MX2007015106A - Incorporacion de aminoacidos codificadores de manera no natural en proteinas. - Google Patents

Abstract

La invencion proporciona metodos y composiciones para la incorporacion in vivo de aminoacidos codificados de manera no natural en polipeptidos mediante especies Pseudomonas y cepas derivadas de las mismas. Tambien se proporcionan composiciones que incluyen proteinas con aminoacidos codificados de manera no natural hechos por especies Pseudomonas y cepas derivadas de las mismas.

Description

INCORPORACIÓN DE AMINOÁCIDOS CODIFICADOS DE MANERA NO NATURAL EN PROTEÍNAS REFERENCIA CRUZADA A SOLICITUDES RELACIONADAS Esta solicitud reivindica la prioridad de la solicitud de patente provisional de E.U. No. Serial 60/687,603, presentada el 3 de Junio de 2005, la especificación de la cual se incorpora en la presente en su totalidad. CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención pertenece al campo de la bioquímica de traducción y expresión de proteínas recombinantes. La invención se refiere a células huésped bacterianas, y métodos para producir proteínas que contienen uno o más aminoácidos codificados de manera no natural . La invención también se refiere a métodos para producir proteínas en células huésped recombinantes bacterianas de especies Pseudomonas y cepas de las mismas utilizando aminoacil tARN sintetasas ortogonales, tARNs ortogonales, aminoácidos codificados de manera no natural, codones selectores, y composiciones relacionadas. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Recientemente, se ha reportado una tecnología completamente nueva en la ciencia de proteínas, que promete superar muchas de las limitaciones asociadas con la modificación de proteínas de sitio específico.

Específicamente, nuevos componentes se han agregado a la maquinaria biosintética de proteína de Escherichia coli (E. coli ) procariota (e.g., L. Wang, et al., (2001), Science 292:498-500) y Sacchromyces cerevisiae ( S . cerevisiae) eucariota (e.g., J. Chin et al., Science 301:964-7 (2003)), que ha permitido la incorporación de aminoácidos no codificados de manera genética a proteínas in vivo . Un número de nuevos aminoácidos con nuevas propiedades químicas, físicas o biológicas, incluyendo etiquetas de fotoafinidad y aminoácidos fotoisomerizables, ceto aminoácidos, y aminoácidos glicosilados se han incorporado eficientemente y con alta fidelidad en proteínas en E. coli y en levadura en respuesta al codón ámbar, TAG, utilizando esta metodología. Ver, e.g., J. W. Chin et al., (2002), Journal of the American Chemical Society 124:9026-9027; J. W. Chin, & P. G. Schultz, (2002), ChemBioChem 11:1135-1137; J. W. Chin, et al., (2002), PNAS United States of America 99:11020-11024; y, L. Wang, & P. G. Schultz, (2002), Chem. Comm. , 1-10. Estos estudios han demostrado que es posible introducir selectivamente y de manera rutinaria grupos funcionales químicos, tales como grupos cetonas, grupos alquino y residuos azida, que no se encuentran en proteínas, que son químicamente inertes a todos los grupos funcionales encontrados en los 20 aminoácidos codificados de manera genética comunes y que pueden utilizarse para reaccionar eficiente y selectivamente para formar enlaces covalentes estables. La capacidad de incorporar aminoácidos no codificados de manera genética en proteínas permite la introducción de grupos funcionales químicos que podrían proporcionar alternativas valuables a los grupos funcionales que ocurren de manera natural, tales como el epsilón-NH2 de lisina, el sulfhidril-SH de cisteína, el grupo imino de histidina, etc. Ciertos grupos funcionales químicos se sabe que son inertes a los grupos funcionales encontrados en los 20 aminoácidos codificados de manera genética comunes pero reaccionan de manera limpia y eficientemente para formar enlaces estables. Se sabe que hay proteínas recombinantee que pueden no expresarse de manera adecuada en células huésped recombinantes E. coli . Células huésped bacterianas alternativas para la expresión de proteínas recombinantes diferentes a E. coli se han desarrollado. Tales alternativas para células huésped recombinantes E. coli incluyen especies de Pseudomonas, una bacteria de gram negativo, y varias cepas derivadas de la misma. Por lo tanto existe una necesidad de células huésped recombinantes alternativas diferentes a E. coli para la incorporación de aminoácidos codificados de manera no natural en proteínas recombinantes. SUMARIO DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona una variedad de métodos para hacer y utilizar sistemas de traducción de Pseudomonas que pueden incorporar aminoácidos codificados de manera no natural en proteínas. La presente invención incluye una amplia variedad de especies Pseudomonas y cepas derivadas de las mismas, así como también composiciones relacionadas. Las proteínas que comprenden aminoácidos codificados de manera no natural hechos por el sistema de traducción de Pseudomonas en especies Pseudomonas y cepas derivadas de las mismas, también son una característica de la invención. Los aminoácidos codificados de manera no natural conocidos y nuevos pueden incorporarse en proteínas utilizando el sistema de traducción de Pseudomonas de la presente invención. De esta manera, en un aspecto, la presente invención proporciona composiciones que comprenden un sistema de traducción de Pseudomonas derivadas de o para utilizarse en especies Pseudomonas y cepas. El sistema de traducción de Pseudomonas comprende un tARN ortogonal (O-tAR?) y una aminoacil tAR? sintetasa ortogonal (O-RS) . Típicamente, O-RS preferentemente aminoacila el O-tAR? con al menos un aminoácidos codificado de manera no natural en el sistema de traducción de Pseudomonas y el O-tAR? reconoce al menos un codón selector. El sistema de traducción de Pseudomonas de esta manera inserta el aminoácido codificado de manera no natural en una proteína en respuesta a un codón selector. El sistema de traducción de Pseudomonas es capaz de funcionar como se describe en la presente en una célula huésped Pseudomonas o con los componentes de traducción de una Célula Pseudomonas para proporcionar un polipéptido que comprenden un aminoácido codificado de manera no natural. El sistema de traducción de Pseudomonas típico de la presente invención incluye células de una amplia variedad de especies Pseudomonas, tales como, pero no limitándose a, P. fluorescens, P. putida, P. aeruginosa, etc., así como también nuevas especies Pseudomonas por identificarse. Alternativamente, el sistema de traducción de Pseudomonas comprende un sistema de traducción de Pseudomonas in vi tro, e.g., un extracto incluyendo componentes de traducción celulares de célula huésped Pseudomonas. Ejemplos de O- tARNs incluyen pero no se limitan a secuencias de polinucleótidos descritas en SEQ ID ?O: 1, 2, y 3 y/o una secuencia de polinucleótidos complementaria de las mismas. De manera similar, ejemplos de O-RSs incluyen pero no se limitan a un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos descrita en SEQ ID ?O: 35-66, y un polipéptido codificado por una secuencia de ácidos nucleicos descrita en SEQ ID ?O: 4-34 y una secuencia de polinucleótidos complementaria de las mismas. Ejemplos de aminoácidos codificados de manera no natural que pueden utilizarse en el sistema de traducción de Pseudomonas de la presente invención incluyen pero no se limitan a un análogo no natural de un aminoácido de tirosina; un análogo no natural de un aminoácido de glutamina; un análogo no natural de un aminoácido de fenilalanina; un análogo no natural de un aminoácido de serina; un análogo no natural de un aminoácido de treonina; un alquilo, arilo, acilo, azido, ciano, halo, hidrazina, hidrazida, hidróxilo, alquenilo, alquinilo, éter, tiol, sulfonilo, seleno, éster, tioácido, borato, boronato, fosfo, fosfono, fosfina, heterocíclico, enona, imina, aldehido, hidroxilamina, ceto, o aminoácido substituido por amino, o cualquier combinación de los mismos; un aminoácido con un reticulador fotoactivable; un aminoácido etiquetado por espín; un aminoácido fluorescente; un aminoácido con un nuevo grupo funcional; un aminoácido que interactúa covalente o no covalehtemente con otra molécula; un aminoácido de unión a metal; un aminoácido que contiene metal; un aminoácido radioactivo; un aminoácido fotoguardado y/o fotoisomerizable; una biotina o análogo de biotina que contiene aminoácido; un aminoácido modificado por carbohidrato o glucosilado; un ceto que contiene aminoácido; aminoácidos que comprenden glicol de polietileno o poliéter; a un aminoácido substituido por átomo pesado; un aminoácido fotodesdoblable o químicamente desdoblable; un aminoácido con una cadena lateral alargada; un aminoácido que contiene un grupo tóxico; un aminoácido substituido por azúcar, e.g., una serina substituida por azúcar o lo similar; un azúcar enlazada a carbono que contiene aminoácido; un aminoácido activo redox; un a-hidroxi que contiene ácido; un ácido tio amino que contiene aminoácido; un aminoácido a,a di-substituido; un ß-aminoácido; y un aminoácido cíclico diferente a prolina. Por ejemplo, el aminoácido codificado de manera no natural puede ser una O-metil-L-tirosina, una L-3-(2-naftil) alanina, una 3-metil-fenilalanina, una 0-4-alil-L-tirosina, una 4-propil-L-tirosina, una tri-O-acetil-GlcNAcß-serina, una L-Dopa, una fenilalanina fluorinada, una isopropil-L-fenilalanina, una p-azido-L-fenilalanina, una p-acil-L-fenilalanina, una p-benzoil-L-fenilalanina, una L-fosfoserina, a fosfonoserina, una fosfonotirosina, una p-yodo-fenilalanina, una p-bromofenilalanina, una p-amino-L-fenilalanina, y una isopropil-L-fenilalanina. En una modalidad, al menos uno de los aminoácidos codificados de manera no natural es una 0- metil -L-tirosina . En una modalidad, el aminoácido codificado de manera no natural es una L-3- (2-naftil) alanina . En otro conjunto de ejemplos específicos, el aminoácido codificado de manera no natural es un análogo de fenilalanina que contiene amino, isopropilo, o 0-alilo. Cualquiera de una variedad de codones selectores puede utilizarse en la presente invención, incluyendo pero no limitándose a codones sin sentido, codones de detención incluyendo pero no limitándose a codones de detención ámbar, ocre, y opal, codones raros, cuatro (o más) codones base, codones en base a nucleósido no naturales, o lo similar. Por ejemplo, en una modalidad, el codón selector es un codón ámbar . El sistema de traducción de Pseudomonas de la presente invención proporciona la capacidad de sintetizar proteínas que comprenden aminoácidos codificados de manera no natural en especies de células Pseudomonas, o en sistemas de traducción de Pseudomonas, en cantidades usualmente adecuadas. Por ejemplo, proteínas que comprenden al menos un aminoácido codificado de manera no natural puede producirse en una concentración de al menos aproximadamente 1, 5, 10, 50, 100, 500, 1000 o más miligramos por litro, en una célula huésped Pseudomonas o sistema de traducción de la presente invención. Además, proteínas que comprenden al menos un aminoácido codificado de manera no natural pueden producirse en una concentración de al menos aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 100 o más gramos por litro, en una célula huésped Pseudomonas o sistema de traducción de la presente invención. Otro aspecto de la presente invención se proporciona para la producción de proteínas que son homologas a cualquier proteína de interés, pero que comprenden uno o más aminoácidos codificados de manera no natural. Por ejemplo, pueden hacerse las proteínas terapéuticas que comprenden uno o más aminoácidos codificados de manera no natural, pero son homologas a una o más otras proteínas. Por ejemplo, en un aspecto, la proteína que comprende un aminoácido codificado de manera no natural es homologa a una proteína terapéutica u otra tal como: una citocina, un factor de crecimiento, un receptor de factor de crecimiento, un interferón, una interleucina, una molécula inflamatoria, un producto oncogénico, una hormona de péptido, una molécula de transducción de señal, un receptor de hormona esteroide, un activador transcripcional, un supresor transcriptional, eritropoyetina (EPO) , insulina, hormona de crecimiento humana, Péptido-78 que Activa el Neutrófilo epitelial, GROa/MGSA, GROE, GRO, MlP-la, IP-1S, MCP-1, factor de crecimiento de hepatocito, factor de crecimiento similar a insulina, factor inhibidor de leucemia, oncostatina M, PD-ECSF, PDGF, pleiotropina, SCF, ligando equipo-c, VEGF, G-CSF, IL-1, IL-2, IL-8, IGF-I, IGF-II, FGF (factor de crecimiento de fibroblasto) , PDGF, TNF, TGF-a, TGF-ß, EGF (factor de crecimiento epidérmico) , KGF (factor de crecimiento de queratinocito) , SCF/equipo-c, CD40L/CD40, VLA-4/VCAM-1 , ICAM-I/LFA-1, hilaurina/CD44, Mos, Ras, Raf, Met; p53, Tat, Fos, Myc, Jun, Myb, Reí, receptor de estrógeno, receptor de progésterona, receptor de testosterona, receptor de aldosterona, Receptor LDL, y/o corticosterona . En otro conjunto de modalidades, la proteína es homologa a una proteína terapéutica u otra tal como: una antitripsina Alfa-1, una Angiostatina, un factor Antihemolítico, un anticuerpo, una Apolipoproteína, una Apoproteína, un factor natriurético Atrial, un polipéptido natriurético Atrial, un péptido Atrial, una quimiocina C-X-C, T39765, NAP-2, ENA-78, Gro-a, Gro-b, Gro-c, IP-10, GCP-2, NAP-4, SDF-1, PF4 , MIG, una Calcitonina, un ligando equipo-c, una citocina, una quimiocina CC, una proteína-1 qumioatrayente de Monocito, una proteína-2 qumioatrayente de Monocito, una proteína-3 qumioatrayente de Monocito, una proteína-1 inflamatoria de Monolito alfa, una proteína-1 inflamatoria de Monocito beta, RANTES, 1309, R83915, R91733, HCCl , T58847, D31065, T64262, CD40, un ligando CD40, un Ligando equipo-c, un Colágeno, un factor estimulante de colonia (CSF) , un factor de complemento 5a, un inhibidor de complemento, un receptor de complemento 1, una citocina, un Péptido- 78 que Activa el Neutrófilo epitelial, GROa/MGSA, GROß, GROG MlP-la, MIP-1&, MCP-1, un Factor de crecimiento epidérmico (EGF) , un Péptido de Activación de Neutrófilo epitelial, una Eritropoyetina (EPO), una toxina exfoliante, un Factor IX, un Factor VII, un Factor VIII, un Factor X, un Factor de crecimiento de fibroblasto (FGF) , un Fibrinogen, una Fibronectina, G-CSF, GM-CSF, Glucocerebrosidasa, una Gonadotropina, un factor de crecimiento, un receptor de factor de crecimiento, una proteína Hedgehog, una Hemoglobina, un Factor de crecimiento de hepatocito (HGF) , una Hirudina, una albúmina de suero humano, ICAM-1, un receptor ICAM-1, un LFA-1, un receptor LFA-1, una Insulina, un Factor de crecimiento similar a insulina (IGF), IGF-I, IGF-II, un interferón, IFN-a, IFN-ß, IFN-?, una interleucina, una IL-1, una IL-2, una IL-3, una IL-4, una IL-5, una IL-6, una IL-7, una IL-8, una IL-9, una IL-10, una IL-11, una IL-12, un Factor de crecimiento de queratinocito (KGF) , una Lactoferrina, un factor inhibidor de leucemia, una Luciferasa, una Neurturina, un factor inhibidor de Neutrófilo (NIF) , una oncostatina M, una proteína Osteogénica, un producto oncogénico, una hormona paratiroidea, PD-ECSF, PDGF, una hormona de péptido, una Hormona de crecimiento humana, una Pleiotropina, una Proteína A, una Proteína G, exotoxinas Pirogénicas A, B, o C, una Relaxina, una Renina, SCF, un receptor de complemento soluble I, un I -CAM soluble 1, un receptor de interleucina soluble, un receptor TNF soluble, una Somatomedina, una Somatostatina, una Somatotropina, una Estreptocinasa, a Superantígeno, una enterotoxina Staphylococcal , SEA, SEB, SECl , SEC2 , SEC3 , SED, SEE, un receptor de hormona esteroide, una dismutasa de superóxido, una toxina de síndrome de choque tóxico, una Timosina Alfa 1, un activador de plasminogen de tejido, un factor de crecimiento de tumor (TGF) , TGF-a, TGF-ß, un Factor de Necrosis de Tumor, un Factor de Necrosis de Tumor Alfa, a Factor de Necrosis de Tumor Beta, un receptor del factor de necrosis de tumor (TNFR), una proteína VLA-4, una proteína VCAM-1, un Factor de Crecimiento Endotelial Vascular (VEGEF) , una Urocinasa, Mos, Ras, Raf, Met; p53, Tat, Fos, Myc, Jun, Myb, a Reí, un receptor de estrógeno, un receptor de progésterona, un receptor de testosterona, un receptor de aldosterona, un Receptor LDL, y/o a corticosterona. En un aspecto, las composiciones en la presente comprenden una proteína que comprende un aminoácido codificado de manera no natural y un excipiente farmacéuticamente aceptable, incluyendo, e.g., cualquiera de las proteínas observadas arriba y un excipiente farmacéuticamente aceptable. La homología al polipéptido puede inferirse al realizar una alineación de secuencia, e.g., utilizando BL STN o BLASTP, e.g., conjunto de parámetros de falla. Por ejemplo, en una modalidad, la proteína es al menos aproximadamente 50%, al menos aproximadamente 75%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% idéntica a una proteína terapéutica conocida (e.g., una proteína presente en Genebank u otras bases de datos disponibles) . La proteína de interés puede contener 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 6, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 o más aminoácidos codificados de manera no natural. El aminoácido codificados de manera no natural puede ser el mismo o diferente, e.g., puede haber 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 6, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 o más sitios diferentes en la proteína que comprende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 6, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 o aminoácidos codificados de manera no natural más diferentes. Por ejemplo, en una modalidad, la proteína es DHFR, y al menos un aminoácido codificado de manera no natural se selecciona del grupo que consiste de O-metil-L-tirosina y L-3- (2-naftil) alanina. La presente invención también proporciona métodos para producir al menos una proteína en un sistema de traducción de Pseudomonas de manera que la proteína comprende al menos un aminoácido codificado de manera no natural . En una modalidad de los métodos de la presente invención, el sistema de traducción de Pseudomonas se proporciona con al menos un ácido nucleico que comprende al menos un codón selector, en donde el ácido nucleico codifica la proteína. Un sistema de traducción de Pseudomonas también se proporciona que comprende un tARN ortogonal (O-tARN) que reconoce al menos un codón selector, y una aminoacil tARN sintetasa ortogonal (O-RS) que preferentemente aminoacila el O-tARN con un aminoácido codificado de manera no natural en el sistema de traducción de Pseudomonas . En un aspecto, la(s) proteína (s) que comprende (n) aminoácidos codificados de manera no natural que se producen en el sistema de traducción de Pseudomonas en la presente invención se procesan y modifican en una manera dependiente de la célula. Esto proporciona la producción de proteínas que se doblan de manera estable, o se modifican de otra manera por la célula. El aminoácido codificado de manera no natural puede proporcionarse opcionalmente de manera exógena al sistema de traducción de Pseudomonas. Alternativamente, e.g., donde el sistema de traducción de Pseudomonas es una célula viva, el aminoácido codificado de manera no natural puede biosintetizarse por las células Pseudomonas. Por ejemplo, una célula Pseudomonas puede comprender una trayectoria biosintética para producir un aminoácido codificado de manera no natural, e.g., p-aminofenilalanina, provenientes de una o más fuentes de carbono dentro de la célula. En algunas modalidades, la trayectoria biosintética puede producir una cantidad fisiológica del aminoácido codificado de manera no natural, e.g., la célula produce el aminoácido codificado de manera no natural en una cantidad suficiente para biosíntesis de proteína, tal cantidad puede no substancialmente alterar la concentración de aminoácidos naturales o substancialmente agotar los recursos celulares en la producción del aminoácido codificados de manera no natural. Otros aminoácidos codificados de manera no natural que pueden producirse opcionalmente por las células de la invención incluyen, pero no se limitan a, dopa, O-metil-L- tirosina, aminoácidos glicosilados, aminoácidos pegilados, otros aminoácidos codificados de manera no natural observados en la presente, y lo similar. Kits son una característica adicional de la invención. Por ejemplo, los kits pueden incluir uno o más sistemas de traducción de Pseudomonas como se observa arriba (e.g., una célula, una célula de 21 o más aminoácidos, extractos celulares, etc.), uno o más aminoácidos codificado de manera no natural, e.g., con material empacado apropiado, contenedores para mantener los componentes del kit, materiales de instrucción para practicar los métodos en la presente y/o lo similar. De manera similar, los productos de los sistemas de traducción de Pseudomonas (e.g., proteínas tales como análogos EPO que comprenden aminoácidos codificados de manera no natural) pueden proporcionarse en forma de kit, e.g., con contenedores para mantener los componentes del kit, materiales de instrucción para practicar los métodos en la presente y/o lo similar. DEFINICIONES Debe entenderse que esta invención no limitándose a la metodología particular, protocolos, líneas celulares, construcciones, y reactivos descritos en la presente y como tales pueden variar. También debe entenderse que la terminología utilizada en la presente es para el propósito de describir modalidades particulares solamente, y no se propone limitar el alcance de la presente invención, el cual se limitará solamente por las reivindicaciones anexas. Como se utiliza en la presente y en las reivindicaciones anexas, las formas singulares "un," "una," y "el (la)" incluyen referencias plurales al menos que el contexto claramente indique otra cosa. De esta manera, por ejemplo, la referencia a "hGH" es una referencia a una o más tales proteínas e incluye equivalentes de la misma conocidos por aquellos expertos en la materia, y así sucesivamente. Al menos que se defina de otra manera, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente tienen el mismo significado como se entiende comúnmente por alguien de experiencia ordinaria en la materia a la cual pertenece esta invención. Aunque cualquier método, dispositivo, y materiales similares o equivalentes a aquellos descritos en la presente puede utilizarse en la práctica o prueba de la invención, los métodos, dispositivos y materiales preferidos se describen ahora. Todas las publicaciones y patentes mencionadas en la presente se incorporan en la presente para referencia con el propósito de describir y explicar, por ejemplo, las construcciones y metodologías que se describen en las publicaciones, que pueden utilizarse en conexión con la invención actualmente descrita. Las publicaciones tratadas en la presente se proporcionan solamente para su descripción antes de la fecha de presentación de la presente solicitud. Nada en la presente debe construirse como una admisión de que los inventores tienen el derecho de adelantar tal descripción en virtud de la invención anterior o por cualquier otra razón. El término "substancialmente purificado" se refiere a un polipéptido que puede estar substancialmente o esencialmente libre de componentes que normalmente acompañan o interactúan con la proteína como se encuentra en su ambiente que ocurre de manera natural, i.e. una célula nativa, o célula huésped en el caso de polipéptidos recombinantemente producidos. El Polipéptido que puede estar substancialmente libre de material celular incluye preparaciones de proteína que tienen menos de aproximadamente 30%, menos de aproximadamente 25%, menos de aproximadamente 20%, menos de aproximadamente 15%, menos de aproximadamente 10%, menos de aproximadamente 5%, menos de aproximadamente 4%, menos de aproximadamente 3%, menos de aproximadamente 2%, o menos de aproximadamente 1% (por peso en seco) de proteína contaminante. Cuando el polipéptido o variante del mismo se produce recombinantemente por la célula huésped Pseudomonas, la proteína puede estar presente en aproximadamente 30% o más, aproximadamente 25%, aproximadamente 20%, aproximadamente 15%, aproximadamente 10%, aproximadamente 5%, aproximadamente 4%, aproximadamente 3%, aproximadamente 2%, o aproximadamente 1% o menos del peso en seco de la células. Cuando el polipéptido o variante del mismo se produce recombinantemente por la célula huésped Pseudomonas, la proteína puede estar presente en el medio de cultivo a aproximadamente lOOg/L o más, aproximadamente 50g/L, aproximadamente lOg/L, aproximadamente 5g/L, aproximadamente 4g/L, aproximadamente 3g/L, aproximadamente 2g/L, aproximadamente lg/L, aproximadamente 750mg/L, aproximadamente 500mg/L, aproximadamente 250mg/L, aproximadamente lOOmg/L, aproximadamente 50mg/L, aproximadamente lOmg/L, o aproximadamente lmg/L o menos del peso en seco de la células. De esta manera, polipéptido "substancialmente purificado" como se produce por los métodos de la presente invención pueden tener un nivel de pureza de al menos aproximadamente 30%, al menos aproximadamente 35%, al menos aproximadamente 40%, al menos aproximadamente 45%, al menos aproximadamente 50%, al menos aproximadamente 55%, al menos aproximadamente 60%, al menos aproximadamente 65%, al menos aproximadamente 70%, específicamente, un nivel de pureza de al menos aproximadamente 75%, 80%, 85%, y más específicamente, un nivel de pureza de al menos aproximadamente 90%, un nivel de pureza de al menos aproximadamente 95%, un nivel de pureza de al menos aproximadamente 99% o más como se determina por los métodos apropiados tales como análisis SDS/PAGE, RP-HPLC, SEC, y/o electroforesis capilar. Una "célula huésped Pseudomonas recombinante" o "célula huésped Pseudomonas" se refiere a una célula de una especie de Pseudomonas o una cepa derivada de la misma, incluyendo un polinucleótido exógeno, sin considerar el método utilizado para inserción, por ejemplo, toma directa, transducción, acoplamiento f, u otros métodos conocidos en la materia para crear células huésped recombinantes. El polinucleótido exógeno puede mantenerse como un vector no integrado, por ejemplo, un plásmido, o alternativamente, puede integrarse en el genoma huésped. Como se utiliza en la presente, el término "medio" o "medios" incluyen cualquier medio de cultivo, solución, sólido, semi-sólido, o soporte rígido que puede soportar o contener cualquier célula huésped Pseudomonas. De esta manera, el término puede comprender medio en el cual la célula huésped Pseudomonas se ha desarrollado, e.g., medio en el cual el polipéptido se ha secretado, incluyendo medio ya sea antes o después de una etapa de proliferación. El término también puede comprender reguladores o reactivos que contienen lisatos de célula huésped Pseudomonas, tal como en el caso en donde el polipéptido se produce intracelularmente y las células huésped se lisan o interrumpen para liberar el polipéptido.

"Agente reductor" como se utiliza en la presente con respecto al redoblado de proteína, se define como cualquier compuesto o material que mantiene grupos sulfhidrilo en el estado reducido y reduce enlaces de disulfuro intra- o intermolecular. Los agentes reductores adecuados incluyen, pero no se limitan a, ditiotreitol (DTT) , 2 -mercaptoetanol , ditioeritritol, cisteína, cisteamina (2-aminoetanotiol) , y glutationa reducida. Es fácilmente aparente para aquellos de experiencia ordinaria en la materia que una amplia variedad de agentes reductores son adecuados para utilizarse en los métodos y composiciones de la presente invención. "Agente oxidante," como se utiliza en la presente con respecto al redoblado de proteína, se define como cualquier compuesto o material que es capaz de remover un electrón de un compuesto que se oxida. Agentes oxidantes adecuados incluyen, pero no se limitan a, glutationa oxidada, cisteína, cistamina, ditiotreitol oxidado, eritreitol oxidado, y oxígeno. Es fácilmente aparente para aquellos de experiencia ordinaria en la materia que una amplia variedad de agentes oxidantes son adecuados para utilizarse en los métodos de la presente invención. "Agente desnaturalizante" o "desnaturalizante," como se utiliza en la presente, se define como cualquier compuesto o material que causará un desdoblado reversible de una proteína. La intensidad de un agente desnaturalizante o desnaturalizante se determinara tanto por las propiedades como la concentración del agente desnaturalizante o desnaturalizante particular. Los agentes desnaturalizantes o desnaturalizantes adecuados pueden ser caotropos, detergentes, solventes orgánicos, solventes miscibles en agua, fosfolípidos, o una combinación de dos o más tales agentes. Los caotropos adecuados incluyen, pero no se limitan a, urea, guanidina, y tiocianato de sodio. Los detergentes útiles pueden incluir, pero no limitándose a, detergentes fuertes tales como sulfato dodecil de sodio, o éteres de polioxietileno (e.g. detergentes Tween o Tritón), Sarkosilo, detergentes no iónicos suaves (e.g., digitonina), detergentes catiónicos medios tales como N->2 , 3- (Dioleioxi) -propil-N, ,N-trimetilamonio, detergentes iónicos suaves (e.g. colato de sodio o deoxicolato de sodio) o detergentes de ion anfotérico incluyendo, pero no limitándose a, sulfobetaínas (Zwittergent) , sulfato de 3- (3-clolamidopropil) dimetilamonio-1 -propano (CHAPS), y sulfonato de 3- (3-clolamidopropil) dimetilammonio-2-hidroxi-l-propano (CHAPSO) . Los solventes orgánicos miscibles en agua tales como acetonitrilo, alcanoles inferiores (especialmente alcanoles C2-C tales como etanol o isopropanol) , o alcandioles inferiores (especialmente alcandioles C2 - C4 tales como glicol de etileno) pueden utilizarse como desnaturalizantes.

Fosfolípidos útiles en la presente invención pueden ser fosfolípidos que ocurren de manera natural tales como fosfatidiletanolamina, fosfatidilcolina, fosfatidilserina, y fosfatidilinositol o derivados de fosfolípido sintéticos o variantes tales como dihexanoilfosfatidilcolina o diheptanoilfosfatidilcolina . "Redoblado," como se utiliza en la presente describe cualquier proceso, reacción o método que transforma la unión de disulfuro que contiene polipéptidos de un estado desdoblado o doblado de manera inapropiada a una conformación adecuadamente doblada o nativa con respecto a uniones de disulfuro. "Codoblado," como se utiliza en la presente, se refiere específicamente a procesos de redoblado, reacciones, o métodos que emplean al menos dos polipéptidos que interactúan entre si y resulta en la transformación de polipéptidos desdoblados o doblados de manera inapropiada en polipéptidos nativos, apropiadamente doblados. Un "aminoácido codificado de manera no natural" se refiere a un aminoácido que no es uno de los 20 aminoácidos comunes o pirolisina o selenocisteína. Otros términos que pueden utilizarse como sinónimos al término "aminoácido codificado de manera no natural" son "aminoácido no natural," "aminoácido codificado de manera no natural," "aminoácido que no ocurre de manera natural," y versiones sin guiones o diversamente con guiones de los mismos. El término "aminoácido codificado de manera no natural" también incluye, pero no se limita a, aminoácidos que ocurren por modificación (e.g. modificaciones post-traduccionales) de un aminoácido codificado de manera natural (incluyendo pero no limitándose a, los 20 aminoácidos comunes o pirolisina y selenocisteína) pero ellos mismos no se incorporan de manera natural en una cadena de polipéptido creciente por el complejo de traducción. Ejemplos de tales aminoácidos que no ocurren de manera natural incluyen, pero no se limitan a, N-acetilglucosaminil-L-serina, N-acetilglucosaminil-L-treonina, y O-fosfotirosina . Un "grupo de modificación de término amino" se refiere a cualquier molécula que puede unirse al término amino de un polipéptido. De manera similar, un "grupo de modificación de término carboxi" se refiere a cualquier molécula que puede unirse al término carboxi de un polipéptido. Los grupos de modificación de términos incluyen, pero no se limitan a, varios polímeros solubles en agua, péptidos o proteínas tales como albúmina de suero, otros residuos que incrementan la vida media en suero de los péptidos . Los términos "grupo funcional" , "residuo activo" , "grupo activador" , "grupo saliente" , "sitio reactivo" , "grupo químicamente reactivo" y "residuo químicamente reactivo" se utilizan en la materia y en la presente se refieren a distintas porciones definibles o unidades de una molécula. Los términos de alguna manera son sinónimos en las técnicas químicas y se utilizan en la presente para indicar las porciones de moléculas que realizan alguna función o actividad y son reactivas con otras moléculas. El término "enlace" o "enlazador" se utiliza en la presente para referirse a grupos o uniones que normalmente se forman como en resultado de una reacción química y típicamente son enlaces covalentes. Los enlaces hidrolíticamente estables significan que los enlaces son substancialmente estables en agua y no reaccionan con agua a valores de pH útiles, incluyendo pero no limitándose a, bajos condiciones fisiológicas por un periodo de tiempo extendido, tal vez aún indefinido. Los enlaces degradables o hidrolíticamente inestables significan que los enlaces son degradables en agua o en soluciones acuosas, incluyendo por ejemplo, sangre. Los enlaces degradables o enzimáticamente inestables significan que el enlace puede degradarse por una o más enzimas. Como se entiende en la materia, PEG y polímeros relacionados pueden incluir enlaces degradables en la estructura de polímero o en el grupo enlazador entre la estructura de polímero y uno o más de los grupos funcionales terminales de la molécula de polímero. Por ejemplo, enlaces de éster formados por la reacción de ácidos carboxílicos PEG o ácidos carboxílicos PEG activados con grupos alcohol en un agente biológicamente activo generalmente se hidrolizan bajo condiciones fisiológicas para liberar el agente. Otros enlaces hidrolíticamente degradables incluyen, pero no se limitan a, enlaces de carbonato; enlaces de imina resultaron de la reacción de una amina y un aldehido; enlaces de éster de fosfato formados al reaccionar un alcohol con un grupo fosfato; enlaces de hidrazona que son el producto de reacción de una hidrazida y un aldehido; enlaces acétales que son el producto de reacción de un aldehido y un alcohol; enlaces de ortoéster que son el producto de reacción de un formato y un alcohol; enlaces de péptido formados por un grupo amina, incluyendo pero no limitándose a, al final de un polímero tal como PEG, y un grupo carboxilo de un péptido; y enlaces de oligonucleótido formados por un grupo fosforamidita, incluyendo pero no limitándose a, al final de un polímero, y un grupo 5' hidroxilo de un oligonucleótido. El término "molécula biológicamente activa" , "residuo biológicamente activo" o "agente biológicamente activo" cuando se utilizan en la presente significa cualquier sustancia que puede afectar cualquier propiedad física o bioquímica de un organismo biológico, incluyendo pero no limitándose a, virus, bacterias, hongos, plantas, animales, y humanos. En particular, como se utiliza en la presente, moléculas biológicamente activas incluyen, pero no se limitan a, cualquier sustancia propuesta para diagnóstico, cura, mitigación, tratamiento, o prevención de enfermedad en humanos u otros animales, o mejorar de otra manera el bienestar mental o físico de humanos o animales. Ejemplos de moléculas biológicamente activas incluyen, pero no se limitan a, péptidos, proteínas, enzimas, fármacos de molécula pequeña, tintes, lípidos, nucleósidos, oligonucleótidos, células, virus, liposomas, micropartículas y micelas. Las clases de agentes biológicamente activos que son adecuadas para utilizarse con la invención incluyen, pero no se limitan a, antibióticos, fungicidas, agentes anti-virales, agentes anti-inflamatorios, agentes anti-tumor, agentes cardiovasculares, agentes anti -ansiedad, hormonas, factores de crecimiento, agentes esteroidales, y lo similar. Un "polímero bifuncional" se refiere a un polímero que comprende dos grupos funcionales discretos que son capaces de reaccionar específicamente con otros residuos (incluyendo pero no limitándose a, grupos laterales aminoácido) para formar enlaces covalentes o no covalentes. Un enlazador bifuncional que tiene un grupo funcional reactivo con un grupo en un componente biológicamente activo particular, y otro grupo reactive con un grupo en un segundo componente biológico, puede utilizarse para formar un conjugado incluyendo el primer componente biológicamente activo, el enlazador bifuncional y el segundo componente biológicamente activo. Se conocen muchos procedimientos y moléculas enlazadoras para unión de varios compuestos a péptidos. Ver, e.g., Solicitud de Patente Europea No. 188,256; Patentes de E.U. Nos. 4,671,958, 4,659,839, 4,414,148, 4,699,784; 4,680,338; 4,569,789; y 4,589,071 que se incorporan para referencia en la presente. Un "polímero multi-funcional" se refiere a un polímero que comprende dos o más grupos funcionales discretos que son capaces de reaccionar específicamente con otros residuos (incluyendo pero no limitándose a, grupos laterales aminoácido) para formar enlaces covalentes o no covalentes. Donde grupos substituyentes se especifican por sus fórmulas químicas convencionales, escritas de izquierda a derecha, comprenden igualmente los substituyentes químicamente idénticos que resultarían de escribir la estructura de derecha a izquierda, por ejemplo, la estructura -CH20- es equivalente a la estructura -OCH2- . El término "substituyentes" incluye pero no limitándose a "substituyentes que no interfieren" . "Substituyentes que no interfieren" son aquellos grupos que producen compuestos estables. Los substituyentes adecuado que no interfieren o radicales incluyen, pero no se limitan a, halo, alquilo C?-C?0, alquenilo C2-C?0, alquinilo C2-C?0, alcoxi Ci-Cio, aralquilo C?-C?2, alcarilo C?-C12, cicloalquilo C3-C?2, cicloalquenilo C3-C?2, fenilo, fenilo substituido, toluoilo, xilenilo, bifenilo, alcoxialquilo C2-C?2, alcoxiarilo C2-C?2, ariloxialquilo C7-C?2, oxiarilo C7-C?2, alquilsulfmilo C?-C6, alquilsulfonilo C1-C10, --(CH2)m --0--( alquilo C1-C10) en donde m es de 1 a 8, arilo, arilo substituido, alcoxi substituido, fluoroalquilo, radical heterocíclico, radical heterocíclico substituido, nitroalquilo, --N02, --CN, - -NRC (O) -- (alquilo C?~ C?o) , --C (O) -- (alquilo d-Cio) , tioalquilo de alquilo C2-C?0, --C(0)0-- (alquilo d-Cio) , --0H, --S02, =S, --COOH, --NR2, carbonilo, --C (0) -- (alquilo C?-C10)-CF3, --C(0)-CF3, C(0)NR2, --(arilo d-Cio) -S- - (arilo C6-C10) , --C (0) -- (arilo Ci-C?o) -- (CH2)m--0-- (-- (CH2)m-0- (alquilo Ci-Cio) en donde cada m es de 1 a 8, --C(0)NR2, --C(S)NR2, --S02NR2, --NRC(0)NR2, --NRC(S)NR2, sales de los mismos, y lo similar. Cada R como se utiliza en la presente es H, alquilo o alquilo substituido, arilo o arilo substituido, aralquilo, o alcarilo. El término "halógeno" incluye flúor, cloro, yodo, y bromo . El término "alquilo," por si mismos o como parte de otro substituyente, significa, al menos que se establezca de otra manera, una cadena recta o ramificada, o radical de hidrocarburo cíclico, o combinación de los mismos, que puede estar completamente saturado, mono- o poliinsaturado y puede incluir radicales di- y multivalentes, que tienen el número de átomos de carbono designado (i.e. d-Cio significa uno a diez carbonos) . Ejemplos de radicales de hidrocarburo saturados incluyen, pero no se limitan a, grupos tales como metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, t-butilo, isobutilo, sec-butilo, ciciohexilo, (ciclohexil) metilo, ciclopropilmetilo, homólogos e isómeros de, por ejemplo, n-pentilo, n-hexilo, n-heptilo, n-octilo, y lo similar. Un grupo alquilo no saturado es uno que tiene una o más uniones dobles o uniones triples. Ejemplos de grupos alquilo no saturados incluyen, pero no se limitan a, vinilo, 2-propenilo, crotilo, 2-isopentenilo, 2- (butadienil) , 2,4-pentadienilo, 3- (1 , 4-pentadienil) , etinilo, 1- y 3-propinilo, 3-butinilo, y homólogos e isómeros más altos. El término "alquilo," al menos que se observe de otra manera, también significa incluir aquellos derivados de alquilo definidos en más detalle abajo, tal como "heteroalquilo". Grupos alquilo que se limitan a grupos hidrocarburo se denominan "homoalquilo" . El término "alquileno" por si mismo o como parte de otro substituyente significa un radical divalente derivado de un alcano, como se ejemplifica, pero no limitándose a, por las estructuras -CH2CH2- y -CH2CH2CH2CH2- , e incluye además aquellos grupos descritos abajo como "heteroalquileno". Típicamente, un grupo alquilo (o alquileno) tendrá de 1 a 24 átomos de carbono, con aquellos grupos que tienen 10 o menos átomos de carbono prefiriéndose en la presente invención. Un "alquilo inferior" o "alquileno inferior" es un grupo alquileno o alquilo de cadena más corta, generalmente que tienen ocho o menos átomos de carbono. Los términos "alcoxi," "alquilamino" y "alquiltio" (o tioalcoxi) se utilizan en su sentido convencional, y se refieren a aquellos grupos alquilo unidos al resto de la molécula a través de un átomo de oxígeno, un grupo amino, o un átomo de azufre, respectivamente. El término "heteroalquilo," por si mismo o en combinación con otro término, significa, al menos que se establezca de otra manera, una cadena recta o ramificada estable, o radical de hidrocarburo cíclico, o combinaciones de los mismos, que consisten del número de átomos de carbono establecido y al menos un heteroátomo seleccionado del grupo que consiste de O, N, Si y S, y en donde los átomos de azufre y nitrógeno pueden oxidarse opcionalmente y el heteroátomo de nitrógeno puede cuaternizarse opcionalmente. El (los) heteroátomo (s) O, N y S y Si pueden colocarse en cualquier posición interior del grupo heteroalquilo o en la posición en la que el grupo alquilo se une al resto de la molécula. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, -CH2-CH2-0-CH3, -CH2-CH2-NH-CH3, -CH2-CH2-N(CH3) -CH3, -CH2-S-CH2-CH3 , -CH2-CH2, -S (O) -CH3, -CH2-CH2-S(0)2-CH3, -CH=CH-0-CH3 , -SÍ(CH3)3, -CH2-CH=N-OCH3, y -CH=CH-N (CH3) -CH3. Hasta dos heteroátomos pueden ser consecutivos, tales como, por ejemplo, -CH2-NH-OCH3 y -CH2-0-Si(CH3)3. De manera similar, el término "heteroalquileno" por si mismo o como parte de otro substituyente significa un radical divalente derivado de heteroalquilo, como se ejemplifica, pero no limitándose a por, -CH2-CH2-S-CH2-CH2- y -CH2-S-CH2-CH2-NH-CH2- . Para grupos heteroalquileno, el mismo o diferentes heteroátomos también pueden ocupar cualquiera o ambos de los términos de cadena (incluyendo pero no limitándose a, alquilenooxi, alquilenodioxi , alquilenoamino, alquilenodiamino, aminooxialquileno, y lo similar). Además, para grupos de enlace alquileno y heteroalquileno, ninguna orientación del grupo de enlace se implica por la dirección en el cual la fórmula del grupo de enlace se escribe. Por ejemplo, la fórmula — C(0)2R'- representa tanto -C(0)2R'- como -R'C(0)2-. Los términos "cicloalquilo" y "heterocicloalquilo" , por si mismos o en combinación con otros términos, representan, al menos que se establezca de otra manera, versiones cíclicas de "alquilo" y "heteroalquilo" , respectivamente. De esta manera, un cicloalquilo o heterocicloalquilo incluyen enlaces anulares saturados y no saturados. Adicionalmente, para heterocicloalquilo, un heteroátomo puede ocupar la posición en la que el heterociclo se une al resto de la molécula. Ejemplos de cicloalquilo incluyen, pero no se limitan a, ciclopentilo, ciciohexilo, 1-ciclohexenilo, 3-ciclohexenilo, cicioheptilo, y lo similar. Ejemplos de heterocicloalquilo incluyen, pero no se limitan a, 1- (1 , 2 , 5, 6-tetrahidropiridil) , 1-piperidinilo, 2-piperidinilo, 3-piperidinilo, 4-morfolinilo, 3-morfolinilo, tetrahidrofuran-2-ilo, tetrahidrofuran-3-ilo, tetrahidrotien-2-ilo, tetrahidrotien-3-ilo, 1-piperazinilo, 2-piperazinilo, y lo similar. Adicionalmente, el término comprende estructuras anulares bicíclicas y tricíclicas. De manera similar, el término "heterocicloalquileno" por si mismo o como parte de otro substituyente significa un radical divalente derivado de heterocicloalquilo, y el término "cicloalquileno" por si mismo o como parte de otro substituyente significa un radical divalente derivado de cicloalquilo. Como se utiliza en la presente, el término "polímero soluble en agua" se refiere a cualquier polímero que es soluble en solventes acuosos. Enlace de polímeros soluble en agua a los polipéptidos hGH puede resultar en cambios incluyendo, pero no limitándose a, vida media en suero modulada o incrementada, o vida media terapéutica modulada o incrementada relativa a la forma no modificada, inmunogenicidad modulada, características de asociación física modulada tales como agregación y formación de multímero, unión alterada del receptor y multimerización o dimerización del receptor alterada. El polímero soluble en agua puede o no tener su propia actividad biológica. Los polímeros adecuados incluyen, pero no se limitan a, glicol de polietileno, propionaldehído de glicol de polietileno, mono C1-C10 alcoxi o derivados de ariloxi del mismo (descritos en la Patente de E.U. No. 5,252,714 que se incorpora para referencia en la presente) , monometoxi -glicol de polietileno, pirrolidona de polivinilo, alcohol polivinílico, poliaminoácidos, anhídrido maléico de diviniléter, N- (2-Hidroxipropil) -metacrilamida, dextran, derivados de dextran incluyendo sulfato de dextran, glicol de polipropileno, copolímero de óxido de polipropileno/óxido de etileno, poliol polioxietilado, heparina, fragmentos de heparina, polisacáridos, oligosacárídos, glicans, celulosa y derivados de celulosa, incluyendo pero no limitándose a metilcelulosa y celulosa de carboximetil, almidón y derivados de almidón, polipéptidos, glicol de polialquileno y derivados de los mismos, copolímeros de glicoles de polialquileno y derivados de los mismos, éteres de etil polivinilo, y alfa-beta-poli [ (2 -hidroxietil) -DL-aspartamida, y lo similar, o mezclas de los mismos. Ejemplos de tales polímeros solubles en agua incluyen, pero no se limitan a, glicol de polietileno y albúmina de suero. Como se utiliza en la presente, el término "glicol de polialquileno" o "poli (glicol de alqueno) " se refiere a glicol de polietileno (poli (glicol de etileno)), glicol de polipropileno, glicol de polibutileno, y derivados de los mismos. El término "glicol de polialquileno" comprende tanto polímeros lineales como ramificados y pesos moleculares promedio de entre 0.1 kDa y 100 kDa. Otras modalidades ejemplificativas se enlistan, por ejemplo, en los catálogos comerciales del proveedor, tal como el catálogo de Shearagua Corporation "Polyethylene Glycol and Derivatives for Biomedical Applications" (2001) . El término "arilo" significa, al menos que se establezca de otra manera, un substituyente de hidrocarburo polinosaturado, aromático, que ser de un anillo único o múltiples anillos (preferentemente de 1 a 3 anillos) que se fusionan o enlazan covalentemente. El término "heteroarilo" se refiere a grupos arilo (o anillos) que contienen de uno a cuatro heteroátomos seleccionados de N, 0, y S, en donde los átomos de azufre y nitrógeno se oxidan opcionalmente, y el (los) átomo (s) de nitrógeno se cuaternizan opcionalmente. Un grupo heteroarilo puede unirse al resto de la molécula a través de un heteroátomo. Ejemplos no limitantes de grupos arilo y heteroarilo incluyen fenilo, 1-naftilo, 2- naftilo, 4-bifenilo, 1-pirrolilo, 2-pirrolilo, 3-pirrolilo, 3-pirazolilo, 2-imidazolilo, 4-imidazolilo, pirazinilo, 2-oxazolilo, 4-oxazolilo, 2-fenil-4-oxazolilo, 5-oxazolilo, 3-isoxazolilo, 4-isoxazolilo, 5-isoxazolilo, 2-tiazolilo, 4-tiazolilo, 5-tiazolilo, 2-furilo, 3-furilo, 2-tienilo, 3-tienilo, 2-piridilo, 3-piridilo, 4-piridilo, 2-pirimidilo, 4-pirimidilo, 5-benzotiazolilo, purinilo, 2-benzimidazolilo, 5- indolilo, 1-isoquinolilo, 5-isoquinolilo, 2 -quinoxalinilo, 5-quinoxalinilo, 3-quinolilo, y 6-quinolilo. Substituyentes para cada uno de los sistemas anulares de arilo y heteroarilo observados arriba se seleccionan del grupo de substituyentes aceptables descritos abajo. Para brevedad, el término "arilo" cuando se utiliza en combinación con otros términos (incluyendo pero no limitándose a, ariloxi, ariltioxi, arilalquilo) incluyen tanto anillos de arilo como heteroarilo como se define arriba. De esta manera, se entiende que el término "arilalquilo" incluye aquellos radicales en los que un grupo arilo se une a un grupo alquilo (incluyendo pero no limitándose a, benzilo, fenetilo, piridilmetilo y lo similar) incluyendo aquellos grupos alquilo en los que un átomo de carbono (incluyendo pero no limitándose a, un grupo metileno) se ha reemplazado por, por ejemplo, un átomo de oxígeno (incluyendo pero no limitándose a, fenoximetilo, 2-piridiloximetilo, 3- (1-naftiloxi) propilo, y lo similar). Se entiende que cada uno de los términos anteriores (incluyendo pero no limitándose a, "alquilo," "heteroalquilo,", "arilo" y "heteroaril") incluyen tanto formas substituidas como nosubstituidas del radical indicado. Substituyentes ejemplificativos para cada tipo de radical se proporcionan abajo. Substituyentes para los radicales alquilo y heteroalquilo (incluyendo aquellos grupos con frecuencia referidos como alquileno, alquenilo, heteroalquileno, heteroalquenilo, alquinilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, cicloalquenilo, y heterocicloalquenilo) pueden ser uno o más de una variedad de grupos seleccionados de, pero no limitándose a: -ORA =0, =NR' , =N-0R' , -NR'R", -SR' , halógeno, - SiR'R"R", -0C(0)R', -C(0)R', -C02R' , -CONR'R", -0C(0)NR'R", -NR"C(0)R', -NR' -C (0) NR"R" ' . -NR"C(0)2R', -NR-C(NR'R"R" *)=NR"", -NR-C(NR'R") =NR" " , -S(0)R', -S(0)2R', S(0)2NR'R", -NRS02R' , -CN y -N02 en un número que varía de cero a (2m'+l), donde m' es el número total de átomos de carbono en tal radical. R' , R" , R" " y R" " cada uno se refiere independientemente a hidrógeno, heteroalquilo substituido o no substituido, arilo substituido o no substituido, incluyendo pero no limitándose a, arilo substituido con 1-3 halógenos, alquilo substituido o no substituido, grupos alcoxi o tioalcoxi, o grupos arilalquilo. Cuando un compuesto de la invención incluye más de un grupo R, por ejemplo, cada uno de los grupos R se selecciona independientemente como lo son cada uno de los grupos R' , R" , R" ' y R" " cuando más de uno de estos grupos está presente. Cuando R' y R" se unen al mismo átomo de nitrógeno, pueden combinarse con el átomo de nitrógeno para formar un anillo de 5 , 6, o 7 miembros. Por ejemplo, -NR'R" significa incluir, pero no limitándose a, 1-pirrolidinilo y 4-morfolinilo . A partir de la discusión anterior de substituyentes, uno de experiencia en la materia entenderá que el término "alquilo" significa incluir grupos incluyendo átomos de carbono unidos a grupos diferentes a grupos hidrógeno, tales como haloalquilo (incluyendo pero no limitándose a, -CF3 y -CH2CF3) y acilo (incluyendo pero no limitándose a, -C(0)CH3, -C(0)CF3, - C(0)CH20CH3, y lo similar) . Similar a los substituyentes descritos para el radical alquilo, substituyentes para los grupos arilo y heteroarilo se varían y se seleccionan de, pero no limitándose a: halógeno, -OR' , =0, =NR' , =N-0R' , -NR'R", -SR' , -halógeno, -SiR'R"R"', -0C(0)R', -C(0)R', -C02R' , CONR'R", -0C(0)NR'R", -NR"C(0)R', -NR' -C (O) NR"R" ' ' NR''C(0)2R'. -NR-C(NR'R"R"' ) =NR" " , -NR-C (NR' R" ) =NR" ' -S(0)R', -S(0)2R', -S(0)2NR'R", -NRS02R' , -CN y -N02, -R' , -N3, CH(Ph)2, fluoro (C?-C ) alcoxi, y fluoro (C1-C4) alquilo, en un número que varía de cero al número total de valencias abiertas en el sistema anular aromático; y donde R' , R" , R" ' y R" " se seleccionan independientemente de hidrógeno, alquilo, heteroalquilo, arilo y heteroarilo. Cuando un compuesto de la invención incluye más de un grupo R, por ejemplo, cada uno de los grupos R se selecciona independientemente como lo son cada uno de los grupos R' , R" , R" ' y R"" cuando más de uno de estos grupos está presente. Como se utiliza en la presente, el término "vida media de suero modulada" significa el cambio positivo o negativo en la vida media circulante de una molécula modificada biológicamente activa relativa a su forma no modificada. Vida media en suero se mide al tomar muestras de sangre en varios puntos de tiempo después de la administración de la molécula biológicamente activa, y determinar la concentración de esa molécula en cada muestra. La correlación de la concentración de suero con tiempo permite el cálculo de la vida media en suero. La vida media en suero creciente deseablemente tiene al menos un incremento de aproximadamente dos veces, pero uno más pequeño puede ser útil, por ejemplo, donde permite un régimen de dosificación satisfactorio o evita un efecto tóxico. En algunas modalidades, el incremento es al menos aproximadamente tres veces, al menos aproximadamente cinco veces, o al menos aproximadamente diez veces. El término "vida media terapéutica modulada" como se utiliza en la presente significa el cambio positivo o negativo en la vida media de la cantidad terapéuticamente efectiva de una molécula modificada biológicamente activa, relativa a su forma no modificada. La vida media terapéutica se mide al medir las propiedades farmacocinéticas y/o farmacodiná icas de la molécula en varios puntos en el tiempo después de administración. La vida media terapéutica incrementada deseablemente permite un régimen de dosificación benéfico particular, una dosis total benéfica particular, o evita un efecto indeseado. En algunas modalidades, la vida media terapéutica incrementada resulta de potencia incrementada, unión incrementada o disminuida, de la molécula modificada a su objetivo, o un incremento o disminución en otro parámetro o mecanismo de acción de la molécula no modificada. El término "aislada," cuando se aplica a ácido nucleico o proteína, denota que el ácido nucleico o proteína está substancialmente libre de otros componentes celulares con los que se asocia en el estado natural . Puede estar en un estado homogéneo. Sustancias aisladas pueden estar ya sea en un estado seco o semi-seco, o en solución, incluyendo pero no limitándose a, una solución acuosa. Pureza y homogeneidad típicamente se determinan utilizando técnicas de química analítica tales como electroforesis de gel de poliacrilamida o cromatografía líquida de alto desempeño. Una proteína que es la especie predominante presente en una preparación está substancialmente purificada. En particular, un gen aislado se separa de marcos abiertos de lectura que flanquean el gen y codifican una proteína diferente al gen de interés. El término "purificado" denotes que un ácido nucleico o proteína da origen a substancialmente una banda en un gel electroforético. Particularmente, significa que el ácido nucleico o proteína es al menos 85% puro, al menos 90% puro, al menos 95% puro, al menos 99% o más puro. El término "ácido nucleico" se refiere a deoxiribonucleótidos, deoxiribonucleósidos, ribonucleósidos, o ribonucleótidos y polímeros de los mismos en ya sea una forma de filamento único o doble. Al menos que se limite específicamente, el término comprende ácidos nucleicos que contienen análogos conocidos de nucleótidos naturales que tienen propiedades de unión celulares como el ácido nucleico de referencia y se metabolizan en una manera similar a los nucleótidos que ocurren de manera natural. Al menos que se limite específicamente de otra manera, el término también se refiere a análogos de oligonucleótido incluyendo PNA (ácido peptidonucleico) , análogos de ADN utilizados en tecnología antisentido (fosforotioatos, fosforoamidatos, y lo similar). Al menos que se indique de otra manera, una secuencia de ácidos nucleicos particular también comprende implícitamente variantes conservadoramente modificadas de la misma (incluyendo pero no limitándose a, substituciones de codones degeneradas) y secuencias complementarias así como también la secuencia explícitamente indicada. Específicamente, las substituciones de codón degeneradas pueden lograrse al generar secuencias en las cuales la tercer posición de uno o más codones seleccionados (o todos) se substituye con residuos de deoxiinosina y/o base mezclados (Batzer et al, Nucleic Acid Res . 19:5081 (1991); Ohtsuka et al, J. Biol .

Chem . 260/2605-2608 (1985); y Cassol et al. (1992); Rossolini et al, Mol . Cell . Probes 8:91-98 (1994)). Los términos "polipéptido," "péptido" y "proteína" se utilizan de manera intercambiable en la presente para referirse a un polímero de residuos aminoácido. Es decir, una descripción dirigida a un polipéptido aplica igualmente a una descripción de un péptido y una descripción de una proteína, y viceversa. Los términos se aplican a polímeros de aminoácido que ocurren de manera natural así como también polímeros de aminoácido en los cuales uno o más residuos aminoácido es un aminoácido codificado de manera no natural. Como se utiliza en la presente, los términos comprenden cadenas de aminoácido de cualquier longitud, incluyendo proteínas de longitud completa (i.e., antígenos), en donde los residuos aminoácido se enlazan por uniones de péptido covalentes . El término "aminoácido" se refiere a aminoácidos que ocurren de manera natural y que no ocurren de manera natural, así como también análogos de aminoácido e imitaciones de aminoácido que funcionan en una manera similar a los aminoácidos que ocurren de manera natural . Los aminoácidos codificados de manera natural son los 20 aminoácidos comunes (alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, glutamina, ácido glutámico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptofan, tirosina, y valina) y pirolisina y selenocisteína . Los análogos de aminoácido se refieren a compuestos que tienen la misma estructura química básica como un aminoácido que ocurre de manera natural, i.e., un carbón a que se unen a un grupo hidrógeno, carboxilo, un grupo amino, y un grupo R, tal como, homoserina, norleucina, sulfóxido de metionina, sulfonilo de metil metionina. Tales análogos tienen grupos R modificados (tal como, norleucina) o estructuras de péptido modificadas, pero mantienen la misma estructura química básica como un aminoácido que ocurre de manera natural . Aminoácidos pueden referirse en la presente por cualquiera de sus símbolos de tres letras comúnmente conocidos o por los símbolos de una letra recomendados por la Comisión de Nomenclatura Bioquímica IUPAC-IUB. Nucleótidos, del mismo modo, pueden referirse por sus códigos de una sola letra comúnmente aceptados. "Variantes conservadoramente modificadas" se aplica tanto a secuencias de aminoácidos como ácidos nucleicos. Con respecto a secuencias de ácidos nucleicos particulares, "variantes conservadoramente modificadas" se refiere a aquellos ácidos nucleicos que codifican secuencias de aminoácidos esencialmente idénticas o idénticas, o donde el ácido nucleico no codifica una secuencia de aminoácidos, para secuencias esencialmente idénticas. Debido a la degenerancia del código genético, un gran número de ácidos nucleicos funcionalmente idénticos codifican cualquier proteína dada. Por ejemplo, los codones GCA, GCC, GCG y GCU todos codifican el aminoácido alanina. De esta manera, en cada posición donde una alanina se especifica por un codón, el codón puede alterarse a cualquier codón correspondiente descrito con alteración del polipéptido codificado. Tales variaciones de ácido nucleico son "variaciones silenciosas" , que son una especie de variaciones conservadoramente modificadas. Cada secuencia de ácidos nucleicos en la presente que codifica un polipéptido también describe cada variación silenciosa posible del ácido nucleico. Un experto en la materia reconocerá que cada codón en un ácido nucleico (excepto AUG, que es ordinariamente el único codón para metionina, y TGG, que es ordinariamente el único codón para triptofan) puede modificarse para producir una molécula funcionalmente idéntica. De acuerdo con lo anterior, cada variación silenciosa de un ácido nucleico que codifica un polipéptido está implícita en cada secuencia descrita. En cuanto a secuencias de aminoácidos, un experto reconocerá que substituciones, eliminaciones o adiciones individuales a una secuencia de ácido nucleico, péptido, polipéptido, o proteína que altera, agrega o elimina un aminoácido único o un porcentaje pequeño de aminoácidos en la secuencia codificada es una "variante conservadoramente modificada" donde la alteración resulta en la substitución de un aminoácido con un aminoácido químicamente similar. Las tablas de substitución conservadora que proporcionan aminoácidos funcionalmente similares se conocen bien en la materia. Tales variantes modificadas están en adición a y no excluyen las variantes poliméricas, homólogos de interespecies, y alelos de la invención. Los siguientes ocho grupos contienen cada uno aminoácidos que son substituciones conservadora para cada uno: 1) Alanina (A) , Glicina (G) ; 2) Ácido aspártico (D) , Ácido glutámico (E) ; 3) Asparagina (N) , Glutamina (Q) ; 4) Arginina (R) , Lisina (K) ; 5) Isoleucina (I) , Leucina (L) , Metionina (M) , Valina (V) ; 6 Fenilalanina (F) , Tirosina (Y) , Triptofan (W) ; 7 Serina (S) , Treonina (T) ; y 8 Cisteína (C) , Metionina (M) {ver, e.g. Creighton, Proteins : Structures and Molecular Properties (W H Freeman & Co.; 2nd edition (Diciembre 1993) Los términos "idénticos" o por ciento de "identidad," en el contexto de dos o más secuencias de ácidos nucleicos o polipéptidos, se refieren a dos o más secuencias o subsecuencias que son las mismas. Las secuencias son "substancialmente idénticas" si tienen un porcentaje de residuos aminoácido o nucleótidos que son los mismos {i.e., aproximadamente 60% identidad, opcionalmente aproximadamente 65%, aproximadamente 70%, aproximadamente 75%, aproximadamente 80%, aproximadamente 85%, aproximadamente 90%, o aproximadamente 95% de identidad sobre una región especificada) , cuando se comparan y alinean para correspondencia máxima sobre una ventana de comparación, o región designada según se mide utilizando uno de los siguientes algoritmos de comparación de esquema o por alineación manual e inspección visual. Esta definición también se refiere al complemento de una secuencia prueba. La identidad puede existir sobre una región que es de al menos aproximadamente 50 aminoácidos o nucleótidos en longitud, o sobre una región que es de 75-100 aminoácidos o nucleótidos en longitud, o, donde no se especifica, a través de la secuencia completa o un polinucleótido o polipéptido. Para comparación de secuencia, típicamente una secuencia actúa como una secuencia de referencia, con la que las secuencias prueba se comparan. Cuando se utiliza un algoritmo de comparación de secuencia, las secuencias prueba y de referencia se introducen en una computadora, se designan las coordenadas de subsecuencia, si es necesario, y se designan los parámetros de programa del algoritmo de secuencia. Los parámetros de programa de falla pueden utilizarse, o pueden designarse parámetros alternativos. El algoritmo de comparación de secuencia entonces calcula el por ciento de identidades de la secuencia para las secuencias prueba relativas a la secuencia de referencia, en base a los parámetros del programa. Una "ventana de comparación" , como se utiliza en la presente, incluye referencia a un segmento de cualquiera del número de posiciones contiguas seleccionadas del grupo que consiste de 20 a 600, usualmente aproximadamente 50 a aproximadamente 200, más usualmente aproximadamente 100 a aproximadamente 150 en las cuales una secuencia puede compararse con una secuencia de referencia del mismo número de posiciones contiguas después de que las dos secuencias se alinean óptimamente. Los métodos de alineación de secuencias para comparación se conocen bien en la materia. La alineación óptima de las secuencias para comparación puede conducirse, incluyendo pero no limitándose a, por el algoritmo de homología local de Smith and Waterman (1970) Adv. Appl . Ma th . 2:482c, por el algoritmo de alineación de homología de Needleman and Wunsch (1970) J. Mol . Biol . 48:443, por la búsqueda por el método de similitud de Pearson and Lipman (1988) Proc . Nati . Acad . Sci . USA 85:2444, por implementaciones computarizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, y TFASTA en el Paquete de Software Wisconsin Genetics, Genetics Computer Grupo, 575 Science Dr . , Madison, Wl) , o por alineación manual e inspección visual (ver, e.g., Ausubel et al . , Current Protocolos in Molecular Biology (complemento 1995) ) . Un ejemplo de un algoritmo que es adecuado para determinar el por ciento de identidad de la secuencia y similitud de la secuencia son los algoritmos BLAST y BLAST 2.0, que se describen en Altschul et al (1977) Nuc . Acids Res . 25:3389-3402, y Altschul et al. (1990) J Mol . Biol . 215:403-410, respectivamente. El Software para ejecutar análisis BLAST está públicamente disponible a través del Centro Nacional para Información de Biotecnología. Los parámetros del algoritmo BLAST W, T, y X determinan la sensibilidad y velocidad de la alineación. El programa BLASTN (para secuencias de nucleótidos) utiliza como fallas una longitud de palabra (W) de 11, una expectación (E) o 10, M=5, N=-4 y una comparación de ambos filamentos. Para secuencias de aminoácidos, el programa BLASTP utiliza como fallas una longitud de palabra de 3 , y expectación (E) de 10, la matriz de puntuación BL0SUM62 (ver Henikoff and Henikoff (1989) Proc . Nati . Acad Sci . USA 89: 10915) alineaciones (B) de 50, expectación (E) de 10, M=5, N=-4, y una comparación de ambos filamentos. El algoritmo BLAST típicamente se ejecuta con el filtro de "baja complejidad" apagado. El algoritmo BLAST también ejecuta un análisis estadístico de la similitud entre dos secuencias (ver, e.g., Karlin and Altschul (1993) Proc . Nati . Acad. Sci . USA 90:5873-5787). Una medición de similitud proporcionada por el algoritmo BLAST algoritmo es la probabilidad de suma más pequeña (P(N)), que proporciona una indicación de la probabilidad por la cual una concordancia entre dos secuencias de aminoácidos o nucleótidos podría ocurrir por suerte. Por ejemplo, un ácido nucleico se considera similar a una secuencia de referencia si la probabilidad de suma más pequeña en una comparación del ácido nucleico prueba con el ácido nucleico de referencia es menos de aproximadamente 0.2, más preferentemente menos de aproximadamente 0.01, y más preferentemente menos de aproximadamente 0.001. La frase "selectivamente (o específicamente) se hibridiza a" se refiere a la unión, duplicación, o hibridización de una molécula solamente a una secuencia de nucleótidos particular bajo condiciones de hibridización severas cuando esa secuencia está presente en una mezcla compleja (incluyendo pero no limitándose a, ARN o AND de biblioteca o celular total) . La frase "condiciones de hibridización severas" se refiere a condiciones de baja intensidad iónica y alta temperatura como se sabe en la materia. Típicamente, bajo condiciones severas una sonda se hibridizará a su subsecuencia objetivo en una mezcla compleja de ácido nucleico (incluyendo pero no limitándose a, ARN O AND de biblioteca o celular total) pero no se hibridiza a otras secuencias en la mezcla compleja. Las condiciones severas son dependientes de la secuencia y serán diferentes en circunstancias diferentes. Las secuencias más largas se hibridizan específicamente a temperaturas más altas. Una guía extensiva a la hibridización de ácidos nucleicos se encuentra en Tijssen, Techniques in Biochemistry and Molecular Biology— Hybridization wi th Nucleic Probes, "Overview of principies of hybridization and the strategy of nucleic acids assays" (1993) . Generalmente, las condiciones severas se seleccionan por ser aproximadamente 5-10°C inferiores que el punto de fusión térmico (Tm) para la secuencia específica a un pH de intensidad iónica definida. La Tm es la temperatura (bajo intensidad iónica definida, pH, y concentración nucleica) a la cual 50% de la sondas complementarias al objetivo se hibridizan a la secuencia objetivo en equilibrio (ya que las secuencias objetivo están presentes en exceso, a Tm, 50% de las sondas se ocupan en equilibrio) . Las condiciones severas pueden ser aquellas en las cuales la concentración de sal es menos de aproximadamente 1.0 M ion de sodio, típicamente aproximadamente 0.01 a 1.0 M concentración de ion de sodio (u otras sales) a pH 7.0 a 8.3 y la temperatura es al menos aproximadamente 30°C para sondas cortas (incluyendo pero no limitándose a, 10 a 50 nucleótidos) y al menos aproximadamente 60 °C para sondas largas (incluyendo pero no limitándose a, más de 50 nucleótidos) . Las condiciones severas también pueden lograrse con la adición de agentes de desestabilización tal como formamida. Para hibridización específica o selectiva, una señal positiva puede ser al menos dos veces la anterior, opcionalmente 10 veces la hibridización anterior. Condiciones de hibridización severa ejemplificativas pueden ser como sigue: 50% formamida, 5X SSC, y 1% SDS, incubándose a 42°C, o 5X SSC, 1% SDS, incubándose a 65°C, con enjuague en 0.2X SSC, y 0.1% SDS a 65°C. Tales enjuagues pueden realizarse por 5, 15, 30, 60, 120, o más minutos. Como se utiliza en la presente, los términos "especies de Pseudomonas" o "célula huésped Pseudomonas" , o especies Pseudomonas y cepas derivadas de las mismas" se refieren a cualquiera de las especies conocidas o por identificarse del género Pseudomonas, incluyendo pero no limitándose a, Pseudomonas fluorescens , Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas putida, etc. así como también la progenie de las mismas y formas química y genéticamente modificadas de las mismas y su progenie. El término "sujeto" como se utiliza en la presente, se refiere a un animal, preferentemente un mamífero, más preferentemente un humano, quien es el objeto de tratamiento, observación o experimento. El término "cantidad efectiva" como se utiliza en la presente se refiere a aquella cantidad del polipéptido de aminoácido no natural (modificado) que se administra, que aliviará a algún grado uno o más síntomas de la enfermedad, condición o trastorno que se trata. Las composiciones que contienen el polipéptido de aminoácido no natural (modificado) descrito en la presente pueden administrarse para tratamientos profilácticos, de mejora y/o terapéuticos. Los términos "mejorar" o "que mejora" significa incrementar o prolongar ya sea en potencia o duración un efecto deseado. De esta manera, con respecto a la mejora del efecto de agentes terapéuticos, el término "que mejora" se refiere a la capacidad para incrementar o prolongar, ya sea en potencia o duración, el efecto de otros agentes terapéuticos en un sistema. Una "cantidad efectiva que mejora", como se utiliza en la presente, se refiere a una cantidad adecuada para mejorar el efecto de otro agente terapéutico en un sistema deseado. Cuando se utiliza en un paciente, las cantidades efectivas para este uso dependerán de la severidad y curso de la enfermedad, trastorno o condición, terapia previa, el estado de salud del paciente y respuesta a fármacos, y el juicio del médico que trata. El término "modificado," como se utiliza en la presente se refiere a la presencia de una modificación post-traduccional en un polipéptido. El término forma "(modificada)" significa que los polipéptidos que se tratan se modifican opcionalmente, es decir, los polipéptidos bajo discusión pueden modificarse o no modificarse. El término "modificado post-traduccionalmente" y "modificado" se refiere a cualquier modificación de un aminoácido natural o no natural que ocurre a tal un aminoácido después de que se ha incorporado en una cadena de polipéptido. El término comprende, a manera de ejemplo solamente, modificaciones in vivo co-traduccionales, modificaciones in vivo post-traduccionales, y modificaciones in vi tro post-traduccionales. En aplicaciones profilácticas, las composiciones que contienen el polipéptido de aminoácido no natural (modificado) se administran a un paciente susceptible a o de otra manera en riesgo de una enfermedad, trastorno o condición particular. Tal una cantidad se define que es una "cantidad profilácticamente efectiva" . En este uso, las cantidades precisas también dependen del estado de salud del paciente, peso, y lo similar. Se considera bien dentro de la experiencia de la materia para uno determinar tales cantidades profilácticamente activas por experimentación de rutina (e.g., una prueba clínica de escala de dosis) . El término "protegido" se refiere a la presencia de un "grupo protector" o residuo que previene la reacción del grupo funcional químicamente reactivo bajo ciertas condiciones de reacción. El grupo protector variará dependiendo del tipo de grupo químicamente reactivo que se protege. Por ejemplo, si el grupo químicamente reactivo es una amina o una hidrazida, el grupo protector puede seleccionarse del grupo de tert-butiloxicarbonilo (t-Boc) y 9-fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc) . Si el grupo químicamente reactivo es un tiol, el grupo protector puede ser ortopiridildisulfuro. Si el grupo químicamente reactivo es un ácido carboxílico, tal como ácido butanócio o propiónico, o un grupo hidroxilo, el grupo protector puede ser un grupo alquilo o bencilo tal como metilo, etilo, o tert-butilo. Otros grupos protectores conocidos en la materia también pueden utilizarse en o con los métodos y composiciones descritas en la presente. A manera de ejemplo solamente, los grupos de bloqueo/protectores pueden seleccionarse de: Otros grupos protectores se describen en Greene and Wuts, Protective Grupos in Organic Synthesis, 3rd Ed., John Wiley & Sons, New York, NY, 1999, que se incorpora en la presente para referencia en su totalidad. En aplicaciones terapéuticas, las composiciones que contiene el polipéptido de aminoácido no natural (modificado) se administra a un paciente que ya sufre de una enfermedad, condición o trastorno, en una cantidad suficiente para curar o al menos detener parcialmente los síntomas de la enfermedad, trastorno o condición. Tal cantidad se define como una "cantidad terapéuticamente efectiva," y dependerá de la severidad y curso de la enfermedad, trastorno o condición, terapia previa, el estado de salud del paciente y respuesta a los fármacos, y el juicio del médico que trata. Se considera bien dentro de la experiencia de la materia para uno determinar tales cantidades terapéuticamente efectivas por experimentación de rutina (e.g., una prueba clínica de escala de dosis) . El término "tratar" se utiliza para referirse a ya sea los tratamientos profilácticos y/o terapéuticos. Como se utiliza en la presente, el término "ortogonal" se refiere a una molécula (e.g,, un tARN ortogonal (O-tARN) y/o una aminoacil tARN sintetasa ortogonal (O-RS) ) que se utiliza con eficiencia reducida por un sistema de interés (e.g., un sistema de traducción, e.g., una célula) . Ortogonal se refiere a la incapacidad o eficiencia reducida, e.g., menos de 20 % eficiente, menos de 10 % eficiente, menos de 5% eficiente, o e.g., menos de 1% eficiente, de un tARN ortogonal y/o ortogonal RS para funcionar en el sistema de traducción de interés. Por ejemplo, un tARN ortogonal en un sistema de traducción de interés aminoacila cualquier RS endógeno de un sistema de traducción de interés con eficiencia reducida o aún cero, cuando se compara con la aminocilación de un tAR? endógeno por el RS endógeno. En otro ejemplo, un RS ortogonal aminocila cualquier tAR? endógeno en el sistema de traducción de interés con eficiencia reducida o aún cero, en comparación con la aminoacilación del tAR? endógeno por un RS endógeno. Preferentemente aminoacila : El término "preferentemente aminoacila" se refiere a una eficiencia de, e.g., aproximadamente 70% eficiente,, aproximadamente 71% eficiente, aproximadamente 72% eficiente, aproximadamente 73% eficiente, aproximadamente 74% eficiente aproximadamente 75% eficiente, aproximadamente 76% eficiente, aproximadamente 77% eficiente, aproximadamente 78% eficiente, aproximadamente 79% eficiente, aproximadamente 80% eficiente, aproximadamente 85% eficiente, aproximadamente 90% eficiente, aproximadamente 95% eficiente, o aproximadamente 99% o más eficiente, en la que un O-RS aminoacila un O-tARN con un aminoácido no natural en comparación con un tARN que ocurren de manera natural o material inicial utilizado para generar el O-tARN . El aminoácido no natural se incorpora entonces en una cadena de polipéptido creciente con alta fidelidad, e.g., a más de aproximadamente 70% eficiente, aproximadamente 71% eficiente, aproximadamente 72% eficiente, aproximadamente 73% eficiente, aproximadamente 74% eficiente, más de aproximadamente 75% eficiencia para un codón selector dado, a más de aproximadamente 80% eficiencia para un codón selector dado, a más de aproximadamente 85% eficiencia para un codón selector dado, a más de aproximadamente 90% eficiencia para un codón selector dado, a más de aproximadamente 95% eficiencia para un codón selector dado, o a más de aproximadamente 99% o más eficiencia para un codón selector dado. Codón selector: El término "codón selector" se refiere a codones reconocidos por O-tARN en el proceso de traducción y no preferentemente reconocido por un tAR? endógeno. El ciclo de anticodón de O-tARN reconoce el codón selector en el mAR? e incorpora su aminoácido, e.g., un aminoácido no natural, en este sitio en el polipéptido. Los codones selectores pueden incluir, pero no limitándose a, e.g., codones sin sentido, tales como, codones de detención, e.g., codones ámbar, ocre, y opal; cuatro o más codones base; codones derivados pares bases naturales o no naturales y lo similar. Para un sistema dado, un codón selector también puede incluir uno de los codones de tres bases naturales, en donde el sistema endógeno no .utiliza dicho codón de tres bases natural, e.g., un sistema que carece de tARN que reconoce un codón de tres bases natural o un sistema en donde un codón de tres bases natural es un codón raro. tAR? supresor: Un tAR? supresor es un tAR? que altera la lectura de un ARN mensajero (mAR?) en un sistema de traducción dado. Un tAR? supresor puede leerse a través de, e.g., un codón de detención, un codón de cuatro bases, o un codón raro . Sistema de traducción: El término "sistema de traducción" se refiere a los componentes necesarios para incorporar un aminoácido que ocurre de manera natural en una cadena de polipéptido creciente (proteína) . Los componentes de un sistema de traducción pueden incluir, e.g., ribosomas, tAR?'s, sintetasas, mARN y lo similar. Los componentes de la presente invención pueden agregarse a un sistema de traducción, in vivo o in vi tro . Un sistema de traducción puede ser una célula, ya sea procariótica, e.g., una célula E. coli , o eucariótica, e.g., una levadura, célula de mamífero, planta, o insecto. Al menos que se indique de otra manera, se emplean los métodos convencionales de espectroscopia de masa, ?MR, HPLC, química de proteína, bioquímica, técnicas de AD? recombinantes y farmacología, dentro de la experiencia de la materia . DESCRIPCIÓN DETALLADA I. Introducción Moléculas de polipéptido que comprenden al menos un aminoácido codificado de manera no natural hecho en células huésped Pseudomonas se proporcionan en la invención. En ciertas modalidades de la invención, el polipéptido con al menos un aminoácido codificado de manera no natural incluye al menos una modificación post-traduccional . En una modalidad, la al menos una modificación post-traduccional comprende la unión de una molécula incluyendo pero no limitándose a, una etiqueta, un tinte, un polímero, un polímero soluble en agua, un derivado de glicol de polietileno, un fotoreticulador, un compuesto citotóxico, un fármaco, una etiqueta de afinidad, una etiqueta de fotoafinidad, un compuesto reactivo, una resina, una segunda proteína o polipéptido o análogo de polipéptido, un anticuerpo o fragmento de anticuerpo, un quelador de metal, un cofactor, un ácido graso, un carbohidrato, un polinucleótido, un ADN, un ARN, un polinucleótido antisentido, un ácido ribonucleico inhibidor, un biomaterial, una nanopartícula, una etiqueta de giro, un fluoroforo, un residuo que contiene metal, un residuo radioactivo, un nuevo grupo funcional, un grupo que interactúa covalente o no covalentemente con otras moléculas, un residuo fotoguardado, un residuo fotoisomerizable, biotina, un derivado de biotina, un análogo de biotina, un residuo que incorpora un átomo pesado, un grupo químicamente desdoblable, un grupo fotodesdoblable, una cadena lateral alargada, un azúcar enlazada a carbono, un agente activo redox, un tioácido amino, un residuo tóxico, un residuo isotópicamente etiquetado, una sonda biofísica, un grupo fosforescente, un grupo quimioluminescente, un grupo denso de electrón, un grupo magnético, un grupo intercalador, un cromóforo, un agente de transferencia de energía, un agente biológicamente activo, una etiqueta detectable, una molécula pequeña, o cualquier combinación de lo anterior o cualquier otro compuesto o sustancia deseable, que comprenden un segundo grupo reactivo a al menos un aminoácido codificado de manera no natural que comprende un primer grupo reactivo utilizando metodología química que se conoce por alguien de experiencia ordinaria en la materia por ser adecuado para los grupos reactivos particulares. Por ejemplo, el primer grupo reactivo es un residuo alquinilo (incluyendo pero no limitándose a, en el aminoácido codificado de manera no natural p-propargiloxifenilalanina, donde el grupo propargil también algunas veces se refiere como un residuo acetileno) y el segundo grupo reactivo es un residuo azido, y se utilizan metodología de química de cicloadición [3+2] . En otro ejemplo, el primer grupo reactivo es el residuo azido (incluyendo pero no limitándose a, en el aminoácido codificado de manera no natural p-azido-L-fenilalanina) y el segundo grupo reactivo es el residuo alquinilo. En ciertas modalidades del polipéptido hGH modificado de la presente invención, al menos un aminoácido codificado de manera no natural (incluyendo pero no limitándose a, aminoácido codificado de manera no natural que contiene un grupo funcional ceto) que comprende al menos una modificación post-traduccional, se utiliza donde la al menos una modificación post-traduccional comprende un residuo de sacárido. En ciertas modalidades, la modificación post-traduccional se hace in vivo en una célula eucariótica o en una célula no eucariótica . En ciertas modalidades, la proteína incluye al menos una modificación post-traduccional que se hace in vivo por una célula huésped, donde la modificación post-traduccional no se hace normalmente por otra tipo de célula huésped. En ciertas modalidades, la proteína incluye al menos una modificación post-traduccional que se hace in vivo por una célula eucariótica, donde la modificación post-traduccional no se hace normalmente por una célula no eucariótica. Ejemplos de modificaciones post-traduccionales incluyen, pero no se limitan a, acetilación, acilación, modificación de lípido, palmitoilación, adición de plamitato, fosforilación, modificación de enlace de glicolípido, y lo similar. En una modalidad, la modificación post-traduccional comprende la unión de un oligosacárido a una Asparagina por un enlace GlcNAc-Asparagina (incluyendo pero no limitándose a, donde el oligosacárido comprende (GlcNAc-Man) 2-Man-GlcNAc-GlcNAc, y lo similar) . en otra modalidad, la modificación post-traduccional comprende unión de un oligosacárido (incluyendo pero no limitándose a, Gal -GalNAc, Gal-GlcNAc, etc.) a una serina o treonina por un enlace GalNAc-serina, GalNAc-treonina, GlcNAc-serina, o GlcNAc-treonina enlace. En ciertas modalidades, una proteína o polipéptido de la invención pueden comprender una secuencia de secreción o localización, una señal de epítope, una señal FLAG, una señal de polihistidina, una fusión GST, y/o lo similar. La proteína o polipéptido de interés puede contener al menos uno, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, al menos seis, al menos siete, al menos ocho, al menos nueve, o diez o más aminoácidos codificados de manera no natural. Los aminoácidos codificados de manera no natural puede ser el mismo o diferente, por ejemplo, puede haber 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más sitios diferentes en la proteína que comprenden 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o aminoácidos codificados de manera no natural más diferentes. En ciertas modalidades, al menos uno, pero menos que todos, de un aminoácido particular presente en una versión que ocurre de manera natural de la proteína es substituido con un aminoácido codificado de manera no natural. La presente invención proporciona conjugados de sustancias que tienen una amplia variedad de grupos funcionales, substituyentes o residuos, con otras sustancias incluyendo pero no limitándose a una etiqueta; un tinte; un polímero; un polímero soluble en agua; un derivado de glicol de polietileno; un fotoreticulador; un compuesto citotóxico; un fármaco; una etiqueta de afinidad; una etiqueta de fotoafinidad; un compuesto reactivo; una resina; una segunda proteína o polipéptido o análogo de polipéptido; un anticuerpo o fragmento de anticuerpo; un quelador de metal; un cofactor; un ácido graso; un carbohidrato; un polinucleótido; un ADN; un ARN; un polinucleótido antisentido; un ácido ribonucleico inhibidor; un biomaterial; una nanopartícula; una etiqueta de giro; un fluoroforo, un residuo que contiene metal; un residuo radioactivo; un nuevo grupo funcional; un grupo que interactúa covalente o no covalentemente con otras moléculas; un residuo fotoguardado; un residuo fotoisomerizable; biotina; un derivado de biotina; un análogo de biotina; un residuo que incorpora un átomo pesado; un grupo químicamente desdoblable; a grupo fotodesdoblable; una cadena lateral alargada; un azúcar enlazada a carbono; un agente activo redox; un tioácido amino; un residuo tóxico; un residuo isotópicamente etiquetado; una sonda biofísica; un grupo fosforescente; un grupo quimioluminescente; un grupo denso de electrón; un grupo magnético; un grupo intercalador; un cromóforo; un agente de transferencia de energía; un agente biológicamente activo; una etiqueta detectable; una molécula pequeña; o cualquier combinación de lo anterior, o cualquier otro compuesto o sustancia deseable) . La presente invención también incluye conjugados de sustancias que tienen residuos de azida o acetileno con derivados de polímero PEG que tienen los residuos azida o acetileno correspondientes. Por ejemplo, un polímero PEG que contiene un residuo azida puede acoplarse a una molécula biológicamente activa en una posición en la proteína que contienen un aminoácido no codificado de manera genética que lleva una funcionalidad de acetileno. El enlace por el cual PEG y la molécula biológicamente activa se acoplan incluyen pero no se limitan a el producto de cicloadición Huisgen [3+2] . Se establece bien en la materia que PEG puede utilizarse para modificar las superficies de biomateriales (ver, e.g., Patente de E.U. 6,610,281; Mehvar, R. , J. Pharmaceut . Sci, 3(1): 125-136 (2000) que se incorpora para referencia en la presente) . Más específicamente, un polímero soluble en agua que tiene al menos una porción hidroxilo activa experimenta una reacción para producir un polímero substituido que tiene un residuo más reactivo, tal como un mesilato, tresilato, tosilato o grupo saliente de halógeno, en el mismo. La preparación y uso de derivados PEG que contienen haluros de ácido sulfonilo, átomos de halógeno y otros grupos salientes se conocen bien por aquellos expertos. El polímero substituido resultante experimenta entonces una reacción para substituir una un residuo más reactivo en un término del polímero. Alternativamente, un polímero soluble en agua que tiene al menos un residuo electrofílico o nucleofílico activo experimenta una reacción con un agente de enlace de manera que se forma una unión covalente entre el polímero PEG y el agente de enlace y el grupo reactivo se coloca en el término del polímero. Residuos nucleofílieos y electrofílieos, incluyendo aminas, tioles, hidrazidas, hidrazinas, alcoholes, carboxilatos, aldehidos, cetonas, tioésteres y lo similar, se conocen bien por aquellos expertos . Esta invención utiliza técnicas de rutina en el campo de genéticas recombinantes. Los textos básicos que describen los métodos generales de uso de esta invención incluyen Sambrook et al,, Molecular Cloning, A Laboratory Manual (3rd ed. 2001) ; Kriegler, Gene Transfer and Expression : A Laboratory Manual (1990) ; y Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al, eds., 1994)). Los textos generales que describen técnicas biológicas moleculares incluyen Berger and Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology volumen 152 Academic Press, Inc., San Diego, CA (Berger); Sambrook et al . , Molecular Cloning - A Laboratory Manual (2nd Ed) Vol. 1-A Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989 ("Sambrook") y Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel et al., eds., Current Protocols, a joint venture between Greene Publishing Associates, Inc. y John Wiley & Sons, Inc., (complementado a 1999) ("Ausubel")). Estos textos describen mutagénesis, el uso de vectores, promotores y muchos otros tópicos relevantes relacionados con, incluyendo pero no limitándose a, la generación de genes incluyendo codones selectores para la producción de proteínas incluyendo aminoácidos codificados de manera no natural, tARNs ortogonales, sintetasas ortogonales, y pares de los mismos. Varios tipos de mutagénesis se utilizan en la invención para una variedad de propósitos, incluyendo pero no limitándose a, para producir bibliotecas de tAR?'s, para producir bibliotecas de sintetasas, para producir codones selectores, para insertar codones selectores que codifican aminoácidos codificados de manera no natural en una proteína o polipéptido de interés. Incluyen pero no limitándose a mutagénesis de punto aleatorio, dirigida a sitio, recombinación homologa, arrastre de AD? u otros métodos de mutagénesis recursiva, construcción quimérica, mutagénesis utilizando templados que contienen uracil, mutagénesis dirigida a oligonucleótido, mutagénesis de ADN modificada por fosforotioato, mutagénesis utilizando ADN dúplex espaciado o lo similar, o cualquier combinación de los mismos. Los métodos adecuados adicionales incluyen reparación de mala concordancia puntual, mutagénesis utilizando cepas huésped deficientes en reparación, purificación por restricción y selección por restricción, mutagénesis de eliminación, mutagénesis por síntesis genética total, reparación de rotura de doble filamento, y lo similar. Mutagénesis, incluyendo pero no limitándose a, construcciones quiméricas envolventes, también se incluyen en la presente invención. En una modalidad, mutagénesis puede guiarse por información conocida de la molécula que ocurre de manera natural o molécula que ocurre de manera natural alterada o mutada, incluyendo pero no limitándose a, secuencia, comparaciones de secuencia, propiedades físicas, estructura de cristal o lo similar. Los textos y ejemplos encontrados en la presente describen estos procedimientos. La información adicional se encuentra en las siguientes publicaciones y referencias citadas dentro de: Ling et al., Approaches to DNA mutagenesi s : an overview, Anal Biochem, 254(2): 157-178 (1997); Dale et al., Oligonucleotide-directed random mutagenesi s using the fosforothioate method, Methods Mol . Biol. 57:369-374 (1996); Smith, In vi tro mutagénesis , Ann.

Rev. Genet. 19:423-462 (1985); Botstein & Shortle, Strategies and applications of in vi tro mutagenesis, Science 229:1193-1201 (1985); Cárter, Si te-directed mutagenesis, Biochem. J. 237:1-7 (1986); Kunkel The efficiency of oligonucleotide directed mutagenesis , in Nucleic Acids & Molecular Biology (Eckstein, F. and Lilley, D.M.J. eds., Springer Verlag, Berlin) (1987); Kunkel, Rapid and efficient si te-specific mutagenesis wi thout phenotypic selection, Proc. Nati. Acad. Sci . 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Células huésped Pseudomonas se forman genéticamente (incluyendo pero no limitándose a, transformadas, transducidas, transfectadas) con los polinucleótidos de la invención o construcciones incluyendo pero no limitándose a, un vector de la invención, que puede ser, por ejemplo, un vector de clonación o un vector de expresión. El vector puede estar, por ejemplo, en la forma de un plásmido, una bacteria, un virus, un polinucleótido puro, o un polinucleótido conjugado. Los vectores se introducen en células y/o microorganismos por métodos estándar incluyendo electroporación (From et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 82, 5824 (1985) , infección por vectores virales, penetración balística a alta velocidad por partículas pequeñas con el ácido nucleico ya sea dentro de la matriz de partículas o perlas pequeñas, o en la superficie (Klein et al., Nature 327, 70-73 (1987) ) .

Las células huésped Pseudomonas formadas pueden cultivarse en medio nutriente convencional modificado según sea apropiado para tales actividades como, por ejemplo, seleccionar etapas, activar promotores y seleccionar transformadores. Otras referencias útiles, incluyendo pero no limitándose a aislamiento y cultivo celular (e.g., para aislamiento subsiguiente de ácido nucleico) incluyen Freshney (1994) Culture of Animal Cells, a Manual of Basic Technique, tercera edición, Wiley-Liss, New York y las referencias cintadas en la presente; Payne et al (1992) Plant Cell and Tissue Culture in Liquid Systems John Wiley & Sons, Inc. New York, NY; Gamborg and Phillips (eds.) (1995) Plant Cell, Tissue and Organ Culture; Fundamental Methods Springer Lab Manual, Springer- Verlag (Berlin Heidelberg New York) y Atlas and Parks (eds.) The Handbook of Microbiological Media (1993) CRC Press, Boca Raton, FL. Varios métodos bien conocidos para introducir ácidos nucleicos objetivo células están disponibles, cualquier de los cuales puede utilizarse en la invención. Estos incluyen: fusión de las células receptoras con protoplastos bacterianas que contienen el ADN, electroporación, bombardeo de proyectil, e infección con vectores virales (descritos además, abajo), etc. Las células bacterianas pueden utilizarse para amplificar el número de plásmidos que contienen construcciones de ADN de esta invención. Las bacterias se desarrollan en fase log y los plásmidos dentro de las bacterias pueden aislarse por una variedad de métodos conocidos en la materia (ver, por ejemplo, Sambrook) . Además, una plétora de kits están comercialmente disponibles para la purificación de plásmidos de bacterias, (ver, e.g., EasyPrep™, FlexiPrep11", ambos de Pharmacia Biotech; StrataClean™ de Stratagene; y, QIAprep™ de Qiagen) . Los plásmidos purificados y aislados se manipulan entonces además para producir otros plásmidos, utilizados para transfectar células o incorporarse en vectores relacionados para infectar organismos. Los vectores típicos contienen terminadores de transcripción y traducción, secuencias de inicio de transcripción y traducción, y promotores útiles para la regulación de la expresión del ácido nucleico objetivo particular. Los vectores opcionalmente comprenden cassettes de expresión genética que contienen al menos una secuencia terminadora independiente, secuencias que permiten la réplica del cassette en eucariotas, o procariotas, o ambas, (incluyendo pero no limitándose a, vectores de traslado) y marcadores de selección tanto para sistemas eucarióticos como procarióticos. Los vectores son adecuados para réplica e integración en procariotas, eucariotas, o preferentemente ambas. Ver, Giliman & Smith, Gene 8:81 (1979); Roberts, et al, Nature . 328:731 (1987); Schneider, B., et al, Protein Expr. Purif. 6435:10 (1995); Ausubel, Sambrook, Berger ( todos supra) . Se proporciona un catálogo de bacterias y bacteriófagos utilizados para clonación, e.g., por ATCC, e.g., The ATCC Catalogue of Bacterias and Bacteriophage (1992) Gherna et al (eds) publicado por ATCC. Los procedimientos básicos adicionales para secuenciación, clonación y otros aspectos de biología molecular y consideraciones teóricas subyacentes también se encuentran en Watson et al. (1992) Recombinant DNA Second Edition Scientific American Books, NY. Además, esencialmente cualquier ácido nucleico (y virtualmente cualquier ácido nucleico etiquetado, ya sea estándar o no estándar) puede adaptarse u ordenarse estándar de cualquiera de una variedad de fuentes comerciales, tales como Midland Certified Reagent Company (Midland, TX disponible en la red en mcrc.com), The Great American Gene Company (Ramona, CA disponible en la red en genco.com), ExpressGen Inc. (Chicago, IL disponible en la red en expressgen.com), Operon Technologies Inc. (Alameda, CA) y muchas otras . CODONES SELECTORES Codones selectores de la invención expanden la estructura del codón genética de maquinaria biosintética de proteína. Por ejemplo, un codón selector incluye, pero no se limita a, un codón único de tres bases, un codón sin sentido, tal como un codón de detención, incluyendo pero no limitándose a, un codón ámbar (UAG) , o un codón ópalo (UGA) , o un codón ocre (UAA) , un codón que contiene nucleósido no natural, un codón de cuatro o más bases, un codón raro, o lo similar. Es fácilmente aparente para aquellos de experiencia ordinaria en la materia que existe un amplio rango en el número de codones selectores que pueden introducirse en un gen deseado, incluyendo pero no limitándose a, uno o más, dos o más, más que tres, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más en un polinucleótido único que codifica al menos una porción del polipéptido. En una modalidad, los métodos incluyen el uso de un codón selector que es un codón de detención para la incorporación de aminoácidos codificados de manera no natural in vivo en una célula eucariótica. Por ejemplo, un O-tARN se produce que reconoce el codón de detención, incluyendo pero no limitándose a, UAG, y se aminoacila por O-RS con un aminoácido deseado codificado de manera no natural. Este 0-tARN no se reconoce por las sintetasas aminoacil tARN del huésped que ocurren de manera natural . La mutagénesis dirigida en sitio convencional puede utilizarse para introducir el codón de detención, incluyendo pero no limitándose a, TAG, en el sitio de interés en un polipéptido de interés. Ver, e.g., Sayers, J.R., et al. (1988), 5', 3 ' Exonuclease in phosphorothioate -based oligonucleotide-directed mutagenesis . ?ucleic Acids Res, 791-802. cuando el y O-RS, O-tARN y el ácido nucleico que codifica el polipéptido de interés se combinan in vivo, el aminoácido codificado de manera no natural se incorpora en respuesta al codón UAG para dar un polipéptido que contiene el aminoácido codificado de manera no natural en la posición especificada. La incorporación de aminoácidos codificados de manera no natural in vivo puede hacerse sin perturbación significativa de la célula huésped Pseudomonas. Por ejemplo, debido a que la eficiencia de supresión para el codón UAG depende de la competición entre O- tARN, incluyendo pero no limitándose a, el tARN supresor ámbar, y un factor de liberación (que se une a un codón de detención e inicia la liberación del péptido de crecimiento de la ribosoma) , la eficiencia de supresión puede modularse al, incluyendo pero no limitándose a, incrementar el nivel de expresión de O-tAR?, y/o el tAR? supresor. Codones selectores también comprenden codones extendidos, incluyendo pero no limitándose a, codones de cuatro o más bases, tales como, codones de cuatro, cinco, seis o más bases. Ejemplos de codones de cuatro bases incluyen, incluyendo pero no limitándose a, AGGA, CUAG, UAGA, CCCU y lo similar. Ejemplos de codones de cinco bases incluyen, pero no se limitan a, AGGAC, CCCCU, CCCUC, CUAGA, CUACU, UAGGC y lo similar. Una característica de la invención incluye utilizar codones extendidos en base a la supresión de cambio de marco. Los codones de cuatro o más bases pueden insertar, incluyendo pero no limitándose a, uno o múltiples aminoácidos codificados de manera no natural en la misma proteína. Por ejemplo, en la presencia de O-tARNs mutados, incluyendo pero no limitándose a, tARNs supresores de cambio de marco especiales, con ciclos anticodón, por ejemplo, con al menos 8-10 nt ciclos anticodón, el codón de cuatro o más bases se lee como un aminoácido único. En otras modalidades, los ciclos anticodón pueden decodificar, incluyendo pero no limitándose a, al menos un codón de cuatro bases, al menos un codón de cinco bases, o al menos un codón de seis bases o más. Ya que existen 256 codones de cuatro base posibles, múltiples aminoácidos codificados de manera no natural pueden codificarse en la misma célula utilizando un codón de cuatro o más bases. Ver, Anderson et al., (2002) Exploring the Limi ts of Codon and Anticodon Size, Chemistry and Biology, 9:237-244; Magliery, (2001) Expanding the Genetic Code : Selection of Efficient Suppressors of Four-base Codons and Identification of "Shifty" Four-base Codons wi th a Library Approach in Escherichia coli , J. Mol. Biol. 307: 755-769. Por ejemplo, codones de cuatro bases se han utilizado para incorporar aminoácidos codificados de manera no natural en proteínas utilizando métodos biosintéticos in vi tro . Ver, e.g., Ma et al., (1993) Biochemistry, 32:7939; y Hohsaka et al., (1999) J. Am. Chem. Soc. 121:34. CGGG y AGGU se utilizan para incorporar simultáneamente 2-naftilalanina y un derivado NBD de lisina en estreptavidina in vi tro con dos tARNs supresores de cambio de marco químicamente acilados. Ver, e.g., Hohsaka et al., (1999) J. Am. Chem. Soc, 121 : 12194. En un estudio in vivo, Moore et al. examinaron la capacidad de derivados de tARNLeu con anticodones NCUA para suprimir los codones UAGN (N puede ser U, A, G, o C) , y encontraron que el cuadruplete UAGA puede decodificarse por un tARNLeu con un anticodón UCUA con una eficiencia de 13 a 26% con poca decodificación en el marco 0 o -1. Ver, Moore et al., (2000) J. Mol. Biol., 298:195. En una modalidad, los codones extendidos en base a los codones raros o codones no sentido pueden utilizarse en la presente invención, los cuales pueden reducir la lectura en mal sentido y supresión de cambio de marco en otros sitios no deseados. Para un sistema dado, un codón selector puede incluir uno de los tres codones base naturales, donde el sistema endógeno no utiliza (o raramente utiliza) el codón base natural. Por ejemplo, este incluye un sistema que carece de tARN que reconoce un codón natural de tres bases, y/o un sistema donde el codón de tres bases es un codón raro A Los codones selectores opcionalmente incluyen pares base no naturales. Estos pares base no naturales expanden el alfabeto genético existente. Un par base extra incrementa el número de codones triplete de 64 a 125. Las propiedades de los pares de tres bases incluyen formación en pareja base selectiva, incorporación enzimática eficiente en ADN con alta fidelidad por una polimerasa, y la extensión del cebador continúa eficiente después de la síntesis del par base no natural naciente. Las descripciones de pares base no naturales que pueden adaptarse para los métodos y composiciones incluyen, e.g., Hirao, et al., (2002) An unnatural base pair for incorporating amino acido analogues into protein , Nature Biotechnology, 20:177-182. Otras publicaciones relevantes se enlistan abajo. Para uso in vivo, el nucleósido no natural es permeable a membrana y se fosforila para formar el trifosfato correspondiente. Además, la información genética incrementada es estable y no destruye las enzimas celulares. Los esfuerzos previos por Benner y otros tomaron ventaja de los patrones de unión a hidrógeno que son diferentes de aquellos en los pares canónicos Watson-Crick, el ejemplo más notable de los cuales es el par iso-C:iso-G. Ver, e.g., Switzer et al., (1989) J. Am. Chem. Soc. 111:8322; y Piccirilli et al., (1990) Nature, 343:33; Kool , (2000) Curr. Opin. Chem. Biol., 4:602. Estas bases en general se desparejan a algún grado con bases naturales y no pueden duplicarse enzimáticamente. Kool y colaboradores demostraron que las interacciones de empacado hidrofóbico entre las bases pueden reemplazar la unión de hidrógeno para conducir la formación de par base. Ver, Kool, (2000) Curr. Opin. Chem. Biol., 4:602; y Guckian and Kool, (1998) Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 36, 2825. En un esfuerzo por desarrollar pares base no naturals que satisfagan todos los requerimientos anteriores, Schultz, Romesberg y colaboradores han sintetizado sistemáticamente y estudiado una serie de bases hidrofóbicas no naturales. Una auto par PICS:PICS se encuentra que es más estable que los pares base naturales, y puede incorporarse eficientemente en ADN por el fragmento Klenow de polimerasa I de ADN de Escherichia coli (KF) . Ver, e.g., McMinn et al., (1999) J. Am. Chem. Soc, 121 : 11586; y Ogawa et al., (2000) J. Am. Chem. Soc, 122:3274. El auto par 3MN:3MN puede sintetizarse por KF con suficiente eficiencia y selectividad para función biológica. Ver, e.g., Ogawa et al., (2000) J. Am. Chem. Soc, 122:8803. Sin embargo, ambas bases actúan como un terminador de cadena para réplica adicional. Una polimerasa de ADN mutante se ha incluido recientemente que puede utilizarse para duplicar el auto par PCIS. Además, un auto par 7AI puede duplicarse. Ver, e.g., Tae et al., (2001) J. Am. Chem. Soc, 123:7439. Un Nuevo par metalobase, Dipic: Py, también se ha desarrollado, que forma un par estable en unión Cu (II) . Ver, Meggers et al., (2000) J. Am. Chem. Soc, 122:10714. Debido a que los codones extendidos y codones no naturales son intrínsecamente ortogonales a los codones naturales, los métodos de la invención pueden tomar ventaja de esta propiedad para generar tARNs ortogonales para ellos. Un sistema de desviación de traducción también puede utilizarse para incorporar un aminoácido codificado de manera no natural en un polipéptido deseado. En un sistema de desviación de traducción, una secuencia larga se incorpora en un gen pero no se traduce en proteína. La secuencia contiene una estructura que sirve como una entrada para inducir la ribosoma para saltar la secuencia y resumir la traducción aguas abajo de la inserción. En ciertas modalidades, la proteína o polipéptido de interés (o porción de la misma) en los métodos y/o composiciones de la invención se codifica por un ácido nucleico. Típicamente, el ácido nucleico comprende al menos un codón selector, al menos dos codones selectores, al menos tres codones selectores, al menos cuatro codones selectores, al menos cinco codones selectores, al menos seis codones selectores, al menos siete codones selectores, al menos ocho codones selectores, al menos nueve codones selectores, diez o más codones selectores. Los genes que codifican proteínas o polipéptidos de interés pueden mutagenizarse utilizando métodos bien conocidos por un experto en la materia y descritos en la presente para incluir, por ejemplo, uno o más codones selectores para la incorporación de un aminoácido codificado de manera no natural. Por ejemplo, un ácido nucleico para una proteína de interés se mutageniza para incluir uno o más codones selectores, proporcionándose para la incorporación de uno o más aminoácidos codificados de manera no natural. La invención incluye cualquier tal variante, incluyendo pero no limitándose a, mutante, versiones de cualquier proteína, por ejemplo, incluyendo al menos un aminoácido codificado de manera no natural. De manera similar, la invención también incluye ácido nucleicos correspondientes, i.e., cualquier ácido nucleico con uno o más codones selectores que codifican uno o más aminoácidos codificados de manera no natural. Las moléculas de ácido nucleico que codifican una proteína de interés pueden mutarse fácilmente para introducir una cisteína en cualquier posición deseada del polipéptido. La cisteína se utiliza ampliamente para introducir moléculas reactivas, polímeros solubles en agua, proteínas, o una amplia variedad de otras moléculas, sobre una proteína de interés. Los métodos adecuados para la incorporación de cisteína en una posición deseada del polipéptido se conocen bien en la materia, tales como aquellos descritos en Patente de E.U. No. 6,608,183, que se incorpora para referencia en la presente, y técnicas de mutagénesis estándar. IV. Aminoácidos codificados de manera no natural Una amplia variedad de aminoácidos codificados de manera no natural son adecuados para utilizarse en la presente invención. Cualquier número de aminoácidos codificados de manera no natural puede introducirse en un polipéptido. En general, los aminoácidos codificados de manera no natural introducidos son de manera substancialmente químicamente inertes hacia los 20 aminoácidos codificados de manera genética comunes (i.e., alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, glutamina, ácido glutámico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptofan, tirosina, y valina) . En algunas modalidades, los aminoácidos codificados de manera no natural incluyen grupos funcionales de cadena lateral que reaccionan eficiente y selectivamente con grupos funcionales no encontrados en los 20 aminoácidos comunes (incluyendo pero no limitándose a, azido, cetona, aldehido y grupos aminooxi) para formar conjugados estables. Por ejemplo, un polipéptido que incluye un aminoácido codificado de manera no natural que contiene un grupo funcional azido puede reaccionarse con un polímero (incluyendo pero no limitándose a, poli (glicol de etileno) o, alternativamente, un segundo polipéptido que contiene un residuo alquino para formar un conjugado estable que resulta de la reacción selectiva de la azide y los grupos funcionales alquino para formar un producto de cicloadición Huisgen [3+2] . La estructura genérica de un alfa-aminoácido se ilustra como sigue (Fórmula I) : Un aminoácido codificado de manera no natural es típicamente cualquier estructura que tienen la fórmula arriba listada en donde el grupo R es cualquier substituyente diferente a uno utilizado en los veinte aminoácidos naturales, y puede ser adecuado para utilizarse en la presente invención. Debido a que los aminoácidos codificados de manera no natural de la invención típicamente difieren de los aminoácidos naturales solamente en la estructura de la cadena lateral, los aminoácidos codificados de manera no natural forman uniones amidas con otros aminoácidos, incluyendo pero no limitándose a, codificado o codificado de manera no natural, en la misma manera en la cual se forman en polipéptidos que ocurren de manera natural. Sin embargo, los aminoácidos codificados de manera no natural tienen grupos de cadena lateral que los distinguen de los aminoácidos naturales. Por ejemplo, R opcionalmente comprende un alquilo-, arilo-, acilo-, ceto-, azido-, hidroxilo-, hidrazina, ciano-, halo-, hidrazida, alquenilo, alquinilo, éter, tiol, seleno-, sulfonilo-, borato, boronato, fosfo, fosfono, fosfina, heterocíclico, enona, imina, aldehido, éster, tioácido, hidroxilamina, grupo amino, o lo similar o cualquier combinación de los mismos. Otros aminoácidos que no ocurren de manera natural de interés que pueden ser adecuados para utilizarse en la presente invención incluyen, pero no se limitan a, aminoácidos que comprenden un degradador fotoactivable, aminoácidos etiquetados por giro, aminoácidos fluorescentes, aminoácidos de unión de metal, aminoácidos que contienen metal , aminoácidos radioactivos, aminoácidos con nuevos grupos funcionales, aminoácidos que interactúan covalentemente o no covalentemente con otras moléculas, aminoácidos fotoguardados y/o fotoisomerizables, aminoácidos que comprenden biotina o un análogo de biotina, aminoácidos glicosilados tal como una serina substituida por azúcar, otros aminoácidos modificados por carbohidrato, aminoácidos que contienen ceto, aminoácidos que comprenden glicol de polietileno o poliéter, aminoácidos substituidos por átomo pesado, aminoácidos químicamente desdoblables y/o fotodesdoblables, aminoácidos con una cadena lateral alargada en comparación con los aminoácidos naturales, incluyendo pero no limitándose a, poliéteres o hidrocarburos de cadena larga, incluyendo pero no limitándose a, más de aproximadamente 5 o más de aproximadamente 10 carbonos, aminoácidos que contienen azúcar enlazada a carbono, aminoácidos activos redox, aminoácidos que contienen tioácido amino, y aminoácidos que comprenden uno o más residuos tóxicos.

Aminoácidos codificados de manera no natural ejemplificativos que pueden ser adecuados para utilizarse en la presente invención y que son útiles para reacciones con polímeros solubles en agua incluyen, pero no se limitan a, aquellos con grupos reactivos carbonilo, aminooxi, hidrazina, hidrazida, semicarbazida, azida y alquina. En algunas modalidades, aminoácidos codificados de manera no natural comprenden un residuo de sacárido. Ejemplos de tales aminoácidos incluyen N-acetil -L-glucosaminil -L- serina , N-acetil-L-galactosaminil-L-serina, N-acetil -L-glucosaminil -L-treonina, N-acetil -L-glucosaminil -L-asparagina y O-manosaminil-L-serina . Ejemplos de tales aminoácidos también incluyen ejemplos donde en ?- u O-enlace que ocurre de manera natural entre el aminoácido y el sacárido se reemplaza por un enlace covalente no comúnmente encontrado en la naturaleza -incluyendo pero no limitándose a, un alqueno, una oxima, un tioéter, una amida y lo similar. Ejemplos de tales aminoácidos también incluyen sacáridos que no se encuentran comúnmente en proteínas que ocurren de manera natural tales como 2-deoxi-glucosa, 2-deoxigalactosa y lo similar. Muchos de los aminoácidos codificados de manera no natural proporcionados en la presente están comercialmente disponibles, e.g., de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA), ?ovabiochem (una división de EMD Biosciences, Darmstadt, Alemania) , o Peptech (Burlington, MA, USA) . Aquellos que no están comercialmente disponibles se sintetizan opcionalmente como se proporciona en la presente o utilizando métodos estándar conocidos por aquellos expertos en la materia. Para técnicas de síntesis orgánica ver, e.g., Organic Chemistry por Fessendon and Fessendon, (1982, Second Edition, Willard Grant Press, Boston Mass.); Advanced Organic Chemistry por March (Third Edition, 1985, Wiley and Sons, New York) ; y Advanced Organic Chemistry por Carey and Sundberg (Third Edition, Parts A y B, 1990, Plenum Press, New York) . Ver, también, Publicaciones de Solicitud de Patente de E.U. 2003/0082575 y 2003/0108885, que se incorporan para referencia en la presente. Además de los aminoácidos codificados de manera no natural que contienen nuevas cadenas laterales, los aminoácidos codificados de manera no natural que pueden ser adecuados para utilizarse en la presente invención también opcionalmente comprenden estructuras modificadas, incluyendo pero no limitándose a, como se ilustra por las estructuras de las Fórmulas II y III: III R R' H2N X. CcfeH en donde Z típicamente comprende OH, NH2, SH, NH-R' , o S-R' ; X y Y, que puede ser el mismo o diferente, típicamente comprenden S u O, y R y R' , que son opcionalmente los mismos o diferentes, se seleccionan típicamente de la misma lista de constituyentes para el grupo R descrito arriba para los aminoácidos codificados de manera no natural que tienen la Fórmula I así como también hidrógeno. Por ejemplo, aminoácidos codificados de manera no natural de la invención opcionalmente comprenden substituciones en el grupo amino o carboxilo como se ilustra por las Fórmulas II y III. Aminoácidos codificados de manera no natural de este tipo incluyen, pero no se limitan a, ácidos a-hidroxi, a-tioácidos, a-aminotiocarboxilatos, incluyendo pero no limitándose a, con cadenas laterales correspondientes a los veinte aminoácidos naturales comunes o cadenas laterales no naturales. Además, las substituciones en el a-carbono opcionalmente incluyen, pero no se limitan a, L, D, o a-a-aminoácidos distribuidos tales como D-glutamato, D-alanina, D-metil-O-tirosina, ácido aminobutírico, y lo similar. Otras alternativas estructurales incluyen aminoácidos cíclicos, tales como análogos de prolina así como también análogos de prolina con un anillo de 3, 4 ,6, 7, 8, y 9 miembros, ß y ? aminoácidos tales como ß-alanina substituida y ?-amino ácido butírico. Muchos aminoácidos codificados de manera no natural se basan en aminoácidos naturales, tales como tirosina, glutamina, fenilalanina, y lo similar, y son adecuados para utilizarse en la presente invención. Los análogos de tirosina análogos incluyen, pero no se limitan a, tirosinas para-substituidas, tirosinas orto-substituidas, y tirosinas meta substituidas, donde la tirosina substituida comprende, incluyendo pero no limitándose a, un grupo ceto (incluyendo pero no limitándose a, un grupo acetilo) , un grupo benzoilo, un grupo amino, una hidrazina, una hidroxiamina, un grupo tiol, un grupo carboxi, un grupo isopropilo, un grupo metilo, un hidrocarburo ramificado o de cadena recta C6-C20, un hidrocarburo saturado o no saturado, un grupo 0-metilo, un grupo poliéter, un grupo nitro, un grupo alquinilo o lo similar. Además, múltiples anillos de arilo substituidos también se contemplan. Los análogos de glutamina que pueden ser adecuados para utilizarse en la presente invención incluyen, pero no se limitan a, derivados a-hidroxi, derivados ?-substituido, derivados cíclicos, y derivados de glutamina amida substituida. Ejemplos de análogos de fenilalanina que pueden ser adecuados para utilizarse en la presente invención incluyen, pero no se limitan a, fenilalaninas para-substituidas, fenilalaninas orto-substituidas, y fenilalaninas meta-substituidas, donde el substituyente comprende, incluyendo pero no limitándose a, a grupo hidroxi, un grupo metoxi, un grupo metilo, un grupo alilo, un aldehido, una azida, un yodo, un bromo, un grupo ceto (incluyendo pero no limitándose a, un grupo acetilo) , un benzoilo, un grupo alquinilo, o lo similar. Los ejemplos específicos de aminoácidos codificados de manera no natural que pueden ser adecuados para utilizarse en la presente invención incluyen, pero no se limitan a, a p-acetil-L-fenilalanina, una O-metil-L-tirosina, una L-3- (2-naftil) alanina, una 3- metil-fenilalanina, una 0-4-alil-L-tirosina, una 4-propil-L-tirosina, una tri-O-acetil-GlcNAcß-serina, una L-Dopa, una fenilalanina fluorinada, una isopropil-L-fenilalanina, una p-azida-L-fenilalanina, una p-acil-L-fenilalanina, una p-benzoil-L-fenilalanina, una L-fosfoserina, una fosfonoserina, una fosfonotirosina, una p-yodo-fenilalanina, una p-bromofenilalanina, una p-amino-L-fenilalanina, una isopropil-L-fenilalanina, y una p-propargiloxi -fenilalanina, y lo similar. Ejemplos de estructuras de una variedad de aminoácidos codificados de manera no natural que pueden ser adecuados para utilizarse en la presente invención se proporcionan en, por ejemplo, WO 2002/085923 titulada "In vivo incorporation of non-naturally encoged amino acids". Ver también Kiick et al., (2002) Incorporation of azidas into recombinant proteins for chemo selec tive modification by the Staudinger ligation, PNAS 99: 19-24, para análogos de metionina. En una modalidad, se proporcionan composiciones de un polipéptido que incluye un aminoácido codificado de manera no natural (tal p- (propargiloxi) -fenialanina) . También se proporcionan varias composiciones que comprenden p- (propargiloxi) -fenialanina e, incluyendo pero no limitándose a, proteínas y/o células. En un aspecto, una composición que incluye el aminoácido codificado de manera no natural de p-(propargiloxi) -fenialanina, incluye además un tARN ortogonal. El aminoácido codificado de manera no natural puede unirse (incluyendo pero no limitándose a, covalentemente) al tARN ortogonal, incluyendo pero no limitándose a, unido covalentemente al tARN ortogonal a través de una unión aminoacil, covalentemente unido a 3 'OH o 2 ' OH de un azúcar de ribosa terminal del tARN ortogonal, etc. Los residuos químicos a través de aminoácidos codificados de manera no natural que pueden incorporarse en las proteínas ofrecen una variedad de ventajas y manipulaciones de la proteína. Por ejemplo, la reactividad única de un grupo funcional ceto permite la modificación selectiva de proteínas con cualquiera de un número de reactivos que contienen hidrazina o hidroxilamina in vi tro e in vivo . El aminoácido codificado de manera no natural de átomo pesado, por ejemplo, puede ser útil para colocar en fase los datos de estructura de rayos X. La introducción específica en sitio de átomos pesados utilizando aminoácidos codificados de manera no natural también proporciona selectividad y flexibilidad para elegir posiciones para átomos pesados. Los aminoácidos codificados de manera no natural fotoreactivos (incluyendo pero no limitándose a, aminoácidos con benzofenona y arilazidas (incluyendo pero no limitándose a, fenilazida) cadenas laterales) , por ejemplo, permiten la fotodegradación in vivo e in vi tro de la proteína. Ejemplos de aminoácidos codificados de manera no natural fotoreactivos incluyen, pero no se limitan a, p-azido-fenilalanina y p-benzoil-fenilalanina. La proteína con los aminoácidos codificados de manera no natural fotoreactivos pueden entonces degradarse como será por la excitación del control temporal que proporciona un grupo fotoreactivo . En un ejemplo, el grupo metilo de un amino no natural puede substituirse con uno isotópicamente etiquetado, incluyendo pero no limitándose a, grupo metilo, como una sonda de estructura local y dinámicas, incluyendo pero no limitándose a, con el uso de resonancia magnética nuclear y espectroscopia vibracional . Los grupos funcionales alquinilo o azido, por ejemplo, permiten la modificación selectiva de proteínas con moléculas a través de la reacción de cicloadición [3+2] .

Un aminoácido no natural incorporado en un polipéptido en el término amino puede comprenderse de un grupo R que es cualquier substituyente diferente a uno utilizado en los veinte aminoácidos naturales y un 2do grupo reactivo diferente del grupo NH2 normalmente presente en a-aminoácidos (ver Fórmula I) . Un aminoácido no natural similar puede incorporarse en el término carboxilo con un 2do grupo reactivo diferente del grupo COOH normalmente presente en a-aminoácidos (ver Fórmula I) . SÍNTESIS QUÍMICA DE AMINOÁCIDOS CODIFICADOS DE MANERA NO NATURAL Muchos de los aminoácidos codificados de manera no natural adecuados para utilizarse en la presente invención que no están comercialmente disponibles se sintetizan opcionalmente como se proporciona en la presente o como se proporcionan en varias publicaciones o utilizando métodos estándar conocidos por aquellos expertos en la materia. Para técnicas de síntesis orgánica, ver, e.g., Organic Chemistry por Fessendon and Fessendon, (1982, Second Edition, Willard Grant Press, Boston Mass.); Advanced Organic Chemistry por March (Third Edition, 1985, Wiley and Sons, New York); y Advanced Organic Chemistry por Carey and Sundberg (Third Edition, Parts A y B, 1990, Plenum Press, New York). Las publicaciones que describen la síntesis de aminoácidos codificados de manera no natural incluyen, e.g., WO 2002/085923 titulada "In vivo incorporation of Non-naturally encoded amino acids;" Matsoukas et al., (1995) J. Med. Chem. , 38, 4660-4669; King, F.E. & Kidd, D.A.A. (1949) A New Synthesis of Glutamine and of ?-Dipeptides of Glutamic Acid from Phthylated Intermedia es, J. Chem. Soc, 3315-3319; Friedman, O.M. & Chatterrji, R. (1959) Synthesi s of Derivatives of Glutamine as Model Substrates for Anti -Tumor Agents . J. Am. Chem. Soc. 81, 3750-3752; Craig, J.C. et al. (1988) Absolute Configuration of the Enantiomers of -Chloro-4 [ [4 - (diethylamino) -1 -methylbutyl] amino] quinoline ( Chloroquine) . J . Org . Chem . 53, 1167-1170; Azoulay, M. , Vilmont, M. & Frappier, F. (1991) Glutamine analogues as Potential Ant imalar i ais , Eur. J. Med. Chem. 26, 201-5; Koskinen, A.M.P. & Rapoport, H. (1989) Synthesis of 4 -Substituted Prolines as Conformationally Constrained Amino Acid Analogues . J. Org. Chem. 54, 1859-1866; Christie, B.D. & Rapoport, H. (1985) Synthesis of Optically Pure Pipecolates from L-Asparagina . Application to the Total Synthesis of (+) -Apovincamine through Amino Acid Decarbonylatiin and Iminium Ion Cyclization . J . Org . Chem . 1989:1859-1866; Barton et al., (1987) Synthesis of Novel a- Amino -Acids and Derivatives Using Radical Chemi stry: Synthesi s of L- and D- -Amino-Adipic Acids , L-a-aminopimelic Acid and Appropriate Unsaturated Derivatives . Tetrahedron Lett. 43:4297-4308: y, Subasinghe et al., (1992) Qui squalic acid analogues : synthesis of beta - heterocyclic 2-aminopropanoic acid derivatives and their activi ty at a novel quisqualate-sensi tized si te. J. Med. Chem. 35:4602-7. Ver también, solicitudes de patente tituladas "Protein Arrays , " presentada el 22 de Diciembre de 2003, número de serie 10/744,899 y número de serie 60/435,821 presentadas el 22 de Diciembre de 2002. o Grupos reactivos carbonilo Aminoácidos con un grupo reactivo carbonilo permite una variedad de reacciones para unirse a moléculas (incluyendo pero no limitándose a, PEG u otras moléculas solubles en agua) a través de la adición nucleofílica o reacciones de condensación de aldol entre otras. Los aminoácidos que contienen carbonilo ejemplificativos pueden representarse como sigue: en donde n es 0-10; Rx es un alquilo, arilo, alquilo substituido, o arilo substituido; R2 es H, alquilo, arilo, alquilo substituido, y arilo substituido; y R3 es H, un aminoácido, un polipéptido, o un grupo de modificación de termino amino, y R es H, un aminoácido, un polipéptido, o un grupo de modificación de término carboxi. En algunas modalidades, n es 1, Ri es fenilo y R2 es un alquilo simple (i.e., metilo, etilo, o propilo) y el residuo cetona se coloca la posición para relativa a la cadena lateral de alquilo. En algunas modalidades, n es 1, Rx es fenilo y R2 es un alquilo simple (i.e., metilo, etilo, o propilo) y el residuo cetona se coloca en la posición meta relativa a la cadena lateral de alquilo. La síntesis de p-acetil- (+/-) -fenilalanina y m-acetil- (+/-) -fenilalanina se describe en Zhang, Z., et al., Biochemistry 42: 6735-6746 (2003), que se incorpora para referencia en la presente. Otros aminoácidos que contienen carbonilo pueden prepararse de manera similar por un experto en la materia. En algunas modalidades, un polipéptido que comprende un aminoácido codificado de manera no natural se modifica químicamente para generar un grupo funcional carbonilo reactivo. Por ejemplo, una funcionalidad de aldehido útil para reacciones de conjugación pueden generarse de una funcionalidad que tiene grupos hidroxilo y amino adyacentes. Donde la molécula biológicamente activa es un polipéptido, por ejemplo, una serina N-terminal o treonina (que puede estar normalmente presente o puede estar expuesta a través de digestión enzimática o química) puede utilizarse para generar una funcionalidad de aldehido bajo condiciones de segmentación oxidantes suaves utilizando periodato. Ver, e.g., Gaertner, et al, Bioconjug. Chem. 3: 262-268 (1992); Geoghegan, K. & Stroh, J. , Bioconjug. Chem . 3:138-146 (1992); Gaertner et al, J. Biol. Chem. 269:7224-7230 (1994). Sin embargo, los métodos conocidos en la materia se restringen al aminoácidos del termino N del péptido o proteína. En la presente invención, un aminoácido codificado de manera no natural que lleva grupos amino e hidroxilo adyacentes puede incorporarse en el polipéptido como una funcionalidad de aldehido "oculta" . Por ejemplo, 5-hidroxilisina lleva un grupo hidroxilo adyacente a la amina epsilón. Las condiciones de reacción para generar el aldehido típicamente incluyen adición de exceso molar de metaperiodato de sodio bajo condiciones suaves para evitar la oxidación en otros sitios dentro del polipéptido. El pH de la reacción de oxidación es típicamente aproximadamente 7.0. Una reacción típica incluye la adición de aproximadamente 1.5 exceso molar de metaperiodato de sodio a una solución regulada del polipéptido, seguido por incubación por aproximadamente 10 minutos en la oscuridad. Ver, e.g. Patente de E.U. No. 6,423,685, que se incorpora para referencia en la presente. La funcionalidad carbonilo puede reaccionarse de manera selectiva con un reactivo que contiene hidracina, hidrazida, hidroxilamina o semicarbazida bajo condiciones suaves en solución acuosa para formar los enlaces correspondientes de hidrazona, oxima, o semicarbazona, respectivamente, que son estables bajo condiciones fisiológicas. Ver, e.g., Jencks, W. P., J Am. Chem. Soc . 81, 475-481 (1959); Shao, J. and Tam, J. P., J". Am. Chem . Soc . 117:3893-3899 (1995). Además, la única reactividad del grupo carbonilo permite la modificación selectiva en la presencia de las otras cadenas laterales de aminoácido. Ver, e.g., Cornish, V. W., et al, J. Am . Chem . Soc . 118:8150-8151 (1996); Geoghegan, K. F. & Stroh, J. G. , Bioconjug. Chem . 3:138-146 (1992); Mahal , L. K. , et al, Science 276:1125-1128 (1997) . B. Grupos reactivos de Hidrazina, hidrazida o semicarbazida Los aminoácidos codificados de manera no natural que contienen un grupo nucleofílico, tal como una hidrazina, hidrazida o semicarbazida, permiten la reacción con una variedad de grupos electrofílicos para formar conjugados (incluyendo pero no limitándose a, con PEG u otros polímeros solubles en agua) . Los aminoácidos que contienen hidrazina, hidrazida o semicarbazida pueden representarse como sigue: en donde n es 0-10; Rx es un alquilo, arilo, alquilo substituido, o arilo substituido o no está presente; X, es 0, N, o S o no está presente; R2 es H, un aminoácido, un polipéptido, o grupo de modificación de término amino, y R3 es H, un aminoácido, un polipéptido, o un grupo de modificación de término carboxi. En algunas modalidades, n es 4 , Ra no está presente, y X es N. En algunas modalidades, n es 2 , R no está presente, y X no está presente. En algunas modalidades, n es 1 , Ri es fenilo, X es 0, y el átomo de oxígeno se coloca para al grupo alifático en el anillo arilo. Los aminoácidos que contienen hidrazida, hidrazina, y semicarbazida están disponibles de fuentes comerciales. Por ejemplo, L-glutamato-?-hidrazida está disponible de Sigma Chemical (St. Louis, MO) . Otros aminoácidos que no están comercialmente disponibles pueden prepararse por un experto en la materia. Ver, e.g., Pat. de E.U. No. 6,281,211, que se incorpora para referencia en la presente. Polipéptidos que contienen aminoácidos codificados de manera no natural que llevan funcionalidades de hidrazida, hidrazina o semicarbazida pueden reaccionarse eficiente y selectivamente con una variedad de moléculas que contienen aldehidos u otros grupos funcionales con reactividad química similar. Ver, e.g., Shao, J. and Tam, J. , J. Am . Chem . Soc . 117:3893-3899 (1995). La reactividad única de grupos funcionales hidrazida, hidrazina y semicarbazida los hacen significativamente más reactivos con aldehidos, acetonas y otros grupos electrofílicos presentes en los 20 aminoácidos comunes (incluyendo pero no limitándose a, el grupo hidroxilo de serina o treonina o los grupos amino de lisina y término N) . C Aminoácidos gue contienen Aminooxi Aminoácidos codificados de manera no natural que contienen un grupo aminooxi (también llamado una hidroxilamina) permite la reacción con una variedad de grupos electrofílicos para formar conjugados (incluyendo pero no limitándose a, con PEG u otros polímeros solubles en agua) . Como hidrazinas, hidrazidas y semicarbazidas, la nucleofilicidad mejorada del grupo aminooxi le permite reaccionar eficiente y selectivamente con una variedad de moléculas que contienen aldehidos u otros grupos funcionales con reactividad química similar. Ver, e.g., Shao, J. and Tam, J., J. Am . Chem . Soc . 117:3893-3899 (1995); H. Hang and C. Bertozzi, Acc . Chem . Res . 34: 727-736 (2001) . Mientras que el resultado de reacción con un grupo hidrazina es la hidrazona correspondiente, sin embargo, una oxima resulta generalmente de la reacción de un grupo aminooxi con un grupo que contiene carbonilo tal como una acetona. Los grupos aminooxi que contienen aminoácidos ejemplificativos pueden representarse como sigue: en donde n es 0-10; R es un alquilo, arilo, alquilo substituido, o arilo substituido o no está presente; X es O, N, S o no está presente; m es 0-10; Y = C (O) o no está presente; R2 es H, un aminoácido, un polipéptido, o grupo de modificación de término amino, y R3 es H, un aminoácido, un polipéptido, o un grupo de modificación de término carboxi. En algunas modalidades, n es 1, Ri es fenilo, X es 0, m es 1, y Y está presente. En algunas modalidades, n es 2, Ri y X no están presentes, m es O, y Y no está presente. Aminoácidos que contienen aminooxi pueden prepararse de precursores de aminoácidos fácilmente disponibles (homoserina, serina y treonina) . Ver, e.g., M. Carrasco and R. Brown, J Org. Chem . 68: 8853-8858 (2003). Ciertos aminoácidos que contienen aminooxi, tal como L-2-amino-4- (aminooxi) ácido butírico), se han aislado de fuentes naturales (Rosenthal, G. et al., Life Sci. 60: 1635-1641 (1997) . Otros aminoácidos que contienen aminooxi pueden prepararse por un experto en la materia. D. Grupos reactivos alquino y azida La reactividad única de grupos funcionales alquino y azida los hace extremadamente útiles para la modificación selectiva de polipéptidos y otras moléculas biológicas. Las azidas orgánicas, particularmente azidas alifáticas, y alquilas son generalmente estables hacia condiciones químicas reactivas comunes. En particular, tanto los grupos funcionales azida como alquino son inertes hacia las cadenas laterales (i.e., grupos R) de los 20 aminoácidos comunes encontrados en polipéptidos que ocurren de manera natural. Cuando se aproximan, sin embargo, la naturaleza "cargada por resorte" de los grupos azida y alquino se revela y reaccionan selectiva y eficientemente a través de la reacción de cicloadición Huisgen [3+2] para generar la triazola correspondiente. Ver, e.g., Chin J., et al, Science 301:964-7 (2003); Wang, Q., et al, J. Am . Chem . Soc . 125, 3192-3193 (2003); Chin, J. W., et al., J. Am . Chem . Soc . 124:9026-9027 (2002) . Debido a que la reacción de cicloadición Huisgen incluye una reacción de cicloadición selectiva {ver, e.g., Padwa, A., en COMPREHENSIVE ORGANIC SYNTHESIS, Vol. 4, (ed. Trost, B. M., 1991), p. 1069-1109; Huisgen, R. en 1,3-DIPOLAR CYCLOADDITION CHEMISTRY, (ed. Padwa, A., 1984), p. 1-176) en lugar de una substitución nucleofílica, la incorporación de aminoácidos codificados de manera no natural que llevan cadenas laterales que contienen alquino y azida permite que los polipéptidos resultantes se modifiquen de manera selectiva en la posición del aminoácido codificado de manera no natural . La reacción de cicloadición que incluye polipéptido hGH que contiene alquino o azida puede llevarse a cabo a temperatura ambiente bajo condiciones acuosas por la adición de Cu (II) (incluyendo pero no limitándose a, en la forma de una cantidad catalítica de CuS04) en la presencia de un agente reductor para reducir Cu(II) a Cu(I), in situ, en cantidad catalítica. Ver, e.g., Wang, Q., et al, J. Am . Chem . Soc . 125, 3192-3193 (2003); Tornoe, C. W., et al, J. Org. Chem . 67:3057-3064 (2002); Rostovtsev, et al, Angew. Chem . Int . Ed . 41:2596-2599 (2002). Los agentes reductores ejemplificativos incluyen, incluyendo pero no limitándose a, ascorbato, cobre metálico, quinina, hidroquinona, vitamina K, glutationa, cisteína, Fe2+, Co2+, y un potencial eléctrico aplicado. En algunos casos, donde una reacción de cicloadición Huisgen [3+2] entre una azida y un alquino se desea, el polipéptido comprende un aminoácido codificado de manera no natural que comprende un residuo alquino y el polímero soluble en agua a unirse al aminoácido comprende un residuo azida. Alternativamente, la reacción conversa (i.e., con el residuo azida en el aminoácido y el residuo alquino presente en el polímero soluble en agua) también pueden realizarse . El grupo funcional azida también puede reaccionarse con un polímero soluble en agua que contiene un éster arilo y funcionalizarse apropiadamente con un residuo fósfina arilo para generar un enlace amida. El grupo fosfina arilo reduce la azida in si tu y la amina resultante reacciona entonces de manera eficiente con un enlace éster próximo para generar la amida correspondiente. Ver, e.g., E. Saxon y C. Bertozzi, Science 287 , 2007-2010 (2000) . El aminoácido que contiene azida puede ser ya sea una azida de alquilo (incluyendo pero no limitándose a, ácido 2-amino-6-azida-l-hexanóico) o una azida de arilo (p-azido-fenilalanina) . Los polímeros solubles en agua ejemplificativos que contienen un éster de arilo y un residuo fosfina puede representarse como sigue: en donde X puede ser O, N, S o no está presente, Ph es fenilo, W es un polímero soluble en agua y R puede ser grupos H, alquilo, arilo, alquilo substituido y arilo substituido. Los grupos R ejemplificativos incluyen pero no se limitan a -CH2, -C(CH3)3, -OR' , -NR'R", -SR' , -halógeno, -C(0)R', CONR'R", -S(0)2R', -S(0)2NR'R", -CN y -N02. R' , R" , R" ' y R" " cada uno se refiere independientemente a hidrógeno, heteroalquilo substituido o no substituido, arilo substituido o no substituido, incluyendo pero no limitándose a, arilo substituido con 1-3 halógenos, alquilo substituido o no substituido, alcoxi o grupos tioalcoxi, o gruposarilalquilo . Cuando un compuesto de la invención incluye más de un grupo R, por ejemplo, cada uno de los grupos R se selecciona independientemente como lo son cada grupo R' , R" , R" ' y R"" cuando más de uno de estos grupos está presente. Cuando R' y R" se unen al mismo átomo de nitrógeno, pueden combinarse con el átomo de nitrógeno para formar un anillo de 5 , 6, o 7 miembros. Por ejemplo, -NR'R" se entiende que incluye, pero no se limita a, 1-pirrolidinil y 4-morfolinil . A partir de la discusión anterior de substituyentes, un experto en la materia entenderá que el término "alquilo" incluye grupos incluyendo átomos de carbono unidos a grupos diferentes a grupos hidrógeno, tales como haloalquilo (incluyendo pero no limitándose a, -CF3 y -CH2CF3) y acilo (incluyendo pero no limitándose a, -C(0)CH3, -C(0)CF3, -C (O) CH20CH3, y lo similar) . El grupo funcional azida también puede reaccionarse selectivamente con un polímero soluble en agua que contiene un tioéster y funcionalizarse apropiadamente con un residuo fosfina arilo para generar un enlace amida. El grupo fosfina arilo reduce la azida in situ y la amina resultante reacciona entonces eficientemente con el enlace de tioéster para generar la amida correspondiente. Los polímeros solubles en agua ejemplificativos que contienen un tioéster o un residuo fosfina pueden representarse como sigue: en donde n es 1-10; X puede ser O, N, S o no está presente, Ph es fenilo, y W es un polímero soluble en agua.

Los aminoácidos que contienen alquino ej emplif icativos pueden representarse como sigue : en donde n es 0-10; Rx es un alquilo, arilo, alquilo substituido, o arilo substituido o no está presente; X es O, N, S o no está presente; m es 0-10, R2 es H, un aminoácido, un polipéptido, o grupo de modificación de término amino, y R3 es H, un aminoácido, un polipéptido, o un grupo de modificación de término carboxi. En algunas modalidades, n es 1, Ri es fenilo, X no está presente, m es 0 y el residuo acetileno se coloca en la posición para relativo a la cadena lateral de alquilo. En algunas modalidades, n es 1, Rx es fenilo, X es O, m es 1 y el grupo propargiloxi se coloca en la posición para relativo a la cadena lateral de alquilo (i.e., O-propargil-tirosina) . En algunas modalidades, n es 1, Ri y X no están presentes y m es 0 (i.e., proparilglicina) . Los aminoácidos que contienen alquino están comercialmente disponibles. Por ejemplo, propargilglicina está comercialmente disponible de Peptech (Burlington, MA) . Alternativamente, aminoácidos que contienen alquino pueden prepararse de acuerdo con métodos estándar. Por ejemplo, p-propargiloxifenilalanina puede sintetizarse, por ejemplo, como se describe en Deiters, A., et al, J. Am . Chem . Soc . 125: 11782-11783 (2003), y 4 -alquinilo-L-fenilalanina puede sintetizarse como se describe en Kayser, B., et al., Tetrahedron 53 (7) : 2475-2484 (1997). Otros aminoácidos que contienen alquino pueden prepararse por un experto en la materia. Los aminoácidos que contienen azida ejemplificativos pueden representarse como sigue: en donde n es 0-10; Rx es un alquilo, arilo, alquilo substituido, arilo substituido o no está presente; X es O, N, S o no está presente; m es 0-10; R2 es H, un aminoácido, un polipéptido, o grupo de modificación de término amino, y R3 es H, un aminoácido, un polipéptido, o un grupo de modificación de término carboxi. En algunas modalidades, n es 1, Ri es fenilo, X no está presente, m es 0 y el residuo azida se coloca para a la cadena lateral de alquilo. En algunas modalidades, n es 0-4 y Rx y X no están presentes, y m=0. En algunas modalidades, n es 1, Rx es fenilo, X es O, m es 2 y el residuo ß-azidoetoxi se coloca en la posición para relativo a la cadena lateral de alquilo. Aminoácidos que contienen azida están disponibles de fuentes comerciales. Por ejemplo, 4-azidofenilalanina puede obtenerse de Chem-Impex International, Inc. (Wood Dale, IL) . Para aquellos aminoácidos que contienen azida que no están comercialmente disponibles, el grupo azida puede prepararse relativamente de manera fácil utilizando métodos estándar conocidos por aquellos expertos en la materia, incluyendo pero no limitándose a, a través de desplazamiento de un grupo saliente adecuado (incluyendo pero no limitándose a, haluro, mesilato, tosilato) o a través de la abertura de una lactona adecuadamente protegida. Ver, e.g., Advanced Organic Chemistry por March (Third Edition, 1985, Wiley and Sons, New York) . ?. Grupos reactivos aminotiol La reactividad única de los grupos funcionales aminotiol beta-substituido los hace extremadamente útiles para la modificación selectiva de polipéptidos y otras moléculas biológicas que contienen grupos aldehido a través de la formación de la tiazolidina. Ver, e.g., J. Shao and J. Tam, J. Am. Chem . Soc . 1995, 117 (14) 3893-3899. En algunas modalidades, aminoácidos aminotiol beta-substituido pueden incorporarse en polipéptidos y después reaccionarse con polímeros solubles en agua que comprenden una funcionalidad aldehido. En algunas modalidades, un polímero soluble en agua, conjugado de fármaco o otra carga puede acoplarse a un polipéptido que comprende un aminoácido de aminotiol beta-substituido a través de la formación de la tiazolidina. TOMA CELULAR DE AMINOÁCIDOS CODIFICADOS DE MANERA NO NATURAL La toma de aminoácido codificado de manera no natural por una célula es un asunto que típicamente se considera cuando se designan y seleccionan aminoácidos codificados de manera no natural, incluyendo pero no limitándose a, para incorporación en una proteína. Por ejemplo, la alta densidad de carga de a-aminoácidos sugiere que estos compuestos son improbablemente permeables a la célula. Los aminoácidos naturales se toman en la célula a través de una recolección de sistemas de transporte a base de proteína. Una selección rápida puede hacerse, los valores de los aminoácidos codificados de manera no natural, si los hay, se toman por las células. Ver, e.g., los ensayos de toxicidad en, e.g., las solicitudes tituladas "Protein Arrays," presentadas el 22 de Diciembre de 2003, número de serie 10/744,899 y número de serie 60/435,821 presentadas el 22 de Diciembre de 22, 2002; y Liu, D.R. & Schultz, P. G. (1999) Progress toward the evolution of an organism wi th an expanded genetic code . PNAS United States 96:4780-4785. Aunque la toma se analiza fácilmente con varios ensayos, una alternativa para designar aminoácidos codificados de manera no natural que son susceptibles a trayectorias de toma celular es proporcionar trayectorias biosintéticas para crear aminoácidos in vivo . BIOSÍNTESIS DE AMINOÁCIDOS CODIFICADOS DE MANERA NO NATURAL Muchas trayectorias biosintéticas ya existen en las células para la producción de aminoácidos y otros compuestos. Aunque el método biosintético para un aminoácido codificado de manera no natural particular puede no existir en la naturaleza, incluyendo pero no limitándose a, en una célula eucariótica, la invención proporciona tales métodos. Por ejemplo, trayectorias biosintéticas para aminoácidos codificados de manera no natural son opcionalmente generadas en célula huésped al agregar nuevas enzimas o modificar las trayectorias de célula huésped existentes. Las nuevas enzimas adicionales son enzimas que opcionalmente ocurren de manera natural o enzimas artificialmente incluidas. Por ejemplo, la biosíntesis de p-aminofenilalanina (como se presenta en el ejemplo en WO 2002/085923 titulada "In vivo incorporation of non-naturally encoded amino acids") yace en la adición de una combinación de enzimas conocidas de otros organismos. Los genes para estas enzimas pueden introducirse en una célula eucariótica al transformar la célula con un plásmido que comprende los genes. Los genes, cuando se expresan en la célula, proporcionan una trayectoria enzimática para sintetizar el compuesto deseado. Ejemplos de los tipos de enzimas que se agregan opcionalmente se proporcionan en los ejemplos abajo. Las secuencias de enzimas adicionales se encuentran, por ejemplo, en Genbank. Las enzimas artificialmente incluidas también se agregan opcionalmente en una célula en la misma manera. De esta manera, la maquinaria celular y recursos de una célula se manipulan para producir aminoácidos codificados de manera no natural. Una variedad de métodos están disponibles para producir nuevas enzimas para utilizarse en trayectorias biosintéticas o para evolución de trayectorias existentes. Por ejemplo, la recombinación recursiva, incluyendo pero no limitándose a, como se desarrolla por Maxygen, Inc. (disponible en la red en maxygen.com), se utiliza opcionalmente para desarrollar nuevas enzimas y trayectorias. Ver, e.g., Stemmer (1994), Rapid evolution of a protein in vi tro by DNA shuffling, Nature 370(4): 389-391; y, Stemmer, (1994), DNA shuffling by random fragmentation and reassembly: In vi tro recombination for molecular evolution, Proc. Nati.

Acad. Sci. USA., 91:10747-10751. De manera similar DesignPath™, desarrollado por Genencor (disponible en la red en genencor.com) se utiliza opcionalmente para formar la trayectoria metabólica, incluyendo pero no limitándose a, formar una trayectoria para crear 0-metil-L-tirosina en una célula. Esta tecnología reconstruye trayectorias existentes en organismos huésped utilizando una combinación de nuevos genes, incluyendo pero no limitándose a, identificados a través de genómicos funcionales, y diseño y evolución molecular. Diversa Corporation (disponible en la red en diversa.com) también proporciona tecnología para seleccionar rápidamente bibliotecas de genes y trayectorias de genes, incluyendo pero no limitándose a, para crear nuevas trayectorias . Típicamente, el aminoácido codificado de manera no natural producido con una trayectoria biosintética formada de la invención se produce en una concentración suficiente para biosíntesis de proteína eficiente, incluyendo pero no limitándose a, una cantidad celular natural, pero no a tal un grado para afectar la concentración de los otros aminoácidos o agotas los recursos celulares. Las concentraciones típicas producidas in vivo en esta manera son aproximadamente 10 mM a aproximadamente 0.05 mM. Una vez que una célula se transforma con un plásmido que comprende los genes utilizados para producir enzimas deseadas para una trayectoria específica y un aminoácido codificado de manera no natural se genera, las selecciones in vivo se utilizan opcionalmente para optimizar además la producción del aminoácido codificado de manera no natural tanto para síntesis de proteína ribosomal como crecimiento celular. POLIPÉOTIDOS CON AMINOÁCIDOS CODIFICADOS DE MANERA NO NATURAL La incorporación de un aminoácido codificado de manera no natural puede hacerse para una variedad de propósitos, incluyendo pero no limitándose a, cambios de adaptación en estructura de proteína y/o función, tamaño de cambio, acidez, nucleofilicidad, unión de hidrógeno, hidrofobicidad, accesibilidad de sitios objetivo proteasa, objetivo a un residuo (incluyendo pero no limitándose a, para un conjunto de proteínas), etc. Las proteínas que incluyen un aminoácido codificado de manera no natural pueden tener propiedades biofísicas o catalíticas completamente nuevas o mejoradas. Por ejemplo, las siguientes propiedades se modifican opcionalmente por inclusión de un aminoácido codificado de manera no natural en una proteína: toxicidad, biodistribución, propiedades estructurales, propiedades espectroscópicas, propiedades fotoquímicas y/o químicas, habilidad catalítica, vida media (incluyendo pero no limitándose a, vida media en suero) , capacidad para reaccionar con otras moléculas, incluyendo pero no limitándose a, covalentemente o no covalentemente, y lo similar. Las composiciones incluyendo proteínas que incluyen al menos un aminoácido codificado de manera no natural son útiles para, incluyendo pero no limitándose a, nuevos terapéuticos, diagnósticos, enzimas catalíticas, enzimas industriales, proteínas de unión (incluyendo pero no limitándose a, anticuerpos) , y incluyendo pero no limitándose a, el estudio de estructura de proteína y función. Ver, e.g., Dougherty, (2000) Non-naturally encoged amino acids as Probes of Protein Structure and Function, Current Opinión in Chemical Biology, 4:645-652. En un aspecto de la invención, una composición incluye al menos una proteína con al menos uno, incluyendo pero no limitándose a, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, al menos seis, al menos siete, al menos ocho, al menos nueve, o al menos diez o más aminoácidos codificados de manera no natural. Los aminoácidos codificados de manera no natural pueden ser el mismo o diferente, incluyendo pero no limitándose a, puede haber 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 o más sitios diferentes en la proteína que comprenden 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 o aminoácidos codificados de manera no natural más diferentes. En otro aspecto, una composición incluye una proteína con al menos uno, pero menos que todos, de un aminoácido particular presente en la proteína es substituido con el aminoácido codificado de manera no natural. Para una proteína dada con más de un aminoácido codificado de manera no natural, los aminoácidos codificados de manera no natural pueden ser idénticos o diferentes (incluyendo pero no limitándose a, la proteína pueden incluir dos o más diferentes tipos de aminoácidos codificados de manera no natural, o pueden incluir dos del mismo aminoácido codificado de manera no natural) . Para una proteína dada con más de dos aminoácidos codificados de manera no natural, los aminoácidos codificados de manera no natural pueden ser los mismos, diferentes o una combinación de un aminoácido codificado de manera no natural de la misma clase con al menos un aminoácido codificado de manera no natural diferente.

Las proteínas o polipéptidos de interés con al menos un aminoácido codificado de manera no natural son una característica de la invención. La invención también incluye polipéptidos o proteínas con al menos un aminoácido codificado de manera no natural producido utilizando las composiciones y métodos de la invención. Un excipiente (incluyendo pero no limitándose a, un excipiente farmacéuticamente aceptable) también puede estar presente con la proteína. En ciertas modalidades, una proteína incluye al menos un aminoácido codificado de manera no natural y al menos una modificación post-traduccional. Por ejemplo, la modificación post-traducción incluye, pero no se limita a, acetilación, acilación, modificación de lípido, palmitoilación, adición de plamitato, fosforilación, modificación de enlace de glicolípido, glicosilación, y lo similar. En un aspecto, la modificación post-traduccional incluye unión de un oligosacárido (incluyendo pero no limitándose a, (GlcNAc-Man) 2-Man-GlcNAc-GlcNAc) ) a una asparagina por un enlace GlcNAc-asparagina . Ver Tabla 1 que enlista algunos ejemplos de oligosacáridos N-enlazados de proteínas eucarióticas (residuos adicionales también pueden estar presentes, que no se muestran) . En otro aspecto, la modificación post-traduccional incluye unión de un oligosacárido (incluyendo pero no limitándose a, Gal -GalNAc, Gal-GlcNAc, etc.) a una serina o treonina por un enlace GalNAc-serina o GalNAc-treonina, o un enlace GlcNAc-serina o a GlcNAc-treonina . TABLA 1: EJEMPLOS DE OLIGOSACÁRIDOS A TRAVÉS DE ENLACE GlcNAc En todavía otro aspecto, la modificación post- traducción incluye procesamiento proteolítico de precursores (incluyendo pero no limitándose a, precursor de calcitonina, precursor de péptido relacionado con gel de calcitonina, hormona de preproparatiroide, preproinsulina, proinsulina, prepro-opiomelanocortina, pro-opiomelanocortina y lo similar) , ensamble en una proteína muítisubunidad o ensamble macromolecular, la traducción a otro sitio en la célula (incluyendo pero no limitándose a, organelos, tales como el retículo endoplásmico), el aparato Golgi, el núcleo, lisosomas, peroxisomas, mitocondria, cloroplastos, vacuolas, etc, o a través de la trayectoria secretoria) . En ciertas modalidades, la proteína comprende a secuencia de secreción o localización, una señal de epítope, una señal FLAG, una señal de polihistidina, una fusión GST, o lo similar. Patentes de E.U. Nos. 4,963,495 y 6,436,674, que se incorporan en la presente para referencia, detallan construcciones diseñadas para mejorar secreción de polipéptidos. Una ventaja de un aminoácido codificado de manera no natural es que presenta residuos químicos adicionales que pueden utilizarse para agregar moléculas adicionales. Estas modificaciones pueden hacerse in vivo en una célula eucariótica o no eucariótica, o in vi tro. De esta manera, en ciertas modalidades, la modificación post-traduscional es a través del aminoácido codificado de manera no natural. Por ejemplo, la modificación post-traduccional puede ser a través de una reacción nucleofílica-electrofílica. La mayoría de las reacciones actualmente utilizadas para la modificación selectiva de proteínas incluyen formación de unión covalente entre compañeros de reacción electrofílica o nucleofílica, incluyendo pero no limitándose a la reacción de a-halocetonas con cadenas laterales de cisteína o histidina. La selectividad en estos casos se determina por el número y accesibilidad de los residuos nucleofílicos en la proteína. En proteínas de la invención, otras reacciones más selectivas pueden utilizarse tal como la reacción de un aminoácido ceto no natural con hidrazidas o compuestos aminooxi, in vi tro e in vivo . Ver, e.g., Cornish, et al., (1996) Am. Chem. Soc. 118:8150-8151; Mahal , et al., (1997) Science, 276: 1125-1128; Wang, et al., (2001) Science 292:498-500; Chin, et al., (2002) Am. Chem. Soc. 124:9026-9027; Chin, et al., (2002) Proc. Nati. Acad. Sci. 99: 11020-11024; Wang, et al., (2003) Proc. Nati. Acad. Sci., 100:56-61; Zhang, et al., (2003) Biochemistry, 42:6735-6746; y, Chin, et al., (2003) Science, en prensa. Esto permite el etiquetado selectivo de virtualmente cualquier proteína con un huésped de reactivos incluyendo fluoroforos, agentes reticuladors, derivados de sacáridos y moléculas citotóxicas. Ver también, Solicitud de Patente de E.U. No. de serie 10/686,944 titulada "Glycoprotein synthesis" presentada el 16 de Enero de 2003, que se incorpora para referencia en la presente. Las modificaciones post-traduccionales, incluyendo pero no limitándose a, a través de un aminoácido azido, también pueden hacerse a través de la ligación Staudinger (incluyendo pero no limitándose a, con reactivos de triarilfosfina) . Ver, e.g., Kiick et al., (2002) Incorporation of azides in recombinant proteins for chemoselective modification by the Staudinger liga tion, PNAS 99: 19-24.

Esta invención proporciona otro método altamente eficiente para la modificación selectiva de proteínas, que incluye la incorporación genética de aminoácidos codificados de manera no natural, incluyendo pero no limitándose a, que contiene un residuo azida o alquinilo en proteínas en respuesta a un codón selector. Estas cadenas laterales de aminoácido pueden entonces modificarse por, incluyendo pero no limitándose a, una reacción de cicloadición Huisgen [3+2] (ver, e.g., Padwa, A. en Comprehensive Organic Synthesis, Vol . 4 , (1991) Ed. Trost, B. M. , Pergamon, Oxford, p. 1069-1109; y, Huisgen, R. en 1,3 -Dipolar Cycloaddition Chemistry, (1984) Ed. Padwa, A., Wiley, New York, p. 1-176) con, incluyendo pero no limitándose a, derivados de alquinilo o azida, respectivamente. Debido a que este método incluye una cicloadición en lugar de una substitución nucleofílica, las proteínas pueden modificarse con selectividad extremadamente alta. Esta reacción puede llevarse a cabo a temperatura ambiente en condiciones acuosas con excelente regioselectividad (1,4 > 1,5) por la adición de cantidades catalíticas de sales Cu (I) a la mezcla de reacción. Ver, e.g., Tornoe, et al., (2002) Org. Chem. 67:3057-3064; y, Rostovtsev, et al, (2002) Angew. Chem. Int. Ed. 41:2596-2599. Otro método que puede utilizarse es el intercambio de ligando en un compuesto biarsénico con un motivo tetracisteína, ver, e.g., Griffin, et al., (1998) Science 281:269-272.

Una molécula que puede agregarse a una proteína de la invención incluyen, pero no se limitan a, tintes, fluoroforos, agentes reticuladors, derivados de sacárido, polímeros (incluyendo pero no limitándose a, derivados de glicol de polietileno), fotoreticuladors, compuestos citotóxicos, etiquetas de afinidad, derivados de biotina, resinas, perlas, una segunda proteína o polipéptido (o más) , polinucleótido (s) (incluyendo pero no limitándose a, 7?DN, ARN, etc.), quemadores de metal, cofactores, ácidos grasos, carbohidratos, y lo similar. Estas moléculas pueden agregarse a un aminoácido codificado de manera no natural con un grupo alquinilo, incluyendo pero no limitándose a, p-propargiloxifenilalanina, o grupo azida, incluyendo pero no limitándose a, p-azido-fenilalanina, respectivamente. Los polipéptidos de la invención pueden generarse por células huésped Pseudomonas in vivo utilizando sintetasas de tARN y tARN modificado para agregar o substituir aminoácidos que no se codifican en sistemas que ocurren de manera natural . Métodos para generar tARNs y sintetasas aminoacil tARN que utilizan aminoácidos que no se codifican en sistemas que ocurren de manera natural se describen en, e.g., Publicaciones de Solicitud de Patente de E.U. 2003/0082575 (No. de serie 10/126,927) y 2003/0108885 (No de serie 10/126,931) que se incorporan para referencia en la presente.

Estos métodos incluyen generar una maquinara traduccional que funciona independientemente de las sintetasae y tARNs endógenos al sistema de traducción Pseudomonas (y por lo tanto se refieren algunas veces como "ortogonal"). Típicamente, el sistema de traducción de Pseudomonas comprende un tAR? ortogonal (O-tAR?) y una aminoacil tAR? sintetasa ortogonal (O-RS) . Típicamente, O-RS preferentemente aminoacila el O-tAR? con al menos un aminoácido que no ocurre de manera natural en el sistema de traducción de Pseudomonas y el O-tAR? reconoce al menos un codón selector que no se reconoce por otros tAR?s en el sistema. El sistema de traducción de Pseudomonas de esta manera inserta el aminoácido codificado de manera no natural en una proteína producida en el sistema, en respuesta a un codón selector codificado, "substituyendo" así un aminoácido en una posición en el polipéptido codificado. Una amplia variedad de tAR?s ortogonales y sintetasas aminoacil tAR? se han descrito en la materia para insertar aminoácidos sintéticos particulares en polipéptidos, y son generalmente adecuados para utilizarse en la presente invención. Por ejemplo, sintetasas O-tAR?/aminoacil tAR? ceto específicas se describen en Wang, L., et al, Proc . Nati . Acad . Sci . USA 100:56-61 (2003) y Zhang, Z. et al., Biochem . 42 (22) :6735-6746 (2003). O-RS ejemplificativos, o porciones de los mismos, se codifican por secuencias de polinucleótidos e incluyen secuencias de aminoácidos descritos en las Publicaciones de Solicitud de Patente de E.U. 2003/0082575 y 2003/0108885, cada una incorporada en la presente para referencia. Las moléculas de O-tARN correspondientes para utilizarse con los O-RSs también se describe en Publicaciones de Solicitud de Patente de E.U. 2003/0082575 (No. de serie 10/126,927) y 2003/0108885 (No. de serie 10/126,931) que se incorporan para referencia en la presente. Un ejemplo de un sistema de sintetasa O-tARN/aminoacil tARN específico de azida se describe en Chin, J. W., et al, J. Am . Chem . Soc . 124:9026-9027 (2002). Las secuencias de O-RS ejemplificativas para p-azido-L-Phe incluyen, pero no se limitan a, secuencias de nucleótidos SEQ ID NOs: 14-16 y 29-32 y secuencias de aminoácidos SEQ ID NOs: 46-48 y 61-64 como se describe en la Publicación de Solicitud de Patente de E.U. 2003/0108885 (No. de serie 10/126,931) que se incorpora para referencia en la presente. Secuencias de O-tARN ejemplificativas adecuadas para utilizarse en la presente invención incluyen, pero no se limitan a, secuencias de nucleótidos SEQ ID NOs : 1-3 como se describe en la Publicación de Solicitud de Patente de E.U. 2003/0108885 (No. de serie 10/126,931) que se incorpora para referencia en la presente. Otros ejemplos de pares de sintetasa 0-tARN/aminoacil tARN específicos para aminoácidos codificados de manera no natural particulares se describen en la Publicación de Solicitud de Patente de E.U. 2003/0082575 (No. de serie 10/126,927) que se incorpora para referencia en la presente. O-RS y el O-tARN que incorporan tanto aminoácidos que contienen ceto como azida en S. cerevisiae como se describe en Chin, J. W. , et al, Science 301:964-967 (2003). El uso de sintetasas O-tARN/aminoacil tARN incluye la selección de un codón específico que codifica el aminoácido codificado de manera no natural. Aunque cualquier codón puede utilizarse, es generalmente deseable seleccionar un codón que se utiliza raramente o nunca en la célula en la cual se expresa la sintetasa O-tARN/aminoacil tARN. Por ejemplo, los codones ejemplificativos incluyen codón sin sentido tales como codones de detención (ámbar, ocre, y opal) , codones de cuatro o más bases y otros codones de tres bases naturales que se utilizan raramente o no se utilizan. El (los) codón (es) específico (s) puede (n) introducirse en posiciones apropiadas en la secuencia de codificación de polinucleótidos utilizando métodos de mutagénesis conocidos en la materia (incluyendo pero no limitándose a, mutagénesis específica en sitio, mutagénesis de cassette, mutagénesis de selección de restricción, etc.). Los métodos para generar componentes de la maquinaria biosintética de proteína, tales como O-RSs, 0-tARNs, y pares O-tARN/O-RS ortogonales que pueden utilizarse de incorporar un aminoácido codificado de manera no natural se describen en Wang, L., et al, Science 292:498-500 (2001); Chin, J. W., et al, J. Am . Chem. Soc . 124:9026-9027 (2002); Zhang, Z. et al, Biochemistry 42:6735-6746 (2003). Métodos y composiciones para la incorporación in vivo de aminoácidos codificados de manera no natural se describen en la Publicación de Solicitud de Patente de E.U. 2003/0082575 (No. de serie 10/126,927) que se incorpora para referencia en la presente. Métodos para seleccionar un par de sintetasa tARN ortogonal -tARN para utilizarse en sistema de traducción de Pseudomonas in vivo de un organismo también se describe en las Publicaciones de Solicitud de Patente de E.U. 2003/0082575 (No. de serie 10/126,927) y 2003/0108885 (No. de serie 10/126,931) que se incorporan para referencia en la presente . Métodos para producir al menos una sintetasa (O-RS) de aminoacil ortogonal -tARN recombinante comprenden: (a) generar una biblioteca de RSs (opcionalmente mutantes) derivados de al menos una aminoacil tARN sintetasa (RS) de un primer organismo, incluyendo pero no limitándose a, un organismo procariótico, tales como Methanococcus jannaschii , Methanobacterium thermoautotrophicum, Halobacterium, Escherichia coli , A . fulgidus, P. furiosus, P. horikoshii , A . pernix, T. thermophilus , o lo similar, o un organismo eucariótico; (b) seleccionar (y/o distinguir) la biblioteca de RSs (RSs opcionalmente mutantes) para miembros que aminoacilan un tARN ortogonal (O-tARN) en la presencia de un aminoácido codificado de manera no natural y un aminoácido natural, proporcionando así un grupo de RSs activos (opcionalmente mutantes) ; y/o, (c) seleccionar (opcionalmente a través de selección negativa) el grupo para RSs activos (incluyendo pero no limitándose a, RSs mutantes) que preferentemente aminoacilan O-tARN en la ausencia del aminoácido codificado de manera no natural, proporcionando así el al menos un O-RS recombinante; en donde el al menos un O-RS recombinante preferentemente aminoacila el O-tARN con el aminoácido codificado de manera no natural . En una modalidad, RS es un RS inactivo. El RS inactivo puede generarse al mutar un RS activo. Por ejemplo, el RS inactivo puede generarse al mutar al menos aproximadamente 1, al menos aproximadamente 2, al menos aproximadamente 3 , al menos aproximadamente 4 , al menos aproximadamente 5 , al menos aproximadamente 6 , o al menos aproximadamente 10 o más aminoácidos en diferentes aminoácidos, incluyendo pero no limitándose a, alanina. Bibliotecas de RSs mutantes pueden generarse utilizando varias técnicas conocidas en la materia, incluyendo pero no limitándose un diseño racional en base a la estructura de RS tridimensional de proteína, o mutagénesis de nucleótidos RS en una técnica de diseño rotacional o aleatorio. Por ejemplo, los RSs mutantes pueden generarse por mutaciones específicas de sitio, mutaciones aleatorias, mutaciones de recombinación que generan diversidad, construcciones quiméricas, diseño racional y por otros métodos descritos en la presente o conocidos en la materia. En una modalidad, seleccionar (y/o distinguir) la biblioteca de RSs (opcionalmente RSs mutantes) para miembros que son activos, incluyendo pero no limitándose a, que aminoacilan un tARN ortogonal (O-tARN) en la presencia de un aminoácido codificado de manera no natural y un aminoácido natural, incluye: introducir un marcador de selección o distinción positivo, incluyendo pero no limitándose a, un gen de resistencia antibiótico, o lo similar, y la biblioteca de RSs (opcionalmente mutantes) en una pluralidad de células, en donde el marcador de selección y/o distinción positivo comprende al menos un codón selector, incluyendo pero no limitándose a, un codón ámbar, ocre, u opal; desarrollar la pluralidad de células en la presencia de un agente de selección; identificar células que sobreviven (o muestran una respuesta específica) en la presencia del agente de selección y/o distinción al suprimir el al menos un codón selector en el marcador de selección o distinción positivo, proporcionando así un subconjunto de células positivamente seleccionadas que contiene el grupo de RSs activos (opcionalmente mutantes). Opcionalmente, la concentración del agente de selección y/o distinción puede variarse.

En un aspecto, el marcador de selección positivo es un gen de acetiltransferasa de cloranfenicol (CAT) y el codón selector es un codón de detención ámbar en el gen CAT. Opcionalmente, el marcador de selección positivo es un gen de ß-lactamasa y el codón selector es un codón de detención ámbar en el gen de ß-lactamasa. En otro aspecto el marcador de distinción positivo comprende un marcador de distinción fluorescente o luminiscente o un marcador de distinción en base a afinidad (incluyendo pero no limitándose a, un marcador de superficie de célula) . En una modalidad, seleccionar o distinguir negativamente el grupo para RSs activos (opcionalmente mutantes) que preferentemente aminoacilan O-tARN en la ausencia del aminoácido codificado de manera no natural incluye: introducir un marcador de selección o distinción negativo con el grupo de RSs activos (opcionalmente mutantes) de la selección o distinción positiva en una pluralidad de células de un segundo organismo, en donde el marcador de selección o distinción negativo comprende al menos un codón selector (incluyendo pero no limitándose a, un gen de resistencia antibiótica, incluyendo pero no limitándose a, un gen de acetiltransferasa cloranfenicol (CAT)); e, identificar células que sobreviven o muestran una respuesta de distinción específica en un primer medio complementado con el aminoácido codificado de manera no natural y un agente de distinción o selección, pero fallan en sobrevivir o mostrar la respuesta específica en un segundo medio no complementado con el aminoácido codificado de manera no natural y el agente de distinción o selección, proporcionando así células sobrevivientes o células distinguidas con el al menos un O-RS recombinante. Por ejemplo, un protocolo de identificación CAT opcionalmente actúa como una selección positiva y/o una distinción negativa en la determinación de O-RS recombinantes apropiados. Por ejemplo, un grupo de clones se duplica opcionalmente en placas de crecimiento que contienen CAT (que comprende al menos un codón selector) ya sea con o sin uno o más aminoácidos codificados de manera no natural. Las colonias que crecen de manera exclusiva en las placas que contienen aminoácidos codificados de manera no natural son de esta manera consideradas como O-RS recombinante. En un aspecto, la concentración del agente de selección (y/o distinción) se varía. En algunos aspectos, los organismos primero y segundo son diferentes. De esta manera, el organismo primero y/o segundo opcionalmente comprende: una procariota, una eucariota, un mamífero, un Escherichia coli , un hongo, una levadura, una archaebacteria, una eubacteria, una planta, un insecto, un microorganismo, etc. En otras modalidades, el marcador de distinción comprende un marcador de distinción fluorescente o luminiscente o un marcador de distinción en base a afinidad.

En otra modalidad, el distinguir o seleccionar (incluyendo pero no limitándose a, seleccionar de manera negativa) el grupo para RSs activos (opcionalmente mutantes) incluye: aislar el grupo de RSs mutantes activos de la etapa de selección positiva (b) ; introducir un marcador de selección o distinción negativo, en donde el marcador de selección o distinción negativo comprende al menos un codón selector (incluyendo pero no limitándose a, un gen marcador tóxico, incluyendo pero no limitándose a, un gen de barnasa de ribonucleasa, que comprende al menos un codón selector) , y el grupo de RSs activos (opcionalmente mutantes) en una pluralidad de células de un segundo organismo; e identificar células que sobreviven o muestran una respuesta de distinción específica en un primer medio no complementado con el aminoácido codificado de manera no natural, pero fallan en sobrevivir o mostrar una respuesta de distinción específica en un segundo medio complementado con el aminoácido codificado de manera no natural, proporcionando así células sobrevivientes o distinguidas con el al menos un O-RS recombinante, en donde el al menos un O-RS recombinante es específico para el aminoácido codificado de manera no natural. En un aspecto, el al menos un codón selector comprende aproximadamente dos o más codones selectores. Tales modalidades opaionalmente pueden incluirse en donde el al menos un codón selector comprende dos o más codones selectores, y en donde el organismo primero y segundo son diferentes (incluyendo pero no limitándose a, cada organismo es opcionalmente, incluyendo pero no limitándose a, una procariota, una eucariota, un mamífero, una Escherichia coli , un hongo, una levadura, una archaebacterias, una eubacteria, una planta, un insecto, un microorganismo, etc.). También, algunos aspectos incluyen en donde el marcador de selección negativo comprende un gen de barnasa de ribonucleasa (que comprende al menos un codón selector) . Otros aspectos incluyen en donde el marcador de distinción opcionalmente comprende un marcador de distinción fluorescente o luminiscente o un marcador de distinción en base a afinidad. En las modalidades en la presente, las selecciones y/o distinciones opcionalmente incluyen variación de la severidad de selección y/o distinción. En una modalidad, los métodos para producir al menos una sintetasa aminoacil ortogonal -tARN recombinante (O-RS) puede comprender además: (d) aislar el al menos un O-RS recombinante; (e) generar un segundo conjunto de O-RS (opcionalmente mutado) derivados de el al menos un O-RS recombinante; y, (f) repetir las etapas (b) y (c) hasta que un O-RS mutado se obtiene que comprende una capacidad para aminoacilar preferentemente O-tAR?. Opcionalmente, las etapas (d) - (f) se repiten, incluyendo pero no limitándose a, al menos aproximadamente dos veces. En un aspecto, el segundo conjunto de O-RS mutados derivados de al menos un O-RS recombinante puede generarse por mutagénesis, incluyendo pero no limitándose a, mutagénesis aleatoria, mutagénesis específica en sitio, recombinación o una combinación de los mismos. La severidad de las etapas de selección/distinción, incluyendo pero no limitándose a, la etapa de selección/distinción positiva (b) , la etapa de selección/distinción negativa (c) o tanto la etapa de selección/distinción positiva como negativa (b) y (c) , en los métodos descritos arriba, opcionalmente incluye variar la severidad de selección/distinción. En otra modalidad, la etapa de selección/distinción positiva (b) , la etapa de selección/distinción negativa (c) o tanto la etapa de selección/distinción positiva como negativa (b) y (c) comprenden utilizando un reportador, en donde el reportador se detecta por clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) o en donde el reportador se detecta por luminiscencia. Opcionalmente, el reportador se despliega en una superficie de célula, en un despliegue de fago o lo similar y se selecciona en base a afinidad o actividad catalítica que incluye el aminoácido codificado de manera no natural o un análogo. En una modalidad, la sintetasa mutada se despliega en una superficie de célula, en un despliegue de fago o lo similar.

Los métodos para producir un tARN ortogonal recombinante (O-tARN) incluyen: (a) generar una biblioteca de tAR?s mutantes derivadas de al menos un tAR?, incluyendo pero no limitándose a, un tAR? supresor, de un primer organismo; (b) seleccionar (incluyendo pero no limitándose a, seleccionar negativamente) o distinguir la biblioteca para tARNs (opcionalmente mutantes) que se aminoacilan por una aminoacil tAR? sintetasa (RS) de un segundo organismo en la ausencia de un RS del primer organismo, proporcionando así un grupo de tARNs (opcionalmente mutantes) ; y, (c) seleccionar o distinguir el grupo de tARNs (opcionalmente mutantes) para miembros que se aminocilan por un RS ortogonal (O-RS) introducido, proporcionando así al menos un O-tAR? recombinante; en donde el al menos un O-tAR? recombinante reconoce un codón selector y no se reconoce en eficiencia por el RS del segundo organismo y se aminocila preferentemente por el O-RS. En algunas modalidades el al menos un tAR? es un tAR? supresor y/o comprende un codón único de tres bases de bases naturales y/o no naturales, o es un codón sin sentido, un codón raro, un codón no natural, un codón que comprende al menos 4 bases, un codón ámbar, un codón ocre, o un codón de detención opal. En una modalidad, el O-tAR? recombinante posee una mejora de ortogonalidad. Se apreciará que en algunas modalidades, O-tAR? se importa opcionalmente hacia un primer organismo de un segundo organismo sin la necesidad de modificación. En varias modalidades, los organismos, primero y segundo, son ya sea los mismos o diferentes y son opcionalmente elegidos de, incluyendo pero no limitándose a, procariotas (incluyendo pero no limitándose a, Methanococcus jannaschii , Methanobacteium thermoautotrophicum, Escherichia coli , Halobacteria, etc.), eucariotas, mamíferos, hongos, levaduras, archaebacterias, eubacterias, plantas, insectos, microorganismos, etc. Adicionalmente, el tARN recombinante se aminocila opcionalmente por un aminoácido codificado de manera no natural, en donde el aminoácido codificado de manera no natural se biosintetiza in vivo ya sea naturalmente o a través de manipulación genética. El aminoácido codificado de manera no natural se agrega opcionalmente a un medio de crecimiento para al menos el primero o segundo organismo. En un aspecto, seleccionar (incluyendo pero no limitándose a, seleccionar negativamente) o distinguir la biblioteca para tARNs (opcionalmente mutantes) que se aminocilan por una aminoacil tARN sintetasa (etapa (b) ) incluye: introducir un gen marcador tóxico, en donde el gen marcador tóxico comprende al menos uno de los codones selectores (o un gen que conduce a la producción de un agente estático o tóxico o un esencial para el organismo en donde tal gen marcador comprende al menos un codón selector) y la biblioteca de tARNs (opcionalmente mutantes) en una pluralidad de células del segundo organismo; y, seleccionar células sobrevivientes, en donde las células sobrevivientes contienen el grupo de tARNs (opcionalmente mutantes) que comprenden al menos un tARN ortogonal o tARN no funcional . Por ejemplo, las células sobrevivientes pueden seleccionarse al utilizar un ensayo de densidad celular de proporción de comparación. En otro aspecto, el gen marcador tóxico puede incluir dos o más codones selectores. En otra modalidad de los métodos, el gen marcador tóxico es un gen barnasa de ribonucleasa, donde el gen barnasa de ribonucleasa comprende al menos un codón ámbar. Opcionalmente, el gen barnasa de ribonucleasa puede incluir dos o más codones ámbar. En una modalidad, seleccionar o distinguir el grupo de tARNs (opcionalmente mutantes) para miembros que se aminocilan por un RS ortogonal (O-RS) introducido puede incluir: introducir un gen marcador de selección o distinción positivo, en donde el gen marcador positivo comprende un gen de resistencia a fármaco (incluyendo pero no limitándose a, gen ß-lactamasa, que comprende al menos uno de los codones selectores, tal como al menos un codón de detención ámbar) o un gen esencial para el organismo, o un gen que conduce a detoxificación de un agente tóxico, junto con O-RS, y el grupo de tARNs (opcionalmente mutantes) en una pluralidad de células del segundo organismo; e, identificar células sobrevivientes o distinguidas desarrolladas en la presencia de un agente de selección o distinción, incluyendo pero no limitándose a, un antibiótico, proporcionando así un grupo de células que poseen el al menos un tARN recombinante, donde el al menos un tARN recombinante se aminocila por el O-RS e inserta un aminoácido en un producción de traducción codificado por el gen marcador positivo, en respuesta a el al menos un codón selector. En otra modalidad, la concentración del agente de selección y/o distinción se varía. Se proporcionan métodos para generar pares de O-tARN/O-RS específicos. Los métodos incluyen: (a) generar una biblioteca de tARNs mutantes derivados de al menos un tAR? de un primer organismo; (b) seleccionar o distinguir negativamente la biblioteca para tAR?s (opcionalmente mutantes) que se aminocilan por una aminoacil tAR? sintetasa (RS) de un segundo organismo en la ausencia de un RS del primer organismo, proporcionando así un grupo de tARNs (opcionalmente mutantes) ; (c) seleccionar o distinguir el grupo de tAR?s (opcionalmente mutantes) para miembros que se aminocilan por un RS ortogonal (O-RS) introducido, proporcionando así al menos un O-tARN recombinante. El al menos un O-tAR? recombinante reconoce un codón selector y no se reconoce en eficiencia por el RS del segundo organismo y se aminocila preferentemente por el O-RS. El método también incluye (d) generar una biblioteca de RSs (opcionalmente mutantes) derivados de al menos una aminoacil tARN sintetasa (RS) de un tercer organismo; (e) seleccionar o distinguir la biblioteca de RSs mutantes para miembros que preferentemente aminoacilan el al menos un O-tARN recombinante en la presencia de un aminoácido codificado de manera no natural y un aminoácido natural, proporcionando así un grupo de RSs activos (opcionalmente mutantes) ; y, (f) seleccionar o distinguir negativamente el grupo para RSs activos (opcionalmente mutantes) que preferentemente aminoacilan el al menos un O-tARN recombinante en la ausencia del aminoácido codificado de manera no natural, proporcionando así el al menos un par O-tARN/O-RS específico, en donde el al menos un par 0-tARN/O-RS específico comprende al menos un O-RS recombinante que es específico para el aminoácido codificado de manera no natural y el al menos un O-tARN recombinante. Los pares 0-tARN/O-RS específicos producidos por los métodos se incluyen. Por ejemplo, el par 0-tARN/O-RS específico puede incluir, incluyendo pero no limitándose a, un par mutARNTyr-mutTyrRS, tal como un par mutARNTyr-SS12TyrRS, un par mutARNLeu-mutLeuRS, un par mutARNThr-mutThrRS, un par mutARNGlu-mutGluRS, o lo similar. Adicionalmente, tales métodos incluyen en donde el primer y tercer organismo son los mismos (incluyendo pero no limitándose a, Methanococcus jannaschi ?) . Métodos para seleccionar un par de tARN ortogonal- sintetasa tARN para utilizarse en un sistema de traducción in vivo de un segundo organismo también se incluyen en la presente invención. Los métodos incluyen: introducir un gen marcador, un tAR? y una aminoacil tARN sintetasa (RS) aislados o derivados de un primer organismo en un primer conjunto de células del segundo organismo; introducir el gen marcador y el tARN en un conjunto de célula duplicada de un segundo organismo; y, seleccionar células sobrevivientes en el primer conjunto que falla en sobrevivir en el conjunto de célula duplicada o distinguir células que muestran una respuesta de distinción específica que falla en dar tal respuesta en el conjunto de célula duplicada, en donde el primer conjunto y el conjunto de célula duplicada se desarrollan en la presencia de un agente de selección o distinción, en donde the células sobrevivientes o distinguidas comprenden el par de tAR? ortogonal -sintetasa tAR? para utilizarse en el sistema de traducción in vivo del segundo organismo. En una modalidad, la comparación y selección o distinción incluye un ensayo de terminación in vivo . La concentración del agente de selección o distinción puede variarse. Los organismos de la presente invención comprenden una variedad de organismo y una variedad de combinaciones. Por ejemplo, los organismos, primero y segundo, de los métodos de la presente invención pueden ser los mismos o diferentes. En una modalidad, los organismos son opcionalmente un organismo procariótico, incluyendo pero no limitándose a, Methanococcus jannaschii , Methanobacterium thermoautotrophicum, Halobacterium, Escherichia coli , A . fulgidus, P. furiosus, P. horikoshii , A . pernix, T. thermophilius, o lo similar. Alternativamente, los organismos opcionalmente comprenden un organismo eucariótico, incluyendo pero no limitándose a, plantas (incluyendo pero no limitándose a, plantas complejas tales como monocotiledoeas o policotiledoneas) , algas, microorganismos, hongos (incluyendo pero no limitándose a, levadura, etc) , animales (incluyendo pero no limitándose a, mamíferos, insectos, artrópodos, etc.), o lo similar. En otra modalidad, el segundo organismo es un organismo procariótico, incluyendo pero no limitándose a, Methanococcus jannaschii , Methanobacterium thermoautotrophicum, Halobacterium, Escherichia coli , A . fulgidus, Halobacterium, P. furiosus, P. horikoshii , A . pernix, T. thermophilus, o lo similar. Alternativamente, el segundo organismo puede ser un organismo eucariótico, incluyendo pero no limitándose a, una levadura, una célula animal, una célula vegetal, un hongo, una célula de mamífero, o lo similar. En varias modalidades los organismos, primero y segundo, son diferentes. Una amplia variedad de aminoácidos codificados de manera no natural puede substituirse por, o incorporarse en, una posición dada en un polipéptido. En general, un aminoácido codificado de manera no natural particular se selecciona para incorporación en base a una examinación de la estructura de cristal tridimensional de un polipéptido, incluyendo con su receptor u otro compañero de unión si es apropiado, una preferencia para substituciones consecutivas (i.e., aminoácidos codificados de manera no natural en base a arilo, tales como p-acetilfenilalanina o O-propargiltirosina substituyendo por Phe, Tyr o Trp) , y la química de conjugación específica que uno desea introducir en el polipéptido (e.g., la introducción de 4-azidofenilalanina si se desea efectuar una cicloadición Huisgen [3+2] con un polímero soluble en agua que lleva un residuo alquino o una formación de unión a amida con un polímero soluble en agua que lleva un éster arilo que, a su vez, incorpora un residuo fosfina) . En una modalidad, el método incluye además incorporar en la proteína el aminoácido codificado de manera no natural, donde el aminoácido codificado de manera no natural comprende un primer grupo reactivo; y contactar la proteína con una molécula (incluyendo pero no limitándose a, una etiqueta, un tinte, un polímero, un polímero soluble en agua, un derivado de glicol de polietileno, un fotoreticulador, un compuesto citotóxico, un fármaco, una etiqueta de afinidad, una etiqueta de fotoafinidad, un compuesto reactivo, una resina, una segunda proteína o polipéptido o análogo de polipéptido, un anticuerpo o fragmento de anticuerpo, un quelador de metal, un cofactor, un ácido graso, un carbohidrato, un polinucleótido, un ADN, a RKA, un polinucleótido antisentido, un ácido ribonucleico inhibidor, un biomaterial, una nanopartícula, una etiqueta de giro, un fluoroforo, un residuo que contiene metal, un residuo radioactivo, un nuevo grupo funcional, un grupo que interactúa covalente o no covalentemente con otras moléculas, un residuo fotoguardado, un residuo fotoisomerizable, biotina, un derivado de biotina, un derivado de biotina, un análogo de biotina, un residuo que incorpora un átomo pesado, un grupo químicamente desdoblable, un grupo fotodesdoblable, una cadena lateral alargada, un azúcar enlazada a carbono, un agente activo redox, un tioácido amino, un residuo tóxico, un residuo isotópicamente etiquetado, una sonda biofísica, un grupo fosforescente, un grupo quimioluminescentee, un grupo denso de electrón, un grupo magnético, un grupo intercalador, un cromóforo, un agente de transferencia de energía, un agente biológicamente activo, una etiqueta detectable, una molécula pequeña, o cualquier combinación de lo anterior, o cualquier otro compuesto o sustancia deseable) que comprende un segundo grupo reactivo. El primer grupo reactivo reacciona con el segundo grupo reactivo para unir la molécula al aminoácido codificado de manera no natural a través de una cicloadición [3+2] . En una modalidad, el primer grupo reactivo es un residuo alquinilo o azido y el segundo grupo reactivo es un residuo alquinilo o azido. Por ejemplo, el primer grupo reactivo es el residuo alquinilo (incluyendo pero no limitándose a, en el aminoácido codificado de manera no natural p-propargiloxifenilalanina) y el segundo grupo reactivo es el residuo azida. En otro ejemplo, el primer grupo reactivo es el residuo azida (incluyendo pero no limitándose a, en el aminoácido codificado de manera no natural p-azido-L-fenilalanina) y el segundo grupo reactivo es el residuo alquinilo. En algunos casos, la(s) substitución (es) de aminoácido codificado de manera no natural se combinará (n) con otras adiciones, substituciones o eliminaciones dentro del polipéptido para afectar otras amenazadas biológicas del polipéptido. En algunos casos, las otras adiciones, substituciones o eliminaciones pueden incrementar la estabilidad (incluyendo pero no limitándose a, resistencia a degradación proteolítica) del polipéptido o incrementar afinidad del polipéptido para su receptor. En algunos casos, las otras adiciones, substituciones o eliminaciones pueden incrementar la solubilidad (incluyendo pero no limitándose a, cuando se expresan en célula huésped Pseudomonas) del polipéptido. En algunas modalidades adiciones, substituciones o eliminaciones pueden incrementar la solubilidad de polipéptido después de la expresión en células huésped Pseudomonas recombinantes. En algunas modalidades los sitios se seleccionan para substitución con un aminoácido no natural o codificado de manera natural además de otro sitio para la incorporación de un aminoácido no natural que resulta en incrementar la solubilidad del polipéptido después de la expresión en células huésped recombinantes Pseudomonas . En algunas modalidades, los polipéptidos comprenden otra adición, substitución o eliminación que modula la afinidad para el receptor de polipéptido, modula (incluyendo pero no limitándose a, incrementos o disminuciones) la dimerización del receptor, estabiliza los dímeros del receptor, modula la vida media circulante, modula la liberación de biodisponibilidad, facilita la purificación, o mejora o latera una vía de administración particular. De manera similar, los polipéptidos pueden comprender secuencias de segmentación de proteasa, grupos reactivos, dominios de unión a anticuerpo (incluyendo pero no limitándose a, FLAG o poly-His) u otras secuencias a base de afinidad (incluyendo, pero no limitándose a, FLAG, poly-His, GST, etc.) o moléculas enlazadas (incluyendo, pero no limitándose a, biotina) que mejoran la detección (incluyendo, pero no limitándose a, GFP) , purificación y otros rasgos del polipéptido. VTJ. Expresión en especies Pseudomonas y cepas de las mismas Para obtener alto nivel de expresión de un polinucleótido clonado, uno típicamente subclona polinucleótidos que codifican un polipéptido en un vector de expresión que contiene un fuerte promotor para transcripción directa, un terminador de transcripción/traducción, y si para un ácido nucleico que codifica una proteína, un sitio de unión a ribosima para inicio de traducción. Los promotores bacterianas adecuados se conocen bien en la materia y se describe, e.g., en Sambrook et al. and Ausubel et al. Los sistemas de expresión bacterianas para expresar polipéptidos de la invención están disponibles en Pseudomonas fluorescens , Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas putida, Pseudomonas syringae, Pseudomonas diminuta, Pseudomonas oleovorans, así como también otras especies Pseudomonas y cepas derivadas de las mismas. Células Pseudomonas que comprenden pares 0-tARN/O-RS pueden utilizarse como se describe en la presente. Una célula huésped Pseudomonas de la presente invención proporciona la capacidad de sintetizar proteínas que comprenden aminoácidos codificados de manera no natural en grandes cantidades útiles de células Pseudomonas en cultivo. En un aspecto, la composición opcionalmente incluye, pero no se limita a, al menos 10 microgramos, al menos 50 microgramos, al menos 75 microgramos, al menos 100 microgramos, al menos 200 microgramos, al menos 250 microgramos, al menos 500 microgramos, al menos 1 miligramo, al menos 10 miligramos, al menos 100 miligramos, al menos un gramo, al menos diez gramos, al menos cincuenta gramos, o más de la proteína que comprende un aminoácido codificado de manera no natural, o cantidades a escala de kilogramo que pueden lograrse con métodos de producción de proteína in vivo a gran escala (detalles en producción de proteína recombinante y purificación se proporcionan en la presente) . En otro aspecto, la proteína está opcionalmente presente en la composición en una concentración de, incluyendo pero no limitándose a, al menos 10 microgramos de proteína por litro, al menos 50 microgramos de proteína por litro, al menos 75 microgramos de proteína por litro, al menos 100 microgramos de proteína por litro, al menos 200 microgramos de proteína por litro, al menos 250 microgramos de proteína por litro, al menos 500 microgramos de proteína por litro, al menos 1 miligramo de proteína por litro, o al menos 10 miligramos de proteína por litro, o al menos 50 miligramos de proteína por litro, o al menos 100 miligramos de proteína por litro, o al menos 500 miligramos de proteína por litro, o al menos 1000 miligramos de proteína por litro, o al menos 1 gramo de proteína por litro, o al menos 5 gramos de proteína por litro, o al menos 10 gramos de proteína por litro, o al menos 20 gramos de proteína por litro o más, en, por ejemplo, un lisato celular, un regulador, un regulador farmacéutico, medio de cultivo, u otra suspensión líquida.

Una célula huésped Pseudomonas de la presente invención proporciona la capacidad de biosintetizar proteínas que comprenden aminoácidos codificados de manera no natural en grandes cantidades útiles. Por ejemplo, proteínas que comprenden an aminoácido codificado de manera no natural pueden producirse en una concentración de, incluyendo pero no limitándose a, al menos 10 µg/litro, al menos 50 µg/litro, al menos 75 µg/litro, al menos 100 µg/litro, al menos 200 µg/litro, al menos 250 µg/litro, o al menos 500 µg/litro, al menos lmg/litro, al menos 2mg/litro, al menos 3 mg/litro, al menos 4 mg/litro, al menos 5 mg/litro, al menos 6 mg/litro, al menos 7 mg/litro, al menos 8 mg/litro, al menos 9 mg/litro, al menos 10 mg/litro, al menos 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 mg/litro, 1 g/litro, 5 g/litro, 10 g/litro o más de proteína en un extracto celular, lisato celular, medio de cultivo, un regulador, y/o lo similar. Las técnicas de expresión bacterial se conocen bien en la materia. Una amplia variedad de vectores están disponibles para utilizarse huéspedes Pseudomonas. Los vectores pueden ser una copia única o vectores altos o bajos de múltiples copias. Los vectores pueden ervir para clonación y/o expresión. En vista de la amplia literatura que concierne a vectores, la disponibilidad comercial en muchos vectores, y aún manuales que describen vectores y sus características y mapas de restricción, no se requiere en la presente una discusión extensiva. Como se sabe bien, los vectores normalmente incluyen marcadores que permiten la selección, tales marcadores pueden proporcionar resistencia a agente citotóxico, protrofia o inmunidad. Frecuentemente, una pluralidad de marcadores está presente, que proporciona diferentes características. Un promotor bacterial es cualquier secuencia de ADN capaz de unir polimerasa de ARN bacterial e iniciar la transcripción aguas abajo (3') de una secuencia de codificación (e.g., gen estructural) en mARN. Un promotor tendrá una región de inicio de transcripción que se coloca usualmente próximo al extremo 5' de la secuencia de codificación. La región de inicio de transcripción típicamente incluye un sitio de unión de polimerasa de ARN y un sitio de inicio de transcripción. Un promotor bacterial también pueden tener un segundo dominio llamado un operador que cubre un sitio de unión de polimerasa de ARN adyacente en el cual inicia la síntesis de ARN. El operador puede permitir transcripción regulada (inducible) negativa, como una proteína represora de gen puede unir el operador y así inhibir la transcripción de un gen específico. La expresión constitutiva puede ocurrir en la ausencia de elementos reguladores negativos, tales como el operador. Además, la regulación positiva puede lograrse por una secuencia de unión de proteína de activador de gen, que, si está presente está usualmente próximo (5') a la secuencia de unión de polimerasa de ARN. Un ejemplo de una proteína de activador de gen es la proteína activadora de catabolito (CAP) , que ayuda a iniciar la transcripción del operón lac en Escherichia coli [Raibaud et al, ANNU. REV. GENET. (1984) 18:173]. La expresión regulada puede por lo tanto ser ya sea positiva o negativa, ya sea mejorando o reduciendo así la transcripción. Las secuencias que codifican las enzimas de trayectoria metabólicas proporcionan secuencias promotoras particularmente útiles. Los ejemplos incluyen secuencias promotoras derivadas de enzimas de metabolización de azúcar, tales como galactosa, lactosa (lac) [Chang et al., NATURE (1977) 198:1056], y maltosa. Los ejemplos adicionales incluyen secuencias promotoras derivadas de enzimas biosintéticas tales como triptofan (trp) [Goeddel et al, NUC.

ACIDS RES. (1980) 8:4057; Yelverton et al., NUCL . ACIDS RES. (1981) 9:731 ; Pat. de E.U. No.4,738,921 ; EP Pub . Nos . 036 776 y 121 775, que se incorporan para referencia en la presente] . El sistema promotor de ß-galactosidasa (bla) [Weissmann (1981) "The cloning of interferon and other mistakes" . En Interferon 3 (Ed. I. Gresser) ] , bacteriófago lambda PL [Shimatake et al., NATURE (1981) 292:128] y T5 [Pat. de E.U. No .4 , 689, 406 , que se incorpora para referencia en la presente] los sistemas promotores también proporcionan secuencias promotoras útiles. Los métodos preferidos de la presente invención utilizan promotores fuertes, tal como el promotor T7 para inducir polipéptidos hGH a altos niveles. Ejemplos de tales vectores se conocen bien en la materia e incluyen las series pET29 de Novagen, y los vectores pPOP descritos en WO99/05297, que se incorpora para referencia en la presente. Tales sistemas de expresión producen altos niveles de polipéptidos en el huésped sin comprometer los parámetros de crecimiento o viabilidad de la célula huésped. Además, los promotores sintéticos que no ocurren en la naturaleza también funcionan como promotores bacterianas. Por ejemplo, las secuencias de activación de transcripción de un promotor de bacteriófago o bacterial pueden unirse con las secuencias de operón de otro promotor de bacteriófago o bacterial, creando un promotor híbrido sintético [Pat. de E.U. No.4, 551, 433 , que se incorpora para referencia en la presente] . Por ejemplo, el promotor tac es un promotor trp-lac híbrido comprendido de tanto el promotor trp como las secuencias de operón lac que se regula por el represor lac [Amann et al., GENE (1983) 25:167; de Boer et al., PROC. NATL. ACAD. SCI. (1983) 80:21]. Además, un promotor bacterial puede incluir promotores que ocurren de manera natural de origen no bacterial que tienen la capacidad de unir pomlimerasa de ARN bacterial e iniciar la transcripción. Un promotor que ocurre de manera natural de origen no bacterial también puede acoplarse con una polimerasa de ARN compatible para producir altos niveles de expresión de algunos genes en procariotas. El sistema promotor/polimerasa de ARN T7 bacteriófago es un ejemplo de un sistema promotor acoplado [Studier et al., J. MOL. Biol. (1986) 189:113; Tabor et al., Proc Nati. Acad. Sci. (1985) 82:1074]. Además, un promotor híbrido también puede comprenderse de un promotor bacteriófago y una región operadora de E. coli (EP Pub. No. 267 851) . Además de una secuencia promotora de funcionamiento, un sitio de unión de ribosima eficiente también es útil para la expresión de genes externos en procariotas. En bacterias, el sitio de unión de ribosima se llama secuencia Shine-Dalgarno (SD) e incluye un codón de inicio (ATG) y una secuencia de 3-9 nucleótidos en 3-11 nucleótidos ubicados a lo largo aguas arriba del codón de inicio [Shine et al., NATURE (1975) 254:34]. Se piensa que la secuencia SD promueve la inhibición de mARN a la ribosima por la formación en pares bases entre la secuencia SD y 3 ' y de E. coli 16S rARN [Steitz et al. "Genetic signáis and nucleotide sequences in messenger RNA" , En Biological Regulation and Development: Gene Expression (Ed. R. F. Goldberger, 1979) ] . Para expresar genes eucarióticos y genes procarióticos con sitio de unión a ribosima débil [Sambrook et al. "Expression of cloned genes in Escherichia coli", Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1989] . El término "huésped Pseudomonas" o "célula huésped Pseudomonas" se refiere a especies Pseudomonas o cepas derivadas de las mismas que pueden utilizarse, o se han utilizado, como un recipiente para vectores recombinantes u otro ADN de transferencia. El término incluye la progenie de la célula huésped bacterial original que se ha transfectado. Se entiende que la progenie de una célula parenteral única puede no necesariamente ser idéntica en morfología, o en complemento de ADN total o genómico al origen, debido a la mutación deliberada o accidental . La progenie de la célula parenteral que son suficientemente similares al origen a caracterizarse por la propiedad relevante, tal como la presencia de una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido, se incluyen en la progenie propuesta por esta definición. La selección de célula huésped Pseudomonas adecuada para la expresión de polipéptidos se conoce bien por aquellos de experiencia ordinaria en la materia. En la selección de huéspedes Pseudomonas para expresión, los huéspedes adecuados pueden incluir aquellos mostrados por tener, inter alia , buena inclusión en la capacidad de formación del cuerpo, baja actividad proteolítica, y robustez total. Los huéspedes Pseudomonas generalmente están disponibles de una variedad de fuentes incluyendo, pero no limitándose a, el Bacterial Genetic Stock Center, Department of Biophysics and Medical Physics, Universidad de California (Berkeley, CA) ; y la Colección de Cultivos Tipo Americano ("ATCC") (Manassas, VA). En otra modalidad de los métodos de la presente invención, la cepa de célula huésped es une especie de Pseudomonas, incluyendo pero no limitándose a, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas aeruginosa, y Pseudomonas putida . Pseudomonas luorescens biovar 1, designada cepa MB101, está disponible para la producción de proteína. Ciertas cepas de Pseudomonas fluorescens se describen por The Dow Chemical Company como una cepa huésped (Midland, MI disponible en la red en dow.com). Patentes de E.U. Nos. 4,755,465 y 4,859,600, que se incorporan en la presente, describen el uso de cepas Pseudomonas como una célula huésped para producción de polipéptido. Una vez que la cepa de célula huésped Pseudomonas se ha establecido (i.e., la construcción de expresión se ha introducido en la célula huésped y células huésped con la construcción de expresión apropiada se aislan) , la cepa de célula huésped recombinante se cultiva bajo condiciones apropiadas para producción de polipéptidos. Como será aparente para un experto en la materia, el método de cultivo de la cepa de célula huésped recombinante dependerá de la naturaleza de la construcción de expresión utilizada y la identidad de la célula huésped. Las cepas huésped recombinantes se cultivan normalmente utilizando métodos que se conocen bien en la materia. Células huésped recombinantes se cultivan típicamente en medio líquido que contiene fuentes asimilables de carbono, nitrógeno, y sales inorgánicas y, opcionalmente que contiene vitaminas, aminoácidos, factores de crecimiento y otros complementos de cultivo proteínicos bien conocidos en la materia. Los medios líquidos para cultivo de células huésped pueden opcionalmente contener antibióticos o anti-fúngicos para prevenir el crecimiento de microorganismos indeseables y/o compuestos incluyendo, pero no limitándose a, antibióticos para seleccionar células huésped que contienen el vector de expresión. Células huésped recombinantes pueden cultivarse en formatos de grupo o continuo con ya sea recolectar célula (en el caso donde el polipéptido se acumula intracelularmente) o recolectar sobrenadante de cultivo en ya se formatos de grupo o continuo. Para la producción en células huésped procarióticas, el cultivo de grupo y recolección de células se prefieren. Los polipéptidos recombinantes se purifican normalmente después de la expresión en sistemas recombinantes. El polipéptido puede purificarse de células huésped por una variedad de métodos conocidos en la materia. Algunas veces un polipéptido producido en células huésped Pseudomonas es deficientemente soluble o insoluble (en la forma de cuerpos de inclusión) . En el caso de proteína insoluble, la proteína puede recolectarse de lisatos de célula huésped mediante cetrifugación y puede seguirse además por homogenización de las células. En el caso de proteína deficientemente soluble, los compuestos incluyendo, pero no limitándose a, imina de polietileno (PEÍ) pueden agregarse para inducir la precipitación de proteína parcialmente soluble. La proteína precipitada puede entonces recolectarse convenientemente por centrifugación. Las células huésped recombinantes pueden interrumpirse y homogenizarse para liberar los cuerpos de inclusión desde adentro de las células utilizando una variedad de métodos bien conocidos por aquellos de experiencia ordinaria en la materia. Homogenización o interrupción de célula huésped puede realizarse utilizando técnicas bien conocidas incluyendo, pero no limitándose a, interrupción de célula enzimática, sonicación, homogenización lenta, o interrupción de liberación a alta presión. En una modalidad del método de la presente invención, la técnica de liberación a alta presión se utiliza para interrumpir las células huésped Pseudomonas para liberar los cuerpos de inclusión de los polipéptidos. El polipéptido precipitado o insoluble puede entonces solubilizarse utilizando cualquiera de un número de agentes de solubilización adecuados conocidos en la materia. Preferentemente, el polipéptido se solubiliza con hidrocloruro de guanidina o urea. El volumen del polipéptido solubilizado debe minimizarse de manera que los grupos grandes pueden producirse utilizando tamaños de grupo convenientemente manejables. Este factor puede ser significativo en un establecimiento comercial a gran escala donde el huésped recombinante puede desarrollarse en grupos que son miles de litros en volumen. Además, cuando se produce el polipéptido en un establecimiento comercial a gran escala, en particular para usos farmacéuticos de humano, el evitar químicos duros que pueden dañar la maquinaria y contenedor, o el producto proteínico por sí mismo, debe evitarse, si es posible . Cuando el polipéptido se produce como una proteína de fusión, la secuencia de fusión se remueve preferentemente. El retiro de una secuencia de fusión puede realizarse por segmentación química o enzimática, preferentemente por segmentación enzimática. El retiro enzimático de secuencias de fusión puede realizarse utilizando métodos bien conocidos por aquellos en la materia. La elección de enzima para el retiro de la secuencia de fusión se determinará por la identidad de la fusión, y las condiciones de reacción se especificarán por la elección de enzimas como será aparente para un experto en la materia. El polipéptido segmentado se purifica preferentemente de la secuencia de fusión segmentada por métodos bien conocidos. Tales métodos se determinarán por la identidad y propiedades de la secuencia de fusión y el polipéptido, como será aparente para un experto en la materia. Los métodos para purificación pueden incluir, pero no se limitan a, cromatografía de exclusión de tamaño, cromatografía de interacción hidrofóbica, cromatografía de intercambio de ion o diálisis o cualquier combinación de los mismos . El polipéptido también se purifica preferentemente para remover ADN de la solución de proteína. El ADN removido puede ser cualquier método conocido por la materia, tales como cromatografía de intercambio de ion o precipitación, pero se remueve preferentemente por precipitación con un agente de precipitación de ácido nucleico, tal como, pero no limitándose a, sulfato de protamina. El polipéptido puede separarse del ADN precipitado utilizando métodos estándar bien conocidos incluyendo, pero no limitándose a, centrifugación o filtración. El retiro de moléculas de ácido nucleico huésped es un factor importante en un establecimiento donde el polipéptido está por utilizarse para tratar humanos y los métodos de la presente invención reducen el ADN de célula huésped a niveles farmacéuticamente aceptables . Los métodos para fermentación a gran escala o escala pequeña también pueden utilizarse en expresión de proteína, incluyendo pero no limitándose a, fermentadores, matraces de agitación, birreactores de lecho fluidizado, birreactores de fibra hueca, sistemas de cultivo de botella de giratoria, y sistemas de birreactor de tanque agitado. Cada uno de estos métodos puede realizarse en un proceso de modo en grupos, alimentado por grupos, o continuo. Cualquiera de los siguientes procedimientos ejemplificativos puede emplearse para purificación de polipéptidos de la invención, cromatografía de afinidad; cromatografía de intercambio de catión o anión (utilizando, incluyendo pero no limitándose a, DEAE SEPHAROSE) ; cromatografía en sílice; HPLC de fase inversa; filtración de gel (utilizando, incluyendo pero no limitándose a, SEPHADEX G-75) ; cromatografía de interacción hidrofóbica; cromatografía de exclusión de tamaño, cromatografía de quelato de metal; ultrafiltración/diafiltración; precipitación de etanol; precipitación de sulfato de amonio; cromatoenfoque; cromatografía de desplazamiento; procedimientos electroforéticos (incluyendo pero no limitándose a enfoque isoeléctrico preparativo) , solubilidad diferencial (incluyendo pero no limitándose a precipitación de sulfato de amonio) , SDS-PAGE, o extracción. Proteínas de la presente invención, incluyendo pero no limitándose a, proteínas que comprenden aminoácidos codificados de manera no natural, anticuerpos a proteínas que comprenden aminoácidos codificados de manera no natural, compañeros de unión para proteínas que comprenden aminoácidos codificados de manera no natural, etc., pueden purificarse ya sea parcial o substancialmente para homogeneidad, de acuerdo a los procedimientos estándar conocidos y utilizados por aquellos expertos en la materia. De acuerdo con lo anterior, los polipéptidos de la invención pueden recuperarse y purificarse por cualquiera de un número de métodos bien conocidos en la materia, incluyendo pero no limitándose a, precipitación de etanol o sulfato de amonio; extracción base o acida, cromatografía de columna, cromatografía de columna de afinidad, cromatografía de intercambio de catión o anión, cromatografía de fosfocelulosa, cromatografía de interacción hidropónica, cromatografía de hidroxilapatita, cromatografía de lectina, electroforesis de gel y lo similar. Las etapas de redoblado de proteína pueden utilizarse, según se desee, para hacer las proteínas maduras correctamente dobladas . Cromatografía líquida de alto desempeño (HPLC) , cromatografía de afinidad u otros métodos adecuados pueden emplearse en etapas de purificación final donde se desea alta pureza. En una modalidad, los anticuerpos hechos contra aminoácidos codificados de manera no natural (o proteínas que comprenden aminoácidos codificados de manera no natural) se utilizan como reactivos de purificación, incluyendo pero no limitándose a, purificación a base de afinidad de proteínas que comprenden uno o más aminoácido (s) no codificado (s) de manera natural. Una vez purificados, parcial o a homogeneidad, según se desee, los polipéptidos se utilizan opcionalmente para una amplia variedad de utilidades, incluyendo pero no limitándose a, componentes de ensayo, terapéuticos, profilaxis, diagnósticos, reactivos de búsqueda y/o como inmunogenes para producción de anticuerpo. Además de las otras referencias observadas en la presente, una variedad de métodos de doblado de proteína/purificación se conocen bien en la materia, incluyendo, pero no limitándose a, aquellos establecidos en R. Scopes, Protein Purification. Springer-Verlag, N. Y. (1982) ; Deutscher, Methods in Enzvmology Vol. 182: Guide to Protein Purification. Academic Press, Inc. N. Y. (1990); Sandana, (1997) Bioseparation of Proteins, Academic Press, Inc.; Bollag et al. (1996) Protein Methods, 2nd Edition Wiley-Liss, NY; Walker, (1996) The Protein Protocols Handbook Humana Press, NJ, Harris and Angal, (1990) Protein Purification Applications: A Practical Approach IRL Press en Oxford, Oxford, Inglaterra; Harris and Angal, Protein Purification Methods: A Practical Approach IRL Press en Oxford, Oxford, Inglaterra; Scopes, (1993) Protein Purification: Principies and Practice 3rd Edition Springer Verlag, NY; Janson and Ryden, (1998) Protein Purification: Principies, High Resolution Methods and Applications, Second Edition Wiley- VCH, NY; and Walker (1998) , Protein Protocols on CD-ROM Humana Press, NJ; y las referencias citadas en la presente . Aquellos expertos en la materia reconocerán que, después de síntesis, la expresión y/o purificación, las proteínas pueden poseer una conformación diferente de las conformaciones deseadas de los polipéptidos relevantes. En un aspecto de la invención, la proteína expresada se desnaturaliza opcionalmente y después se vuelve a renaturalizar. Esto se realiza utilizando métodos conocidos en la materia, incluyendo pero no limitándose a, al agregar una caperonina a la proteína o polipéptido de interés, al solubilizar las proteínas en un agente caotrópico tal como HCl guanidina, utilizando isomerasa de disulfuro de proteína, etc . En general, se desea ocasionalmente desnaturalizar y reducir los polipéptidos expresados y después causar que los polipéptidos se vuelvan a doblar en la conformación preferida. Por ejemplo, guanidina, urea, DTT, DTE, y/o a caperonina pueden agregarse a un producto de traducción de interés. Los métodos para reducir, desnaturalizar y volver a naturalizar las proteínas se conocen por aquellos expertos en la materia (ver, las referencias anteriores, y Debinski, et al. (1993) J. Biol. Chem., 268: 14065-14070; Kreitman and Pastan (1993) Bioconjug. Chem. , 4:581-585; y Buchner, et al., (1992) Anal . Biochem. , 205: 263-270). Debinski, et al., por ejemplo, describe la desnaturalización y reducción de proteínas de cuerpo de inclusión en guanidina-DTE. Las proteínas pueden volverse a doblar en un regulador redox que contiene, incluyendo pero no limitándose a, glutationa oxidada y L-arginina. Los reactivos de redoblado pueden fluirse y de otra manera moverse en contacto con el uno o más polipéptidos u otro producto de expresión, o vice-versa. Métodos de Purificación General Cualquiera de una variedad de etapas de aislamiento puede realizarse en el lisato celular que comprende polipéptido o en cualquiera de las mezclas de polipéptido que resultan de las etapas de aislamiento incluyendo, pero no limitándose a cromatografía de afinidad, cromatografía de intercambio de ion, cromatografía de interacción hidrofóbica, cromatografía de filtración de gel, cromatografía líquida de alto desempeño ("HPLC"), HPLC de fase inversa ("RP-HPLC"), adsorción de lecho expandido, o cualquier combinación y/o repetición de los mismos y en cualquier orden apropiado. Equipo y otros materiales necesarios utilizados para realizar las técnicas descritas en la presente están comercialmente disponibles. Bombas, recolectores de fracción, monitores, grabadoras y sistemas completos están disponibles de, por ejemplo, Applied Biosystems (Foster City, CA) , BioRad Laboratories, Inc. (Hercules, CA) , y Amersham Biosciences, Inc. (Piscataway, NJ) . Los materiales cromatográficos incluyendo, pero no limitándose a, materiales de matriz de intercambio, medios y reguladores también están disponibles en tales compañías. El equilibrio, y otras etapas en los procesos de cromatografía de columna descritos en la presente tales como enjuague y elución, pueden realizarse de manera más rápida utilizando equipo especializado tal como una bomba. Las bombas comercialmente disponibles incluyen, pero no se limitan a, Bomba HILO AD P-50, Bomba Periestáltica P-I, Bomba P-901, y Bomba P-903 (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) . Ejemplos de recolectores de fracción incluyen Recolector de Fracción RediFrac, Recolectores de fracción FRAC-100 y FRAC-200, y Recolector de Fracción SUPERFRAC® (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) . Los mezcladores también están disponibles para formar gradientes de concentración lineal y pH. Los mezcladores comercialmente disponibles incluyen Mezclador de Gradiente GM-1 y Mezcladores En Línea (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) . El proceso cromatográfico puede monitorearse utilizando cualquier monitor comercialmente disponible. Tales monitores pueden utilizarse para obtener información como UV, pH y conductividad. Ejemplos de detectores incluyen Monitor UV-1, UVICORD® S II, Monitor UV-M II, Monitor UV-900, Monitor UPC- 900, Monitor pH/C-900, y Monitor de Conductividad (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) . Sin embargo, sistemas completos están comercialmente disponibles en varios sistemas AKTA® de Amersham Biosciences (Piscataway, NJ) . En una modalidad de la presente invención, por ejemplo, el polipéptido puede reducirse y desnaturalizarse al desnaturalizar primero el polipéptido purificado resultante en úrea, seguido por la dilución en regulador TRIS que contiene un agente reductor (tal como DTT) a un pH adecuado. En otra modalidad, el polipéptido se desnaturaliza en úrea en un rango de concentración de entre aproximadamente 2 M a aproximadamente 9 M, seguido por dilución en regulador TRIS a un pH en el rango de aproximadamente 5.0 a aproximadamente 8.0. La mezcla de redoblado de esta modalidad puede entonces incubarse. En una modalidad, la mezcla de redoblado se incuba a temperatura ambiente por veinticuatro horas. La mezcla de polipéptido desnaturalizada y reducida puede entonces además aislarse y purificarse. Como se utiliza en la presente, el pH de la primer mezcla de polipéptidos puede ajustarse antes de realizar cualquier etapa de aislamiento subsiguiente. Además, la primer mezcla de polipéptido o cualquier mezcla subsiguiente de la misma puede concentrarse utilizando técnicas conocidas en la materia. Además, el regulador de elución que comprende la primer mezcla de polipéptido o cualquier mezcla subsiguiente del mismo puede intercambiarse para un regulador adecuado para la siguiente etapa de aislamiento utilizando técnicas bien conocidas por aquellos de experiencia ordinaria en la materia. Cromatografía de Intercambio de Ion En una modalidad, y como una etapa adicional, opcional, cromatografía de intercambio de ion puede realizarse en la primer mezcla de polipéptido hGH. Ver generalmente ION EXCHANCHE CHROMATOGRAPHY: PRINCIPLES AND METHODS (Cat. No. 18-1114-21, Amersham Biosciences (Piscataway, NJ) ) . Las columnas de intercambio de ion comercialmente disponibles incluyen Columnas HITRAP®, HIPREP®, y HILOAD® (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) . Tales columnas utilizan intercambiadores de anión fuertes tales como Q SEPHAROSE" Flujo Rápido, Q SEPHAROSE® Alto Desempeño, y Q SEPHAROSE® XL; intercambiadores de catión fuertes tales como SP SEPHAROSE Alto Desempeño, SP SEPHAROSE8 Flujo Rápido, y SP SEPHAROSE0 XL; los intercambiadores de anión débiles tales como DEAE SEPHAROSE Flujo Rápido; e intercambiadores de catión débiles tales como CM SEPHAROSE Flujo Rápido (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) . La cromatografía de columna de intercambio de catión puede realizarse en el polipéptido en cualquier etapa del proceso de purificación para aislar polipéptido substancialmente purificado. La etapa de cromatografía de intercambio de catión puede realizarse utilizando cualquier matriz de intercambio de catión adecuada. Las matrices de intercambio de catión útiles incluyen, pero no se limitan a, materiales de matriz de intercambio de catión fibrosas, porosas, no porosas, microgranulares, en perla, o degradadas. Tales materiales de matriz de intercambio de catión incluyen, pero no se limitan a, celulosa, agarosa, dextran, poliacrilato, polivinilo, poliestireno, sílice, poliéter, o compuestos de cualquiera de los anteriores. Después de la adsorción del polipéptido en la matriz de intercambio de catión, el polipéptido substancialmente purificado puede producirse al contactar la matriz con un regulador que tiene un pH suficientemente alto o intensidad iónica para desplazar el polipéptido de la matriz. Los reguladores adecuados para utilizarse en la elución de pH alto de polipéptido substancialemtne purificado incluyen, pero no se limitan a, reguladores de citrato, fosfato, formato, acetato, HEPES, y MES que varían en concentración de al menos aproximadamente 5 mM a al menos aproximadamente 100 mM. Cromatografía de Fase Inversa RP-HPLC puede realizarse para purificar proteínas siguiendo los protocolos adecuados que se conocen por aquellos de experiencia ordinaria en la materia. Ver, e.g., Pearson et al., ANAL BIOCHEM. (1982) 124:217-230 (1982); Rivier et al., J. CHROM. (1983) 268:112-119; Kunitani et al., J. CHROM. (1986) 359:391-402. RP-HPLC puede realizarse en el polipéptido hGH para aislar polipéptido hGH substancialmente purificado. En este aspecto, las resinas derivadas de sílice con funcionalidades de alquilo con una amplia variedad de longitudes, incluyendo, pero no limitándose a, resinas de al menos aproximadamente C3 a al menos aproximadamente C30, al menos aproximadamente C3 a al menos aproximadamente C20, o al menos aproximadamente C3 a al menos aproximadamente C?8, pueden utilizarse. Alternativamente, una resina polimérica puede utilizarse. Por ejemplo, la resina TosoHaas Amberchrome CGlOOOsd puede utilizarse, que es una resina de polímero de estireno. Las resinas poliméricas o ciano con una amplia variedad de longitudes de cadena de alquilo también pueden utilizarse. Además, la columna RP-HPLC puede enjugarse con un solvente tal como etanol . Un regulador de elución adecuado que contiene un agente formador de pares de ion y un modificador orgánico tales como metanol, isopropanol, tetrahidrofuran, acetonitrilo o etanol, puede utilizarse para producir el polipéptido de la columna RP-HPLC. Los agentes formadores de pares de ion más comúnmente utilizados incluyen, pero no se limitan a, ácido acético, ácido fórmico, ácido perclórico, ácido fosfórico, ácido trifluoroacético, ácido heptafluorobutírico, trietilamina, tetrametilamonio, tetrabutilamonio, acetato de trietilamonio. La elución puede realizarse utilizando uno o más gradientes o condiciones isocráticas, con condiciones de gradiente preferidas para reducir el tiempo de separación y disminuir el ancho máximo. Otro método incluye el uso de dos gradientes con diferentes rangos de concentración de solvente. Ejemplos de reguladores de elución adecuados para utilizarse en la presente pueden incluir, pero no se limitan a, acetato de amonio y soluciones de acetonitrilo. Técnicas de Purificación de Cromatografía de Interacción Hidrofóbica Cromatografía de interacción hidrofóbica (HIC) puede realizarse en el polipéptido. Ver generalmente HYDROPHOBIC INTERACTION CHROMATOGRAPHY HANDBOOK: PRINCIPLES AND METHODS (Cat. No. 18-1020-90, Amersham Biosciences (Piscataway, NJ) que se incorpora para referencia en la presente. Las matrices HIC pueden incluir, pero no se limitan a, matrices substituidas por arilo o alquilo, tales como matrices substituidas por butilo, hexilo, octilo o fenilo incluyendo agarosa, agarosa degradada, sefarosa, celulosa, sílice, dextran, poliestireno, matrices de poli (metacrilato) , y resinas de modo mezclado, incluyendo pero no limitándose a, resina de polietilenoamina o matriz de poli (metacrilato) substituida por fenilo o butilo. Las fuentes comercialmente disponibles para cromatografía de columna de interacción hidropónica incluyen, pero no se limitan a, columnas HITRAP , HIPREP®, y HILOAD® (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) . Brevemente, antes de la carga, la columna HIC puede equilibrarse utilizando reguladores estándar conocidos por aquellos de experiencia ordinaria en la materia, tales como una solución de cloruro de sodio/ácido acético o sulfato de amonio que contiene HEPES. Después de cargar el polipéptido, la columna puede entonces enjuagarse utilizando reguladores estándar y condiciones para remover materiales indeseados pero reteniendo el polipéptido en la columna HIC. El polipéptido puede eluirse con aproximadamente 3 a aproximadamente 10 volúmenes de columna de un regulador estándar, tales como un regulador HEPES que contiene EDTA y concentración de sulfato de amonio inferior que el regulador de equilibrio, o un regulador de cloruro de sodio/ácido acético, entre otros. Un gradiente de sal lineal decreciente utilizando, por ejemplo, un gradiente de fosfato de potasio, también puede utilizarse para eluir las moléculas. El eluyente puede entonces concentrarse, por ejemplo, por filtración tal como diafiltración o ultrafiltración. La diafiltración puede utilizarse para remover la sal utilizada para eluir el polipéptido hGH. Otras Técnicas de Purificación Todavía otra etapa de aislamiento utilizando, por ejemplo, filtración de gel (GEL FILTRATION: PRINCIPLES AND METHODS (Cat. No. 18-1022-18, Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) que se incorpora para referencia en la presente, HPLC, adsorción de lecho expandido, ultrafiltración, diafiltración, liofilización y lo similar, pueden realizarse en la primer mezcla de polipéptido hGH o cualquier mezcla subsiguiente de la misma, para remover cualquier exceso de sal y volver a colocar el regulador con un regulador adecuado para la siguiente etapa de aislamiento o aún formulación del producto de fármaco final. La producción de . polipéptido, incluyendo substancialmente polipéptido purificado, puede monitorearse en cada etapa descrita en la presente utilizando técnicas conocidas por aquellos de experiencia en la materia. Tales técnicas también pueden utilizarse para valorar la producción de polipéptido substancialmente purificado después de la última etapa de aislamiento. Por ejemplo, la producción de polipéptido puede monitorearse utilizando cualquiera de varias columnas de cromatografía líquida a alta presión de fase inversa, teniendo una variedad de longitudes de cadena de alquilo tales como ciano RP-HPLC, C?8RP-HPLC; así como también HPLC de intercambio de catión y HPLC de filtración de gel. La pureza debe determinarse utilizando técnicas estándar, tal como SDS-PAGE, o al medir polipéptido utilizando ensayos Western blot y ELISA. Por ejemplo, los anticuerpos policlonales pueden generarse contra proteínas aisladas de fermentación de levadura de control negativa y la recuperación de intercambio de catión. Los anticuerpos también pueden utilizarse para sondear la presencia de proteínas de célula huésped contaminantes. Material RP-HPLC Vydac C4 (Vydac) consiste de partículas de gel de sílice, las superficies de las cuales llevan cadenas de alquilo C4. La separación de polipéptido de las impurezas proteínicas se basa en diferencias en la intensidad de interacciones hidrofóbicas. La elución se realiza con un gradiente de acetonitrilo en ácido trifluoroacético diluido. HPLC preparativo se realiza utilizando una columna de acero inoxidable (llenada con 2.8 a 3.2 litros de gel de sílice Vydac C4) . El eluato de Ultrogel de Hidroxiapatita se acidifica al agregar ácido trifluoroacético y cargarse en la columna Vydac C4. Para enjuague y elución, se utiliza un gradiente de acetonitrilo en ácido trifluoroacétido diluido. Las fracciones se recolectan e inmediatamente se neutralizan con regulador de fosfató. Las fracciones de polipéptido que están dentro de los límites IPC se agrupan. El material de DEAE Sepharose (Pharmacia) consiste de grupos dietilaminoetil (DEAE) que se unen covalentemente a la superficie de perlas de Sepharose. La unión de polipéptido a los grupos DEAE se media por interacciones iónicas. El acetonitrilo y ácido trifluoroacético pasan a través de la columna sin retenerse. Después de que estas substancias se han enjuagado, las impurezas indicadoras se remueven al enjuagar la columna con regulador de acetato a un pH bajo. Entonces la columna se enjuaga con regulador de fosfato neutral y el polipéptido se eluye con un regulador con intensidad iónica incrementada. La columna se empaca con flujo rápido de DEAE Sepharose. El volumen de columna se ajusta para asegurar una carga de polipéptido en el rango de 3-10 mg polipéptido/ml gel. La columna se enjuaga con agua y regulador de equilibrio (fosfato de sodio/potasio) . Las fracciones agrupadas del eluato de HPLC se cargan y la columna se enjuaga con regulador de equilibrio. Entonces, la columna se enjuaga con regulador de enjuague (regulador de acetato de sodio) seguido por enjuague con regulador de equilibrio. Subsiguientemente, el polipéptido se eluye de la columna con regulador de elución (cloruro de sodio, fosfato de sodio/potasio) y se recolecta en una fracción única de acuerdo con el perfil de elución maestro. El eluato de la columna DEAE Sepharose se ajusta a la conductividad específica. La sustancia de fármaco resultante se filtra estéril en las botellas Teflon y se almacenan a -70°C. Una amplia variedad de métodos y procedimientos pueden utilizarse para valorar la producción y pureza de una proteína en uno o más aminoácidos codificados de manera no natural, incluyendo pero no limitándose a, ensayo Bradford, SDS-PAGE, SDS-PAGE color plata, SDS-PAGE color coomassie, espectrometría de masa (incluyendo pero no limitándose a, MALDI-TOF) y otros métodos para caracterizar las proteínas conocidas por un experto en la materia. VIII. Expresión en Sistemas Alternos Se ha descrito una variedad de sistemas de expresión alternativos, incluyendo pero no limitándose a aquellos descritos en la presente, para expresión de proteína recombinante en E. coli, y estos sistemas pueden utilizarse en el sistema de traducción de Pseudomonas de la presente invención en una manera análoga. Un método in vivo, denominado incorporación de presión selectiva, se desarrolla para explotar la promiscuidad de sintetasas tipo silvestre. Ver, e.g., N. Budisa, C. Minks, S. Alefelder, W. Wenger, F. M. Dong, L. Moroder y R. Huber, FASEB J . , 13:41 (1999). Una cepa auxotrófica, en la cual la trayectoria metabólica relevante que suministra la célula con un aminoácido natural particular se cambia, se desarrolla en medio mínimo conteniendo concentraciones limitadas del aminoácido natural, aunque se reprime la transcripción del gen objetivo. Al inicio de una fase de crecimiento estacionario, el aminoácido natural se elimina y reemplaza con el análogo de aminoácido codificado de manera no natural. La inducción de la expresión de la proteína recombinante resulta en la acumulación de una proteína que contiene el análogo no natural. Por ejemplo, utilizando esta estrategia, o, m y p-fluorofenilalaninas se han incorporado en proteínas, y muestran dos ramas características en el espectro UV que pueden identificarse fácilmente, ver, e.g., C. Minks, R. Huber, L. Moroder y N. Budisa, Anal . Biochem. , 284:29 (2000); trifluorometionina se ha utilizado para reemplazar metionina en lisozima T4 de bacteriófago para estudiar su interacción con ligandos de quitooligosacárido por 19F NMR, ver, e.g., H. Duewel, E. Daub, V. Robinson y J. F. Hunok, Biochemistry, 36:3404 (1997); y trifluoroleucina se ha incorporado en lugar de leucina, resultando en estabilidad química y térmica incrementada de una proteína de cierre de leucina. Ver, e.g., Y. Tang, G. Ghirlanda, W. A. Petka, T. Nakajima, W. F. DeGrado y D. A. Tirrell, Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 40:1494 (2001). Además, la selenometionina y telurometionina se incorporan en varias proteínas recombinantes para facilitar la solución de fases en cristalografía de rayos X. Ver, e.g., W. A. Hendrickson, J. R. Horton y D. M. Lemaster, EMBO J . , 9:1665 (1990); J. O. Boles, K. Lewinski, M. Kunkle, J. D. Odom, B. Dunlap, L. Lebioda y M. Hatada, Nat. Struct. Biol., 1 :283 (1994); N. Budisa, B. Steipe, P. Demange, C. Eckerskorn, J. Kellermann and R. Huber, Eur. J. Biochem. , 230:788 (1995); y, N. Budisa, W. Karnbrock, S. Steinbacher, A. Humm, L. Prade, T.

Neuefeind, L. Moroder y R. Huber, J. Mol . Biol . , 270:616 (1997) . Los análogos de metionina con funcionalidades de alquino y alqueno también se han incorporado de manera eficiente, permitiendo la modificación adicional de proteínas por medios químicos. Ver, e.g., J. C. M. vanHest y D. A. Tirrell, FEBS Lett . , 428:68 (1998); J. C. M. van Hest, K. L. Kiick y D. A. Tirrell, J. Am. Chem. Soc. 122:1282 (2000); y, K. L. Kiick y D. A. Tirrell, Tetrahedron, 56:9487 (2000); Patente de E.U. No. 6,586,207; Patente de E.U. Publicación 2002/0042097, que se incorporan para referencia en la presente . El éxito de este método depende del reconocimiento de los análogos de aminoácido codificado de manera no natural por sintetasas aminoacil tARN, que, en general, requieren alta selectividad para asegurar la fidelidad de traducción de proteína. Una manera de expandir el alcance de este método es relajar la especificidad de substrato de sintetasas aminoacil tARNs, que, se ha logrado en un número limitado de casos. Por ejemplo, el reemplazo de Ala294 por Gly en sintetasas fenilalanil tARN Escherichia coli (PheRS) incrementa el tamaño de la cavidad de unión a substrato, y resulta en la acilación de tARNPhe por p-Cl-fenilalanina (p-Cl-Phe) . Ver, M. Ibba, P. Kast and H. Hennecke, Biochemistry, 33:7107 (1994) . Una cepa de Escherichia coli que aloja este PheRS mutante permite la incorporación de p-Cl-fenilalanina o p-Br-fenilalanina en lugar de fenilalanina. Ver, e.g., M. Ibba and H. Hennecke, FEBS Lett . , 364:272 (1995); y, N. Sharma, R. Furter, P. Kast and D. A. Tirrell, FEBS Lett. , 467:37 (2000). De manera similar, se muestra que una mutación puntual de Phel30Ser cercana al sitio de unión de aminoácido de sintetasa tirosil tARN Escherichia coli permite que la azatirosina se incorpore de manera más eficiente que tirosina. Ver, F. Hamano-Takaku, T. Iwama, S. Saito-Yano, K.

Takaku, Y. Monden, M. Kitabatake, D. Solí and S. Nishimura, J. Biol. Chem., 275:40324 (2000). Otra estrategia para incorporar aminoácidos codificados de manera no natural en proteínas in vivo es para modificar las sintetasas que tienen mecanismos a prueba de lectura. Estas sintetasas no pueden discriminarse y por lo tanto activan los aminoácidos que son estructuralmente similares a los aminoácidos naturales cognados. Este error se corrige en un sitio separado, que deacila el aminoácido mal cargado del tARN para mantener la fidelidad de la traducción de proteína. Si la actividad a prueba de lectura de la sintetasa se deshabilita, los análogos estructurales que no se activan bien pueden escapar de la función de edición e incorporarse. Este planteamiento se ha demostrado recientemente con la sintetasa vailil tAR? (ValRS) . Ver, V.

Doring, H. D. Mootz, L. A. ?angle, T. L. Hendrickson, V. de Crecy-Lagard, P. Schimmel and P. Marliere, Science, 292:501 (2001) . ValRS puede carecer de aminoacilato Tarn Val con Cys, Thr, o aminobutirate (Abu) ; estos aminoácidos no cognados se hidrolizan subsiguientemente por el dominio de edición. Después de la mutagénesis aleatoria del cromosoma de Escherichia coli , una cepa de Escherichia coli mutante se selecciona, la cual tiene una mutación en el sitio de edición de ValRs . Este ValRS defectuoso en edición carga de manera incorrecta tAR? Val con Cys. Debido a que Abu se parece estéricamente a Cys (grupo -SH grupo de Cys se reemplaza con -CH3 en Abu) , ValRS mutante también incorpora Abu en proteínas cuando esta cepa de Escherichia coli mutante se desarrolla en la presencia de Abu. Análisis espectromético de masa muestra que aproximadamente 24% de valinas se reemplazan por Aby en cada posición valina en la proteína nativa. Previamente, se ha mostrado que los aminoácidos codificados de manera no natural pueden incorporarse específicamente en sitio en proteínas in vi tro por la adición de tARNs supresores químicamente aminoacilados a las reacciones de síntesis de proteína programadas con un gen que contiene una mutación no sentido ámbar deseada. Utilizando estos planteamientos, uno puede substituir un número de los veinte aminoácidos comunes con homólogos estructurales cerrados, e.g., fluorofenilalanina para fenilalanina, utilizando cepas auxotrópicas para un aminoácido particular. Ver, e.g., Noren, C. J. , Anthony-Cahill, Griffith, M.C., Schultz, P.G. A general method for si te-specific incorporation of non-naturally encoded amino acids into proteins, Science, 244: 182-188 (1989); M. W. Nowak, et al., Science 268:439-42 (1995); Bain, J.D., Glabe, C.G., Dix, T.A. , Chamberlin, A.R., Diala, E.S. Biosynthetic si te-specific Incorporation of a non-natural amino acid into a polypeptide, J. Am Chem Soc, 111:8013-8014 (1989); N. Budisa et al., FASEB J. 13:41-51 (1999); Ellman, J.A., Mendel, D., Anthony-Cahill, S., Noren, C J., Schultz, P.G. Biosynt etic method for introducing non-naturally encoged amino acids si te-specifically into proteins, Methods in Enz., 301-336 (1992); y, Mendel, D., Cornish, V.W. & Schultz, P.G. Si te-Directed Mutagenesis wi th an Expanded Genetic Code, Annu Rev Biophys. Biomol Struct. 24, 435-62 (1995) . Por ejemplo, un tARN supresor se prepara, el cual reconoce el codón de detención UAG y se aminoacila químicamente con un aminoácido codificado de manera no natural. La mutagénesis digerida en sitio convencional se utiliza para introducir el codón de detención TAG, en el sitio de interés en el gen de proteína. Ver, e.g., Sayers, J.R., Schmidt, W. Eckstein, F. 5', 3' Exonuclease in phosphorothioate -based olignoucleotide-directed mutagensis, Nucleic Acids Res, 16 (3) : 791-802 (1988). Cuando el tARN supresor acilado y el gen mutante se combinan en un sistema de transcripción/traducción in vi tro, el aminoácido codificado de manera no natural se incorpora en respuesta al codón UAG que dio una proteína que contiene ese aminoácido en la posición especificada. Los experimentos utilizando [3H] -Phe y experimentos con ácidos a-hidroxi demostraron que solamente el aminoácido deseado se incorpora en la posición especificada por el codón UAG y que este aminoácido no se incorpora en ningún otro sitio en la proteína. Ver, e.g., Noren, et al, supra; Kobayashi et al., (2003) Nature Structural Biology 10 (6) :425-432 ; y, Ellman, J. A., Mendel, D., Schultz, P.G. Si te-specific incorporatión of novel backbone structures into proteins, Science, 255 (5041) : 197-200 (1992) . La capacidad de incorporar aminoácidos codificados de manera no natural directamente en proteínas in vivo ofrece las ventajas de altas producciones de proteínas mutantes, facilidad técnica, el potencial para estudiar las proteínas mutantes en células o posiblemente en organismos vivos y el uso de estas proteínas mutantes en tratamientos terapéuticos. La capacidad de incluir aminoácidos codificados de manera no natural con varios tamaños, acidez, nucleofilicidades, hidrofobicidades, y otras propiedades en proteínas puede expandir grandemente nuestra capacidad para manipular racional y sistémicamente las estructuras de proteínas, tanto para sondear la función de la proteína como crear nuevas proteínas u organismos con nuevas propiedades. Sin embargo, el proceso es difícil, debido a la naturaleza compleja de interacciones de sintetasas tARN que se requieren para lograr un alto grado de fidelidad en la traducción de la proteína. En un intento por incorporar de manera específica en sitio para-F-Phe, un par de tARNPheCUA/sintetasa fenilalanil tARN supresor se utiliza en una cepa de Eschericihia coli auxotrófica Phe, resistente a p-F-Phe. Ver, e.g., R. Furter, Protein Sci . , 7:419 (1998).

También puede ser posible obtener expresión de un polinucleótido de la presente invención utilizando un sistema de traducción libre de célula ( in vi tro) . En estos sistemas, que pueden incluir ya sea mARN como un templado (traducción in vi tro) o ADN como un templado (transcripción y traducción in vi tro combinadas), la síntesis in vi tro se dirige por las ribosomas. Se ha aplicado un esfuerzo considerable al desarrollo de sistemas de expresión de proteína libre de célula. Ver, e.g., Kim, D.-M. and J.R. Swartz, Biotechnology and Bioengineering, IA:309~316 (2001); Kim, D.- M. and J.R.

Swartz, Biotechnology Letters, 22, 1537-1542, (2000); Kim, D.-M., and J.R. Swartz, Biotechnology Progress, 16, 385-390, (2000); Kim, D.-M., and J.R. Swartz, Biotechnology and Bioengineering, 66, 180-188, (1999); y Patnaik, R. and J.R. Swartz, Biotechniques 24, 862-868, (1998); Patente de E.U. No. 6,337,191; Publicación de Patente de E.U. No. 2002/0081660; WO 00/55353; WO 90/05785, que se incorporan para referencia en la presente. Otro planteamiento que puede aplicarse a la expresión de polipéptidos que comprenden un aminoácido codificado de manera no natural incluye la técnica de fusión de mARN-péptido. Ver, e.g., R. Roberts and J. Szostak, Proc . Nati Acad . Sci (USA) 94:12297-12302 (1997); A. Frankel, et al , Chemistry & Biology 10:1043-1050 (2003). En este planteamiento, un templado de mARN enlazado a puromicina se traduce en péptido en el ribosoma. Si uno o más moléculas tARN se han modificado, los aminoácidos no naturales pueden incorporarse en el péptido también. Después de que el último codón mARN se ha leído, purmocina captura el término C del péptido. Si el conjugado de mARN-péptido resultante se encuentra que tiene propiedades interesantes en un ensayo in vi tro, su identidad puede revelarse fácilmente de la secuencia mARN. De esta manera, uno puede seleccionar bibliotecas de polipéptidos que comprenden uno o más aminoácidos codificados de manera no natural para identificar polipéptidos que tienen propiedades deseadas. Más recientemente, las traducciones de ribosima in vi tro con componentes purificados se han reportado, lo que permite la síntesis de péptidos substituidos con aminoácidos codificados de manera no natural. Ver, e.g., A. Forster et al, Proc . Nati Acad . Sci . (USA) 100:6353 (2003). IX. Polímeros Macromoleculares Acoplados a Polipéptidos Varias modificaciones a los polipéptidos de aminoácido no natural descritos aquí pueden efectuarse utilizando las composiciones, métodos, técnicas y estrategias descritas en la presente. Estas modificaciones incluyen la incorporación de funcionalidad adicional sobre el componente de aminoácido no natural del polipéptido, incluyendo pero no limitándose a, una etiqueta; un tinte; un polímero; un polímero soluble en agua; un derivado de glicol de polietileno; un fotoreticulador ; un compuesto citotóxico; un fármaco; una etiqueta de afinidad; una etiqueta de fotoafinidad; un compuesto reactivo; una resina; una segunda proteína o polipéptido o análogo de polipéptido; un anticuerpo o fragmento de anticuerpo; un quelador de metal; un cofactor; un ácido graso; un carbohidrato; un polinucleótido; un ADN; un ARN; un polinucleótido antisentido; un ácido ribonucleico inhibidor; un biomaterial; una nanopartícula; una etiqueta de giro; un fluoroforo, un residuo que contiene metal; un residuo radioactivo; un nuevo grupo funcional; un grupo que interactúa covalente o no covalentemente con otras moléculas; un residuo fotoguardado; un residuo fotoisomerizable; biotina; un derivado de biotina; un análogo de biotina; un residuo que incorpora un átomo pesado; un grupo químicamente desdoblable; un grupo fotodesdoblable; una cadena lateral alargada; un azúcar enlazada a carbono; un agente activo redox; un tioácido amino; un residuo tóxico; un residuo isotópicamente etiquetado; una sonda biofísica; un grupo fosforescente; un grupo quimioluminescentee; un grupo denso de electrón; un grupo magnético; un grupo intercalador; un cromóforo; un agente de transferencia de energía; un agente biológicamente activo; una etiqueta detectable; una molécula pequeña; o cualquier combinación de lo anterior, o cualquier otro compuesto o sustancia deseable. Como un ejemplo ilustrativo, no limitante de las composiciones, métodos, técnicas y estrategias descritas en la presente, la siguiente descripción se enfocará en agregar polímeros macromoleculares al polipéptido de aminoácido no natural con el entendimiento de que las composiciones, métodos, técnicas y estrategias descritas en la misma también se aplican (con modificaciones apropiadas, si es necesario y las cuales un experto en la materia podría hacer con la descripción en la presente) para agregar otras funcionalidades, incluyendo pero no limitándose a aquellos listados arriba. Una amplia variedad de polímeros macromoleculares y otras moléculas puede enlazarse a polipéptidos de la presente invención para modular las propiedades biológicas del polipéptido, y/o proporcionar nuevas propiedades biológicas a la molécula. Estos polímeros macromoleculares pueden enlazarse al polipéptido a través de un aminoácido codificado de manera natural, a través de un aminoácido codificado de manera no natural, o cualquier substituyente de un aminoácido natural o no natural, o cualquier substituyente o grupo funcional agregado al aminoácido natural o no natural. La presente invención proporciona preparaciones substancialmente homogéneas de conjugados de polímero :proteína. "Substancialmente homogéneas" como se utiliza en la presente significa que se observa que las moléculas de conjugado de polímero: proteína son mayores a la mitad de la proteína total. El conjugado de polímero : proteína tiene actividad biológica y las presentes preparaciones de polipéptido PEGilado "substancialmente homogéneas" proporcionadas en la presente son aquellas que son lo suficientemente homogéneas para desplegar las ventajas de una preparación homogénea, e.g., facilidad en la aplicación clínica en predicción de farmacocinéticas de lote en lote. Uno puede elegir preparar una mezcla de moléculas de conjugado de polímero: proteína, y la ventaja proporcionada en la presente es que uno puede seleccionar la proporción de conjugado de monopolímero ¡proteína para incluir en la mezcla. De esta manera, si se desea, uno puede preparar una mezcla de varias proteínas con varios números de residuos de polímero unidos (i.e., di-, tri-, tetra-, etc.) y combinar dichos conjugados con conjugado de monopolímero :proteína preparado utilizando los métodos de la presente invención, y tienen una mezcla con una proporción predeterminada de conjugados de polímero :proteína . El polímero seleccionado puede ser soluble en agua de manera que la proteína a la cual se une no se precipita en un ambiente acuoso, tal como un ambiente fisiológico. El polímero puede ramificarse o no ramificarse. Preferentemente, para uso terapéutico de la preparación de producto final, el polímero será farmacéuticamente aceptable. La proporción de moléculas de glicol de polietileno a moléculas de proteína variará, como lo harán sus concentraciones en la mezcla de reacción. En general, la proporción óptima (en términos de eficiencia de reacción en que hay exceso mínimo de polímero o proteína sin reaccionar) puede determinarse por el peso molecular del glicol de polietileno seleccionado y en el número de grupos reactivos disponibles. En lo que se refiere al peso molecular, típicamente mientras más alto sea el peso molecular del polímero, menor será el número de moléculas de polímero que pueden unirse a la proteína. De manera similar, la ramificación del polímero debe tomarse en cuenta cuando se perfeccionan estos parámetros. Generalmente, mientras más alto sea el peso moelcular (o más ramificaciones) más alta será la proporción de polímero : proteína . El polímero soluble en agua puede ser cualquier forma estructural que incluye pero no se limita a, lineal, en temedor o ramificada. Típicamente, el polímero soluble en agua es un poli (glicol de alquileno) , tal como poli (glicol de etileno) (PEG) , pero otros polímeros solubles en agua también pueden emplearse. A manera de ejemplo, PEG se utiliza para describir ciertas modalidades de esta invención, PEG es un polímero soluble en agua, bien conocido que está comercialmente disponible o puede prepararse por polimerización de abertura de anillo de glicol de etileno de acuerdo a los métodos bien conocidos en la materia (Sandier and Karo, Polymer Synthesi s, Academic Press, New York, Vol. 3, páginas 138-161). El término "PEG" se utiliza ampliamente para comprender cualquier molécula de glicol de polietileno, sin considerar el tamaño o modificación en un extremo de PEG, y puede representarse como enlazada al polipéptido hGH por la fórmula: XO- (CH2CH20)n-CH2CH2-Y donde n es 2 a 10,000 y X es H o una modificación terminal, incluyendo pero no limitándose a, un alquilo C?_4. En algunos casos, un PEG utilizado en la invención termina en un extremo con hidroxi o metoxi, i.e., X es H o CH3 ("metoxi PEG") . Alternativamente, PEG puede terminar con un grupo reactivo, formando así un polímero bifuncional. Grupos reactivos típicos pueden incluir aquellos grupos reactivos que se utilizan comúnmente para reaccionar con los grupos funcionales encontrados en los 20 aminoácidos comunes (incluyendo pero no limitándose a, grupos maleimida, carbonatos activados (incluyendo pero no limitándose a, p-nitrofenil éster) , esteres activados (incluyendo pero no limitándose a, N-hidroxisuccinimida, p-nitrofenil éster) y aldehidos) así como también grupos funcionales que son inertes a los 20 aminoácidos comunes pero que reaccionan específicamente con grupos funcionales complementarios presentes en aminoácidos codificados de manera no natural (incluyendo pero no limitándose a, grupos azida, grupos alquino) . Se observa que el otro extremo de PEG, que se muestra en la fórmula anterior por Y, se unirá ya sea directa o indirectamente a un polipéptido a través de aminoácido codificado de manera no natural o que ocurre de manera natural. Por ejemplo, Y puede ser un enlace de amida, carbamato o urea a un grupo amina (incluyendo pero no limitándose a, la amina epsilon de lisina o el término N) del polipéptido. Alternativamente, Y puede ser un enlace de maleimida a un grupo tiol (incluyendo pero no limitándose a, el grupo tiol de cisteína) . Alternativamente, Y puede ser un enlace a un residuo no comúnmente accesible a través de los 20 aminoácidos comunes. Por ejemplo, un grupo azida en PEG puede reaccionarse con un grupo alquino en el polipéptido para formar un producto de cicloadición Huisgen [3+2] . Alternativamente, un grupo alquino en PEG puede reaccionarse con un grupo azida presente en un aminoácido codificado de manera no natural para formar un producto similar. En algunas modalidades, un nucleófilo fuerte (incluyendo pero no limitándose a, hidrazina, hidrazida, hidroxilamina, semicarbazida) puede reaccionarse con un grupo aldehido o cetona presente en un aminoácido codificado de manera no natural para formar una hidrazona, oxima o semicarbazida, según sea aplicable, que en algunos casos puede reducirse además por tratamiento con un agente reductor apropiado. Alternativamente, el nucleófilo fuerte puede incorporarse en el polipéptido a través de un aminoácido codificado de manera no natural y se utiliza para reaccionar preferentemente con un grupo cetona o aldehido presente en el polímero soluble en agua. Cualquier masa molecular para PEG puede utilizarse según se desee prácticamente, incluyendo pero no limitándose a, de aproximadamente 100 Daltons (Da) a 100,000 Da o más según se desee (incluyendo pero no limitándose a, algunas veces 0.1-50 kDa o 10-40 kDa). PEGs de cadena ramificada, incluyendo pero no limitándose a, moléculas PEG con cada cadena teniendo un MW que varía de 1-100 kDa (incluyendo pero no limitándose a, 1-50 kDa o 5-20 kDa) también puede utilizarse. Un amplio rango de moléculas PEG se describen en, incluyendo pero no limitándose al catálogo de Shearwater Polymers, Inc., catálogo de Nektar Therapeutics, incorporados en la presente para referencia. Generalmente, al menos un término de la molécula PEG está disponible para reacción con el aminoácido codificado de manera no natural. Por ejemplo, los derivados PEG que llevan residuos alquino y azida para reacción con cadenas laterales de aminoácido pueden utilizarse para unir PEG a aminoácidos codificados de manera no natural como se describe en la presente. Si el aminoácido codificado de manera no natural comprende una azida, entonces PEG típicamente contendrá ya sea un residuo alquino para efectuar la formación del producto de cicloadición [3+2] o una especie PEG activada (i.e., éster, carbonato) que contiene un grupo fosfina, para efectuar la formación del enlace de amida. Alternativamente, si el aminoácido codificado de manera no natural comprende un alquino, entonces PEG típicamente contendrá un residuo azida para efectuar la formación del producto de cicloadición [3+2] Huisgen. Si el aminoácido codificado de manera no natural comprende un grupo carbonilo, PEG típicamente comprenderá un nucleofilo potente (incluyendo pero no limitándose a, una funcionalidad de hidrazida, hidrazina, hidroxilamina, o semicarbazida) para efectuar la formación de enlaces de hidrazona, oxima, y semicarbazida, respectivamente. En otras alternativas, una inversión de la orientación de los grupos reactivos descritos arriba puede utilizarse, i.e., un residuo azida el aminoácido codificado de manera no natural puede reaccionarse con un derivado de PEG que contiene un alquino. En algunas modalidades, el polipéptido con un derivado de PEG contiene una funcionalidad química que es reactiva con la funcionalidad química presente en la cadena lateral del aminoácido codificado de manera no natural. La invención proporciona en algunas modalidades derivados de polímero que contienen azida y acetileno que comprenden una estructura de polímero soluble en agua que tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 800 Da a aproximadamente 100,000 Da. La estructura de polímero del polímero soluble en agua puede ser poli (glicol de etileno) . Sin embargo, debe entenderse que una amplia variedad de polímeros solubles en agua incluyendo pero no limitándose a poli (etileno) glicol y otros polímeros relacionados, incluyendo poli (dextran) y poli (glicol de propileno) , también son adecuados para utilizarse en la practica de esta invención y que el uso del término PEG o poli (glicol de etileno) se propone comprender e incluir todas las moléculas. El término PEG incluye, pero no se limita a, poli (glicol de etileno) en cualquiera de sus formas, incluyendo PEG bifuncional, PEG con múltiples brazos, PEG derivado, PEG en tenedor, PEG ramificado, PEG pendiente (i.e. PEG o polímeros relacionados que tienen uno o más grupos funcionales pendientes a la estructura de polímero) , o PEG con enlaces degradables en el mismo. PEG es típicamente claro, sin color, sin olor, soluble en agua, estable en calor, inerte a muchos agentes químicos, no se hidroliza o deteriora, y generalmente no es tóxico. Poli (glicol de etileno) se considera que es biocompatible, es decir, que el PEG es capaz de coexistir con organismos o tejidos vivos sin causar daño. Más específicamente, PEG es substancialmente no inmunogénico, es decir, que PEG no tiende a producir una respuesta inmune en el cuerpo. Cuando se une a una molécula que tiene alguna función deseable en el cuerpo, tal como un agente biológicamente activo, PEG tiende a ocultar el agente y puede reducir o eliminar una respuesta inmune de manera que un organismo puede tolerar la presencia del agente. Los conjugados PEG tienden a no producir una respuesta inmune substancial o causar coagulación u otros efectos indeseables. PEG que tiene la fórmula -CH2CH20-- (CH2CH20) n--CH2CH2-- , donde n es de aproximadamente 3 a aproximadamente 4000, típicamente de aproximadamente 20 a aproximadamente 2000, es adecuado para utilizarse en la presente invención. PEG que tiene un peso molecular de aproximadamente 800 Da a aproximadamente 100,000 Da son, en algunas modalidades de la presente invención particularmente útiles como la estructura de polímero. La estructura de polímero puede ser lineal o ramificada. Las estructuras de polímero ramificadas generalmente se conocen en la materia. Típicamente, un polímero ramificado tiene un residuo de núcleo de ramificación central y una pluralidad de cadenas de polímero lineales al núcleo de ramificación central. PEG se utiliza comúnmente en formas ramificadas que pueden prepararse por adición de óxido de etileno en varios polioles, tales como glicerol, oligómeros de glicerol, pentaeritritol y sorbitol. El residuo de ramificación central puede también derivarse de varios aminoácidos, tales como lisina. El poli (glicol de etileno) ramificado puede representarse en la forma general como R(-PEG-OH)m en la cual R se deriva de una residuo de núcleo, tal como glicerol, oligómeros de glicerol, o pentaeritritol, y m representa el número de brazos. Moléculas PEG de múltiples brazos, tales como aquellas descritas en las Pats. de E.U. Nos. 5,932,462, 5,643,575; 5,229,490; 4,289,872; Sol. de Pat. de E.U. 2003/0143596; WO 96/21469; y WO 93/21259, cada una de las cuales se incorpora para referencia en la presente en su totalidad, también puede utilizarse como la estructura de polímero. PEG ramificado también puede estar en la forma de un PEG en tenedor representado por PEG ( - -YCHZ2) n, donde Y es un grupo de enlace y Z es un grupo terminal activado enlazado a CH por una cadena de átomos de longitud definida. Todavía otra forma ramificada, PEG pendiente, tiene grupos reactivos, tales como carboxilo, a lo largo de la estructura PEG en lugar de al final de las cadenas PEG. Además de estas formas de PEG, el polímero también puede prepararse con enlaces degradables o débiles en la estructura. Por ejemplo, PEG puede prepararse con enlaces de éster en la estructura de polímero que están sujetos a hidrólisis. Como se muestra abajo, esta hidrólisis resulta en segmentación del polímero en fragmentos de peso molecular inferior : -PEG-C02-PEG-+H20 -> PEG-C02H+HO-PEG- Se entiende por aquellos expertos en la materia que el término poli (glicol de etileno) o PEG representa o incluye todas las formas conocidas en la materia que incluyen pero no se limitan a aquellas descritas en la presente. Muchos otros polímeros también son adecuados para utilizarse en la presente invención. En algunas modalidades, las estructuras de polímero que son solubles en agua, con de 2 a aproximadamente 300 términos, son particularmente útiles en la invención. Ejemplos de polímeros adecuados incluyen, pero no se limitan a, otros poli (glicoles de alquileno), tales como poli (glicol de propileno) ("PPG"), copolímeros de los mismos (incluyendo pero no limitándose a copolímeros de glicol de etileno y glicol de propileno) , terpolímeros de los mismos, mezclas de los mismos, y lo similar. Aunque el peso molecular de cada cadena de la estructura de polímero puede variar, típicamente está en el rango de desde aproximadamente 800 Da a aproximadamente 100,000 Da, con frecuencia de aproximadamente 6,000 Da a aproximadamente 80,000 Da. Aquellos de experiencia ordinaria en la materia reconocerán que la lista anterior para estructuras substancialmente solubles en agua no es de ninguna manera exhaustiva y es meramente ilustrativa, y que todos los materiales poliméricos que tienen las cualidades descritas arriba se contemplan como siendo adecuados para utilizarse en la presente invención. En algunas modalidades de la presente invención los derivados de polímero son "multifuncionales" , lo que significa que la estructura de polímero tiene al menos dos términos, y posiblemente tantos como aproximadamente 300 términos, funcionalizados o activados con un grupo funcional. Los derivados de polímero multifuncionales incluyen, pero no se limitan a, polímeros lineales que tienen dos términos, cada término uniéndose a un grupo funcional que puede ser el mismo o diferente. En una modalidad, el derivado de polímero tiene la estructura: X-A-POLI-B-N=N=N en donde: N=N=N es un residuo azida; B es un residuo de enlace, que puede estar presente o ausente; POLI es un polímero no antigénico soluble en agua; A es un residuo de enlace, que puede estar presente o ausente y que puede ser el mismo que B o diferente; y X es un segundo grupo funcional . Ejemplos de un residuo de enlace para A y B incluyen, pero no se limitan a, un grupo alquilo multifuncional que contiene hasta 18, y más preferentemente entre 1-10 átomos de carbono. Un heteroátomo tal como nitrógeno, oxígeno o azufre puede estar incluido con la cadena de alquilo. La cadena de alquilo también puede ramificarse en un heteroátomo. Otros ejemplos de un residuo de enlace para A y B incluyen, pero no se limitan a, un grupo arilo multifuncional, que contiene hasta 10 y más preferentemente 5-6 átomos de carbono. El grupo arilo puede estar substituido con uno más átomos de carbono, átomos de nitrógeno, oxígeno o azufre. Otros ejemplos de grupos de enlace adecuados incluyen aquellos grupos de enlace descritos en Pat. de E.U. Nos. 5,932,462; 5,643,575; y Publicación de Sol. de Pat. de E.U. 2003/0143596, cada uno de los cuales se incorpora para referencia en la presente. Aquellos de experiencia ordinaria en la materia reconocerán que la lista anterior para residuos de enlace no es de ninguna manera exhaustiva y es meramente ilustrativa, y que todos los residuos de enlace que tienen las cualidades descritas arriba se contemplan para ser adecuados para utilizarse en la presente invención. Ejemplos de grupos funcionales adecuados para utilizarse como X incluyen, pero no se limitan a, hidróxilo, hidrófilo protegido, alcoxilo, éster activo, tal como N-hidroxisuccinimidil esteres y 1-benzotriazolil esteres, carbonato activo, tales como carbonatos de N-hidroxisuccinimidil y carbonatos de 1-benzotriazolil, acetal, aldehido, hidratos de aldehido, alquenilo, acrilato, metacrilato, acrilamida, sulfona activa, amina, aminooxi, amina protegida, hidrazida, hidrazida protegida, tiol protegido, ácido carboxílico, ácido carboxílico protegido, isocianato, isotiocianato, maleimida, vinilsulfona, ditiopiridina, vinilpiridina, yodoacetamida, epóxido, glioxals, dionas, mesilatos, tosilatos, tresilato, alqueno, cetona, y azida. Como se entiende por aquellos expertos en la materia, el residuo X seleccionado debe ser compatible con el grupo azida de manera que la reacción con el grupo azida no ocurre. Los derivados de polímero que contienen azida pueden homobifuncionales, lo que significa que el segundo grupo funcional (i.e., X) también es un residuo azida, o heterobifuncional, lo que significa que el segundo grupo funcional es un grupo funcional diferente. El término "protegido" se refiere a la presencia de un residuo o grupo protector que previene la reacción del grupo funcional químicamente reactivo bajo ciertas condiciones de reacción. El grupo protector variará dependiendo del tipo de grupo químicamente reactivo que se protege. Por ejemplo, si el grupo químicamente reactivo es una amina o una hidrazida, el grupo protector puede seleccionarse del grupo de tert-butiloxicarbonil (t-Boc) y 9-fluorenilmetoxicarbonil (Fmoc) . Si el grupo químicamente reactivo es un tiol, el grupo protector puede ser ortopiridildisulfuro. Si el grupo químicamente reactivo es un ácido carboxílico, tal como ácido propiónico o butanóico, o un grupo hidroxilo, el grupo protector puede ser bencilo o un grupo alquilo tal como metilo, etilo, o tert-butilo. Otros grupos protectores conocidos en la materia también pueden utilizarse en la presente invención. Los ejemplos específicos de grupos funcionales terminales en la literatura incluyen, pero no se limitan a, carbonato de N-succinimidilo (ver e.g., Pats. de E.U. Nos. 5,281,698, 5,468,478), amina (ver, e.g., Buckmann et al. Makromol. Chem. 182:1379 (1981), Zaplipsky et al. Eur. Polym. J. 19:1177 (1983)), hidrazida (Ver, e.g., Andresz et al. Makromol. Chem. 179:301 (1978)), propionate de succinimilo y butanoato de succinimidilo (ver, e.g., Olson et al. en Poly (ethylene glycol) Chemistry & Biological Applications, pp 170-181, Harris & Zaplipsky Eds., ACS, Washington, D. C, 1997; ver también Pat. de E.U. No .5 , 672 , 662) , succinato de succinimidilo (Ver, e.g., Abuchowski et al. Cáncer Biochem. Biophys. 7:175 (1984) y Joppich et al. Macrolol . Chem. 180:1381 (1979), éster de succinimidilo (ver, e.g., Pat. de E.U. No .4 , 670 , 417) , carbonato de benzotriazola (ver, e.g., Pat. de E.U. No.5 , 650 , 234) , éter de glicidilo (ver, e.g., Pitha et al. Eur. J Biochem. 94:11 (1979), Elling et al., Biotech. Appl. Biochem. 13:354 (1991), oxicarbonilimidazola (ver, e.g., Beauchamp, et al., Anal. Biochem. 131:25 (1983), Tondelli et al. J. Controlled Reléase 1:251 (1985)), carbonato de p-nitrofenilo (ver, e.g., Verunose, et al., Appl. Biochem. Biotech., 11: 141 (1985); y Sartore et al., Appl. Biochem. Biotech., 27:45 (1991)), aldehido (ver, e.g., Harris et al. J. Polym. Sci. Chem. Ed. 22:341 (1984), Pat. de E.U. No.5, 824, 784, Pat. de E.U. No .5 , 252 , 714) , maleimida (ver, e.g., Goodson et al. Bio/Technology 8:343 (1990), Romani et al. in Chemistry of Peptides and Proteins 2:29 (1984)), y Kogan, Synthetic Comm. 22:2417 (1992)), disulfuro de ortopiridilo (ver, e.g., Woghiren, et al. Bioconj. Chem. 4:314(1993)), acrilol (ver, e.g., Sawhney et al., Macromolecules, 26:581 (1993)), vinilsulfona (ver, e.g., Pat. de E.U. No.5, 900 , 461) . Todas las referencias anteriores y patentes se incorporan en la presente para referencia. En ciertas modalidades de la presente invención, los derivados de polímero de la invención comprenden una estructura de polímero que tiene la estructura: X-CH2CH20-- (CH2CH20)n--CH2CH2 -N=N=N en donde: X es un grupo funcional como se describe arriba; y n es aproximadamente 20 a aproximadamente 4000. En otra modalidad, los derivados de polímero de la invención comprenden una estructura de polímero que tiene la estructura: X-CH2CH20-- (CH2CH20)n--CH2CH2-0- (CH2) m-W-N=N=N en donde : W es un residuo enlazador aromático o alifático que comprende entre 1-10 átomos de carbono; n es aproximadamente 20 a aproximadamente 4000; y X es un grupo funcional como se describe arriba, m es entre 1 y 10. Los derivados de PEG que contienen azida de la invención pueden prepararse por una variedad de métodos conocidos en la materia y/o describirse en la presente. En un método, mostrado abajo, una estructura de polímero soluble en agua que tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 800 Da a aproximadamente 100,000 Da, la estructura de polímero teniendo un primer término unido a un primer grupo funcional y un segundo término unido a un grupo saliente adecuado, se reacciona con un anión azida (que puede emparejarse con cualquiera de un número de contraiones adecuados, incluyendo sodio, potasio, tert-butilamonio y así sucesivamente) . El grupo saliente experimenta un desplazamiento nucleofílico y se reemplaza por el residuo azida, proporcionando el polímero PEG que contiene azida deseado . X-PEG-L + NJ ? X-PEG- ?3 Como se muestra, una estructura de polímero adecuada para utilizarse en la presente invención tiene la fórmula X-PEG-L, en donde PEG es poli (glicol de etileno) y X es un grupo funcional que no reacciona con grupos azida y L es un grupo saliente adecuado. Ejemplos de grupos funcionales adecuados incluyen, pero no se limitan a, hidróxilo, hidróxilo protegido, acetal, alquenilo, amina, aminooxi, amina protegida, hidrazida protegida, tiol protegido, ácido carboxílico, ácido carboxílico protegido, maleimida, ditiopiridina, y vinilpiridina, y cetona. Ejemplos de grupos salientes adecuados incluyen, pero no se limitan a, cloruro, bromuro, yoduro, mesilato, tresilato, y tosilato. En otro método para la preparación de los derivados de polímero que contienen azida de la presente invención, un agente de enlace que lleva una funcionalidad de azida se contacta con una estructura de polímero soluble en agua que tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 800 Da a aproximadamente 100,000 Da, en donde el agente de enlace lleva una funcionalidad química que reaccionará selectivamente con una funcionalidad química en el polímero PEG, para formar un producto derivado de polímero que contiene azida en donde la azida se separa de la estructura de polímero por un grupo de enlace. Un esquema de reacción ejemplificativo se muestra abajo : X-PEG-M+N-enlazador-N=N=N?PG-X-PEG-enlazador-N=N=N en donde: PEG is poli (glicol de etileno) y X es un grupo de cubierta tal como alcoxi o un grupo funcional como se describe arriba; y M es un grupo funcional que no es reactivo con la funcionalidad de azida pero que reaccionará eficientemente y selectivamente con el grupo funcional N. Ejemplos de grupos adecuados funcionales incluyen, pero no se limitan a, M siendo un ácido carboxílico, carbonato o éster activo si N es una amina; M siendo una cetona si N es una residuo de aminooxi o hidrazida; M siendo un grupo saliente si N es un nucleófilo. La purificación del producto crudo puede llevarse a cabo por métodos conocidos incluyendo, pero no limitándose a, precipitación del producto seguido por cromatografía, si es necesario. Un ejemplo más específico se muestra abajo en el caso de diamina de PEG, en la cual una de las aminas se protege por un residuo de grupo protector tal como tert-butil -Boc y la diamina de PEG mono-protegida resultante se reacciona con un residuo de enlace que lleva la funcionalidad de azida: BocHN-PEG-NH2+H02C- (CH2) 3-N=N=N En este caso, el grupo amina puede acoplarse al grupo ácido carboxílico utilizando a variedad de agentes de activación tales como reactivos de carbodiimida o cloruro de tionilo y N-hidroxisuccinimida o N-hidroxibenzotriazola para crear una unión amida entre el derivado de PEG de monoamina y el residuo enlazador que lleva azida. Después de la formación exitosa de la unión amida, el derivado que contiene azida protegido por N-tert-butil-Boc resultante puede utilizarse directamente para modificar moléculas bioactivas o puede elaborarse además para instalar otros grupos funcionales útiles. Por ejemplo, el grupo N-t-Boc puede hidrolizarse por tratamiento con ácido fuerte para generar una omega-amino-PEG-azida . La amina resultante puede utilizarse como una manija sintética para instalar otras funcionalidades útiles tales como grupos maleimida, disulfuros activados, esteres activados y así sucesivamente para la creación de reactivos heterobifuncionales valuables. Los derivados heterobifuncionales son particularmente útiles cuando se desea unir diferentes moléculas a cada término del polímero. Por ejemplo, omega-N-amino-N-azida PEG permitiría la unión de una molécula que tiene un grupo electrofílico activado, tal como un aldehido, cetona, éster activado, carbonato activado y así sucesivamente, a un término del PEG y una molécula que tiene un grupo acetileno al otro término de PEG. En otra modalidad de la invención, el derivado de polímero tiene la estructura: X-A-POLI-B-C=C-R en donde: R puede ser ya sea H o un alquilo, alqueno, alquioxi, o aril o grupo substituido arilo; B es un residuo de enlace, que puede estar presente o ausente ; POLI es un polímero no antigénico soluble en agua; A es un residuo de enlace, que puede estar presente o ausente y que puede ser el mismo que B o diferente; y X es un segundo grupo funcional . Ejemplos de un residuo de enlace para A y B incluyen, pero no se limitan a, un grupo alquilo multifuncional que contiene hasta 18, y más preferentemente entre 1-10 átomos de carbono. Un heteroátomo tal como nitrógeno, oxígeno o azufre puede estar incluido con la cadena de alquilo. La cadena de alquilo también puede ramificarse en un heteroátomo. Otros ejemplos de un residuo de enlace para A y B incluyen, pero no se limitan a, un grupo arilo multifuncional, que contiene hasta 10 y más preferentemente 5-6 átomos de carbono. El grupo arilo puede estar substituido con uno más átomos de carbono, nitrógeno, oxígeno, o átomo de azufres. Otros ejemplos de grupos de enlace adecuados incluyen aquellos grupos de enlace descritos en Pats. de E.U. Nos. 5,932,462 y 5,643,575 y Publicación de Sol. de Pat. de E.U. 2003/0143596, cada una de las cuales se incorpora para referencia en la presente. Aquellos de experiencia ordinaria en la materia reconocerán que la lista anterior para residuos de enlace de ningina manera es exhaustiva y se propone ser meramente ilustrativa, y que una amplia variedad de residuos de enlace que tienen las cualidades descritas arriba se contemplan por ser útiles en la presente invención.

Ejemplos de grupos adecuados funcionales para utilizarse como X incluyen hidróxilo, hidróxilo protegido, alcoxilo, éster activo, tal como N-hidroxieuccinimidil esteres y 1-benzotriazolil esteres, carbonato activo, tal como N-hidroxisuccinimidil carbonatos y 1-benzotriazolil carbonatos, acetal, aldehido, hidratos de aldehido, alquenilo, acrilato, metacrilato, acrilamida, sulfona activa, amina, aminooxi, amina protegida, hidrazida, hidrazida protegida, tiol protegido, ácido carboxílico, ácido carboxílico protegido, isocianato, isotiocianato, maleimida, vinilsulfona, ditiopiridina, vinilpiridina, yodoacetamida, epóxido, glioxales, dionas, mesilatos, tosilatos, y tresilato, alqueno, cetona, y acetileno. Como se entendería, el residuo X seleccionado debe ser compatible con el grupo acetileno de manera que la reacción con el grupo acetileno no ocurre. Los derivados de polímero que contienen acetileno pueden ser homobifuncionales, significado que el segundo grupo funcional (i.e., X) es también un residuo acetileno, o heterobifuncional, significando que el segundo grupo funcional es un grupo funcional diferente. En otra modalidad de la presente invención, los derivados de polímero comprenden una estructura de polímero teniendo la estructura: X-CH2CH20-- (CH2CH20)n--CH2CH2-0- (CH2)m-C=CH en donde: X es un grupo funcional como se describe arriba; n es aproximadamente 20 a aproximadamente 4000; y m es entre 1 y 10. Los ejemplos específicos de cada uno de los polímeros PEG heterobifuncionales se muestran abajo. Los derivados PEG que contienen acetileno de la invención pueden prepararse utilizando métodos conocidos por aquellos expertos en la materia y/o descritos en la presente. En un método, una estructura de polímero soluble en agua que tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 800 Da a aproximadamente 100,000 Da, la estructura de polímero teniendo un primer término unido a un primer grupo funcional y un segundo término unido a un grupo nucleofílico adecuado, se reacciona con un compuesto que lleva tanto una funcionalidad de acetileno como un grupo saliente que es adecuado para reacción con el grupo nucleofílico en PEG. Cuando el polímero PEG que lleva el residuo nucleofílico y la molécula que lleva el grupo saliente se combinan, el grupo saliente experimenta un desplazamiento nucleofílico y se reemplaza por el residuo nucleofílico, proporcionando el polímero que contiene acetileno deseado. X-PEG-Nu+L-A-C? X-PEG-Nu-A-C=CR' Como se muestra, una estructura de polímero preferida para utilizarse en la reacción tiene la fórmula X-PEG-Nu, en donde PEG es poli (glicol de etileno), Nu es un residuo nucleofílico y X es un grupo funcional que no reacciona con Nu, L o la funcionalidad de acetileno. Ejemplos de Nu incluyen, pero no se limitan a, amina, alcoxi, ariloxi, sulfhidrilo, imino, carboxiloato, hidrazida, grupos aminoxi que reaccionarían principalmente a través de un mecanismo tipo SN2. Ejemplos adicionales de grupos Nu incluyen aquellos grupos funcionales que reaccionarían principalmente a través de una reacción de adición nucleofílica. Ejemplos de grupos L incluyen cloruro, bromuro, yoduro, mesilato, tresilato, y tosilato y otros grupos esperados para experimentar el desplazamiento nucleofílico así como también cetonas, aldehidos, tioésteres, olefinas, grupos carbonilo alfa-beta no saturados, carbonatos y otros grupos electrofílicos esperados para experimentar la adición por nucleófilos. En otra modalidad de la presente invención, A es un enlazador alifático de entre 1-10 átomos de carbono o un anillo substituido de arilo de entre 6-14 átomos de carbono. X es un grupo funcional que no reacciona con grupos azida y L es un grupo saliente adecuado En otro método para la preparación del polímero que contiene derivados de acetileno de la invención, un polímero PEG que tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 800 Da a aproximadamente 100,000 Da, que lleva ya sea un grupo funcional protegido o un agente de cubierta en un término y un grupo saliente adecuado en el otro término se contacta por un anión acetileno. Un esquema de reacción ejemplificativo se muestra abajo: X-PEG-L + -C=CR'? X-PEG-C=CR' en donde : PEG es poli (glicol de etileno) y X es un grupo de cubierta tal como alcoxi o un grupo funcional como se describe arriba; y R' es ya sea H, un grupo alquilo, alcoxi, aril o ariloxi o un grupo alquilo substituido, alcoxilo, arilo o ariloxi. En el ejemplo anterior, el grupo saliente L debe ser suficientemente reactivo para experimentar desplazamiento tipo SN2 cuando se contacta con una concentración suficiente del anión de acetileno. Las condiciones de reacción requeridas para realizar desplazamiento SN2 de grupos salientes por aniones de acetileno se conocen bien en la materia . La purificación del producto crudo puede usualmente realizarse por métodos conocidos en la materia incluyendo, pero no limitándose a, precipitación del producto seguido por cromatografía, si es necesario. El número y posición en la cadena de polipéptidos de polímeros solubles en agua a un polipéptido (i.e., el grado de PEGilación o glicosilación) de la presente invención puede ajustarse para proporcionar una característica alterada (incluyendo pero no limitándose a, incrementada o disminuida) farmacológica, farmacocinética o farmacodinámica tal como vida media in vivo . En algunas modalidades, la vida media de un polipéptido se incrementa al menos aproximadamente 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 por ciento, 2-veces, 5-veces, 10-veces, 50 -veces, o al menos aproximadamente lOO^veces sobre un polipéptido no modificado. Derivados de PEG que contienen un grupo nucleofílico fuerte (i.e., hidrazida, hidracina, hidroxilamina o semicarbazida En una modalidad de la presente invención, un polipéptido que comprende un aminoácido codificado de manera no natural que contiene carbonilo se modifica con un derivado de PEG que contiene un residuo de hidrazina, hidroxilamina, hidrazida o semicarbazida terminal que se enlaza directamente a la estructura PEG. En algunas modalidades, el derivado de PEG de hidroxilamina terminal tendrá la estructura: RO- (CH2CH20)n-0- (CH2)m-0-NH2 donde R es un alquilo simple (metilo, etilo, propilo, etc.), m es 2-10 y n es 100-1,000 (i.e., peso molecular promedio es entre 5-40 kDa) . En algunas modalidades, el derivado de PEG que contiene hidrazina o hidrazida tendrá la estructura: RO- (CH2CH20)n-0- (CH2) m-X-NH-NH2 donde R es un alquilo simple (metilo, etilo, propilo, etc.), m es 2-10 y n es 100-1,000 y X es opcionalmente un grupo carbonilo (C=0) que puede estar presente o ausente. En algunas modalidades, el derivado de PEG que contiene semicarbazida tendrá la estructura: RO- (CH2CH20)n-0- (CH2)m-NH-C(0) -NH-NH2 donde R es un alquilo simple (metilo, etilo, propilo, etc.), m es 2-10 y n es 100-1,000. En otra modalidad de la invención, un polipéptido hGH que comprende un aminoácido que contiene carbonilo se modifica con un derivado de PEG que contiene un residuo de hidroxilamina, hidrazida, hidrazina, o semicarbazida terminal que se enlaza a la estructura PEG por medio de un enlace de amida . En algunas modalidades, derivados de PEG de hidroxilamina terminal tienen la estructura: RO- (CH2CH20)n-0- (CH2)2-NH-C(0) (CH2)m-0-NH2 donde R es un alquilo simple (metilo, etilo, propilo, etc.), m es 2-10 y n es 100-1,000 (i.e., peso molecular promedio es entre 5-40 kDa) . En algunas modalidades, los derivados de PEG que contienen hidrazina o hidrazida tienen la estructura: RO- (CH2CH20)n-0- (CH2)2-NH-C(0) (CH2) m-X-NH-NH2 donde R es un alquilo simple (metilo, etilo, propilo, etc.), m es 2-10, n es 100-1,000 y X es opcionalmente un grupo carbonilo (C=0) que puede estar presente o ausente. En algunas modalidades, los derivados de PEG que contienen semicarbazida tienen la estructura: RO- (CH2CH20)n-0- (CH2)2-NH-C(0) (CH2) m-NH-C (O) -NH-NH2 donde R es un alquilo simple (metilo, etilo, propilo, etc.), m es 2-10 y n es 100-1,000. En otra modalidad de la invención, un polipéptido que comprende un aminoácido que contiene carbonilo se modifica con un derivado de PEG ramificado que contiene un residuo de hidrazina, hidroxilamina, hidrazida o semicarbazida terminal, con cada cadena del PEG ramificado teniendo un MW que varía de 10-40 kDa y, más preferentemente, de 5-20 kDa. En otra modalidad de la invención, un polipéptido que comprende un aminoácido codificado de manera no natural se modifica con un derivado de PEG que tiene una estructura ramificada. Por ejemplo, en algunas modalidades, el derivado de PEG de hidrazina o hidrazida terminal la siguiente estructura : [RO- (CH2CH20)n-0- (CH2) 2-NH-C (O) ] 2CH (CH2) m-X-NH-NH2 donde R es un alquilo simple (metilo, etilo, propilo, etc.), m es 2-10 y n es 100-1,000, y X es opcionalmente un grupo carbonilo (C=0) que puede estar presente o ausente. En algunas modalidades, los derivados de PEG que contienen un grupo semicarbazida tendrá la estructura: [RO-(CH2CH20)n-0- (CH2)2-C(0) -NH-CH2-CH2] 2CH-X- (CH2) m-NH-C (O) -NH-NH2 donde R es un alquilo simple (metilo, etilo, propilo, etc.), X es opcionalmente NH, O, S, C (0) o no está presente, m es 2-10 y n es 100-1,000. En algunas modalidades, los derivados de PEG que contienen un grupo hidroxilamina tendrá la estructura: [RO- (CH2CH20)n-0- (CH2)2-C(0) -NH-CH2-CH2] 2CH-X- (CH2) m-0-NH2 donde R es un alquilo simple (metilo, etilo, propilo, etc.), X es opcionalmente NH, O, S, C(O) o no está presente, m es 2-10 y n es 100-1, 000. Se describen métodos y química para la activación de polímeros así como también para la conjugación de péptidos en la literatura y se conocen en la materia. Los métodos comúnmente utilizados para la activación de polímeros incluyen, pero no se limitan a, activación de grupos funcionales, con bromuro de cianogen, periodato, glutaraldehído, biepóxidos, epiclorohidrina, divinilsulfona, carbodiimida, haluros de sulfonilo, triclorotriazina, etc. (ver, R. F. Taylor, (1991), PROTEIN IMMOBILISATION. FUNDAMENTAL AND APPLICATIONS, Marcel Dekker, N.Y.; S. S.

Wong, (1992) , CHEMISTRY OF PROTEIN CONJUGATION AND CROSSLINKING, CRC Press, Boca Ratón; G. T. Hermanson et al, (1993), IMMOBILIZED AFFINITY LIGAND TECHNIQUES, Academic Press, N. Y.; Dunn, R.L., et al, Eds. POLYMERIC DRUGS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS, ACS Symposium Series Vol. 469, American Chemical Society, Washington, D. C. 1991). Están disponibles varias revisiones y monografías de la funcionalización y conjugación de PEG. Ver, por ejemplo, Harris, Macronol , Chem. Phys . C25: 325-373 (1985); Scouten, Methods in Enzymology 135: 30-65 (1987); Wong et al, Enzyme Microb, Technol 14: 866-874 (1992); Delgado et al, Cri tical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 9: 249-304 (1992); Zalipsky, Bioconjugate Chem . 6: 150-165 (1995). También pueden encontrarse métodos para la activación de polímeros en WO 94/17039, Pat. de E.U. No. 5,324,844, WO 94/18247, WO 94/04193, Pat. de E.U. No.5, 219, 564, Pat. de E.U. No .5 , 122 , 614 , WO 90/13540, Pat. De E.U. No.5, 281, 698, y WO 93/15189, y para conjugación entre polímeros activados y enzimas incluyendo pero no limitándose a Factor de Coagulación VIII (WO 94/15625) , hemoglobina (WO 94/09027), molécula que lleva oxígeno (Pat. de E.U.

No .4 , 412 , 989) , ribonucleasa y dismutasa de superóxido (Verunose et al, App . Biochem. Biotech . 11:141-45 (1985)).

Todas las referencias y patentes citadas se incorporan para referencia en la presente. PEGilación (i.e., adición de cualquier polímero soluble en agua) de polipéptidos que contienen un aminoácido codificado de manera no natural, tal como p-azido-L-fenilalanina, se lleva a cabo por cualquier método conveniente. Por ejemplo, un polipéptido es PEGilado con un derivado de mPEG terminado en alquileno. Brevemente, un exceso de mPEG (5000) -0-CH2-C=CH sólido se agrega, con agitación, a una solución acuosa de polipéptido que contiene p-azido-L-Phe a temperatura ambiente. Típicamente, la solución acuosa se regula con un regulador que tiene un pKa cercano al pH en el cual la reacción está por llevarse a cabo (generalmente aproximadamente pH 4-10) . Ejemplos de reguladores adecuados para PEGilación a pH 7.5, por ejemplo, incluyen, pero no se limitan a, HEPES, fosfato, borato, TRIS-HCl, EPPS, y TES. El pH se monitorea de manera continua y se ajusta si es necesario. La reacción se deja continuar típicamente por entre aproximadamente 1-48 horas. Los productos de reacción se someten subsiguientemente a cromatografía de interacción hidrofóbica para separar las variantes de polipéptido PEGilado de mPEG(5000) -0-CH2-C=CH libre y cualquier complejo de alto peso molecular del polipéptido hGH pegilado que se puede formar cuando el PEG no bloqueado se activa en ambos extremos de la molécula, degradando así las moléculas variantes de polipéptido de hGH. Las condiciones durante cromatografía de interacción hidrofóbica son tales que mPEG (5000) -0-CH2-C=CH libre fluye a través de la columna, mientras cualquier complejo variante de polipéptido de hGH PEGilado degradado se eluye después de las formas deseadas, que contienen una molécula variante de polipéptido de hGH conjugada con uno o más grupos PEG. Las condiciones adecuadas variarán dependiendo de los tamaños relativos de los complejos degradados contra los conjugados deseados y se determinan fácilmente por aquellos expertos en la materia. El eluyente que contiene los conjugados deseados se concentra por ultrafiltración y desala por diafiltración. Si es necesario, el polipéptido PEGilado obtenido de la cromatografía hidrofóbica puede purificarse además por uno o más procedimientos conocidos por aquellos expertos en la materia incluyendo, pero no limitándose a, cromatografía de afinidad; cromatografía de intercambio de anión y catión (utilizando, incluyendo pero no limitándose a, DEAE SEPHAROSE) ; cromatografía en sílice; HPLC de fase inversa; filtración de gel (utilizando, incluyendo pero no limitándose a, SEPHADEX G-75) ; cromatografía de interacción hidrofóbica; cromatografía de exclusión de tamaño, cromatografía de quelato de metal; ultrafiltración/diafiltración; precipitación de etanol; precipitación de sulfato de amonio; cromatoenfoque; cromatografía de desplazamiento; procedimientos electroforéticos (incluyendo pero no limitándose a enfoque isoeléctrico preparativo) , solubilidad diferencial (incluyendo pero no limitándose a precipitación de sulfato de amonio) , o extracción. El peso molecular aparente puede estimarse por GPC en comparación con estándares de proteína globulares (PROTEIN PURIFICATION METHODS, A PRACTICAL APPROACH (Harris & Angal, Eds.) IRL Press 1989, 293-306) . La pureza del conjugado hGH-PEG puede valorarse por degradación proteolítica (incluyendo pero no limitándose a, segmentación de tripsina) seguido por análisis de espectrometría de masa. Pepinsky B., et al, J. Pharmcol . & Exp. Ther. 297(3): 1059-66 (2001). Un polímero soluble en agua enlazado a un aminoácido de un polipéptido de la invención puede derivarse o substituirse además sin limitación. Derivados de PEG que contienen Azida En otra modalidad de la invención, un polipéptido se modifica con un derivado de PEG que contiene un residuo azido que reaccionará con un residuo alquino presente en la cadena lateral del aminoácido codificado de manera no natural. En general, los derivados de PEG tendrán un peso molecular promedio que varía de 1-100 kDa y, en algunas modalidades, de 10-40 kDa. En algunas modalidades, el derivado de PEG azida terminal tendrá la estructura: RO- (CH2CH20)n-0- (CH2)m-N3 donde R es un alquilo simple (metilo, etilo, propilo, etc.), m es 2-10 y n es 100-1,000 (i.e., peso molecular promedio es entre 5-40 kDa) . En otra modalidad, el derivado de PEG azida terminal tendrá la estructura: RO- (CH2CH20)n -O- (CH2)m-NH-C(0) - (CH2)P-N3 donde R es un alquilo simple (metilo, etilo, propilo, etc.), m es 2-10, p es 2-10 y n es 100-1,000 (i.e., peso molecular promedio es entre 5-40 kDa) . En otra modalidad de la invención, un polipéptido que comprende un aminoácido que contiene alquino se modifica con un derivado de PEG ramificado que contiene un residuo azida terminal, con cada cadena del PEG ramificado teniendo un MW que varía de 10-40 kDa y, más preferentemente, de 5-20 kDa. Por ejemplo, en algunas modalidades, el derivado de PEG azida terminal tendrá la siguiente estructura: [RO- (CH2CH20)n-0- (CH2)2-NH-C(0) ]2CH(CH2)m-X- (CH2)PN3 donde R es un alquilo simple (metilo, etilo, propilo, etc.), m es 2-10, p es 2-10, y n es 100-1,000, y X es opcionalmente un grupo 0, N, S o carbonilo (C=0) , en cada caso que puede estar presente o ausente. Derivados de PEG que contienen Alquino En otra modalidad de la invención, un polipéptido se modifica con un derivado de PEG que contiene un residuo alquino que reaccionará con un residuo azido presente en la cadena lateral del aminoácido codificado de manera no natural . En algunas modalidades, el derivado de PEG alquino terminal tendrá la siguiente estructura: RO- (CH2CH20) n-0- (CH2) m-C=CH donde R es un alquilo simple (metilo, etilo, propilo, etc.), m es 2-10 y n es 100-1,000 (i.e., peso molecular promedio es entre 5-40 kDa) . En otra modalidad de la invención, un polipéptido que comprende un aminoácido codificado de manera no natural que contiene alquino se modifica con un derivado de PEG que contiene un residuo alquino terminal o azida terminal que se enlaza a la estructura PEG por medio de un enlace de amida. En algunas modalidades, el derivado de PEG alquino terminal tendrá la siguiente estructura: RO- (CH2CH20)n-0- (CH2)m-NH-C(0) - (CH2)P-C=CH donde R es un alquilo simple (metilo, etilo, propilo, etc.), m es 2-10, p es 2-10 y n es 100-1,000. En otra modalidad de la invención, un polipéptido hGH que comprende un aminoácido que contiene azida se modifica con un derivado de PEG ramificado que contiene un residuo alquino terminal, con cada cadena del PEG ramificado teniendo un MW que varía de 10-40 kDa y, más preferentemente, de 5-20 kDa. Por ejemplo, en algunas modalidades, el derivado de PEG alquino terminal tendrá la siguiente estructura: [RO- (CH2CH20)n-0- (CH2)2-NH-C(0)]2CH(CH2)m-X- (CH2)p C?CH donde R es un alquilo simple (metilo, etilo, propilo, etc.), m es 2-10, p es 2-10, y n es 100-1,000, y X es opcionalmente un grupo O, N, S o carbonilo (C=0) , o no está presente. Derivados de PEG que contienen Fosfina En otra modalidad de la invención, un polipéptido se modifica con un derivado de PEG que contiene un grupo funcional activado (incluyendo pero no limitándose a, éster, carbonato) comprendiendo además un grupo aril fosfina que reaccionará con un residuo azido presente en la cadena lateral del aminoácido codificado de manera no natural. En general, el los derivados de PEG tendrán un peso molecular promedio que varía de 1-100 kDa y, en algunas modalidades, de 10-40 kDa. En algunas modalidades, el derivado de PEG tendrá la estructura: en donde n es 1-10; X puede ser O, N, S o no está presente, Ph es fenilo, y W es un polímero soluble en agua. En algunas modalidades, el derivado de PEG tendrá la estructura: en donde X puede ser 0, N, S o no está presente, Ph es fenilo, W es un polímero soluble en agua y R puede ser grupos H, alquilo, arilo, alquilo substituido y arilo substituido.

Los grupos R ejemplificativos incluyen pero no se limitan a -CH2, -C(CH3)3, -OR' , -NR'R", -SR' , -halógeno, -C(0)R', CONR'R", -S(0)2R', -S(0)2NR'R", -CN y -N02. R' , R" , R" ' y R" " cada uno se refiere independientemente a hidrógeno, heteroalquilo substituido o no substituido, arilo substituido o no substituido, incluyendo pero no limitándose a, grupos arilo substituido con 1-3 halógenos, alquilo substituido o no substituido, alcoxi o tioalcoxi, o grupos arilalquilo. Cuando un compuesto de la invención incluye más de un grupo R, por ejemplo, cada uno de los grupos R se selecciona independientemente como lo son cada grupo R' , R" , R" ' y R" " cuando más de uno de estos grupos está presente. Cuando R' y R" se unen al mismo átomo de nitrógeno, pueden combinarse con el átomo de nitrógeno para formar un anillo de 5 , 6, o 7 miembros. Por ejemplo, -NR'R" se entiende que incluye, pero no se limita a, 1-pirrolidinilo y 4-morfolinilo . A partir de la discusión anterior de substituyentes, un experto en la materia entenderá que el término "alquilo" se entiende que incluye grupos incluyendo átomos de carbono unidos a grupos diferentes a grupos hidrógeno, tal como haloalquilo (incluyendo pero no limitándose a, -CF3 y —CH2CF3) y acilo (incluyendo pero no limitándose a, -C(0)CH3, -C(0)CF3, C(0)CH2OCH3, y lo similar). Otros derivados de PEG y Técnicas de PEGilación General Otras moléculas de PEG ejemplificativas que pueden enlazarse a polipéptidos, así como también métodos de PEGilación incluyen aquellos descritos en, e.g., Publicación de Patente de E.U. No. 2004/0001838 2002/0052009 2003/0162949 2004/0013637 2003/0228274 2003/0220447 2003/0158333 2003/0143596 2003/0114647 2003/0105275 2003/0105224 2003/0023023 2002/0156047 2002/0099133 2002/0086939 2002/0082345 2002/0072573 2002/0052430 2002/0040076 2002/0037949 2002/0002250 2001/0056171 2001/0044526 2001/0027217; 2001/0021763; Patente de E.U. No 66,,664466,, 111100;; 5,824,778; 5,476,653; 5,219,564; 5,629,384 ,736,625; 4,902,502; 5,281,698; 5,122,614; 5,473,034 ,516,673; 5,382,657; 6,552,167; 6,610,281; 6,515,100 6,461,603; 6,436,386 6,214,966; 5,990,237; 5,900,461 5,739,208; 5,672,662 5,446,090; 5,808,096; 5,612,460 55,,332244,,884444;; 5,252,714; 6,420,339; 6,201,072; 6,451,346 6,306,821; 5,559,213; 5,612,460; 5,747,646; 5,834,594 5,849,860; 5,980,948; 6,004,573; 6,129,912; WO 97/32607, EP 229,108, EP 402,378, WO 92/16555, WO 94/04193, WO 94/14758, WO 94/17039, WO 94/18247, WO 94/28024, WO 95/00162, WO 95/11924, WO95/13090, WO 95/33490, WO 96/00080, WO 97/18832, WO 98/41562, WO 98/48837, WO 99/32134, WO 99/32139, WO 99/32140, WO 96/40791, WO 98/32466, WO 95/06058, EP 439 508, WO 97/03106, WO 96/21469, WO 95/13312, EP 921 131,, WO 98/05363, EP 809 996, WO 96/41813, WO 96/07670, EP 605 963, EP 510 356, EP 400 472, EP 183 503 y EP 154 316, que se incorporan para referencia en la presente. Cualquiera de las moléculas de PEG descritas en la presente pueden utilizarse en cualquier forma, incluyendo pero no limitándose a, cadena única, cadena ramificada, cadena de múltiples brazos, funcional única, bi - funcional , multi -funcional , o cualquier combinación de los mismos. X. Glicosilación de Polipéptidos La invención incluye polipéptidos que incorporan uno o más aminoácidos codificados de manera no natural que llevan residuos sacárido. Los residuos sacárido pueden ser ya sea naturales (incluyendo pero no limitándose a, N-acetilglucosamina) o no naturales (incluyendo pero no limitándose a, 3-fluorogalactosa) . Los sacáridos pueden enlazarse a los aminoácidos codificados de manera no natural ya sea por un enlace glucosídico N- u 0-enlazado (incluyendo pero no limitándose a, N-acetilgalactosa-L-serina) o un enlace no natural (incluyendo pero no limitándose a, una oxima o el glucósido C- o S-enlazado correspondiente) . Los residuos sacárido (incluyendo pero no limitándose a, glicosilo) pueden agregarse a polipéptidos ya sea in vivo o in vi tro . En algunas modalidades de la invención, un polipéptido que comprende un aminoácido codificado de manera no natural que contiene carbonilo se modifica con un sacárido derivado con un grupo aminoxi para generar el polipéptido glicosilado correspondiente a enlazado a través de un enlace de oxima. Una vez unido al aminoácido codificado de manera no natural, el sacárido puede elaborarse además por tratamiento con glicosiltransferasas y otras enzimas para generar un oligosacárido unido al polipéptido. Ver, e.g., H. Liu, et al. J Am. Chem. Soc . 125: 1702-1703 (2003) . En algunas modalidades de la invención, un polipéptido que comprende un aminoácido codificado de manera no natural que contiene carbonilo se modifica directamente con un glican con estructura definida preparada como un derivado de aminooxi . Un experto en la materia reconocerá que otras funcionalidades, incluyendo azida, alquino, hidrazida, hidrazina, y semicarbazida, pueden utilizarse para enlazar el sacárido al aminoácido codificado de manera no natural. En algunas modalidades de la invención, un polipéptido que comprende un aminoácido codificado de manera no natural que contiene azida o alquinilo puede entonces modificarse por, incluyendo pero no limitándose a, una reacción de cicloadición Huisgen [3+2] con, incluyendo pero no limitándose a, derivados de alquinilo o azida, respectivamente. Este método permite que las proteínas se modifiquen con selectividad extremadamente alta. XIV. Administración y Composiciones Farmacéuticas Los polipéptidos o proteínas de la invención (incluyendo pero no limitándose a proteínas que comprenden uno o más aminoácidos codificados de manera no natural, etc.) se emplean opcionalmente para usos terapéuticos, incluyendo pero no limitándose a, en combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Tales composiciones, por ejemplo, comprenden una cantidad • terapéuticamente efectiva del compuesto, y un vehículo farmacéuticamente aceptable o excipiente. Tal vehículo o excipiente incluye, pero no se limita a, salina, salina regulada, dextrosa, agua, glicerol, etanol, y/o combinaciones de los mismos. La formulación se hace para ajustarse al modo de administración. En general, los métodos para administrar proteínas se conocen bien en la materia y pueden aplicarse a la administración de los polipéptidos de la invención. Las composiciones terapéuticas que comprenden uno o más polipéptidos de la invención se prueban opcionalmente en uno o más modelos animales de enfermedad apropiados in vi tro y lo in vivo para confirmar la eficacia, metabolismo de tejido, y para estimar las dosificaciones, de acuerdo a métodos bien conocidos en la materia. En particular, las dosificaciones pueden determinarse inicialmente por actividad, estabilidad u otras mediciones adecuadas de homólogos de aminoácido no natural o natural (incluyendo pero no limitándose a, comparación de un polipéptido modificado para incluir uno o más aminoácidos codificados de manera no natural a un polipéptido de aminoácido natural), i.e., en un ensayo relevante. La administración es por cualquiera de las vías normalmente utilizadas para introducir una molécula en contacto final con células de tejido o sangre. Los polipéptidos de aminoácido codificado de manera no natural de la invención se administran en cualquier manera adecuada, opcionalmente con uno o más vehículos farmacéuticamente aceptables. Los métodos adecuados para administrar tales polipéptidos en el contexto de la presente invención a un paciente están disponibles, y, aunque más de una vía puede utilizarse para administrar una composición particular, una vía particular puede con frecuencia proporcionar una reacción o acción más inmediata y más efectiva que otra vía. Los vehículos farmacéuticamente aceptables se determinan en parte por la composición particular que se administra, así como también por el método particular utilizado para administrar la composición. De acuerdo con lo anterior, existe una amplia variedad de formulaciones adecuadas de composiciones farmacéuticas de la presente invención. Las composiciones de polipéptido pueden administrarse por un número de vías incluyendo, pero no limitándose a, medio oral, intravenoso, intraperitoneal, intramuscular, transdermal, subcutáneo, tópico, sublingual, o rectal. Las composiciones que comprenden polipéptidos de aminoácido no natural, modificados o no modificados, también pueden administrarse a través de liposomas. Tales vías de administración y formulaciones apropiadas se conocen generalmente por aquellos de experiencia en la materia. El polipéptido que comprende un aminoácido no natural, solo o en combinación con otros componentes adecuados, también puede hacerse en formulaciones de aerosol (i.e., pueden "nebulizarse") a administrarse a través de inhalación. Las formulaciones en aerosol pueden colocarse en impulsores aceptables presurizados, tales como diclorodifluorometano, propano, nitrógeno, y lo similar. Las formulaciones adecuadas para administración parenteral, tales como, por ejemplo, por vías intraarticular (en las articulaciones) , intravenosa, intramuscular, intradermal, intraperitoneal, y subcutánea, incluyen soluciones acuosas o no acuosas, de inyección estéril isotónica, que pueden contener antioxidantes, reguladores, bacterioestatos, y solutos que vuelven a la formulación isotónica con la sangre del recipiente propuesto, y suspensiones estériles acuosas y no acuosas que pueden incluir agentes de suspensión, solubilizadores, agentes espesadores, estabilizadores, y conservadores. Las formulaciones de ácido nucleico empacado pueden estar presentes en contenedores sellados de múltiples dosis o dosis única, tales como ampolletas y frascos. La administración parenteral y administración intravenosa son métodos de administración preferidos. En particular, las vías de administración ya en uso para terapéuticos homólogos de aminoácido natural (incluyendo pero no limitándose a, aquello típicamente utilizados para EPO, GH, G-CSF, GM-CSF, IFNs, interleucinas, anticuerpos, y/o cualquier otra proteína farmacéuticamente derivada) , junto con las formulaciones en uso actual, proporcionan vías de administración preferidas y formulación para los polipéptidos de la invención. La dosis administrada a un paciente, en el contexto de la presente invención, es suficiente para tener una respuesta terapéutica benéfica en el paciente con el tiempo, o incluyendo pero no limitándose a, inhibir la infección por un patógeno, u otra actividad apropiada, dependiendo de la aplicación. La dosis se determina por la eficacia del vector particular, o formulación, y la actividad, estabilidad o vida media en suero del polipéptido de aminoácido no naturalmente codificado empleado y la condición del paciente, así como también, el peso del cuerpo o área de superficie del paciente a tratarse. El tamaño de la dosis también se determina por la existencia, naturaleza, y grado de cualquier efecto secundario adverso que acompaña la administración de un vector particular, formulación, o lo similar en un paciente particular. Para determinar la cantidad efectiva del vector o formulación a administrarse en el tratamiento o profilaxis de enfermedad (incluyendo pero no limitándose a, cánceres, enfermedades heredadas, diabetes, SIDA, o lo similar) , el médico evalúa los niveles de plasma circulantes, toxicidades de formulación, progresión de la enfermedad, y/o donde sea relevante, la producción de anti -anticuerpos de polipéptido de aminoácido codificado de manera no natural. La dosis administrada, por ejemplo, a un paciente de 70 kilogramos, está típicamente en el rango equivalente a dosificaciones de proteínas terapéuticas actualmente utilizadas, ajustadas para la actividad alterada o vida media de suero de la composición relevante. Los vectores de esta invención pueden complementar las condiciones de tratamiento por cualquier terapia convencional conocida, incluyendo administración de anticuerpo, administración de vacuna, administración de agentes citotóxicos, polipéptidos de aminoácido natural, ácidos nucleicos, análogos de nucleótido, modificadores de respuesta biológica, y lo similar. Para administración, las formulaciones de la presente invención se administran a una velocidad determinada por LD-50 o ED-50 de la formulación relevante, y/u observación de cualquier efecto secundario de los aminoácidos codificados de manera no natural a diversas concentraciones, incluyendo pero no limitándose a, según se aplica a la masa y salud total del paciente. La administración puede realizarse por dosis divididas y única. Si un paciente que experimenta infusión de una formulación desarrolla fiebre, escalofríos o dolores musculares, recibe la dosis apropiada de aspirina, ibuprofen, acetaminofen u otro fármaco que controla el dolor/fiebre. Los pacientes que experimentan reacciones a la infusión tal como fiebre, dolores musculares y escalofríos se premedican 30 minutos antes de las infusiones futuras con ya sea aspirina, acetaminofen, o, incluyendo pero no limitándose a, difenhidramina. Meperidina se utiliza para escalofríos más severos y dolores musculares que no responden rápidamente a antipiréticos y antihistaminas. La infusión celular se disminuye o discontinua dependiendo de la severidad de la reacción. Los polipéptidos de la invención pueden administrarse directamente a un sujeto mamífero. La administración es por cualquiera de las vías normalmente utilizadas para introducir un polipéptido a un Sujeto. Las composiciones de polipéptido de acuerdo a modalidades de la presente invención incluyen aquellas para administración oral, rectal, tópica, inhalación (incluyendo pero no limitándose a, sub-lingual), vaginal, parenteral (incluyendo pero no limitándose a, subcutánea, intramuscular, intradermal, intraarticular, intrapleural, intraperitoneal, intracerebral, intraarterial, o intravenosa), tópica (i.e., tanto en las superficies musculares como en la piel, incluyendo las superficies de las vías respiratorias) y administración transdérmica, aunque la vía más adecuada en cualquier caso dependerá de la naturaleza y severidad de la condición que se trata. La administración puede ser ya sea local o sistémica. Las formulaciones de los compuestos pueden presentarse en contenedores sellados de múltiples dosis o dosis única, tales como ampolletas y frascos. Los polipéptidos de la invención pueden prepararse en una mezcla en una forma inyectable de dosis unitaria (incluyendo pero no limitándose a, solución, suspensión, o emulsión) con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Los polipéptidos de la invención también pueden administrarse por infusión continua (utilizando, incluyendo pero no limitándose a, minibombas tales como bombas osmóticas) , bolo único o formulaciones de depósito de liberación lenta. Las formulaciones adecuadas para la administración incluyen soluciones acuosas y no acuosas, soluciones estériles isotónicas, que pueden contener antioxidantes, reguladores, bacterioestatos y solutos que vuelven a la formulación isotónica, y suspensiones estériles acuosas y no acuosas que pueden incluir agentes de suspensión, solubilizadores, agentes espesadores, estabilizadores, y conservadores. Las soluciones y suspensiones pueden prepararse de polvos estériles, granulos, y tabletas de la clase previamente descrita. Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden comprender un vehículo farmacéuticamente aceptable. Los vehículos farmacéuticamente aceptables se determinan en parte por la composición particular que se administra, así como también por el método particular utilizado para administrar la composición. De acuerdo con lo anterior, hay una amplia variedad de formulaciones adecuadas de composiciones farmacéuticas (incluyendo estabilizadores, excipientes, vehículos farmacéuticamente aceptables opcionales) de la presente invención (ver, e.g., Remington ' s Pharmaceutical Sciences, 17h ed. 1985) ) . Los vehículos adecuados incluyen reguladores que contienen fosfato, borato, HEPES, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes que incluyen ácido ascórbico; polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos); proteínas, tales como albúmina de suero, gelatina, o inmunoglobulinas; polímeros hidrofílicos tal como polivinilpirrolida; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, arginina, o lisina; monosacáridos, disacáridos, y otros carbohidratos, incluyendo glucosa, mañosa, o dextrinas; agentes de quelación tal como EDTA; iones de metal divalente, tales como zinc, cobalto, o cobre; alcoholes de azúcar tal como manitol o sorbitol; contrapones formadores de sal tal como sodio; y/o agentes tensoactivos no iónicos Tween™, Pluronics™, o PEG. Los polipéptidos de la invención, incluyendo aquellos enlazados a polímeros solubles en agua tales como PEG también pueden administrarse por o como parte de sistemas de liberación prolongada. Las composiciones de liberación prolongada incluyen, pero no limitándose a, matrices de polímero semi-permeables en la forma de artículos formados, incluyendo pero no limitándose a, películas, o microcápsulas.

Matrices de liberación prolongada incluyen de materiales biocompatibles tales como poli (2-hidroxietil metacrilato) (Langer et al., J. Biomed. Mater. Res . , 15: 167-277 (1981); Langer, Chem. Tech . , 12:98-105 (1982), acetato de vinil etileno (Langer et al, supra) o ácido poli-D- (-) -3-hidroxibutírico (EP 133,988), poliláctidos (ácido poliláctico) (Patente de E.U. No. 3,773,919; EP 58,481), poliglucólido (polímero of ácido glicólico) , co-glicólido de polilactido (copolímeros de ácido láctico y ácido glucólico) polianhidridas, copolímeros de ácido L-glutámico y gamma-etil-L-glutamato (U. Sidman et al., Biopolymers, 22, 547-556 (1983), poli (orto) esteres, polipéptidos, ácido hialurónico, colágeno, sulfato de condroitina, ácidos carboxílicos, ácidos grasos, fosfolípidos, polisacáridos, ácido nucleicos, poliaminoácidos, aminoácidos tales como fenilalanina, tirosina, isoleucina, polinucleótidos, propileno de polivinilo, polivinilpirrolidona y silicona. Las composiciones de liberación prolongada también incluyen un compuesto liposomalmente atrapado. Liposomas que contienen el compuesto se preparan por métodos conocidos per se : DE 3,218,121; Epstein et al, Proc. Nati Acad. Sci U.S.A., 82: 3688-3692 (1985); Hwang et al, Proc. Nati Acad. Sci. U.S.A., 77:4030-4034 (1980); EP 52,322; EP 36,676; EP 88,046; EP 143,949; EP 142,641; Sol. De Pat. Japonesa 83-118008; Pats. de E.U. Nos. 4,485,045 y 4,544,545; y EP 102,324. Todas las referencias y patentes citadas se incorporan para referencia en la presente. Los polipéptidos liposomalmente atrapados pueden prepararse por métodos descritos en e.g., DE 3,218,121; Epstein et al, Proc. Nati Acad. Sci. U.S.A., 82: 3688-3692 (1985); Hwang et al, Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A., 11: 4030- 4034 (1980); EP 52,322; EP 36,676; EP 88,046; EP 143,949; EP 142,641; Sol. de Pat. Japonesa 83-118008; Patentes de E.U.

Nos. 4,485,045 y 4,544,545; y EP 102,324. Composición y tamaño de liposomas se conocen bien o son capaces de determinarse empíricamente por un experto en la materia. Algunos ejemplos de liposomas se señalan en, e.g., Park JW, et al, Proc. Nati Acad. Sci. USA 92:1327-1331 (1995); Lasic D y Papahadjopoulos D (eds) : MEDICAL APPLICATIONS OF LIPOSOMAS (1998); Drummond DC, et al, Liposomal drug delivery systems for cáncer therapy, en Teicher B (ed) : CÁNCER DRUG DISCOVERY AND DEVELOPMENT (2002); Park JW, et al, Clin . Cáncer Res . 8:1 172-1 181 (2002); Nielsen UB, et al, Biochim. Biophys . Acta 1591 (1-3): 109-118 (2002); Mamot C, et al, Cáncer Res . 63: 3154-3161 (2003) . Todas las referencias y patentes citadas se incorporan para referencia en la presente. La dosis administrada a un paciente en el contexto de la presente invención debe ser suficiente para causar una respuesta benéfica en el sujeto con el tiempo. Generalmente, la cantidad farmacéuticamente efectiva total del polipéptido de la presente invención administrado de manera parenteral por dosis está en el rango de aproximadamente 0.01 µg/kg/día a aproximadamente 100 µg/kg, o aproximadamente 0.05 mg/kg a aproximadamente 1 mg/kg, de peso corporal del paciente, aunque está sujeto a discreción terapéutica. La frecuencia de dosificación también está sujeta a discreción terapéutica, y puede ser más frecuente o menos frecuente que los productos de polipéptido comercialmente disponibles aprobados para utilizarse en humanos. Generalmente, un polipéptido PEGilado de la invención puede administrarse por cualquiera de las vías de administración descritas arriba. EJEMPLOS Los siguientes ejemplos se ofrecen para ilustrar, pero no limitar la invención reivindicada. Ejemplo 1 Un sistema de traducción de célula huésped de especie Pseudomonas que comprende un tARN ortogonal (O-tAR?) y una aminoacil tAR? sintetasa ortogonal (O-RS) se utiliza para expresar hGH que contiene un aminoácido codificado de manera no natural. O-RS preferentemente aminoacila el O-tAR? con un aminoácido codificado de manera no natural. A su vez el sistema de traducción de Pseudomonas inserta el aminoácido codificado de manera no natural en hGH, en respuesta a un codón selector codificado. Los sistemas de expresión de polipéptido para especies Pseudomonas se construyen como se describe en la técnica (ver Production of Recombinant Proteins: Novel Microbial and Eukaryotic Expression Systems, Gellissen (editor), John Wiley & Sons, Inc. publisher, 2005). Se utiliza Pseudomonas fluorescens Biovar I cepa MB101 Tabla 2: Secuencias O-RS y O-tARN La transformación de P. fluorescens con plásmidos que contienen el gen hGH modificado y el par aminoacil tARN sintetasa ortogonal/tARN (específico para el aminoácido codificado de manera no natural deseado) permite la incorporación específica en sitio de aminoácido codificado de manera no natural en el polipéptido hGH. P. fluorescens transformado, desarrollado a 37°C en medio que contiene entre 0.01 — 100 mM del aminoácido codificado de manera no natural particular, expresa hGH modificado con alta fidelidad y eficiencia. hgH marcado con His que contiene un aminoácido codificado de manera no natural se produce por las células huésped Pseudomonas como proteína soluble, cuerpos de inclusión o agregados. Los métodos para la purificación de hGH se conocen bien en la materia y se confirman por SDS- PAGE, análisis Western Blot, o espectrometría de masa de trampa de ion por ionización-electrorocío y lo similar. Las proteínas hGH marcadas con His se purifican utilizando la Resina Quelante de Níquel ProBond (Invitrogen, Carlsbad, CA) a través de los procedimientos de purificación de proteína marcada con His proporcionada por el fabricante, seguido por una columna de intercambio de anión antes de cargar al gel . Para valorar además la actividad biológica de polipéptidos de hGH modificados, se utiliza un ensayo que mide un marcador aguas debajo de la interacción de hGH con su receptor. La interacción de hGH con su receptor endógenamente producido conduce a la fosforilación de tirosina de un transductor de señal y activador de miembro de familia de transcripción, STAT5, en la línea celular de linfocito IM-9 de humano. Células IM-9 se estimulan con polipéptidos hGH de la presente invención. Los linfocitos IM-9 de humano pueden comprarse de ATCC (Manassas, VA) y se desarrollan en RPMI 1640 complementado con piruvato de sodio, penicilina, estreptomicina (Invitrogen, Carlsbad, San Diego) y 10% suero de bovino fetal inactivado por calor (Hycluno, Logan, UT) . Las células IM-9 se colocan durante la noche en medio de ensayo (RPMI fenol rojo, 10 mM Hepes, 1% FBS tratado con negro de humo de gas natural inactivado por calor/dextran, piruvato de sodio, penicilina y estreptomicina) antes de la estimulación con un rango de dosis de 12 puntos de polipéptidos hGH por 10 min a 37°C. Las células estimuladas se fijan con 1% formaldehído antes de la permeabilziación con 90% metanol frío por 1 hora en hielo. El nivel de fosforilación STAT5 se detecta por coloración intra-celular con un anticuerpo primario fosfo-5STAT5 (Cell Signaling Technology, Beverly, MA) a temperatura ambiente por 30 min seguido por un anticuerpo secundario conjugado por PE. La adquisición de muestra se realiza en el Conjunto FACS con datos adquiridos analizados en el software Flowjo (Tree Star Inc., Ashland, OR) . Valores EC50 se derivan de curvas de respuesta de dosis trazadas con intensidad fluorescente promedio (MFI) contra concentración de proteína utilizando SigmaPlot . Ejemplo 2 Este ejemplo detalla la introducción de un aminoácido que contiene carbonilo y la reacción subsiguiente con un PEG que contiene aminooxi. Este ejemplo demuestra un método para la generación de un polipéptido hGH que incorpora un aminoácido codificado de manera no natural que contiene cetona que se reacciona subsiguientemente con un PEG que contiene aminooxi de aproximadamente 5,000 MW. Las posiciones de aminoácido seleccionadas pueden substituirse por separado con un aminoácido codificado de manera no natural que tiene la siguiente estructura: Una vez modificado, la variante de polipéptido hGH que comprende el aminoácido que contiene carbonilo se reacciona con un derivado de PEG que contiene amínooxi de la forma : R-PEG(N) -0- (CH2)n-NH2 donde R es metilo, n es 3 y N es aproximadamente 5,000 MW. PEG-hGH se diluye entonces en regulador apropiado para análisis y purificación inmediata. Ejemplo 3 Conjugación con un PEG que consiste de un grupo hidroxiamina enlazado al PEG a través de un enlace de amida. Un reactivo PEG que tiene la siguiente estructura se acopla a un aminoácido codificado de manera no natural que contiene cetona utilizando el procedimiento descrito en el Ejemplo 3 R-PEG(N) -0- (CH2)2-NH-C(0) (CH2)n-0-NH2 donde R = metilo, n=4 y N es aproximadamente 20,000 MW. Las condiciones de reacción, purificación, y análisis son como se describe en el Ejemplo 3. Ejemplo 4 Este ejemplo detalla la introducción de dos aminoácidos codificados de manera no natural distintos en polipéptidos hGH. Este ejemplo demuestra un método para la generación de un polipéptido hGH que incorpora aminoácido codificado de manera no natural que comprende una funcionalidad de cetona en dos posiciones. El polipéptido hGH se prepara como se describe en la presente, excepto que el codón supresor se introduce en dos sitios distintos dentro del ácido nucleico. Ejemplo 5 Este ejemplo detalla la conjugación de polipéptido hGH a un PEG que contiene hidrazida y subsiguiente reducción in si tu . Un polipéptido hGH que incorpora un aminoácido que contiene carbonilo se prepara de acuerdo al procedimiento descrito en los Ejemplos 2 y 3. Una vez modificado, un PEG que contiene hidrazida que tiene la siguiente estructura se conjuga con el polipéptido hGH: R-PEG (N) -O- (CH2) 2-NH-C (O) (CH2) n-X-NH-NH2 donde R = metilo, n=2 y N = 10,000 MW y X es un grupo carbonilo (C=0) . El hGH purificado que contiene p-acetilfenilalanina se disuelve a entre 0.1-10 mg/mL en 25 mM MES (Sigma Chemical, St . Louis, MO) pH 6.0, 25 mM Hepes (Sigma Chemical, St . Louis, MO) pH 7.0 , o en 10 mM Acetato de Sodio (Sigma Chemical, St . Louis, MO) pH 4.5, se reacciona con un exceso de 1 a 100 veces de PEG que contiene hidrazida, y la hidrazona correspondiente se reduce in situ por adición de reserva 1M NaCNBH3 (Sigma Chemical, St . Louis, MO) , disuelto en H20, a una concentración final de 10-50 mM. Las reacciones se llevan a cabo en la oscuridad a 4°C a RT por 18-24 horas. Las reacciones se detienen por adición de 1 M Tris (Sigma Chemical, St . Louis, MO) a aproximadamente pH 7.6 a una concentración final Tris de 50 mM o se diluyen en regulador apropiado para purificación inmediata. Ejemplo 6 Este ejemplo detalla la introducción de un aminoácido que contiene alquino en un polipéptido hGH y derivación con mPEG-azida. Los residuos seleccionados se substituyen cada uno con el siguiente aminoácido codificado de manera no natural : El polipéptido hGH que contiene la propargil tirosina se expresa en P. fluorescens y purifica utilizando las condiciones descritas en la presente. El hGH purificado que contiene propargil-tirosina se disuelve a entre 0.1-10 mg/mL en regulador PB (100 mM fosfato de sodio, 0.15 M NaCl , pH = 8) y un exceso de 10 a 1000 veces de un PEG que contiene azida se agrega a la mezcla de reacción. Una cantidad catalítica de CuS04 y alambre Cu se agregan entonces a la mezcla de reacción. Después de que la mezcla se incuba (incluyendo pero no limitándose a, aproximadamente 4 horas a temperatura ambiente o 37°C, o durante la noche a 4°C) , H20 se agrega y la mezcla se filtra a través de una membrana de diálisis. La muestra puede analizarse para la adición de PEG, incluyendo pero no limitándose a, mediante procedimientos similares descritos en la presente. En este ejemplo, el PEG tendrá la siguiente estructura : R-PEG (N) -O- (CH2) 2-NH-C (O) (CH2) n-N3 donde R es metilo, n es 4 y N es 10,000 MW. Ejemplo 7 Este ejemplo detalla la substitución de un aminoácido hidrofóbico grande en un polipéptido hGH con propargil tirosina. Un residuo Phe, Trp o Tyr presente dentro de una de las siguientes regiones de hGH: 1 -5 (término N) , 6-33 (hélice A) , 34-74 (región entre hélice A y hélice B, el ciclo A-B) , 75-96 (hélice B) , 97-105 (región entre hélice B y hélice C, el ciclo B-C) , 106-129 (hélice C) , 130-153 (región entre hélice C y hélice D, el ciclo C-D) , 154-183 (hélice D) , 184-191 (término C) , se substituye con el siguiente aminoácido codificado de manera no natural como se describe en el Ejemplo 7 Una vez modificado, un PEG se une a la variante de polipéptido hGH que comprende el aminoácido que contiene alquino. El PEG tendrá la siguiente estructura: Me-PEG(N) -0- (CH2)2-N3 y se seguirían aquellos procedimientos de acoplamiento en el Ejemplo 7. Esto generaría una variante de polipéptido hGH que comprende un aminoácido codificado de manera no natural que es aproximadamente isostérico con uno de los aminoácidos hidrofóbicos grandes que ocurren de manera natural y que se modifica con un derivado de PEG en un sitio distinto dentro del polipéptido. Ejemplo 8 Este ejemplo detalla la generación de un homodímero, heterodímero, homomultímero, o heteromultímero de polipéptido hGH separado por uno o más enlazadores PEG. La variante de polipéptido hGH que contiene alquino producida en el Ejemplo 7 se reacciona con un derivado de PEG bifuncional de la forma: N3- (CHa)n-C(O) -NH- (CH2) 2-0-PEG (N) -O- (CH2) 2-NH-C (O) - (CH2)n-N3 donde n es 4 y el PEG tiene un MW promedio de aproximadamente 5,000, para generar el homodímero de polipéptido hGH correspondiente donde las dos moléculas hGH se separan físicamente por PEG. En una manera análoga un polipéptido hGH puede estar acoplado a uno o más otros polipéptidos para formar heterodímeros, homomultímeros, o heteromultímeros . Acoplamiento, purificación, y análisis se realizarán como en los Ejemplos 7 y 3. Ejemplo 9 Este ejemplo detalla el acoplamiento de un residuo de sacárido a un polipéptido hGH. Un residuo de hGH substituido con el aminoácido codificado no natural abajo como se describe en Ejemplo 3. Una vez modificada, la variante de polipéptido hGH que comprende el aminoácido que contiene carbonilo se reacciona con un análogo de aminooxi ß-enlazado de N-acetilglucosamina (GlcNAc) . La variante de polipéptido hGH (10 mg/mL) y el sacárido de aminooxi (21 mM) se mezclan en 100 mM de regulador de acetato de sodio acuoso (pH 5.5) e incuba a 37°C por 7 a 26 horas. Un segundo sacárido se acopla al primero enzimáticamente al incubar el polipéptido phGH conjugado con sacárido (5 mg/mL) con UDP-galactosa (16 mM) y ß-1 , 4-galacitosiltransferasa (0.4 unidades/mL) en 150 mM regulador HEPES (pH 7.4) por 48 horas a temperatura ambiente (Schanbacher et al. J Biol . Chem . 1970, 245, 5057-5061).

Ejemplo 10 La generación de un homodímero, heterodímero, homomultímero, o heteromultímero de polipéptido hGH en el cual las moléculas hGH en enlazan directamente. Una variante de polipéptido hGH que comprende el aminoácido que contiene alquino puede acoplarse directamente a otra variante de polipéptido hGH que comprende el aminoácido que contiene azida, cada uno de los cuales comprende substituciones de aminoácido codificado de manera no natural en los sitios descritos en, pero no limitándose a, Ejemplo 10. Esto generará el homodímero de polipéptido hGH correspondiente donde las dos variantes de polipéptido hGH se unen físicamente a la interfase de unión sitio II. En una manera análoga un polipéptido hGH puede estar acoplado a uno o más otros polipéptidos para formar heterodímeros, homomultímeros, o heteromultímeros . Acoplamiento, purificación, y análisis se realizan como en los Ejemplos 3, 6, y 7. Ejemplo 11 PEG-OH + Br- (CH2)n-C=CR' ? PEG-O- (CH2) n-C=CR' A B El glicol de polialquileno (P-OH) se reacciona con el haluro de alquilo (A) para formar el éter (B) . En estos compuestos, n es un entero de uno a nueve y R' puede ser un grupo heteroalquilo o alquilo Cl, a C20 de cadena recta o ramificada, saturada o no saturada. R' también puede ser un grupo heteroarilo o arilo substituido o no substituido, heteroalquilo cíclico o alquilo cíclico saturado o no saturado C3 a C7 o un grupo heteroalquilo o alcarilo substituido o no substituido (el alquilo es un alquilo saturado o no saturado Cl a C20) . Típicamente, PEG-OH es glicol de polietileno (PEG) o glicol de polietileno monometoxi (mPEG) que tiene un peso molecular de 800 a 40,000 Daltons (Da) . Ejemplo 12 mPEG-OH + Br-CH2 -C=CH ? mPEG-0-CH2-C=CH mPEG-OH con un peso molecular de 20,000 Da (mPEG-OH 20 kDa; 2.0 g, 0.1 mmol, Sunbio) se trata con NaH (12 mg, 0.5 mmol) en THF (35 mL) . Una solución de bromuro de propargilo, disuelto como una solución a 80% de peso en xileno (0.56 mL, 5 mmol, 50 equiv., Aldrich), y una cantidad catalítica de Kl se agregan entonces a la solución y la mezcla resultante se calienta a reflujo por 2 horas. Agua (1 mL) se agrega entonces y el solvente se remueve bajo vacío. Al residuo se agrega CH2C12 (25 mL) y la capa orgánica se separa, seca sobre Na2S04 anhidro, y el volumen se reduce a aproximadamente 2 mL. Esta solución de CH2C12 se agrega a éter dietilo (150 mL) gota a gota. El precipitado resultante se recolecta, enjuaga con varias porciones de éter dietilo frío, y se seca para proporcionar propargil -0-PEG.

Ejemplo 13 mPEG-OH + Br- (CH2)3-C=CH X mPEG-0- (CH2) 3-C=CH El mPEG-OH con un peso molecular de 20,000 Da (mPEG-OH 20 kDa; 2.0 g, 0.1 mmol, Sunbio) se trata con NaH (12 mg, 0.5 mmol) en THF (35 mL) . Cincuenta equivalentes de 5-bromo-l-pentina (0.53 mL, 5 mmol, Aldrich) y una cantidad catalítica de Kl se agregan entonces a la mezcla. La mezcla resultante se calienta a reflujo por 16 horas. Agua (1 mL) se agrega entonces y el solvente se remueve bajo vacío. Al residuo se agrega CH2C12 (25 mL) y la capa orgánica se separa, seca sobre Na2S04 anhidro, y el volumen se reduce a aproximadamente 2 mL. Esta solución CH2C12 se agrega a éter dietilo (150 mL) gota a gota. El precipitado resultante se recolecta, enjuaga con varias porciones de éter dietilo frío, y seca para proporcionar el alquino correspondiente. 5-cloro-1-pentino puede utilizarse en una reacción similar. Ejemplo 14 (1) m-HOCH2C6H4OH + NaOH + Br- CH2-C=CH ? n--HOCH2CsH40-CH2-C=CH (2) m-HOCH2C6H40-CH2-C=CH + MsCl + N(Et)3 ? ?r?-MSOCH2C6H40-CH2-C=CH (3) -TJ-MsOCHzCgHíO-CHz-C=CH + LiBr ? m-Br-CH2C6H40-CH2-C=CH (4) mPEG-OH + m-Br-CH2C6H40-CH2-C=CH ? mPEG-0-CH2-C6H40-CH2-C=CH A una solución de 3 -hidroxibencilalcohol (2.4 g, 20 mmol) en THF (50 mL) y agua (2.5 mL) se agrega primero hidróxido de sodio en polvo (1.5 g, 37.5 mmol) y después una solución de bromuro propargil, disuelta como una solución a 80% peso en xileno (3.36 mL, 30 mmol) . La mezcla de reacción se calienta a reflujo por 6 horas. A la mezcla se agrega 10% ácido cítrico (2.5 mL) y el solvente se remueve bajo vacío. El residuo se extrae con acetato de etilo (3 x 15 mL) y las capas orgánicas combinadas se enjuagan con solución de NaCl saturada (10 mL) , secan sobre MgS04 y concentran para dar el alcohol 3-propargiloxibencil . Cloruro de metanosulfonil (2.5 g, 15.7 mmol) y trietilamina (2.8 mL, 20 mmol) se agregan a una solución de compuesto 3 (2.0 g, 11.0 mmol) en CH2C12 a 0°C y la reacción se coloca en el refrigerador por 16 horas. Una elaboración usual proporcionó el mesilato como un aceite amarillo pálido. Este aceite (2.4 g, 9.2 mmol) se disuelve en THF (20 mL) y LiBr (2.0 g, 23.0 mmol) se agrega. La mezcla de reacción se calienta a reflujo por 1 hora y se enfría entonces a temperatura ambiente. A la mezcla se agrega agua (2.5 mL) y el solvente se remueve bajo vacío. El residuo se extrae con acetato de etilo (3 x 15 mL) y las capas orgánicas combinadas se enjuagan con solución de NaCl saturada (10 mL) , secan sobre anhidro Na2S0 , y concentran para dar el bromuro deseado. mPEG-OH 20 kDa (1.0 g, 0.05 mmol, Sunbio) se disuelve en THF (20 mL) y la solución se enfría en un baño de hielo. NaH (6 mg, 0.25 mmol) se agrega con agitación vigorosa durante un periodo de varios minutos seguido por la adición del bromuro obtenido de arriba (2.55 g, 11.4 mmol) y una cantidad catalítica de Kl . El baño frío se remueve y la mezcla resultante se calienta a reflujo por 12 horas. Agua (1.0 mL) se agrega a la mezcla y el solvente se remueve bajo vacío. Al residuo se agrega CH2C12 (25 mL) y la capa orgánica se separa, seca sobre Na2S04 anhidro, y el volumen se reduce a aproximadamente 2 mL. La adición gota a gota de una solución de éter (150 mL) resulten en un precipitado blanco, que se recolecta para producir el derivado de PEG. Ejemplo 15 mPEG-NH2 + X-C (O) - (CH2) n-C=CR' ? mPEG-NH-C (O) - (CH2) n-C=CR' Los polímeros de poli (glicol de etileno) que contienen alquino terminal también pueden obtenerse al acoplar un polímero de un polímero de poli (glicol de etileno) que contiene un grupo funcional terminal a una molécula reactiva que contiene la funcionalidad de alquino como se muestra arriba, n es entre 1 y 10. R' puede ser H o un grupo alquilo pequeño de Cl a C4.

Ej emplo 16 ( 1 ) H02C- (CH2 ) 2 - C=CH + NHS +DCC ? NHSO-C (O) - (CH2 ) 2 -C=CH ( 2 ) mPEG-NH2 + NHSO-C (O) - (CH2 ) 2 - C=CH ? mPEG-NH-C (O) - (CH2 ) 2 - C=CH Ácido 4-pentinóico (2.943 g, 3.0 mmol) se disuelve en CH2C12 (25 mL) . N-hidroxisuccinimida (3.80 g, 3.3 mmol) y DCC (4.66 g, 3.0 mmol) se agregan y la solución se agita durante la noche a temperatura ambiente. El éster NHS crudo resultante 7 se utiliza en la siguiente reacción sin purificación adicional. mPEG-NH2 con un peso molecular de 5,000 Da (mPEG-NH2, 1 g, Sunbio) se disuelve en THF (50 mL) y la mezcla se enfría a 4°C. éster NHS 7 (400 mg, 0.4 mmol) se agrega por porción con agitación vigorosa. La mezcla se deja agitar por 3 horas mientras se calienta a temperatura ambiente. Agua (2 mL) se agrega entonces y el solvente se remueve bajo vacío. Al residuo se agrega CH2Cl2 (50 mL) y la capa orgánica se separa, seca sobre Na2S04 anhidro, y el volumen se reduce a aproximadamente 2 mL. Esta solución CH2C1 se agrega a éter (150 mL) gota a gota. El precipitado resultante se recolecta y seca in vacuo. Ejemplo 17 Este ejemplo representa la preparación de éster sulfonil metano de poli (glicol de etileno) , que también puede referirse al metanosulfonato o mesilato de poli (glicol de etileno) . El tosilato correspondiente y los haluros pueden prepararse por procedimientos similares. mPEG-OH + CH3S02C1 + N(Et) 3 ? mPEG-0-S02CH3 -» mPEG-Nj mPEG-OH (MW = 3,400, 25 g, 10 mmol) en 150 mL de tolueno se destila azeotrópicamente por 2 horas bajo nitrógeno y la solución se enfría a temperatura ambiente. 40 mL de CH2C12 seco y 2.1 mL de trietilamina seca (15 mmol) se agregan a la solución. La solución se enfría en un baño de hielo y 1.2 mL of metanosulfonil cloruro destilado (15 mmol) se agrega gota a gota. La solución se agita a temperatura ambiente bajo nitrógeno durante la noche, y la reacción se enfría al agregar 2 mL de etanol absoluto. La mezcla se evapora bajo vacío para remover solventes, principalmente aquellos diferentes a tolueno, filtra, concentra de nuevo bajo vacío, y después de precipita en 100 mL de éter dietilo. El filtrado se enjuaga con varias porciones de éter dietilo frío y se seca in vacuo para proporcionar el mesilato. El mesilato (20 g, 8 mmol) se disuelve en 75 ml de THF y la solución sé enfría a 4°C. A la solución fría se agrega azida de sodio (1.56 g, 24 mmol) . La reacción se calienta a reflujo bajo nitrógeno por 2 horas. Los solventes se evaporan entonces y el residuo se diluye con CH2CI2 (50 mL) . La fracción orgánica se enjuaga con solución NaCl y seca sobre MgS0 anhidro. El volumen se reduce a 20 ml y el producto se precipita por la adición a 150 ml de éter seco frío . Ejemplo 18 (1) N3-C6H4-C02H ? N3-C6H4CH20H ( 2 ) N3 -C6H4CH2OH ? Br- CH2 - C6H4 -N3 ( 3 ) mPEG-OH + Br- CH2 - C6H4 -N3 ? mPEG-0-CH2 -C6H4 -N3 Un alcohol de 4-azidobencil puede producirse utilizando el método descrito en la Patente de E.U. 5,998,595, que se incorpora para referencia en la presente. Cloruro de metanosulfonil (2.5 g, 15.7 mmol) y trietilamina (2.8 mL, 20 mmol) se agregan a una solución de alcohol 4-azidobencil (1.75 g, 11.0 mmol) en CH2C12 a 0°C y la reacción se coloca en el refrigerador por 16 horas. Una elaboración usual proporcionó el mesilato como un aceite amarillo pálido. Este aceite (9.2 mmol) se disuelve en THF (20 mL) y LiBr (2.0 g, 23.0 mmol) se agrega. La mezcla de reacción se calienta a reflujo por 1 hora y se enfría entonces a temperatura ambiente. A la mezcla se agrega agua (2.5 mL) y el solvente se remueve bajo vacío. El residuo se extrae con acetato de etilo (3 x 15 mL) y las capas orgánicas combinadas se enjuagan con solución de NaCl saturada (10 mL) , secan sobre Na2S04 anhidro, y concentran para dar el bromuro deseado. mPEG-OH 20 kDa (2.0 g, 0.1 mmol, Sunbio) se trata con NaH (12 mg, 0.5 mmol) en THF (35 mL) y el bromuro (3.32 g, 15 mmol) se agrega a la mezcla junto con una cantidad catalítica de Kl . La mezcla resultante se calienta a reflujo por 12 horas. Agua (1.0 mL) se agrega a la mezcla y el solvente se remueve bajo vacío. Al residuo se agrega CH2C12 (25 mL) y la capa orgánica se separa, seca sobre anhidro Na2S04, y el volumen se reduce a aproximadamente 2 mL. La adición gota a gota a una solución de éter (150 mL) resultó en un precipitado, que se recolecta para producir mPEG-0-CH2-CeH4-N3. Ejemplo 19 NH2-PEG-0-CH2CH2C02H + N3-CH2CH2C?2-NHS ? N3-CH2CH2-C (O) NH-PEG-0-CH2CH2C02H NH2-PEG-0-CH2CH2C02H (MW 3,400 Da, 2.0 g) se disuelve en una solución acuosa saturada de NaHC03 (10 mL) y la solución se enfría a 0°C. Propionato de 3-azido-l-N-hidroxisuccinimido (5 equiv.) se agrega con agitación vigorosa. Después de 3 horas, 20 mL de H20 se agrega y la mezcla se agita por un adicional de 45 minutos a temperatura ambiente. El pH se ajusta a 3 con 0.5 N H2S04 y NaCl se agrega a una concentración de aproximadamente 15 % en peso. La mezcla de reacción se extrae con CH2C12 (100 mL x 3) , seca sobre Na2S04 y concentra. Después de la precipitación con éter dietilo frío, el producto se recolecta por filtración y se seca bajo vacío para producir el derivado de PEG omega-carboxi -azida . Ejemplo 20 mPEG-OMs + HC=CLi ? mPEG-0-CH2-CH2-C=C-H A una solución de acetilida de litio (4 equiv. ) , preparada como se sabe en la materia y enfriada a -78°C en THF, se agrega gota a gota una solución de mPEG-OMs disuelta en THF con agitación vigorosa. Después de 3 horas, la reacción se deja calentar a temperatura ambiente y se enfría con la adición de 1 mL de peroanol . 20 mL de H20 se agrega entonces y la mezcla se agita por un adicional de 45 minutos a temperatura ambiente. El pH se ajusta a 3 con 0.5 N H2S04 y NaCl se agrega a una concentración de aproximadamente 15% en peso. La mezcla de reacción se extrae con CH2C12 (100 mL x 3) , seca sobre Na2S04 y concentra. Después de la precipitación con éter dietilo frío, el producto se recolecta por filtración y seca bajo vacío para producir el glicol de 1- (but-3-iniloxi) -metoxiglicolpolietileno (mPEG) . Ejemplo 21 Los aminoácidos que contienen azida y se incorporan de manera selective en sitio en proteínas utilizando los métodos descritos en L. Wang, et al., (2001), Science 292:498-500, J. W. Chin et al., Science 301:964-7 (2003)), J. W. Chin et al., (2002), Journal of the American Chemical Society 124:9026-9027; J. W. Chin, & P. G. Schultz, (2002), Chem Bio Chem 11:1135-1137; J. W. Chin, et al., (2002), PNAS United States of America 99:11020- 11024: y, L. Wang, & P. G. Schultz, (2002), Chem. Comm. 1-10. Una vez que los aminoácidos se incorporen, la reacción de cicloadición se lleva a cabo con 0.01 mM proteína en regulador de fosfato (PB) , pH 8, en la presencia de 2 mM derivado de PEG, 1 mM CuS04, y -1 mg alambre Cu- por 4 horas a 37 °C.

Ejemplo 22 Este ejemplo describe la síntesis de p-Acetil-D, L-fenilalanina (pAF) y derivados de m-PEG-hidroxilamina. pAF racémico se sintetiza utilizando el procedimiento previamente descrito en Zhang, Z., Smith, B. A. C, Wang, L., Brock, A., Cho, C. & Schultz, P. G., Biochemistry, (2003) 42, 6735-6746. Para sintetizar el derivado de m-PEG-hidroxilamina, se completan los siguientes procedimientos. A una solución de ácido (N-t-Boc-aminooxi) acético (0.382 g, 2.0 mmol) y 1,3- Diisopropilcarbodiimida (0.16 mL, 1.0 mmol) en diclorometano (DCM, 70mL) , que se agita a temperatura ambiente (RT) por 1 hora, amina de glicol metoxi-polietileno (m-PEG-NH , 7.5 g, 0.25 mmol, Mt . 30 K, de BioVectra) y Diisopropiletilamina (0.1 mL, 0.5 mmol) se agregan. La reacción se agita a RT por 48 horas, y después se concentra a aproximadamente 100 mL. La mezcla se agrega gota a gota a éter frío (800 mL) . El producto t-Boc-protegido se precipita y se recolecta al filtrar, enjuagar por éter 3xlOOmL. Se purifica además al volver a disolver en DCM (100 mL) y precipitar en éter (800 mL) dos veces. El producto se seca al vacío produciendo 7.2 g (96%), se confirma por NMR y prueba de Nihidrirta. El deBoc del producto protegido (7.0 g) obtenido arriba se lleva a cabo en 50% TFA/DCM (40 mL) a 0°C por 1 hora y después a RT por 1.5 hora. Después de remover más de TFA al vacío, la sal de TFA del derivado de hidroxilamina se convierte en la sal de HCl al agregar 4N HCl en dioxano (lmL) al residuo. El precipitado se disuelve en DCM (50 mL) y vuelve a precipitar en éter (800 mL) . El producto final (6.8 g, 97%) se recolecta al filtrar, se enjuaga con éter 3xl00mL, seca al vacío, almacena bajo nitrógeno. Otros derivados de PEG (5K, 20K) hidroxilamina se sintetizan utilizando el mismo procedimiento . Ejemplo 23 Este ejemplo describe los métodos de expresión y purificación utilizados para polipéptidos hGH que comprenden un aminoácido no natural . Las células huésped se han transformado con construcciones de tARN ortogonal, aminoacil tARN sintetasa ortogonal, y hGH. Un pedazo pequeño de una reserva de glicerol congelada de las células DH10B(fis3) transformadas se desarrolla primero en 2 ml de medio definido (medio mínimo de glucosa complementado con leucina, isoleucina, metales indicadores y vitaminas) con 100 µg/ml ampicilina a 37°C. Cuando OD60O alcanzó 2-5, 60 µl se transforman en 60 ml de medio definido fresco con 100 µg/ml de ampicilina y de nuevo se desarrollan a 37°C a un OD60O de 2-5. 50 ml del cultivo se transfieren a 2 litros de medio definido con 100 µg/ml ampicilina en un fermentador de 5 litros (Sartorius BBI) . El pH del fermentado se controla a pH 6.9 con carbonato de potasio, la temperatura a 37°C, la velocidad de flujo de aire a 5 lpm, y espuma con el desespumador de polialquileno KFO F119 (Lubrizol) . Las velocidades del agitador se ajustan automáticamente para mantener los niveles de oxígeno disueltos _> 30% y el oxígeno puro se utiliza para complementar ahorrar aire si las velocidades del agitador alcanzaron su valor máximo. Después de 8 horas a 37°C, el cultivo se alimenta con un 50X concentrado del medio definido a una velocidad exponencialmente creciente para mantener una velocidad de crecimiento específica de 0.15 hora"1. Cuando ODgoo alcanzó aproximadamente 100, una mezcla racémica de para-acetil- fenilalanina se agrega a una concentración final de 3.3 mM, y la temperatura se enfría a 28°C. Después de 0.75 hora, isopropil-b-D-thiogalactopiranoside se agrega a una concentración final de 0.25 mM. Las células se desarrollan un adicional de 8 horas a 28°C, forman en bolitas, y congelan a -80 C hasta su procesamiento adicional. Las proteínas hGH mutantes marcadas con His se purifican utilizando Resina Quelante de Níquel ProBond (Invitrogen, Carlsbad, CA) a través de los procedimientos de purificación de proteína marcada His estándar proporcionados por el manil de instrucción de Invitrogen, seguido por una columna de intercambio de anión. hGH purificado se concentra a 8 mg/ml y el regulador se intercambia con el regulador de reacción (20 mM acetato de sodio, 150 mM NaCl , 1 mM EDTA, pH 4.0). El polvo de MPEG-Oxiamina se agrega a la solución hGH en una proporción molar 20:1 de PEG: hGH. La reacción se lleva a cabo a 28°C por 2 días con agitación gentil. PEG-hGH se purifica a partir de un PEG y hGH sin reaccionar a través de una columna de intercambio de anión. La calidad de cada hGH mutante PEGilada se evalúa por estos ensayos antes de entrar a los experimentos animales. La pureza del PEG-hGH se examina al correr un gel NuPAGE Bis-Tris de archilamida al 4-12% con regulador que corre MES SDS bajo condiciones no reductoras (Invitrogen) . Los geles se colorean con azul Coomassie. La banda PEG-hGH es mayor que 95% puro en base a exploración de densitometría. El nivel de endotoxina en cada PEG-hGH se prueba para un ensayo LAL cinético utilizando el kit KTA2 de Charles River Laboratories (Wilmington, MA) , y fue menor a 5 EU por dosis. La actividad biológica del PEG-hGH se valora con el bioensayos IM-9 pSTAT5 (mencionado en el Ejemplo 2) , y el valor ECSo fue menos de 15 nM. Ejemplo 24 Este ejemplo describe métodos para medir actividad in vi tro e in vivo de hGH PEGilado. Ensayos de Unión Celular Las células (3xl06) se incuban por duplicado en PBS/1% BSA (100 µl) en la ausencia o presencia de varias concentraciones (volumen: 10 µl) de GH, hGH o GM-CSF sin etiquetas y en la presencia de 125I-GH (aprox. 100,000 cpm o 1 ng) a 0°C por 90 minutos (volumen total: 120 µl) . Las células se vuelven a suspender y se colocan sobre 200 µl FSC frío en un tubo centrífugo de plástico de 350 µl y se centrífuga (1000 g; 1 minuto) . La bola se recolecta al cortar el final del tubo y la bola y sobrenadante se cuentan por separado en un contador gamma (Packard) . La unión específica (cpm) se determina como unión total en la ausencia de un competidor (promedio de duplicados) menos unión (cpm) en la presencia de un exceso de 100 veces de HG no marcado (unión no específica) . La unión no específica se mide para cada uno de los tipos celulares utilizados. Los experimentos se corren por separado los días utilizando la misma preparación de 1 5I-GH y deberían desplegar consistencia interna. 125I-GH demuestra la unión a las células que producen el receptor GH. La unión se inhibe en una manera dependiente de dosis por hGH o GH natural sin marcar, pero no por GM-CSF u otro control negativo. La habilidad de hGH para competir con la unión de 125 I-GH natural, similar a GH natural, sugiere que los receptores reconocen ambas formas igualmente bien.

Secuencias ATGAGCGATT TCAGGATAAT TGAGGAGAAG TGGCAGAAGG CGTGGGAGAA Smtetasa de RS GGACAGAATT TTTGAGTCCG ATCCTAATGA GAAGGAGAAG TTTTTTCTCA tARN leucilo CAATTCCCTA TCCTTACCTT AATGGAAATC TTCACGCAGG TCACACGAGA archaeoglobu ACCTTCACAA TTGGCGATGC CTTCGCCAGA TACATGAGAA TGAAGGGCTA s fulgidus CAACGTTCTC TTTCCCCTCG GCTTTCATGT TACGGGCACC CCAATCATTG (AFLRS) GCCTTGCGGA GCTCATAGCC AAGAGGGACG AGAGGACGAT AGAGGTTTAC ACCAAATACC ATGACGTTCC GCTGGAGGAC TTGCTTCAGC TCACAACTCC AGAGAAAATC GTTGAGTACT TCTCAAGGGA GGCGCTGCAG GCTTTGAAGA GCATAGGCTA CTCCATTGAC TGGAGGAGGG TTTTCACCAC AACCGATGAA GAGTATCAGA GATTCATCGA GTGGCAGTAC TGGAAGCTCA AGGAGCTTGG CCTGATTGTG AAGGGCACCC ACCCCGTCAG ATACTGCCCC CACGACCAGA ATCCTGTTGA AGACCACGAC CTTCTCGCTG GGGAGGAGGC AACTATTGTT GAATTTACCG TTATAAAGTT CAGGCTTGAA GATGGAGACC TCATTTTCCC CTGTGCAACT CTCCGTCCCG AAACCGTGTT TGGCGTCACG AACATCTGGG TAAAGCCGAC AACCTACGTA ATTGCCGAGG TGGATGGGGA AAAGTGGTTT GTGAGCAAAG AGGCTTACGA GAAGCTCACC TACACGGAGA AAAAAGTCAG GCTGCTGGAG GAGGTTGATG CGTCGCAGTT CTTCGGCAAG 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GCTCTGATCC AAGGCAAACT GCCAAAATAT CTGCTGGCAC CGGAAGTCAG CGCCCTGCAC CATTATGTTC CGGATCTGCA TCGCAGGATG CTGCTGGCTA CCCTGTGGAA CACCTACATC TGTATTAACG AAGCGCTGGC ATTGACCCTG AGTGATTTTT CTCTGGTGCC GCCCTATCCC TTTGTGCAGC TTGCCACGCT CAAAGGGGTT TGAGGTCCAA CCGTACGAAA ACGTACGGTA AGAGGAAAAT TATCGTCTGA AAAATCGATT AGTAGACAAG AAAGTCCGTT AAGTGCCAAT TTTCGATTAA AAAGACACCG TTTTGATGGC GTTTTCCAAT GTACATTATG TTTCGATATA TCAGACAGTT ACTTCACTAA CGTACGTTTT CGTTCTATTG GCCTTCAGAC CCCATATCCT TAATGTCCTT TATTTGCTGG GGTTATCAGA TCCCCCCGAC ACGTTTAATT AATGCTTTCT CCGCCGGAGA TCGACGCACA GGCTTCTGTG TCTATGATGT TATTTCTTAA TAATCATCCA GGTATTCTCT TTATCACCAT ACGTAGTGCG AGTGTCCACC TTAACGCAGG GCTTTCCGTC ACAGCGCGAT ATGTCAGCCA GCGGGGCTTT CTTTTGCCAG ACCGCTTCCA TCCTCTGCAT TTCAGCAATC TGGCTATACC CGTCATTCAT AAACCACGTA AATGCCGTCA CGCAGGAAGC CAGGACGAAG AATATCGTCA GTACAAGATA AATCGCGGAT TTCCACGTAT AGCGTGACAT CTCACGACGC ATTTCATGGA TCATCGCTTT CGCCGTATCG GCAGCCTGAT TCAGCGCTTC TGTCGCCGGT TTCTGCTGTG CTAATCCGGC TTGTTTCAGT TCTTTCTCAA CCTGAGTGAG CGCGGAACTC 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GGTGAATACC GTCATTAATG CGTTCAGAGA ACATGATATG GGCGTGGGGC TGCTCGCCAC CGGCTATCGC TGCTTTCGGA TTATGGATAG CGAACTGATA GGCATGGCGG TCGCCAATTT CCTGTTGGAC AAAATCGCGG ACAAGCTCAA GACGTTGTTC GGGTTTTAAC TCACGCGGCA GGGCAATCTC GATTTCACGG TAGGTACAGC CGTTGGCACG TTCAGACGTG TCAGCGGCTT TCCAGAACTC GGACGGTTTA TGCGCTGCCC ACGCCGGCAT ATTGCCGGAC TCCTTGTGCT CAAGGTCGGA GTCTTTTTCA CGGGCATACT TTCCCTCACG CGCAATATAA TCGGCATGAG GAGAGGCACT GCCTTTTCCG CCGGTTTTTA CGCTGAGATG ATAGGATGCC ATCGTGTTTT ATCCCGCTGA AGGGCGCACG TTTCTGAACG AAGTGAAGAA AGTCTAAGTG CGCCCTGATA AATAAAAGAG TTATCAGGGA TTGTAGTGGG ATTTGACCTC CTCTGCCATC ATGAGCGTAA TCATTCCGTT AGCATTCAGG AGGTAAACAG CATGAATAAA AGCGAAAAAA CAGGAACAAT GGGCAGCAGA AAGAGTGCAG TATATTCGCG GCTTAAAGTC GCCGAATGAG CAACAGAAAC TTATGCTGAT ACTGACGGAT AAAGCAGATA AAACAGCACA GGATATCAAA ACGCTGTCCC TGCTGATGAA GGCTGAACAG GCAGCAGAGA AAGCGCAGGA AGCCAGAGCG AAAGTCATGA ACCTGATACA GGCAGAAAAG CGAGCCGAAG CCAGAGCCGC CCGTAAAGCC CGTGACCATG CTCTGTACCA GTCTGCCGGA TTGCTTATCC TGGCGGGTCT GGTTGACAGT AATASGGGTA AGCCTGTTGA TGATACCGCT GCCTTACTGG GTGCATTAGC CAGTCTGAAT GACCTGTCAC GGGATAATCC GAAGTGGTCA GACTGGAAAA TCAGAGGGCA GGAACTGCTG AACAGCAAAA AGTCAGATAG CACCACATAG CAGACCCGCC ATAAAACGCC CTGAGAAGCC CGTGACGGGC TTTTCTTGTA TTATGGGTAG TTTCCTTGCA TGAATCCATA AAAGGCGCCT GTAGTGCCAT TTACCCCCAT TCACTGCCAG AGCCGTGAGC GCAGCGAACT GAATGTCACG AAAAAGACAG CGACTCAGGT GCCTGATGGT CGGAGACAAA AGGAATATTC AGCGATTTGC CCGAGCTTGC GAGGGTGCTA CTTAAGCCTT TAGGGTTTTA AGGTCTGTTT TGTAGAGGAG CAAACAGCGT TTGCGACATC CTTTTGTAAT ACTGCGGAAC TGACTAAAGT AGTGAGTTAT ACACAGGGCT GGGATCTATT CTTTTTATCT TTTTTTATTC TTTCTTTATT CTATAAATTA TAACCACTTG AATATAAACA AAAAAAACAC ACAAAGGTCT AGCGGAATTT ACAGAGGGTC TAGCAGAATT TACAAGTTTT CCAGCAAAGG TCTAGCAGAA TTTACAGATA CCCACAACTC AAAGGAAAAG GACTAGTAAT TATCATTGAC TAGCCCATCT CAATTGGTAT AGTGATTAAA ATCACCTAGA CCAATTGAGA TGTATGTCTG AATTAGTTGT TTTCAAAGCA AATGAACTAG CGATTAGTCG CTATGACTTA ACGGAGCATG AAACCAAGCT AATTTTATGC TGTGTGGCAC TACTCAACCC CACGATTGAA AACCCTACAA GGAAAGAACG GACGGTATCG TTCACTTATA ACCAATACGC TCAGATGATG AACATCAGTA GGGAAAATGC TTATGGTGTA TTAGCTAAAG CAACCAGAGA GCTGATGACG AGAACTGTGG AAATCAGGAA TCCTTTGGTT AAAGGCTTTG AGATTTTCCA GTGGACAAAC TATGCCAAGT TCTCAAGCGA AAAATTAGñA TTAGTTTTTA GTGAAGAGAT ATTGCCTTAT CTTTTCCAGT TAAAAAAATT CATAAAATAT AATCTGGAAC ATGTTAAGTC TTTTGAAAAC AAATACTCTA TGAGGATTTA TGAGTGGTTA TTAAAAGAAC TAACACAAAA GAAAACTCAC AAGGCAAATA TAGAGATTAG CCTTGATGAA TTTAAGTTCA TGTTAATGCT TGAAAATAAC TACCATGAGT TTAAAAGGCT TAACCAATGG GTTTTGAAAC CAATAAGTAA AGATTTAAAC ACTTACAGCA ATATGAAATT GGTGGTTGAT AAGCGAGGCC GCCCGACTGA TACGTTGATT TTCCAAGTTG AACTAGATAG ACAAATGGAT CTCGTAACCG AACTTGAGAA CAACCAGATA AAAATGAATG GTGACAAAAT ACCAACAACC ATTACATCAG ATTCCTACCT ACGTAACGGA CTAAGAAAAA CACTACACGA TGCTTTAACT GCAAAAATTC AGCTCACCAG TTTTGAGGCA AAATTTTTGA GTGACATGCA AAGTAAGCAT GATCTCAATG GTTCGTTCTC ATGGCTCACG CAAAAACAAC GAACCACACT AGAGAACATA CTGGCTAAAT ACGGAAGGAT CTGAGGTTCT TATGGCTCTT GTATCTATCA GTGAAGCATC AAGACTAACA AACAAAAGTA GAACAACTGT TCACCGTTAG ATATCAAAGG GAAAACTGTC CATATGCACA GATGAAAACG GTGTAAAAAA GATAGATACA TCAGAGCTTT TACGAGTTTT TGGTGCATTT AAAGCTGTTC ACCATGAACA GATCGACAAT GTAACAGATG AACAGCATGT AACACCTAAT AGAACAGGTG AAACCAGTAA AACAAAGCAA CTAGAACATG AAATTGAACA CCTGAGACAA CTTGTTACAG CTCAACAGTC ACACATAGAC AGCCTGAAAC AGGCGATGCT GCTTATCGAA TCAAAGCTGC CGACAACACG GGAGCCAGTG ACGCCTCCCG TGGGGAAAAA ATCATGGCAA TTCTGGAAGA AATAGCGCTT TCAGCCGGCA AACCTGAAGC CGGATCTGCG ATTCTGATAA CAAACTAGCA ACACCAGAAC AGCCCGTTTG CGGGCAGCAA AACCCGTACT TTTGGACGTT CCGGCGGTTT TTTGTGGCGA GTGGTGTTCG GGCGGTGCGC GCAAGATCCA TTATGTTAAA CGGGCGAGTT TACATCTCAA AACCGCCCGC TTAACACCAT CAGAAATCCT CAGCGCGATT TTAAGCACCA ACCCCCCCCC GTAACACCCA AATCCATACT GAAAGTGGCT TTGTTGAATA AATCGAACTT TTGCTGAGTT GAAGGATCAG ATCACGCATC CTCCCGACAA CACAGACCAT TCCGTGGCAA AGCAAAAGTT CAGAATCACC AACTGGTCCA CCTACAACAA AGCTCTCATC AACCGTGGCT CCCTCACTTT CTGGCTGGAT GATGAGGCGA TTCAGGCCTG GTATGAGTCG GCAACACCTT CATCACGAGG AAGGCCCCAG CGCTATTCTG ATCTCGCCAT CACCACCGTT CTGGTGATTA AACGCGTATT CCGGCTGACC CTGCGGGCTG CGCAGGGTTT TATTGATTCC ATTTTTGCCC TGATGAACGT TCCGTTGCGC TGCCCGGATT ACACCAGTGT CAGTAAGCGG GCAAAGTCGG TTAATGTCAG TTTCAAAACG TCCACCCGGG GTGAAATCGC ACACCTGGTG ATTGATTCCA CCGGGCTGAA GGTCTTTGGT GAAGGCGAAT GGAAAGTCAG AAAGCACGGC AAAGAGCGCC GTCGTATCTG GCGAAAGTTG CATCTTGCTG TTGACAGCAA CACACATGAA GTTGTCTGTG CAGACCTGTC GCTGAATAAC GTCACGGACT CAGAAGCCTT CCCGGGCCTT ATCCGGCAGA CTCACAGAAA AATCAGGGCA GCCGCGGCAG ACGGGGCTTA CGATACCCGG CTCTGTCACG ATGAACTGCG CCGCAAAAAA ATCAGCGCGC TTATTCCTCC CCGAAAAGGT GCGGGTTACT GGCCCGGTGA ATATGCAGAC CGTAACCGTG CAGTGGCTAA TCAGCGAATG ACCGGGAGTA ATGCGCGGTG GAAATGGACA ACAGATTACA ACCGTCGCTC GATAGCGGAA ACGGCQATGT ACCGGGTAAA ACAGCTGTTC GGGGGTTCAC TGACGCTGCG TGACTACGAT GGTCAGGTTG CGGAGGCTAT GGCCCTGGTA CGAGCGCTGA ACAAAATGAC GAAAGCAGGT ATGCCTGAAA GCGTGCGTAT TGCCTGAAAA CACAACCCGC TACGGGGGAG ACTTACCCGA AATCTGATTT ATTCAACAAA GCCGGGTGTG GTGAACTACA AAGCAGACCC GTTGAGGTTA TCAGTTCGAT GCACAATCAG CAGCGCATAA AATATGCACA AGAACAGGAG CACCCTTCGC ATTAAGCTGT GGTGGTAACA AGTAGTGCCG GGCTACCATC AGCGAGCATG ATGCGCTCCC ACAGCATTCG CCTTGGCAGT ATGGAAGTTC CTCGCTCCAG TTCGGGCCGG TATCCACCTC GAGAGGTGGC ACTTTTCGGG GAAATGTGCG CGGAACCCCT ATTTGTTTAT TTTTCTAAAT ACATTCAAAT ATGTATCCGC TCATGAGACA ATAACCCTGA TAAATGCTTC AATAATATTG AAAAAGGAAG AGTATGAGTA TTCAACATTT CCGTGTCGCC CTTATTCCCT TTTTTGCGGC ATTTTGCCTT CCTGTTTTTG CTCACCCAGA AACGCTGGTG AAAGTAAAAG ATGCTGAAGA TCAGTTGGGT GCACGAGTGG GTTACATCGA ACTGGATCTC AACAGCGGTA AGATCCTTGA GAGTTTTCGC CCCGAAGAAC GTTTTCCAAT GATGAGCACT TTTAAAGTTC TGCTATGTGG CGCGGTATTA TCCCGTGTTG ACGCCGGGCA AGAGCAACTC GGTCGCCGCA TACACTATTC TCAGAATGAC TTGGTTGAGT ACTCACCAGT CACAGAAAAG CATCTTACGG ATGGCATGAC AGTAAGAGAA TTATGCAGTG CTGCCATAAC CATGAGTGAT AACACTGCGG CCAACTTACT TCTGACAACG ATCGGAGGAC CGAAGGAGCT AACCGCTTTT TTGCACAACA TGGGGGATCA TGTAACTCGC CTTGATCGTT Rnf?aarrRRa «GTGAATGAA GGGATACCAA ACGACGAGCG TGACACCACG ATGCCTGCAG CAATGGCAAC AACGTTGCGC AAACTATTAA CTGGCGAACT ACTTACTCTA GCTTCCCGGC AACAATTAAT AGACTGGATG GAGGCGGATA AAGTTGCAGG ACCACTTCTG CGCTCGGCCC TTCCGGCTGG CTGGTTTATT GCTGATAAAT CTGGAGCCGG TGAGCGTGGG TCTCGCGGTA TCATTGCAGC ACTGGGGCCA GATGGTAAGC CCTCCCGTAT CGTAGTTATC TACACGACGG GGAGTCAGGC AACTATGGAT GAACGAAATA GACAGATCGC TGAGATAGGT GCCTCACTGA TTAAGCATTG GTAACCCGGG ACCAAGTTTA CTCATATATA CGGACAGCGG TGCGGACTGT TGTAACTCAG AATAAGAAAT GAGGCCGCTC ATGGCGTTCT GTTGCCCGTC TCACTGGTGA AAAGAAAAAC AACCCTGGCG CCGCTTCTTT GAGCGAACGA TCAAAAATAA GTGGCGCCCC ATCAAAAAAA TATTCTCAAC ATAAAAAACT TTGTGTAATA CTTGTAACGC T ATGCGCACGC TTCTGATCGA CAACTACGAC TCGTTCACCC AGAACCTGTT Tres genes plás CCAGTACATC GGCGAGGCCA CCGGGCAGCC CCCCGTCGTG CCCAACGACG (papABC) mido CCGACTGGTC GCGGCTGCCC CTCGAGGACT TCGACGCGAT CGTCGTGTCC CCGGGCCCCG GCAGCCCCGA CCGGGAACGG GACTTCGGGA TCAGCCGCCG GGCGATCACC GACAGCGGCC TGCCCGTCCT CGGCGTCTGC CTCGGCCACC AGGGCATCGC CCAGCTCTCG GCGGAACCCA TGCACGGCCG GGTCTCCGAG GTGCGGCACA CCGGCGAGGA CGTCTTCCGG GGCCTCCCCT CGCCGTTCAC CGCCGTGCGC TACCACTCCC TGGCCGCCAC CGACCTCCCC GACGAGCTCG AACCCCTCGC CTGGAGCGAC GACGGCGTCG TCATGGGCCT GCGGCACCGC GAGAAGCCGC TGATGGGCGT CCAGTTCCCA CCGGAGTCCA TCGGCAGCGA CTTCGGCCGG GAGATCATGG CCAACTTCCG CGACCTCGCC CTCGCCCACC ACCGGGCACG TCGCGACGCG GCCGACTGGG GCTACGAACT CCACGTGCGC CGCGTCGACG TGCTGCCGGA CGCCGAAGAG GTACGCCGCG CTGCCTGCCC GGCCGAGGGC GCCACGTTCT GGCTGGACAG CAGCTCCGTC CTCGAAGGCG CCTCGCCGTT CTCCTTCCTC GGCGACGACC GCGGCCCGCT CGCCGAGTAC CTCACCTACC GCGTCGCCGA CGGCGTCGTC TCCGTCCGCG GCTCCGACGG CACCACGACC CGGGACGCGG CGACCCTCTT CAGCTACCTG GAGGAGCAGC TCGAACCGCC GGCGGGTCCC GTCGCCCCCG ACCTGCCCTT CGAGTTCAAC CTCGGCTACG TCGGCTACCT CGGCTACGAG CTGAAGGCGG AGACCACCGG CGACCCCGCA GTACCGGCCC CGCACCCCGA CGCCGCGTTC CTCTTCGCCG ACCGCGCCAT CGCCCTCGAC CACCAGGAAG GCTGCTGCTA CCTGCTGGCC CTCGACCGCC GGGGCCACGA CGACGGCGCC CGCGCCTGGC TGCGGGAGAC GGCCGAGACC CTCACCGGCC TGGCCGTCCG CGTCCGGCCG AGGCCGACCC CCGCCATGGT CTTCGGGGTC CCCGAGGCGG CGGCCGGCTT CGGCCCCCTG GCTCGCGCAC GCCACGACAA GGACGCCTCG GCGCTCCGCA ACGGCGAGTC GTACGAGATC TGCCTGACCA ACATGGTCAC CGCGCCGACC GAGGCGACGG CCCTGCCGCT CTACTCCGCG CTGCGCCGCA TCAGCCCCGT CCCGTCTGGC GCCCTGCTCG AGTTCCCCGA GCTGTCGGTG CTCAGCGCCT CGCCCGAGCG GTTCCTCACG ATCGGCGCCG ACGGCGGCGT CGAGTCCAAG CCCATCAAGG GGACCCGCCC CCGGGGCGCA CCGGCGGAGG AGGACGAGCG GCTCCGCGCC GACCTGGCCG GCCGGGAGAA GGACCGGGCC GAGAACCTGA TGATCGTCGA CCTGGTCCGC AACGACCTCA ACAGCGTCTG CGCGATCGGC TCCGTCCACG TGCCCCGGCT CTTCGAGGTG GGAGACCTCG CGCCCGTGCA CCAGCTGGTG TCGACCATCC GGGGACGGCT GCGGCCCGGC ACCAGCACCG CCGCCTGCGT ACGCGCCGCC TTCCCCGGCG GCTCCATGAC CGGCGCGCCC AAGAAGCGAC CCATGGAGAT—GATCGACCGC CTGGAGGAAG GCCCCCGGGG CGTCTTACCC GGGGCGCTCG GATGGTTCGC CCTCAGCGGC GCCGCCGACC TCAGCATCGT CATCCGCACC ATCGTGCTGG CCGACGGCCG GGCCGAGTTC GGCGTCGGCG GGGCGATCGT GTCCCTCTCC GACCAGGAGG AGGAGTTCAG GCAGACCGTG GTCAAGGCCC GCGCCATGGT CACCGCCCTC GACGGCAGCG CAGTGGCGGG CGCCCGATGA GCGGCTTCCC CCGGAGCGTC GTCGTCGGCG GCAGCGGAGC GGTGGGCGGC ATGTTCGCCG GGCTGCTGCG GGAGGCGGGC AGCCGCACGC TCGTCGTCGA CCTCGTACCG CCGCCGGGAC GGCCGGACGC CTGCCTGGTG GGCGACGTCA CCGCGCCGGG GCCCGAGCTC GCGGCCGCCC TCCGGGACGC GGACCTCGTC CTGCTCGCCG TACACGAGGA CGTGGCCCTC AAGGCCGTGG CGCCCGTGAC CCGGCTCATG CGACCGGGCG CGCTGCTCGC CGACACCCTG TCCGTCCGGA CGGGCATGGC CGCGGAGCTC GCGGCCCACG CCCCCGGCGT CCAGCACGTG GGCCTCAACC CGATGTTCGC CCCCGCCGCC GGCATGACCG GCCGGCCCGT GGCCGCCGTG GTCACCAGGG ACGGGCCGGG CGTCACGGCC CTGCTGCGGC TCGTCGAGGG CGGCGGCGGC AGGCCCGTAC GGCTCACGGC GGAGGAGCAC GACCGGACGA CGGCGGCGAC CCAGGCCCTG ACGCACGCCG TGATCCTCTC CTTCGGGCTC GCCCTCGCCC GCCTCGGCGT CGACGTCCGG GCCCTGGCGG CGACGGCACC GCCGCCCCAC CAGGTGCTGC TCGCCCTCCT GGCCCGTGTG CTCGGCGGCA GCCCCGAGGT GTACGGGGAC ATCCAGCGGT CCAACCCCCG GGCGGCGTCC GCGCGCCGGG CGCTCGCCGA GGCCCTGCGC TCCTTCGCCG CGCTGATCGG CGACGACCCG GACCGCGCCG AGGACCCGGA CCGCGCCGAC GACCCCGACC GCACCGACAA CCCCGGCCAT CCCGGGGGAT GCGACGGCGC CGGGAACCTC GACGGCGTCT TCGAGGAACT CCGCCGGCTC ATGGGACCGG AGCTCGCGGC GGGCCAGGAC CACTGCCAGG AGCTGTTCCG CACCCTCCAC CGCACCGACG ACGAAGGCGA GAAGGACCGA TGACCGAGCA GAACGAGCTG CAGGTTGCGG CTGCGCGCGG AGCTCGACGC CCTCGACGGG ACGCTTCTGG ACACGGTGCG GCGCCGCATC GACCTCGGTG TCCGCATCGC GCGGTACAAG TCCCGGCACG GCGTCCCGAT GATGCAGCCC GGCCGGGTCA GCCTGGTCAA GGACAGGGCC GCCCGCTACG CCGCCGACCA CGGCCTCGAC GAATCGTTCC TGGTGAACCT CTACGACGTG ATCATCACGG AGATGTGCCG CGTCGAGGAC CTGGTGATGA GCCGGGAGAG CCTGACGGCC GAGGACCGGC GGTGA

Claims (15)

1. REIVINDICACIONES 1. Una composición que comprende un sistema de traducción en una especie de Pseudomonas o cepa derivada de la misma, el sistema de traducción comprende un tARN ortogonal (O-tARN) y una aminoacil tARN sintetasa ortogonal (O-RS) , en donde el O-RS preferentemente aminoacila el O-tARN con al menos un aminoácido no natural en el sistema de traducción y el O-tARN reconoce al menos un codón selector.
2. 2. La composición de la reivindicación 1, en donde el sistema de traducción comprende un sistema de traducción in vi tro derivado de una especie de Pseudomonas o cepa de las mismas.
3. 3. La composición de la reivindicación 1, en donde el sistema de traducción comprende una extracto celular de una especie de Pseudomonas o cepa de las mismas.
4. 4. La composición de la reivindicación 1, en donde el O-tARN comprende un ácido nucleico que Comprende una secuencia de polinucleótidos seleccionada del grupo que consiste de: SEQ ID NO: 1-3 y una secuencia de polinucleótidos complementaria de las mismas.
5. 5. La composición de la reivindicación 1, en donde el O-RS comprende un polipéptido seleccionado del grupo que consiste de: un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 4-34, un polipéptido codificado por un ácido nucleico que comprende una secuencia de polinucleótidos seleccionado del grupo que consiste de: SEQ ID NO: 35-66 y una secuencia de polinucleótidos complementaria de las mismas.
6. 6. La composición de la reivindicación 1, en donde el al menos un aminoácido no natural se selecciona del grupo que consiste de: una O-metil-L-tirosina, una L-3- (2-naftil) alanina, una 3-metil-fenilalanina, una 0-4-alil-L-tirosina, una 4-propil-L-tirosina, una tri-O-acetil-GlcNAcß-serina, una L-Dopa, una fenilalanina fluorinada, una isopropil-L-fenilalanina, una p-azido-L-fenilalanina, una p-acil-L-fenilalanina, una p-benzoil-L-fenilalanina, una L-fosfoserina, una fosfonoserina, una fosfonotirosina, una p-yodo-fenilalanina, una p-bromofenilalanina, una p-amino-L-fenilalanina, una isopropil-L-fenilalanina, un análogo no natural de un aminoácido de tirosina; un análogo no natural de un aminoácido de glutamina; un análogo no natural de un aminoácido de fenilalanina; un análogo no natural de un aminoácido de serina; un análogo no natural de un aminoácido de treonina; un alquilo, arilo, acilo, azida, ciano, halo, hidrazina, hidrazida, hidróxilo, alquenilo, alquinilo, éter, tiol, sulfonilo, seleno, éster, tioácido, borato, boronato, fosfo, fosfono, fosfina, heterocíclico, enona, imina, aldehido, hidroxilamina, ceto, o aminoácido substituido por amino, o cualquier combinación de los mismos; un aminoácido con un reticulador fotoactivable; un aminoácido etiquetado por espín; un aminoácido fluorescente; un aminoácido con un nuevo grupo funcional; un aminoácido que interactúa covalente o no covalentemente con otra molécula; un aminoácido de unión a metal; un aminoácido que contiene metal; un aminoácido radioactivo; un aminoácido fotoguardado y/o fotoisomerizable; un aminoácido que contiene biotina o análogo de biotina; un aminoácido modificado por carbohidrato o glusosilado; un aminoácido que contiene ceto; aminoácidos que comprenden glicol de polietileno o poliéter; un aminoácido substituido por átomo pesado; un aminoácido fotodesdoblable o químicamente desdoblable; un aminoácido con una cadena lateral alargada; un aminoácido que contiene un grupo tóxico; un aminoácido substituido por azúcar, e.g., una serina substituida por azúcar o lo similar; un aminoácido que contiene un azúcar enlazada a carbono; un aminoácido activo redox; un ácido que contiene a-hidroxi; un aminoácido que contiene amino tio ácido; un aminoácido a,a disubstituido; un ß-aminoácido; y un aminoácido cíclico diferente a prolina.
7. 7. La composición de la reivindicación 1, en donde el al menos un codón selector es un codón sin sentido, un codón raro, o un codón de cuatro bases.
8. 8. La composición de la reivindicación 1, en donde el al menos un codón selector es un codón ámbar.
9. 9. Un método para producir en un sistema de traducción de Pseudomonas al menos una proteína que comprenden al menos un aminoácido no natural, comprendiendo el método: proporcionar el sistema de traducción con al menos un ácido nucleico que comprende al menos un codón selector, en donde el ácido nucleico codifica la al menos una proteína; proporcionar el sistema de traducción con un tARN ortogonal (O-tARN) , en donde el O-tARN funciona en el sistema de traducción y en donde el O-tARN reconoce el al menos un codón selector; proporcionar el sistema de traducción con una aminoacil tARN sintetasa ortogonal (O-RS) , en donde el O-RS preferentemente aminoacila el O-tARN con el al menos un aminoácido no natural en el sistema de traducción; y proporcionar el sistema de traducción con el al menos un amino no natural, produciendo así en el sistema de traducción la al menos una proteína que comprende el al menos un aminoácido no natural .
10. 10. La proteína que comprende al menos un aminoácido no natural producido por el método de la reivindicación 9, en donde la proteína se procesa y modifica en una manera dependiente de la célula.
11. 11. La proteína de la reivindicación 10, en donde la proteína es homologa a una proteína terapéutica seleccionada del grupo que consiste de una citocina, un factor de crecimiento, un receptor de factor de crecimiento, un interferón, una interleucina, una molécula inflamatoria, un producto oncogénico, una hormona de péptido, una molécula de transducción de señal, un receptor de hormona esteroide, un activador transcriptional, un supresor transcriptional , eritropoyetina (EPO) , insulina, hormona de crecimiento humana, Péptido-78 que Activa el Neutrófilo epitelial, GROa/MGSA, GROß, GROG MlP-la, MIP-1&, MCP-1, factor de crecimiento de hepatocito, factor de crecimiento similar a insulina, factor inhibidor de leucemia, oncostatina , PD-ECSF, PDGF, pleiotropina, SCF, ligando equipo-c, VEGF, G-CSF, IL-1, IL-2, IL-8, IGF-I, IGF-II, FGF (factor de crecimiento de fibroblasto) , PDGF, TNF, TGF-a, TGF-ß, EGF (factor de crecimiento epidérmico) , KGF (factor de crecimiento de queratinocito) , SCF/equipo-c, CD40L/CD40, VLA-4/VCAM-1 , ICAM-1/LFA-l, hilaurina/CD44, Mos, Ras, Raf, Met; p53, Tat, Fos, Myc, Jun, Myb, Reí, receptor de estrógeno, receptor de progésterona, receptor de testosterona, receptor de aldosterona, Receptor LDL, y corticosterona.
12. 12. La proteína de la reivindicación 10, en donde la proteína es homologa a una proteína terapéutica seleccionada del grupo que consiste de una Alfa-1 antitripsina, una Angiostatina, un factor Antihemolítico, un anticuerpo, una Apolipoproteína, una Apoproteína, un factor natriurético Atrial, un polipéptido natriurético Atrial, un péptido Atrial, una quimiocina C-X-C, T39765, NAP-2, ENA-78, un Gro-a, un Gro-b, un Gro-c, un IP-IO, un GCP-2, un NAP-4 , un SDF-I, un PF4 , un MIG, una Calcitonina, un ligando equipo-c, una citocina, una quimiocina CC, una proteína-1 quimoatrayente de Monocito, una proteína-2 quimoatrayente de Monocito, una proteína-3 quimoatrayente de Monocito, una proteína-1 inflamatoria de Monocito alfa, una proteína-1 inflamatoria de Monocito beta, RA?TES, 1309, R83915, R91733, HCC1, T58847, D31065, T64262, CD40, un ligando CD40, un Ligando equipo-c, un Colágeno, un factor estimulante de colonia (CSF) , un factor de complemento 5a, un inhibidor de complemento, un receptor de complemento 1, una citocina, un Péptido-78 que Activa el ?eutrófilo epitelial, un GROa/MGSA, un GROE, un GROG, un MIP- la, un MIP- 1&, un MCP-I, un Factor de crecimiento epidérmico (EGF) , un Péptido de Activación de ?eutrófilo epitelial, una Eritropoyetina (EPO), una toxina exfoliante, un Factor IX, un Factor VII, un Factor VIII, un Factor X, un Factor de crecimiento de fibroblasto (FGF) , un Fibrinogeno, un Fibrunoctina, un G-CSF, un GM-CSF, una Glucocerebrosidasa, una Gonadotropina, un factor de crecimiento, un receptor de factor de crecimiento, una proteína Hedgehog, una Hemoglobina, un Factor de crecimiento de hepatocito (HGF) , una Hirudina, una albúmina de suero humano, un ICAM-1, un receptor ICAM-1, un LFA-1, un receptor LFA-l, una Insulina, un Factor de crecimiento similar a insulina (IGF), un IGF-I, un IGF-II, un interferón, un IF?-a, un IFN-5, un IFN-?, una interleucina, una IL-I, una IL-2, una IL-3, una IL-4, una IL-5, una IL-6, una IL-7, una IL-8, una IL-9, una IL-10, una IL-11, una IL- 12, un Factor de crecimiento de queratinocito (KGF) , una Lactoferrina, un factor inhibidor de leucemia, una Luciferasa, una Neurturina, un factor inhibidor de Neutrófilo (NIF) , una oncostatina M, una proteína Osteogénica, un producto oncogénico, una hormona paratiroidea, un PD-ECSF, un PDGF, una hormona de péptido, una Hormona de crecimiento humana, una Pleiotropina, una Proteína A, una Proteína G, exotoxinas Pirogénicas A, B, o C, una Relaxina, una Renina, un SCF, un receptor de complemento soluble I, un I -CAM soluble 1, receptores de interleucina soluble, un receptor TNF soluble, una Somatomedina, una Somatostatina, una Somatotropina, una Estreptocinasa, Superantígenos, una enterotoxinas Staphylococcales, un SEA, un SEB, un SECl , un SEC2 , un SEC3 , un SED, SEE, un receptor de hormona esteroide, una dismutasa de superóxido, una toxina de síndrome de choque tóxico, una Timosina Alfa 1, un activador de plasminogen de tejido, un factor de crecimiento de tumor (TGF) , un TGF-a, un TGF-ß, un Factor de Necrosis de Tumor, un Factor de Necrosis de Tumor Alfa, un Factor de Necrosis de Tumor Beta, un receptor del factor de necrosis de tumor (TNFR), una proteína VLA-4, una proteína VCAM-1, un Factor de Crecimiento Endotelial Vascular (VEGF) , una Urocinasa, un Mos, un Ras, un Raf, un Met; un p53, un Tat, un Fos, un Myc, un Jun, un Myb, un Reí, un receptor de estrógeno, un receptor de progésterona, un receptor de testosterona, un receptor de aldosterona, un Receptor LDL, y una corticosterona.
13. 13. Una célula de Pseudomonas que comprende: (a) un sistema de trayectoria biosintética para producir un aminoácido no natural provenientes de una o más fuentes de carbono dentro de la célula; y, (b) un sistema de traducción que comprende un tARN ortogonal (O-tARN) y una aminoacil tARN sintetasa ortogonal (O-RS) , en donde el ORS preferentemente aminoacila el O-tARN con el aminoácido no natural y el O-tARN incorpora el aminoácido no natural en una proteína en respuesta a un codón selector.
14. 14. La célula de la reivindicación 13, en donde el codón selector comprende un codón sin sentido, un codón de cuatro bases, un codón ocre, un codón ópalo, o un codón ámbar.
15. 15. La célula de la reivindicación 13, en donde el sistema de trayectoria biosintética produce un aminoácido codificado de manera no natural a una cantidad suficiente para la incorporación en un polipéptido.