CN115261399A - 基于细菌展示和蛋白酶切割的寡肽表达和提纯方法 - Google Patents
基于细菌展示和蛋白酶切割的寡肽表达和提纯方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN115261399A CN115261399A CN202210920430.XA CN202210920430A CN115261399A CN 115261399 A CN115261399 A CN 115261399A CN 202210920430 A CN202210920430 A CN 202210920430A CN 115261399 A CN115261399 A CN 115261399A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- oligopeptides
- oligopeptide
- expression
- bacteria
- protein
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 108010038807 Oligopeptides Proteins 0.000 title claims abstract description 79
- 102000015636 Oligopeptides Human genes 0.000 title claims abstract description 79
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 28
- 238000000746 purification Methods 0.000 title claims abstract description 23
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 title claims abstract description 20
- 239000004365 Protease Substances 0.000 title claims abstract description 20
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 title claims abstract description 20
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 title claims abstract description 20
- 230000007017 scission Effects 0.000 title claims abstract description 20
- 238000002819 bacterial display Methods 0.000 title claims abstract description 18
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 35
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims abstract description 34
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 33
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims abstract description 15
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims abstract description 10
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 claims abstract description 10
- 108010013369 Enteropeptidase Proteins 0.000 claims abstract description 8
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims abstract description 8
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims abstract description 8
- 102100029727 Enteropeptidase Human genes 0.000 claims abstract description 7
- 108010075254 C-Peptide Proteins 0.000 claims abstract description 4
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims abstract description 4
- 238000001035 drying Methods 0.000 claims abstract description 3
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 9
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 9
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 9
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 claims description 6
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 claims description 6
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 claims description 5
- 241000252867 Cupriavidus metallidurans Species 0.000 claims description 4
- 241000589776 Pseudomonas putida Species 0.000 claims description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 4
- 241000186660 Lactobacillus Species 0.000 claims description 3
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 claims description 3
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 claims description 3
- 229940039696 lactobacillus Drugs 0.000 claims description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 3
- ISJKIHHTPAQLLW-TUFLPTIASA-N (2S)-2-[[(2S)-3-(4-hydroxyphenyl)-2-[[(2S)-1-[(2S)-pyrrolidine-2-carbonyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]propanoyl]amino]-4-methylpentanoic acid Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O ISJKIHHTPAQLLW-TUFLPTIASA-N 0.000 claims description 2
- OGNHOGPWQTWKGQ-VGWMRTNUSA-N (2S)-5-amino-2-[[(2S)-1-[2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-1-(2-aminoacetyl)pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]acetyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-5-oxopentanoic acid Chemical compound NCC(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)NCC(=O)N1[C@H](C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O)CCC1 OGNHOGPWQTWKGQ-VGWMRTNUSA-N 0.000 claims description 2
- QTEWJFPLRGWOOU-IHRRRGAJSA-N (2s)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-(3-aminopropanoylamino)-3-(1h-imidazol-5-yl)propanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-(1h-imidazol-5-yl)propanoic acid Chemical compound C([C@H](NC(=O)CCN)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(O)=O)C1=CN=CN1 QTEWJFPLRGWOOU-IHRRRGAJSA-N 0.000 claims description 2
- LDWBQGACJJOIKA-RHEFHGCGSA-N (2s)-2-[[(2s)-6-amino-2-[[(2s,3r)-2-[[(2s,3r)-2-[[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]amino]hexanoyl]amino]-3-hydroxypropanoic acid Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O LDWBQGACJJOIKA-RHEFHGCGSA-N 0.000 claims description 2
- WZHKXNSOCOQYQX-FUAFALNISA-N (2s)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-[[(2r)-2-[[(2s)-2-amino-3-(1h-imidazol-5-yl)propanoyl]amino]-3-(1h-indol-3-yl)propanoyl]amino]propanoyl]amino]-3-(1h-indol-3-yl)propanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]hexanamide Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(N)=O)C1=CN=CN1 WZHKXNSOCOQYQX-FUAFALNISA-N 0.000 claims description 2
- AJLNZWYOJAWBCR-OOPVGHQCSA-N (4s)-4-acetamido-5-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(2s)-5-amino-1-[[(2s)-1-[[(2s)-1-amino-5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-1,5-dioxopentan-2-yl]amino]-4-methylsulfanyl-1-oxobutan-2-yl]amino]-4-car Chemical compound OC(=O)CC[C@H](NC(C)=O)C(=C)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(N)=O AJLNZWYOJAWBCR-OOPVGHQCSA-N 0.000 claims description 2
- 101100295756 Acinetobacter baumannii (strain ATCC 19606 / DSM 30007 / JCM 6841 / CCUG 19606 / CIP 70.34 / NBRC 109757 / NCIMB 12457 / NCTC 12156 / 81) omp38 gene Proteins 0.000 claims description 2
- WPWUFUBLGADILS-WDSKDSINSA-N Ala-Pro Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O WPWUFUBLGADILS-WDSKDSINSA-N 0.000 claims description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 claims description 2
- 101100059000 Bacillus subtilis (strain 168) capA gene Proteins 0.000 claims description 2
- 101100165567 Borrelia bavariensis (strain ATCC BAA-2496 / DSM 23469 / PBi) bmpA2 gene Proteins 0.000 claims description 2
- KNFLNGRLKALWRF-LDXSYGEZSA-N CSCC[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(N)=O)CC1=CC=CC=C1 Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(N)=O)CC1=CC=CC=C1 KNFLNGRLKALWRF-LDXSYGEZSA-N 0.000 claims description 2
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 2
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 claims description 2
- MVORZMQFXBLMHM-QWRGUYRKSA-N Gly-His-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)CC1=CN=CN1 MVORZMQFXBLMHM-QWRGUYRKSA-N 0.000 claims description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 claims description 2
- 108091007573 Multidrug and toxin extrusion transporters Proteins 0.000 claims description 2
- 101100083407 Mycobacterium tuberculosis (strain ATCC 25618 / H37Rv) pgsA1 gene Proteins 0.000 claims description 2
- UEJYSALTSUZXFV-SRVKXCTJSA-N Rigin Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(O)=O UEJYSALTSUZXFV-SRVKXCTJSA-N 0.000 claims description 2
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 claims description 2
- PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N arabinose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N 0.000 claims description 2
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 101150042295 arfA gene Proteins 0.000 claims description 2
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 101150014900 bmpA gene Proteins 0.000 claims description 2
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 claims description 2
- 239000008101 lactose Substances 0.000 claims description 2
- 101150087557 omcB gene Proteins 0.000 claims description 2
- 101150115693 ompA gene Proteins 0.000 claims description 2
- 101150076330 pgsA gene Proteins 0.000 claims description 2
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 claims description 2
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 claims description 2
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 claims description 2
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 claims description 2
- -1 tetrapeptide-9 Chemical compound 0.000 claims description 2
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N lactic acid Chemical compound CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- 235000014655 lactic acid Nutrition 0.000 claims 1
- 239000004310 lactic acid Substances 0.000 claims 1
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 claims 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 abstract description 4
- 241001052560 Thallis Species 0.000 abstract description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 10
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 9
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 8
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 5
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 4
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 3
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 238000002823 phage display Methods 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 2
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- CPYVQXAASIFAMD-KNIFDHDWSA-N (2s)-2-aminobutanedioic acid;(2s)-2,6-diaminohexanoic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O.NCCCC[C@H](N)C(O)=O CPYVQXAASIFAMD-KNIFDHDWSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010016626 Dipeptides Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241001198387 Escherichia coli BL21(DE3) Species 0.000 description 1
- 241000724791 Filamentous phage Species 0.000 description 1
- 108010073429 Type V Secretion Systems Proteins 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 101150063416 add gene Proteins 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000017531 blood circulation Effects 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 1
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000005265 energy consumption Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 1
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000007661 gastrointestinal function Effects 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 239000013067 intermediate product Substances 0.000 description 1
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000006916 protein interaction Effects 0.000 description 1
- 238000009790 rate-determining step (RDS) Methods 0.000 description 1
- 210000000813 small intestine Anatomy 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/035—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal for targeting to the external surface of a cell, e.g. to the outer membrane of Gram negative bacteria, GPI- anchored eukaryote proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/50—Fusion polypeptide containing protease site
Landscapes
- Genetics & Genomics (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本发明涉及一种基于细菌展示和蛋白酶切割的寡肽表达和提纯方法,其特征在于其步骤包括:(1)构建用于在宿主菌表面展示寡肽的质粒,寡肽与展示蛋白之间使用DDDDK氨基酸连接;(2)将质粒转入宿主菌中,诱导表达展示蛋白‑DDDK‑寡肽融合蛋白;(3)离心收集细菌,肠激酶切割DDDDK连接肽,释放出细菌表面的寡肽;(4)离心分离寡肽和细菌,寡肽经超滤后结晶或者干燥,细菌回到步骤(2),重新诱导表达。本发明方法简单高效,无需破碎菌体,也无需进行蛋白纯化,且细菌可以重复利用,是一种高效简便的寡肽生产和提纯工艺,非常适用于工业级规模的寡肽制备工艺。
Description
技术领域
本发明属于蛋白质工程技术领域,特别涉及一种基于细菌展示和蛋白酶切割的寡肽表达和提纯方法。
背景技术
寡肽又称为小肽、低聚肽或称为小分子活性肽,是由2~10个氨基酸彼此缩合形成的化合物,是多肽的一种分类。在20世纪60年代出Newey和Smyth(1959,1960)第一次提供了肽被完整吸收的资料。蛋白质在小肠中被消化成氨基酸与寡肽,且寡肽可以完整的进入肠粘膜细胞并水解成氨基酸进入血液循环。寡肽具有不需要消化直接吸收、吸收时不消耗能量、不增加肠胃功能负担、100%被人体吸收等特点。
传统的寡肽合成主要分为化学合成和生物合成。化学合成利用固相或者液相介质,将肽链依照顺序逐个添加到合成中间产物上。这种化学合成的方法适用于二肽或者三肽的合成,但是对于长一点的寡肽的合成,就会出现反应步骤多,副产物和中间产物多,产量低和提纯困难等问题。生物合成是利用生物系统的蛋白表达技术,将寡肽融合蛋白表达在宿主内部,再经过蛋白纯化和寡肽释放来获得目的寡肽。这种方法的优势是不受寡肽长度和氨基酸序列的影响,可以简单高效地合成寡肽,副产物少,也是目前工业上合成寡肽的重要方法。但生物合成的方法还是需要经过菌株破碎和蛋白纯化的步骤,极大地提高了寡肽的生产成本,也降低了寡肽的合成规模,是寡肽生物合成的重要限速步骤。因此,开发免菌体破碎和蛋白纯化的寡肽生产工艺和提高寡肽的表达效率,对于寡肽的工业化生产而言,具有重要的价值,
1985年,Smith GP第一次将外源基因插入丝状噬菌体f1的基因Ⅲ,创建了噬菌体展示技术,并获得了2018年诺贝尔化学奖。随着噬菌体表面展示技术的发展,表面展示技术成为表达和筛选蛋白和寡肽的重要技术。但是,噬菌体展示技术也存在大蛋白展示困难,噬菌体效价降低等缺陷。因此,在近些年,在细菌表面展示蛋白的技术被开发出来,细菌表面展示技术具有拷贝数多,表达蛋白大小限制小等优点,在蛋白互作、酶催化、靶标蛋白和抗体的筛选等领域具有重要的价值。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于细菌展示和蛋白酶切割的寡肽表达和提纯方法。
为了达到上述目的,所采取的技术解决方案如下:
一种基于细菌展示和蛋白酶切割的寡肽表达和提纯方法,其步骤包括:
(1)构建用于在宿主菌表面展示寡肽的质粒,寡肽与展示蛋白之间使用DDDDK氨基酸连接;
(2)将质粒转入宿主菌中,诱导表达展示蛋白-DDDK-寡肽融合蛋白;
(3)离心收集细菌,肠激酶切割DDDDK连接肽,释放出细菌表面的寡肽;
(4)离心分离寡肽和细菌,寡肽经超滤后结晶或者干燥。细菌可回到第(2)步重复使用。
其中DDDDK连接肽指的天冬氨酸-天冬氨酸-天冬氨酸-天冬氨酸-赖氨酸组成的五肽,可以被肠激酶识别和切割。
优选的,所述寡肽为长度在2-50个氨基酸的短肽。
优选的,所述寡肽为二肽-1、AP二肽、三肽-1、三肽-5、三肽-8、谷胱甘肽(GSH)、四肽-5、四肽-7、四肽-9、四肽-11、五肽-4、六肽-2、六肽-3、六肽-9、九肽-1、十肽-4。
优选的,所述宿主菌为大肠杆菌、芽孢杆菌、乳酸菌、恶臭假单胞菌或真氧产碱杆菌。
优选的,所述展示蛋白为大肠杆菌的Omp家族系列蛋白、冰核蛋白INP、自转运蛋白Ag43蛋白;芽孢杆菌的Cot家族系列蛋白;乳酸菌的PgsA、BmpA、M6蛋白;恶臭假单胞菌的MATE蛋白;或真氧产碱杆菌的FhuA、IgA、OmpA。
优选的,所述宿主菌为大肠杆菌。
优选的,步骤(2)中采用电转法或者氯化钙转化法将质粒转入宿主菌中。
优选的,步骤(2)中采用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)、乳糖、阿拉伯糖或者四环素诱导融合蛋白表达,根据质粒中的操纵子来确定诱导剂。
优选的,步骤(4)中离心条件为5000-10000rpm离心2-10min。
优选的,步骤(4)中取离心后的上清,采用3kDa的超滤膜,用超滤离心的方法分离寡肽和大分子蛋白,在超滤离心的作用下,寡肽穿过超滤膜,大分子蛋白截留在超滤膜上。
优选的,步骤(4)中分离的细菌可重复被诱导,继续表达展示蛋白-DDDK-寡肽融合蛋白。
本发明的基于细菌展示和蛋白酶切割的寡肽表达和提纯技术,将寡肽展示在细菌的表面,寡肽与展示蛋白之前使用DDDDK氨基酸序列连接。将构建的展示质粒转入宿主菌中,通过诱导产生展示蛋白-DDDDK-寡肽融合蛋白,展示在宿主菌的表面。通过离心收集菌体,使用肠激酶切割DDDDK肽释放出细菌表面的寡肽,再通过离心和超滤分离菌体和寡肽。这种方法简单高效,无需破碎菌体,也无需使用亲和层析进行蛋白纯化,大幅度缩短了纯化时长,且细菌可以重复利用,降低了生产成本,是一种高效简便的寡肽生产和提纯工艺,非常适用于工业级规模的寡肽制备。
附图说明
图1Lpp-OmpA蛋白展示DDDDK-寡肽质粒图谱。
图2INP蛋白展示DDDDK-寡肽质粒图谱。
图3细菌展示DDDDK-寡肽示意图。
图4细菌展示寡肽和蛋白酶切割表达和提纯寡肽流程示意图。
图5HPLC检测基于大肠杆菌展示和蛋白酶切割方法表达和提纯的寡肽效果。
具体实施方式
下面通过表达纯化寡肽对细菌表面展示寡肽的纯化的构建及验证。对本发明做进一步说明,这些具体实施例不应以任何方式被解释为限制本发明的应用范围。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
在本实施例中,公布了基于大肠杆菌(BL21)展示寡肽的方法。展示蛋白Lpp-OmpA蛋白或者INP的C端连接肠激酶酶切位点DDDK与目标寡肽融合,质粒图谱见图1和图2,pET28a骨架来自Addgene,利用大肠杆菌展示和制备寡肽的示意图见图3和图4。
构建好图1或图2图谱中的质粒后,转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,在含抗性的LB培养基固体平板中涂布,37℃培养过夜后,挑取单克隆在LB培养基中培养至OD600值达到0.6-0.8,加入1mM终浓度IPTG诱导4-12h后,5000rpm离心10min后,用PBS清洗沉淀2次后,加入25mM pH8.0的Tris-HCl与1~3U肠激酶(Enterokinase,Recombinant),在25℃室温孵育过夜后,12000rpm离心取上清,使用3kD超滤管,8000rpm离心20min,流传液经HPLC检测。沉淀用LB培养基悬浮后,加入IPTG重新诱导表达展示寡肽。
本发明利用细菌展示和蛋白酶切割的寡肽表达和提纯技术表达了各种小分子肽,结果见图5和表1,提纯的寡肽产量高、纯度高好。这说明本发明方法具有操作简单、成本低、产物产量和纯度高等特点,适用于大规模寡肽的工业化生产和制备。
表1
Claims (10)
1.一种基于细菌展示和蛋白酶切割的寡肽表达和提纯方法,其特征在于其步骤包括:
(1)构建用于在宿主菌表面展示寡肽的质粒,寡肽与展示蛋白之间使用DDDDK氨基酸连接;
(2)将质粒转入宿主菌中,诱导表达展示蛋白-DDDK-寡肽融合蛋白;
(3)离心收集细菌,肠激酶切割DDDDK连接肽,释放出细菌表面的寡肽;
(4)离心分离寡肽和细菌,寡肽经超滤后结晶或者干燥,细菌回到步骤(2),重新诱导表达。
2.权利要求1所述的基于细菌展示和蛋白酶切割的寡肽表达和提纯方法,其特征在于:所述寡肽为长度在2-50个氨基酸的短肽。
3.权利要求2所述的基于细菌展示和蛋白酶切割的寡肽表达和提纯方法,其特征在于:所述寡肽为二肽-1、AP二肽、三肽-1、三肽-5、三肽-8、谷胱甘肽、四肽-5、四肽-7、四肽-9、四肽-11、五肽-4、六肽-2、六肽-3、六肽-9、九肽-1、十肽-4。
4.权利要求1所述的基于细菌展示和蛋白酶切割的寡肽表达和提纯方法,其特征在于:所述宿主菌为大肠杆菌、芽孢杆菌、乳酸菌、恶臭假单胞菌或真氧产碱杆菌。
5.权利要求4所述的基于细菌展示和蛋白酶切割的寡肽表达和提纯方法,其特征在于:所述展示蛋白为大肠杆菌的Omp家族系列蛋白、冰核蛋白INP、自转运蛋白Ag43蛋白;芽孢杆菌的Cot家族系列蛋白;乳酸菌的PgsA、BmpA、M6蛋白;恶臭假单胞菌的MATE蛋白;或真氧产碱杆菌的FhuA、IgA、OmpA。
6.权利要求1所述的基于细菌展示和蛋白酶切割的寡肽表达和提纯方法,其特征在于:所述宿主菌为大肠杆菌。
7.权利要求1所述的基于细菌展示和蛋白酶切割的寡肽表达和提纯方法,其特征在于:步骤(2)中采用电转法或者氯化钙转化法将质粒转入宿主菌中。
8.权利要求1所述的基于细菌展示和蛋白酶切割的寡肽表达和提纯方法,其特征在于:步骤(2)中采用异丙基硫代半乳糖苷、乳糖、阿拉伯糖或者四环素诱导融合蛋白表达。
9.权利要求1所述的基于细菌展示和蛋白酶切割的寡肽表达和提纯方法,其特征在于:步骤(4)中离心条件为5000-10000rpm离心2-10min。
10.权利要求1所述的基于细菌展示和蛋白酶切割的寡肽表达和提纯方法,其特征在于:步骤(4)中取离心后的上清,采用3kDa的超滤膜,用超滤离心的方法分离寡肽和大分子蛋白。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202210920430.XA CN115261399A (zh) | 2022-08-02 | 2022-08-02 | 基于细菌展示和蛋白酶切割的寡肽表达和提纯方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202210920430.XA CN115261399A (zh) | 2022-08-02 | 2022-08-02 | 基于细菌展示和蛋白酶切割的寡肽表达和提纯方法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN115261399A true CN115261399A (zh) | 2022-11-01 |
Family
ID=83747296
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202210920430.XA Pending CN115261399A (zh) | 2022-08-02 | 2022-08-02 | 基于细菌展示和蛋白酶切割的寡肽表达和提纯方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN115261399A (zh) |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN103045632A (zh) * | 2013-01-03 | 2013-04-17 | 吉林大学 | 一种蛋白质表达质粒及其在将蛋白展示在细胞表面并自动释放出来方面的应用 |
CN105164260A (zh) * | 2013-03-13 | 2015-12-16 | 自动显示生物技术有限公司 | 功能性蛋白在范围广泛的革兰氏阴性细菌中的改善的表面展示 |
US20180002687A1 (en) * | 2007-07-26 | 2018-01-04 | The Regents Of The University Of California | Methods for Enhancing Bacterial Cell Display of Proteins and Peptides |
CN109879970A (zh) * | 2019-03-14 | 2019-06-14 | 美药星(南京)制药有限公司 | 一种融合蛋白及其制备利拉鲁肽中间体多肽的方法 |
-
2022
- 2022-08-02 CN CN202210920430.XA patent/CN115261399A/zh active Pending
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20180002687A1 (en) * | 2007-07-26 | 2018-01-04 | The Regents Of The University Of California | Methods for Enhancing Bacterial Cell Display of Proteins and Peptides |
CN103045632A (zh) * | 2013-01-03 | 2013-04-17 | 吉林大学 | 一种蛋白质表达质粒及其在将蛋白展示在细胞表面并自动释放出来方面的应用 |
CN105164260A (zh) * | 2013-03-13 | 2015-12-16 | 自动显示生物技术有限公司 | 功能性蛋白在范围广泛的革兰氏阴性细菌中的改善的表面展示 |
CN109879970A (zh) * | 2019-03-14 | 2019-06-14 | 美药星(南京)制药有限公司 | 一种融合蛋白及其制备利拉鲁肽中间体多肽的方法 |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
SABINE TASCHNER 等: "Selection of peptide entry motifs by bacterial surface display" * |
徐黎明 等: "筛选Fab 抗体库的细菌展示技术的建立" * |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN104619726B (zh) | 由超折叠绿色荧光蛋白构成的融合蛋白及其用途 | |
CN104755502B (zh) | 多肽的产生和纯化方法 | |
CN107245494B (zh) | Aβ42在大肠杆菌中的高效可溶性表达及纯化方法 | |
US20050158838A1 (en) | Novel enterokinase cleavage sequences | |
JPH11511983A (ja) | 細胞表面における物質の付着およびディスプレイに関連する材料および方法 | |
CN113025675B (zh) | 多肽的制备方法 | |
AU774216B2 (en) | Purification of recombinant proteins fused to multiple epitopes | |
CN113025598A (zh) | 一种利用sumo融合表达系统制备重组肝素酶iii的方法及其所制备的sumo_肝素酶iii融合蛋白 | |
US6906176B2 (en) | Enterokinase cleavage sequences | |
CN114790474A (zh) | 一种索马鲁肽的制备方法 | |
CN115261399A (zh) | 基于细菌展示和蛋白酶切割的寡肽表达和提纯方法 | |
WO2014177021A1 (zh) | 强分泌性信号肽增强小肽模序及其应用 | |
CN115197953A (zh) | 基于大肠杆菌展示和内含肽切割的寡肽表达和提纯方法 | |
JP7016552B2 (ja) | 組換えタンパク質の分泌を増加させる方法 | |
CN114736309A (zh) | 一种基于离心法的寡肽合成及纯化方法 | |
CN113493780A (zh) | 一种利用sumo融合表达系统制备重组肝素酶ii的方法及其所制备的sumo_肝素酶ii融合蛋白 | |
CN107629129A (zh) | 生产和纯化多肽的方法 | |
CN113025599A (zh) | 一种重组溶组织梭菌i型胶原酶及其制备方法和应用 | |
CN115261398A (zh) | 基于噬菌体展示和内含肽切割的寡肽表达和提纯方法 | |
CN117362401A (zh) | 一种牛病毒性腹泻病毒n蛋白及其作为自我切割蛋白的应用 | |
CN117801123B (zh) | 沃索利肽可溶性中间体、中间体制备方法及沃索利肽的制备方法 | |
CN116855470B (zh) | 酰基转移酶MsAcT变体、融合蛋白及其固定方法和应用 | |
WO2022179552A1 (zh) | 一种经修饰的神经毒素的单链多肽及其用途 | |
WO2022179556A1 (zh) | 一种经修饰的毒素多肽的制备方法 | |
US20240228533A9 (en) | Preparation method for modified toxin polypeptide |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20221101 |
|
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |