CN1264860C

CN1264860C - 在遗传载体上表面展示蛋白的方法

Info

Publication number: CN1264860C
Application number: CNB028037529A
Authority: CN
Inventors: 潘在龟; 崔树根; 郑兴采
Original assignee: GENOFOCUS CO Ltd
Current assignee: GENOFOCUS CO Ltd
Priority date: 2001-01-15
Filing date: 2002-01-15
Publication date: 2006-07-19
Anticipated expiration: 2022-01-15
Also published as: EP1353956A1; US20040180348A1; KR20020061218A; KR100810527B1; WO2002055561A1; CN1486328A; JP4128871B2; JP2004529616A

Abstract

本发明涉及在遗传载体上表面展示的目的蛋白的制备方法，目的蛋白的改进方法，目的物质的分离、生物转化以及生产抗体的方法。更具体而言，本发明涉及在遗传载体上表面展示的目的蛋白的制备方法，其包含下列步骤：(a)用含有编码目的蛋白基因的载体转化内有选自孢子和病毒的遗传载体的宿主细胞；(b)培养转化的宿主细胞和在宿主细胞中表达目的蛋白；和(c)让表达蛋白和遗传载体表面之间形成非共价键，从而目的蛋白展示在遗传载体表面上。

Description

在遗传载体上表面展示蛋白的方法

技术领域

本发明涉及表面展示蛋白的方法，具体涉及在孢子等的表面上展示目的蛋白的、改进目的蛋白和分离目的物质的方法。

背景技术

生物体在其表面上展示所需的拟蛋白(proteinaceous)物质如肽和多肽的表面展示技术有更广的应用领域，这取决于所展示蛋白或宿主生物体的类型(Georgiou等，1993，1997；Fischetti等，1993；和Schreuder等，1996)。这种常规表面展示技术已通过采用若干单细胞生物体如噬菌体、细菌、酵母和哺乳动物细胞开发出来。

把待展示蛋白的基因含在宿主生物体中，由此利用所展示蛋白的特征可选择性地筛选宿主，从而容易地从所选择的宿主中获得所需的基因。所以，这种表面展示技术对蛋白的分子进化可确保有强大的工具(参见WO 9849286；和美国专利号5,837,500)。

高通量筛选

例如，将在其表面上展示具有所需结合亲和性的抗体的噬菌体与固定化抗原结合，然后洗脱，接着使洗脱的噬菌体增殖，由此获得编码噬菌体靶抗体的基因(美国专利号5,837,500)。上述的生物摇摄方法通过在大量的噬菌体表面上表面展示抗体文库，可提供筛选靶抗体的工具，以及包含如下的连续步骤：(1)构建文库；(2)表面展示文库；(3)与固定化抗原结合；(4)洗脱结合的噬菌体；最后(5)使选择的克隆增殖。

已发现噬菌体表面展示技术在从大量文库中获取所需的单克隆变体方面是有用的(例如，10⁶-10⁹变体)，并因此应用到抗体的高通量筛选的领域。抗体已用于各种领域如治疗、诊断、分析等，并且其需求已日益增长。就此而论，对新物质具有结合亲和性或催化生化反应的新型抗体一直存在着需要。生产单克隆抗体的杂交瘤技术已普遍使用以满足需求。然而，常规方法的实施需要高的成本和长的时间，但抗体的产量却很低。除此以外，为了筛选新型抗体，一般使用超过10¹⁰个抗体文库，结果，杂交瘤技术已被认为在发现显示新的结合特性的抗体方面是不够的。

许多研究已集中在较容易和更有效的新方法上，如上述的生物摇摄方法，然后开发了以此方式进行的新技术，该方式是将文库展示在细菌或酵母的表面上，然后展示靶蛋白的细胞用流式细胞仪以高通量方式分类。根据此技术，将标记有荧光染料的抗原与表面—展示细胞结合，以及具有所需的结合亲和性的抗体用每小时能分析超过10⁸细胞的流式细胞仪分离。通过揭示表面展示单克隆抗体可用流式细胞仪以超过10⁵的速率被浓缩，最终超过79％经证明是所需的细胞(Daugherty等，1998)，Francisco等已证实微生物展示技术的有用性。活疫苗

上述的表面展示技术可展示抗原或其片段，因此提供重组活疫苗的递送系统。迄今为止，减毒的病原体或病毒已被主要用作疫苗。特别地，已发现细菌在胞内或胞外或其细胞膜上表达抗原，由此给宿主细胞递送抗原。表面展示的活疫苗诱导潜在的免疫反应，并在宿主细胞的增殖过程中连续表达抗原；所以，它已成为突出的疫苗的新递送系统。具体而言，展示在非病原性大肠杆菌(E.coli)或沙门氏菌(Salmonella)的表面上的病原体衍生的抗原性表位以活体形式口服，然后显示以更连续或强大的方式诱导免疫反应(Georgiou等，1997；和Lee等，2000)。

全细胞生物转化

全细胞作为生物催化剂，在其表面上展示的酶能催化化学反应，可避免酶的直接表达、分离和稳定的必要性。在细胞中表达酶用于生物转化的情况下，迫使细胞回收及化学(例如甲苯)处理以确保对底物的不通透性。此外，持续使用致使酶失活或者带来底物和产物转移上的问题，由此降低整个过程的生产率。

利用展示在细胞表面上的酶可克服上述的缺陷(Jung等，1998a：1998b)。采用在其表面上展示磷酸二酯酶的全细胞，具有更高毒性的有机磷种类对硫磷和对氧磷可被降解，这是个典型的例子，表示展示酶的细胞对环境纯化过程的应用性(Richins等，1997)。

抗肽抗体

Martineau等报道了利用大肠杆菌的表面展示技术生产抗肽抗体的高度简便的方法(Martineau等，1991)。正如所述，把所需的肽展示在MalE和外膜蛋白Lamb的突出区域，然后，全细胞或片段化的细胞施用给动物以生成抗肽抗体。该方法使得生产抗体的同时避免肽的化学合成及其与载体蛋白的键合成为可能。

全细胞吸附剂

为了使抗体或多肽固定于合适的载体上，这在吸附层析中是有用的，必须进行随后的若干步骤，例如，发酵生长蛋白，纯化纯的蛋白以及固定于载体上。一般而言，难以制备生物吸附剂。

作为吸附剂，已开发出了展示吸附蛋白的全细胞。最有名的全细胞吸附剂是在其表面上自然展示蛋白A的金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，它与哺乳动物抗体的Fc区具有高的结合亲和性。当前，已提出了去除和回收重金属的新方法，其采用大量展示在微生物细胞表面上的金属硫蛋白或金属吸附蛋白(Sousa等，1996，1998；和Samuelson等，2000)。与利用吸附金属微生物的常规方法比较，该方法可更有效地从污染源中去除和回收重金属。

正是基于对上述事实的了解，为了在细胞表面上展示外源蛋白，合适的表面蛋白和外源蛋白必须在基因水平是相互连接的以表达融合蛋白，以及融合蛋白应稳定地越过细胞内膜以附着于细胞表面。优选地，具有下列特征的表面蛋白推荐为表面展示基元：1)有能通过细胞内膜的分泌信号，2)有能稳定附着于细胞表面上的靶信号，3)细胞表面上的高表达水平，和4)不管蛋白大小都可稳定表达(Georgiou等，1993)。

同时，根据上述现有的表面展示方法，为了把目的蛋白整合到表面蛋白的N-端或C-端或中心区，表面展示的基元需要进行遗传修饰。所有表面展示的蛋白以与表面展示基元融合的方式表达。所以，所得表面展示的蛋白是修饰蛋白而非野生型蛋白。

迄今为止，所开发的表面展示系统如下：噬菌体表面展示系统(Chiswell和McCarferty，1992)、细菌表面展示系统(Georgiou等，1993；Little等，1993；和Georgiou等，1997)、革兰氏阴性细菌表面展示系统(Francisco等，1992；Fuchs等，1991；Klauser等，1990，1992；和Hedegaard等，1989)、革兰氏阳性细菌表面展示系统(Samuelson等，1995；Palva等，1994；和Sleytr和Sara，1997)和酵母表面展示系统(Ferguson，1988；和Schreuder等，1996)。此外，还已开发出了与芽孢外被蛋白融合的目的蛋白展示在孢子表面上。例如，美国专利号5,766,914公开了利用枯草芽孢杆菌的芽孢外被蛋白中的cotC或cotD与作为报道蛋白的lacZ的融合蛋白来生产和纯化酶的方法。美国专利号5,837,500和5,800,821也表明cotC和cotD作为优选的表面展示基元，但其实验演示未加以说明。

根据革兰氏阴性细菌的表面展示系统，外源多肽整合到表面结构不仅导致位的限制使得不可能具有稳定的膜蛋白(Charbit等，J.Immunol，139：1644-1658(1987)；和Agterberg等，Gene，88：37-45(1990))而且导致细胞外膜的稳定性及其生存力的降低。大肠杆菌作为展示宿主，其已被深入地进行了研究，通常利用细胞外膜蛋白作为表面展示基元。然而，与外源蛋白融合的细胞外膜蛋白的过表达可能带来细胞外膜结构的不稳定，结果使宿主细胞的生存力突然下降(Georgiou等，1996)。

上述常规展示方法中存在的问题是由于目的蛋白和用于展示的表面展示基元之间的融合蛋白的制备。如果融合蛋白以少量表达，则全细胞生物转化的反应效率、蛋白阵列和抗体产量降低；但如果过表达，很可能导致上述的缺陷。另外，利用融合蛋白的表面展示方法依赖于表面展示基元整合到细胞、孢子或噬菌体表面中的程度，引起展示蛋白量的限制。

如上所述，常规表面展示技术根本上取决于目的蛋白和表面展示基元之间的融合蛋白的形成。因此，在常规表面展示系统中存在若干缺陷：(1)必须得知表面展示基元的基因序列；(2)必须克隆表面展示基元的基因；(3)表面展示基元很可能影响目的蛋白的三级结构；(4)当仅有多聚体形式的目的蛋白具有活性以及融合蛋白是独立表面展示时，致使目的蛋白失活；(5)由于利用融合蛋白的表面展示方法依赖于表面展示基元整合到宿主细胞表面中的程度，限制所展示蛋白的量；(6)当目的蛋白过量表面展示时，诱导宿主细胞的结构不稳定，从而降低了宿主细胞对环境的抗性和生存力。

因此，为了开发新表面展示系统，该系统能够克服常规方法中的缺陷，下列特征应得以实现：(1)能够构建系统而无需知道表面展示基元的基因序列；(2)能够构建系统而无需克隆表面展示基元的基因；(3)在目的蛋白形成其内在结构后，能够在宿主细胞表面上进行展示；(4)通过非选择性键合，能够增加表面展示的蛋白的量；和/或(6)即使在目的蛋白过量表面展示时，也不降低宿主细胞对环境的抗性和生存力。

在整个申请中，参考了各种各样的专利和出版物，文献引用在括号内。为了更充分说明本发明以及本发明涉及的技术领域状态，这些专利和出版物以其全文在此引作参考。

发明内容

在此情形下，本发明人进行了深入研究以克服常规表面展示方法的缺陷，结果我们开发了无需表面展示基元的新型展示系统。令人惊奇的是，开发的系统发现能够在表面上展示任何蛋白，而同时维持其内在结构，并且当过量展示时，遗传载体可保持其生存力以及对周围环境的抗性。

因此，本发明的一个目的是提供在遗传载体上表面展示的目的蛋白的制备方法。

本发明的另一目的是提供利用在遗传载体上表面展示的方法改进目的蛋白的方法。

本发明的另一目的是提供利用在遗传载体上表面展示的方法从混合物中分离目的物质的方法。

本发明的进一步目的是提供利用在遗传载体上表面展示的方法进行生物转化的方法。

本发明的进一步目的是提供利用在遗传载体上表面展示的方法生产针对脊椎动物抗原的抗体的方法。

本发明的另一目的是提供用于在遗传载体表面上展示目的蛋白的载体。

本发明的另一目的是提供用于在遗传载体表面上展示目的蛋白的微生物转化子。

本发明的进一步目的是提供遗传载体和目的蛋白之间的复合体。

本发明的进一步目的是提供展示在表面目的蛋白变体上的遗传载体文库。

本发明的另一目的是提供利用在遗传载体上表面展示的方法所制备的蛋白微阵列。

附图简述

图1示意性说明本发明的原理；

图2表示展示在孢子表面上的荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)脂肪酶活性；

图3表明在宿主细胞中表达的野生型脂肪酶在孢子表面上的展示；

图4显示流式细胞仪分析的结果，用于证实野生型羧甲基纤维素酶的孢子表面展示；

图5是用于孢子表面展示的载体pCrylp-CMCase-hp的遗传图；

图6显示流式细胞仪分析的结果，用于证实含有修饰的分泌信号的羧甲基纤维素酶的孢子表面展示；

图7是用于孢子表面展示的载体pCrylp-CMCasehis的遗传图；和

图8示出流式细胞仪分析的结果，用于证实含有融合序列、阳离子区的羧甲基纤维素酶的孢子表面展示。

实施本发明的最佳方式

首先在此使用的术语“遗传载体”是指在其表面上展示目的蛋白并具有下列特征的生物体：(1)选自孢子和病毒；(2)具有与目的蛋白形成非共价键的能力，所述目的蛋白具有所需的解离常数，在内含遗传载体的宿主细胞中表达；和(3)如果需要，其表面特性能够通过遗传工程方法进行修饰。

此处所用的术语“宿主细胞”意思不同于涉及蛋白表面展示的现有出版物所公开和显示的含义。在此所用的术语“宿主细胞”是指表达目的蛋白并具有下列特性的细胞：(1)能够被编码目的蛋白的基因转化；(2)能够内含遗传载体如孢子和病毒以及增殖遗传载体；和(3)如果需要，能够进行遗传操作。

如上所述，在本说明书中，术语“遗传载体”在其表面上展示目的蛋白，以及“宿主细胞”表达目的蛋白，它们具有严格不同的含义。

在本发明的一个方面，提供了在遗传载体上表面展示的目的蛋白的制备方法，所述方法包含下列步骤：(a)用含有编码目的蛋白的基因的载体转化内含选自孢子和病毒的遗传载体的宿主细胞；(b)培养转化的宿主细胞并在宿主细胞中表达目的蛋白；和(c)使表达蛋白和遗传载体表面之间形成非共价键，以便目的蛋白展示在遗传载体表面上。

在本发明的另一方面，提供了改进目的蛋白的方法，所述方法包括下列步骤：(a)通过突变编码目的蛋白的基因，构建目的蛋白的基因文库；(b)制备含有构建的基因文库的载体文库；(c)用载体文库转化内含选自孢子和病毒的遗传载体的宿主细胞；(d)培养转化的宿主细胞并在宿主细胞中表达目的蛋白的变体；(e)通过在表达的蛋白变体和遗传载体表面之间形成非共价键以便使变体展示在遗传载体表面上，从而获取遗传载体文库；和(f)筛选在其表面上展示具有所需特性的目的蛋白变体的遗传载体。

在本发明的另一方面，提供了从混合物中分离目的物质的方法，所述方法包括下列步骤：(a)通过突变编码结合蛋白或作为目的蛋白的结合区的基因，构建编码结合蛋白或其结合区的基因文库；(b)制备含有构建的基因文库的载体文库；(c)用载体文库转化内含选自孢子和病毒的遗传载体的宿主细胞；(d)培养转化的宿主细胞并在宿主细胞中表达结合蛋白或结合区的变体；(e)通过在表达的结合蛋白变体或结合区变体和遗传载体表面之间形成非共价键以便使变体展示在遗传载体表面上，从而获取遗传载体文库；和(f)将遗传载体文库与预定的物质接触，并通过选择在其表面上展示变体结合预定的物质来筛选改进的结合蛋白或其结合区；(g)将在其表面上展示改进的结合蛋白或其结合区的遗传载体与混合物接触以从混合物中分离物质。

本发明方法已根据新的概念开发出来，其与常规表面展示方法大大不同。本发明方法利用了在遗传载体表面上组分的特性，具体利用了在遗传载体表面上的蛋白和目的蛋白之间的非共价键。本发明的原理路线利用孢子作为遗传载体，说明性示例在图1中。参照图1，宿主细胞被携带编码目的蛋白的序列的载体转化，目的蛋白在形成孢子过程中或之前胞内或胞外表达，并且凭借目的蛋白和宿主细胞中形成的孢子表面之间的非共价键最终实现目的蛋白的表面展示。

如上所述，本发明的显著特征在于无需表面展示的基元，所述基元在常规表面展示蛋白的方法中是必需的。由于本发明方法规避了表面展示基元的必要性，因此蛋白在宿主细胞中表达时，发现难以越过细胞膜，可在遗传载体表面上充分展示，当宿主细胞裂解露出遗传载体时，可回收在其表面上展示蛋白的遗传载体。这种回收的目的蛋白和遗传载体的复合体具有广泛的用途。

根据本发明方法，孢子或病毒可作为遗传载体使用。孢子是优选的遗传载体，这是由于其具有如下特性(Driks，1999)：(1)较高的热稳定性；(2)对放射性显著的稳定性；(3)对毒素的稳定性；(4)对酸和碱较高的稳定性；(5)对溶菌酶显著的稳定性；(6)抗干燥性；(7)对有机溶剂较高的稳定性；(8)无代谢活性；和(9)较短的获取孢子的时间，例如几小时。

根据本发明方法，当病毒用作遗传载体时，优选使用噬菌体，以及在原核宿主细胞中表达的目的蛋白是通过非共价键结合到噬菌体的外被蛋白而得到表面展示的。如果噬菌体位于宿主细胞的周质中，可将信号肽与目的蛋白融合，以允许向周质中分泌，从而确保表面展示。如果目的蛋白不能与噬菌体的外被蛋白自然结合，则为了进行表面展示，可将其融合到能与噬菌体的外被蛋白结合的基元上。

根据一优选的实施方案，遗传载体具有修饰的表面蛋白以增强与目的蛋白的非共价键。遗传载体的修饰方法包括：(i)将寡肽或多肽与遗传载体表面蛋白融合，所述寡肽或多肽增强了目的蛋白与遗传载体之间的非共价键；(ii)使遗传载体表面蛋白进行定点诱变；和(iii)把遗传载体表面蛋白进行随机诱变，但不限于此。

在本发明方法中，目的蛋白包括任何蛋白和肽，如激素、激素类似物、酶、酶抑制剂、信号转导蛋白或其片段、抗体或其片段、单链抗体、结合蛋白或其片段、肽、抗原、粘着蛋白、结构蛋白、调节蛋白、毒素蛋白、细胞因子、转录调节蛋白、血液凝固蛋白和植物防卫一诱导蛋白，但不限于此。

本发明所用的结合蛋白或其结合区包括任何能够结合预定的物质的蛋白或其结构域，例如当分离某种抗原物质时，所述结合蛋白或其结合区是抗体或其抗体结构域。结合蛋白或结合区包括但不限于蛋白酶抑制剂、芥菜素(crambin)、肠毒素、芋螺毒素、蜂毒明肽(apaminm)溶菌酶、核糖核酸酶、卡律蝎毒素、半胱氨酸蛋白酶抑制剂、水蛭蛋白酶抑制剂、卵类粘蛋白、天青蛋白、肿瘤坏死因子和CD4。

根据本发明方法，单体或多聚体(包括同型多聚体和异型多聚体)可被表面展示。多聚体蛋白一般只有其所有单体结合时才具有完整的活性。在常规方法中，已发现多聚体蛋白是以失活形式进行表面展示的，因为其单体是彼此独立表面展示的。根据本发明方法，多聚体蛋白可以展示在遗传载体表面上而同时维持其整体结构。

根据优选的实施方案，待表面展示的目的蛋白可以被修饰，以便增强与遗传载体的非共价键。修饰方法包括：(i)缺失一部分目的蛋白的氨基酸；(ii)将寡肽或多肽与(i)中的目的蛋白或其缺失形式融合，所述寡肽或多肽增强目的蛋白与遗传载体之间的非共价键；(iii)将目的蛋白进行定点诱变；和(iv)将目的蛋白进行随机诱变，但不限于此。

使一部分目的蛋白氨基酸缺失的方法可以各种各样的方式进行，例如通过从目的蛋白的N-端序列(例如信号肽)缺失离子型氨基酸。由此修饰的目的蛋白增强了与遗传载体的疏水性相互作用，因此可以较低的解离常数被表面展示。有报道孢子表面携带阴离子电荷。所以优选阳离子肽与用于表面展示的目的蛋白进行融合。

在本发明方法中，作为编码待转化目的蛋白的基因，两个或更多个重复序列也是有用的。在两个或更多个重复序列中，重复序列可以彼此相同或不同。其他组合也可用于融合序列中。此外，转化中所用的基因可以质粒独立存在于宿主细胞中，或整合到宿主细胞的染色体中。

目的蛋白的表达可以依靠其自身的启动子或其他可在宿主细胞中诱导的适当的启动子进行诱导。

根据本发明方法，非共价键，尤其是疏水键、离子键、氢键和范德瓦耳斯键中的一种或多种，使得目的蛋白与遗传载体之间相互作用。

根据一优选的实施方案，内含孢子的宿主细胞包括但不限于孢子形成革兰氏阴性菌如粘球菌(Myxococcus)；孢子形成革兰氏阳性菌如梭状芽孢杆菌(Clostridium)、类芽孢杆菌(Paenibacillus)和芽孢杆菌(Bacillus)；孢子形成放线菌(Actionmycete)；孢子形成酵母如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、假丝酵母(Candida)和汉逊酵母(Hansenulla)和孢子形成真菌。更优选地，宿主细胞是孢子形成革兰氏阳性菌，以及最优选地，芽孢杆菌包括枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)和巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)。具体而言，枯草芽孢杆菌在某种意义上是有利的，因为对其孢子形成的遗传知识和实验方法以及培养方法是众所周知的。

根据一优选的实施方案，宿主细胞是一种突变细胞，其删除了胞内和胞外蛋白酶的生成，所述蛋白酶参与表面展示的目的蛋白的降解。

虽然本发明方法主要针对通过遗传载体和目的蛋白之间非共价键的表面展示，但如果需要更稳定的连接，其它共价键也可使用。使遗传载体表面和目的蛋白之间的键稳定的操作方法可以是使用物理、化学或生化方法在遗传载体表面和目的蛋白之间形成共价键，接着通过非共价键在遗传载体表面上展示目的蛋白。在形成共价键的方法中，化学法戊二醛处理(DeSantis G.和Jones J.B.Curr.Opin.Biotechnol.10：324-330(1999))是优选的，物理法紫外线处理(Graham L.，和Gallop P.M.Anal.Biochem.217：298-305(1994))是优选的，以及生化法酶处理确保了共价键的形成(Gao Y.，和Mehta K.，J.Biochem.129：179-183(2001))。

在遗传载体上表面展示的目的蛋白的制备方法中，优选方法进一步包含筛选在其表面上展示目的蛋白的遗传载体的步骤。

在改进目的蛋白的方法中，通过突变野生型目的蛋白基因来构建基因文库的步骤是利用：DNA改组方法(Stemmer，Nature，370：389-391(1994))、StEP方法(Zhao，H.等，Nat.Biotechnol.，16：258-261(1998))、RPR方法(Shao，Z.等，Nucleic acids Res.，26：681-683(1998))、分子繁殖方法(Ness，J.E.等，Nat.Biotechnol.，17：893-896(1999))、ITCHY方法(Lutz S.和Benkovic S.，Current Opinion in Biotechnology，11：319-324(2000))、易错PCR(Cadwell，R.C.和Joyce，G.F.，PCR Methods Appl.，2：28-33(1992))和点诱变(Sambrook等，Molecular Cloning：A LaboratoryManual，Cold Spring Harbor，N.Y.，1989)。

根据改进目的蛋白方法的一优选实施方案，遗传载体是孢子，以及筛选步骤的方式是将孢子文库用选自有机溶剂、热、酸、碱、氧化剂、干燥、表面活性剂和蛋白酶中的一种或多种进行处理，然后对在其表面上展示目的蛋白变体、具有处理抗性的孢子加以选择。

根据改进目的蛋白方法的另一优选实施方案，遗传载体是孢子，以及筛选步骤的方式是将孢子文库先用选自有机溶剂、热、酸、碱、氧化剂、干燥、表面活性剂中的一种或多种进行处理，接着用蛋白酶进行二次处理，然后对在其表面上展示目的蛋白变体、具有蛋白酶抗性的孢子加以选择。

在本发明方法中，筛选步骤的操作依靠：(i)展示在遗传载体表面上的目的蛋白的活性；(ii)能够识别标记目的蛋白的物质的蛋白；(iii)能够结合目的蛋白的标记配体；或(iv)能够与目的蛋白特异性结合的抗体，但不限于此。优选地，通过能够与目的蛋白结合的标记配体或能够与目的蛋白特异性结合的抗体，将流式细胞仪用于筛选中。例如，一级抗体结合于展示在孢子表面上的目的蛋白，然后与标记有荧光化学物质的二级抗体反应以染色孢子，接着用荧光显微镜观察或用流式细胞仪分析。如果二级抗体是金标记的，则能用电子显微镜观察。通过测量由此蛋白催化的比色反应，利用目的蛋白的活性进行筛选。

在本发明制备表面展示的目的蛋白以及改进目的蛋白的方法中，优选的是在所筛选的遗传载体增殖后，具有所需特性的蛋白变体或编码它们的基因得到回收。

根据利用孢子作为遗传载体的一优选实施方案，孢子回收的操作方式是通过控制培养时间，使目的蛋白在孢子表面上的展示最大化，其后培养终止，然后回收孢子。适当的培养时间是变化的，这取决于所用的细胞类型，例如在使用枯草芽孢杆菌作为宿主的情形下，优选的培养时间为16-25小时。根据本领域一名技术人员已知的常规方法，更优选renografin梯度方法(C.R.Harwood等，″Molecular BiologicalMethods for Bacillus.″John Wiley & Sons，New York，第416页(1990))，可进行孢子回收。

改进蛋白的方法以高通量方式从野生型中提供(1)催化非生物反应的酶(例如第尔斯—阿尔德缩合)；(2)具有非自然立体选择性或区域选择性的酶；(3)在有机溶剂或有机溶剂—水溶液两相体系中具有活性的酶；和(4)在极端条件如高温或高压下具有活性的酶。此外，为了选择具有增强的结合亲和性的抗体变体，通常是使pH突然发生变化或调整碱的浓度，从而洗脱变体。在利用噬菌体或细菌作为载体的方法中，这种洗脱条件有可能降低噬菌体或细菌在培养基中的生存力。然而，利用孢子表面展示系统改进蛋白的方法克服了这种障碍。

在本发明的进一步方面，提供了在遗传载体表面上展示目的蛋白的载体，所述载体包含复制起点、抗生素抗性基因、限制性位点、编码目的蛋白的基因，其中当目的蛋白在宿主细胞中表达时，其能够与遗传载体的表面形成非共价键。

根据一优选实施方案，编码目的蛋白的基因是一种突变基因，其增强遗传载体表面和目的蛋白之间的非共价键。将编码目的蛋白的基因突变成(i)缺失一部分目的蛋白的氨基酸；(ii)将寡肽或多肽与(i)中的目的蛋白或其缺失形式融合，所述寡肽或多肽增强目的蛋白与遗传载体之间的非共价键；(iii)将目的蛋白进行定点诱变；或(iv)将目的蛋白进行随机诱变。

在本发明的进一步方面，提供了微生物转化子，其特征在于转化子的制备方法是用本发明载体转化内含孢子或病毒的宿主细胞。根据一优选实施方案，宿主细胞是一种突变细胞，其消除了胞内蛋白酶或胞外蛋白酶的产生，所述蛋白酶参与降解表面展示的目的蛋白。

在本发明的另一方面，提供了遗传载体和目的蛋白之间的复合体，其特征在于复合体的制备是根据权利要求1所述的方法在遗传载体表面上展示激素、激素类似物、酶、酶抑制剂、信号转导蛋白或其片段、抗体或其片段、单链抗体、结合蛋白或其片段、肽、抗原、粘着蛋白、结构蛋白、调节蛋白、毒素蛋白、细胞因子、转录调节蛋白、血液凝固蛋白和植物防卫—诱导蛋白。

根据一优选实施方案，目的蛋白是一种修饰蛋白，其修饰方法是(i)缺失一部分目的蛋白的氨基酸；(ii)将寡肽或多肽与(i)中的目的蛋白或其缺失形式融合，所述寡肽或多肽增强目的蛋白与遗传载体之间的非共价键；(iii)将目的蛋白进行定点诱变；或(iv)将目的蛋白进行随机诱变。

此外，本发明复合体可具有其它共价键以使遗传载体表面和目的蛋白之间的键稳定，其中使用物理、化学或生化方法形成共价键，接着通过非共价键在遗传载体表面上展示目的蛋白。

在本发明复合体中，孢子是优选的遗传载体。如果孢子用作遗传载体，孢子优选的是非繁殖孢子，其获得途径是选自遗传方法(PophamD.L.等，J.Bacteriol.，181：6205-6209(1999))、化学方法(Setlow T.R.等，J.Appl.Microbiol.，89：330-338(2000))和物理方法(Munakata N等，Photochem.Photobiol.，54：761-768(1991))中的一种或多种。本发明复合体仅利用孢子作为目的蛋白的展示手段可排除繁殖孢子的必要性。可考虑的是经遗传工程改造的生物体有可能受到法律和规章的控制；因此非繁殖孢子是优选的。造成孢子非繁殖的遗传方法可通过缺失参与宿主细胞的孢子再生的基因来实施。例如，缺乏cwlD基因的枯草芽孢杆菌优选用于本发明中。另外，孢子优选衍生自突变的变体，所述变体通过选自物理方法(Wienc K.M.等，Appl.Environ.Microbiol.，56：2600-2605(1990))、化学方法和遗传方法中的一种或多种增加了其凝集特性。具有增加的凝集特性的孢子可在以工业规模进行的生物转化中从所得产物方便地分离出来。

在优选的实施方案中，遗传载体是噬菌体。

在本发明另一方面，提供了在其表面上展示目的蛋白变体的遗传载体文库，该文库的制备方法包含下列步骤：(a)通过突变编码目的蛋白的基因，构建目的蛋白的基因文库；(b)制备含有构建的基因文库的载体文库；(c)用载体文库转化内含选自孢子和病毒的遗传载体的宿主细胞；(d)培养转化的宿主细胞并在宿主细胞中表达目的蛋白变体；(e)通过在表达的蛋白变体和遗传载体表面之间形成非共价键以使变体展示在遗传载体表面上，获取遗传载体文库；和(f)筛选在其表面上展示具有所需特性的目的蛋白变体的遗传载体。

根据一优选实施方案，遗传载体是孢子或噬菌体。

在本发明的进一步方面，提供了利用具有转化反应活性的蛋白来进行生物转化的方法，其特征在于所述方法采用遗传载体和目的蛋白之间的本发明复合体。能够催化(生物)化学反应的任何蛋白包括酶和酶活性抗体，可用于此生物转化中。

同时，利用表面展示的酶的生物转化方法要求表面展示的遗传载体在极端条件下的生理化学的稳定性，这是因为所述方法通常在高温和/或有机溶剂下进行。特别地，在当今工业中有价值的化学合成主要在有机溶剂中进行，以及手性化合物的合成或外消旋混合物的分辨也是在高度苛刻的生理化学条件下进行的。所以，表面展示的酶以及展示酶的生物体被迫在如此极端条件下具有稳定性。就此而论，本发明利用表面展示的孢子或病毒的生物转化方法显示是大为有利的。

利用表面展示酶的化学方法已有人提出(Georgiou等，1993)。然而，这种方法一般要求细胞表面用交联剂固定化，因为展示酶的宿主在此过程中很不稳定(Freeman等，1996)。本发明生物转化方法不含有上述的缺陷。由于表面展示的酶以及展示酶的遗传载体大都稳定，因此本发明方法避免了固定化。本发明生物转化方法也可应用于任意类型的酶，如脂肪酶、蛋白酶、纤维素酶、糖基转移酶、氧化还原酶和醛缩酶。此外，本发明方法在单步或多步反应以及水溶液或非水溶液中是有用的。本发明生物转化方法采用遗传载体作为游离或固定的形式，可采用其他微生物或酶来实施。

在本发明的进一步方面，提供针对脊椎动物抗原的抗体的生产方法，其特征在于所述方法包含给脊椎动物施用一种组合物，所述组合物含有免疫学上有效量的在遗传载体和目的蛋白之间的本发明复合体。根据本发明生产抗体的方法，组合物含有免疫学上有效量的复合体，优选另包含佐剂，如不完全和完全弗氏佐剂。在本发明方法中，给药可通过口服和静脉内、腹膜内、皮下和肌内注射进行。第一次给药后，在适当的期间内加强给药是优选的，以生成足够量的抗体。

与DNA微阵列相似，蛋白质微阵列提供用于分析某些细胞中靶蛋白的表达或表达水平的手段。为了制造蛋白质阵列，必须获得适当的待阵列的蛋白，然后固定于固相表面。在利用蛋白质阵列的分析过程中，清洗步骤必须进行以除去非结合的蛋白，以及各种处理如高温、高盐浓度和pH调节得以实施；所以，关键是保证拟蛋白物质在这种有害环境中具有较高的稳定性。此外，制备蛋白质阵列的常规方法需要乏味和重复的工作，如克隆数千到数万种蛋白的基因并且固定所表达的蛋白。所以，有需要对该工作的简便和快速进行改进。

根据本发明蛋白质阵列的制备方法，上述工作可确保以更迅速的方式进行。在本发明方法中，将前述的本发明复合体或遗传载体文库固定于固相基底上。本发明蛋白质阵列的制备方法是使在其表面上展示目的蛋白的遗传载体固定于固相基底上。在制备蛋白质阵列的方法中，可使用常规的方法(参见WO 0061806、WO 0054046、US 5807754、EP 0818467、WO 9742507、US 5114674和WO 9635953)。由本发明制造的蛋白质微阵列具有各种各样的可应用领域，包括诊断、基因表达的分析、蛋白质之间相互作用的分析、蛋白和配体之间的相互作用的分析、代谢的研究、筛选新型或改进的酶、组合的生化合成和生物传感器。

本发明方法中适当的固相基底包括但不限于玻璃(例如，功能化的玻璃)、Si、Ge、GaAs、GaP、SiO、SiN4、改性的硅氧烷硝化纤维素、聚偏氟乙烯(polyvinylidene fluoride)、聚苯乙烯(polystylene)、聚四氟乙烯、聚碳酸酯、尼龙、纤维及其组合。遗传载体通过接头分子可任选连接到阵列基底。阵列表面未被点击的区域优选加以封闭。施用到各个点(或地址)的遗传载体的量依赖于阵列的种类。连接到固相基底的遗传载体上展示的蛋白和所施加的样品之间的相互作用可根据它们固有的特征(例如免疫原性)加以检测或通过标记有独立可检测的标志(例如荧光、化学发光或放射分子和表位)给予检测。利用已知的电脑化的系统如“读数仪”和“扫描仪”对用本发明的蛋白质阵列所产生的数据进行分析。

正如从本申请的所有说明中所了解的，本发明表面展示方法利用适合于所有本发明方法的遗传载体，具有若干优点：(1)避免需要表面展示的基元；(2)确保目的蛋白具有其完整的活性，其作用方式是目的蛋白在表达后形成其固有的结构，并且展示在表面上；(3)增加目的蛋白表面展示的量，这是因为蛋白通过非共价键即以非选择的方式加以展示；和(4)尽管表面展示的蛋白量得到增加，但是对遗传载体的存活力和周围环境的抗性没有或很少有影响。

下列特定的实施例旨在说明本发明，不应理解成如所附权利要求所限定的那样限制本发明的范围。

实施例

实施例1：对孢子表面展示纯的分离的脂肪酶的确认

胞质蛋白能否如以前报道的外被蛋白或结构蛋白(形态发生素)那样结合和展示在孢子表面仍有待证实。根据孢子表面的疏水特性(Wiencek，K.M.等，Appl.Environ.Microbiol.，56：2600-2605(1990))，本发明人假设含有疏水区的蛋白如脂肪酶(Brockerhoff H.，Chem.Phys.Lipids，10：215(1973))可通过疏水键连接并展示在孢子表面上。该假设的证实是在脂肪酶附着到从枯草芽孢杆菌中分离的纯孢子上后测定其酶活性，该酶纯化自荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)。

首先，将枯草芽孢杆菌DB104菌株(Kawamura F.和Doi R.H.，J.Bacteriol.，160：442-444(1984))在GYS培养基((NH₄)₂SO₄2g/l、酵母提取物2g/l、K₂HPO₄0.5g/l、葡萄糖1g/l、MgSO₄·H₂O 0.41g/l、CaCl₂·2H₂O 0.08g/l、MnSO₄·5H₂O 0.07g/l)中摇床(37℃，250rpm)培养24小时，以及利用renografin梯度方法仅分离纯化的孢子(C.R.Harwood等，″Molecular Biological Methods for Bacillus.″John Wiley &Sons，New York，第416页(1990))。在显微镜下验证纯的分离的孢子(1000x，ALPHAPHOT-2，Nikon)。

将2mg纯的分离的芽孢杆菌孢子和94μg部分纯化的假单胞菌脂肪酶(Ahn，J.H.等，J.Bacteriol.，181：1847-1852(1999))混合到2001的50mM Tris缓冲液(pH8.0)中，4℃下无搅动反应12小时，然后离心使孢子从缓冲液中分离出来。接着，分离的孢子用0.5ml的50mMTris缓冲液(pH8.0)漂洗三次，最后将脂肪酶附着的孢子进行纯化。为了测定附着在孢子上的脂肪酶活性，将脂肪酶附着的孢子悬浮在添加有10％橄榄油的PBS缓冲液中反应48小时，上清液用0.2ml铜酸(cupric acid)处理，以及在715nm处测定最终的OD。上清液的结果显示脂肪酶活性通过橄榄油从脂肪酶附着的孢子中释放出来(图2)。在图2中，线(1)代表脂肪酶附着的孢子，线(2)代表无脂肪酶附着的对照，以及水平线是指脂肪酶活性的反应时间。

这些结果显示由于疏水作用，脂肪酶仅能通过吸附结合到孢子表面。

这些结果举例说明具有疏水性的任何蛋白都可展示在孢子上，本领域的那些技术人员应理解，当蛋白在细胞中表达或分泌到胞外时，具有疏水性的蛋白可展示在孢子表面上。

实施例2：野生型脂肪酶在孢子表面上的展示

对宿主细胞中表达的野生型脂肪酶的孢子展示进行如下检查：质粒pBS：lipA(Bell P.J.L.等，Biotechnol.Lett.，21：1003-1006(1999))由澳大利亚的Bergquist博士赠送。利用lipl(SEQ ID NO：1)和lip2(SEQ IDNO：2)为引物及pBS：lipA质粒为模板进行PCR。Taq聚合酶购自Boehringer Mannheim，PCR共35次循环，条件为94℃变性30秒、55℃退火30秒以及72℃延伸1分钟。

然后，将各个扩增的PCR产物用BamHI和KpnI限制性酶切，并克隆到切去预先克隆的羧甲基纤维素酶基因后的质粒pCrylP-CMCase同样的限制性位点中，并通过自然转化方法(C.R.Harwood等，″枯草芽孢杆菌的分子生物学方法(Molecular Biological methods forBacillus)″John Wiley & Sons，New York，第416页(1990))将该克隆的质粒转化到枯草芽孢杆菌DB104中。在以实施例1相同的方式从转化的芽孢杆菌菌株分离孢子后，测定纯的分离的孢子中的脂肪酶活性(图3)。在图3中，线(1)代表展示有野生型脂肪酶的孢子，线(2)为对照孢子的结果，以及水平线是指脂肪酶活性的反应时间。这些结果显示，利用本发明的孢子展示系统，具有疏水性的蛋白可展示在孢子表面。

该实施例中表达的脂肪酶的N-端含有分泌信号肽，导致胞外分泌。分泌的酶可附着到在孢子形成后暴露于培养基的孢子表面。此外，尽管存在分泌性信号肽，非分泌酶在孢子形成过程中由于疏水特性(Bron S.，J.Biotechnol.，64：313(1998))也可附着到孢子表面上。

结果一目了然，具有疏水性的蛋白可展示到孢子表面，不管蛋白是胞内表达还是胞外分泌。

实施例3：野生型羧甲基纤维素酶在孢子表面上的展示

为了在孢子表面上展示羧甲基纤维素酶，将分离自枯草芽孢杆菌BSE616菌株的羧甲基纤维素酶基因(Park S.H.等，Agric.Biol.Chem.，55：441-448(1991))克隆在苏云金芽孢杆菌菌株的crylAa毒素基因的启动子的控制之下。

首先，利用1AP1(SEQ ID NO：3)和1AP2(SEQ ID NO：4)为引物，通过Kalman S.等方法(Appl.Environ.Microbiol.，59：1131-1137(1993))从购自BGSC(Bacillus Genetic Stock Center，Ohio，USA)的苏云金芽孢杆菌库斯塔基亚种(Bacillus thurigiensis kurstaki)HD1菌株中分离的DNA为模板，以实施例2相同的条件，由PCR扩增crylAa启动子。将PCR产物克隆到购自Promega公司(USA)的载体pGemT-easy中，随后用SphI和SalI消化，并克隆到质粒pUC19(GenBank X02514)同样的限制性位点中。质粒pUC19再次用HindIII和BamHI限制性酶切割，并把所得的片段插入到pCPaC3(KCTC 0831BP)同样的限制性位点中，由此构建pCrylP-CMCase。pCrylP-CMCase是一种穿梭载体，其在大肠杆菌和芽孢杆菌菌株中均可复制。

将最终构建的质粒pCrylP-CMCase通过自然转化方法转化到枯草芽孢杆菌DB104菌株中。其他方法如接合或转导也可用于使重组载体导入到芽孢杆菌菌株中。其后，由pCrylP-CMCase转化的芽孢杆菌菌株在GYS培养基中摇床(37℃，250rpm)培养24小时，并利用renografin梯度方法仅分离纯的孢子。

对分离的孢子中的羧甲基纤维素酶活性进行如下测定：首先，将100μl密度为OD(600nm)＝1.4的孢子悬浮液的0.1M磷酸钾缓冲液(pH6.0)与200μl的1％羧甲基纤维素的0.1M磷酸钾缓冲液(pH6.0)混合，然后50℃反应40分钟。反应后，向反应溶液中加入900μl的DNS溶液(20％酒石酸钾钠、1％NaOH、0.05％NaHSO₃、0.2％苯酚、1％3，5-二硝基水杨酸)，加热5分钟，然后在冷水中冷却。离心后上清液的光密度在波长575nm处进行测定。与对照0mU比较，展示在孢子表面上的羧甲基纤维素酶的活性为1.96mU。

在另一确认方法中，当通过Kim等(Appl.Environ，Microbiol.，66：788-793(2000))的方法利用羧甲基纤维素酶特异抗体(Kim等，Appl.Environ，Microbiol.，66：788-793(2000))来操作流式细胞仪(FACSort，Becton Dickinson，USA)时，流式细胞仪也显示在转化有pCrylP-CMCase的芽孢杆菌菌株的孢子表面上展示羧甲基纤维素酶(图4)。在图4中，线1代表对照孢子，线2是指由pCrylP-CMCase转化的芽孢杆菌菌株的孢子，垂直线表示孢子数，以及水平线为荧光强度。如图4所示，与对照比较，在展示羧甲基纤维素酶的孢子中峰移向右边，这说明有更多的特异于羧甲基纤维素酶的抗体结合在转化有质粒pCrylP-CMCase的孢子表面上。结果，羧甲基纤维素酶附着在转化有pCrylP-CMCase的孢子表面上。

该实施例中表达的羧甲基纤维素酶的N-端含有分泌信号肽，导致胞外分泌。虽然分泌的酶有可能附着到在孢子形成后暴露于培养基的孢子表面，但是非分泌酶尽管存在分泌性信号肽(Bron S.，J.Biotechnol.，64：313(1998))，由于信号肽的疏水特性也可附着到孢子上。因此可以理解，任何具有分泌信号的蛋白通过本发明的孢子表面展示系统能在孢子表面上得以展示。

实施例4：具有修饰的分泌信号的羧甲基纤维素酶的孢子展示

N-端分泌信号肽一般包含N-端2-3个阳离子型氨基酸残基，接着是疏水区，阳离子型氨基酸通过与细胞膜的阴离子磷脂结合使得蛋白分泌(Tjalsma H.，Microbiol.Mol.Biol.Rev.，64：515-547(2000))。另外，用中性氨基酸取代阳离子型氨基酸已知会导致分泌降低(Chen M.和Nagarajan V.，J.Bacteriol.，176：5796-5801(1994))。基于上述事实，本发明人假设蛋白分泌的降低会增加胞内蛋白，并且由于蛋白的N-端疏水区，导致蛋白在孢子表面上更高的展示。为了试图证明此假设，进行了如下实验。

为了用仅含有疏水区而不含阳离子型氨基酸残基的分泌信号克隆羧甲基纤维素酶，将法国巴斯德研究所(Pasteur Institute in France)的F.Kunst博士赠送的枯草芽孢杆菌168菌株的DNA(Nature，390：249-256(1997))通过Kalman等方法分离。其后，利用引物cmc-hp(SEQ NO：5)和另一引物(SEQ NO：6)以及与实施例2同样条件分离的DNA为模板进行PCR。

随后，用BamHI和SacI消化PCR产物，并克隆到已切去CMCase基因的pCrylP-CMCase中。通过自然转化方法，将pCrylP-CMCase-hp(图5)转化到枯草芽孢杆菌DB104中。所得转化子命名为“枯草芽孢杆菌BSK209”，于2000年12月2日保藏在国际保藏机构韩国典型培养物保藏中心(KCTC)，保藏号为KCTC 0902BP。SEQ ID NO：7是指在其信号肽中缺乏阳离子型氨基酸的CMCase的DNA序列，而SEQID NO：8是指其CMCase的氨基酸序列。

然后，将转化的芽孢杆菌菌株BSK209培养在摇床(37℃，250rpm)中，并通过renografin梯度方法分离纯的孢子。

与对照0mU比较，以实施例3所述的同样方法，分离孢子的羧甲基纤维素酶活性为4.74mU。该结果比野生型高出2.4倍，并显示比野生型有更多的酶得到展示。此外，以实施例3的同样方式，流式细胞仪利用羧甲基纤维素酶，显示有更多的酶展示在转化有pCrylP-CMCase-hp的芽孢杆菌菌株的孢子表面上(图6)。

在图6中，线1是指对照孢子，而线2是用质粒pCrylP-CMCase-hp转化的芽孢杆菌菌株的孢子。如图6所示，与图4所示的野生型羧甲基纤维素酶比较，峰移向右边，这显示有更多的羧甲基纤维素酶结合到孢子表面。结果，其分泌信号仅含疏水区而不含阳离子残基的羧甲基纤维素酶是孢子展示的中意形式。

从这些结果中可以理解，N-端阳离子信号氨基酸的缺失或中和在孢子展示中可利用来得到更多的便利。此外，信号肽的疏水区或其他不含信号肽的目的蛋白的疏水区显然可用于孢子展示。再者，通过选择性或随机诱变编码遗传载体表面蛋白的基因，或通过融合其他增强载体蛋白和目的蛋白之间的非共价键合的寡肽或多肽，疏水性增加，显然也会在孢子表面上增强目的蛋白的展示。

实施例5：利用离子结构域进行孢子表面展示羧甲基纤维素酶

如实施例1所示，尽管芽孢杆菌的孢子表面是疏水的，但是也有阴离子型氨基酸残基(Nishihara T.等，Microbiol.Immunol.，25：763771(1981))。本发明人假设目的阳离子蛋白可由离子键展示，而阳离子基元融合到无阳离子特性的目的蛋白将能在孢子表面上展示目的蛋白。为了试图证实这种假设，实施了如下实例。

为了使阳离子结构域融合到羧甲基纤维素酶上，利用下列引物将6个组氨酸残基融合到酶的成熟形式的N-端。首先，利用引物cmc-his(SEQ ID NO：9)和引物cmc-ter(SEQ ID NO：10)以及枯草芽孢杆菌168的DNA为模板在与实施例2相同的条件下进行PCR。

随后，PCR产物用BamHI和SacI限制性酶切，并克隆到实施例3所述的pCrylP-CMCase而非CMCase基因中。把构建的质粒pCrylP-CMCase-his(图7)通过自然转化方法转化到枯草芽孢杆菌DB104中。SEQ ID NO：11是指在其N-端区域融合有6个组氨酸残基的CMCase的基因序列，而SEQ No.12是指其氨基酸序列。

然后，将转化有pCrylP-CMCase-his的芽孢杆菌菌株培养在摇床(37℃，250rpm)中，并通过renografin梯度方法分离纯的孢子。

以实施例3所述的相同方法，与对照0mU比较，分离孢子的羧甲基纤维素酶活性为1.90mU，以及利用羧甲基纤维素酶特异的抗体以实施例3相同的方式操作流式细胞仪，显示酶展示在用pCrylP-CMCase-his转化的芽孢杆菌菌株的孢子表面上(图8)。

在图8中，线1是指对照孢子，线2代表用质粒pCrylP-CMCase-his转化的芽孢杆菌菌株的孢子。如图8所示，与对照比较，峰移至右边，这表明有更多的特异于羧甲基纤维素酶的抗体结合于孢子表面。这些结果显示其N-端含有其他阳离子结构域的羧甲基纤维素酶结合于转化有pCrylP-CMCase-his的芽孢杆菌的孢子表面。

所以，通过选择性或随机诱变基因或通过与任何蛋白中的阳离子结构域融合，阳离子特性增加显然会增强孢子展示。此外，融合其他寡肽或多肽，增强遗传载体表面蛋白和目的蛋白之间的非共价键，或通过选择性或随机诱变编码遗传载体表面蛋白的基因，增加阴离子特性，会提高孢子表面展示阳离子目的蛋白。

根据实施例的结果，显示通过融合其他序列增加表面展示，可以想象的是把结合配偶体如抗体—抗原或配体—受体融合到目的蛋白和遗传载体表面蛋白有助于表面展示。

另应理解，通过戊二醛、紫外线或酶处理，催化共价键的形成，由此在遗传载体表面蛋白和目的蛋白之间形成其他共价键，所展示的目的蛋白会更加得以稳定。

实施例6：在噬菌体表面上展示目的蛋白

根据上述实施例所证实的事实和发现，能够与噬菌体的外被蛋白结合的目的蛋白可展示在噬菌体表面上是一目了然的。这种可能性证实如下：而且，不能结合于噬菌体表面的目的蛋白通过融合能结合于外被蛋白的基元可在噬菌体表面上加以展示，这也是很有可能的。

首先，把疏水结构域融合到噬菌体的外被蛋白和目的蛋白上。此外，还融合向胞质分泌的信号肽。当它们在宿主细胞中表达时，所分泌的目的蛋白通过与位于胞质中的噬菌体的外被蛋白疏水作用，在噬菌体表面上得以展示。

根据此实施例中的发现，通过其他键合而非疏水作用能够展示的修饰对本领域那些技术人员来说是一目了然的。

实施例7：利用在遗传载体上的展示方法定向进化目的蛋白

利用本发明中设计的展示系统，有可能实施目的蛋白的定点进化，其中表面展示由目的蛋白和遗传载体表面之间的相互作用来实现。首先，以羧甲基纤维素酶基因为模板进行易错PCR(Cadwell，R.C.和Joyce，G.F.，PCR Methods Appl.，2：28-33(1992))。采用特异于羧甲基纤维素酶基因的引物和以实施例3中所述的质粒pCPaC3为模板，进行PCR。

PCR混合物的制备方法是混合0.3μM各种引物、5ng DNA模板、PCR溶液(10mM Tris(pH8.3)、50mM KCl、7mM MgCl₂、0.01％(w/v)明胶)、0.2mM dGTP、0.2mM dATP、1mM dTTP、1mM dCTP、0.15mM MnCl₂、5U Bioneer(Korea)的Taq聚合酶和蒸馏水补至100μl。在下列条件下共进行13个循环的PCR：94℃变性30秒、50℃退火30秒以及72℃延伸1分钟。

随后，将上述PCR扩增的插入片段克隆到可复制载体中，并通过自然转化方法用克隆的载体转化枯草芽孢杆菌DB104，以及通过在摇床中培养转化的芽孢杆菌菌株24小时，将羧甲基纤维素酶在孢子表面上得以展示，并通过renografin梯度方法分离纯的孢子。其后，如实施例3所述，利用羧甲基纤维素酶活性的变化或采用特异于羧甲基纤维素酶的抗体的流式细胞仪的变化，对具有改性羧甲基纤维素酶的孢子加以选择。

实施例8：利用遗传载体表面展示目的蛋白进行生物转化

利用有机溶剂中的脂肪酶进行生物转化已有报道(Zaks，A.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.82：3192(1985)；和Klibanow，A.M.，CHEMTECH，16：354(1986))。没有酶的失活对实施反应是必不可少的。为了达到此目的，按惯例一直采用脂肪酶的固定(Mustranta，A.Forssell等，Enz.Microb.Technol.，15：133(1993)；和Reetz，M.T.等，J.Biotechnol.Biogen.，49：527(1996))。根据这些报道，固定的脂肪酶在有机溶剂中保持高的稳定性，并与游离的脂肪酶比较，合成增加。

首先，根据本发明将脂肪酶展示孢子的表面上，以及如所述进行生物转化(Zaks，A.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.82：3192(1985)；Klibanow，A.M.，CHEMTECH，16；354(1986))。

本发明的生物转化也可通过在抗有机溶剂的病毒表面上展示目的蛋白来进行。

实施例9：利用遗传载体上表面展示的目的蛋白的蛋白质阵列

采用自动化阵列装置，将10⁶-10⁹个展示抗特异表面抗原的单克隆抗体的孢子附着到玻璃基底上用于在其表面上含有醛官能团的蛋白质阵列(BMS，Germany)。附着以共价键的形式进行，所述共价键是孢子表面上蛋白的氨基和载玻片表面上的醛基之间的席夫碱。虽然在固相表面上附着的展示蛋白有可能是失活的，但它们可具有方向性。

根据本发明制造的蛋白质阵列试剂盒具有各种各样的应用领域，包括诊断、基因表达的分析、蛋白质之间相互作用的分析、蛋白和配体之间的相互作用的分析、代谢的研究、筛选新型或改进的酶、组合的生化合成和生物传感器。

实施例10：利用遗传载体上表面展示的目的蛋白生产抗体

通过展示能够体内诱导免疫应答的抗原，抗体可被诱导。

首先，通过自然转化方法，将实施例3中所用的含有羧甲基纤维素酶的pCrylP-CMCase作为抗原转化到枯草芽孢杆菌DB104中。然后，通过在补充有GYS培养基的摇床中培养转化的芽孢杆菌菌株24小时，将羧甲基纤维素酶展示在孢子表面上。随后，通过renografin梯度方法分离纯的孢子。将抗原—展示的孢子重悬浮于PBS中，并加入相同体积的佐剂。其后，通过旋涡混合上述溶液，并静脉内注射到出生后6-8周龄的BALB/c小鼠中。4周后，进行第二次注射。通过2-3次加强诱导抗体。

实施例11：利用遗传载体上表面展示的目的蛋白分离特异物质

利用遗传载体展示结合区从混合物中分离特异物质是可能的。首先，采用编码结合区的基因作为模板进行易错PCR(Cadwell，R.C.和Joyce，G.F.，PCR Methods Appl.，2：28-33(1992))。利用特异于目的基因的引物以及含有目的基因或染色体的质粒模板，进行PCR。PCR混合物的制备方法是混合0.3μM各种引物、5ng DNA模板、PCR溶液(10mM Tris(pH8.3)、50mM KCl、7mM MgCl₂、0.01％(w/v)明胶)、0.2mM dGTP、0.2mM dATP、1mM dTTP、1mM dCTP、0.15mMMnCl₂、5U Bioneer(Korea)的Taq聚合酶和蒸馏水补至100μl。在下列条件下共进行13个循环的PCR：94℃变性30秒、50℃退火30秒以及72℃延伸1分钟。

随后，将上述PCR扩增的插入片段克隆到可复制的载体中以在宿主细胞中构建文库。用克隆载体文库转化宿主细胞，使结合区在宿主细胞中表达并在遗传载体表面上展示，并对具有目标特性的载体展示修饰的结合区进行筛选。通过与混合物混合，将筛选的遗传载体分离、繁殖、表达并用于分离特异物质。

如上所述，本发明方法用于制备在遗传载体上表面展示的目的蛋白，可用来在缺乏展示基元的情况下在遗传载体表面上展示各种各样的蛋白，目的蛋白在形成其固有结构后，由于展示可获取完全的活性，并且目的蛋白表达和展示的量的增加从来不降低对环境的抗性和遗传载体的生存力。

参考文献

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4.Charbit，A.，Molla，A.，Saurin，W.和Hofnung，M.用于在革兰氏阴性细菌的表面上表达外源多肽的载体的多样性。Gene 70：181-189(1988)

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6.Chiswell，D.J.和McCafferty，J.噬菌体抗体：新“多克隆抗体”会取代单克隆抗体吗？TIBTECH 10：80-84(1992)

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8.d′Enfert，C.，Ryter，A.和Pugsley，A.P.在大肠杆菌中克隆和表达肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)基因用于载脂蛋白普鲁兰酶的生产、细胞表面定位和分泌。EMBO J.6：3531-3538(1987)

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10.Ferguson，M.A.J.和Williams，A.F.通过糖基磷脂酰肌醇结构对蛋白进行细胞表面锚定。Ann.Rev.Biochem.57：285-320(1988)

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14.Fuchs，P.，Breitling，F.，Dubel，S.，Seehaus，T.和Little，M.将重组抗体靶击到大肠杆菌的表面：与肽聚糖相关的载脂蛋白的融合。Bio/Technology 9：1369-1372(1991)

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17.Georgiou，G.，Stathopoulos，C.，Daugherty，P.S.，Nayak，A.R.，Iverson，B.L.和Curtiss III，R.异源蛋白在微生物表面上的展示：从组合文库的筛选到活的重组疫苗。Nature Biotechnology 15：29-34(1997)

18.Georgiou，G.，Stephens D.，Stathopoulos，C.，Poetschke H.L.，Mendenhall J.和Earhart C.F.在大肠杆菌表面上展示b-内酰胺酶：由Lpp′-OmpA′-b-内酰胺酶融合赋予外膜表型。Protein Eng.9：239-247(1996)

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20.Jung，H.C.，Lebeault，J.M.和Pan，J.G.通过利用丁香假单胞菌(Pseudomonas syringe)的冰核蛋白来表面展示运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)左聚糖蔗糖酶(levansucrase)。Nature Biotechnol.16：576-580(1998a).

21.Jung，H.C.，Park，J.H.，Park，S.H.，Lebeault，J.M.和Pan，J.G.利用丁香假单胞菌(Pseudomonas syringe)冰核蛋白在大肠杆菌表面上表达羧甲基纤维素酶。Enzyme Microb.Technol.16：576-580(1998b).

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23.Kim，E.J.和Yoo，S.K.利用丁香假单胞菌(Pseudomonassyringe)冰核蛋白在大肠杆菌上细胞表面展示乙型病毒表面抗原。Lett.Appl.Microbiol.29：292-297(1999).

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29.Lee，J.S.，Shin，K.S.，Pan，J.G.和Kim，C.J.Nature Biotechnol.18：645-648(2000)

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33.Newton，S.M.，Jacob，C.O.和Stocker，B.A.D.对插入到沙门氏菌鞭毛蛋白中的霍乱毒素表位的免疫应答。Science 244：70-72(1989)

34.Ochs，M.，Angerer，A.，Enz，S.和Braun，V.表面信号在大肠杆菌的柠檬酸铁转运系统中的转录调节：突变分析或选的σ因子FecI支持其在fec转运基因转录中的必要作用。Mol.Gen.Genet.250：455-465(1996)

35.Palva，A.M.和Palva，I.A.利用表面蛋白基因序列的乳杆菌表达系统，W094/00581(1994).

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44.Sousa，C.，Kotrba，P.，Ruml，T.Cebolla，A.，和de Lorenzo，V.通过大肠杆菌展示酵母的金属吸附和锚定于外膜蛋白LamB的哺乳动物金属硫蛋白。Bacteriol.180：2280-2284(1998).

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46.Webb，C.D.，Decatur A.，Teleman A.和Losick R.利用绿色荧光蛋白目测细胞特异基因表达以及在枯草芽孢杆菌的孢子形成过程中亚细胞蛋白的定位。J.Bacteriol.177：5906-5911(1995)

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根据布达佩斯条约用于专利程序的微生物保藏国际识别

国际表格

原始保藏收据

根据第7.1条颁布

授予人：潘在龟

大韩民国大田广域市305-340儒城区道龙洞380-43

I.微生物的识别
I.微生物的识别	保藏者给出的识别号：枯草芽孢杆菌BSK209	国际保藏单位给出的登记号：KCTC 0902BP
II.科学描述和/或建议的分类名称	保藏者给出的识别号：枯草芽孢杆菌BSK209	国际保藏单位给出的登记号：KCTC 0902BP
II.科学描述和/或建议的分类名称	有关I识别的微生物：(×)科学描述()建议的分类名称(×表示适用)
III.接收	有关I识别的微生物：(×)科学描述()建议的分类名称(×表示适用)
III.接收	国际保藏单位已接收I识别的微生物，收到日：2000年12月2日
IV.国际保藏单位	国际保藏单位已接收I识别的微生物，收到日：2000年12月2日
IV.国际保藏单位	名称：韩国典型培养物保藏中心地址：大韩民国大田广域市305-333韩国生物科学和生物技术研究所(KRIBB)	国际保藏单位授权官签名：DAE Kyung Sook，Director日期：2000.12.7.

序列表

<110>格诺福库斯株式会社(GENOFOCUS Co.，Ltd.)

<120>在遗传载体上表面展示蛋白的方法

(Method for Surface Display of Proteins on Genet ic Carriers)

<130>SCT031940-47

<150>KR2001-2156

<151>2001-01-15

<160>12

<170>KopatentIn 1.71

<210>1

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>对脂肪酶基因进行PCR的有义引物

<400>1

ggggatccgt tggaaggaga gggagaac 28

<210>2

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>对脂肪酶基因进行PCR的反义引物

<400>2

gcggtacctt tttgtccgtt ctcctga 27

<210>3

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>对crylAa启动子进行PCR的有义引物

<400>3

tccccgcggg actcttccta tatttactt 29

<210>4

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>对crylAa启动子进行PCR的反义引物

<400>4

atttgtacag gaaatgcgtc 20

<210>5

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>对突变CMCase基因进行PCR的有义引物

<400>5

ggatccgggg aggagaatca tgatctctat ttttattacg tg 42

<210>6

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>对突变CMCase基因进行PCR的反义引物

<400>6

gagctccagt at ttcatcca caacgc 26

<210>7

<211>1491

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>含有突变的信号序列以增强其疏水性的CMCase基因

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(1488)

<400>7

atg atc tct att ttt att acg tgt tta ttg att acg tta ttg aca atg 48

Met Ile Ser Ile Phe Ile Thr Cys Leu Leu Ile Thr Leu Leu Thr Met

1 5 10 15

ggc ggc atg ctg gct tcg ccg gca tca gca gca ggg aca aaa acg cca 96

Gly Gly Met Leu Ala Ser Pro Ala Ser Ala Ala Gly Thr Lys Thr Pro

20 25 30

gta gcc aag aat ggc cag ctt agc ata aaa ggt aca cag ctc gtt aac 144

Val Ala Lys Asn Gly Gln Leu Ser Ile Lys Gly Thr Gln Leu Val Asn

35 40 45

cga gac ggt aaa gcg gta cag ctg aag ggg atc agt tca cac gga ttg 192

Arg Asp Gly Lys Ala Val Gln Leu Lys Gly Ile Ser Ser His Gly Leu

50 55 60

caa tgg tat gga gaa tat gtc aat aaa gac agc tta aaa tgg ctg agg 240

Gln Trp Tyr Gly Glu Tyr Val Asn Lys Asp Ser Leu Lys Trp Leu Arg

65 70 75 80

gac gat tgg ggt atc acc gtt ttc cgt gca gcg atg tat acg gca gat 288

Asp Asp Trp Gly Ile Thr Val Phe Arg Ala Ala Met Tyr Thr Ala Asp

85 90 95

ggc ggt ata att gac aac ccg tcc gtg aaa aat aaa atg aaa gaa gcg 336

Gly Gly Ile Ile Asp Asn Pro Ser Val Lys Asn Lys Met Lys Glu Ala

100 105 110

gtt gaa gcg gca aaa gag ctt ggg ata tat gtc atc att gac tgg cat 384

Val Glu Ala Ala Lys Glu Leu Gly Ile Tyr Val Ile Ile Asp Trp His

115 120 125

atc tta aat gac ggt aat cca aac caa aat aaa gag aag gca aaa gaa 432

Ile Leu Asn Asp Gly Asn Pro Asn Gln Asn Lys Glu Lys Ala Lys Glu

130 135 140

ttc ttc aag gaa atg tca agc ctt tac gga aac acg cca aac gtc att 480

Phe Phe Lys Glu Met Ser Ser Leu Tyr Gly Asn Thr Pro Asn Val Ile

145 150 155 160

tat gaa att gca aac gaa cca aac ggt gat gtg aac tgg aag cgt gat 528

Tyr Glu Ile Ala Asn Glu Pro Asn Gly Asp Val Asn Trp Lys Arg Asp

165 170 175

att aaa ccg tat gcg gaa gaa gtg att tcc gtt atc cgc aaa aat gat 576

Ile Lys Pro Tyr Ala Glu Glu Val Ile Ser Val Ile Arg Lys Asn Asp

180 185 190

cca gac aac att atc att gtc gga acc ggt aca tgg agc cag gat gtg 624

Pro Asp Asn Ile Ile Ile Val Gly Thr Gly Thr Trp Ser Gln Asp Val

195 200 205

aat gat gct gcc gat gac cag cta aaa gat gca aac gtt atg gac gca 672

Asn Asp Ala Ala Asp Asp Gln Leu Lys Asp Ala Asn Val Met Asp Ala

210 215 220

ctt cat ttt tat gcc ggc aca cac ggc caa ttt tta cgg gat aaa gca 720

Leu His Phe Tyr Ala Gly Thr His Gly Gln Phe Leu Arg Asp Lys Ala

225 230 235 240

aac tat gca ctc agc aaa gga gca cct att ttt gtg aca gag tgg gga 768

Asn Tyr Ala Leu Ser Lys Gly Ala Pro Ile Phe Val Thr Glu Trp Gly

245 250 255

aca agc gac gcg tct ggc aat ggc ggt gta ttc ctt gat caa tcg agg 816

Thr Ser Asp Ala Ser Gly Asn Gly Gly Val Phe Leu Asp Gln Ser Arg

260 265 270

gaa tgg ctg aaa tat ctc gac agc aag acc atc agc tgg gtg aac tgg 864

Glu Trp Leu Lys Tyr Leu Asp Ser Lys Thr Ile Ser Trp Val Asn Trp

275 280 285

aat ctt tct gat aag cag gaa tca tcc tca gct tta aag ccg ggg gca 912

Asn Leu Ser Asp Lys Gln Glu Ser Ser Ser Ala Leu Lys Pro Gly Ala

290 295 300

tct aaa aca ggc ggc tgg cgg ttg tca gat tta tct gct tca gga aca 960

Ser Lys Thr Gly Gly Trp Arg Leu Ser Asp Leu Ser Ala Ser Gly Thr

305 310 315 320

ttc gtt aga gaa aac att ctc ggc acc aaa gat tcg acg aag gac att 1008

Phe Val Arg Glu Asn Ile Leu Gly Thr Lys Asp Ser Thr Lys Asp Ile

325 330 335

cct gaa acg cca gca aaa gat aaa ccc aca cag gaa aac ggt att tct 1056

Pro Glu Thr Pro Ala Lys Asp Lys Pro Thr Gln Glu Asn Gly Ile Ser

340 345 350

gta caa tac aga gca ggg gat ggg agt atg aac agc aac caa atc cgt 1104

Val Gln Tyr Arg Ala Gly Asp Gly Ser Met Asn Ser Asn Gln Ile Arg

355 360 365

ccg cag ctt caa ata aaa aat aac ggc aat acc acg gtt gat tta aaa 1152

Pro Gln Leu Gln Ile Lys Asn Asn Gly Asn Thr Thr Val Asp Leu Lys

370 375 380

gat gtc act gcc cgt tac tgg tat aac gcg aaa aac aaa ggc caa aac 1200

Asp Val Thr Ala Arg Tyr Trp Tyr Asn Ala Lys Asn Lys Gly Gln Asn

385 390 395 400

gtt gac tgt gac tac gcg cag ctt gga tgc ggc aat gtg aca tac aag 1248

Val Asp Cys Asp Tyr Ala Gln Leu Gly Cys Gly Asn Val Thr Tyr Lys

405 410 415

ttt gtg acg ttg cat aaa cca aag caa ggt gca gat acc tat ctg gaa 1296

Phe Val Thr Leu His Lys Pro Lys Gln Gly Ala Asp Thr Tyr Leu Glu

420 425 430

ctt gga ttt aaa aac gga acg ctg gca ccg gga gca agc aca ggg aat 1344

Leu Gly Phe Lys Asn Gly Thr Leu Ala Pro Gly Ala Ser Thr Gly Asn

435 440 445

att cag ctt cgt ctt cac aat gat gac tgg agc aat tat gca caa agc 1392

Ile Gln Leu Arg Leu His Asn Asp Asp Trp Ser Asn Tyr Ala Gln Ser

450 455 460

ggc gat tat tcc ttt ttc aaa tca aat acg ttt aaa aca acg aaa aaa 1440

Gly Asp Tyr Ser Phe Phe Lys Ser Asn Thr Phe Lys Thr Thr Lys Lys

465 470 475 480

atc aca tta tat gat caa gga aaa ctg att tgg gga aca gaa cca aat 1488

Ile Thr Leu Tyr Asp Gln Gly Lys Leu Ile Trp Gly Thr Glu Pro Asn

485 490 495

ta g 1491

<210>8

<211>496

<212>PRT

<213>人工序列

<400>8

Met Ile Ser Ile Phe Ile Thr Cys Leu Leu Ile Thr Leu Leu Thr Met

1 5 10 15

Gly Gly Met Leu Ala Ser Pro Ala Ser Ala Ala Gly Thr Lys Thr Pro

20 25 30

Val Ala Lys Asn Gly Gln Leu Ser Ile Lys Gly Thr Gln Leu Val Asn

35 40 45

Arg Asp Gly Lys Ala Val Gln Leu Lys Gly Ile Ser Ser His Gly Leu

50 55 60

Gln Trp Tyr Gly Glu Tyr Val Asn Lys Asp Ser Leu Lys Trp Leu Arg

65 70 75 80

Asp Asp Trp Gly Ile Thr Val Phe Arg Ala Ala Met Tyr Thr Ala Asp

85 90 95

Gly Gly Ile Ile Asp Asn Pro Ser Val Lys Asn Lys Met Lys Glu Ala

100 105 110

Val Glu Ala Ala Lys Glu Leu Gly Ile Tyr Val Ile Ile Asp Trp His

115 120 125

Ile Leu Asn Asp Gly Asn Pro Asn Gln Asn Lys Glu Lys Ala Lys Glu

130 135 140

Phe Phe Lys Glu Met Ser Ser Leu Tyr Gly Asn Thr Pro Asn Val Ile

145 150 155 160

Tyr Glu Ile Ala Asn Glu Pro Asn Gly Asp Val Asn Trp Lys Arg Asp

165 170 175

Ile Lys Pro Tyr Ala Glu Glu Val Ile Ser Val Ile Arg Lys Asn Asp

180 185 190

Pro Asp Asn Ile Ile Ile Val Gly Thr Gly Thr Trp Ser Gln Asp Val

195 200 205

Asn Asp Ala Ala Asp Asp Gln Leu Lys Asp Ala Asn Val Met Asp Ala

210 215 220

Leu His Phe Tyr Ala Gly Thr His Gly Gln Phe Leu Arg Asp Lys Ala

225 230 235 240

Asn Tyr Ala Leu Ser Lys Gly Ala Pro Ile Phe Val Thr Glu Trp Gly

245 250 255

Thr Ser Asp Ala Ser Gly Asn Gly Gly Val Phe Leu Asp Gln Ser Arg

260 265 270

Glu Trp Leu Lys Tyr Leu Asp Ser Lys Thr Ile Ser Trp Val Asn Trp

275 280 285

Asn Leu Ser Asp Lys Gln Glu Ser Ser Ser Ala Leu Lys Pro Gly Ala

290 295 300

Ser Lys Thr Gly Gly Trp Arg Leu Ser Asp Leu Ser Ala Ser Gly Thr

305 310 315 320

Phe Val Arg Glu Asn Ile Leu Gly Thr Lys Asp Ser Thr Lys Asp Ile

325 330 335

Pro Glu Thr Pro Ala Lys Asp Lys Pro Thr Gln Glu Asn Gly Ile Ser

340 345 350

Val Gln Tyr Arg Ala Gly Asp Gly Ser Met Asn Ser Asn Gln Ile Arg

355 360 365

Pro Gln Leu Gln Ile Lys Asn Asn Gly Asn Thr Thr Val Asp Leu Lys

370 375 380

Asp Val Thr Ala Arg Tyr Trp Tyr Asn Ala Lys Asn Lys Gly Gln Asn

385 390 395 400

Val Asp Cys Asp Tyr Ala Gln Leu Gly Cys Gly Asn Val Thr Tyr Lys

405 410 415

Phe Val Thr Leu His Lys Pro Lys Gln Gly Ala Asp Thr Tyr Leu Glu

420 425 430

Leu Gly Phe Lys Asn Gly Thr Leu Ala Pro Gly Ala Ser Thr Gly Asn

435 440 445

Ile Gln Leu Arg Leu His Asn Asp Asp Trp Ser Asn Tyr Ala Gln Ser

450 455 460

Gly Asp Tyr Ser Phe Phe Lys Ser Asn Thr Phe Lys Thr Thr Lys Lys

465 470 475 480

Ile Thr Leu Tyr Asp Gln Gly Lys Leu Ile Trp Gly Thr Glu Pro Asn

485 490 495

<210>9

<211>58

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>对突变的CMCase基因进行PCR的有义引物

<400>9

ggatccgggg aggagaatca tgcaccatca ccaccaccac gcagggacaa aaacgcca 58

<210>10

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>对突变的CMCase基因进行PCR的反义引物

<400>10

gagctccagt atttcatcca caacgc 26

<210>11

<211>1434

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>含有额外的组氨酸编码序列的CMCase基因

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(1431)

<400>11

atg cac cat cac cac cac cac gca ggg aca aaa acg cca gta gcc aag 48

Met His His His His His His Ala Gly Thr Lys Thr Pro Val Ala Lys

1 5 10 15

aat ggc cag ctt agc ata aaa ggt aca cag ctc gtt aac cga gac ggt 96

Asn Gly Gln Leu Ser Ile Lys Gly Thr Gln Leu Val Asn Arg Asp Gly

20 25 30

aaa gcg gta cag ctg aag ggg atc agt tca cac gga ttg caa tgg tat 144

Lys Ala Val Gln Leu Lys Gly Ile Ser Ser His Gly Leu Gln Trp Tyr

35 40 45

gga gaa tat gtc aat aaa gac agc tta aaa tgg ctg agg gac gat tgg 192

Gly Glu Tyr Val Asn Lys Asp Ser Leu Lys Trp Leu Arg Asp Asp Trp

50 55 60

ggt atc acc gtt ttc cgt gca gcg atg tat acg gca gat ggc ggt ata 240

Gly Ile Thr Val Phe Arg Ala Ala Met Tyr Thr Ala Asp Gly Gly Ile

65 70 75 80

att gac aac ccg tcc gtg aaa aat aaa atg aaa gaa gcg gtt gaa gcg 288

Ile Asp Asn Pro Ser Val Lys Asn Lys Met Lys Glu Ala Val Glu Ala

85 90 95

gca aaa gag ctt ggg ata tat gtc atc att gac tgg cat atc tta aat 336

Ala Lys Glu Leu Gly Ile Tyr Val Ile Ile Asp Trp His Ile Leu Asn

100 105 110

gac ggt aat cca aac caa aat aaa gag aag gca aaa gaa ttc ttc aag 384

Asp Gly Asn Pro Asn Gln Asn Lys Glu Lys Ala Lys Glu Phe Phe Lys

115 120 125

gaa atg tca agc ctt tac gga aac acg cca aac gtc att tat gaa att 432

Glu Met Ser Ser Leu Tyr Gly Asn Thr Pro Asn Val Ile Tyr Glu Ile

130 135 140

gca aac gaa cca aac ggt gat gtg aac tgg aag cgt gat att aaa ccg 480

Ala Asn Glu Pro Asn Gly Asp Val Asn Trp Lys Arg Asp Ile Lys Pro

145 150 155 160

tat gcg gaa gaa gtg att tcc gtt atc cgc aaa aat gat cca gac aac 528

Tyr Ala Glu Glu Val Ile Ser Val Ile Arg Lys Asn Asp Pro Asp Asn

165 170 175

att atc att gtc gga acc ggt aca tgg agc cag gat gtg aat gat gct 576

Ile Ile Ile Val Gly Thr Gly Thr Trp Ser Gln Asp Val Asn Asp Ala

180 185 190

gcc gat gac cag cta aaa gat gca aac gtt atg gac gca ctt cat ttt 624

Ala Asp Asp Gln Leu Lys Asp Ala Asn Val Met Asp Ala Leu His Phe

195 200 205

tat gcc ggc aca cac ggc caa ttt tta cgg gat aaa gca aac tat gca 672

Tyr Ala Gly Thr His Gly Gln Phe Leu Arg Asp Lys Ala Asn Tyr Ala

210 215 220

ctc agc aaa gga gca cct att ttt gtg aca gag tgg gga aca agc gac 720

Leu Ser Lys Gly Ala Pro Ile Phe Val Thr Glu Trp Gly Thr Ser Asp

225 230 235 240

gcg tct ggc aat ggc ggt gta ttc ctt gat caa tcg agg gaa tgg ctg 768

Ala Ser Gly Asn Gly Gly Val Phe Leu Asp Gln Ser Arg Glu Trp Leu

245 250 255

aaa tat ctc gac agc aag acc atc agc tgg gtg aac tgg aat ctt tct 816

Lys Tyr Leu Asp Scr Lys Thr Ile Ser Trp Val Asn Trp Asn Lcu Ser

260 265 270

gat aag cag gaa tca tcc tca gct tta aag ccg ggg gca tct aaa aca 864

Asp Lys Gln Glu Ser Ser Ser Ala Leu Lys Pro Gly Ala Ser Lys Thr

275 280 285

ggc ggc tgg cgg ttg tca gat tta tct gct tca gga aca ttc gtt aga 912

Gly Gly Trp Arg Leu Ser Asp Leu Ser Ala Ser Gly Thr Phe Val Arg

290 295 300

gaa aac att ctc ggc acc aaa gat tcg acg aag gac att cct gaa acg 960

Glu Asn Ile Leu Gly Thr Lys Asp Ser Thr Lys Asp Ile Pro Glu Thr

305 310 315 320

cca gca aaa gat aaa ccc aca cag gaa aac ggt att tct gta caa tac 1008

Pro Ala Lys Asp Lys Pro Thr Gln Glu Asn Gly Ile Ser Val Gln Tyr

325 330 335

aga gca ggg gat ggg agt atg aac agc aac caa atc cgt ccg cag ctt 1056

Arg Ala Gly Asp Gly Ser Met Asn Ser Asn Gln Ile Arg Pro Gln Leu

340 345 350

caa ata aaa aat aac ggc aat acc acg gtt gat tta aaa gat gtc act 1104

Gln Ile Lys Asn Asn Gly Asn Thr Thr Val Asp Leu Lys Asp Val Thr

355 360 365

gcc cgt tac tgg tat aac gcg aaa aac aaa ggc caa aac gtt gac tgt 1152

Ala Arg Tyr Trp Tyr Asn Ala Lys Asn Lys Gly Gln Asn Val Asp Cys

370 375 380

gac tac gcg cag ctt gga tgc ggc aat gtg aca tac aag ttt gtg acg 1200

Asp Tyr Ala Gln Leu Gly Cys Gly Asn Val Thr Tyr Lys Phe Val Thr

385 390 395 400

ttg cat aaa cca aag caa ggt gca gat acc tat ctg gaa ctt gga ttt 1248

Leu His Lys Pro Lys Gln Gly Ala Asp Thr Tyr Leu Glu Leu Gly Phe

405 410 415

aaa aac gga acg ctg gca ccg gga gca agc aca ggg aat att cag ctt 1296

Lys Asn Gly Thr Leu Ala Pro Gly Ala Ser Thr Gly Asn Ile Gln Leu

420 425 430

cgt ctt cac aat gat gac tgg agc aat tat gca caa agc ggc gat tat 1344

Arg Leu His Asn Asp Asp Trp Ser Asn Tyr Ala Gln Ser Gly Asp Tyr

435 440 445

tcc ttt ttc aaa tca aat acg ttt aaa aca acg aaa aaa atc aca tta 1392

Ser Phe Phe Lys Ser Asn Thr Phe Lys Thr Thr Lys Lys Ile Thr Leu

450 455 460

tat gat caa gga aaa ctg att tgg gga aca gaa cca aat tag 1434

Tyr Asp Gln Gly Lys Leu Ile Trp Gly Thr Glu Pro Asn

465 470 475

<210>12

<211>477

<212>PRT

<213>人工序列

<400>12

Met His His His His His His Ala Gly Thr Lys Thr Pro Val Ala Lys

1 5 10 15

Asn Gly Gln Leu Ser Ile Lys Gly Thr Gln Leu Val Asn Arg Asp Gly

20 25 30

Lys Ala Val Gln Leu Lys Gly Ile Ser Ser His Gly Leu Gln Trp Tyr

35 40 45

Gly Glu Tyr Val Asn Lys Asp Ser Leu Lys Trp Leu Arg Asp Asp Trp

50 55 60

Gly Ile Thr Val Phe Arg Ala Ala Met Tyr Thr Ala Asp Gly Gly Ile

65 70 75 80

Ile Asp Asn Pro Ser Val Lys Asn Lys Met Lys Glu Ala Val Glu Ala

85 90 95

Ala Lys Glu Leu Gly Ile Tyr Val Ile Ile Asp Trp His Ile Leu Asn

100 105 110

Asp Gly Asn Pro Asn Gln Asn Lys Glu Lys Ala Lys Glu Phe Phe Lys

115 120 125

Glu Met Ser Ser Leu Tyr Gly Asn Thr Pro Asn Val Ile Tyr Glu Ile

130 135 140

Ala Asn Glu Pro Asn Gly Asp Val Asn Trp Lys Arg Asp Ile Lys Pro

145 150 155 160

Tyr Ala Glu Glu Val Ile Ser Val Ile Arg Lys Asn Asp Pro Asp Asn

165 170 175

Ile Ile Ile Val Gly Thr Gly Thr Trp Ser Gln Asp Val Asn Asp Ala

180 185 190

Ala Asp Asp Gln Leu Lys Asp Ala Asn Val Met Asp Ala Leu His Phe

195 200 205

Tyr Ala Gly Thr His Gly Gln Phe Leu Arg Asp Lys Ala Asn Tyr Ala

210 215 220

Leu Ser Lys Gly Ala Pro Ile Phe Val Thr Glu Trp Gly Thr Ser Asp

225 230 235 240

Ala Ser Gly Asn Gly Gly Val Phe Leu Asp Gln Ser Arg Glu Trp Leu

245 250 255

Lys Tyr Leu Asp Ser Lys Thr Ile Ser Trp Val Asn Trp Asn Leu Ser

260 265 270

Asp Lys Gln Glu Ser Ser Ser Ala Leu Lys Pro Gly Ala Ser Lys Thr

275 280 285

Gly Gly Trp Arg Leu Ser Asp Leu Ser Ala Ser Gly Thr Phe Val Arg

290 295 300

Glu Asn Ile Leu Gly Thr Lys Asp Ser Thr Lys Asp Ile Pro Glu Thr

305 310 315 320

Pro Ala Lys Asp Lys Pro Thr Gln Glu Asn Gly Ile Ser Val Gln Tyr

325 330 335

Arg Ala Gly Asp Gly Ser Met Asn Ser Asn Gln Ile Arg Pro Gln Leu

340 345 350

Gln Ile Lys Asn Asn Gly Asn Thr Thr Val Asp Leu Lys Asp Val Thr

355 360 365

Ala Arg Tyr Trp Tyr Asn Ala Lys Asn Lys Gly Gln Asn Val Asp Cys

370 375 380

Asp Tyr Ala Gln Leu Gly Cys Gly Asn Val Thr Tyr Lys Phe Val Thr

385 390 395 400

Leu His Lys Pro Lys Gln Gly Ala Asp Thr Tyr Leu Glu Leu Gly Phe

405 410 415

Lys Asn Gly Thr Leu Ala Pro Gly Ala Ser Thr Gly Asn Ile Gln Leu

420 425 430

Arg Leu His Asn Asp Asp Trp Ser Asn Tyr Ala Gln Ser Gly Asp Tyr

435 440 445

Ser Phe Phe Lys Ser Asn Thr Phe Lys Thr Thr Lys Lys Ile Thr Leu

450 455 460

Tyr Asp Gln Gly Lys Leu Ile Trp Gly Thr Glu Pro Asn

465 470 475

Claims

1.一种制备在遗传载体上表面展示的目的蛋白的方法，其包括下列步骤：

(a)用含有编码目的蛋白基因的载体转化内含选自孢子和病毒的遗传载体的宿主细胞；

(b)培养转化的宿主细胞并在宿主细胞中表达目的蛋白；和

(c)使表达蛋白和遗传载体表面之间形成非共价键，以便目的蛋白展示在遗传载体表面上。

2.一种改进目的蛋白的方法，其包括下列步骤：

(a)通过突变编码目的蛋白的基因，构建目的蛋白的基因文库；

(b)制备含有构建的基因文库的载体文库；

(c)用载体文库转化内含选自孢子和病毒的遗传载体的宿主细胞；

(d)培养转化的宿主细胞并在宿主细胞中表达目的蛋白的变体；

(e)通过在表达的蛋白变体和遗传载体表面之间形成非共价键以便使变体展示在遗传载体表面上，从而获取遗传载体文库；和

(f)筛选在其表面上展示具有所需特性的目的蛋白变体的遗传载体。

3.一种从混合物中分离目的物质的方法，其包括下列步骤：

(a)通过突变编码作为目的蛋白的结合蛋白或结合区的基因，构建编码结合蛋白变体或其结合区的基因文库；

(b)制备含有构建的基因文库的载体文库；

(d)培养转化的宿主细胞并在宿主细胞中表达结合蛋白或结合区的变体；

(e)通过在表达的结合蛋白变体或结合区变体和遗传载体表面之间形成非共价键以使变体展示在遗传载体表面上，从而获取遗传载体文库；

(f)将遗传载体文库与预定的物质接触，并通过选择在其表面上展示结合预定物质的变体来筛选改进的结合蛋白或其结合区；和

(g)将在其表面上展示改进的结合蛋白或其结合区的遗传载体与混合物接触以从混合物中分离目的物质。

4.根据权利要求1或2所述的方法，其中目的蛋白选自激素、激素类似物、酶、酶抑制剂、信号转导蛋白或其片段、抗体或其片段、单链抗体、结合蛋白或其片段、肽、抗原、粘着蛋白、结构蛋白、调节蛋白、毒素蛋白、细胞因子、转录调节蛋白、血液凝固蛋白和植物防卫—诱导蛋白。

5.根据权利要求3所述的方法，其中结合蛋白或其结合区为抗体或其抗体结构域。

6.根据权利要求4所述的方法，其中结合蛋白或其片段为抗体或其抗体结构域。

7.根据权利要求3所述的方法，其中结合蛋白或结合区选自蛋白酶抑制剂、芥菜素、肠毒素、芋螺毒素、蜂毒明肽溶菌酶、核糖核酸酶、卡律蝎毒素、半胱氨酸蛋白酶抑制剂、水蛭蛋白酶抑制剂、卵类粘蛋白、天青蛋白、肿瘤坏死因子和CD4。

8.根据权利要求4所述的方法，其中结合蛋白或结合区选自蛋白酶抑制剂、芥菜素、肠毒素、芋螺毒素、蜂毒明肽溶菌酶、核糖核酸酶、卡律蝎毒素、半胱氨酸蛋白酶抑制剂、水蛭蛋白酶抑制剂、卵类粘蛋白、天青蛋白、肿瘤坏死因子和CD4。

9.根据权利要求3所述的方法，其中结合蛋白为单体或多聚体。

10.根据权利要求4所述的方法，其中结合蛋白为单体或多聚体。

11.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中目的蛋白是一种修饰蛋白，其增强与遗传载体的非共价键。

12.根据权利要求11所述的方法，其中目的蛋白的修饰方法有：(i)缺失一部分目的蛋白的氨基酸；(ii)将寡肽或多肽与(i)中的目的蛋白或其缺失形式融合，所述寡肽或多肽增强目的蛋白与遗传载体之间的非共价键；(iii)将目的蛋白进行定点诱变；或(iv)将目的蛋白进行随机诱变。

13.根据权利要求12所述的方法，其中缺失一部分目的蛋白的氨基酸的操作是使离子型氨基酸从目的蛋白的N-端序列中缺失。

14.根据权利要求12所述的方法，其中融合寡肽是阳离子型肽。

15.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中遗传载体具有修饰的表面蛋白，以增强与目的蛋白的非共价键。

16.根据权利要求15所述的方法，其中遗传载体的修饰方法有：(i)将寡肽或多肽与遗传载体表面蛋白融合，所述寡肽或多肽增强了目的蛋白与遗传载体之间的非共价键；(ii)使遗传载体表面蛋白进行定点诱变；或(iii)将遗传载体表面蛋白进行随机诱变。

17.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中内含孢子的宿主选自孢子形成革兰氏阴性菌、孢子形成革兰氏阳性菌、孢子形成放线菌(Actionmycete)、孢子形成酵母和孢子形成真菌。

18.根据权利要求17所述的方法，其中孢子形成革兰氏阳性细菌选自梭状芽孢杆菌(Clostridium)、类芽孢杆菌(Paenibacillus)和芽孢杆菌(Bacillus)。

19.根据权利要求18所述的方法，其中芽孢杆菌选自枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)和巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)。

20.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中病毒是噬菌体。

21.根据权利要求20所述的方法，其中噬菌体位于宿主细胞的周质，以及目的蛋白结合于噬菌体的表面。

22.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中宿主细胞为一种突变细胞，其消除了胞内蛋白酶或胞外蛋白酶的产生，所述蛋白酶参与降解表面展示的目的蛋白。

23.根据权利要求2所述的方法，其中筛选步骤的操作方式是将孢子文库用选自有机溶剂、热、酸、碱、氧化剂、干燥、表面活性剂和蛋白酶中的一种或多种进行处理，然后对在其表面上展示目的蛋白变体、具有处理抗性的孢子加以选择。

24.根据权利要求2所述的方法，其中遗传载体是孢子，以及筛选步骤的操作方式是将孢子文库用选自有机溶剂、热、酸、碱、氧化剂、干燥和表面活性剂中的一种或多种首先进行处理，接着用蛋白酶进行二次处理，然后对在其表面上展示目的蛋白变体、具有蛋白酶抗性的孢子加以选择。

25.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括对在其表面上展示目的蛋白的遗传载体进行筛选的步骤。

26.根据权利要求2、3或25所述的方法，其中筛选步骤的操作依靠：(i)展示在遗传载体表面上的目的蛋白的活性；(ii)能够识别标记目的蛋白的物质的蛋白；(iii)能够结合目的蛋白的标记配体；或(iv)能够与目的蛋白特异性结合的抗体。

27.根据权利要求26所述的方法，其中筛选采用能够结合于目的蛋白的标记配体或能够特异性结合于目的蛋白的抗体，由流式细胞仪来实施。

28.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其还包括使遗传载体表面和目的蛋白之间的键稳定的步骤，所述稳定步骤的操作途径是使用物理、化学或生化方法在遗传载体表面和目的蛋白之间形成共价键，接着通过非共价键在遗传载体表面上展示目的蛋白。

29.根据权利要求28所述的方法，其中形成共价键的化学法是戊二醛处理，物理法是紫外线处理，以及生化法是酶处理，以确保共价键的形成。

30.一种用于在遗传载体表面上展示目的蛋白的载体，其包括复制起点、抗生素抗性基因、限制性位点、编码目的蛋白的基因，其中当目的蛋白在宿主细胞中表达时，其能够与遗传载体表面形成非共价键。

31.根据权利要求30所述的载体，其中编码目的蛋白的基因是一种突变基因，以增强遗传载体表面和目的蛋白之间的非共价键。

32.根据权利要求31所述的载体，其中将编码目的蛋白的基因突变成(i)缺失一部分目的蛋白的氨基酸；(ii)将寡肽或多肽与(i)中的目的蛋白或其缺失形式融合，所述寡肽或多肽增强目的蛋白与遗传载体之间的非共价键；(iii)将目的蛋白进行定点诱变；或(iv)将目的蛋白进行随机诱变。

33.一种微生物转化子，其特征在于转化子的生产方法是用根据权利要求30-32中任一项所述的载体转化内含孢子或病毒的宿主细胞。

34.根据权利要求33所述的转化子，其中宿主细胞是一种突变细胞，以消除胞内蛋白酶或胞外蛋白酶的产生，所述蛋白酶参与降解表面展示的目的蛋白。

35.一种遗传载体和目的蛋白之间的复合体，其特征在于复合体的制备方法是根据权利要求1所述的方法在遗传载体表面上展示激素、激素类似物、酶、酶抑制剂、信号转导蛋白或其片段、抗体或其片段、单链抗体、结合蛋白或其片段、肽、抗原、粘着蛋白、结构蛋白、调节蛋白、毒素蛋白、细胞因子、转录调节蛋白、血液凝固蛋白或植物防卫-诱导蛋白。

36.根据权利要求35所述的复合体，其中目的蛋白是一种修饰蛋白，修饰方法有：(i)缺失一部分目的蛋白的氨基酸；(ii)将寡肽或多肽与(i)中的目的蛋白或其缺失形式融合，所述寡肽或多肽增强目的蛋白与遗传载体之间的非共价键；(iii)将目的蛋白进行定点诱变；或(iv)将目的蛋白进行随机诱变。

37.根据权利要求35所述的复合体，其中复合体具有其他共价键以使遗传载体表面和目的蛋白之间的键稳定，其中共价键的形成是采用物理、化学或生化方法，接着通过非共价键在遗传载体表面上展示目的蛋白。

38.根据权利要求35-37中任一项所述的复合体，其中遗传载体为孢子。

39.根据权利要求38所述的复合体，其中孢子是非再生孢子，其是通过选自遗传方法、化学方法和物理方法中的一种或多种获得的。

40.根据权利要求39所述的复合体，其中使孢子成为非再生性的遗传方法是通过缺失参与宿主细胞的孢子再生的基因来进行的。

41.根据权利要求38所述的复合体，其中孢子衍生自突变体，以通过选自遗传方法、化学方法或物理方法中的一种或多种来增加其凝集特性。

42.根据权利要求35所述的复合体，其中目的蛋白为单体或多聚体。

43.根据权利要求35-37中任一项所述的复合体，其中遗传载体是噬菌体。

44.一种在其表面上展示目的蛋白变体的遗传载体文库，其制备方法包含下列步骤：(a)通过突变编码目的蛋白的基因，构建目的蛋白的基因文库；(b)制备含有构建的基因文库的载体文库；(c)用载体文库转化内含选自孢子和病毒的遗传载体的宿主细胞；(d)培养转化的宿主细胞并在宿主细胞中表达目的蛋白的变体；(e)通过在表达的蛋白变体和遗传载体表面之间形成非共价键以使变体展示在遗传载体表面上，从而获取遗传载体文库；和(f)筛选在其表面上展示具有所需特性的目的蛋白变体的遗传载体。

45.根据权利要求44所述的遗传载体文库，其中遗传载体为孢子。

46.根据权利要求44所述的遗传载体文库，其中遗传载体为噬菌体，以及目的蛋白变体为结合蛋白或结合区的变体。

47.一种利用具有转化反应活性的蛋白进行生物转化的方法，其特征在于该方法采用根据权利要求35-37中任一项所述的遗传载体和目的蛋白之间的复合体。

48.根据权利要求47所述的方法，其中具有转化反应活性的蛋白为酶或抗体。

49.一种生产针对脊椎动物抗原的抗体的方法，其特征在于该方法包括给脊椎动物施用一种组合物，所述组合物含有免疫有效量的根据权利要求35-37中任一项所述的遗传载体和目的蛋白之间的复合体，以及从所述脊椎动物中分离所述抗体。

50.一种蛋白微阵列，其包括固相基底和固定到所述基底上的物质，其特征在于固定到基底上的物质选自根据权利要求35-37中任一项所述的遗传载体和目的蛋白之间的复合体以及根据权利要求44-46中任一项所述的遗传载体文库。