CN102888387A - 3-氯代酪氨酸翻译系统及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及氨酰基-tRNA合成酶突变体，其含有的氨基酸序列选自由SEQ ID NO：2、3、4所示氨基酸和它们的保守性变体构成的组。本发明提供利用正交tRNA、正交氨酰基-tRNA合成酶和它们的配对将3-氯代酪氨酸掺入目标蛋白质的3-氯代酪氨酸翻译系统，和利用所述翻译系统在目标蛋白质中掺入3-氯代酪氨酸的方法。所述3-氯代酪氨酸翻译系统包含：(i)3-氯代酪氨酸；(ii)正交氨酰基-tRNA合成酶；(iii)正交tRNA，其中所述正交氨酰基-tRNA合成酶用所述3-氯代酪氨酸优先氨酰化所述正交tRNA；和(iv)编码目标蛋白质的核酸，其中所述核酸含有所述正交tRNA特异性识别的至少一个选择密码子。

Description

3-氯代酪氨酸翻译系统及其应用

技术领域

本发明属于生物化学领域。具体地，本发明提供氨酰基-tRNA合成酶突变体，其含有的氨基酸序列选自由SEQ ID NO：2、3、4所示氨基酸和它们的保守性变体构成的组。本发明还涉及一种3-氯代酪氨酸(3-Cl-Tyr)翻译系统。更具体地，本发明涉及利用正交tRNA、正交氨酰基-tRNA合成酶和它们的配对将3-氯代酪氨酸掺入目标蛋白质的3-氯代酪氨酸翻译系统，和利用所述翻译系统在目标蛋白质中掺入3-氯代酪氨酸的方法。本发明还涉及用这种翻译系统和这种方法产生的含有3-氯代酪氨酸的突变蛋白质。

背景技术

生物体氧化应激状态产生的活性物质一方面可以起到防御和免疫作用，另一方面会对自身蛋白造成氧化损伤，其中蛋白酪氨酸残基氯代是一种常见的氧化修饰，目前已知这种氧化修饰与帕金森氏病，哮喘，动脉粥样硬化，急性心肌梗死等疾病密切相关(Choi DK，Pennathur S，PrzedborskiS，et al.J Neurosci 2005，25(28)：6594-6600；Aldridge RE，Chan T，Kettle AJ，etal.Free Radic Biol Med 2002，33(6)：847-856.)。载脂蛋白ApoA1是高密度脂蛋白主要成分，介导胆固醇从血管壁到血液反向传输。ApoA1 192位酪氨酸是髓过氧化物酶氯代修饰的主要位点，在动脉粥样硬化患者中发现有高水平的ApoA1氯代(Heinecke JW.Am J Cardiol 2003，91(3A)：12A-16A.)。目前研究ApoA1氯代与功能主要采用位点突变和氧化剂氧化的方法，除了192位酪氨酸可以被氯化，其它氨基酸和位点也可以被氧化。从而使目前ApoA1氧化与功能损伤机理仍然存在争议(Shao B，Bergt C，HeineckeJW，et al.J Biol Chem 2005，280(7)：5983-5993；Peng DQ，Wu Z，Brubaker G，Smith JD，et al.J Biol Chem 2005，280(40)：33775-33784.)。

另一方面，生物体内有一些酸性的环境，如溶酶体(lysosome)，以及与溶酶体相关的自噬体(autophagosome)及抗原呈递过程中的吞噬酶体(phagolysosome)，它们内部pH低于6，在4-5左右。目前用来标记这类酸性细胞器主要使用EGFP-LC3载体(Ni HM，Bockus A，Ding WX，et al.Autophagy，7(2)：188-204.)。但是当EGFP进入酸性细胞器内部，会引起488nm激发荧光减弱。目前通过引入红色荧光蛋白mRFP来标记自噬体(Kimura S，Noda T，Yoshimori T.Autophagy 2007，3(5)：452-460.)。由于mRFP pKa为4.5，在600nm处发红光，在自噬体中不影响其荧光亮度。

虽然目前有红色荧光蛋白dsRed pKa 4.3(Baird GS，Zacharias DA，Tsien RY.Proc Natl Acad Sci U S A 2000，97(22)：11984-11989.)，青色荧光蛋白ECFP pKa 4.7(Patterson G，Day RN，Piston D.J Cell Sci 2001，114(Pt5)：837-838.)，但是目前使用的绿色荧光蛋白EGFP pKa 6.0，黄色荧光蛋白YFP pKa 5.6均不太适合标记溶酶体等酸性细胞器，而研究细胞内蛋白与蛋白相互作用，以及多种蛋白的动态情况，往往需要多种不同颜色的荧光蛋白来标记。

对比Tyr，Cl-Tyr的酚环羟基更容易解离去质子化，具有更低的pKa值。在绿色荧光蛋白GFP中包含有Ser-Tyr-Gly交联形成的荧光活性中心(Reid B G，Flynn GC.Biochemistry 1997，36(22)：6786-6791.)，我们设想在GFP荧光活性中心用Cl-Tyr取代Tyr会降低荧光活性中心pKa，使其在酸性条件下，荧光活性中心主要以去质子化形式存在。由于中性状态GFP荧光活性中心激发峰波长为397nm，在紫外区域，这个波段的光会给细胞带来光损伤。而去质子化状态GFP荧光活性中心激发峰波长在470nm，不会给细胞带来损伤。同时我们也可对单分子成像中应用最突出的一种荧光蛋白mEOS2荧光活性中心用3-Cl-Tyr取代Tyr来研究其pKa及光学性质(McKinney SA，Murphy CS，Looger LL.A，et al.Nat Methods.2009，6(2)：131-133.)。

为了研究这些蛋白质的结构和功能，本领域需要能将非天然3-氯代酪氨酸掺入蛋白质的新方案。现已开发了在原核和真核生物中将各种非天然氨基酸体内位点特异性地掺入蛋白质的通用方法。这些方法依赖于正交蛋白质翻译组分，所述组分识别合适的选择密码子(selector codon)从而能在体内多肽翻译期间将所需的非天然氨基酸插入限定位置。这些方法利用识别选择密码子的正交tRNA(O-tRNA)，而相应的特异性正交氨酰基-tRNA合成酶(O-RS)用非天然氨基酸加载该O-tRNA。这些组分不与宿主生物体内的任何内源性tRNA、氨酰基-tRNA合成酶(RS)、氨基酸或密码子交叉反应(即，它必须是正交的)。利用这种正交tRNA-RS配对可能遗传编码大量结构各异的非天然氨基酸。

本领域普遍知道利用适合于制备含一个或多个非天然氨基酸的蛋白质的正交翻译系统，例如产生正交翻译系统的通用方法。例如，参见国际公布号WO 2002/086075，其名为“METHODS AND COMPOSITION FORTHE PRODUCTION OF ORTHOGONAL tRNA-AMINOACYL-tRNASYNTHETASE PAIRS”；WO 2002/085923，其名为“IN VIVOINCORPORATION OF UNNATURAL AMINO ACIDS”；WO 2004/094593，其名为“EXPANDING THE EUKARYOTIC GENETIC CODE”。掺入非天然氨基酸的正交翻译系统及它们的产生和使用方法的其他讨论还可参见Wang和Schultz，Chem.Commun.(Camb)1：1-11(2002)；Wang和Schultz，Angewandte Chemie Int.Ed.44(1)：34-66(2005)；Xie和Schultz，Methods36(3)：227-238(2005)；Xie和Schultz，Curr.Opinion in Chemical Biology9(6)：548-554(2005)；Wang等，Annu.Rev.Biophys.Biomol.Struct.35：225-249(2006)。

发明内容

1、技术问题

本发明提供氨酰基-tRNA合成酶突变体，其含有的氨基酸序列选自由SEQ ID NO：2、3、4所示氨基酸和它们的保守性变体构成的组。本发明涉及利用正交tRNA、正交氨酰基-tRNA合成酶和它们的配对将3-氯代酪氨酸掺入目标蛋白质的3-氯代酪氨酸翻译系统，和利用所述翻译系统在目标蛋白质中掺入3-氯代酪氨酸的方法。本发明还涉及用这种翻译系统和这种方法产生的含有3-氯代酪氨酸的突变蛋白质。

因此，本发明的目的在于提供利用正交tRNA、正交氨酰基-tRNA合成酶和它们的配对将3-氯代酪氨酸掺入蛋白质的3-氯代酪氨酸翻译系统，并且提供该翻译系统在目标蛋白质中掺入3-氯代酪氨酸的方法。

在本发明的优选方面中，本发明人利用这种方法将3-氯代酪氨酸分别掺入肌红蛋白(myoglobin)、ApoA1、mEOS2和GFP及其系列突变体中来研究这些蛋白的性质。

2、技术方案

本发明提供在体内(例如在宿主细胞内)对选择密码子(selector codon)如琥珀终止密码子(TAG)起反应而将非天然氨基酸3-氯代酪氨酸掺入延伸中的多肽链的3-氯代酪氨酸翻译系统。所述3-氯代酪氨酸翻译系统包含不与宿主细胞翻译机制相互作用的正交-tRNA(O-tRNA)和正交氨酰基-tRNA合成酶(O-RS)配对。即，宿主细胞内源性氨酰基-tRNA合成酶不会用氨基酸(天然的或非天然的)加载O-tRNA。类似地，本发明提供的O-RS不以显著水平或者某些情况下不以可检测水平地用氨基酸(天然的或非天然的)加载内源性tRNA。利用所述翻译系统能够产生含有在翻译过程中掺入3-氯代酪氨酸的大量蛋白质。

在一些方面中，本发明提供3-氯代酪氨酸翻译系统。所述翻译系统包含：(a)非天然氨基酸，即3-氯代酪氨酸，(b)正交氨酰-tRNA合成酶(O-RS)，和(c)正交tRNA(O-tRNA)，其包含SEQ ID NO：1所示的多核苷酸序列，其中所述正交氨酰-tRNA合成酶用所述非天然氨基酸(即3-氯代酪氨酸)，优先氨酰化所述O-tRNA。

优选地，本发明的3-氯代酪氨酸翻译系统还包含编码目标蛋白质的核酸，其中所述核酸含有由正交tRNA(O-tRNA)特异性识别的至少一个选择密码子，优选地为琥珀密码子。更优选地，本发明的3-氯代酪氨酸翻译系统还包含编码正交氨酰基-tRNA合成酶的核苷酸序列。

所述系统中所用的正交氨酰基-tRNA合成酶(O-RS)即为本发明人发现的氨酰基tRNA合成酶突变体，其含有的氨基酸序列选自由SEQ ID NO：2、3、4所示氨基酸和它们的保守性变体构成的组。

在本发明的优选方面中，本发明提供一种3-氯代酪氨酸翻译系统，所述系统包含：

(i)3-氯代酪氨酸；

(ii)正交氨酰基-tRNA合成酶；

(iii)正交tRNA，其包含SEQ ID NO：1所示的多核苷酸序列；其中所述正交氨酰基-tRNA合成酶用所述3-氯代酪氨酸优先氨酰化所述正交tRNA；和

(iv)编码目标蛋白质的核酸，其中所述核酸含有所述正交tRNA特异性识别的至少一个选择密码子。

优选地，所述3-氯代酪氨酸翻译系统还包含编码正交氨酰基-tRNA合成酶的核苷酸序列。

该翻译系统中的各种组分可以衍生自各种物种来源，例如，该翻译系统中的各组分衍生自詹氏甲烷球菌(Methanococcus jannaschii)。例如，正交tRNA(O-tRNA)为古菌来源的反密码子突变为与琥珀密码互补的酪氨酸tRNA。在一些实施方式中，O-tRNA是琥珀抑制型tRNA。在一些实施方式中，O-tRNA包含SEQ ID NO：1所示的多核苷酸序列，优选地，O-tRNA的序列如SEQ ID NO：1所示。在一个实施方式中，用于该系统的正交氨酰基-tRNA合成酶(O-RS)可以包含SEQ ID NO：2、3或4所示的氨基酸序列及该序列的保守变体。

在一些方面中，本发明的3-氯代酪氨酸翻译系统还包含编码目标蛋白质的核酸，其中所述核酸具有由正交tRNA(O-tRNA)特异性识别的至少一个选择密码子。在优选方面中，所述正交tRNA是琥珀抑制型tRNA，并且所述选择密码子是琥珀密码子。

在一些方面中，本发明提供包含正交tRNA序列和编码正交氨酰基-tRNA合成酶的核苷酸序列的宿主细胞。所用的宿主细胞不作具体限定，只要O-RS和O-tRNA在它们的宿主细胞环境中保留它们的正交性即可。例如，所述宿主细胞可以是真细菌细胞，如大肠杆菌。

本发明还提供产生在至少一个所选位置掺入3-氯代酪氨酸的突变蛋白质的方法。所述方法利用上述3-氯代酪氨酸翻译系统。所述方法通常始于提供含有以下组分的3-氯代酪氨酸翻译系统的步骤：(i)非天然氨基酸，即3-氯代酪氨酸；(ii)正交氨酰基-tRNA合成酶(O-RS)；(iii)正交tRNA(O-tRNA)，其包含SEQ ID NO：1所示的多核苷酸序列，其中所述O-RS用所述非天然氨基酸(即3-氯代酪氨酸)优先氨酰化所述O-tRNA；和(iv)编码目标蛋白质的核酸，其中所述核酸含有O-tRNA特异性识别的至少一个选择密码子(任选地为琥珀密码子)；然后将编码所述目标蛋白质的核酸转化到包含正交tRNA序列和编码正交氨酰基-tRNA合成酶的核苷酸序列的宿主细胞中，在所述蛋白质的翻译过程中，3-氯代酪氨酸氨酰化的O-tRNA对所述选择密码子起反应而将培养基中的3-氯代酪氨酸掺入所述目标蛋白质的所选位置，从而产生在所选位置含有3-氯代酪氨酸的蛋白质。

在所述方法的一些实施方式中，提供翻译系统的步骤包括通过定点诱变使野生型氨酰基-tRNA合成酶的氨基酸结合口袋发生突变，选择用所述非天然氨基酸(即3-氯代酪氨酸)优先氨酰化所述O-tRNA的氨酰基-tRNA合成酶突变体(即，本发明所用的正交氨酰基-tRNA合成酶)。所述选择步骤包括定点诱变后从得到的氨酰基-tRNA合成酶分子库进行所述O-RS的正选择和负选择(参见下述实施例1)。在一些实施方式中，提供翻译系统的步骤还包括提供O-tRNA的序列，O-tRNA为古菌来源的反密码子突变为与琥珀密码互补的酪氨酸tRNA，例如，所述O-tRNA是琥珀抑制型tRNA，或者O-tRNA包含SEQ ID NO：1所示的多核苷酸序列。在这些方法中，提供翻译系统的步骤还包括提供含有所述翻译系统所用的琥珀选择密码子的编码目标蛋白质的核酸。

还可在宿主细胞内实施产生含有3-氯代酪氨酸的突变蛋白质的方法。在这些情况中，提供的宿主细胞包含本发明的3-氯代酪氨酸翻译系统(即，包含编码O-RS的核苷酸序列、O-tRNA序列和含有至少一个选择密码子的编码目标蛋白质的核酸)，而在适宜的培养条件下(例如，在培养基中添加3-氯代酪氨酸等)培养该宿主细胞可导致在所述目标蛋白质中掺入3-氯代酪氨酸。在一些实施方式中，提供步骤包括提供真细菌宿主细胞(例如，大肠杆菌)。

本发明还提供改变荧光蛋白pKa及光学性质的方法，所述方法利用上述3-氯代酪氨酸翻译系统。这些方法通常始于提供含有以下组分的3-氯代酪氨酸翻译系统的步骤：(i)3-氯代酪氨酸；(ii)正交氨酰基-tRNA合成酶(O-RS)；(iii)正交tRNA(O-tRNA)，其包含SEQ ID NO：1所示的多核苷酸序列，其中所述O-RS用所述3-氯代酪氨酸优先氨酰化所述O-tRNA；和(iv)编码所述荧光蛋白质的核酸，其中所述核酸含有所述O-tRNA特异性识别的至少一个选择密码子(任选地为琥珀密码子)；然后在所述蛋白质的翻译过程中，3-氯代酪氨酸氨酰化的O-tRNA对所述选择密码子起反应而将培养基中的所述3-氯代酪氨酸掺入所述荧光蛋白的所选位置，使其pKa降低，同时改变光学性质。

3、有益效果

通常研究蛋白酪氨酸氯化损伤影响蛋白功能，在体外研究主要采用次氯酸等氧化剂进行体外氧化，这样的缺点是对酪氨酸位点没有特异性，很多酪氨酸位点都可以氧化，同时又会引起假阳性，因为其它氨基酸被氧化同样会引起功能损伤，此外这种方法比较难以应用于体内。另外是采用酪氨酸位点突变为苯丙氨酸或其它氨基酸，但是这种方法难以消除氨基酸本身突变而引起的功能变化。我们通过基因密码扩展方法，在目标蛋白任意位点通过引入TAG琥珀密码子，可以特异性引入3-氯代酪氨酸，从而可以位点特异性研究某个位点酪氨酸氯化引起的蛋白功能损伤。

我们通过这种方法，在ApoA1-192位成功引入3-氯代酪氨酸，可以进一步结晶ApoA1氯代型，与野生型结构比较，从而可以从结构上解释酪氨酸氯代与功能关系。另外在细胞中，可以研究氯代ApoA1介导的胆固醇反向运输，提供酪氨酸氯代与胆固醇反向运输障碍的新方法和直接证据。

由于氯原子的影响，Cl-Tyr的pKa为8.3，低于Tyr的pka(为10.5)，一些荧光蛋白荧光活性中心包含有酪氨酸交联形成的共轭体系，因此具有质子化和去质子化两种存在形式。据此我们推断在荧光活性中心用3-Cl-Tyr取代Tyr会降低pKa，适合标记酸性细胞器。

因此，我们系统的研究了3-Cl-Tyr突变的绿色荧光蛋白突变体，发现在绿色荧光蛋白活性中心氯代能够明显的降低绿色荧光蛋白的pKa，其中GFP66-Cl-Tyr降低最明显，由pKa高于10.8降低到pKa 4.7。推断其降低pKa主要有两个方面的原因，一方面，从结构上来看，GFP66-Cl-Tyr跟EGFP(S65T)有相似的结构效果，荧光活性中心增加一个Cl离子，阻碍了GFP的66位Tyr，水分子，Glu222之间的质子传递体系，从而以66位Tyr主要以去质子化形式存在；另一方面，3-Cl-Tyr比Tyr有更低的pKa，从而也降低了荧光活性中心的pKa。而Cl原子的空间位阻效应应该是主要原因。

在EGFP66-Cl-tyr，以及YFP66-Cl-Tyr突变体中均比相应野生型pKa降低pH 1左右，因为EGFP和YFP在结构上有利于荧光活性中心以去质子化形式存在，推断其影响pKa主要为3-Cl-Tyr比Tyr有更低的pKa。

从荧光量子产率来看，荧光活性中心氯代突变体均比野生型量子产率有所降低。但是GFP66-Cl-Tyr荧光量子产率为0.57，与EGFP荧光量子产率0.60相当，但是相比EGFP具有更低的pKa，EGFP pKa为6.0，而GFP66-Cl-Tyr pKa为4.7。

光激活绿红转化荧光蛋白mEOS2由于在400nm强光照射情况下，会由发绿色荧光转化为发红色荧光，是研究单分子成像的理想荧光分子。其荧光活性中心由His62-Tyr63-Gly64共轭交联形成。绿色状态的mEOS2pKa为5.6，我们通过用3-Cl-Tyr取代Tyr使其pKa降低到4.2，使其可以在溶酶体和吞噬酶体中保持去质子化状态，在502nm光照情况下发绿光。

我们根据氨基酸的pKa性质，理性的设计出了pKa降低的绿色荧光蛋白GFP，黄色荧光蛋白YFP，以及光转化荧光蛋白mEOS2.

传统的进化酶或蛋白的方式是通过在酶活中心或附近做定点突变库，或者易错PCR来引入随机突变。这往往需要很大的库容量以及合适的筛选策略。而这种根据氨基酸性质定点引入突变的理性设计提高了目标的靶向性。另外可以根据进化目标需要引入相应功能的非天然氨基酸，为酶和蛋白的定向进化提供了新的思路和解决办法。

总之，我们进化出了可以位点特异性插入3-Cl-Tyr的氨酰基-tRNA合成酶，为体内外研究蛋白氯代氧化损伤提供了新的方法。我们通过荧光活性中心氯代，得到了具有更低pKa，以及荧光波谱稍有红移的突变体。尤其是GFP66-Cl-Tyr，具有跟EGFP相似的荧光量子产率，和更低的pKa。另外mEOS2氯代使其pKa由5.6降低到4.2是标记溶酶体、吞噬酶体(内部pH4-5)等酸性细胞器的合适的荧光蛋白。最后由于这种理性设计进化荧光蛋白方法，突破了传统定向进化中突变库容量和筛选策略的限制，引入了带有新性质的非天然氨基酸，为酶和蛋白定向进化提供了新的思路。

附图说明

从下面结合附图的详细描述中，本发明的上述特征和优点将更明显，其中：

图1是3-氯代酪氨酸结构式；

图2是正交tRNA及特异性识别3-Cl-Tyr的氨酰基-tRNA合成酶的序列；

图3是3-Cl-Tyr-肌红蛋白的SDS-PAGE电泳图；

图4是3-Cl-Tyr-肌红蛋白的质谱图；

图5是3-Cl-Tyr-ApoA1的质谱图：上图是3-Cl-Tyr-ApoA1的HPLC图谱，下图是3-Cl-Tyr-ApoA1的核质比图谱；

图6是绿色荧光蛋白不同突变体的pKa：上图是EGFP的pKa滴定曲线，488nm处波峰曲线由上到下依次指pH为10.0、9.0、8.0、7.0、6.6、6.4、6.2、6.0、5.8、5.6、5.4、5.2、5.0、4.8、4.0、3.0；中图是GFP-66-Cl-Tyr的pKa滴定曲线，484nm处波峰曲线由上到下依次指pH为10.0、9.0、8.0、7.0、6.0、5.4、5.2、5.0、4.8、4.6、4.5、4.4、4.2、4.0、3.0；下图是GFP不同突变体的pKa滴定曲线；

图7是绿色荧光蛋白不同突变体的荧光性质：上图是GFP不同突变体的吸收光谱，下图是GFP不同突变体的荧光光谱；

图8是mEOS2-63-Cl-Tyr的荧光光谱；

图9是mEOS2-63-Cl-Tyr的pKa滴定，其中502nm处波峰曲线由上到下依次指pH为10.0、9.0、8.5、8.0、7.5、6.8、6.6、6.4、6.2、6.0、5.8、5.6、5.4、5.2、5.0、4.8、4.6、4.4、4.2、4.0、3.8、3.6、3.6、3.6、3.4、3.2、3.0)及Henderson-Hasselbalch方程曲线(方框内的曲线图)。

具体实施方式

以下通过实施例来进一步阐明本发明。但是应该理解，所述实施例只是举例说明的目的，并不意欲限制本发明的范围和精神。

本领域技术人员应该理解，除非特别说明，下述实施例中所用的化学试剂均为可通过商业途径购得的分析纯级别的试剂。

实施例1：进化3-Cl-Tyr特异性氨酰基-tRNA合成酶

为了在基因中位点特异性插入3-Cl-Tyr，需要在所用的E.coli宿主细胞中引入氨酰基-tRNA合成酶/tRNA正交对，这个正交对来源于詹氏甲烷球菌(Methanococcus jannaschii)琥珀抑制酪氨酰tRNA(MjtRNA_CUA ^Tyr)/酪氨酰tRNA合成酶(MjTyrRS，野生型，其氨基酸序列为SEQ ID NO：12)对。MjTyrRS突变库构建在卡纳霉素抗性pBK质粒(购自美国scripps研究所Peter G.Schultz实验室)中，位于该质粒上E.coli谷氨酰胺合成酶的启动子和终止子之间。所使用的合成酶突变库为pBk-lib-jw1库，该突变库的构建方法为：在MjTyrRS基因上挑选6个位点(Tyr32，Leu65，Phe108，Gln109，Asp158，和Leu162)引入NNK突变(N＝A+T+C+G；K＝T+G)，另外6个位点(Ile63，Ala67，His70，Tyr114，Ile159，Val164)或随机突变为Gly或保持不变(参见Xie，J.；Liu，W.S.；Schultz，P.G.Angew.Chem.，Int.Ed.2007，46，9239-9242；Wang，JY.；Zhang W.；Song WJ；et al.J.Am.Chem.Soc.2010，132，14812-14818)。

通过正负筛选来进化特异性识别3-Cl-Tyr的氨酰基-tRNA合成酶。正筛选质粒包含MjtRNA_CUA ^Tyr，TAG突变的氯霉素乙酰转移酶基因，启动表达绿色荧光蛋白的琥珀突变的T7RNA聚合酶，四环素抗性基因。负筛选质粒包含MjtRNA_CUA ^Tyr，在阿拉伯糖操纵子下的琥珀突变芽孢杆菌RNA酶基因，以及氨苄青霉素抗性基因。进行3轮正负筛选：包含有正筛选质粒的E.coli DH10B细胞作为正筛选寄主细胞。细胞电转pbk-lib-jw1库，SOC培养基(2％(W/V)胰蛋白胨，0.5％(W/V)酵母粉，0.05％(W/V)NaCl，2.5mM KCl，10mM MgCl₂，20mM葡萄糖)在37℃培养1小时。之后换用极限培养基(GMML极限培养基的配方：M9盐/甘油：764g Na₂HPO₄.7H₂O或者30g Na₂HPO₄，15g KH₂PO₄，2.5g NaCl，5g NH₄Cl，50ml甘油，高压灭菌，pH 7.0；1M MgSO₄：高压灭菌；50mM CaCl₂：高压灭菌；25mM FeCl₂：过滤灭菌；0.3M亮氨酸：溶解于0.3M NaOH中，过滤灭菌；1L液体GMML培养基：200ml M9盐/甘油，2ml MgSO₄，2ml CaCl₂，2ml FeCl₂，1ml亮氨酸)洗两次，铺板固体极限培养基(在液体GMML培养基中加入500ml 3％琼脂粉，1mM 3-Cl-Tyr，50mg/L卡那霉素，60mg/L氯霉素，15mg/L四环素)，37℃培养60小时。收取细胞，提取质粒DNA，电泳分离，胶回收。然后，将经过正筛选的pBK-lib-jw1转化到包含负筛选质粒的DH10B感受态细胞中。SOC培养基中恢复1小时。之后涂板包含0.2％阿拉伯糖(购自sigma公司)的LB固体培养基(每升培养基含10g胰蛋白胨，5g酵母粉，10g NaCl)。37℃培养8-12小时。共重复3轮。

最后一轮正筛选挑384个克隆，分别点板在含有1mM 3-Cl-Tyr、氯霉素60，80，100，120mg/L的GMML固体培养基上，及不包含3-Cl-Tyr、但包含氯霉素0，20，40，60mg/L的GMML固体培养基。挑选在在1mM3-Cl-Tyr 120mg/L氯霉素的培养基上生长，而在0mM 3-Cl-Tyr 40mg/L氯霉素培养基中不生长的克隆进行进一步验证。挑出3个克隆，测序结果如图2所述。其中克隆1的3-氯代酪氨酸插入效率最高，测序表明，克隆1所包含的氨酰基-tRNA合成酶突变体1的氨基酸序列为SEQ ID NO：2所示，其中的突变位点为H70A，D158S，I159S。

另外两种氨酰基-tRNA合成酶突变体2和3的氨基酸序列分别为SEQID NO：3和4所示。氨酰基-tRNA合成酶突变体1-3的相应的核苷酸序列分别为SEQ ID NO：5-7。

实施例2：表达3-Cl-Tyr-肌红蛋白及质谱鉴定

将正交tRNA(SEQ ID NO：1)和筛选出来的氨酰基-tRNA合成酶突变体1(SEQ ID NO：5)分别构建到pEVOL载体(购自美国scripps研究所Peter G.Schultz实验室)上，然后共转化到包含有pbad-肌红蛋白(4TAG)(该质粒购自美国scripps研究所Peter G.Schultz实验室)(其中肌红蛋白(4TAG)的核苷酸序列为SEQ ID NO：8)的DH10B细胞(购自全式金公司)中。挑取单个克隆在37℃培养到OD₆₀₀约等于0.5时，向LB培养基中加入1mM 3-Cl-Tyr(购自上海吉尔生化公司)，及0.2％阿拉伯糖(购自sigma公司)培养细胞，对照不加入3-Cl-Tyr。6-8小时之后，收菌，Ni-NTA纯化蛋白，并用SDS-PAGE电泳分析(图3)。

我们发现，只有在存在3-Cl-Tyr的培养基中才能纯化出全长的肌红蛋白，这说明氨酰基-tRNA合成酶突变体可以特异性的识别3-Cl-Tyr。在LB培养基中3-Cl-Tyr肌红蛋白的产率为2-5mg/L。为了检测3-Cl-Tyr仅仅插入到肌红蛋白的4位琥珀突变位点，我们对3-Cl-Tyr-肌红蛋白进行了ESI-TOF质谱检测，检测结果分子量为18465Da(图4)，与计算的分子量18465.5Da吻合。

实施例3：表达插入3-Cl-Tyr的ApoA1及其质谱鉴定

将AopA1(核苷酸序列为SEQ ID NO：9)构建在pet24a载体(购自novagen公司)上，同时将正交tRNA(SEQ ID NO：1)和筛选出来的氨酰基-tRNA合成酶突变体1(SEQ ID NO：5)分别构建到pEVOL载体(购自美国scripps研究所Peter G.Schultz实验室)上。通过重叠PCR方法，在ApoA1 192位引入TAG。共转化pEVOL-tRNA，pEVOL-3-Cl-TyrRS及pet24a-ApoA1-192TAG到BL21(DE3)细胞(购自全式金公司)中，挑单克隆到2YT培养基(每升培养基含16g胰蛋白胨，5g酵母粉，5gNaCl)，加相应的抗生素(卡纳霉素50ug/ml四环素10ug/ml)。待细胞生长到OD₆₀₀约等于1.0左右时，加入1mM 3-Cl-Tyr，IPTG 0.5mM，阿拉伯糖0.2％，37℃继续培养6-8h。收菌，Ni-NTA纯化蛋白。通过ESI质谱鉴定，我们发现纯化出的3-Cl-Tyr-ApoA1分子量为25156，对比野生型分子量25119，相差37，与一个Cl分子量相当(图5)。

实施例4：表达插入3-Cl-Tyr的荧光蛋白并测定其pKa及检测光性质

将GFP系列突变体(GFP的核苷酸序列见SEQ ID NO：10，EGFP，YFP均通过GFP基因改造获得)均分别构建在pet24a载体(购自novagen公司)上，同时将正交tRNA(SEQ ID NO：1)和筛选出来的氨酰基-tRNA合成酶突变体1(SEQ ID NO：5)分别构建到pEVOL载体(购自美国scripps研究所Peter G.Schultz实验室)上。Pet24a-EGFP通过重叠PCR方法，在GFP基因上引入F64L，S65T。pet24a-YFP通过重叠PCR方法，在GFP基因引入S65G，S72A，K79R，T203Y。用同样方法，在GFP，EGFP，YFP的66位引入TAG，在GFP，YFP的203位引入TAG。共转化pEVOL-tRNA，pEVOL-3-Cl-TyrRS及相应的荧光蛋白载体如pet24a-GFP66TAG，pet24a-GFP203TAG，pet24a-EGFP66TAG，pet24a-YFP66TAG，pet24a-YFP203TAG，pe24at-mEOS2-63TAG到BL21(DE3)细胞(购自全式金公司)中，表达纯化条件同ApoA1-192-Cl-Tyr。

将上述各种荧光蛋白溶在不同pH值范围的缓冲液中：(1)不同比例的0.1M柠檬酸-0.2M的Na₂HPO₄缓冲液中，pH值3.0-7.0；(2)pH7.5-10.0为50mM Tris缓冲液；(3)pH值10.5，10.8为0.1M Na₂CO₃-NaHCO₃。紫外分光光度计扫描光吸收，从240nm到700nm。

从pH3.0-10.8，测定荧光蛋白去质子化状态吸收峰，YFP 514nm，YFP203-Cl-Tyr 514nm，YFP66-Cl-Tyr 519nm，EGFP 488nm，EGFP66-Cl-Tyr498nm，GFP66-Cl-Tyr 484nm，mEOS2-63-Cl-Tyr 502nm。去质子化状态最高吸收峰值对应去质子化比例为1，其它pH值光吸收峰与最高吸收峰比例为相应去质子化比例。测定值做图，pH值为x轴，去质子化比例为y轴，根据Henderson-Hasselbalch公式：

$\mathrm{pH}=p{K}_a+\log \frac{\left[A^{-}\right]}{\left[\mathrm{HA}\right]}={\mathrm{pK}}_a-\log \frac{\left[\mathrm{HA}\right]}{\left[A^{-}\right]}---\left(1\right)$

推出： $\log \frac{\left[\mathrm{HA}\right]}{\left[A^{-}\right]}={\mathrm{pK}}_a-\mathrm{pH}---\left(2\right)$

推出： $\frac{\left[\mathrm{HA}\right]}{\left[A^{-}\right]}={10}^{{\mathrm{pK}}_a-\mathrm{pH}}---\left(3\right)$

而 $y=\frac{\left[A^{-}\right]}{\left[A^{-}\right]+\left[\mathrm{HA}\right]}=\frac{1}{\frac{\left[\mathrm{HA}\right]}{\left[A\right]}+1}$

$=\frac{1}{{10}^{{\mathrm{pK}}_a-\mathrm{pH}}+1}=\frac{1}{{10}^{{\mathrm{pK}}_a-x}+1}---\left(4\right)$

测定的pH值(x)，去质子化比例(y)根据公式4拟合曲线，计算pKa。

其中GFP，GFP203-Cl-Tyr，GFP203-Tyr，滴定pH3.0-10.8，质子化形式荧光活性中心光吸收没有明显的降低。故其pKa高于我们测定的pH范围，在pH 10.8以上。其它绿色荧光蛋白突变体的pKa如图6所示，EGFP66-Cl-Tyr pKa为pH4.7，EGFP pKa为pH6.0，YFP66-Cl-Tyr pKa为pH4.9，YFP pKa 5.6，GFP66-Cl-Tyr pKa为pH4.7。荧光活性中心氯代能够明显降低绿色荧光蛋白的pKa，其中EGFP66-Cl-Tyr和YFP66-Cl-Tyr均比野生型降低pKa pH值1左右。而GFP66-Cl-Tyr降低pKa最明显，由原来的pH 10.8以上，降低到pH 4.7。

Hi-tachi F4500荧光分光光度计(日本，日立公司)检测，发射波谱测定，EFP66-Cl-Tyr，EFP，GFP66-Cl-Tyr固定450nm激发，扫描450-700发射谱。GFP203Y，GFP203-Cl-Tyr，GFP固定375nm激发，扫描380-700nm发射波谱。YFP，YFP203-Cl-Tyr，YFP66-Cl-Tyr固定470nm激发，扫描470-700nm发射波谱。

激发波谱测定，EGFP66-Cl-Tyr，EGFP，GFP66-Cl-Tyr固定545光发射，扫描200-540光激发波谱。GFP203Y，YFP66-Cl-Tyr，GFP固定565nm光发射，扫描200-560nm光激发波谱。YFP，YFP203-Cl-Tyr固定560nm光发射，扫描200-555nm光激发波谱。

GFP66-Cl-Tyr，EGFP，EGFP66-Cl-Tyr，GFP溶在pH7.050mM Tris缓冲液中，488nm光吸收为0.1，514nm光激发，扫描495-700nm发射波谱。激发495-620nm发射波谱，以已经发表的EGFP荧光量子产率0.60为标准。YFP，YFP66-Cl-Tyr，YFP203-Cl-Tyr，GFP203-Cl-Tyr，GFP203Y溶在pH7.050mM Tris缓冲液中，稀释514nm光吸收为0.1，514nm光激发，扫描520-700nm光发射波谱。激发520-620nm发射波谱，根据已经发表的YFP量子产率0.60为标准。

在pH7.0情况下，从最大光吸收来看，荧光活性中心氯代突变体均比野生型光吸收向红光方向偏移约5-10nm。其中GFP最大光吸收为396nm，是质子化荧光活性中心的光吸收，而GFP66-Cl-Tyr最大光吸收是488nm，是去质子化荧光活性中心光吸收。

从摩尔消光系数来看，荧光活性中心氯代对比野生型荧光蛋白摩尔消光系数均有增加。其中EGFP66-Cl-Tyr消光系数增加41％。而在203位Cl-Tyr取代Tyr没有怎么影响绿色荧光蛋白光吸收和摩尔消光系数。

我们进一步在pH7.0情况下，测定了绿色荧光蛋白不同突变体的荧光性质(图7)。

从荧光激发波谱和荧光发射波谱来看，荧光活性中心氯代的突变体均比野生型最大激发波长及最大发射波长向红光方向偏移，其中GFP66-Cl-Tyr最大激发波长为492nm，对比GFP的最大发射波长397nm，荧光活性中心主要为去质子化形式。

而不同类型绿色荧光蛋白203位Cl-Tyr取代Tyr没有怎么影响绿色荧光蛋白的荧光发射波谱及荧光激发波谱。从不同绿色荧光蛋白突变体量子产率来看，荧光活性中心氯代比野生型蛋白荧光量子产率有所降低。但是GFP203-Cl-Tyr突变体比GFP203-Tyr在405nm左右光激发荧光量子产率有所提高，由0.23增高到0.39。

实施例5：3-Cl-Tyr插入mEOS2荧光蛋白并检测其光学性质

通过与实施例2或3相同的方法，将mEOS2基因(其核苷酸序列为SEQ ID NO：11)构建在pet24a载体(购自novagen公司)上，同时将正交tRNA(SEQ ID NO：1)和筛选出来的氨酰基-tRNA合成酶突变体1(SEQID NO：5)分别构建到pEVOL载体(购自美国scripps研究所Peter G.Schultz实验室)上。通过重叠PCR方法，在mEOS2 63位引入TAG。共转化pEVOL-tRNA，pEVOL-3-Cl-TyrRS及pet24a-mEOS2-63TAG到BL21(DE3)细胞(购自全式金公司)中，在蛋白翻译过程中，通过本发明的翻译系统将mEOS2 Tyr63替换为3-Cl-Tyr，并测量mEOS2发射光谱和激发光谱。

对于mEOS2的绿色荧光状态，其吸收光谱最大吸收峰为506nm，发射光谱峰值为519nm。对于mEOS2-63-Cl-Tyr的绿色荧光状态，我们测得吸收峰为502nm，发射峰为518nm。可见吸收峰向短波长移动4nm，而发射峰几乎没变(图8)。

对于绿色荧光状态的3-Cl-Tyr-mEos2，随着pH的降低，502nm吸收峰逐渐降低，同时在381nm处出现吸收峰并逐渐升高(图9)。在pH3.0时，502nm吸收峰几乎完全消失。绿色荧光状态的mEos2随着pH降低会在395nm出现吸收峰。与野生型类似，3-Cl-Tyr-mEos2的381nm吸收峰对应着发色团的质子化状态的光吸收，而502nm吸收峰对应着去质子化发色团的光吸收。发色团的质子化与去质子化发生在酪氨酸的酚羟基上。3-Cl-Tyr使得质子化状态的吸收峰向短波方向移动了14nm。吸收光谱随pH变化的过程中，在426nm处存在一个等消光点，其吸光值不随pH的变化而变化。3-Cl-Tyr的替代不仅改变了荧光发色团在质子化以及去质子化状态的吸收峰，而且改变了发色团的pKa。mEos2的pKa＝5.6。3-Cl-TyrmEos2在502nm的吸收峰随pH的变化可以用Henderson-Hasselbalch方程拟合，得到pKa＝4.2。

应该理解，尽管参考其示例性的实施方案，已经对本发明进行具体地显示和描述，但是本领域的普通技术人员应该理解，在不背离由后附的权利要求所定义的本发明的精神和范围的条件下，可以在其中进行各种形式和细节的变化，可以进行各种实施方案的任意组合。

Claims (10)

1.一种3-氯代酪氨酸翻译系统，所述系统包含：

(i)3-氯代酪氨酸；

(ii)正交氨酰基-tRNA合成酶；

(iii)正交tRNA，其包含SEQ ID NO：1所示的多核苷酸序列；其中所述正交氨酰基-tRNA合成酶用所述3-氯代酪氨酸优先氨酰化所述正交tRNA；和

(iv)编码目标蛋白质的核酸，其中所述核酸含有所述正交tRNA特异性识别的至少一个选择密码子。

2.如权利要求1所述的翻译系统，其特征在于，所述正交氨酰基-tRNA合成酶含有的氨基酸序列选自由SEQ ID NO：2、3、4所示氨基酸和它们的保守性变体构成的组。

3.如权利要求1所述的翻译系统，其特征在于，所述正交tRNA是琥珀抑制型tRNA，并且所述选择密码子是琥珀密码子。

4.如权利要求1所述的翻译系统，其还包含编码正交氨酰基-tRNA合成酶的核苷酸序列。

5.一种宿主细胞，其包含所述正交tRNA序列和编码所述正交氨酰基-tRNA合成酶的核苷酸序列。

6.如权利要求5所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是真细菌细胞，优选大肠杆菌细胞。

7.一种产生在至少一个所选位置掺入3-氯代酪氨酸的突变蛋白质的方法，所述方法包括下述步骤：

(a)提供权利要求1所述的3-氯代酪氨酸翻译系统，该系统包含：

(i)3-氯代酪氨酸；

(ii)正交氨酰基-tRNA合成酶；

(iii)正交tRNA，其包含SEQ ID NO：1所示的多核苷酸序列；其中所述正交氨酰基-tRNA合成酶用所述3-氯代酪氨酸优先氨酰化所述正交tRNA；和

(iv)编码所述目标蛋白质的核酸，其中所述核酸在所选的位置包含所述正交tRNA特异性识别的至少一个选择密码子；和

(b)将编码所述目标蛋白质的核酸转化到权利要求5所述的宿主细胞中，在所述蛋白质的翻译期间，3-氯代酪氨酸氨酰化的正交tRNA对所述选择密码子起反应而将培养基中的3-氯代酪氨酸掺入所述目标蛋白质的所述所选位置，从而产生在所选位置含3-氯代酪氨酸的所述目标蛋白质。

8.如权利要求7所述的方法，其中所述正交氨酰基-tRNA合成酶含有的氨基酸序列选自由SEQ ID NO：2、3、4所示氨基酸和它们的保守性变体构成的组。

9.如权利要求7所述的方法，其中所述正交tRNA是琥珀抑制型tRNA，并且所述选择密码子是琥珀密码子。

10.一种氨酰基tRNA合成酶突变体，其含有的氨基酸序列选自由SEQ ID NO：2、3、4所示氨基酸和它们的保守性变体构成的组。

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