KR20020061218A - 유전자 담체 표면 전시방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 유전자 담체의 표면에 결합된 단백질의 제조방법, 이를 이용한 단백질의 개량방법, 특정 물질의 분리방법, 생물 전환방법 및 항체 생성방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 (a) 포자 및 바이러스로 구성된 그룹으로부터 선택되는 유전자 담체를 함유하는 숙주 세포를 목적단백질을 인코딩하는 유전자를 포함하는 벡터로 형질전환하는 단계; (b) 상기 형질전환된 숙주 세포를 배양하여 목적단백질을 숙주 세포내에 발현하는 단계; 및 (c) 상기 발현된 목적단백질이 상기 유전자 담체 표면과 비공유결합을 형성하여 유전자 담체 표면에 전시되도록 하는 단계를 포함하는 유전자 담체의 표면에 결합된 목적단백질의 제조방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 단백질의 표면 전시방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 포자 등의 표면에 단백질을 전시하는 방법, 이를 이용한 단백질의 개량방법, 특정 물질의 분리방법 및 생물 전환방법에 관한 것이다.
단일 유기체 표면에 원하는 펩타이드, 폴리펩타이드 등 단백질류를 표면에 부착하여 발현하는 표면 전시 기술은 발현된 단백질류의 성질에 따라, 또는 표면 전시될 숙주 단일 유기체의 성질에 따라 다양한 생물공학분야에 응용이 가능하다 (Georgiouet al., 1993, 1997; Fischettiet al., 1993; Schreuderet al., 1996). 이러한 표면 전시기술은 박테리오파아지, 박테리아, 효모 또는 포유동물 세포 등 여러 가지 단일세포 유기체를 숙주 세포로 이용하여 개발되었다.
표면 전시기술은 표면에 전시된 단백질의 유전자가 숙주 유기체내에 포함되어 있기 때문에 표면발현된 숙주 유기체를 표면발현된 단백질의 성질을 이용하여 선택적으로 선별할 수 있고, 선별된 숙주 유기체로부터 원하는 유전자를 쉽게 확보할 수 있으므로, 단백질의 분자적 진화를 위한 강력한 수단을 제공한다는 특징이 있다 (WO 9849286, 미합중국 특허 제 5837500호).
초고속 스크리닝
예를 들면 원하는 결합력을 갖는 항체가 표면발현된 파아지를 고정화된 항원과 결합시키고, 용출하여 파아지를 다시 증식시키면 타겟 항체를 코딩하는 유전자를 파아지로부터 확보할 수 있다 (미합중국 특허 제 5837500호). 이러한 팬닝법은 항체의 라이브러리를 대량으로 파아지에 표면 발현함으로써 타겟 항체를 선별하는 수단을 제공할 수 있고, 다음과 같은 단계를 포함하는 연속과정으로 이루어진다: (1) 라이브러리를 제조하는 단계; (2) 라이브러리의 표면발현 단계; (3) 고정화된 항원과 결합하는 단계; (4) 결합된 파아지를 용출하는 단계; 최종적으로 (5) 선별된 클론을 증식하는 단계.
상술한 파아지 표면 전시기술은 다량의 라이브러리(106-1012변이체)에서 가장 빠르게 원하는 단일 클론 변이체를 획득하는데 유리하여 항체의 초고속 스크리닝 분야에 응용되면서 매우 중요하게 되었다. 항체는 최근 치료, 진단, 그리고 기타 분석 작업에서 수요가 크게 증가되고 있는 중요한 생리활성 단백질이다. 이에, 새로운 물질에 대한 결합력을 갖거나 또는 생화학적 반응을 촉매할 수 있는 항체를 확보하는 것이 중요하게 되었고, 이를 위하여 전통적으로는 하이브리도마 기술을 이용하여 단일클론 항체를 생산하여 왔다. 그러나, 상기 방법은 비용적인 측면에서 고가이고, 시간도 많이 소요되며, 최종적으로 수득할 수 있는 항체의 양이 소량이라는 단점이 있다. 더욱이, 새로운 항체를 탐색하기 위해서는 1010이상의 항체 라이브러리로부터 찾아야 하기 때문에, 하이브리도마 기술은 새로운 결합력을 갖는 항체를 탐색하는 데는 부적합하다.
한편, 상술한 파아지 표면발현기술을 이용한 팬닝법 보다 더욱 간단하고 효과적인 방법을 제공하기 위하여, 박테리아나 효모의 표면에 라이브러리를 발현하고 유세포 분석기를 활용하여 신속하게 원하는 타겟 단백질이 표면발현된 세포를 순수 분리하는 기술도 개발되었다. 이 기술에 따르면, 형광물질로 표식된 항원을 표면발현된 세포와 접촉시켜 결합시키고 시간당 108개 이상의 세포를 분석할 수 있는 유세포 분석기를 사용하여 원하는 결합력을 갖는 항체를 순수 분리한다. 프란시스코 등은 이러한 유세포 분석기가 표면발현된 단일클론 항체가 105이상의 비로 농축될 수 있으며, 최종적으로 79% 이상의 세포가 원하는 세포임을 확인하여 미생물 표면발현기술의 유용성을 보였다 (Daughertyet al., 1998).
생백신
상술한 표면 전시기술은 항원 또는 그 일부분을 세포 표면에 전시하여 재조합 생백신의 전달 수단을 제공하게 된다. 현재까지의 백신은 약독화된 병원성 세균이나 바이러스를 주로 사용하였고, 특히 박테리아의 경우에는 항원을 세포내, 세포막 또는 세포외로 분비 발현하여 숙주 세포에 전달하였다. 한편, 표면 전시된 생백신은 매우 강력한 면역반응을 나타내고 숙주 세포 내에 증식하면서 지속적으로 항원을 발현할 수 있기 때문에, 새로운 백신 전달수단으로서 주목을 받고 있다. 특히 비병원성 대장균이나 살모넬라균의 표면에 병원성 유래의 항원 에피토프를 발현하여 살아있는 상태로 경구 투여할 경우에는 훨씬 지속적이고 강력한 면역반응을 나타내는 것으로 알려져 있다 (Georgiouet al., 1997; Lee et al., 2000).
전세포 생물전환
화학적 반응에 사용할 수 있는 효소가 표면에 전시된 전세포를 생물촉매로 사용하는 경우에는, 효소의 직접 발현, 분리 및 안정화 등의 과정이 필요 없다는 장점이 있다. 생물전환에 사용되는 효소를 세포내에 발현시키는 경우에는, 세포를 배양하고 회수한 다음, 톨루엔과 같은 화학물질을 사용하여 기질이 투과할 수 있도록 하는 과정이 필수적이다. 또한 지속적으로 사용할 경우 효소가 실활 되거나, 기질과 산물의 물질전달 문제점이 있어서 공정 전체의 생산성이 저하되는 문제점이 있다.
한편, 상술한 문제점들은 효소를 지속적으로 세포표면에 전시시킴으로써 제거할 수 있다 (Jung et al, 1998a: 1998b). 포스포디에스터라아제가 표면에 전시된 전세포를 이용하여, 독성이 매우 강한 유기인 계열의 파라티온(parathion)과 파라옥손(paraoxon)을 분해한 예는, 효소가 표면 전시된 세포가 환경정화공정에 이용될 수 있음을 보여준 전형적인 예이다 (Richins et al., 1997).
항펩타이드 항체
Martineau 등은 대장균의 표면 전시기술을 이용하여 항펩타이드 항체를 생산하는 매우 간단한 방법을 보고하였다 (Martineauet al., 1991). 이 문헌에 개시된 내용을 살펴보면, MalE와 세포외막 단백질인 LamB의 표면돌출부위에 원하는 펩타이드를 발현한 다음, 전세포 또는 분쇄된 세포를 동물에 투여하여 항펩타이드 항체의 생성을 유도하였고, 이러한 방법에 따르는 경우에는 화학적으로 펩타이드를 합성하거나 이를 전달 단백질에 부착하지 않고도 항체를 생산할 수 있게 된다.
전세포 흡착제
흡착 크로마토그라피에 사용되는 항체나 단백질을 적당한 담체에 고정화하기 위해서는, 발효를 통한 단백질의 생산, 순수한 상태로의 분리 및 정제 그리고 담체에로의 고정화 과정을 거쳐야 한다. 그러나, 대부분의 경우 이러한 바이오흡착제는 그 생산 공정이 단순치 않다.
한편, 흡착단백질을 미생물의 표면에 전시시켜, 세포전체를 일종의 흡착제로서 개발이 되었다. 가장 잘 공지된 전세포 흡착제는 포유류 항체의 Fc 도메인과 높은 친화성을 갖는 단백질 A가 표면에 자연적으로 발현된Staphylococcus aureus이다. 또한, 최근에는 미생물 표면 전시기술을 이용하여 메탈로티오네인(metallothionein), 또는 여러개의 히스티딘 잔기와 같은 금속 흡착단백질을 세포표면에 대량 발현 전시하여, 중금속의 제거 및 회수하는 새로운 방법이 발표되었다 (Sousa et al., 1996, 1998; Samuelson et al., 2000). 상기한 방법에 따르면, 종래의 금속 흡착미생물을 이용한 방법보다 훨씬 적극적이고 효과적인 방법으로 오염원으로부터 중금속을 제거 또는 회수할 수 있다.
상술한 바와 같이 어떤 유기체의 표면단백질을 이용하여 외래단백질을 세포 표면에 발현하여 부착 및 전시시키기 위해서는 적당한 표면단백질과 외래단백질을 유전자 수준에서 서로 연결하여 융합단백질이 생합성 되도록 하고, 이들이 안정하게 세포내막을 통과하여 세포표면에 부착되어 유지되도록 해야 한다. 이를 위해서는 다음과 같은 성질을 갖는 표면단백질을 선정하여 표면발현의 모체로 사용해야 할 것이다: 1) 세포내막을 통과할 수 있는 분비 시그날을 갖고, 2) 세포 표면에 안정되게 부착될 표적 시그날을 갖으며, 3) 세포 표면에 다량으로 발현되어 부착전시되면서, 4) 단백질의 크기에 관계없이 안정적으로 발현되어야 한다 (Georgiou et al., 1993).
한편, 상술한 종래의 표면 전시 방법에 따르면 표면 전시 모체는 유전자 담체에 따라 유전자 담체 표면에 존재하는 적당한 표면단백질을 선택하여 표면단백질의 N-말단이나 C-말단, 또는 단백질의 중앙에 삽입되도록 유전적인 조작이 필요하다. 표면에 발현전시된 모든 단백질이 표면 전시 모체와 연결된 융합단백질의 합성이 필수적이다. 따라서 야생형 단백질이 아닌 변형된 목적단백질이 표면에 부착전시되는 것이다.
현재까지 유전자 담체의 표면 단백질을 표면 전시모체로 사용하여 목적단백질을 표면 전시할 수 있는 표면 전시 시스템은 파아지의 표면 전시 시스템 (Chiswell and McCarferty, 1992), 박테리아 표면 전시 시스템 (Georgiou et al., 1993; Little et al., 1993; Georgiou et al., 1997), 그람음성 세균의 표면 전시시스템(Francisco et al., 1992; Fuchs et al., 1991; Klauser et al., 1990, 1992; Hedegaard et al., 1989), 그람양성 세균의 표면 전시 시스템(Samuelson et al., 1995; Palva et al., 1994; Sleytr and Sara, 1997), 효모의 표면 전시 시스템(Ferguson, 1988; Schreuder et al.,1996) 등이 공지되어 있다. 또한 미생물 포자 표면 코트단백질과 융합하여 목적단백질을 포자의 표면에 노출하여 전시하고자한 시도가 있었다. 상기 포자 표면 전시의 예로서, 미합중국 특허 제 5766914호는 바실러스 서브틸리스의 외피 코트단백질인 CotC 또는 내피 코트단백질인 CotD에 리포터 효소인 LacZ를 융합하여 실시한 효소의 분리 정제 방법을 개시하고 있다. 또한, 미합중국 특허 제 5837500호 및 미합중국 특허 제 5800821호도 CotC 또는 CotD가 표면 전시모체로 적합한 것으로 기재하고 있지만 실험적 증명을 보이지 못하였다.
또한, 그람음성 세균의 표면 전시시스템은 외래 폴리펩타이드를 삽입하면 구조적 제한을 가져와 안정한 막단백질을 형성하지 못하였고 (Charbit et al.,J. Immunol, 139:1644-1658(1987); Agterberg et al.,Gene, 88:37-45(1990)), 숙주 세포의 세포외막의 안정성과 생존력이 감소되었다. 표면전시 기술이 가장 많이 연구된 대장균 숙주의 경우 대부분이 세포외막 단백질을 표면발현 모체로 개발되었는데, 세포외막 단백질이 외래단백질과 융합하여 과발현되면 세포외막이 구조적으로 불안정하게 되고 결과적으로 숙주 세포의 생존력이 떨어지는 단점이 있다 (Georgiou et al., Protein Eng. 9:239-247 (1996)).
상술한 종래의 표면전시 시스템의 문제점은 목적단백질의 표면전시을 위해표면전시 모체와의 융합단백질을 만들어야 하는데 그 원인이 있다. 한편, 상기 융합단백질의 발현양이 적을 경우 전세포 생물전환, 단백질 어레이 및 항체생성 등과 같은 반응의 효율이 떨어지고, 과발현될 경우에는 상술한 바와 같은 문제점이 있다. 또한 표면전시 모체와 융합단백질을 통한 목적단백질의 표면발현은 목적단백질의 융합 파트너인 표면전시 모체가 세포, 포자 또는 파아지의 표면에 삽입되는 정도에 의존하기 때문에 표면에 전시되는 양에 한계가 있게 된다.
상술한 바와 같이, 종래의 표면전시 기술은 목적단백질이 표면전시 모체와 융합단백질을 구성한다는 것에 기초한다. 이에, 종래의 표면전시 시스템에 따르는 경우에는 (1) 표면전시 모체의 유전자 서열을 알아야 하고, (2) 표면전시 모체 유전자가 클로닝 되어야 하며, (3) 목적단백질의 3차 구조가 융합된 표면전시 모체에 의하여 영향을 받을 수도 있고, (4) 목적단백질이 멀티머를 이루어야 활성을 나타내는 경우에는 융합단백질이 독립적으로 표면전시되면 목적단백질이 활성을 상실하며, (5) 목적단백질의 표면전시는 표면전시 모체가 숙주 세포의 표면에 삽입되는 정도에 의존하기 때문에 표면전시 되는 양에 한계가 있고, (6) 단백질을 표면에 과량 전시하는 경우에는 숙주 세포의 표면에 구조적인 문제가 발생되어, 최종적으로는 숙주 세포의 생존력 또는 환경에 대한 내성이 크게 저하되는 문제점이 있다.
따라서, 상술한 종래의 표면전시 기술의 문제점을 해결하기 위해서는, (1) 표면전시 모체의 유전자 서열을 알지 못하여도 표면전시 시스템을 구축할 수 있거나, (2) 표면전시 모체 유전자가 클로닝되어 있지 않아도 표면전시 시스템을 구축할 수 있거나, (3) 목적단백질이 전시되어 고유의 구조를 이루고난 후 숙주 세포의 표면에 전시될 수 있거나, (4) 표면에 비선택적으로 결합함으로서 표면에 전시된 목적단백질의 양이 증가될 수 있거나, (5) 표면 전시된 목적단백질의 양이 증가해도 숙주의 생존력이나 환경에 대한 내성이 감소되지 않는 새로운 표면 전시 시스템이 요구된다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 특허문헌 및 논문이 참조되고 그 인용은 괄호내에 표시된다. 인용된 특허문헌 및 논문의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입됨으로써 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명자들은 상술한 종래의 표면전시 기술의 문제점을 해결하고자 예의 연구 노력한 결과, 표면전시 모체를 필요로 하지 않는 전혀 새로운 개념의 표면 전시 방법을 개발하고 본 방법에 따르는 경우에는 어떠한 단백질이라도 자신의 고유한 구조를 유지한 채 표면 전시될 수 있고, 과량으로 표면 전시된 경우에도 유전자 담체의 생존력 및 환경에 대한 내성이 변화되지 않음을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 유전자 담체 표면에 결합된 목적단백질의 제조방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 유전자 담체 표면 전시방법을 이용한 목적단백질의개량방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 유전자 담체 표면 전시방법을 이용한 혼합물내의 특정물질을 분리하는 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 유전자 담체 표면 전시방법을 이용한 생물 전환방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 유전자 담체 표면 전시방법을 이용한 척추동물에서 항원에 대한 항체의 생산방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 목적단백질의 유전자 담체 표면 전시용 벡터를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 유전자 담체 표면 전시용 형질전환체를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 유전자 담체-목적단백질의 복합체를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 목적단백질의 다양한 변이체가 표면 전시된 유전자 담체 라이브러리를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 유전자 담체 표면 전시방법을 이용하여 제조되는 단백질 어레이를 제공하는 데 있다.
도 1은 본 발명의 기본 원리를 설명하는 개념도;
도 2는 포자 표면 전시된 슈도모나스 플로레센스 리파제의 활성을 나타내는 그래프;
도 3은 숙주 세포에서 발현된 야생형 리파제의 포자 표면 전시 여부를 확인한 리파제 활성 검정 그래프;
도 4는 야생형 카복시메틸셀룰라아제의 포자 표면 전시 여부를 확인하기 위한 유세포 분석기를 통한 분석결과를 나타낸 그래프;
도 5는 본 발명의 포자 표면 전시용 pCry1p-CMCase-hp 벡터의 유전자 지도;
도 6은 변형된 분비신호를 갖는 카복시메틸셀룰라아제의 포자 표면 전시 여부를 확인하기 위한 유세포 분석기를 통한 분석결과를 나타낸 그래프;
도 7은 본 발명의 포자 표면 전시용 pCry1p-CMCase-his 벡터의 유전자 지도; 및
도 8은 양이온성 도메인과 융합된 카복시메틸셀룰라아제의 포자 표면 전시 여부를 확인하기 위한 유세포 분석기를 통한 분석결과를 나타낸 그래프.
본 명세서에서 처음으로 채택하고 있는 용어, "유전자 담체 (Geneticcarrier)"는 목적단백질을 표면에 전시하는 유기체를 의미하며, 다음과 같은 특징을 갖는 것을 의미한다: (1) 포자 및 바이러스로 구성된 그룹으로부터 선택되고; (2) 유전자 담체를 함유하고 있는 숙주 세포에서 발현된 목적단백질과 바람직한 해리상수를 갖고 비공유결합을 형성할 수 있는 능력이 있으며; (3) 필요한 경우에는 그 표면 특성이 변화되도록 유전적으로 변형이 가능하다.
더욱이, 본 명세서에서는 단백질의 표면 전시와 관련된 종래 문헌에 개시되어 있는 용어 "숙주 세포"와는 다른 의미로 숙주 세포를 기재하고 있다. 본 명세서에서의 용어 "숙주 세포"는 목적단백질을 발현하는 세포로서 다음과 같은 특징을 갖는 것을 의미한다: (1) 목적단백질을 인코딩하는 유전자에 의해 형질전환되고; (2) 유전자 담체가 포자 또는 바이러스인 경우에는 이러한 유전자 담체를 포함하고 있으면서 유전자 담체의 증식을 가능하게 하며; (3) 필요한 경우에는 유전적으로 변형이 가능하다.
상술한 바와 같이, 본 명세서에서는 목적단백질을 발현하는 숙주 세포와 목적단백질을 표면 전시하는 유전자 담체를 엄격하게 구별하고 있다.
본 발명은 (a) 포자 및 바이러스로 구성된 그룹으로부터 선택되는 유전자 담체를 함유하는 숙주 세포를 목적단백질을 인코딩하는 유전자를 포함하는 벡터로 형질전환하는 단계; (b) 상기 형질전환된 숙주 세포를 배양하여 목적단백질을 숙주 세포내에 발현하는 단계; 및 (c) 상기 발현된 목적단백질이 상기 유전자 담체 표면과 비공유결합을 형성하여 유전자 담체 표면에 전시되도록 하는 단계를 포함하는유전자 담체 표면에 결합된 목적단백질의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 다른 양태는 (a) 목적단백질을 인코딩하는 유전자를 돌연변이시켜 목적단백질 변이체를 인코딩하는 유전자 라이브러리를 구축하는 단계; (b) 상기 구축된 유전자 라이브러리를 포함하는 벡터 라이브러리를 제작하는 단계; (c) 유전자 담체로서의 포자 및 바이러스를 함유하는 숙주 세포를 상기 벡터 라이브러리로 형질전환하는 단계; (d) 상기 형질전환된 숙주 세포를 배양하여 목적단백질 변이체를 발현하는 단계; (e) 상기 발현된 목적단백질 변이체가 상기 유전자 담체 표면과 비공유결합을 통하여 유전자 담체 표면에 전시되도록 하여 유전자 담체 라이브러리를 얻는 단계; 및 (f) 상기 유전자 담체 라이브러리로부터 소망하는 특성을 갖는 목적단백질 변이체가 표면 전시된 유전자 담체를 스크리닝하는 단계를 포함하는 단백질의 개량방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태는 (a) 목적단백질로서의 결합단백질 또는 그 결합도메인을 인코딩하는 유전자를 돌연변이시켜 결합단백질 또는 그 결합도메인 변이체를 인코딩하는 유전자 라이브러리를 구축하는 단계; (b) 상기 구축된 유전자 라이브러리를 포함하는 벡터 라이브러리를 제작하는 단계; (c) 유전자 담체로서의 포자 및 바이러스를 함유하는 숙주 세포를 상기 벡터 라이브러리로 형질전환하는 단계; (d) 상기 형질전환된 숙주 세포를 배양하여 결합단백질 또는 그 결합도메인 변이체를 발현하는 단계; (e) 상기 발현된 결합단백질 또는 그 결합도메인 변이체가 상기유전자 담체 표면과 비공유결합을 통하여 유전자 담체 표면에 전시되도록 하여 유전자 담체 라이브러리를 얻는 단계; (f) 상기 유전자 담체 라이브러리를 예정 목적물질과 접촉하여 상기 예정 목적물질이 결합된 결합단백질 변이체 또는 그 결합도메인 변이체를 선택하여 실시되는 스크리닝 단계; 및 (g) 스크리닝된 개량된 결합단백질 또는 그의 결합도메인이 표면 전시된 유전자 담체를 혼합물과 접촉시켜 상기 결합단백질 또는 그의 결합도메인에 결합하는 혼합물내의 특정물질을 분리하는 단계를 포함하는 혼합물내의 특정물질을 분리하는 방법을 제공한다.
본 발명의 방법은 현재까지 구축된 표면 전시 방법과는 그 개념이 완전히 상이한 것으로서, 유전자 담체의 표면에 있는 성분, 특히 단백질과 목적단백질의 비공유결합에 기초한다. 본 발명의 기본적인 전략을 유전자 담체로서 포자를 이용한 경우를 예를 들어 설명하면 첨부한 도 1과 같다. 도 1을 참조하여 설명하면, 목적단백질을 인코딩하는 서열을 갖는 벡터로 숙주 세포를 형질전환하고, 이어 포자가 세포내에서 형성될 시기나 또는 그 이전에 목적단백질을 세포내 또는 세포외에 발현하여 최종적으로는 세포내에서 형성된 미생물 포자의 표면과 목적단백질이 자연스럽게 비공유결합 방법으로 결합 전시된다.
상술한 바와 같이, 본 발명의 가장 큰 특징은 종래의 단백질 표면 전시에 반드시 필요로 하였던 표면 전시 모체가 사용되고 있지 않는 점이다. 본 발명의 방법은 표면 전시를 위해 사용되는 표면 전시 모체가 필요하지 않기 때문에, 세포막 통과가 어려운 단백질도 숙주 세포내에서 생합성되면 자연스럽게 유전자 담체의 표면에 결합되어 표면에 노출 전시되며, 숙주 세포가 분해되어 유전자 담체가 숙주 세포로부터 노출되면 목적단백질이 표면에 부착 전시된 유전자 담체를 회수할 수 있고, 결국 최종적으로 형성된 목적단백질-유전자 담체의 복합체는 다양한 용도로 사용할 수 있게 된다.
상술한 본 발명의 방법에 있어서, 유전자 담체로서 이용될 수 있는 것은 포자 또는 바이러스이다. 상기 유전자 담체 중에서 포자가 가장 바람직하고, 이는 포자의 다음과 같은 특성 때문이다 (Driks, 1999): (1) 열에 대한 매우 안정하고; (2) 방사선에 대해 비교적 안정하며; (3) 독성에 대해 안정하고; (4) 산, 염기에 대해 매우 안정하며; (5) 리소자임에 안정하고; (6) 건조에 내성을 갖고 있으며; (7) 유기용매에 대해 안정하고; (8) 대사적 활성이 없고; 그리고 (9) 쉽게 수 시간 안에 포자를 형성할 수 있다.
본 발명의 방법에 있어서, 유전자 담체가 바이러스인 경우에는 특히, 박테리오파아지를 이용하는 것이 바람직하고, 원핵 숙주 세포에서 발현된 목적단백질은 박테리오파아지의 코트 단백질에 비공유결합되어 표면 전시된다. 또한, 박테리오파아지가 숙주 세포의 페리플라즘 (periplasm)에 위치해 있는 경우에는 목적단백질에 시그널 펩타이트를 융합시켜 페리플라즘으로 분비되도록 함으로써 표면 전시를 가능하게 한다. 한편, 파아지 코트단백질과 자연상태에서 결합할 수 없는 목적단백질은 파아지 코트단백질과 결합할 수 있는 모티브와 융합되면 파아지 표면 전시가 가능하다.
본 발명의 바람직한 구현 예에 따르면, 상기 유전자 담체는 목적단백질과의 비공유결합을 증가시키기 위하여 그 표면단백질이 변형된 것이다. 상기 유전자 담체를 변형시키는 방법은 (ⅰ) 유전자 담체와 목적 단백질과의 비공유결합을 도와주는 다른 올리고펩타이드 또는 폴리펩타이드를 유전자 담체의 표면 단백질과 융합시키는 방법; (ⅱ) 유전자 담체 표면 단백질을 위치 특이적으로 돌연변이시키는 방법; (ⅲ) 유전자 담체 표면 단백질을 무작위 돌연변이시키는 방법 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 방법에 있어서, 목적단백질은 어떠한 단백질 또는 펩타이드도 포함하고, 예를 들어 호르몬, 호르몬 유사체, 효소, 효소저해제, 신호전달단백질 또는 그 일부분, 항체 또는 그 일부분, 단쇄항체, 결합단백질 또는 그 결합도메인, 펩타이드, 항원, 부착단백질, 구조단백질, 조절단백질, 독소단백질, 사이토카인, 전사조절 인자, 혈액 응고 인자, 식물 생체방어 유도 단백질 등을 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다.
한편, 본 발명의 방법에 있어서 이용되는 결합단백질 또는 그의 결합도메인은 예정의 특정물질과 결합할 수 있는 어떠한 단백질 또는 그의 도메인을 포함하며, 예를 들어 특정 항원성 물질을 분리하고자 하는 경우에는 항체 또는 항체도메인이 이용될 수 있다. 또한, 결합 단백질 또는 그의 결합도메인은 단백질 분해효소 저해제, 크람빈, 엔테로톡신, 코노톡신, 아파민, 라이소자임, 리보뉴클리아제,차립도톡신, 시스타틴, 에글린, 오보뮤코이드, 아주린, 종양괴사인자, CD4 등을 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 방법을 따르는 경우에는, 모노머 및 멀티머 (호모 멀티머 및 헤테로 멀티머 포함) 모두 표면 전시될 수 있다. 특히, 멀티머의 경우에는 이를 구성하는 모노머가 모두 결합하여야만 완전한 활성을 나타내는 경우가 일반적인데, 종래의 표면 전시방법으로는 모노머들이 서로 독립적으로 표면 전시되므로 활성을 나타내는 목적단백질을 얻기가 어렵다. 그러나, 본 발명의 방법에 따르는 경우에는 멀티머성 단백질이 완전한 구조를 형성하면서 유전자 담체의 표면에 전시될 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 표면 전시되는 목적단백질은 유전자 담체와의 비공유결합을 개선하기 위하여 변형된다. 목적단백질을 개선할 수 있는 방법은 (ⅰ) 목적단백질의 아미노산 서열 일부를 제거하는 방법; (ⅱ) 목적단백질 또는 상기 (ⅰ)의 방법에 의해 아미노산 서열의 일부가 제거된 목적단백질과 유전자 담체 표면단백질과의 비공유결합을 돕는 다른 올리고펩타이드 또는 폴리펩타이드와 융합시키는 방법; (ⅲ) 목적단백질을 위치 특이적으로 돌연변이시키는 방법; (ⅳ) 목적단백질을 무작위 돌연변이시키는 방법 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 한편, 상기 목적단백질의 아미노산 서열 일부를 제거하는 방법은 예컨대 목적단백질의 N-말단 예컨대 시그널 펩타이드 중 이온성 아미노산 서열을 제거하여 실시될 수 있고, 이렇게 변형된 목적단백질은 유전자 담체와의 소수성 상호작용이 강화되어 보다 낮은 해리상수를 갖으면서 표면 전시될 수 있다. 또한, 포자의 표면은 음이온을 띠는 것으로 알려져 있는 바, 양이온성 올리고펩타이드를 목적단백질에 융합하는 것이 목적단백질의 표면 전시를 위해 바람직하다.
본 발명의 방법에 있어서, 형질전환에 이용되는 목적 단백질을 인코딩하는 유전자는 하나이거나 두 번 이상 반복된 것, 또는 두 번 이상 반복된 목적 단백질 유전자가 동일한 것이거나 서로 다른 것 등이 가능하고 상기한 어떠한 조합의 경우도 이용될 수 있다. 또한, 본 발명의 방법에서 형질전환에 이용되는 유전자는 숙주 세포 내에서 플라스미드내에 독립적으로 또는 숙주의 염색체에 끼여 들어가 존재할 수 있다.
목적단백질의 발현은 숙주 세포에서 발현이 유도될 수 있는 프로모터에 의해 발현되거나 또는 목적단백질 유전자의 프로모터에 의해 발현되거나 또는 숙주 박테리아에서 발현 가능한 적절한 다른 프로모터에 의해 발현될 수 있음은 당업자에게 자명한 것이다.
본 발명에 있어서, 목적단백질과 유전자 담체 사이의 상호작용은 원칙적으로는 비공유결합, 보다 상세하게는 소수성결합, 이온결합, 수소결합 및 반데르발스결합 중 하나의 결합 또는 이들의 복합적인 결합을 통해 이루어진다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 포자를 포함하는 숙주 세포는 믹소코커스를 포함하는 포자형성 그람음성균; 클로스트리디움 속, 페니바실러스 속,바실러스 속을 포함하는 포자형성 그람양성균; 포자형성 방선균; 사카로마이세스 세레비시애, 칸디다 (Candida) 속과 한세눌라 속을 포함하는 포자형성 효모, 포자형성 곰팡이 등으로부터 유래된 것이나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 바람직하게는, 숙주 세포는 포자형성 그람 양성균에서 유래된 것이고, 가장 바람직하게는 바실러스 츄린겐시스, 바실러스 메가테리움, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 폴리믹사 등을 포함하는 바실러스 속 미생물로부터 유래된 것이다. 특히, 바실러스 서브틸리스는 유전학적 지식 및 실험방법이 잘 알려져 있고, 배양방법이 잘 알려져 있기 때문에 본 발명에 유리하다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 숙주 세포는 표면 전시를 위해 발현된 목적단백질의 분해와 관련된 세포내 단백질 분해효소 또는 세포외 단백질 분해효소를 생산하지 못하도록 변형된 것이다.
본 발명의 방법은 목적단백질과 유전자 담체와의 비공유결합을 통한 표면 전시를 기본으로 하나, 보다 안정된 결합을 원하는 경우에는, 비공유결합을 통해 목적단백질을 유전자 담체 표면에 전시를 한 다음, 물리적 방법, 화학적 방법 및 생화학적 방법으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 1종 이상의 방법에 의해 목적단백질과 유전자 담체 사이의 결합 또는 목적단백질 사이의 결합을 공유결합으로 변화시킬 수 있다. 상기 공유결합을 형성시키기 위하여 처리하는 방법 중 화학적 방법은 글루타르알데히드의 처리 (DeSantis G. and Jones J. B. Curr. Opin. Biotechnol. 10: 324-330(1999))가 바람직하고, 물리적 방법은 자외선의 처리(Graham L., and Gallop P.M. Anal. Biochem. 217: 298-305(1994))가 바람직하며, 그리고 생화학적 방법은 공유결합의 형성을 도와주는 효소의 처리 (Gao Y., and Mehta K., J. Biochem. 129: 179-183(2001))가 바람직하다.
본 발명의 유전자 담체 표면에 결합된 목적단백질의 제조방법은 바람직하게는 목적단백질이 표면 전시된 유전자 담체를 스크리닝하는 단계를 추가적으로 포함한다.
본 발명의 단백질 개량방법에 있어서, 유전자 라이브러리를 구축하는 단계는 DNA 셔플링법 (Stemmer,Nature, 370: 389-391(1994)), StEP법 (Zhao, H., et al.,Nat. Biotechnol., 16: 258-261 (1998)), RPR법 (Shao, Z., et al.,Nucleic acids Res., 26: 681-683 (1998)), 분자육종법 (Ness, J. E., et al.,Nat. Biotechnol., 17: 893-896 (1999)), ITCHY법 (Lutz S. and Benkovic S.,Current Opinion in Biotechnology, 11: 319-324 (2000)), 에러 유발 (error prone) PCR (Cadwell, R. C. and Joyce, G. F.,PCR Methods Appl., 2: 28-33 (1992)), 포인트 돌연변이법 (Sambrook et al.,Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, N. Y., 1989)을 이용하여 야생형 목적단백질의 유전자를 변이시킴으로써 얻을 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 바람직한 단백질 개량방법의 일 구현예에 따르면, 유전자 담체는 포자이고, 상기 스크리닝 단계는 포자 라이브러리를 유기용매, 열, 산, 염기, 산화제, 건조, 계면활성제 및 단백질분해효소로 구성된 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 방법으로 처리한 후 상기 처리에 대하여 내성을 갖는 목적단백질 변이체가 표면 전시된 포자를 선택하여 실시된다.
본 발명의 바람직한 단백질 개량방법의 다른 구현예에 따르면, 스크리닝 단계는 포자 라이브러리를 유기용매, 열, 산, 염기, 산화제, 건조 및 계면활성제로 구성된 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 방법으로 1차 처리하고, 단백질 분해효소로 2차 처리한 후 단백질 분해효소에 대하여 내성을 갖는 목적단백질 변이체가 표면 전시된 포자를 선택하여 실시된다.
본 발명의 유전자 담체 표면에 결합된 목적단백질의 제조방법 및 단백질 개량방법에 있어서, 채택되는 상기 스크리닝 단계는 (ⅰ) 유전자 담체 표면에 전시된 목적단백질의 활성; (ⅱ) 목적단백질에 표식된 물질을 인식하는 단백질; (ⅲ) 목적단백질에 결합하는 표식된 리간드; (ⅳ) 목적단백질에 특이적으로 결합하는 항체 등을 이용하여 실시할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 목적단백질에 결합하는 표식된 리간드 또는 목적단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 실시되는 스크리닝 단계는 유세포 분석기를 이용하여 실시하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 포자 표면 전시된 단백질에 일차항체를 부착시키고, 형광을 나타내는 화합물로 표식된 이차항체를 반응시켜 포자를 염색한 다음, 형광현미경으로 관찰하거가 유세포 분석기로 분석할 수 있다. 물론, 이차항체가 금으로 표식된 경우는 전자현미경으로 관찰할 수 있다. 목적단백질의 활성을 이용하여 스크리닝하는 경우에는 단백질에 의해 촉매되는 발색 반응을 측정하여 스크리닝할 수 있다.
본 발명의 유전자 담체 표면에 결합된 목적단백질의 제조방법 및 단백질 개량방법에 있어서, 바람직하게는 스크리닝된 유전자 담체를 증식시켜 소망하는 특성을 갖는 목적단백질 변이체 또는 상기 목적단백질 변이체를 인코딩하는 유전자를 회수하는 단계를 추가로 포함한다.
유전자 담체로서 포자를 이용하는 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 포자의 회수는 숙주 세포의 배양시간을 조절하여 목적 단백질이 포자 표면에 최적으로 전시되는 시점에 배양을 정지시켜 회수하여 실시된다. 적합한 배양 시간은 사용되는 균주의 종류에 따라 결정되고, 바실러스 서브틸리스를 숙주로 이용하는 경우에는 16-25시간을 배양하는 것이 바람직하다. 포자의 회수는 통상적인 방법에 의해 실시될 수 있으나, 보다 바람직하게는 레노그라핀 밀도구배 (renografin gradients) 방법 (C. R. Harwood,et al., "Molecular Biological Methods for Bacillus." John Wiley & Sons, New York, p.416(1990))을 이용한다.
상술한 본 발명의 단백질 개량방법을 이용하는 경우에는, 종래의 방법으로는 용이하게 얻을 수 없는, (1) 생물학적으로 발생하지 않는 화학반응을 촉매하는 효소 (예: Diels-Alder 축합반응), (2) 비자연적인 입체 선택성 또는 레지오선택성 (regioselectivity) 활성을 갖는 효소, (3) 유기용매 또는 유기용매-수용액 이상의 용액에서 반응을 촉매할 수 있는 효소, 그리고 (4) 고온 고압과 같은 극한 조건에서 반응을 촉매하는 효소 등을 야생형 효소로부터 신속하게 얻을 수 있다. 또한, 결합력이 증가한 항체의 변이체을 선별할 때 통상적으로 pH의 급격한 변화나 염기농도를 조절하여 용출하게 되는 데, 이러한 경우 파아지나 박테리아를 배양 배지에 재접종을 하면 생존율이 떨어지는 문제점이 발생한다. 본 발명의 단백질 개량방법을 이러한 문제점을 해결할 수 있다.
본 발명의 다른 양태는 복제원점; 항생제 내성 유전자; 제한효소 자리; 및 목적단백질을 인코딩하는 유전자를 포함하는 목적단백질의 유전자 담체 표면 전시용 벡터에 있어서, 상기 목적단백질을 인코딩하는 유전자는 숙주 세포내에서 발현되는 경우 포자 및 바이러스로 구성된 그룹으로부터 선택되는 유전자 담체의 표면과 비공유결합할 수 있는 단백질을 인코딩하는 유전자인 것을 특징으로 하는 목적단백질의 유전자 담체 표면 전시용 벡터를 제공한다.
본 발명의 바람직한 벡터에 따르는 경우에는 상기 목적단백질을 인코딩하는 유전자는 그에 의해 발현되는 목적단백질이 유전자 담체와 비공유결합을 하는 것을 개선하기 위하여 변형된 것이다. 상기 변형된 목적단백질을 인코딩하는 유전자는 (ⅰ) 목적단백질의 아미노산 서열 일부를 제거하는 방법; (ⅱ) 목적단백질 또는 상기 (ⅰ)의 방법에 의해 아미노산 서열의 일부가 제거된 목적단백질과 유전자 담체 표면단백질과의 비공유결합을 도와주는 다른 올리고펩타이드 또는 폴리펩타이드와 융합시키는 방법; (ⅲ) 목적단백질을 위치 특이적으로 돌연변이시키는 방법; (ⅳ) 목적단백질을 무작위 돌연변이시키는 방법 등으로 변형된 것이나, 이에 한정되는것은 아니다.
본 발명의 다른 양태는 포자를 함유한 미생물 및 바이러스를 함유한 세포로 구성된 그룹으로부터 선택된 숙주 세포를 본 발명의 벡터로 형질전환하여 제조되는 형질전환 미생물을 제공한다. 본 발명의 바람직한 구현예에서 상기 숙주 세포는 상기 목적단백질을 인코딩하는 유전자로부터 발현된 목적단백질의 분해와 관련된 세포내 단백질 분해효소 또는 세포외 단백질 분해효소를 생산하지 못하도록 변형된 것이다.
본 발명의 다른 양태는 호르몬, 호르몬 유사체, 효소, 효소저해제, 신호전달단백질 또는 그 일부분, 항체 또는 그 일부분, 단쇄항체, 결합단백질, 결합도메인, 펩타이드, 항원, 부착단백질, 구조단백질, 조절단백질, 독소단백질, 사이토카인, 전사조절 인자, 혈액 응고 인자 및 식물 생체방어 유도 단백질로 구성된 그룹으로부터 선택되는 목적단백질이 포자, 바이러스 및 세포로 구성된 그룹으로부터 선택되는 유전자 담체의 표면에 상술한 본 발명의 표면 전시 방법에 의해 비공유결합을 통해 전시되어 있는 유전자 담체-목적단백질의 복합체를 제공한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 목적단백질은 유전자 담체와의 결합을 개선하기 위하여 (ⅰ) 목적단백질의 아미노산 서열 일부를 제거하는 방법; (ⅱ) 목적단백질 또는 상기 (ⅰ)의 방법에 의해 아미노산 서열의 일부가 제거된 목적단백질과 유전자 담체 표면단백질과의 비공유결합을 도와주는 다른 올리고펩타이드 또는 폴리펩타이드와 융합시키는 방법; (ⅲ) 목적단백질을 위치 특이적으로 돌연변이시키는 방법; (ⅳ) 목적단백질을 무작위 돌연변이시키는 방법 등으로 변형될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 상기 유전자 담체-목적단백질 복합체는 그 결합력을 개선하기 위하여, 목적단백질을 유전자 담체 표면에 비공유결합을 통해 전시한 다음, 물리적 방법, 화학적 방법 및 생화학적 방법으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 1종 이상의 방법으로 목적단백질과 유전자 담체 사이의 결합 또는 목적단백질 사이의 결합이 공유결합으로 변화시킬 수 있다.
본 발명의 유전자 담체-목적 단백질 복합체에 있어서, 상기 유전자 담체는 바람직하게는 포자이다. 유전자 담체로서 포자를 이용하는 경우, 바람직하게는 유전학적 방법 (Popham D. L., et al.,J. Bacteriol., 181: 6205-6209 (1999)), 화학적 방법 (Setlow T. R., et al.,J. Appl. Microbiol., 89: 330-338 (2000)) 및 물리적 방법 (Munakata N, et al.,Photochem. Photobiol., 54: 761-768 (1991))으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 방법에 의해 생식이 불가능하도록 변형시킨 포자이다. 이와 같은 이유는 본 발명과 같이 포자를 목적단백질의 단순한 전시 수단으로 사용할 경우에는 포자를 재생할 필요가 없기 때문이다. 특히 유전적으로 조작된 유기체로 취급되는 경우에는 사용규제를 받을 수 있으므로 재생이 불가능한 변이주를 사용하는 것이 적합하다. 상기 포자 생식을 불가능하게 하는 유전학적인 방법은 숙주 세포의 포자 생식에 관여하는 유전자의 결핍을 통해 실시될 수 있다. 예컨대, 바실러스 서브틸리스에 있어서는cwlD유전자가 결핍된 재생 불가능한 변이주가 본 발명에 사용될 수 있다. 또한, 바람직하게는 상기 포자는 물리적 방법 (Wienc K. M., et al.,Appl. Environ. Microbiol., 56: 2600-2605 (1990)), 화학적 방법 및 유전학적 방법으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 방법에 의해 응집성이 증가되도록 변형시킬 수 있다. 응집성을 증가시키는 이유는 산업적 스케일에서의 생물전환 반응시 반응 산물과 포자가 쉽게 분리되기 때문이다.
본 발명의 바람직한 유전자 담체-목적 단백질 복합체에 있어서, 상기 유전자 담체는 박테리오파아지이다.
본 발명의 다른 양태는 (a) 목적단백질을 인코딩하는 유전자를 돌연변이시켜 목적단백질 변이체를 인코딩하는 유전자 라이브러리를 구축하는 단계; (b) 상기 구축된 유전자 라이브러리를 포함하는 벡터 라이브러리를 제작하는 단계; (c) 유전자 담체로서의 포자 및 바이러스를 함유하는 숙주 세포를 상기 벡터 라이브러리로 형질전환하는 단계; (d) 상기 형질전환된 숙주 세포를 배양하여 목적단백질 변이체를 발현하는 단계; (e) 상기 발현된 목적단백질 변이체가 상기 유전자 담체 표면과 비공유결합을 통하여 유전자 담체 표면에 전시되도록 하여 유전자 담체 라이브러리를 얻는 단계; 및 (f) 상기 유전자 담체 라이브러리로부터 소망하는 특성을 갖는 목적단백질 변이체가 표면 전시된 유전자 담체를 스크리닝하는 단계를 포함하는 과정에 의해 제조된 목적단백질 변이체가 표면 전시된 유전자 담체 라이브러리를 제공한다.
본 발명의 유전자 담체 라이브러리에 있어서, 유전자 담체는 바람직하게는 포자 또는 박테리오파아지이다.
본 발명의 다른 양태는 전환 활성을 갖는 단백질이 유전자 담체 표면에 전시되어 있는 상술한 본 발명의 유전자 담체-목적단백질의 복합체를 이용하여 실시되는 것을 특징으로 하는 전환 활성을 갖는 단백질을 이용한 생물전환 방법을 제공한다. 상기 전환 활성을 갖는 단백질은 효소 또는 촉매 항체 등 화학반응을 촉매할 수 있는 어떠한 단백질도 이용할 수 있다.
한편, 표면 전시된 효소를 생물전환 공정에 사용할 때에는 고온 및/또는 유기용매 내에서 반응이 이루어지므로, 표면 전시 유전자 담체가 극한 조건에서 물리화학적으로 안정하여야 한다. 특히 최근 산업적으로 중요한 화학합성 반응은 주로 유기용매내에서의 반응이 많고, 특히 키랄화합물을 합성하거나 라세믹 혼합물로부터의 분해도 매우 혹독한 물리화학적 환경에서 수행하여야 한다. 따라서 표면 전시된 효소가 이러한 극한 조건에서 안정해야 하고 이를 표면에 전시하고 있는 유기체도 안정해야 한다. 이러한 측면에서 효소 등을 표면 전시하는 포자 또는 바이러스를 이용하는 본 발명의 생물전환 방법은 특히 유리하다.
한편, 표면 전시된 촉매에 의한 화학반응공정이 제안되기는 하였으나 (Georgiou et al., 1993), 표면 전시된 촉매를 이용할 경우 표면 전시된 숙주 세포가 반응공정 동안 안정되지 못하여 가교 결합 화학물질을 이용하여 세포표면을 고정할 필요가 있었다 (Freeman et al., 1996). 본 발명의 생물전환 방법은 상기한문제점를 해결한다. 본 발명의 방법은 포자 또는 바이러스 표면에 전시된 촉매를 이용하므로, 표면 전시된 촉매 뿐 아니라 포자 자체가 안정하여 특별히 고정화할 필요가 없다.
본 발명의 생물 전환방법에 이용되는 효소는 베타갈락토시다아제, 리파아제, 프로테아제, 셀룰라제, 당전이효소, 산화환원효소 및 알돌라아제 등 유전자 담체에 표면 전시되는 어떠한 효소도 이용할 수 있으며, 생물전환 반응이 단일 단계 또는 다단계인 경우에도 적용되며, 생물전환 반응이 수용액상 또는 비수용액상에서 일어나는 경우에도 적용되고, 유전자 담체는 고정 또는 비고정화된 상태에서 이용될 수 있으며, 생물전환이 다른 미생물 또는 효소와 혼합하여 사용할 수 있다.
본 발명의 다른 양태는 항원성 목적단백질을 갖는 상술한 본 발명의 유전자 담체-목적단백질 복합체를 척추동물에 투여하는 단계를 포함하는 척추동물에서 특정 항원에 대한 항체의 생성방법을 제공한다. 본 발명의 항체 생성방법에 이용되는 유전자 담체-목적단백질 복합체의 면역학적 유효량을 포함하는 조성물은 바람직하게는 불완전 프로이드 아쥬방 및 완전 프로이드 아쥬방과 같은 아쥬방을 포함한다. 한편, 투여는 구강투여, 정맥내 투여, 복강내 투여, 피하 투여, 근육내 투여등으로 실시될 수 있다. 한편, 충분한 양의 항체를 수득하기 위해서는 투여는 1차 투여후 적합한 시기내에 부스터 투여를 하는 것이 바람직하다.
단백질 어레이는 DNA 어레이와 같이 다양한 단백질, 특히 항체들을 고체 표면에 어레이하여 특정 세포에서의 원하는 타겟 단백질의 발현여부, 발현정도 등을 분석할 수 있는 수단을 제공한다. 단백질 어레이를 제조하기 위해서는 어레이할 단백질을 확보하고, 고체 표면에 단백질을 고정화해야 한다. 단백질 어레이를 이용한 분석 과정에서는 고정화된 단백질과 결합시키고 결합하지 않는 단백질들을 세척시키기 위하여, 고온, 염농도 및 pH의 변화 등 다양한 처리가 이루어지고, 이에 이러한 악환경에서 견딜 수 있는 안정화된 단백질의 고정화가 필요하다. 또한, 수천개-수만개의 단백질 유전자를 발현벡터에 클로닝하고, 발현하여 분리한 다음 이를 고체 표면에 고정화하는 것은 매우 많은 작업이 반복적으로 이루어져야 하는 것이다. 따라서, 상기 작업을 보다 단순하고 신속하게 할 필요가 있다.
본 발명의 단백질 어레이는 상기한 종래의 단백질 어레이의 제조방법을 보다 용이하게 한 것으로서, 상술한 본 발명의 유전자 담체-목적단백질 복합체 또는 상술한 본 발명의 유전자 담체 라이브러리가 고체 기판에 부착되어 있는 단백질 어레이를 제공한다. 본 발명의 단백질 어레이는 소망하는 단백질이 표면에 전시된 유전자 담체를 고체 기판에 고정화하여 제조된다. 본 발명의 단백질 어레이의 제조 과정에는 통상적으로 당업계에 이용되는 단백질 어레이의 제조과정이 적용될 수 있다 (참조: WO 0061806, WO 0054046, US 5807754, EP 0818467, WO 9742507, US 5114674 및 WO 9635953). 본 발명의 방법에 의해 제조된 단백질 어레이는 진단용 키트, 유전자 발현분석, 단백질간 또는 단백질과 리간드간 의 상호반응 분석, 대사과정 분석, 신규 효소 탐색 또는 개량된 효소의 탐색, 조합 생화학합성 및 바이오센서 등에 이용될 수 있다.
본 발명에서 이용될 수 있는 고체 기판은 유리 (예: 작용기가 노출된 유리), Si, Ge, GaAs, GaP, SiO, SiN4, 변형된 실리콘 니트로셀룰로오스, 폴리비닐리덴 플루오리드, 폴리스틸렌, 폴리테트라플루오로에틸렌, 폴리카보네이트, 나일론, 섬유 또는 이의 조합이다. 상기한 기판에는 단백질의 고정화를 위하여 링커 분자가 부착되기도 하고, 스팟팅이 되지 않은 나머지 부분은 블록킹되는 것이 바람직하다. 한편, 각각의 스팟 (또는 어드레스)에 적용되는 본 발명의 유전자 담체의 양은 어레이 형태에 따라 결정된다. 고체 기판에 고정화된 표면 전시된 단백질과 시료의 상호작용은 단백질의 고유 특성 (예: 면역반응성)을 이용하여 검출할 수도 있고, 또는 표면 전시된 단백질에 적합한 표식 물질 (예: 형광물질, 발광물질, 방사능 물질, 에피토프)을 결합시켜 표식 물질의 신호 변화를 검출할 수도 있다. 본 발명의 단백질 어레이에 의한 최종적인 결과의 분석은 당업계에서 "리더" 또는 "스캔너"로 공지되어 있는 자동화된 장치를 이용하여 실시할 수 있다.
본 명세서의 전체적인 기재 사항으로부터 파악할 수 있듯이, 다수의 본 발명에 있어서 채택하고 있는 기본적인 유전자 담체 전시방법은 (1) 표면발현 모체의 필요성을 제거하고, (2) 목적단백질이 발현되어 고유의 구조를 이루고난 후 유전자 담체의 표면에 전시되도록 하여 완전한 활성을 갖도록 하며, (3) 비공유결합, 즉 비선택적으로 목적단백질을 결합시켜 표면에 전시하므로 전시되는 목적단백질의 양을 증가시키고, (4) 표면 전시된 목적단백질의 양이 증가해도 유전자 담체의 생존력이나 환경에 대한 내성을 감소시키지 않는 각별한 장점이 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 순수 분리된 리파아제의 포자 표면 전시의 가능성 확인
바실러스 포자를 구성하고 있는 코트단백질 또는 구조단백질 (morphogen) 이외에 세포 내에서 발현되는 단백질이 포자의 표면에 결합하여 전시될 수 있다는 사실은 아직까지 보고되지 않았다. 본 발명자들은 바실러스 포자의 표면이 소수성을 띠고 있으므로(Wiencek, K.M. et al.,Appl. Environ. Microbiol., 56:2600-2605(1990)) 리파아제와 같이 소수성 도메인을 갖는 단백질은 (Brockerhoff H.,Chem. Phys. Lipids, 10:215(1973)) 포자 표면에 소수성 결합으로 표면 전시가 가능할 것이라는 가설을 정립하였다. 상기 가설을 입증하기 위하여 정제된 슈도모나스 플로레센스의 리파아제를 순수 분리된 바실러스 서브틸리스 포자와 결합시킨 후 효소활성을 측정하였다.
먼저 바실러스 서브틸리스 DB104 (Kawamura F. and Doi R. H.,J. Bacteriol., 160:442-444(1984))를 GYS 배지 ((NH4)2SO42 g/ℓ, 효모엑기스분말 2 g/ℓ, K2HPO40.5 g/ℓ, 포도당 1 g/ℓ, MgSO4·H2O 0.41 g/ℓ, CaCl2·2H2O 0.08 g/ℓ, MnSO4·5H2O 0.07 g/ℓ)에서 약 24시간 동안 진탕배양 (37℃, 250 rpm)하였고, 그런 다음 레노그라핀 밀도구배 방법 (C. R. Harwood,et al., "Molecular Biological Methods for Bacillus." John Wiley & Sons, New York, p.416(1990))으로 순수 포자만을 분리하였다. 분리된 포자는 현미경 (니콘사, ALPHAPHOT-2, x1000)으로 관찰하여 포자만 순수하게 분리되었음을 확인하였다.
상기 분리된 바실러스 포자 2 ㎎과 부분 정제된 슈도모나스 플로레센스의 리파아제 (Ahn, J.H. et al.,J. Bacteriol., 181:1847-1852(1999)) 94 ㎍를 50 mM Tris (pH 8.0) 완충용액 200 ℓ에 넣고 혼합한 다음, 4℃에서 12 시간 정치시킨 후 원심분리하여 포자와 용액을 분리하였다. 이어, 분리한 포자를 50 mM Tris (pH 8.0) 완충용액 0.5 ㎖로 3회 세척한 후 리파아제가 흡착된 포자를 회수하였다. 포자에 흡착된 리파아제의 활성을 측정하기 위하여, 리파아제가 흡착된 상기 포자를 PBS 용액에 현탁한 후 10%의 올리브 기름을 혼합하여 48시간 동안 반응시킨 다음, 상등액에 큐프릭산 0.2 ㎖을 처리하여 715 nm의 파장에서 흡광도를 측정하였다. 그 결과 포자 표면에 흡착되었다가 올리브 기름에 의해 상등액으로 분리된 리파아제로 인한 활성이 관찰되었다(참조: 도 2). 첨부한 도 2에서 (1)번 라인은 포자표면에 리파아제를 흡착시킨 시료에 대한 것이고, (2)번 라인은 대조구로 사용한 리파아제를 흡착시키지 않은 포자에 대한 것이며, 가로축의 시간은 활성 측정을 위한 반응 시간이다.
따라서 리파아제가 소수성 상호작용에 의한 단순한 흡착을 통해 포자 표면에결합되는 것을 확인할 수 있었다.
상기한 실험 결과는 소수성을 띤 어떠한 단백질이라도 포자 표면에 전시가 가능하다는 것을 예시하는 것이며, 이에 소수성 단백질이 세포 내에서 발현되거나 세포 외로 분비되어도 포자 표면에 전시가 가능할 것이라는 것은 당업자라면 누구나 예측할 수 있다.
실시예 2: 야생형 리파아제의 포자 표면 전시
숙주 세포에서 발현된 야생형 리파아제가 포자 표면에 전시가 되는지 여부를 다음과 같이 조사하였다: 포자 표면 전시를 위한 야생형 리파아제 유전자를 포함한 플라스미드 pBS:lipA (Bell P.J.L. et al,Biotechnol. Lett., 21: 1003-1006(1999))는 호주의 Bergquist 박사로부터 얻었다. 상기 플라스미드를 주형으로 하고 서열 1의 프라이머 lip1과 서열 2의 프라이머 lip2를 사용하여 PCR을 수행하였다. 중합효소는 베링거만하임사로부터 구입한 Taq 중합효소를 사용하였고, 어닐링은 55℃에서 30초, 연장반응은 72℃에서 1분, 변성은 94℃에서 30초간으로 하여 총 35 사이클을 수행하였다.
PCR 산물을BamHI 및KpnI으로 절단하고, 하기 실시예 3의 플라스미드 pCry1P-CMCase의 동일 부위에 카복시메틸셀룰라아제를 치환하여 삽입한 후 바실러스 서브틸리스 DB104에 자연도입법 (C. R. Harwood,et al., "Molecular Biological Methods for Bacillus." John Wiley & Sons, New York, p.416(1990))으로 형질전환하였다. 형질전환된 바실러스 균은 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 포자를 분리하고 리파아제 활성을 측정한 결과 순수 분리된 포자에서 리파아제 활성이 검출되었다 (참조: 도 3). 첨부한 도 3에서 (1)번 라인은 야생형 리파아제가 표면전시된 포자에 대한 것이고, (2)번 라인은 대조구로 사용된 포자에 대한 것이며, 가로축의 시간은 활성 측정을 위한 반응시간이다. 따라서, 본 발명의 포자 표면전시 시스템을 이용하는 경우에는 소수성 단백질을 표면 전시할 수 있음을 알 수 있다.
한편, 본 실시예에서 발현된 리파아제는 N-말단에 자체 분비신호를 가지고 있어 세포 외로 분비가 일어난다. 세포 외로 분비된 효소는 포자 형성 과정이 끝난 후 포자가 배양액으로 노출되면 포자와 결합할 수 있다. 한편 효소가 자체 분비신호를 가지고 있어도 분비되지 못한 효소가 세포 내에 존재하게 되는데 (Bron S.,J. Biotechnol., 64:3-13(1998)), 세포 내에 남아있는 효소가 소수성에 의해 포자 표면에 결합할 수 있다.
따라서 어떠한 소수성 단백질이 세포 내에 발현되거나 세포 외로 분비되어도 포자 표면에 전시가 가능할 것이라는 것도 충분히 예측할 수 있다.
실시예 3: 야생형 카복시메틸셀룰라아제의 포자 표면 전시
카복시메틸셀룰라아제의 포자 표면 전시를 위해 바실러스 츄린겐시스 독소단백질 유전자cry1Aa의 프로모터 뒤에 바실러스 서브틸리스 BSE616 균으로부터 분리된 카복시메틸셀룰라아제 유전자 (Park S.H. et al.,Agric. Biol. Chem., 55:441-448(1991))를 클로닝하였다.
먼저cry1Aa프로모터를 클로닝하기 위해 미국 BGSC (Bacillus Genetic Stock Center, Ohio)로부터 얻은 바실러스 츄린겐시스 쿠스타키 HD1 균주의 DNA를 칼만 등의 방법 (Kalman S. et al.,Appl. Environ. Mirobiol., 59: 1131-1137(1993))으로 분리하여 주형으로 하고, 서열 3의 프라이머 1AP1과 서열 4의 프라이머 1AP2를 사용하여 상기 실시예 2와 동일하게 PCR을 수행하였다. PCR 산물은 미국 프로메가사 (Promega Co.)로부터 구입한 pGemT-easy 벡터에 클로닝하고 이어 클로닝 산물을SphI과SalI으로 절단하여 플라스미드 pUC19 (GenBank X02514)의 동일 부위에 삽입한 후HindⅢ와BamHI으로 절단하여 플라스미드 pCPaC3 (KCTC 0831BP)의 동일 부위에 치환 삽입하여 플라스미드 pCry1P-CMCase를 완성하였다. 상기 플라스미드 pCry1P-CMCase는 대장균과 바실러스 속의 균주에서 모두 복제가 가능한 셔틀벡터이다.
상기 최종적으로 제작된 플라스미드 pCry1P-CMCase를 바실러스 서브틸리스 DB104에 자연도입법으로 형질전환하였다. 한편, 바실러스 균주내로 재조합 벡터를 도입하는 방법으로서 세포접합법 (conjugation), 형질도입법 (transduction) 등을 사용할 수 있다. 이어, 플라스미드 pCry1P-CMCase로 형질전환된 바실러스 균주를 GYS 배지에서 약 24시간 동안 진탕배양 (37℃, 250 rpm)하였고, 그런 다음 레노그라핀 밀도구배 방법으로 순수 포자만을 분리하였다.
분리된 포자들에 대한 카복시메틸셀룰라아제의 활성 측정은 다음과 같이 실시하였다: 우선, 0.1 M 포타슘포스페이트 (pH 6.0)에 포자가 흡광도(600 nm)=1.4 정도로 현탁된 포자용액 100 ㎕에 1% 카복시메틸셀룰로오스가 용해되어 있는 용액 (0.1M 포타슘포스페이트, pH 6.0) 200 ㎕를 첨가하고 50℃에서 40분간 반응하였다. 반응이 종료된 후 반응용액에 DNS (포타슘 소듐 타르타레이트 20%, NaOH 1%, NaHSO30.05%, 페놀 0.2%, 3,5-디니트로살리시클산 1%) 용액 900 ㎕를 첨가하고 5분간 가열한 후 찬물에서 냉각시켰다. 다시 원심분리를 통해서 나온 상등액을 575 nm의 파장에서 흡광도를 측정하였다. 카복시메틸셀룰라아제의 활성은 대조구에서는 0 mU이었지만 효소가 표면 전시된 포자에서는 1.96 mU로 효소활성이 나타났다.
한편, 카복시메틸셀룰라아제에 특이적으로 결합하는 항체 (Kim et al.,Appl. Environ. Microbiol., 66:788-793(2000))를 이용하여 김 등의 방법 (Kim et al.,Appl. Environ. Microbiol., 66:788-793(2000))으로 유세포 분석기(FACSort, 미합중국 Becton Dickinson 사)로 분석한 결과, pCry1P-CMCase로 형질전환된 바실러스 숙주의 포자의 표면에서 카복시메틸셀룰라아제가 검출되었다 (참조: 도 4). 첨부 도 4에서 녹색 곡선(1번 곡선)은 대조구로 사용된 포자 시료이고, 적색 곡선(2번 곡선)은 pCry1P-CMCase로 형질전환된 바실러스 숙주의 포자 시료이며, 세로축은 포자수이고, 가로축은 형광의 세기이다. 첨부 도 4에서 대조구에 비하여 카복시메틸셀룰라아제가 표면전시된 포자에서 그래프의 피크가 오른쪽으로 이동했음을 관찰할 수 있는데 이것은 pCry1P-CMCase로 형질전환된 바실러스 숙주의 포자표면에 카복시메틸셀룰라아제에 특이적으로 결합하는 항체가 많이 결합하였음을 의미한다. 따라서 pCry1P-CMCase로 형질전환된 바실러스 숙주의 포자의 표면에카복시메틸셀룰라아제가 결합되어 있음을 확인할 수 있다.
상기 실시예에서 발현된 카복시메틸셀룰라아제는 N-말단에 자체 분비신호를 가지고 있어 세포 외로 분비가 일어난다. 세포 외로 분비된 효소는 포자형성 과정이 끝난 후 포자가 배양액으로 노출되면 포자와 결합할 가능성도 있지만 효소가 자체 분비신호를 가지고 있어도 분비되지 못한 효소가 세포내에 존재하게 되는데 (Bron S.,J. Biotechnol., 64:3-13(1998)), 이 때 분비 신호의 소수성에 의해 포자표면에 결합할 수 있게 된다. 따라서, 본 발명의 포자 표면 전시 시스템을 이용하는 경우에는, 분비신호를 갖고 있는 어떠한 단백질이라도 포자 표면에 전시하는 것이 가능하다는 것은 충분히 예측할 수 있다.
실시예 4: 변형된 분비신호를 갖는 카복시메틸셀룰라아제의 포자 표면 전시
일반적으로 단백질의 N-말단 분비신호는 N-말단의 맨 끝에 2-3개의 양이온을 띤 아미노 잔기와 후속의 소수성 도메인으로 구성되어 있는데, 상기 양이온 아미노산들은 세포막의 음이온성 인지질과 결합함으로써 단백질의 분비를 도와주는 것으로 알려져 있다 (Tjalsma H.,Microbiol. Mol. Biol. Rev., 64:515-547(2000)). 더욱이, 상기 양이온 아미노산을 중성으로 치환시켜 주면 단백질의 분비가 다소 감소한다고 알려져 있다 (Chen M. and Nagarajan V.,J. Bacteriol., 176:5796-5801(1994)). 따라서, 본 발명자들은 단백질의 분비를 감소시키는 경우에는 세포내에 존재하는 해당 단백질의 양이 증가되고, 증가된 단백질은 N-말단의 소수성 도메인에 의해 포자 표면과 소수성결합을 통해 포자 표면 전시가 더 용이하게 일어날 수 있을 것이라는 가설을 정립하였다. 이러한 가설을 증명하기 위해 다음과 같은 실시예를 수행하였다.
양이온을 띤 아미노산 잔기가 제거되고 소수성 도메인만 갖는 카복시메틸셀룰라아제를 클로닝하기 위해 프랑스국 파스테르 연구소의 F. Kunst 박사로부터 분양 받은 바실러스 서브틸리스 168 균주 (Nature, 390:249-256(1997))의 DNA를 상기한 칼만 등의 방법으로 분리하였다. 이어, 분리된 DNA를 주형으로 하고, 서열 5의 프라이머 cmc-hp와 서열 6의 프라이머를 사용하여 상기 실시예 2와 같이 PCR을 수행하였다.
그런 다음, PCR 산물을BamHI 및SacI으로 절단하고, 상기 실시예 3의 플라스미드 pCry1P-CMCase의 CMCase 유전자와 치환 삽입하였다. 이렇게 제작된 플라스미드 pCry1p-CMCase-hp (참조: 도 5)를 바실러스 서브틸리스 DB104에 자연도입법으로 형질전환하고, 형질전환체를 바실러스 서브틸리스 BSK209라 명명하여, 이를 국제기탁기관인 생명공학연구소 유전자은행에 2000년 12월 2일자로 기탁하고, 기탁번호 KCTC 0902BP를 부여받았다. 첨부 서열 7은 시그널 펩타이드에서 양이온성 아미노산이 제거된 CMCase를 인코딩하는 상기 벡터에 포함되어 있는 유전자의 염기 서열이고, 첨부 서열 8은 이에 의해 인코딩되는 CMCase의 아미노산 서열이다.
이어, 형질전환된 바실러스 균주 BSK209를 GYS 배지에서 약 24시간 동안 진탕배양 (37℃, 250 rpm)하였고, 그런 다음 레노그라핀 밀도구배 방법으로 순수 포자만을 분리하였다.
분리된 포자들에 대해 상기 실시예 3과 동일한 방법으로 카복시메틸셀룰라아제의 활성을 측정하였는데, 대조구에서는 0 mU이었지만 효소가 표면 전시된 포자에서는 4.74 mU로 효소활성이 나타났다. 이는 야생형 카복시메틸셀룰라아제에 비해 2.4배 정도 활성이 높은 것으로 야생형보다 포자 표면 전시된 효소의 양이 더 많아졌음을 나타내는 것이다. 한편, 카복시메틸셀룰라아제에 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여, 상기 실시예 3과 동일한 방법으로 유세포 분석기로 분석한 결과, pCry1p-CMCase-hp로 형질전환된 포자의 표면에서 카복시메틸셀룰라아제가 검출되었다 (참조: 도 6).
첨부 도 6에서 녹색 곡선(1번 곡선)은 대조구로 사용된 포자 시료이고, 청색 곡선(2번 곡선)은 pCry1P-CMCase-hp로 형질전환된 바실러스 숙주의 포자 시료이다. 첨부 도 6에서 대조구에 비하여 카복시메틸셀룰라아제가 표면전시된 포자에서 그래프의 피크가 오른쪽으로 이동했음을 관찰할 수 있는데 이것은 pCry1P-CMCase-hp로 형질전환된 바실러스 숙주의 포자표면에 카복시메틸셀룰라아제에 특이적으로 결합하는 항체가 많이 결합하였음을 의미한다. 따라서 pCry1P-CMCase-hp로 형질전환된 바실러스 숙주의 포자의 표면에 변형된 분비신호를 갖는 카복시메틸셀룰라아제가 결합되어 있음을 확인할 수 있다. 또한, 도 6의 그래프에서 피크가 도 4에 도시된 야생형 카복시메틸셀룰라아제의 그래프보다 더 오른쪽으로 이동했음을 볼 수 있는데, 오른쪽으로 이동이 심할수록 더 많은 효소가 포자의 표면에 전시되어 있음을 보여주는 것이다. 따라서, N-말단의 양이온성 아미노산 잔기가 제거되고 소수성 도메인만 갖는 카복시메틸셀룰라아제가 야생형보다 포자 표면전시에 더 유리함을 알 수 있다.
상기한 실험 결과로부터 자체 분비신호를 가지고 있는 어떠한 단백질이라도 분비신호 N-말단의 양이온성 아미노산을 제거 또는 중성으로 치환하면 포자 표면 전시에 더욱 유리하게 이용될 수 있음을 예측할 수 있다. 또한, 분비신호를 가지고 있지 않은 어떠한 단백질이라도 분비신호의 소수성 도메인 또는 다른 소수성 도메인과 융합되거나 목적단백질을 위치특이적으로 돌연변이시키거나 무작위 돌연변이법에 의해 목적단백질의 소수성이 증가하면 능히 포자 표면에 전시가 가능할 것이라는 것도 충분히 예측할 수 있다. 더불어, 유전자 담체 표면 단백질과 목적단백질과의 비공유결합을 도와주는 다른 올리고펩타이드 또는 폴리펩타이드와 융합시키는거나 유전자담체 표면 단백질을 선택적 돌연변이시키거나 유전자 담체 표면 단백질을 무작위 돌연변이시키는 방법을 통하여 유전자 담체 표면의 소수성을 증가시키면 소수성 도메인을 가진 목적단백질의 표면전시가 유리해진다는 것은 충분히 예측할 수 있다.
실시예 5: 이온성 도메인을 이용한 카복시메틸셀룰라아제의 포자 표면 전시
바실러스 포자의 표면은 실시예 1에서 기재한 바와 같이 소수성을 나타내지만, 음이온성도 띠는 것으로 알려져 있다 (Nishihara T., et al.,Microbiol. Immunol., 25:763-771(1981)). 따라서, 본 발명자들은 양이온을 띠는 목적단백질은 포자 표면에 이온결합에 의해 전시가 일어날 것이며 목적단백질이 양이온성을 띠지 않아도 양이온을 띠는 어떤 모티브와 융합되면 포자 표면 전시가 가능할 것이라는 가설을 정립하였다. 상기한 가설을 입증하기 위해 다음과 같은 실시예를 수행하였다.
양이온을 띤 도메인을 카복시메틸셀룰라아제와 융합하기 위해 효소의 성숙형(mature form)의 N-말단에 히스티딘 잔기 6개를 다음과 같은 프라이머를 이용하여 융합하였다. 우선, 바실러스 서브틸리스 168 균주의 DNA를 주형으로 하고, 서열 9의 프라이머 cmc-his와 서열 10의 프라이머 cmc-ter를 사용하여 상기 실시예 2와 동일하게 PCR을 수행하였다.
이어, PCR 산물을BamHI 및SacI으로 절단하고, 상기 실시예 3의 플라스미드 pCry1P-CMCase의 CMCase 유전자와 치환 삽입하였다. 이렇게 제작된 플라스미드 pCry1p-CMCase-his (참조: 도 7)를 바실러스 서브틸리스 DB104에 자연도입법으로 형질전환하였다. 첨부 서열 11은 N-말단에 히스티딘 잔기 6개가 추가된 CMCase를 인코딩하는 상기 벡터에 포함되어 있는 유전자의 염기 서열이고, 첨부 서열 12는 이에 의해 인코딩되는 CMCase의 아미노산 서열이다.
이어, 플라스미드 pCry1p-CMCase-his로 형질전환된 바실러스 균주를 GYS 배지에서 약 24시간 동안 진탕배양 (37℃, 250 rpm)하였고, 그런 다음 레노그라핀 밀도구배 방법으로 순수 포자만을 분리하였다. 분리된 포자들에 대해 상기 실시예 3과 동일한 방법으로 카복시메틸셀룰라아제의 활성을 측정하였는데 대조구에서는 0 mU이었지만 효소가 표면 전시된 포자에서는 1.90 mU로 효소활성이 나타났다. 한편, 카복시메틸셀룰라아제에 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여, 상기 실시예 3과 동일한 방법으로 유세포 분석기로 분석한 결과, pCry1p-CMCase-his로 형질전환된 포자의 표면에서 카복시메틸셀룰라아제가 검출되었다 (참조: 도 8).
첨부 도 8에서 녹색 곡선(1번 곡선)은 대조구로 사용된 포자 시료이고, 오렌지색 곡선(2번 곡선)은 pCry1P-CMCase-his로 형질전환된 바실러스 숙주의 포자 시료이다. 첨부 도 8에서 대조구에 비하여 카복시메틸셀룰라아제가 표면전시된 포자에서 그래프의 피크가 오른쪽으로 이동했음을 관찰할 수 있는데 이것은 pCry1P-CMCase-his로 형질전환된 바실러스 숙주의 포자표면에 카복시메틸셀룰라아제에 특이적으로 결합하는 항체가 많이 결합하였음을 의미한다. 따라서 N-말단에 양이온성 도메인이 추가된 카복시메틸셀룰라아제가 pCry1P-CMCase-his로 형질전환된 바실러스 숙주의 포자의 표면에 결합되어 있음을 확인할 수 있다.
상기한 실험결과로부터 어떠한 단백질이라도 양이온을 띤 도메인과 융합되거나 목적단백질을 위치특이적으로 돌연변이시키거나 무작위 돌연변이법에 의해 목적단백질의 양이온성이 증가하면 능히 포자 표면에 전시가 가능하다는 것이 충분히 예측된다. 또한 유전자 담체 표면 단백질과 목적단백질과의 비공유결합을 도와주는 다른 올리고펩타이드 또는 폴리펩타이드와 융합시키는거나 유전자 담체 표면 단백질을 선택적 돌연변이시키거나 유전자담체 표면단백질을 무작위 돌연변이시키는 방법을 통하여 유전자담체 표면의 음이온성을 증가시키면 양이온성 도메인을 가진 목적단백질의 표면전시가 유리해진다는 것은 충분히 예측할 수 있다.
또한, 다른 서열을 추가적으로 융합시켜 표면전시 효과를 증가시킨 본 실시예의 결과로부터, 항원과 항체 및 리간드와 수용체 등 서로간에 결합이 가능한 두개의 모티브를 각각 목적단백질 및 유전자 담체의 표면단백질과 융합시키는 경우에는 목적단백질이 유전자 담체의 표면에 전시가 가능할 것이라는 것도 충분히 예측할 수 있다.
한편, 목적단백질이 유전자 담체 표면에 비공유결합으로 전시된 후 상술한 글루타르알데히드 처리법, 자외선처리법 및 공유결합을 도와주는 효소처리 등을 통하여 비공유결합을 공유결합으로 변형되게 함으로써 목적단백질의 전시를 보다 안정되게 하는 것도 충분히 예측가능한 일이다.
실시예 6: 목적단백질의 파아지 표면 전시
파아지 코트단백질과 결합할 수 있는 목적단백질은 파아지 표면 전시가 가능하다는 것은 상기한 실시예로부터 충분히 예측되며, 이와 같은 사실은 다음과 같이 확인된다. 한편, 파아지 코트단백질과 자연상태에서 결합할 수 없는 목적단백질은 파아지 코트단백질과 결합할 수 있는 모티브와 융합되면 파아지 표면 전시가 가능하다.
먼저, 파아지 코트단백질에 소수성 도메인을 융합하고 목적단백질에도 역시 소수성 도메인을 융합한다. 또한, 목적단백질이 페리플라즘으로 분비되기 위한 분비신호도 융합시킨다. 이 들을 숙주 세포에서 발현시키면 페리플라즘로 분비된 목적단백질은 역시 페리플라즘에 위치하고 있는 파아지 코트단백질과의 소수성 결합을 통하여 파아지 표면 전시가 일어난다.
이러한 파아지 표면 전시를 소수성 결합 이외에 다른 결합에 의해서도 이루어질 수 있도록 변형하는 것은 당업자에게 용이하다.
실시예 7: 본 발명의 유전자 담체 표면 전시 방법을 이용한 목적단백질의 방향 성 진화
본 발명에서 구축된 시스템 즉 발현된 목적단백질이 유전자 담체의 표면과의 상호작용에 의해 표면 전시가 가능하게 한 시스템을 이용하여, 목적단백질의 방향성 진화를 할 수 있다. 우선, 카복실메틸셀룰라아제를 코딩하는 유전자에 대한 에러 유발 PCR을 Cadwell, R. C. and Joyce, G. F.,PCR Methods Appl., 2: 28-33 (1992)에 개시된 방법에 따라 수행한다. PCR 반응은 목적단백질 유전자가 포함된 상기 실시예 3의 pCPaC3를 주형으로 하고 카복실메틸셀룰라아제 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머를 사용한다. 이들 프라이머 0.3 μM와 주형 DNA 5 ng를 반응용액 (10 mM Tris (pH 8.3), 50 mM KCl, 7 mM MgCl2, 0.01% (w/v) 젤라틴)에 넣고 여기에 0.2 mM dGTP, 0.2 mM dATP, 1 mM dCTP, 1 mM dTTP, 0.15 mM MnCl2, Taq 중합효소 5 U을 넣어 총 100 ㎕의 반응액을 준비한다. 반응조건은 변성은 94℃에서 30초, 어닐링은 50℃에서 30초, 연장반응은 72℃에서 1분으로 하여 총 13 사이클을 수행한다.
이어, 상기의 PCR 산물을 바실러스 서브틸리스 DB104에서 복제가 가능한 플라스미드에 발현이 가능한 형태로 삽입한 후 바실러스 숙주 세포에 자연도입법으로 형질전환한다. 그런 다음, 형질전환된 바실러스 균주를 GYS 배지에서 약 24시간 동안 진탕배양하여 포자의 표면에 카복실메틸셀룰라아제의 라이브러리를 전시한 후, 레노그라핀 밀도구배 방법으로 순수 포자만을 분리한다. 그리고 나서, 상기 실시예 3과 동일하게 유전자 담체인 포자의 표면에 전시된 카복실메틸셀룰라아제의 활성의 변화를 이용하거나 카복실메틸셀룰라아제에 특이적으로 결합하는 항체와의 결합력의 변화를 유세포분석기로 측정하여 개선된 특성을 갖는 카복실메틸셀룰라아제 변이체를 선별한다.
실시예 8: 목적단백질이 표면 전시된 유전자 담체를 이용한 생물전환
유기용매상에서 리파아제를 이용한 생물전환반응은 지난 수년간 보고되어 왔다 (Zaks, A. et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.82:3192(1985); Klibanov, A. M.,CHEMTECH, 16:354(1986)). 이러한 반응계에서는 효소의 불활성화 없이 반응을 수행하는 것이 필수적이다. 이를 위해 일반적으로 리파아제의 고정화를 수행하였다 (Mustranta, A. Forssell et al.,Enz. Microb. Technol., 15: 133(1993); Reetz, M. T. et al.,J. Biotechnol. Bioeng., 49:527(1996)). 상기 보고들에 의하면 리파아제를 고정화한 경우, 유리된 리파아제에 비해 유기용매상에서 효소의 안정성이 증가되었으며 합성 반응속도 또한 증가됨을 보고하고 있다.
우선, 상기 실시예 1 또는 실시예 2와 동일한 방법으로 리파아제를 포자표면 전시하고, Zaks, A., Klibanov, A. M.Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.,82:3192(1985); 및 Klibanov, A. M.CHEMTECH, 16:354(1986)에 개시된 방법과 동일한 방법으로 생물전환 반응을 한다.
본 발명의 생물전환 반응은 유기용매에 내성을 갖는 바이러스를 이용하여 목적단백질을 상기 담체에 표면 전시함으로써 실시될 수도 있다.
실시예 9: 목적단백질이 표면 전시된 유전자 담체를 이용한 단백질어레이
슬라이드글라스 표면에 알데히드 활성기가 코팅되어 있는 단백질 어레이용 고체 표면(BMS사, 독일국)에 특정 항원에 대한 단일클론 항체가 표면 전시된 유전자 담체 106-109개를 자동화 어레이 장치를 이용하여 부착한다. 이는 유전자 담체 표면의 단백질에 존재하는 아미노기와 슬라이드글라스 표면의 알데히드기가 반응하여 쉬프-베이스를 형성함으로써 고체 표면에 공유결합 형태로 부착되는 것이다. 비록 부착된 면에서는 표면 전시된 목적 단백질이 고체 표면에 부착되어 활성을 상실하여도 표면에 노출된 유전자 담체의 표면에 전시된 목적 단백질은 일정한 방향성을 갖을 수 있다.
본 발명의 방법에 의해 제조된 단백질 어레이는 진단용 키트, 유전자 발현분석, 단백질간 또는 단백질과 리간드간 의 상호반응 분석, 대사과정 분석, 신규 효소 탐색 또는 개량된 효소의 탐색, 조합 생화학합성 및 바이오센서 등에 이용될 수 있다.
실시예 10: 목적단백질이 표면 전시된 유전자 담체를 이용한 항체 생성
생체 내에서 면역 반응을 유도할 수 있는 항원을 유전자 담체에 표면 전시시키는 경우에는 이를 이용해 항체생성을 유도할 수 있다.
우선, 항원인 카복실메틸셀룰라아제를 포함하는 상기 실시예 3의 pCry1P-CMCase를 바실러스 서브틸리스 DB104에 자연도입법으로 형질전환한다. 이어, 형질전환된 바실러스 균주를 GYS 배지에서 약 24시간 동안 진탕배양하여 포자의 표면에 카복실메틸셀룰라아제를 전시한 후, 레노그라핀 밀도구배 방법으로 순수 포자만을 분리한다. 그런 다음, 항원이 표면 전시된 포자를 PBS에 현탁하고, 동일부피의 완전 프로이드 아쥬방을 첨가한다. 이어, 상기 혼합액을 교반하여 유탁액으로 한 다음, 주사기를 이용하여 6 내지 8 주령의 BALB/c 마우스에 정맥내 투여를 한다. 투여를 한 다음, 4주가 되는 날에 2차 투여를 한다. 그리고 나서, 약 2-3번 정도 더 부스터 투여를 하여 항체 생성을 유도한다.
실시예 11: 목적단백질이 표면 전시된 유전자 담체를 이용한 특정 물질의 분리
결합 도메인이 표면 전시된 유전자 담체를 이용하여 혼합물로부터 특정물질을 분리할 수 있다. 우선, 결합도메인을 코딩하는 유전자에 대한 에러 유발 PCR을 Cadwell, R. C. and Joyce, G. F.,PCR Methods Appl., 2: 28-33 (1992)에 개시된 방법에 따라 수행한다. PCR 반응은 목적단백질 유전자가 포함된 플라스미드 혹은 염색체를 주형으로 하고 목적단백질 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머를 사용한다. 이들 프라이머 0.3 μM와 주형 DNA 5 ng를 반응용액 (10 mM Tris(pH 8.3), 50 mM KCl, 7 mM MgCl2, 0.01% (w/v) 젤라틴)에 넣고 여기에 0.2 mM dGTP, 0.2 mM dATP, 1 mM dCTP, 1 mM dTTP, 0.15 mM MnCl2, Taq 중합효소 5U을 넣어 총 100 ㎕의 반응액을 준비한다. 반응조건은 변성은 94℃에서 30초, 어닐링은 50℃에서 30초, 연장반응은 72℃에서 1분으로 하여 총 13 사이클을 수행한다.
이어, 각 숙주 세포에서 복제가 가능한 플라스미드에 상기의 PCR 산물을 발현이 가능한 형태로 삽입한 후 숙주 세포에 라이브러리를 구축한다. 상기 표면 전시용 벡터 라이브러리로 숙주 세포를 형질전환시키고 상기 결합 도메인 변이체를 숙주 세포 내에서 발현하여 상기 유전자 담체 표면에 전시시킨 유전자 담체 라이브러리를 얻은 후 소망하는 특성을 갖는 결합 도메인의 변이체가 표면 전시된 유전자 담체를 스크리닝한다. 스크리닝된 유전자 담체를 분리하고 증식하여 결합도메인이 전시된 유전자 담체를 생산한 후 상기 결합도메인이 전시된 유전자 담체를 혼합물과 접촉시켜 특정물질을 분리한다.
본 발명은 유전자 담체 표면에 결합된 목적단백질의 제조방법 및 목적단백질의 개량방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 유전자 담체 표면 전시방법을 이용한 혼합물내의 특정물질을 분리하는 방법, 생물 전환방법 및 항체의 생산방법을 제공한다. 한편, 본 발명은 목적단백질의 유전자 담체 표면 전시용 벡터, 형질전환체, 유전자 담체-목적단백질의 복합체 및 유전자 담체 라이브러리를 제공한다.더불어, 본 발명은 유전자 담체 표면 전시방법을 이용하여 제조되는 단백질 어레이를 제공한다. 본 발명의 유전자 담체 표면에 결합된 목적단백질의 제조방법은 발현모체가 없는 경우에도 다양한 단백질를 표면전시할 수 있고, 목적단백질이 발현되어 고유의 구조를 이루고난 후 유전자 담체의 표면에 전시하므로 완전한 활성을 갖게하며, 발현 및 전시되는 목적단백질의 양이 크게 증가하여도 유전자 담체의 생존력이나 환경에 대한 내성을 감소시키지 않는 우수한 장점을 제공한다.
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Claims (50)
- 다음과 같은 단계를 포함하는 유전자 담체 표면에 결합된 목적단백질의 제조방법:(a) 포자 및 바이러스로 구성된 그룹으로부터 선택되는 유전자 담체를 함유하는 숙주 세포를 목적단백질을 인코딩하는 유전자를 포함하는 벡터로 형질전환하는 단계;(b) 상기 형질전환된 숙주 세포를 배양하여 목적단백질을 숙주 세포내에 발현하는 단계; 및(c) 상기 발현된 목적단백질이 상기 유전자 담체 표면과 비공유결합을 형성하여 유전자 담체 표면에 전시되도록 하는 단계.
- 다음과 같은 단계를 포함하는 단백질 개량방법:(a) 목적단백질을 인코딩하는 유전자를 돌연변이시켜 목적단백질 변이체를 인코딩하는 유전자 라이브러리를 구축하는 단계;(b) 상기 구축된 유전자 라이브러리를 포함하는 벡터 라이브러리를 제작하는 단계;(c) 유전자 담체로서의 포자 및 바이러스를 함유하는 숙주 세포를 상기 벡터 라이브러리로 형질전환하는 단계;(d) 상기 형질전환된 숙주 세포를 배양하여 목적단백질 변이체를 발현하는 단계;(e) 상기 발현된 목적단백질 변이체가 상기 유전자 담체 표면과 비공유결합을 통하여 유전자 담체 표면에 전시되도록 하여 유전자 담체 라이브러리를 얻는 단계; 및(f) 상기 유전자 담체 라이브러리로부터 소망하는 특성을 갖는 목적단백질 변이체가 표면 전시된 유전자 담체를 스크리닝하는 단계.
- 다음과 같은 단계를 포함하는 혼합물내의 특정물질을 분리하는 방법:(a) 목적단백질로서의 결합단백질 또는 그 결합도메인을 인코딩하는 유전자를 돌연변이시켜 결합단백질 또는 그 결합도메인 변이체를 인코딩하는 유전자 라이브러리를 구축하는 단계;(b) 상기 구축된 유전자 라이브러리를 포함하는 벡터 라이브러리를 제작하는 단계;(c) 유전자 담체로서의 포자 및 바이러스를 함유하는 숙주 세포를 상기 벡터 라이브러리로 형질전환하는 단계;(d) 상기 형질전환된 숙주 세포를 배양하여 결합단백질 또는 그 결합도메인 변이체를 발현하는 단계;(e) 상기 발현된 결합단백질 또는 그 결합도메인 변이체가 상기 유전자 담체표면과 비공유결합을 통하여 유전자 담체 표면에 전시되도록 하여 유전자 담체 라이브러리를 얻는 단계;(f) 상기 유전자 담체 라이브러리를 예정 목적물질과 접촉하여 상기 예정 목적물질이 결합된 결합단백질 변이체 또는 그 결합도메인 변이체를 선택하여 실시되는 스크리닝 단계; 및(g) 스크리닝된 개량된 결합단백질 또는 그의 결합도메인이 표면 전시된 유전자 담체를 혼합물과 접촉시켜 상기 결합단백질 또는 그의 결합도메인에 결합하는 혼합물내의 특정물질을 분리하는 단계.
- 제 1 항 내지 제 2 항 중 어느 한 항에 있어서, 목적단백질이 호르몬, 호르몬 유사체, 효소, 효소저해제, 신호전달단백질 또는 그 일부분, 항체 또는 그 일부분, 단쇄항체, 결합단백질 또는 그 결합도메인, 펩타이드, 항원, 부착단백질, 구조단백질, 조절단백질, 독소단백질, 사이토카인, 전사조절 인자, 혈액 응고 인자 및 식물 생체방어 유도 단백질로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 3 항에 있어서, 상기 결합단백질 또는 그의 결합도메인은 항체 또는 항체도메인인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 4 항에 있어서, 상기 결합단백질 또는 그의 결합도메인은 항체 또는 항체도메인인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 3 항에 있어서, 상기 결합단백질 또는 그의 결합도메인은 단백질 분해효소 저해제, 크람빈, 엔테로톡신, 코노톡신, 아파민, 라이소자임, 리보뉴클리아제, 차립도톡신, 시스타틴, 에글린, 오보뮤코이드, 아주린, 종양괴사인자 및 CD4로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 4 항에 있어서, 상기 결합단백질 또는 그의 결합도메인은 단백질 분해효소 저해제, 크람빈, 엔테로톡신, 코노톡신, 아파민, 라이소자임, 리보뉴클리아제, 차립도톡신, 시스타틴, 에글린, 오보뮤코이드, 아주린, 종양괴사인자 및 CD4로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 3 항에 있어서, 상기 목적단백질인 결합단백질은 모노머 또는 멀티머인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 4 항에 있어서, 상기 목적단백질은 모노머 또는 멀티머인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 목적단백질은 유전자 담체와의 비공유결합을 개선하기 위하여 변형된 것임을 특징으로 하는 방법.
- 제 11 항에 있어서, 상기 목적단백질은 (ⅰ) 목적단백질의 아미노산 서열 일부를 제거하는 방법; (ⅱ) 목적단백질 또는 상기 (ⅰ)의 방법에 의해 아미노산 서열의 일부가 제거된 목적단백질과 유전자 담체 표면단백질과의 비공유결합을 도와주는 다른 올리고펩타이드 또는 폴리펩타이드와 융합시키는 방법; (ⅲ) 목적단백질을 위치 특이적으로 돌연변이시키는 방법; 및 (ⅳ) 목적단백질을 무작위 돌연변이시키는 방법으로 구성된 그룹으로터 선택되는 1종 이상의 방법에 의해 변형된 것임을 특징으로 하는 방법.
- 제 12 항에 있어서, 상기 목적단백질의 아미노산 서열 일부를 제거하는 방법은 목적단백질의 N-말단 부위의 서열 중 이온성 아미노산 서열을 제거하여 실시됨을 특징으로 하는 방법.
- 제 12 항에 있어서, 상기 융합되는 올리고펩타이드는 양이온성 펩타이드인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유전자 담체는 목적단백질과의 비공유결합을 증가시키기 위하여 그 표면단백질이 변형된 것임을 특징으로 하는 방법.
- 제 15 항에 있어서, 상기 유전자 담체는 (ⅰ) 유전자 담체와 목적 단백질과의 비공유결합을 도와주는 다른 올리고펩타이드 또는 폴리펩타이드를 유전자 담체의 표면 단백질과 융합시키는 방법; (ⅱ) 유전자 담체 표면 단백질을 위치 특이적으로 돌연변이시키는 방법; 및 (ⅲ) 유전자 담체 표면 단백질을 무작위 돌연변이시키는 방법으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 1종 이상의 방법에 의해 변형된 것임을 특징으로 방법.
- 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 포자를 포함하는 숙주 세포는 포자를 형성하는 그람음성균, 포자를 형성하는 그람양성균, 포자를 형성하는 방선균, 포자를 형성하는 효모 및 포자를 형성하는 곰팡이로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 17 항에 있어서, 상기 그람양성균은 클로스트리디움 속, 페니바실러스 속 및 바실러스 속으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 미생물인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 18 항에 있어서, 상기 바실러스 속 미생물은 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스 및 바실러스 메가테리움으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 미생물인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바이러스는 박테리오파아지인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 20 항에 있어서, 상기 박테리오파아지는 숙주 세포의 페리플라즘에 위치하는 박테리오파이지이고 목적단백질은 페리플라즘에 위치한 상기 박테리오파아지의 표면에 결합하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 숙주 세포는 표면 전시를 위해 발현된 목적단백질의 분해와 관련된 세포내 단백질 분해효소 또는 세포외 단백질 분해효소를 생산하지 못하도록 변형된 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 2 항에 있어서, 상기 유전자 담체는 포자이고, 상기 스크리닝 단계는 포자 라이브러리를 유기용매, 열, 산, 염기, 산화제, 건조, 계면활성제 및 단백질분해효소로 구성된 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 방법으로 처리한 후 상기 처리에 대하여 내성을 갖는 목적단백질 변이체가 표면 전시된 포자를 선택하여 실시됨을 특징으로 하는 단백질 개량방법.
- 제 2 항에 있어서, 상기 유전자 담체는 포자이고, 상기 스크리닝 단계는 포자 라이브러리를 유기용매, 열, 산, 염기, 산화제, 건조 및 계면활성제로 구성된그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 방법으로 1차 처리하고, 단백질 분해효소로 2차 처리한 후 단백질 분해효소에 대하여 내성을 갖는 목적단백질 변이체가 표면 전시된 포자를 선택하여 실시됨을 특징으로 하는 단백질 개량방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 방법은 목적단백질이 표면 전시된 유전자 담체를 스크리닝하는 단계를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 유전자 담체 표면에 결합된 목적단백질의 제조방법.
- 제 2 항, 제 3 항 또는 제 25 항에 있어서, 상기 스크리닝 단계는 (ⅰ) 유전자 담체 표면에 전시된 목적단백질의 활성; (ⅱ) 목적단백질에 표식된 물질을 인식하는 단백질; (ⅲ) 목적단백질에 결합하는 표식된 리간드; 및 (ⅳ) 목적단백질에 특이적으로 결합하는 항체로 구성된 그룹으로부터 선택되는 하나 이상을 이용하여 실시됨을 특징으로 하는 단백질 개량방법.
- 제 26 항에 있어서, 상기 목적단백질에 결합하는 표식된 리간드 또는 목적단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 실시되는 스크리닝 단계는 유세포 분석기를 이용하여 실시됨을 특징으로 하는 단백질의 개량방법.
- 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 비공유결합을 통해 목적단백질이 유전자 담체 표면에 전시가 이루진 다음, 물리적 방법, 화학적 방법 및 생화학적 방법으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 1종 이상의 방법에 의해 목적단백질과 유전자 담체 사이의 결합 또는 목적단백질 사이의 결합이 공유결합으로 변화되어 목적단백질이 유전자 담체 표면에 보다 안정되게 결합되도록 처리하는 단계를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 28 항에 있어서, 상기 공유결합을 형성하기 위하여 처리하는 방법 중 화학적 방법은 글루타르알데히드의 처리이고, 물리적 방법은 자외선의 처리이며, 그리고 생화학적 방법은 공유결합의 형성을 도와주는 효소의 처리인 것을 특징으로 하는 방법.
- 복제원점; 항생제 내성 유전자; 제한효소 자리; 및 목적단백질을 인코딩하는 유전자를 포함하는 목적단백질의 유전자 담체 표면 전시용 벡터에 있어서, 상기 목적단백질을 인코딩하는 유전자는 숙주 세포내에서 발현되는 경우 포자 및 바이러스 로 구성된 그룹으로부터 선택되는 유전자 담체의 표면과 비공유결합할 수 있는 단백질을 인코딩하는 유전자인 것을 특징으로 하는 목적단백질의 유전자 담체 표면 전시용 벡터.
- 제 30 항에 있어서, 상기 목적단백질을 인코딩하는 유전자는 그에 의해 발현되는 목적단백질이 유전자 담체와 비공유결합을 하는 것을 개선하기 위하여 변형된 것임을 특징으로 하는 목적단백질의 유전자 담체 표면 전시용 벡터.
- 제 31 항에 있어서, 상기 변형된 목적단백질을 인코딩하는 유전자는 (ⅰ) 목적단백질의 아미노산 서열 일부를 제거하는 방법; (ⅱ) 목적단백질 또는 상기 (ⅰ)의 방법에 의해 아미노산 서열의 일부가 제거된 목적단백질과 유전자 담체 표면단백질과의 비공유결합을 도와주는 다른 올리고펩타이드 또는 폴리펩타이드와 융합시키는 방법; (ⅲ) 목적단백질을 위치 특이적으로 돌연변이시키는 방법; 및 (ⅳ) 목적단백질을 무작위 돌연변이시키는 방법으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 1종 이상의 방법에 의해 변형된 것임을 특징으로 하는 목적단백질의 유전자 담체 표면 전시용 벡터.
- 포자를 함유한 미생물 및 바이러스를 함유한 세포로 구성된 그룹으로부터 선택된 숙주 세포를 제 30 항 내지 제 32 항 중 어느 한 항의 벡터로 형질전환하여 제조되는 형질전환 미생물.
- 제 33 항에 있어서, 상기 숙주 세포는 상기 목적단백질을 인코딩하는 유전자로부터 발현된 목적단백질의 분해와 관련된 세포내 단백질 분해효소 또는 세포외 단백질 분해효소를 생산하지 못하도록 변형된 것을 특징으로 하는 형질전환 미생물.
- 호르몬, 호르몬 유사체, 효소, 효소저해제, 신호전달단백질 또는 그 일부분, 항체 또는 그 일부분, 단쇄항체, 결합단백질, 결합도메인, 펩타이드, 항원, 부착단백질, 구조단백질, 조절단백질, 독소단백질, 사이토카인, 전사조절 인자, 혈액 응고 인자 및 식물 생체방어 유도 단백질로 구성된 그룹으로부터 선택되는 목적단백질이 포자 및 바이러스로 구성된 그룹으로부터 선택되는 유전자 담체의 표면에 상기 제 1 항의 방법에 의해 비공유결합을 통해 전시되어 있는 유전자 담체-목적단백질의 복합체.
- 제 35 항에 있어서, 상기 목적단백질은 (ⅰ) 목적단백질의 아미노산 서열 일부를 제거하는 방법; (ⅱ) 목적단백질 또는 상기 (ⅰ)의 방법에 의해 아미노산 서열의 일부가 제거된 목적단백질과 유전자 담체 표면단백질과의 비공유결합을 도와주는 다른 올리고펩타이드 또는 폴리펩타이드와 융합시키는 방법; (ⅲ) 목적단백질을 위치 특이적으로 돌연변이시키는 방법; 및 (ⅳ) 목적단백질을 무작위 돌연변이시키는 방법으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 1종 이상의 방법에 의해 변형된 것임을 특징으로 하는 유전자 담체-목적단백질의 복합체.
- 제 35 항에 있어서, 상이 유전자 담체-목적단백질 복합체는 비공유결합을 통해 목적단백질이 유전자 담체 표면에 전시가 이루진 다음, 물리적 방법, 화학적 방법 및 생화학적 방법으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 1종 이상의 방법에 의해 목적단백질과 유전자 담체 사이의 결합 또는 목적단백질 사이의 결합이 공유결합으로 변화되어 목적단백질이 유전자 담체의 표면에 안정하게 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 유전자 담체-목적단백질의 복합체.
- 제 35 항 내지 제 37 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유전자 담체는 포자인 것을 특징으로 하는 유전자 담체-목적단백질의 복합체.
- 제 38 항에 있어서, 상기 포자는 유전학적 방법, 화학적 방법 및 물리적 방법으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 방법에 의해 생식이 불가능하도록 변형된 것을 특징으로 하는 유전자 담체-목적단백질의 복합체.
- 제 39 항에 있어서, 상기 포자 생식을 불가능하게 하는 유전학적인 방법은 숙주 세포의 포자 생식에 관여하는 유전자의 결핍을 통해 실시되는 것을 특징으로 하는 유전자 담체-목적단백질의 복합체.
- 제 38 항에 있어서, 상기 포자는 물리적 방법, 화학적 방법 및 유전학적 방법으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 방법에 의해 응집성이 증가되도록 변형된 것을 특징으로 하는 유전자 담체-목적단백질의 복합체.
- 제 35 항에 있어서, 상기 목적단백질은 모노머 또는 멀티머인 것을 특징으로 하는 유전자 담체-목적단백질의 복합체.
- 제 35 항 내지 제 37 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유전자 담체는 박테리오파아지인 것을 특징으로 하는 유전자 담체-목적단백질의 복합체.
- (a) 목적단백질을 인코딩하는 유전자를 돌연변이시켜 목적단백질 변이체를 인코딩하는 유전자 라이브러리를 구축하는 단계; (b) 상기 구축된 유전자 라이브러리를 포함하는 벡터 라이브러리를 제작하는 단계; (c) 유전자 담체로서의 포자 및 바이러스를 함유하는 숙주 세포를 상기 벡터 라이브러리로 형질전환하는 단계; (d) 상기 형질전환된 숙주 세포를 배양하여 목적단백질 변이체를 발현하는 단계; (e) 상기 발현된 목적단백질 변이체가 상기 유전자 담체 표면과 비공유결합을 통하여 유전자 담체 표면에 전시되도록 하여 유전자 담체 라이브러리를 얻는 단계; 및 (f) 상기 유전자 담체 라이브러리로부터 소망하는 특성을 갖는 목적단백질 변이체가 표면 전시된 유전자 담체를 스크리닝하는 단계를 포함하는 과정에 의해 제조된 목적단백질 변이체가 표면 전시된 유전자 담체 라이브러리.
- 제 44 항에 있어서, 상기 유전자 담체가 포자인 것을 특징으로 하는 유전자 담체 라이브러리.
- 제 44 항에 있어서, 상기 유전자 담체가 박테리오파아지이고, 목적단백질 변이체가 결합도메인 변이체 또는 결합단백질 변이체인 것을 특징으로 하는 유전자 담체 라이브러리.
- 전환 활성을 갖는 단백질을 이용한 생물전환 방법에 있어서, 상기 방법은 전환 활성을 갖는 단백질이 유전자 담체 표면에 전시되어 있는 제 35 항 내지 제 37 항 중에서 어느 한 항의 유전자 담체-목적단백질의 복합체를 이용하는 것을 특징으로 하는 생물전환 방법.
- 제 47 항에 있어서, 상기 전환 활성을 갖는 단백질은 효소 또는 항체인 것을 특징으로 하는 생물전환 방법.
- 척추동물에서 특정 항원에 대한 항체의 생성방법에 있어서, 상기 방법은 목적단백질이 항원이 상기 제 35 항 내지 제 37 항 중 어느 한 항의 유전자 담체-목적단백질 복합체를 척추동물에 투여하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 항체의 생성방법.
- 고체 기판 및 상기 고체 기판에 부착되어 있는 물질을 포함하는 단백질 어레이에 있어서, 상기 고체 기판에 부착되어 있는 물질은 상기 제 35 항, 제 36 항 또는 제 37 항의 유전자 담체-목적단백질 복합체; 및 제 44 항, 제 45 항 또는 제 46 항의 유전자 담체 라이브러리로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 단백질 어레이.
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