CN109295025B - 酪氨酸类似物翻译系统和基因编码的蛋白质光致电子转移荧光传感器蛋白家族 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及蛋白质光致电子转移荧光传感器蛋白家族iLovU,其包括五种突变体蛋白,其分别通过在野生型黄素蛋白iLov 486位氨基酸位点特异性插入3‑氯代酪氨酸、3,5‑二氯代酪氨酸、3,5‑二氟代酪氨酸、2,3,5‑三氟代酪氨酸或2,3,5,6‑四氟代酪氨酸(这五种酪氨酸类似物作为光致电子转移探针)而得到。本发明还涉及两种氨酰基‑tRNA合成酶突变体,其含有的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:11或13所示。这两种氨酰基‑tRNA合成酶突变体能够分别在翻译的氨基酸序列中插入3,5‑二氯代酪氨酸或2,3,5,6‑四氟代酪氨酸。
Description
本申请是申请号为201410444233.0的中国发明专利申请的分案申请,原始申请的发明名称为“酪氨酸类似物翻译系统和基因编码的蛋白质光致电子转移荧光传感器蛋白家族”,申请日为2014年9月3日。
技术领域
本发明属于生物化学领域。具体地,本发明提供两种酪氨酸类似物翻译系统和基因编码的蛋白质光致电子转移荧光传感器蛋白家族iLovU。更具体地,本发明通过基因编码的方法在黄素蛋白iLov中定点特异性插入五种酪氨酸类似物:3-氯代酪氨酸(ClY)、3,5-二氯代酪氨酸(Cl2Y)、3,5- 二氟代酪氨酸(F2Y)、2,3,5-三氟代酪氨酸(F3Y)、2,3,5,6-四氟代酪氨酸 (F4Y)(该五种酪氨酸类似物简称为ClnY/FnY)作为光致电子转移探针,得到的突变蛋白即为光致电子转移荧光传感器。本发明还涉及两种氨酰基 -tRNA合成酶突变体,其氨基酸序列分别如SEQ ID NO:11和13所示。这种氨酰基-tRNA合成酶突变体能够用3,5-二氯代酪氨酸/2,3,5,6-四氟代酪氨酸优先氨酰化与之配对的正交tRNA,从而在翻译的氨基酸序列中插入3,5-二氯代酪氨酸/2,3,5,6-四氟代酪氨酸。
背景技术
基因编码和荧光蛋白(fluorescent protein,简称FP)传感器是生物学研究中的重要技术手段。在过去的几十年中,人们已经开发出多种荧光蛋白传感器,用于监测金属离子,pH值,第二信使和翻译后修饰(PTM),这对于解开它们在体内信号转导网络中的作用是至关重要的。这些荧光蛋白传感器通常依赖于荧光共振能量转移(FRET)或者绿色荧光蛋白GFP 荧光团酚基的质子化/去质子化来发挥作用。尽管它们现在已被广泛应用,但是在分析物结合前后,这些荧光蛋白传感器的荧光强度变化通常都在两倍以内。相比之下,光致电子转移(photo-induced electron transfer,简称 PET)机制开始越来越广泛地被引用到荧光传感器设计中来,最重要的原因在于分析物结合前后,荧光蛋白传感器可以展现出显著的荧光强度变化 (通常可以增强10至100倍)。
蛋白质光致电子转移荧光传感器蛋白的设计通常使用荧光发光体-连接体-接受体的分子结构形式。在配体结合之前,传感器处于关闭状态,光激发致使受体和荧光基团之间产生电子转移,削弱光能,最终导致荧光淬灭。而当配体结合之后,传感器转变为开启状态,受体分子由于配体的结合可以显著增加HOMO能量,阻断光致电子转移,从而使荧光基团发射光子,产生荧光。基于这种原理,科学家在光致电子转移荧光传感器的设计中通常选择一些相对简单的分析物来进行传感器的开启,如H+,Na+,Ca2+, Zn2+,Cd2+,Pd2+,Hg2+,F-和神经元电压等。这些传感器现已广泛应用于临床,细胞生物学研究以及环境监测中。
为了开发基因编码的蛋白质光致电子转移传感器蛋白,我们首先需要在蛋白中遗传整合非天然氨基酸(UAAs)。本研究现已开发了在原核和真核生物中将各种非天然氨基酸体内位点特异性地定点插入蛋白的通用方法。这些方法依赖于正交蛋白翻译组分,所述组分识别合适的选择密码子 (selector codon)从而能在体内多肽翻译期间将所需的非天然氨基酸插入限定位置。这些方法利用识别选择密码子的正交tRNA(O-tRNA),而相应的特异性正交氨酰基-tRNA合成酶(O-RS)用非天然氨基酸加载该 O-tRNA。这些组分不与宿主生物体内的任何内源性tRNA、氨酰基-tRNA 合成酶(RS)、氨基酸或密码子交叉反应(即,它必须是正交的)。利用这种正交tRNA-RS配对可能遗传编码大量结构各异的非天然氨基酸。
本领域普遍知道利用适合于制备含一个或多个非天然氨基酸的蛋白的正交翻译系统,例如产生正交翻译系统的通用方法。例如,参见国际公布号WO 2002/086075,其发明名称为“METHODS AND COMPOSITION FOR THE PRODUCTION OF ORTHOGONAL tRNA-AMINOACYL-tRNA SYNTHETASE PAIRS”;WO 2002/085923,其发明名称为“IN VIVOINCORPORATION OF UNNATURAL AMINO ACIDS”;WO 2004/094593,其发明名称为“EXPANDINGTHE EUKARYOTIC GENETIC CODE”。定点特异插入非天然氨基酸的正交翻译系统及它们的产生和使用方法的其他讨论还可参见Wang和Schultz,Chem.Commun.(Camb)1:1-11(2002);Wang和 Schultz,Angewandte Chemie Int.Ed.44(1):34-66(2005);Xie和Schultz,Methods 36(3):227-238(2005);Xie和Schultz,Curr.Opinion in Chemical Biology 9(6):548-554(2005);Wang等,Annu.Rev.Biophys.Biomol.Struct.35: 225-249(2006)。
发明内容
本发明提供基因编码的蛋白质光致电子转移荧光传感器蛋白。通过基因编码的方法在黄素蛋白iLov中定点特异性插入五种酪氨酸类似物:3-氯代酪氨酸(ClY)、3,5-二氯代酪氨酸(Cl2Y)、3,5-二氟代酪氨酸(F2Y)、 2,3,5-三氟代酪氨酸(F3Y)、2,3,5,6-四氟代酪氨酸(F4Y)(该五种酪氨酸类似物简称为ClnY/FnY)作为光致电子转移探针,得到的突变蛋白即为蛋白质光致电子转移荧光传感器蛋白。
本发明还提供两种氨酰基-tRNA合成酶突变体,其氨基酸序列分别如 SEQ ID NO:11和13所示。这种氨酰基-tRNA合成酶突变体能够用3,5-二氯代酪氨酸/2,3,5,6-四氟代酪氨酸优先氨酰化与之配对的正交tRNA,从而在翻译的氨基酸序列中插入3,5-二氯代酪氨酸/2,3,5,6-四氟代酪氨酸。这是本发明人首次发现的。
因此,本发明的目的在于利用正交tRNA、正交氨酰基-tRNA合成酶的配对将五种酪氨酸类似物定点特异插入iLov蛋白中,得到蛋白质光致电子转移荧光传感器蛋白。
蛋白质光致电子转移传感器设计的重点主要是在合适的荧光蛋白上定点特异性插入环境敏感型光致电子转移探针。首先,我们选择遗传编码五种酪氨酸类似物:3-氯代酪氨酸(ClY)、3,5-二氯代酪氨酸(Cl2Y)、3,5- 二氟代酪氨酸(F2Y)、2,3,5-三氟代酪氨酸(F3Y)、2,3,5,6-四氟代酪氨酸 (F4Y)(该五种酪氨酸类似物简称为ClnY/FnY)作为光致电子转移探针,具体原因如下:第一、已有实验证明,酪氨酸阴离子和发光体之间的光致电子转移速率比电中性酪氨酸快百倍。而酪氨酸的pKa为10.2,该值与生理条件的pH值相差较大,因此我们设想,在生理条件下可以用酚基团被取代的酪氨酸类似物来作为最理想的环境敏感型光致电子转移探针。第二、静电场可以严重影响酪氨酸残基的pKa值,因此,带电基团的结合或者神经信号触发的外部静电场变化都能显著干扰非天然氨基酸受体的 pKa,最终导致荧光强度的剧烈变化。利用这种特性,我们可以设计出受电荷分析物(例如,ATP、第二信使、核酸)或者活细胞质膜电场调控的蛋白质传感器。第三、酪氨酸的翻译后修饰,如磷酸化,硫酸化和糖基化对于信号转导是至关重要的,而酪氨酸或者酪氨酸类似物酚侧链上氧原子的化学修饰可以显著调节它的光致电子转移供体特性,因此我们可以进一步设计酪氨酸磷酸化,硫酸化或者糖基化的荧光传感器。这些传感器将是测量酪氨酸激酶,酪氨酸磷酸酶,硫酸酯酶和糖基化酶活性的重要工具。
除了光致电子转移探针,我们还需要选择一种合适的荧光蛋白,其激发态荧光基团可以有效地接受非天然氨基酸ClnY/FnY传递的电子。目前研究中常用的荧光蛋白共有四种,分别是:依赖红外荧光蛋白1.4(IF 1.4) 的胆绿素;依赖UnaG的胆红素;包含4-(对-羟基苯亚甲基)-5-咪唑啉酮(HBI)发光基团的绿色荧光蛋白(GFP)以及依赖黄素的iLov。之前我们已经证实了绿色荧光蛋白GFP在其激发状态时是一个很好的电子供体,但是,203位酪氨酸残基与HBI之间的电子传递仅能产生荧光红移,并不能导致荧光淬灭,证明了当ClnY/FnY作为电子供体时,光激发的HBI 并不能作为一个很好的电子受体。同样的,在胆绿素和胆红素中,至少有一个酪氨酸残基与IF 1.4和UnaG之间存在范德华力,说明光激发的胆绿素和胆红素也不能成为很好的电子受体。相比之下,以前曾有研究证明,一个距离黄素的酪氨酸残基可以有效地淬灭黄素荧光。值得注意的是,在荧光黄素蛋白iLov中,距离黄素辅因子的距离范围内并没有酪氨酸或者色氨酸侧链。因此,我们选择在iLov的特定位点上遗传编码 ClnY/FNY来构建蛋白质光致电子转移传感器。
当光致电子转移传感器的探针和蛋白载体都确定好之后,我们需要进行蛋白质传感器的基因编码。本发明中选用的五种光致电子转移探针:3- 氯代酪氨酸、3,5-二氯代酪氨酸、3,5-二氟代酪氨酸、2,3,5-三氟代酪氨酸和2,3,5,6-四氟代酪氨酸,其中3-氯代酪氨酸和3,5-二氟代酪氨酸已有成熟的翻译系统和基因编码方法(参见本申请人的专利申请:申请号201110205760.2,发明名称“3-氯代酪氨酸翻译系统及其应用”和申请号201310056306.4,发明名称“3,5-二氟代酪氨酸翻译系统及其应用”),而 2,3,5-三氟代酪氨酸的遗传编码也曾被报道。但是,3,5-二氯代酪氨酸和 2,3,5,6-四氟代酪氨酸的正交氨酰基-tRNA合成酶是本发明人经过筛选首次获得的,其氨基酸序列分别如SEQ ID NO:11和13所示。并且,本发明人利用所述正交氨酰基-tRNA合成酶,参照专利:3-氯代酪氨酸翻译系统及其应用和3,5-二氟代酪氨酸翻译系统及其应用,以类似的方法研发了 3,5-二氯代酪氨酸/2,3,5,6-四氟代酪氨酸翻译系统。
本发明提供利用本发明的3,5-二氯代酪氨酸/2,3,5,6-四氟代酪氨酸翻译系统(也可称为翻译试剂盒)以及先前开发的非天然氨基酸翻译系统产生的含有五种酪氨酸类似物的iLov蛋白突变体,所述iLov蛋白突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO:3,在野生型iLov蛋白的486位(即,插入位点对应SEQ ID NO:2的第99和100位氨基酸位点之间,亦即,对应SEQ ID NO:3所示的iLov蛋白突变体的第100位氨基酸位点)分别引入五种酪氨酸类似物,所述iLov蛋白突变体可以作为良好的蛋白质光致电子转移荧光传感器。
总的来说,本发明提供下述技术方案:
1.SEQ ID NO:11所示的正交氨酰基-tRNA合成酶,其用3,5-二氯代酪氨酸优先氨酰化与之配对的正交tRNA,从而在翻译的氨基酸序列中插入3,5-二氯代酪氨酸。
2.一种表达包含至少一个3,5-二氯代酪氨酸的突变蛋白的3,5-二氯代酪氨酸翻译系统,所述系统包含:
(i)3,5-二氯代酪氨酸;
(ii)第1项所述的正交氨酰基-tRNA合成酶;
(iii)正交tRNA,其包含SEQ ID NO:9所示的多核苷酸序列;其中所述正交氨酰基-tRNA合成酶用所述3,5-二氯代酪氨酸优先氨酰化所述正交 tRNA;和
(iv)编码目标蛋白的核酸,其中所述核酸含有所述正交tRNA特异性识别的至少一个选择密码子。
3.SEQ ID NO:13所示的正交氨酰基-tRNA合成酶,其用2,3,5,6-四氟代酪氨酸优先氨酰化与之配对的正交tRNA,从而在翻译的氨基酸序列中插入2,3,5,6-四氟代酪氨酸。
4.一种表达包含至少一个2,3,5,6-四氟代酪氨酸的突变蛋白的2,3,5,6- 四氟代酪氨酸翻译系统,所述系统包含:
(i)2,3,5,6-四氟代酪氨酸;
(ii)第3项所述的正交氨酰基-tRNA合成酶;
(iii)正交tRNA,其包含SEQ ID NO:9所示的多核苷酸序列;其中所述正交氨酰基-tRNA合成酶用所述2,3,5,6-四氟代酪氨酸优先氨酰化所述正交tRNA;和
(iv)编码目标蛋白的核酸,其中所述核酸含有所述正交tRNA特异性识别的至少一个选择密码子。
5.第2或4项所述的翻译系统,其特征在于,所述正交tRNA是琥珀抑制型tRNA,所述选择密码子是琥珀密码子。
6.第2或4项所述的翻译系统,其中所述翻译系统还包含编码正交氨酰基-tRNA合成酶的核苷酸序列。
7.一种宿主细胞,其包含编码第1或3项所述的正交氨酰基-tRNA 合成酶的核苷酸序列和相对应的正交tRNA序列,其中所述宿主细胞是真细菌细胞,优选大肠杆菌细胞。
8.一种产生在至少一个所选位置定点特异插入3,5-二氯代酪氨酸的突变蛋白的方法,所述方法包括下述步骤:
(a)提供第2项所述的3,5-二氯代酪氨酸翻译系统,该系统包含:
(i)3,5-二氯代酪氨酸;
(ii)第1项所述的正交氨酰基-tRNA合成酶;
(iii)正交tRNA,其为SEQ ID NO:9所示的多核苷酸序列;其中所述正交氨酰基-tRNA合成酶用所述3,5-二氯代酪氨酸优先氨酰化所述正交 tRNA;和
(iv)编码所述目标蛋白的核酸,其中所述核酸在所选的位置包含所述正交tRNA特异性识别的至少一个选择密码子;和
(b)将编码所述目标蛋白的核酸转化到第7项所述的宿主细胞中,在所述蛋白的翻译期间,3,5-二氯代酪氨酸氨酰化的正交tRNA对所述选择密码子起反应而将培养基中的3,5-二氯代酪氨酸定点特异插入所述目标蛋白的所述所选位置,从而产生在所选位置含3,5-二氯代酪氨酸的所述目标蛋白。
9.一种产生在至少一个所选位置定点特异插入2,3,5,6-四氟代酪氨酸的突变蛋白的方法,所述方法包括下述步骤:
(a)提供第4项所述的2,3,5,6-四氟代酪氨酸翻译系统,该系统包含:
(i)2,3,5,6-四氟代酪氨酸;
(ii)第3项所述的正交氨酰基-tRNA合成酶;
(iii)正交tRNA,其为SEQ ID NO:9所示的多核苷酸序列;其中所述正交氨酰基-tRNA合成酶用所述2,3,5,6-四氟代酪氨酸优先氨酰化所述正交tRNA;和
(iv)编码所述目标蛋白的核酸,其中所述核酸在所选的位置包含所述正交tRNA特异性识别的至少一个选择密码子;和
(b)将编码所述目标蛋白的核酸转化到第7项所述的宿主细胞中,在所述蛋白的翻译期间,2,3,5,6-四氟代酪氨酸氨酰化的正交tRNA对所述选择密码子起反应而将培养基中的2,3,5,6-四氟代酪氨酸定点特异插入所述目标蛋白的所述所选位置,从而产生在所选位置含2,3,5,6-四氟代酪氨酸的所述目标蛋白。
10.蛋白质光致电子转移荧光传感器蛋白家族iLovU,其包括五种突变体蛋白,所述突变体蛋白分别通过在野生型黄素蛋白iLov 486位氨基酸位点特异性插入3-氯代酪氨酸、3,5-二氯代酪氨酸、3,5-二氟代酪氨酸、 2,3,5-三氟代酪氨酸或2,3,5,6-四氟代酪氨酸而得到,其中在野生型黄素蛋白iLov 486位氨基酸位点特异性插入3,5-二氯代酪氨酸得到的突变体蛋白通过第8项的方法制备,在野生型黄素蛋白iLov 486位氨基酸位点特异性插入2,3,5,6-四氟代酪氨酸的突变体蛋白通过第9项的方法制备。
11.根据权利要求2或4所述的翻译系统,其中所述正交tRNA如SEQ ID NO:9所示。
12.根据权利要求8或9所述的方法,其中所述正交tRNA如SEQ ID NO:9所示。
本领域技术人员应该理解,在具体的实施方案中,依据所用的宿主,用于表达的核苷酸序列可以相应地进行密码子优化,从而提高其表达效率。重组表达载体的构建、转化或转染等均可通过常规分子克隆技术实现。
本发明的有益技术效果:
目前,开发基因编码的光致电子转移传感器可以显著扩大现有传感器的技术范围,主要原因如下:1、可以通过荧光活化细胞分选(FACS)以及其他高通量细胞分选方法进行受体位点微调和快速筛选,这样就能够依据不同的目标物设计出具有最适亲和力的光致电子转移传感器;2、蛋白具有较大的配体结合表面,利用这种特性可以开发适用于复杂大分子的光致电子转移传感器;3、通过细胞特异性启动子或细胞器靶向肽的基因融合,基因编码光致电子转移传感器能够针对性地应用于特定器官,细胞和细胞器;4、蛋白可以在活细胞内直接翻译,因此将不再需要传统传感器所必须的定位和洗涤步骤。
为了实现上述目标,本发明遗传整合了五种酪氨酸类似物作为环境敏感型光致电子转移探针(图1、图2),分别为:3-氯代酪氨酸(ClY)、3,5- 二氯代酪氨酸(Cl2Y)、3,5-二氟代酪氨酸(F2Y)、2,3,5-三氟代酪氨酸 (F3Y)、2,3,5,6-四氟代酪氨酸(F4Y)(该五种酪氨酸类似物简称为 ClnY/FnY)。本发明人将以上五种酪氨酸类似物定点特异性插入到改良型荧光蛋白iLov(拟南芥向光素2中荧光特异优化域,Lov代表光,氧和电压域)中。本发明中选用的上述五种非天然氨基酸FnY和ClnY分别具有不同的pKa值,其范围为5.6-8.3(图1),该范围显著低于酪氨酸的pKa值-10.2。因此,在生理条件下(pH为4.5-8),我们遗传编码的非天然氨基酸可以去质子化,而其他天然酪氨酸残基则不受影响。实验结果发现,在阴离子状态下,非天然氨基酸的酚基团将电子传递给黄素(FMN*)的速率是电中性非天然氨基酸或天然酪氨酸的上百倍,而当pH值降低到这些非天然氨基酸pKa值以下时,会导致荧光强度增强20倍以上。相较于以前报告中的荧光蛋白pH传感器,我们开发的传感器在酸化时具有更强的荧光增强能力,范围更广的pKa值,并能够匹配多种细胞器,例如溶酶体(pH约为4.8),次级内体(pH约为5.0),初级内体(pH约为6.0)以及线粒体(pH约为8.0)。更重要的是,我们开发的iLovU传感器展现出高效的酸控特性,使其非常适用于研究细胞内吞作用。运用这些传感器,我们可以在酸性介质中或巨噬细胞吞噬后监测大肠杆菌的细胞质酸化动力学。
附图说明
从下面结合附图的详细描述中,本发明的上述特征和优点将更明显,其中:
图1是3-氯代酪氨酸(ClY)、3,5-二氯代酪氨酸(Cl2Y)、3,5-二氟代酪氨酸(F2Y)、2,3,5-三氟代酪氨酸(F3Y)和2,3,5,6-四氟代酪氨酸(F4Y) 的结构式和pKa值;
图2是蛋白质光致电子转移荧光传感器的设计原理图;
图3是蛋白质光致电子转移荧光传感器,正交tRNA,氨酰基-tRNA合成酶,iLov蛋白系列突变体序列;
图4是Cl2Y-iLov(486TAG)蛋白的SDS-PAGE电泳图;
图5是F4Y-iLov(486TAG)蛋白的SDS-PAGE电泳图;
图6是质谱图,图6A是Cl2Y-iLov(486TAG)蛋白的质谱图,图6B 是F4Y-iLov(486TAG)蛋白的质谱图;
图7是晶体结构图,图7A是3,5-二氯代酪氨酸氨酰基-tRNA合成酶高分辨率晶体结构图,图7B是3,5-二氯代酪氨酸氨酰基-tRNA合成酶和野生型酪氨酸氨酰基-tRNA合成酶的活性位点叠加图;
图8是紫外吸收光谱图,图8A是iLov蛋白在不同pH条件下的紫外吸收光谱图,图8B是iLovU2蛋白(即iLov-486-Cl2Y)在不同pH条件下的紫外吸收光谱图;
图9是iLov和iLovU2蛋白的发射光谱图,从横坐标向上依次为iLovU2 pH=9(a),iLovU2 pH=5(b)和iLov pH=5(c);
图10是iLovU2蛋白的晶体结构图;
图11是iLovU系列突变体的荧光强度曲线图;
图12A是iLovU2蛋白在pH=5条件下的荧光衰减图谱,图12B是 iLovU2蛋白在pH=9条件下的荧光衰减图谱,图12C是iLovU2蛋白在pH 为5和9条件下的荧光衰减时间,图12D是Cl2Y-iLov蛋白的荧光衰减曲线,图12E是Y-iLov蛋白的荧光衰减曲线,图12F是logkET对距离的图表;
图13A是过度表达iLovU3(iLov-486Cl2Y388R)的大肠杆菌BL21 (DE3)细胞的荧光成像,图13B是过度表达iLovU3的大肠杆菌MG1655 菌株的荧光强度;
图14是大肠杆菌细胞吞噬作用的荧光成像,图14A是表达iLov的大肠杆菌细胞吞噬作用的荧光成像,图14B是表达iLovU3的大肠杆菌细胞吞噬作用的荧光成像。
序列表说明
SEQ ID NO:1 野生型黄素蛋白iLov的核苷酸序列
SEQ ID NO:2 野生型黄素蛋白iLov的氨基酸序列
SEQ ID NO:3 iLovU传感器家族的氨基酸序列,其中第100位的TYR (即,对应图3中的X)表示引入的五种非天然氨基酸 3-氯代酪氨酸(ClY)、3,5-二氯代酪氨酸(Cl2Y)、3,5- 二氟代酪氨酸(F2Y)、2,3,5-三氟代酪氨酸(F3Y)或者2,3,5,6-四氟代酪氨酸(F4Y)
SEQ ID NO:4 iLovU传感器家族的核苷酸序列
SEQ ID NO:5 iLovU2的氨基酸序列,其中第100位的TYR(即,对应图3中的X)表示引入的3,5-二氯代酪氨酸(Cl2Y)
SEQ ID NO:6 iLovU2的核苷酸序列
SEQ ID NO:7 iLovU3的氨基酸序列,其中第100位的TYR(即,对应图3中的X)表示引入的3,5-二氯代酪氨酸(Cl2Y)
SEQ ID NO:8 iLovU3的核苷酸序列
SEQ ID NO:9 正交tRNA
SEQ ID NO:10 野生型酪氨酰tRNA合成酶(MjTyrRS),来源于詹氏甲烷球菌
SEQ ID NO:11 正交氨酰基-tRNA合成酶(Cl2Y RS)的氨基酸序列
SEQ ID NO:12 正交氨酰基-tRNA合成酶(Cl2Y RS)的核苷酸序列
SEQ ID NO:13 正交氨酰基-tRNA合成酶(F4Y RS)的氨基酸序列
SEQ ID NO:14 正交氨酰基-tRNA合成酶(F4Y RS)的核苷酸序列
具体实施方式
以下通过实施例来进一步阐明本发明。但是应该理解,所述实施例只是举例说明的目的,并不意欲限制本发明的范围和精神。
实施例1:进化3,5-二氯代酪氨酸/2,3,5,6-四氟代酪氨酸特异性氨酰基 -tRNA合成酶
为了在基因中位点特异性插入3,5-二氯代酪氨酸/2,3,5,6-四氟代酪氨酸(简称Cl2Y/F4Y),需要在所用的E.coli宿主细胞中引入氨酰基-tRNA 合成酶/tRNA正交对,这个正交对来源于詹氏甲烷球菌(Methanococcus jannaschii)琥珀抑制酪氨酰tRNA(MjtRNACUA Tyr)/酪氨酰tRNA合成酶 (MjTyrRS,野生型,其氨基酸序列为SEQ ID NO:10)对。MjTyrRS突变库构建在卡纳霉素抗性pBK质粒(购自美国Scripps研究所Peter G. Schultz实验室)中,位于该质粒上E.coli谷氨酰胺合成酶的启动子和终止子之间。所使用的合成酶突变库为pBk-lib-jw1库,该突变库的构建方法为:在MjTyrRS基因上挑选6个位点(Tyr32,Leu65,Phe108,Gln109, Asp158,和Leu162)引入NNK突变(N=A+T+C+G;K=T+G),另外6 个位点(Ile63,Ala67,His70,Tyr114,Ile159,Va1164)或随机突变为 Gly或保持不变(参见Xie,J.;Liu,W.S.;Schultz,P.G.Angew.Chem.,Int.Ed. 2007,46,9239-9242;Wang,JY.;Zhang W.;Song WJ;et al.J.Am.Chem.Soc. 2010,132,14812-14818)。
通过正负筛选来进化特异性识别pyTyr的氨酰基-tRNA合成酶(参见 Liu,X.H.;Yu,Y.;Hu,C.;Zhang,W.;Lu,Y.;Wang,J.Y,Significant Increase of Oxidase Activitythrough the Genetic Incorporation of a Tyrosine-Histidine Cross-Link in aMyoglobin Model of Heme-Copper Oxidase.Angewandte Chemie-InternationalEdition 2012,51(18),4312-4316.)。正筛选质粒包含 MjtRNACUA Tyr,TAG突变的氯霉素乙酰转移酶基因,启动表达绿色荧光蛋白的琥珀突变的T7 RNA聚合酶,四环素抗性基因。负筛选质粒包含 MjtRNACUA Tyr,在阿拉伯糖操纵子下的琥珀突变芽孢杆菌RNA酶基因,以及氨苄青霉素抗性基因。进行3轮正负筛选:包含有正筛选质粒的E.coli DH10B细胞作为正筛选寄主细胞。细胞电转pbk-lib-jw1库,SOC培养基 (2%(W/V)胰蛋白胨,0.5%(W/V)酵母粉,0.05%(W/V)NaCl, 2.5mM KCl,10mM MgCl2,20mM葡萄糖)在37℃培养1小时。之后换用极限培养基(GMML极限培养基的配方:M9盐/甘油:764g Na2HPO4.7H2O或者30g Na2HPO4,15gKH2PO4,2.5g NaCl,5g NH4Cl, 50ml甘油,高压灭菌,pH 7.0;1M MgSO4:高压灭菌;50mMCaCl2:高压灭菌;25mM FeCl2:过滤灭菌;0.3M亮氨酸:溶解于0.3M NaOH 中,过滤灭菌;1L液体GMML培养基:200ml M9盐/甘油,2mlMgSO4, 2ml CaCl2,2ml FeCl2,1ml亮氨酸)洗两次,铺板固体极限培养基(在液体GMML培养基中加入500ml 3%琼脂粉,1mM Cl2Y/F4Y,50mg/L卡那霉素,60mg/L氯霉素,15mg/L四环素),37℃培养60小时。收取细胞,提取质粒DNA,电泳分离,胶回收。然后,将经过正筛选的pBK-lib-jw1 转化到包含负筛选质粒的DH10B感受态细胞中。SOC培养基中恢复1小时。之后涂板包含0.2%阿拉伯糖(购自sigma公司)的LB固体培养基(每升培养基含10g胰蛋白胨,5g酵母粉,10g NaCl)。37℃培养8-12小时。共重复3轮。
最后一轮正筛选挑384个克隆,分别点板在含有0.5mM Cl2Y/F4Y、氯霉素60,80,100,120mg/L的GMML固体培养基上,及不包含Cl2Y/F4Y、但包含氯霉素0,20,40,60mg/L的GMML固体培养基。挑选在0.5mM Cl2Y/ F4Y 100mg/L氯霉素的培养基上生长,而在0mMCl2Y/F4Y 20mg/L氯霉素培养基中不生长的克隆进行进一步验证。挑选得到2个克隆,其中克隆1插入3,5-二氯代酪氨酸Cl2Y效率最高,我们将其命名为Cl2YRS;克隆2插入 2,3,5,6-四氟代酪氨酸F4Y效率最高,我们将其命名为F4YRS。测序表明,克隆1所包含的氨酰基-tRNA合成酶突变体(Cl2YRS)的氨基酸序列为SEQ ID NO:11所示,其中突变位点为Y32L,L65I,H70G,F108I,Q109L, Y114G,D158S,L162M;克隆2所包含的氨酰基-tRNA合成酶突变体(F4YRS)的氨基酸序列为SEQ ID NO:13所示,其中突变位点为Y32A, L65H,H70G,F108T,Q109R,D158G,L162H。
实施例2:表达Cl2Y/F4Y-iLov蛋白及质谱鉴定
将正交tRNA(SEQ ID NO:9)和筛选出来的Cl2YRS或F4YRS(SEQ ID NO:11或13)分别构建到pEVOL载体(购自美国scripps研究所Peter G.Schultz实验室)上,然后共转化到包含有pET-iLov(486TAG)表达质粒(该质粒购自美国Scripps研究所Peter G.Schultz实验室)(其中iLov 的核苷酸序列为SEQ ID NO:2)的DH10B细胞(购自全式金公司)中。挑取单个克隆在37℃培养到OD600约等于1.1时,向LB培养基中加入1mM Cl2Y或F4Y,1mM IPTG及0.2%阿拉伯糖(购自Sigma公司)培养细胞,对照不加入Cl2Y或F4Y。6-8小时之后,收菌,Ni-NTA纯化蛋白,并用 SDS-PAGE电泳分析(图4,图5)。
我们发现,只有在存在Cl2Y或F4Y的培养基中才能纯化出全长的 iLov蛋白,这说明筛选出来的Cl2YRS可以特异性的识别Cl2Y,F4YRS 可以特异性的识别F4Y。在LB培养基中Cl2Y/F4Y-iLov蛋白的产率为 15-21mg/L,而野生型iLov蛋白的产率为30mg/L。为了检测Cl2Y/F4Y仅仅插入到iLov蛋白的486位琥珀突变位点,我们对Cl2Y/F4Y-iLov蛋白进行了ESI-MS质谱检测,检测结果分子量分别为13947Da和13952(图 6),均与计算分子量吻合。
实施例3:3,5-二氯代酪氨酸氨酰基-tRNA合成酶高分辨率晶体结构的解析
为了进一步了解3,5-二氯代酪氨酸氨酰基-tRNA合成酶Cl2YRS选择性识别Cl2Y的结构基础,我们解析了Cl2YRS结合Cl2Y的高分辨率晶体结构。如图7所示,32位酪氨酸突变为亮氨酸,65位亮氨酸突变为异亮氨酸,108 位苯丙氨酸突变为异亮氨酸,109位谷氨酰胺突变为亮氨酸,162位亮氨酸突变为甲硫氨酸。这五个残基共同形成一个新的疏水口袋,以稳定二氯苯酚侧链。有趣的是,114位酪氨酸和70位组氨酸均突变为甘氨酸,它们在活性位点中创造出更大的空间来容纳Cl2Y残基。相比于野生型TyrRS结构, Cl2Y围绕Cα原子旋转了10度,但是多肽骨架结构变化不大。重要的是, 158位天冬氨酸突变为丝氨酸,从而与Cl2Y形成一个氢键。由于Cl2Y酚基团的pKa为6.4,Cl2Y很可能是以阴离子状态存在,因此在野生型TyrRS中,阴离子状态的Cl2Y无法与带负电荷的158位天冬氨酸结合(图7B)。
实施例4:基因编码的蛋白质光致电子转移传感器iLovU的特征
我们用基因工程方法构建了蛋白质光致电子转移传感器 iLov-486-Cl2Y(核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示),其中486位突变为TAG 终止密码子,然后用实施例3中的相同方法在iLov的突变位定点特异插入 3,5-二氯代酪氨酸(Cl2Y),表达产生突变蛋白iLov-486-Cl2Y(氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示,简称为iLovU2)。
iLov和iLovU2蛋白的紫外光谱均展现出了黄素蛋白的特性(图8),它们的最大吸收波长分别为365nm,450nm和475nm。当pH从9.0降至5.0后, iLov和iLovU2蛋白在可见光区域的紫外光谱以及iLov蛋白的荧光强度均没有发生显著变化,而iLovU2蛋白的荧光强度却增加了20倍(图9)。
为了研究iLovU2的荧光猝灭机制,我们解析了iLovU2在pH分别为6.5, 7.0,7.5和9.0条件下的晶体结构(图10)。通过分析iLov蛋白的晶体结构,我们认为在486位插入非天然氨基酸Cl2Y不会影响iLov蛋白的整体结构。此外,iLovU2在pH为6.5和9.0条件下的晶体结构几乎是重叠的,这表明pH 下降引起的传感器开关并不是蛋白构象改变的结果。
接下来,我们通过监测电中性酚基团转变为阴离子酚基团时的红移 (275nm-305nm)来检测Cl2Y的pKa值。将测量结果代入Hill方程,计算出Cl2Y的pKa值为6.3。值得注意的是,虽然iLov和iLovU2的紫外光谱图在可见光区几乎是相同的,但是当pH从4升高到9时,在iLovU2紫外光谱图的 305nm位置出现了一个新的峰(图8),而iLov蛋白的紫外光谱图却没有这个新的峰,因此我们认为该峰是486位的Cl2Y产生的。我们将这个数据代入Hill方程,计算出486位Cl2Y的pKa值也为6.3。根据图11结果计算可知, iLovU2荧光蛋白的pKa值同样为6.3。iLovU2和486位Cl2Y具有相同的pKa 值,说明iLovU2的荧光是通过486位Cl2Y的质子化状态进行调控的。而486 位Cl2Y距离黄素荧光基团较远,无法通过范德华力来干扰黄素的荧光特性。另外,Cl2Y的吸收光谱与iLov的发射光谱没有重叠,因此也可以排除荧光能量共振转移导致荧光淬灭的可能。
由于pH传感器只能用于精确测量接近其pKa值的pH值,我们进一步设计了具有不同pKa值的荧光蛋白突变体,用于匹配多种细胞器,例如溶酶体(pH约为4.8),次级内体(pH约为5.0),初级内体(pH约为6.0)以及线粒体(pH约为8.0)。往iLov荧光蛋白的486位点插入不同的非天然氨基酸(即,插入位点对应SEQ ID NO:3的第100位氨基酸位点),可以改变iLovU 传感器的pKa值,获得的传感器pKa范围为5.3至9.2(图11)。接着,我们测试了486位非天然氨基酸临近位点的突变能否调控iLovU传感器的荧光特性。结果如图11所示,往388位引入一个带正电荷的精氨酸残基可以使 iLovU2传感器的pKa值从6.3降低至5.9,往388和393位同时引入两个正电荷的精氨酸残可以使iLovU2传感器的pKa值进一步降低至5.7。同样地,往另一传感器iLov-486F4Y中引入388位精氨酸可以使pKa值从6.1降低至5.3。先前已有研究表明,带电荷的氨基酸产生的本地静电场可以显著扰乱酪氨酸残基的pKa。本实验中,由于引入388和393位精氨酸能够稳定带负电荷的 486位非天然氨基酸,而阴离子非天然氨基酸是一种有效的光致电子转移猝灭剂,因此388和393位精氨酸突变体可以显著降低iLovU荧光传感器的 pKa值。
为了进一步验证iLovU荧光传感器的光致电子转移特性,我们通过酪氨酰自由基捕获方法检测Cl2Y自由基来证明iLovU2传感器中的Cl2Y和黄素之间是否产生了光致电子转移。我们发现,在pH 9的缓冲液中加入2mM 半胱氨酸,100mM 5,5′-二甲基-1-吡咯啉-N-氧化物(DMPO)和10μM iLovU2蛋白,然后用405nm激光笔进行光照射,最后通过液相色谱-质谱联用仪来检测到大量DMPO-cys加成化合物(M+H+=234Da)。相比之下,当在相同的条件下对10μM iLov蛋白进行光照射后,没有检测到任何 DMPO-cys加成化合物生成。这些结果表明,在光照射下,产生的Cl2Y自由基可以和半胱氨酸快速反应,得到含硫自由基,该含硫自由基又可以和 DMPO相互反应,最终形成DMPO-cys加成化合物。综上所述,所有的研究结果足以表明,iLovU2的荧光猝灭是由Cl2Y阴离子和黄素之间的光致电子转移导致的。
我们接着通过荧光寿命的方法来分析Cl2Y和黄素间光致电子转移的 pH和距离依赖性。iLovU2在pH 5和9时呈单指数荧光衰减,而当pH从5上升至9时,iLovU2的荧光寿命从5.0ns急剧下降至0.2ns(图12,表1),通过计算可以得到其光致电子转移速率kET为4.8×109s-1。我们同时还测量了 iLov-486Tyr突变体中486位酪氨酸和黄素之间的光致电子转移速率,并且发现该速率较iLovU2降低了上百倍,仅为3.5×107s-1。该结果与以前的报道相吻合,当酪氨酸和黄素之间的距离足够近时,可以通过光致电子转移淬火荧光黄素。我们还发现,iLov-393Cl2Y,iLov-391Cl2Y和iLov-488Cl2Y 的电子传递速率均低于iLovU2,分别为3.8×108,1.1×108s-1和0.58×108s-1。从iLovU2的晶体结构图中可以得知,486位Cl2Y和黄素荧光基团之间的距离为而393位,391位和488位Cl2Y和黄素荧光基团之间的距离可以通过测量突变前相应位点和黄素荧光基团之间的距离来分别进行估算。分析结果可知,即使Cl2Y和黄素荧光基团间的距离高达它们仍可以发生光致电子转移。总的来说,这些结果表明,Cl2Y和黄素荧光基团间仅需不到1纳秒的时间,就可以发生光致电子转移,并且,电子转移速率随着Cl2Y和黄素荧光基团间距离的增加而呈指数下降(图12,表1)。
表1.iLov系列突变体的荧光寿命值及电子传递速率kET值。
实施例5:光致电子转移传感器iLovU的应用
细菌,尤其是肠致病性大肠杆菌,主要依靠耐酸性系统在酸性环境中生存。为了预防和治疗肠道致病细菌感染,发展一种酸控荧光传感器来研究细菌的耐酸性机制就变得尤其重要。目前已有一些小分子pH传感器,但是这些指示剂在细胞中的定位能力很差。此前也曾报道过一些pH敏感型荧光蛋白传感器,但是它们仅具有有限的动态范围。为了更好地研究细菌的耐酸性和内吞作用机制,研发具有较强荧光增强能力和光漂白抗性的酸控荧光蛋白传感器是非常可取的。
我们用基因工程方法构建了荧光传感器iLov-486Cl2Y388R(核苷酸序列如SEQ IDNO:8所示),即将iLovU2的388位突变为精氨酸,表达产生突变蛋白iLov-486Cl2Y388R(氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示,简称为 iLovU3),其pKa值为5.9。
我们之所以选择iLovU3进行体内pH传感实验,主要因为其pKa值低于 iLovU2,因此在中性pH条件下具有更少的背景荧光。在pH分别为7和5的条件下,我们将过度表达iLovU3的大肠杆菌BL21(DE3)细胞经过488nm 荧光激发,在共聚焦荧光显微镜的FITC通道下进行荧光成像。结果如图13 所示,当pH为7时,细胞仅展示出很弱的荧光,而当pH降低至5时,细胞荧光强度开始持续增强,并在5分钟后达到最大。这些结果表明,当大肠杆菌缺乏耐酸性(AR)系统时,即使在弱酸性条件下,细胞质pH也会迅速下降。
接着,我们使用耐酸性大肠杆菌MG1655菌株进行进一步研究。我们将浓度为1×109cells/ml,过度表达iLovU3的MG1655菌株分别加入pH为 7,5或者2.5的缓冲液中,同时加入谷氨酰胺和6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸 (DLN),孵育90分钟,并以未加入谷氨酰胺和DLN的细胞作为对照。孵育结束后,使用多功能酶标仪在450nm激发,495nm发射的条件下检测细胞荧光强度。我们发现,当pH为从7降至5后,细胞荧光强度大约增强了50% (图13),而当pH进一步下降至2.5后,细胞荧光强度增强了5.5倍。结果表明,在极酸条件下,抗性菌株即使长时间孵育,其细胞质仍然可以酸化。最近,有研究表明谷氨酰胺在细菌耐酸性机制中发挥着重要作用。当胞质 pH降低到6以下时,谷氨酰胺酶YbaS被激活以水解谷氨酰胺生成谷氨酸和氨。在酸性条件下,氨被质子化形成铵,从而降低质子浓度,帮助细胞产生抗酸性。如图13所示,当细胞中加入5mM谷氨酰胺后,细胞荧光强度显著降低,表明谷氨酰胺确实可以帮助耐酸性大肠杆菌菌株在酸性环境中实现胞质pH平衡。谷氨酰胺类似物6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸(DLN)为谷氨酰胺酶抑制剂,当细胞中加入5mM DLN后,细胞荧光强度又开始增强,说明谷氨酰胺虽然可以在酸性条件下防止胞质酸化来保护细菌,DLN 却能够抵制谷氨酰胺的这种保护作用。本实验结果还说明我们研发的酸控 iLovU传感器可以直接用于细胞荧光成像,不再需要传统传感器所必须的定位、连接和洗涤步骤,因此有利于新酶或者细菌耐酸性通道的发现,以及耐酸性通道小分子抑制剂的筛选。
最后,我们通过iLovU3跟踪观察巨噬细胞吞噬细菌的过程。首先从雌性小鼠中制备出新鲜的巨噬细胞,然后将过量表达iLov或者iLovU3的 BL21(DE3)大肠杆菌与巨噬细胞混合,37度孵育90分钟。接下来,我们用荧光显微镜直接观察过量表达iLov或iLovU3蛋白的大肠杆菌的荧光信号。如图14所示,在巨噬细胞吞噬前后,表达iLov蛋白的大肠杆菌均可观察到荧光信号,而表达iLovU3蛋白的大肠杆菌只有被巨噬细胞吞噬后才能观察到荧光信号(图14)。结果证明,iLovU3蛋白的荧光信号可以被Cl2Y和黄素荧光基团间产生的光致电子转移所淬灭,而巨噬体中的酸性环境可以有效地开启iLovU3蛋白的荧光信号,从而使吞噬作用过程变得直观可视。由于细胞质酸化是巨噬细胞的主要杀伤机制,我们的新方法可以为进一步确定细胞吞噬和吞噬体成熟的关键因素提供有力工具。
实施例6:包含氟代酪氨酸的蛋白质光致电子转移荧光传感器蛋白 iLov的实验数据
我们用基因工程方法构建了荧光传感器iLov-486位点分别突变为单氯酪氨酸、二氯酪氨酸、二氟酪氨酸、三氟酪氨酸及四氟酪氨酸的系列突变体,荧光检测发现在不同的pH条件下以上突变体具有不同的荧光强度,通过计算可知其pKa值分别为9.2、6.3、7、6.5和6.1(图11)。
以上结果表明,包含氟代酪氨酸的系列突变体均可作为光致电子转移荧光传感器,同时,范围较广的pKa值能够使其匹配多种细胞器。
应该理解,尽管参考其示例性的实施方案,已经对本发明进行具体地显示和描述,但是本领域的普通技术人员应该理解,在不背离由后附的权利要求所定义的本发明的精神和范围的条件下,可以在其中进行各种形式和细节的变化,可以进行各种实施方案的任意组合。
Claims (8)
1.SEQ ID NO:13所示的正交氨酰基-tRNA合成酶,其用2,3,5,6-四氟代酪氨酸优先氨酰化与之配对的正交tRNA,从而在翻译的氨基酸序列中插入2,3,5,6-四氟代酪氨酸。
2.一种表达包含至少一个2,3,5,6-四氟代酪氨酸的突变蛋白的2,3,5,6-四氟代酪氨酸翻译试剂盒,所述试剂盒包含:
(i)2,3,5,6-四氟代酪氨酸;
(ii)权利要求1所述的正交氨酰基-tRNA合成酶;
(iii)正交tRNA,其为SEQ ID NO:9所示的多核苷酸序列;其中所述正交氨酰基-tRNA合成酶用所述2,3,5,6-四氟代酪氨酸优先氨酰化所述正交tRNA;和
(iv)编码目标蛋白的核酸,其中所述核酸含有所述正交tRNA特异性识别的至少一个选择密码子。
3.如权利要求2所述的翻译试剂盒,其特征在于,所述正交tRNA是琥珀抑制型tRNA,所述选择密码子是琥珀密码子。
4.如权利要求2所述的翻译试剂盒,其中所述翻译试剂盒还包含编码正交氨酰基-tRNA合成酶的核苷酸序列。
5.一种宿主细胞,其是包含编码权利要求1所述的正交氨酰基-tRNA合成酶的核苷酸序列和SEQ ID NO:9所示的正交tRNA序列的真细菌细胞。
6.如权利要求5所述的宿主细胞,其中所述宿主细胞是包含编码权利要求1所述的正交氨酰基-tRNA合成酶的核苷酸序列和SEQ ID NO:9所示的正交tRNA序列的大肠杆菌细胞。
7.一种产生在至少一个所选位置定点特异插入2,3,5,6-四氟代酪氨酸的突变蛋白的方法,所述方法包括下述步骤:
(a)提供权利要求2所述的2,3,5,6-四氟代酪氨酸翻译试剂盒,该试剂盒包含:
(i)2,3,5,6-四氟代酪氨酸;
(ii)权利要求1所述的正交氨酰基-tRNA合成酶;
(iii)正交tRNA,其为SEQ ID NO:9所示的多核苷酸序列;其中所述正交氨酰基-tRNA合成酶用所述2,3,5,6-四氟代酪氨酸优先氨酰化所述正交tRNA;和
(iv)编码所述目标蛋白的核酸,其中所述核酸在所选的位置包含所述正交tRNA特异性识别的至少一个选择密码子;和
(b)将编码所述目标蛋白的核酸转化到权利要求5或6所述的宿主细胞中,在所述蛋白的翻译期间,2,3,5,6-四氟代酪氨酸氨酰化的正交tRNA对所述选择密码子起反应而将培养基中的2,3,5,6-四氟代酪氨酸定点特异插入所述目标蛋白的所述所选位置,从而产生在所选位置含2,3,5,6-四氟代酪氨酸的所述目标蛋白。
8.一种在野生型黄素蛋白iLov第99和100位氨基酸位点之间特异性插入2,3,5,6-四氟代酪氨酸的方法,所述方法通过权利要求7的步骤进行,并且由此得到的插入2,3,5,6-四氟代酪氨酸的黄素蛋白iLov变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示,其中第100位的TYR表示插入的2,3,5,6-四氟代酪氨酸。
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