子在起始反应中指定fMet(甲酰基甲硫氨酸),在其后的延伸反应中指定Met(甲硫氨酸)。即,在起始和延伸中分别严格地定义fMet和Met这样的结构不同的氨基酸。在此,本发明人等考虑到其它的密码子是否也同样能够用于起始和延伸两者中、且对应不同的氨基酸。即,提出了如下的“双重遗传密码”的新概念:在延伸用之外,创新地准备了起始反应专用的人工密码子表,使这两者同时发挥作用。
天然翻译系统中,仅AUG作为起始密码子发挥作用,与此相对,在双重遗传密码中,AUG以外的多个密码子参加起始反应。进而,这些人工起始密码子可以称为“双义密码子(Dualsensecodon)”,即,在起始和延伸反应中各指示二个氨基酸。在使用双重遗传密码的翻译系统中,多个人工起始残基同时发挥作用,因此能够一举合成具有各种N末端结构的肽文库。这与在一个翻译系统中发挥作用的起始残基仅限于一个的现有翻译系统相比可以说是一个大的优点。
2.密码子框(codonbox)的人工分割
双重遗传密码的情况下,起始残基的变化大幅增加,但在延伸反应中利用特殊氨基酸时,也依然会利用几种蛋白质氨基酸,这是必然的。解决该问题的是对密码子框进行人工分割、即遗传密码的重编程。
通用遗传密码表中,多个密码子定义同一氨基酸的情况也是存在的。例如,GUN的密码子框完全被Val占据。在密码子框的人工分割的概念中,将这一密码子框分割成二个,一方面指定原来的蛋白质氨基酸而另一方面则定义其它的特殊氨基酸[图1中右边的延伸专用遗传密码;例如,GUN的框中,给GU(A/G)分配了Val,给GU(U/C)分配了期望的特殊氨基酸(Xa3)]。原理上,该翻译系统在延伸反应中除了天然20种氨基酸外还能够同时利用11种之多的特殊氨基酸。
3.将双重遗传密码表和人工密码子框分割组合而成的新型人工翻译合成系统
通过组合双重遗传密码表和人工密码子框分割,可以制作能够同时利用的氨基酸的种类大幅增加的翻译系统。即,配置至:将双重遗传密码表所利用的多个双义密码子进行人工分割而成的密码子框中。即,在1个密码子框内分配4个不同的氨基酸残基。进而,对终止密码子也能够分配特殊氨基酸。由此在一个翻译系统中能够同时利用全部20种蛋白质氨基酸+11种以上的人工起始残基+最大12种之多的特殊氨基酸。进而,由于在人工分割的密码子框以外的场所也能够配置双义密码子,因此是一种能够同时利用全部总计为40种以上的氨基酸的翻译系统。
图2为对该FIT系统和利用现有的起始反应改写而进行的环状肽文库合成(Gotoetal.、ACSChem.Biol.、2008、3、120-129;WO2008/117833“环状肽化合物的合成方法”)进行比较的图。图2的a表示现有的起始反应改写法、b表示本发明的FIT系统。在以前的方法(图2的a)中,一个翻译系统中的起始残基仅限于一种,此外不能同时利用Met。与此相对,Fit系统中能够以多样的结构进行环化、获得包含含有多个特殊氨基酸的肽的文库。
进而,当在延伸反应中利用特殊氨基酸时,蛋白质氨基酸的利用相应地受到限制。但FIT系统中,在fMet基础上还能够同时利用多种改变的(altered)起始残基,进而,还能够在延伸反应中导入多个特殊氨基酸及全部的蛋白质氨基酸。
本发明的主旨如下所述。
(1)一种将结合了特殊氨基酸的tRNA添加到体外翻译系统中进行肽合成、从而合成导入了特殊氨基酸的肽的方法,
在核糖体上的翻译起始反应中,具有与mRNA的翻译起始位点的密码子互补的反密码子的起始tRNA上所结合的特殊氨基酸作为起始氨基酸发挥作用从而被导入肽的N末端,
肽链延伸反应中,按照改变后的遗传密码表,通过结合了特殊氨基酸的延伸用tRNA的反密码子,在指定位置导入特殊氨基酸,所述改变后的遗传密码表特征在于,在通用遗传密码表中指定1种蛋白质氨基酸的多个密码子的一部分被分配给特殊氨基酸。
(2)根据前述方法,其中,结合了特殊氨基酸的tRNA是将体外转录合成的tRNA在体外进行氨基酰基化而制备的。
(3)根据前述方法,其中,延伸反应用的改变后的遗传密码表的特征在于,在通用遗传密码表中分别指定Leu、Val、Ser、Pro、Thr、Ala、Arg、及Gly的多个密码子的一部分被分配给特殊氨基酸。
(4)根据(3)的方法,其中,延伸反应用的改变后的遗传密码表中,在通用遗传密码表(universalgeneticcodetable)中分别指定Leu、Val、Ser、Pro、Thr、Ala、Arg、Gly的4个或6个密码子中,2个密码子仍被分配给原来的蛋白质氨基酸,但其余的这些密码子被分配给任意的特殊氨基酸。
(5)根据(3)的方法,其中,延伸反应用的改变后的遗传密码表中,进而,将终止密码子的一部分分配给特殊氨基酸。
(6)根据前述方法,其中,体外翻译系统含有代替天然tRNA的体外转录合成的tRNA、及能够使蛋白质氨基酸与所述tRNA特异结合的ARS的组合作为蛋白质氨基酸用的tRNA及ARS(氨酰tRNA合成酶)的组合,不含天然tRNA。
(7)根据前述方法,其中,翻译起始位点的密码子为由AUG或AUG以外的任意的三联序列构成的人工起始密码子。
(8)根据(7)的方法,其中,人工起始密码子为AUG、UGG、AUC、ACC、UCG、AAC、GCC、GGC、CCG、CGG、GGG或AUA。
(9)根据前述方法,通过使具有相同反密码子序列的起始tRNA和延伸tRNA结合不同的特殊氨基酸,能够在翻译起始反应和延伸反应中将相同序列的密码子分配给不同的特殊氨基酸。
(10)根据(8)的方法,其中,在翻译起始反应和延伸反应中被分配给不同的特殊氨基酸的相同序列的密码子是AUG、UGG、AUC、ACC、UCG、或AAC。
(11)根据前述方法,利用具有序列彼此不同的人工起始密码子的多个mRNA作为模板,在体外翻译系统中添加氨基酰基起始tRNA进行肽合成,从而在一个翻译系统中合成具有彼此不同的N末端氨基酸的多个肽,所述氨基酰基起始tRNA为:在具有与各个人工起始密码子互补的反密码子的起始tRNA上结合了不同的人工起始残基的氨基酰基起始tRNA。
(12)根据(1)的方法,在体外翻译系统中,添加由具有彼此不同的各种序列的模板核酸构成的核酸文库、结合了任意的特殊氨基酸的具有各种反密码子序列的起始tRNA、及结合了任意的特殊氨基酸的具有各种反密码子序列的延伸用tRNA,合成由具有各种序列的特殊肽构成的肽文库。
(13)根据(12)的方法,特殊肽以与编码该肽的模板核酸结合的状态被合成。
(14)一种用于翻译合成特殊肽的试剂盒,其至少包含:
(i)如下mRNA:编码肽的区域包含(a)指定人工起始残基的人工起始密码子、及(b)指定特殊氨基酸的延伸密码子的mRNA;
(ii)如下的人工起始残基及特殊氨基酸用的氨酰tRNA:(c)具有与前述(a)的人工起始密码子互补的反密码子的、结合了人工起始残基的起始tRNA;及(d)具有与前述(b)的延伸密码子互补的反密码子的、结合了特殊氨基酸的延伸tRNA;
(iii)如下的组合:一种蛋白质氨基酸用的tRNA及ARS的组合,其含有蛋白质氨基酸、不含修饰碱基的人工tRNA、及能够使蛋白质氨基酸与所述人工tRNA结合的ARS;及
(iv)分离得到的核糖体。
发明的效果
根据本发明,能够极大提高利用体外翻译系统合成的特殊肽的多样性。进而,与现有公知的翻译系统相比,能够以少数的容易控制的因子群进行肽合成,且能够简单地制造。
使用本发明的翻译系统(FIT系统)构建的肽文库能够涵盖比现有的更宽的序列空间,在检索生理活性肽方面可以期待更大的优点。
附图说明
图1表示本发明人等提出的人工遗传密码的例子。使用起始反应专用(左)和延伸反应专用(右)的二个密码子表。
图2为利用翻译合成而得的环状肽文库合成的概况图。对(a)现有的起始反应改写法和(b)本发明的FIT系统进行比较。
分别表示人工起始残基、特殊氨基酸、蛋白质氨基酸。
图3为AUG以外的多个密码子作为人工起始密码子发挥作用的确认实验结果。
图4为同一密码子在起始和延伸两方面发挥作用、编码各自的氨基酸的确认实验结果。
图5为利用双重遗传密码同时使用共8种特殊氨基酸和人工起始残基的实验结果。
图6表示用T7RNA聚合酶进行体外转录合成的tRNA在翻译反应中发挥作用的确认实验结果。
图7为密码子框分割实验的概况图。
图8为密码子框(Val密码子框)的人工分割实验结果。
图9为密码子框(Val密码子框以外的密码子框)的人工分割实验结果。
图10为表示密码子框的人工分割实验(一次对二个密码子框进行分割)的结果。
图11为基于双重遗传密码和分割密码子框的组合的FIT系统的概况图。
图12表示组合了双重遗传密码表和分割密码子框的肽合成的例子。
具体实施方式
首先,说明本申请中使用的重要术语和技术。
“遗传密码(密码子)”:天然翻译中,给64种密码子按照以下所示的通用遗传密码表分别分配了20种蛋白质氨基酸及翻译的终止。
[表1]
蛋白质氨基酸或天然氨基酸是指通常的翻译中使用的α-氨基羧酸(或取代型α-氨基羧酸),即丙氨酸(Ala)、缬氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)、异亮氨酸(Ile)、脯氨酸(Pro)、色氨酸(Trp)、苯丙氨酸(Phe)、甲硫氨酸(Met)、甘氨酸(Gly)、丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)、酪氨酸(Tyr)、半胱氨酸(Cys)、谷氨酰胺(Gln)、天冬酰胺(Asn)、赖氨酸(Lys)、精氨酸(Arg)、组氨酸(His)、天冬氨酸(Asp)、及谷氨酸(Glu)这20种氨基酸。
与此相对,本发明中,由人工遗传密码给各密码子分配特殊氨基酸。图1为本发明中提出的人工遗传密码的例子。可以使用起始反应专用(左)和延伸反应专用(右)这二个密码子表。Xi和Xa分别意味着人工起始残基和延伸用特殊氨基酸。
起始反应用的密码子表特征在于,除了AUG以外,多个“人工起始密码子”发挥作用。
延伸反应用的密码子表的特征在于,对密码子框进行分割而能够追加定义特殊氨基酸。20种蛋白质氨基酸的指定中并非必需的分割密码子框有11个。因此,可以在维持20种天然氨基酸的状态下对这些分割密码子框指定最多11种非天然氨基酸。例如,在通用遗传密码表中分别指定Leu、Val、Ser、Pro、Thr、Ala、Arg、Gly的4个或6个密码子中,可以将2个密码子仍旧分配给原来的蛋白质氨基酸,但其余的这些密码子(2个或4个)被分配给任意的特殊氨基酸。
通过将起始用和延伸用的二种密码子表组合,由一种三联序列构成的密码子在起始反应和延伸反应中分别定义不同的二个氨基酸(双义密码子)。
“特殊氨基酸”及“特殊肽”:本申请中,氨基酸是指蛋白质氨基酸和特殊氨基酸两者。“特殊氨基酸”是指所有的、与天然翻译中使用的20种蛋白质氨基酸结构不同的氨基酸。即,包括蛋白质氨基酸的侧链结构的一部分进行了化学上的变更、修饰而成的非蛋白质氨基酸、人工氨基酸、D型氨基酸、N-甲基氨基酸、N-酰基氨基酸、β-氨基酸、氨基酸骨架上的氨基和/或羧基具有取代结构的衍生物等的全部。本申请中为方便起见,将起始反应中被引入肽的N末端的特殊氨基酸特别称为“人工起始残基”,与其相对地,有时也将延伸反应中被引入肽链中的特殊氨基酸称为狭义上的“特殊氨基酸”。
“导入了特殊氨基酸的肽”或“特殊肽”包括以上述各种特殊氨基酸为构成要素的聚合物。特殊肽的构成要素的一部分或全部可以为特殊氨基酸。因此,特殊肽是主链骨架也可以具有不同于通常的酰胺键的结构的肽。例如,由氨基酸和羟基酸构成的酯肽、羟基酸连续缩合而成的聚酯、N-甲基肽、N-末端具有各种酰基(乙酰基、焦谷氨酸、脂肪酸等)的肽也包括在特殊肽中。此外,特殊肽中还包含环状肽。如上所述,本发明人等以前开发并报道了使翻译合成的直链状的肽通过分子内反应而环状化的方法(Gotoetal.、ACSChem.Biol.、2008、3、120-129、WO2008/117833“环状肽化合物的合成方法”)。同样的方法也可以用于本申请中。其一个例子为:通过翻译合成而得到的在N末端配置具有氯乙酰基的特殊氨基酸、在肽链中或C末端配置半胱氨酸的肽序列、以硫醚键环化而成的环状肽。除此以外,也可以根据能够形成键的官能团的各种组合以多样的结构进行环化。
“tRNA”是具有能够形成类似于三叶草叶结构的二级结构的序列的RNA分子,进而,取L字形的紧凑的三级结构,具有如下功能:位于L字形结构的一端的3’末端结合氨基酸(酰基化)、通过位于另一端的反密码子识别mRNA上的密码子。本说明书中,tRNA是指天然tRNA和人工构建的tRNA两者。人工构建的tRNA的典型例子是由体外转录而合成的tRNA。
“起始tRNA”:对于起始mRNA的翻译而言,被称为“起始tRNA”的特定的tRNA是必需的。结合了起始氨基酸的起始tRNA与起始因子(IF)一起结合到核糖体的小亚基,通过核糖体的小亚基与mRNA上的起始密码子结合而开始翻译。通用密码表中,作为起始密码子,通常使用甲硫氨酸的密码子即AUG,因此起始tRNA具有与甲硫氨酸对应的反密码子,起始tRNA必须运载甲硫氨酸(原核细胞中为甲酰基甲硫氨酸)。但是,本发明中,通过在具有任意的反密码子的起始tRNA上结合任意的起始氨基酸,起始氨基酸并不限于甲硫氨酸,起始密码子也不限于AUG。本申请中,将指定甲硫氨酸(或甲酰基甲硫氨酸)以外的氨基酸的AUG或AUG以外的起始密码子称为“人工起始密码子”。此外,将由人工起始密码子指定、被导入肽N末端的特殊氨基酸称为“人工起始残基”。
据报道,在原核生物的起始tRNA中,1号碱基(5’末端的第一个碱基)和72号碱基为错配(非互补的),该错配碱基对被甲硫氨酰甲酰基转移酶(methionylformyltransferase,MTF)识别并甲酰化,从而引入起始反应,此外,抑制与EF-Tu的结合。(MayerC、StortchevoiA、KohrerC、VarshneyU、RajBhandaryUL.InitiatortRNAanditsroleininitiationofproteinsynthesis.ColdSpringHarbSympQuasntBiol.2001;66:195-206.)一般认为,来源于原核生物的翻译起始反应中,在甲酰基转移酶及甲酰基供体(10-甲酰基-5,6,7,8-四氢叶酸)的作用下用甲酰基修饰起始tRNA上的甲硫氨酸的氨基是必需的,但本发明人等的其它研究阐明并不存在这种限制。例如,即使是不具有酰基的氨基酸也能够起始翻译,而且氨基中导入的酰基可以带有任意的R(R-CO-aa-)。因此,FIT系统中,甲酰基供体及MTF并非是必需的。
作为起始tRNA的例子,在后述的实施例中使用了tRNAfMetE。该tRNA的碱基序列基于大肠杆菌的天然tRNAfMet:
(5’-CGCGGGGs4UGGAGCAGCCUGGDAGCUCGUCGGGCmUCAUAACCCGAAGAUCGUCGGTΨCAAAUCCGGCCCCCGCAACCA-3’)。(s4U:4-硫尿苷、D:二氢尿苷、Cm:2’-O-甲基胞苷、T:胸腺嘧啶核苷、Ψ:假尿苷)(序列号7),下划线部CAU的位置相当于反密码子,对应于AUG起始密码子。
本发明人等利用体外转录制作了对该天然tRNA去除修饰碱基、将5’末端最初的C变成G的起始用tRNAfMetE。示出本申请实施例中使用的tRNAfMetE的序列。NNN的位置相当于反密码子,按照与起始密码子对应的方式使其变化。
5’-GGCGGGGUGGAGCAGCCUGGUAGCUCGUCGGGCUNNNAACCCGAAGAUCGUCGGUUCAAAUCCGGCCCCCGCAACCA-3’(序列号1)([去除修饰的位置共6处:s4U8U、D20U、Cm32C、T54U、Ψ55U。][变异的位置共1处:C1G])
“延伸tRNA”:肽链延伸反应中,结合了氨基酸的“延伸tRNA”或“延伸用tRNA”与延伸因子Tu(原核生物中称为EF-Tu、真核生物中称为eEF-1A)结合,并向着核糖体的A位点运输。原核生物的延伸tRNA中,1号碱基和72号碱基形成碱基对且50号碱基和64号碱基形成碱基对,据报道这些碱基对的形成对EF-Tu的识别是必要的。
作为特殊氨基酸用的延伸用tRNA的例子,后述的实施例中使用了源自tRNAAsn的人工tRNA(tRNAAsnE2)。该tRNA的碱基序列基于大肠杆菌的天然tRNAAsn
(5’-UCCUCUGs4UAGUUCAGDCGGDAGAACGGCGGACUQUUt6AAΨCCGUAUm7GUCACUGGTΨCGAGUCCAGUCAGAGGAGCCA-3’)(s4U:4-硫尿苷、D:二氢尿苷、Q:辫苷、t6A:6-苏氨酰基氨甲酰基腺嘌呤、Ψ:假尿苷、m7G:7-甲基鸟苷、T:胸腺嘧啶核苷)(序列号8)。
本发明人等通过体外转录制作了由于对该天然tRNA去除修饰碱基并导入变异而不接受大肠杆菌的20种氨基酰基化酶的氨基酰基化的延伸用tRNAAsn-E2。NNN的位置相当于反密码子,按照与延伸密码子对应的方式使其变化。
(tRNAAsn-E2:
5’-GGCUCUGUAGUUCAGUCGGUAGAACGGCGGACUNNNAAUCCGUAUGUCACUGGUUCGAGUCCAGUCAGAGCCGCCA-3’(序列号2)[去除修饰的位置共8处:s4U8U、D16U、D20U、t6A37A、Ψ39U、m7G46G、T54U、Ψ55U。关于34位的Q,由于为反密码子,因此使其根据延伸密码子而变化。][变异的位置共4处:U1G、C2G、G71C、A72C])
“互补的”:将可以形成碱基对这样的核酸碱基的组合彼此称为“互补的”。DNA中,腺嘌呤(A)和胸腺嘧啶(T)配对,鸟嘌呤(G)和胞嘧啶(C)配对;RNA中,A和尿嘧啶(U)、及G和C配对。进而,RNA中,G-U等所谓的非沃森-克里克碱基对也作为热力学稳定碱基对存在,因此本说明书中,这些组合也称为“互补的”。mRNA的密码子和tRNA的反密码子的对应依赖于互补的碱基的配对。尤其是,密码子的3’侧第三碱基和反密码子的5’侧第一碱基的互补链的形成在摆动规则(Wobblelaw)下是允许的非沃森-克里克碱基对的匹配。密码子序列和反密码子序列“相对应”是指密码子和反密码子的序列形成互补链。
除上述外,用于实施本发明的材料及方法按照化学及分子生物学技术领域中惯用的技术、使用各种常见教科书、专业的参考文献中记载的方法。专业的参考文献中包括本发明人等的研究小组迄今为止发表的多篇论文和专利文献。
肽翻译合成方法
本发明涉及基于双重遗传密码表和人工密码子框分割的新型的体外(invitro)人工翻译合成系统“柔性体外翻译(FIT)系统”。一般,翻译系统或翻译合成系统是包括用于肽翻译合成的方法及试剂盒两者的概念。
本发明的肽翻译合成方法为通过将结合了特殊氨基酸的tRNA添加到体外翻译系统进行肽合成而合成特殊肽的方法。此时的体外翻译系统、即“柔性体外翻译(FIT)系统”为将翻译所必需的蛋白质、RNA、小分子任意混合而制备的混合物。作为与其类似的重建型的翻译系统的例子,公知的是使用了大肠杆菌的核糖体的系统、即下述文献所记载的技术:H.F.Kung、B.Redfield、B.V.Treadwell、B.Eskin、C.SpearsandH.Weissbach(1977)“DNA-directedinvitrosynthesisofbeta-galactosidase.Studieswithpurifiedfactors”TheJournalofBiologicalChemistryVol.252、No.19、6889-6894;M.C.Gonza、C.CunninghamandR.M.Green(1985)“IsolationandpointofactionofafactorfromEscherichiacolirequiredtoreconstructtranslation”ProceedingofNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmericaVol.82、1648-1652;M.Y.PavlovandM.Ehrenberg(1996)“RateoftranslationofnaturalmRNAsinanoptimizedinVitrosystem”ArchivesofBiochemistryandBiophysicsVol.328、No.1、9-16;Y.Shimizu、A.Inoue、Y.Tomari、T.Suzuki、T.Yokogawa、K.NishikawaandT.Ueda(2001)“Cell-freetranslationreconstitutedwithpurifiedcomponents”NatureBiotechnologyVol.19、No.8、751-755;H.Ohashi、Y.Shimizu、B.W.Ying、andT.Ueda(2007)“Efficientproteinselectionbasedonribosomedisplaysystemwithpurifiedcomponents”BiochemicalandBiophysicalResearchCommunicationsVol.352、No.1、270-276。
作为FIT系统的特征,重要的一点是其构成成分中任意成分均可以自由去除。只要具有该特征,则FIT系统可以在由任意的生物分离的成分中适当组合体外合成成分而使用。本说明书的说明及后述的实施例中,使用源自原核生物的系统进行说明,但这只是为了说明的方便,而非意图排除源自真核生物的翻译系统的使用。
以下,基于使用源自大肠杆菌的核糖体的实施例说明本发明。
目前,翻译系统的典型构成包括:(i)T7RNA聚合酶(还进行由DNA进行转录的情况下)、(ii)作为翻译因子的大肠杆菌的起始因子、延伸因子、终止因子、核糖体循环因子、(iii)20种氨酰tRNA合成酶(ARS)、甲硫氨酰tRNA甲酰基转移酶(MTF)、(iv)大肠杆菌70S核糖体、(v)大肠杆菌tRNA(由大肠杆菌分离)、(vi)各种氨基酸、NTP、能量再生系统、等等。
本发明中使用的FIT系统中,上述(ii)、(iii)及(v)的材料中的全部、或一部分是不添加的。例如,制备不添加氨基酸、氨酰tRNA合成酶、甲硫氨酰tRNA甲酰基转移酶、终止因子、tRNA等构成分子的翻译系统。这样的系统不具有通常的翻译系统的功能,但通过向其中添加对体外转录合成的tRNA负载氨基酸的物质等人工合成要素、其他的成分,可以恢复肽合成功能。换言之,通过根据需要不添加翻译系统的构成要素而能够进行期望的遗传密码的重编程。
特殊氨基酸、人工起始残基的分配所必需的氨酰tRNA,通过分离体外转录合成的tRNA、在体外进行氨基酰基化而制备。将分离的tRNA在体外进行氨基酰基化是指:在其它的tRNA、ARS不存在的条件下使期望的氨基酸结合到tRNA的3’末端。由于本发明中对导入肽中的特殊氨基酸、人工起始残基没有限制,因此作为这样的氨基酰基化的方法,优选的是对各种氨基酸均能适用的方法。作为这样的方法,公知的是例如化学的氨基酰基化法(HecklerT.G.、ChangL.H.、ZamaY.、NakaT.、ChorghadeM.S.、HechtS.M.:T4RNAligasemediatedpreparationofnovel“chemicallymisacylated”tRNAPheS.Biochemistry1984、23:1468-1473.)、或本发明人等开发的使用氨酰tRNA合成核酶(ARS核酶)的方法。或者也可以利用对天然ARS进行人工改变的酶的方法,虽然可以应用的氨基酸种类存在限制。
本发明中,作为在体外对tRNA进行氨基酰基化的方法,最优选的是以体外转录合成的tRNA为底物、利用ARS核酶进行合成的方法。
作为本发明中使用的氨酰tRNA合成酶,本发明人等利用进化分子工程学创制的RNA催化剂、即ARS核酶(弹性酶)是合适的。ARS核酶与天然ARS蛋白质酶不同,对各氨基酸及各tRNA不具有特异性,能够使用本来应该负载的氨基酸以外的任意氨基酸或羟基酸进行氨基酰基化。
弹性酶还以二硝基苄基弹性酶(dFx)、增强型弹性酶(eFx)、氨基弹性酶(aFx)等名称而被知晓。通过利用这些ARS核酶,可以使期望的人工起始残基或特殊氨基酸结合到任意的tRNA。
以下示出公知的ARS核酶的例子(RNA序列)。
弹性酶Fx的原型
[GGAUCGAAAGAUUUCCGCAGGCCCGAAAGGGUAUUGGCGUUAGGU-3’、45核苷酸](序列号3)
二硝基苄基弹性酶dFx
[5'-GGAUCGAAAGAUUUCCGCAUCCCCGAAAGGGUACAUGGCGUUAGGU-3’,46核苷酸](序列号4)
增强型弹性酶eFx
[5'-GGAUCGAAAGAUUUCCGCGGCCCCGAAAGGGGAUUAGCGUUAGGU-3’,45核苷酸])(序列号5)
氨基弹性酶aFx
[5'-GGAUCGAAAGAUUUCCGCACCCCCGAAAGGGGUAAGUGGCGUUAGGU-3’,47核苷酸])(序列号6)
基于弹性酶的氨基酰基化反应可以在温和的条件下进行,仅通过容易的后处理即可导入翻译系统并使用。弹性酶以弱活化的氨基酸为底物,识别氨基酸的反应位点即羰基、及氨基酸侧链或作为离去基团的芳香环、以及存在于tRNA的3’末端的5'-RCC-3'序列部分(R=A或G),具有催化3’末端的腺苷的氨基酰基化的催化能力。基于弹性酶的氨基酰基化反应在弹性酶存在下将氨基酸底物和作为结合对象的tRNA分子在冰上放置2小时左右即可进行。具体细节请参照以下文献。
H.Murakami、H.Saito、andH.Suga、(2003)、Chemistry&Biology、Vol.10、655-662;H.Murakami、D.Kourouklis、andH.Suga、(2003)、Chemistry&Biology、Vol.10、1077-1084;H.Murakami、A.Ohta、H.Ashigai、H.Suga(2006)NatureMethods3、357-359"AhighlyflexibletRNAacylationmethodfornon-naturalpolypeptidesynthesis";N.Niwa、Y.Yamagishi、H.Murakami、H.Suga(2009)Bioorganic&MedicinalChemistryLetters19、3892-3894"Aflexizymethatselectivelychargesaminoacidsactivatedbyawater-friendlyleavinggroup";及WO2007/066627。
本发明中,作为特殊氨基酸用的延伸tRNA,利用对天然ARS具有正交(orthogonal)性的人工tRNA。即,利用不被翻译系统固有的天然ARS识别的、不负载翻译系统中的天然氨基酸这样的人工tRNA。这样的人工tRNA可以通过体外转录而合成。作为特殊氨基酸用的延伸用tRNA的例子,在后述的说明及实施例中,使用源自大肠杆菌tRNAAsn的人工tRNA(tRNAAsnE2)。但是,并非仅限于此,在所使用的翻译系统中,只要是已经确认对固有ARS为正交性、在核糖体上的肽延伸反应中可以利用的tRNA就可以使用。
起始tRNA具有与延伸tRNA不同的序列,被起始因子识别。后述的实施例中,使用了利用体外转录合成的、源自大肠杆菌tRNAfMet的人工tRNA(tRNAfMetE)。但是,并非仅限于此,只要是已经确认在所使用的翻译系统中在核糖体上的肽翻译起始反应中可以利用的tRNA就可以使用。
Fit系统的成分
含有用于翻译合成特殊肽的具体构成成分的试剂盒也为本发明的一实施方式。对照现有公知的系统来说明本发明中能够利用的翻译系统的具体构成成分。
翻译系统提供与作为翻译模板的碱基序列对应的DNA或RNA分子。为了由模板DNA进行转录,加入T7RNA聚合酶这样的合适的RNA聚合酶。当在翻译系统中加入预先转录的mRNA时,则不需要添加RNA聚合酶。核酸序列方面,与利用活细胞的蛋白质表达系统同样地,除了编码目标氨基酸序列的区域外,还可以根据所使用的翻译系统添加对翻译有利的碱基序列。例如,在利用源自大肠杆菌的核糖体的系统时,通过在起始密码子的上游包含SD(Shine-Dalgarno)序列、ε序列等可以提高翻译反应的效率。至此均与现有的体外翻译系统是相同的。在编码肽的区域的N末端,配置有指定作为人工起始残基的特殊氨基酸的人工起始密码子。延伸反应中导入的特殊氨基酸由延伸密码子指定。与现有系统同样地,为了用于体外展示,在C末端侧可以含有用于连接核酸分子和作为其翻译产物的肽的序列。
进而,为了人工起始残基用、特殊氨基酸用,翻译系统还提供预先用人工起始残基或特殊氨基酸进行氨基酰基化的tRNA。为了蛋白质氨基酸用,提供蛋白质氨基酸、tRNA、特异性ARS蛋白质酶的组合。作为蛋白质氨基酸用的tRNA,在使用大肠杆菌的核糖体的现有公知的系统中使用源自大肠杆菌的tRNA,但本申请发明中,使用由体外转录而合成的人工tRNA。关于ARS,现有公知的系统中使用与全部的蛋白质氨基酸对应的20种ARS,但本申请发明中,为了利用任意指定的双重遗传密码、分割遗传密码,则并非必须使用全部20种ARS。
通常的翻译反应中,起始密码子AUG因起始tRNA而被限定为N-甲酰基甲硫氨酸,因此10-甲酰基-5,6,7,8-四氢叶酸(Baggottetal.、1995)这样的甲酰基供体是必需的,但本发明中,利用起始密码子AUG或人工起始密码子导入特殊氨基酸(人工起始残基),因此甲酰基供体是任意的。基于同样的理由,甲硫氨酰-tRNA甲酰基转移酶(MTF)也并非必需。
与现有系统同样地,作为蛋白质合成装置的核糖体是必需的。核糖体为集成了50种以上的核糖体蛋白质和数种RNA分子(rRNA)的RNA-蛋白质复合体,其读取mRNA的遗传信息,催化氨基酸的聚合。优选利用由大肠杆菌分离的核糖体,但也可以利用源自其它生物的核糖体。
此外,在蛋白质类中,使用翻译起始因子(例如,IF1、IF2、IF3)、翻译延伸因子(例如EF-Tu、EF-Ts、EF-G)、翻译终止因子(例如,RF1、RF2、RF3、RRF)、用于能源再生(energysourceregeneration)的酶(例如creatinekinase、myokinase、pyrophosphatase、nucleotide-diphosphatasekinase)。其中,翻译终止因子、用于能源再生的酶的添加是任意的。
进而,与现有系统同样地,可以适当使用合适的缓冲液、作为翻译反应的能源的NTP类、磷酸肌酸,用于核糖体活化、RNA稳定化、稳定蛋白质所必需的因子等。
进而,为了合成本发明人等在其它研究中已经实际证明的主链骨架发生环化的肽(T.Kawakami、A.Ohta、M.Ohuchi、H.Ashigai、H.Murakami、H.Suga、Nat.Chem.Biol.、2009、5,888-890),还可以适当追加加入肽脱甲酰基酶(peptidedeformylase,PDF)、甲硫氨酸胺基肽酶(methionineaminopeptidase,MAP)等不直接参与翻译反应的酶。
以下,将人工起始残基称为Xi、将延伸反应中使用的特殊氨基酸称为Xa进行说明。
1.双重遗传密码
为了将多个密码子作为人工起始密码子加以利用,在翻译系统中加入具有各种反密码子序列的多个氨基酰基起始tRNA。若使其预先分别负载各人工起始残基,则可以给与反密码子序列对应的密码子(人工起始密码子)分配各人工起始残基。当被翻译的mRNA上的起始密码子位置存在人工起始密码子的序列时,对应的氨基酰基起始tRNA(例如,具有对应的反密码子序列的氨酰tRNAfMetE)读取其信息,合成在N末端具有期望的人工起始残基的肽。
为了将上述利用的人工起始密码子序列作为双义密码子而还用于延伸反应中,对翻译系统加入具有各种反密码子序列的多个氨基酰基延伸tRNA(例如,具有对应的反密码子序列的氨酰tRNAAsnE2)。
起始tRNA和延伸tRNA具有不同的序列,因此不会错误地发挥对方的功能(例如,延伸tRNA在起始反应中不会被利用,反过来也同样)。由此,一个密码子序列能够在起始反应和延伸反应中分配各氨基酸。
2.密码子框的人工分割
天然tRNA由于其碱基序列受到修饰,因此即使是3个以下的tRNA也能够读取一个密码子框中的全部4个密码子的序列。例如,反密码子序列UAC中的U已被修饰为cmo5U的Val的tRNA读取GU(U/C/A/G)的全部4个密码子。这是由于GUN密码子框被Val所占据。
本发明中,为了避免这样的密码子-反密码子序列的错配被允许,在进行密码子框的人工分割时,彻底不再使用天然tRNA,而使用不含修饰碱基的人工合成的tRNA。优选通过适当的RNA聚合酶体外合成的tRNA。体外合成的tRNA由于不具有修饰碱基,不会如上述那样读取4种密码子。
若以Val的密码子框为例继续说明,例如,加入具有CAC反密码子的体外合成的tRNAVal CAC和具有用期望的特殊氨基酸酰基化的GAC反密码子的tRNAAsnE2(Xa-tRNAAsnE2 GAC)。于是,tRNAVal CAC在系统中被Val的ARS变换为Val-tRNAVal CAC,读取GUG密码子,从而分配Val,Xa-tRNAAsnE2 GAC则与其独立地读取GU(U/C)密码子,分配Xa。由此,将通常仅被一个氨基酸利用的密码子框进行人工分割,可以在保持原来的蛋白质氨基酸的基础上将期望的特殊氨基酸追加到遗传密码中。
以下通过实施例具体说明本发明。予以说明,这些实施例是用于说明本发明的,而非用来限定本发明的范围。
实施例1
AUG以外的多个密码子作为人工起始密码子发挥作用的确认实验(图3)
准备在起始密码子位点配置了各种密码子的mRNA(mRNA1XXX,XXX表示配置在各个mRNA上的人工起始密码子的序列)。
对于具有与各个人工起始密码子序列对应的反密码子序列的tRNAfMetE,负载N-乙酰基苯丙氨酸(AcPhe),在所得的tRNA(AcPhe-tRNAfMetE xxx、xxx表示各个反密码子)存在下翻译mRNA,确认是否能够获得作为翻译产物的期望的在N末端具有AcPhe的肽。
其结果显示,除了天然起始密码子AUG外,至少UGG、AUC、ACC、UCG、AAC、GCC、GGC、CCG、CGG、AUA也能够起始翻译反应,确认了较宽范围的密码子均能够用作人工起始密码子。
实施例2
同一密码子发挥起始、延伸两种功能并编码各自的氨基酸的确认实验(图4)
准备在起始密码子位点和延伸位点两位点配置了各种密码子的mRNA(mRNA2XXX,XXX表示配置在各个mRNA上的作为评价对象的双义密码子的序列)。制备在具有与各个双义密码子的密码子序列对应的反密码子序列的tRNAfMetE上负载了N-乙酰基苯基丙氨酸(AcPhe)的tRNA
(AcPhe-tRNAfMetE xxx,xxx表示各个反密码子)和在具有相同反密码子序列的tRNAAsnE2上负载了N-乙酰基赖氨酸(Aly)的tRNA(Aly-tRNAAsnE2 xxx)。然后,在起始、延伸二种氨酰tRNA存在下翻译mRNA,确认是否能够获得作为翻译产物的期望的在N末端具有AcPhe、在肽链中含有Aly的肽。
其结果是,确认至少密码子AUG、UGG、AUC、ACC,UCG、AAC作为双义密码子发挥作用,能够在起始反应和延伸反应两反应中指定各自的氨基酸。
实施例3
利用双重遗传密码同时使用共8种特殊氨基酸、人工起始残基的实验(图5)
在该实验所使用的双重遗传密码中,对AUG、UCG、AAC、UGG的人工起始密码子分别配置N-乙酰基苯丙氨酸(AcPhe)、N-戊烯基苯丙氨酸(PePhe)、N-氨基甲基苯甲酰基苯基丙氨酸(BAPhe)、N-甲基己酰苯基丙氨酸(MhPhe)共4种人工起始残基,对AUG、UCG、AAC、UGG的延伸密码子分别配置N-乙酰基赖氨酸(Aly)、碘代苯基丙氨酸(Iph)、羟基脯氨酸(Hyp)、瓜氨酸(Cit)共4种特殊氨基酸。为此,制备AcPhe-tRNAfMetE CAU、PePhe-tRNAfMetE CGA、BAPhe-tRNAfMetE GUU、MhPhe-tRNAfMetE CCA,Aly-tRNAAsnE2 CAU、Iph-tRNAAsnE2 CGA、Hyp-tRNAAsnE2 GUU、Cit-tRNAAsnE2 CCA共8种氨酰tRNA并加入翻译系统中。进而,在其中混合4种mRNA(mRNA2AUG、mRNA2UGG、mRNA2AAC、mRNA2UGG)在一个翻译系统中进行共表达。
获得的翻译产物的混合物中仅存在期望的4种肽。该结果显示,实际利用基于双重遗传密码的翻译系统,能够通过一个反应混合合成具有不同的N末端(人工起始残基)及特殊氨基酸的多个肽。
实施例4
用T7RNA聚合酶体外转录合成的tRNA在翻译反应中发挥作用的确认实验(图6)
准备具有分别编码20种蛋白质氨基酸的密码子的mRNA4XXX(XXX表示各种密码子),使这些mRNA在仅存在体外转录合成的tRNA的翻译系统(translationsystemwithoutnaturaltRNAs)中表达。
其结果是,合成了含有全部种类氨基酸的肽,确认即使使用用T7RNA聚合酶体外转录合成的tRNA也能够与通常一样地发挥翻译合成功能。
实施例5
密码子框的人工分割实验(图7~10)
在此说明对缬氨酸、丝氨酸、精氨酸、甘氨酸的密码子框进行人工分割的实验。
图7是密码子框分割实验的概况图。密码子框分割实验中,使用完全不含天然tRNA的翻译系统(translationsystemwithoutnaturaltRNAs)。在其中加入指定20种蛋白质氨基酸所必需的tRNA(通过体外转录来合成)和指定期望的特殊氨基酸所必需的氨酰tRNA(通过体外转录、及利用弹性酶等的酰基化技术而合成),从而对密码子框进行人工分割,使原来的蛋白质氨基酸和特殊氨基酸共存于分割后的各个框中。
准备加入了用于编码配置在进行分割的密码子中的4种氨基酸的体外转录tRNA(tRNAVal CAC、tRNAArg CCG、tRNASer CGA、tRNAGly CCC)、上述以外的16种蛋白质氨基酸用的体外转录tRNA、及负载了四种特殊氨基酸的tRNAAsnE2(MeTyr-tRNAAsnE2 GAC、MeSer-tRNAAsnE2 GCG、Aly-tRNAAsnE2 GGA、Iph-tRNAAsnE2 GCC)的翻译系统。就该翻译系统中使用的遗传密码而言,上述4个密码子框进行了人工分割且使原来的蛋白质氨基酸和特殊氨基酸共存于其中。
使用该翻译系统对各种序列的mRNA进行表达的结果是:在所有情况下均获得了期望的肽(即,含有存在于分割后的密码子框中的天然和非天然两方的氨基酸的肽)。由此,通过实验实际验证了密码子框的人工分割的概念,并且建立了能够同时利用天然20种氨基酸+4种特殊氨基酸的翻译合成系统。
图8~图10为密码子框分割实验结果的例示。
图8中,对GUN的密码子框进行分割,给GUG密码子分配蛋白质氨基酸Val、给GUC密码子分配特殊氨基酸MeTyr。
〔上部〕使用的mRNA的序列、及其编码的氨基酸序列(P-1及P-2)。
〔下部的左边〕翻译产物即Tricine-SDSPAGE。泳道1:用含有全部的天然tRNA的通常的翻译系统翻译mRNA、合成P-1。泳道2:用完全不含天然tRNA、加入了必要的体外转录tRNA的翻译系统翻译mRNA、合成P-1。泳道3:用完全不含天然tRNA、加入了必要的体外转录tRNA和非天然氨酰tRNA的翻译系统翻译mRNA、合成P-2。
〔下段的右边〕按照Tricine-SDSPAGE的泳道2及3的条件翻译合成的肽的质量分析结果(MALTI-TOFMS分析)。
确认按照指定那样合成了具有P-1及P-2的序列的肽。
图9中,对(1)CGN、(2)UCN、(3)GGN的密码子框进行分割,作为特殊氨基酸,分配(1)MeSer、(2)Aly、(3)Iph。此外,右边示意出利用分割遗传密码进行翻译合成的肽的质量分析结果。确认:按照分割遗传密码指定那样,合成了含有分割的密码子框中的天然和非天然两方的氨基酸的肽。
图10表示一次对二个密码子框进行分割的实验。分别对(1)CGN、GUN,(2)UCN、GUN,(3)CGN、GGN的密码子框进行分割。右边示意出实际进行翻译合成并对翻译产物进行质量分析的结果。确认:按照分割遗传密码指定那样,合成了含有多个分割密码子框中的天然和非天然两方的氨基酸的肽。
实施例6
将双重遗传密码表和人工密码子框分割组合而成的新型人工翻译合成系统(图11~12)
图11为基于双重遗传密码和分割密码子框的组合的新型人工翻译系统的概况图。该翻译系统中,使用完全不含天然tRNA的翻译系统。在其中加入指定20种蛋白质氨基酸所必需的tRNA(通过体外转录而合成)和指定期望的特殊氨基酸及人工起始残基所必需的氨酰tRNA(通过体外转录、及利用弹性酶等的酰基化技术而合成)。由此,增加所利用的起始密码子,对其分别分配人工起始残基,此外,另一方面在延伸反应中人工地对密码子框进行分割,使原来的蛋白质氨基酸和特殊氨基酸共存于分割后的各个框中。
本实施例中,对丝氨酸、精氨酸、甘氨酸的密码子框进行人工分割且存在于其中的某些密码子不仅用作人工起始密码子,还作为双义密码子发挥作用。
准备添加有负载了三种人工起始残基的tRNAfMetE(AcTyr-tRNAfMetE CCG、PenTyr-tRNAfMetE CGA、MhPhe-tRNAfMetE CCC)、负载了三种特殊氨基酸的tRNAAsnE2(MeSer-tRNAAsnE2 GCG、Aly-tRNAAsnE2 GGA、Iph-tRNAAsnE2 GCC)、用于编码配置于分割的密码子中的3种氨基酸的体外转录tRNA(tRNAArg CCG、tRNASer CGA、tRNAGly CCC)、除此以外的17种蛋白质氨基酸用的体外转录tRNA的翻译系统。就该翻译系统中使用的遗传密码而言,上述3个密码子框进行了人工分割且在其中配置了发挥起始和延伸两种功能的双义密码子,因此原来的蛋白质氨基酸、人工起始残基、特殊氨基酸这3种氨基酸共存于一个密码子框中。
图12示出上述的肽合成例的结果。在此,(1)CGG、(2)UCG、(3)GGG用作人工起始密码子,在延伸反应中对(1)CGN、(2)UCN、(3)GGN的密码子框进行分割,分配特殊氨基酸。实际进行翻译合成并对翻译产物进行质量分析的结果是,确认:按照含有密码子分割的双重遗传密码指定那样,合成了N末端具有人工起始残基、含有多个分割密码子框中的天然和非天然两方的氨基酸的肽。
使用该翻译系统对各种序列的mRNA进行表达的结果是,在所有情况下均获得了期望的肽(即,含有在分割后的密码子框中指定的人工起始残基、天然和非天然两方的氨基酸的肽)。由此,通过实验实际验证了双重遗传密码和密码子框的人工分割能够组合,并且建立了能够同时利用天然20种氨基酸+3种人工起始残基+4种特殊氨基酸的翻译合成系统。
产业上的可利用性
迄今为止,本发明人等通过在翻译系统中利用特定的特殊氨基酸而开发了多种含有各种特殊骨架的肽(特殊肽)的翻译合成法。特殊肽是N末端酰基、N-甲基氨基酸、D-氨基酸、含有大环状骨架等结构的肽的总称,由于含有这些特殊骨架,同时具有膜透过性、特异性、生物体稳定性等药品所必需的特性,可以期待其作为药品开发的基序(motif)。翻译系统为作为肽文库的构建法的优异合成方法,因此用翻译系统合成特殊肽的技术在检索新药候补方面逐渐成为强有力的工具。
通过本技术,可以增加一个翻译系统中能够利用的特殊氨基酸的数量(通常,在20种蛋白质氨基酸基础上追加20种以上的特殊氨基酸,达40种以上)。由此,能够大幅扩展用翻译系统构建的特殊肽文库中的序列空间。这意味着不仅获得的肽文库具有丰富的序列多样性,而且显示丰富的结构多样性,可以说能够构建更优质的文库。
[序列表自由文本]
序列号1:tRNAfMetE
序列号2:tRNAAsn-E2
序列号3:Fx
序列号4:dFx
序列号5:eFx
序列号6:aFx
序列号7:tRNAfMet
序列号8:tRNAAsn
Claims (13)
1.一种将结合了特殊氨基酸的tRNA添加到体外翻译系统中进行肽合成、从而合成导入了特殊氨基酸的肽的方法,
在核糖体上的翻译起始反应中,具有与mRNA的翻译起始位点的密码子互补的反密码子的起始tRNA上所结合的特殊氨基酸作为起始氨基酸发挥作用从而被导入肽的N末端,
肽链延伸反应中,按照改变后的遗传密码表,通过结合了特殊氨基酸的延伸用tRNA的反密码子,在指定位置导入特殊氨基酸,所述改变后的遗传密码表特征在于,在通用遗传密码表中指定1种蛋白质氨基酸的多个密码子的一部分被分配给特殊氨基酸,
通过使具有相同反密码子序列的起始tRNA和延伸tRNA结合不同的特殊氨基酸,能够在翻译起始反应和延伸反应中将相同序列的密码子分配给不同的特殊氨基酸,
利用多个mRNA作为模板,在体外翻译系统中添加氨基酰基起始tRNA进行肽合成,从而在一个翻译系统中合成具有彼此不同的N末端氨基酸的多个肽,所述多个mRNA具有序列彼此不同的人工起始密码子作为翻译起始位点的密码子,所述氨基酰基起始tRNA为:在具有与各个人工起始密码子互补的反密码子的起始tRNA上结合了不同的特殊氨基酸的氨基酰基起始tRNA,
其中,所述特殊氨基酸指与蛋白质氨基酸的结构不同的氨基酸,所述蛋白质氨基酸为丙氨酸Ala、缬氨酸Val、亮氨酸Leu、异亮氨酸Ile、脯氨酸Pro、色氨酸Trp、苯丙氨酸Phe、甲硫氨酸Met、甘氨酸Gly、丝氨酸Ser、苏氨酸Thr、酪氨酸Tyr、半胱氨酸Cys、谷氨酰胺Gln、天冬酰胺Asn、赖氨酸Lys、精氨酸Arg、组氨酸His、天冬氨酸Asp及谷氨酸Glu这20种氨基酸。
2.根据权利要求1的方法,结合了特殊氨基酸的tRNA是将体外转录合成的tRNA在体外进行氨基酰基化而制备的。
3.根据权利要求1或2的方法,延伸反应用的改变后的遗传密码表的特征在于,在通用遗传密码表中分别指定Leu、Val、Ser、Pro、Thr、Ala、Arg、及Gly的多个密码子的一部分被分配给特殊氨基酸。
4.根据权利要求3的方法,延伸反应用的改变后的遗传密码表中,在通用遗传密码表中分别指定Leu、Val、Ser、Pro、Thr、Ala、Arg、Gly的4个或6个密码子中,2个密码子仍被分配给原来的蛋白质氨基酸,但其余的这些密码子被分配给任意的特殊氨基酸。
5.根据权利要求3的方法,延伸反应用的改变后的遗传密码表中,进而,将终止密码子的一部分分配给特殊氨基酸。
6.根据权利要求4的方法,延伸反应用的改变后的遗传密码表中,进而,将终止密码子的一部分分配给特殊氨基酸。
7.根据权利要求1或2的方法,体外翻译系统含有代替天然tRNA的体外转录合成的tRNA、及能够使蛋白质氨基酸与所述tRNA特异结合的ARS的组合作为蛋白质氨基酸用的tRNA及ARS的组合,不含天然tRNA。
8.根据权利要求1或2的方法,翻译起始位点的密码子为由AUG或AUG以外的任意的三联序列构成的人工起始密码子。
9.根据权利要求8的方法,人工起始密码子为AUG、UGG、AUC、ACC、UCG、AAC、GCC、GGC、CCG、CGG、GGG或AUA。
10.根据权利要求1或2的方法,在翻译起始反应和延伸反应中被分配给不同的特殊氨基酸的相同序列的密码子是AUG、UGG、AUC、ACC、UCG、或AAC。
11.根据权利要求1的方法,在体外翻译系统中,添加由具有彼此不同的各种序列的模板核酸构成的核酸文库、结合了任意的特殊氨基酸的具有各种反密码子序列的起始tRNA、及结合了任意的特殊氨基酸的具有各种反密码子序列的延伸用tRNA,合成由具有各种序列的特殊肽构成的肽文库。
12.根据权利要求11的方法,特殊肽以与编码该肽的模板核酸结合的状态被合成。
13.一种用于翻译合成特殊肽的试剂盒,其至少包含:
(i)如下mRNA:编码肽的区域包含
(a)指定人工起始残基的人工起始密码子、及
(b)指定特殊氨基酸的延伸密码子
的mRNA,
其中所述延伸密码子为改变后的密码子,在通用遗传密码表中指定1种蛋白质氨基酸的多个密码子的一部分被分配给所述特殊氨基酸;
(ii)如下的人工起始残基及特殊氨基酸用的氨酰tRNA:
(c)具有与前述(a)的人工起始密码子互补的反密码子的、结合了人工起始残基的起始tRNA、及
(d)具有与前述(b)的延伸密码子互补的反密码子的、结合了特殊氨基酸的延伸tRNA;
(iii)如下的组合:一种蛋白质氨基酸用的tRNA及ARS的组合,其含有蛋白质氨基酸、不含修饰碱基的人工tRNA、及能够使蛋白质氨基酸与所述人工tRNA结合的ARS;及
(iv)分离得到的核糖体。
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