CN113584056A - 靶蛋白-内含肽-磁小体融合基因及其构建的产物自动提纯的智能细菌表达系统和制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种靶蛋白‑内含肽‑磁小体融合蛋白及其构建的产物自动提纯的智能细菌和制备方法，其中，融合蛋白是由靶蛋白、内含肽以及磁小体膜蛋白之间直接串联连接或通过柔性Linker可操作地连接构成；本发明还提供了一种靶蛋白‑内含肽‑磁小体融合基因，融合基因包括磁小体膜蛋白基因的上游序列、纳米抗体基因、内含肽基因、磁小体膜蛋白基因和磁小体膜蛋白基因的下游序列；本发明还提供了通过靶蛋白‑内含肽‑磁小体融合基因构建的产物自动提纯的智能细菌；本发明的智能细菌较传统原核生物表达系统具有靶蛋白提纯条件温和、无需外加试剂、成本低、操作简单、纯度高，且对靶蛋白的产量等影响小。

Description

靶蛋白-内含肽-磁小体融合基因及其构建的产物自动提纯的 智能细菌表达系统和制备方法

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及靶蛋白-内含肽-磁小体融合基因及其构建的产物自动提纯的智能细菌表达系统和制备方法。

背景技术

细菌具有代时短、可高密度生产、培养基成分简单等特点，使其成为无需转录或翻译后修饰的简单异源基因表达的首选。大肠杆菌除了具备细菌一般的特点，因其遗传学背景最为清晰，易于操作，是实验室以及工业生产中最为青睐的。蛋白异源表达是为了获得高产量有功能的蛋白产物，这就要求首先将细胞破碎释放出靶蛋白，接着从细胞碎片中筛选出靶蛋白。细胞破碎有物理、化学以及酶法，典型的蛋白纯化涉及各种层析等多步骤。实际生产中，需要对各步骤的工艺条件进行摸索，每一次的条件摸索都不可避免的会导致蛋白产量降低、活性降低或功能的破坏。也就是说，步骤越繁杂，对蛋白造成的破坏会越严重。报道显示，在工业和药用蛋白的大规模生产中，后续蛋白纯化产生的费用高达整个工艺流程产生费用的80％。

发明内容

为了解决以上技术问题，本发明提供了一种靶蛋白-内含肽-磁小体融合蛋白及其构建的产物自动提纯的智能细菌表达系统和制备方法。首先以同源双交换的方法将靶蛋白基因整合到宿主菌(磁螺菌)的基因组上，选择的锚定蛋白为MamC；其次，将裂解酶基因以及核酸酶基因游离表达在上述重组菌株的基因组外。本方法首次以宿主菌合成的磁颗粒为载体并且全程利用宿主菌自身的工程酶绿色提纯外源靶蛋白。

本发明提供了一种靶蛋白-内含肽-磁小体融合基因，融合基因包括磁小体膜蛋白基因的上游序列、靶蛋白基因、内含肽基因、磁小体膜蛋白基因和磁小体膜蛋白基因的下游序列，融合基因的结构如下：磁小体膜蛋白基因的上游序列-纳米抗体基因-内含肽基因-磁小体膜蛋白基因-磁小体膜蛋白基因的下游序列。

其中，磁小体膜蛋白基因的上游序列如SEQ ID NO:7所示，磁小体膜蛋白基因的下游序列如SEQ ID NO:8所示

优选地，融合基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。

本发明还提供了一种编码靶蛋白-内含肽-磁小体融合基因的融合蛋白，该融合蛋白是由靶蛋白、内含肽以及磁小体膜蛋白之间依次直接串联连接或通过柔性Linker可操作地连接构成。

其中，靶蛋白包括利用噬菌体展示技术获得的能够特异性识别抗原的纳米抗体。内含肽来自嗜热菌(Pyrococcus abyssi)的某段内含肽序列，序列来源是公开的嗜热菌基因数据库。磁小体膜蛋白来自于趋磁细菌。

优选地，纳米抗体为四溴双酚A特异性纳米抗体，其氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示，编码纳米抗体的基因序列如SEQ ID NO:4所示。

优选地，内含肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示，编码内含肽的基因序列如SEQID NO:5所示。

优选地，磁小体膜蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示，编码膜蛋白的基因序列如SEQ ID NO:6所示。

优选地，纳米抗体-内含肽-磁小体融合蛋白为四溴双酚A特异性纳米抗体-内含肽-磁小体膜蛋白的融合蛋白。也可将融合蛋白中的四溴双酚A特异性纳米抗体替换成其他靶蛋白。

本发明还提供了一种含有靶蛋白-内含肽-磁小体融合基因的生物材料，生物材料还包括重组DNA、表达盒、转座子、质粒载体、噬菌体载体、病毒载体或工程菌中的一种或多种。

本发明还提供了一种智能细菌表达系统，智能细菌表达系统是在磁螺菌中整合融合基因、表达裂解酶的基因和表达核酸酶的基因，裂解酶的基因具有如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，所述核酸酶的基因具有如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。

优选地，智能细菌表达系统通过以下方法构建：(1)将靶蛋白-内含肽-磁小体融合基因插入到自杀质粒的多克隆位点处得重组质粒1，(2)将重组质粒1转移至野生型磁螺菌中，制得重组磁螺菌；(3)将裂解酶基因以及核酸酶基因串联插入到穿梭质粒的多克隆位点处得重组质粒2；(4)将重组质粒2转移至重组磁螺菌中，即得智能细菌表达系统。

优选地，裂解酶来自λ噬菌体，编码裂解酶基因序列如SEQ ID NO:1所示。

优选地，核酸酶来自金黄色葡萄球菌，编码核酸酶基因序列如SEQ ID NO:2所示。

优选地，本发明利用质粒pK18mobSacB构建融合蛋白基因的表达载体。即，将磁小体膜蛋白基因的上游序列-纳米抗体基因-内含肽基因-磁小体膜蛋白基因-磁小体膜蛋白基因的下游序列插入到自杀质粒的多克隆位点处得到的重组质粒。

优选地，本发明利用质粒pBBR1MCS-2构建核酸酶和裂解酶基因的表达载体。即，将核酸酶基因和裂解酶基因以串联的方式插入到穿梭质粒的多克隆位点处得到的重组质粒。

优选地，步骤(3)重组质粒2的制备方法如下：PCR扩增分别获得核酸酶基因和裂解酶基因，并分别插入到穿梭质粒中，制得重组质粒2，步骤(4)制备智能细菌表达系统的具体步骤为：将重组质粒2转化进供体菌株E.coli S17-1(大肠杆菌)中，再将供体菌株E.coliS17-1胞内的重组质粒转化至步骤(2)制得的重组质粒1中，抗性筛选，即得智能细菌表达系统。

本发明还提供一种重组磁螺菌，将融合蛋白基因或聚核苷酸通过质粒转移进磁螺菌中或通过基因工程手段整合到磁螺菌染色体上。

优选地，磁螺菌为Magnetospirillumgryphiswaldensense，更优选M.gryphiswaldense MSR-1。

重组磁螺菌的构建方法如下：将SEQ ID NO:3所示的聚核苷酸(融合基因)构建到pK18mobSacB载体的多克隆位点处，所得重组载体转移进M.gryphiswaldense MSR-1，筛选重组子1；接着将SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的聚核苷酸构建到pBBR1MCS-2载体的多克隆位点处，所得重组载体转移进重组子1，筛选得最终重组子2。

本发明还提供了一种重组菌株及其构建方法，该重组菌株合成的纳米磁小体表面能够展示靶蛋白。具体为将靶蛋白基因与磁小体膜蛋白基因进行融合，融合基因插入到自杀质粒的多克隆位点处得重组质粒，将重组质粒转移至野生型磁螺菌中，获得的重组磁螺菌即可在磁小体膜上展示靶蛋白。

本发明还提供了一种靶蛋白-内含肽-磁小体免疫磁珠复合物，靶蛋白-磁小体复合物是对智能细菌表达系统进行培养，并从培养物中通过磁性吸附得到的。

本发明还利用智能细菌表达系统制备的靶蛋白-内含肽-磁小体免疫磁珠复合物，复合物的制备方法包括以下步骤：对智能细菌表达系统进行培养，离心收集细胞，在细胞自裂解后提取靶蛋白-内含肽-磁小体免疫磁珠复合物。

进一步地，本发明提供基于基因工程技术制备靶蛋白-磁小体复合物的方法，包括以下步骤：

1、构建携带锚定蛋白基因上游臂基因、靶蛋白-内含肽-锚定蛋白的融合基因、锚定蛋白基因下游臂基因的重组自杀质粒；

2、通过双亲接合实验将上述重组自杀质粒转移至野生型M.gryphiswaldense中，依次通过抗生素和蔗糖筛选，由菌落PCR验证以及磁响应验证确定筛选获得的阳性克隆菌株；

本发明提供了一种重组菌株及其构建方法，该菌株能够提纯自身表达的蛋白产物。具体为将核酸酶基因和裂解酶基因以串联的方式插入到穿梭质粒的多克隆位点处得重组质粒，将重组质粒转移至重组磁螺菌中，获得的重组磁螺菌即可提纯自身的蛋白产物。

本发明提供利用重组磁螺菌表达提纯靶蛋白，包括在发酵培养基中对重组磁螺菌进行培养，收集细胞株，细胞自我裂解提纯靶蛋白；

进一步地，方法包括细胞收集，重悬，裂解，粘度降低，磁性吸附靶蛋白—细胞器复合物，温控靶蛋白释放。

本发明还利用靶蛋白-内含肽-磁小体免疫磁珠复合物纯化靶蛋白的方法，方法将靶蛋白-内含肽-磁小体免疫磁珠复合物重悬，30℃-50℃恒温孵育至靶蛋白释放。

本发明还提供了一种产物自动提纯的智能细菌表达系统表达系统的构建方法如下：

(1)PCR扩增分别得磁小体膜蛋白基因的上游基因SEQ ID NO:7、纳米抗体基因SEQID NO:4、内含肽基因SEQ ID NO:5、磁小体膜蛋白基因SEQ ID NO:6以及磁小体膜蛋白基因的下游基因SEQ ID NO:8，通过融合PCR技术将SEQ ID NO:7-SEQ ID NO:4-SEQ ID NO:5-SEQ ID NO:6-SEQ ID NO:8拼接得到融合基因SEQ ID NO:3。将融合基因SEQ ID NO:3插入到pMD19-T simple载体中，并转化进E.coli DH5α感受态细胞中，挑取单菌落测序，获得正确序列的融合基因SEQ ID NO:3；

(2)利用限制性内切酶酶切得到pMD19-T simple载体上的SEQ ID NO:3序列，插入到具有相同酶切位点的pK18mobSacB载体的多克隆位点处，构建得到的重组质粒转化E.coli S17-1感受态细胞；

(3)将步骤(2)中供体菌E.coli S17-1胞内的重组质粒转移至野生型M.gryphiswaldensense MSR-1中，依次于抗生素和蔗糖存在的条件下筛选出融合基因整合到M.gryphiswaldensense MSR-1基因组上的重组菌株。

(4)PCR扩增分别得核酸酶基因SEQ ID NO:2和裂解酶基因SEQ ID NO:1，并分别插入到pMD19-T simple载体中，转化进相应的E.coli DH5α感受态细胞中，挑取单菌落测序，获得正确序列的融合基因SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:1；

(5)利用限制性内切酶酶切得到pMD19-T simple载体上的SEQ ID NO:2和SEQ IDNO:1，插入到具有相同酶切位点的pBBR1MCS-2载体的多克隆位点处，构建得到的重组子转化E.coli S17-1感受态细胞；

(6)将步骤(5)中供体菌E.coli S17-1胞内的重组质粒转移至步骤(3)中的重组磁螺菌中，抗性筛选得智能细菌表达系统。

前述的方法，步骤(1)中用于扩增SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQID NO:6和SEQ ID NO:8的PCR反应体系为：2×pfu Mix 25μl；正向引物1.25μl；反向引物1.25μl；双蒸水21.25μl；模板DNA 1.25μl。反应条件为：预变性95℃5min；变性95℃30s，退火55℃-65℃，延申72℃30s或1min，30个循环；最终延伸72℃10min；保存25℃1min。

用于扩增SEQ ID NO:7的正向引物如下：

CCGGAATTCGGCGCAGTTTCGTCTCAGG；

反向引物如下：

GAGCTGCAACTGCATCATCGCTGTTGTCCT；

用于扩增SEQ ID NO:4的正向引物：ATGCAGTTGCAGCTCGTGGAG；反向引物为：ATGGTGATGG TGATGGTG；用于扩增SEQ ID NO:5的正向引物为：CACCATCACCATCACCATTCCGGCGGTGGTGGAC；反向引物为：CAGATCTTCTTCGCTAAT；用于扩增SEQ ID NO:6的正向引物为：ATTAGCGAAGAAGATCTGTCTGGTGGCGGCGGTTCC；反向引物为：TCAGGCCAATTCTTCCCTCAG；用于扩增SEQ ID NO:8的正向引物为：TGAGGGAAGAATTGG；反向引物为：GCTCTAGAAGAACAAGGCAGAGGCGAT。

前述的方法，步骤(2)中用于扩增SEQ ID NO:3的PCR反应体系为：2×Pfu 25μl；正向引物0.5μl；反向引物0.5μl；双蒸水23.5μl；模板DNA 0.5μl。反应条件为：预变性95℃5min；变性95℃30s，退火55℃-65℃，延申72℃3min，30个循环；最终延伸72℃10min；保存25℃1min。

用于扩增SEQ ID NO:3的正向引物如下：

CCGGAATTCGGCGCAGTTTCGTCTCAGG；反向引物如下：

GCTCTAGAAGAACAAGGCAGAGGCGAT。

前述的方法，步骤(4)中用于扩增SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:1的PCR反应体系为：2×pfu Mix 25μl；正向引物1.25μl；反向引物1.25μl；双蒸水21.25μl；模板DNA 1.25μl。反应条件为：预变性95℃5min；变性95℃30s，退火55℃-65℃，延申72℃30s或1min，30个循环；最终延伸72℃10min；保存25℃1min。

用于扩增SEQ ID NO:2的正向引物如下：

TAGCGCAGGCTTCACAAACAGATAATGGCGTAAAT；

反向引物如下：

GAAGATCTTCAAGCGTAGTCCGGAACGTCGTACGGGTATTGACCTGAATCAGCGTTG；

用于扩增SEQ ID NO:1的正向引物如下：

CGTTGTGGTAGTGAGATGGTAGAAATCAAT；

反向引物如下：

GCTCTAGACTACTTGTCATCGTCGTCCTTGTAATCTCGATATGGGCAACTTCT。

前述的方法，步骤(2)中使用的限制性内切酶分别为：EcoR I和Xba I。

前述的方法，步骤(3)中使用的抗生素为卡那霉素，蔗糖浓度为10％。

前述的方法，步骤(5)中使用的限制性内切酶分别为：BamH I、Bgl II和Xba I

前述的方法，步骤(6)中使用的抗生素为卡那霉素。

本发明提供产物自动提纯的智能细菌表达系统表达系统用于四溴双酚A特异性纳米抗体的纯化。

智能细菌表达系统表达系统是能够发生自裂解，同时破碎细胞液的粘度降低，磁场分离靶蛋白-细胞器复合物与细胞碎片，最终，靶蛋白从细胞器表面释放提纯的整个过程；其中，细菌是Magnetospirillum gryphiswaldensense MSR-1重组菌株；细胞器是来自MSR-1的磁小体；靶标蛋白是利用噬菌体展示技术获得的纳米抗体；自裂解是细菌在胞质内异源表达的λ噬菌体的Lysis蛋白介导的细胞自我裂解过程；粘度降低是细菌在周质空间异源表达的金葡菌核酸酶介导的细菌基因组的自我降解过程；靶蛋白-细胞器复合物是纳米抗体与磁小体膜蛋白融合蛋白；自动释放是内嵌在纳米抗体与磁小体膜蛋白之间的热敏性内含肽介导的蛋白自我剪切过程，其中，Lysis蛋白是λ噬菌体的R、Rz和Rz1蛋白，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1；金葡菌核酸酶是Snase(EC 3.1.31.3)，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2。

本发明还提供了应用智能细菌表达系统自动提纯四溴双酚A特异性纳米抗体的方法，所述方法包括以下步骤：

A、智能细菌表达系统培养条件的确定：

1)将冻纯的智能细菌表达系统在乳酸钠普通培养基中连续活化两次；

2)对活化后的智能细菌表达系统进行培养；

3)在磁响应(Cmag值)最高时收集细胞，细胞自裂解后提取四溴双酚A纳米抗体-磁小体复合物，热诱导四溴双酚A纳米抗体的释放，ELISA检测四溴双酚A纳米抗体的功能；

B、纳米抗体-磁小体免疫磁珠复合物纯化条件的确定：

1)细胞重悬：按照1g菌泥：100μL缓冲液(10mM CaCl+10mM PBS pH 7.4)的比例重悬菌体(菌体刚好能重悬)；

2)破碎细胞：

滴加一滴氯仿于步骤1)中，震荡加速细胞的裂解；

3)纳米抗体-磁小体复合物的纯化：

将步骤2)制得的细胞破碎液用40mL的PBS(pH 7.4)重悬后，静置在强力磁铁上(4℃)，待复合物已被吸附至容器底部后，测定上清的OD₂₆₀和OD₂₈₀值，弃上清，用等体积的PBS重悬沉淀，重复磁铁吸附的过程，待上清OD₂₆₀和OD₂₈₀低于0.05时，说明复合物已经纯化好。

4)纳米抗体的收集：

将步骤3)中的复合物用PBS重悬，40℃恒温孵育至四溴双酚A纳米抗体的释放，ELISA检测。

本发明至少具有下列优点及有益效果：

(一)采用本发明方法构建获得的重组磁螺菌，核酸酶表达在周质空间，裂解酶表达在细胞质中，外源蛋白对细胞无毒性，不影响细胞的正常生长，同时该系统在人工控制下发生自裂解释放的细胞内溶物，不仅细胞液粘度低且无核酸污染；

(二)采用本发明方法构建获得的重组磁螺菌合成的磁小体表面展示着功能性靶蛋白，复合物之间的内含肽自我剪切后，可以一步获得高纯度的靶蛋白，简化了靶蛋白的生产、纯化的成本，同时降低了传统靶蛋白纯化的方法带来的低产、功能损失、活性降低等的危险；

(三)采用本发明方法构建获得的重组磁螺菌合成的磁小体表面展示的是功能性纳米抗体，内含肽不发生自我剪切时，该复合物可同时具有磁性分离和对相应抗原识别的双重功能。不仅可用于目标抗原的ELISA检测及应用，还可以用于目标抗原的吸附和富集。本发明基于基因工程技术制备出纳米抗体-磁小体免疫磁珠复合物，相较传统的化学偶联方法具有生产成本低、周期短、易于纯化等明显优势；

(四)采用本发明构建获得的重组磁螺菌控制靶蛋白基因-内含肽基因-磁小体膜蛋白基因融合基因的转录和表达的元件仍是原基因组上的控制元件，靶蛋白的表达稳定；核酸酶和裂解酶基因由质粒控制元件控制，在细胞分裂过程中即便有部分菌株丢失质粒，但整个群体中依然有核酸酶和裂解酶的表达，不影响最后细胞破碎和蛋白纯化的效果以及靶蛋白的产量；

(五)本发明提供的特异性识别小分子四溴双酚A的纳米抗体-内含肽-磁小体免疫磁珠复合物，基于此复合物可以开发其他展示在磁小体表面靶蛋白的纯化，应用前景广阔。

附图说明

图1为本发明实施例4中重组磁螺菌的电镜照片。

图2为本发明实施例6中采用竞争法ELISA利用纯化的纳米抗体检测小分子四溴双酚A的结果，基于anti-TBBPA Nb-磁小体ELISA检测结果显示IC₅₀值为0.23ng/mL，线性检测范围(IC₂₀-IC₈₀)是0.06-0.6ng/mL，最低检测线为0.025ng/mL。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

实施例1重组自杀质粒的构建

1、利用表1引物、高保真pfu酶，分别PCR扩增mamC上游臂基因、抗四溴双酚A的纳米抗体基因、内含肽基因、mamC基因以及mamC下游臂基因。PCR体系和条件如下：

PCR体系(50μl)：

PCR条件(变性→退火→延伸：30个循环)：

表1 PCR扩增所用引物

注：下划线为酶切位点序列。

2、按照天根生化科技(北京)有限公司的琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒的说明书将步骤1中的PCR扩增产物进行切胶回收；

3、采用融合PCR技术将步骤2中回收获得的各基因片段进行3步融合PCR扩增：

首先是纳米抗体基因、内含肽基因与mamC基因的融合扩增得融合基因1，反应体系和条件如下：

PCR体系(50μl)：

PCR条件(变性→退火→延伸：30个循环)：

接着是融合基因1与mamC上游臂基因的融合得融合基因2，反应体系和条件如下：

PCR体系(50μl)：

PCR条件(变性→退火→延伸：30个循环)：

随后是融合基因2与mamC下游臂基因的融合得融合基因TBInC，反应体系和条件如下：

PCR体系(50μl)：

PCR条件(变性→退火→延伸：30个循环)：

最后是将TBInC融合基因的3′末端加上“A”，供后续实验备用，即在上述反应体系中加10μl的2×Taq PCR Mix于72℃条件下反应30min。

4、将步骤3中的融合基因TBInC连接到pMD19-T simple(购自TaKaRa)质粒上，通过化学转化的方法，将连接产物转化进DH5α细胞中，涂布于含有氨苄抗生素的LB固体平板进行筛选，挑取单克隆，菌落PCR验证后，送公司测序，验证融合基因的正确性。

融合基因TBInC连接到pMD19-T simple上的反应体系为：4.5μlPCR产物；5μlSolution I；0.5μl pMD19-T simple。

融合基因TBInC连接到pMD19-T simple上的反应条件为：16℃2h。

LB培养基的配方(1L)：10g蛋白胨；5g酵母粉；10g NaCl；15g琼脂粉。

5、EcoR I和Xba I(购自TaKaRa)双酶切得TBInC基因片段和pK18mobSacB载体片段。

酶切体系：

反应条件：37℃，约3h。

6、T4 DNA Ligase(购自TaKaRa)连接TBInC与pK18mobSacB得重组质粒pKuTBInCd。

连接体系：

反应条件：16℃，约20h。

7、最后将重组质粒通过化学转化的方法，转化进供体菌株E.coli S17-1中。

实施例2重组表达菌株1的筛选

通过双亲接合实验将实施例1中供体菌株E.coli S17-1胞内的重组质粒pKuTBInCd转化至受体菌株M.gryphiswaldensense MSR-1中。具体为：1)S17-1单菌落接种于4ml液体LB中，37℃，200rpm培养过夜；2)S17-1按10％的比例接种于无抗生素的液体LB中(200μl S17-1+2ml LB)，30℃，150rpm，培养3h；3)MSR-1在乳酸钠培养基中活化2次，第三次培养至OD₅₆₅为0.8-1.0；4)分别取2)中300μl培养后的S17-1和3)中1ml MSR-1进行混合，12,000rpm离心1min，在超净工作台中弃上清；5)用1ml谷氨酸钠选择性培养基洗菌体，12,000rpm离心1min，在超净工作台中弃上清，重复一次；6)用50μl谷氨酸钠选择培养基重悬5)中的菌体，然后将菌体重悬液滴在没有抗生素的谷氨酸钠固体选择性培养基上的微孔滤膜上，Parafilm封口，于30℃正置接合过夜；7)用1ml谷氨酸钠选择性培养基洗下微孔滤膜上的菌体，于30℃，100rpm的摇床中复壮2h；8)12,000rpm离心1min，留约100μl的上清重悬菌体，并将重悬好的菌体涂于含有卡纳抗生素的谷氨酸钠固体选择培养基上，Parafilm封口，于30℃恒温箱中，正置培养5-7天。

谷氨酸钠固体选择性培养基的配方如下：

乳酸钠培养基的配方(1L)：

注：半固体培养基中加入终浓度为0.2％的琼脂粉；固体培养基中加入终浓度为1.5％的琼脂粉。

矿质元素混合液的配方(1L)：

谷氨酸钠选择性培养基配方(1L)：

注：固体培养基中加入终浓度为1.5％的琼脂粉。

2、菌落PCR验证步骤1中的单克隆，挑取阳性单克隆先于含有卡纳抗生素的半固体乳酸钠培养基中进行穿刺培养，培养条件为：30℃恒温静置培养；接着将半固体培养基中的菌体转接到含有卡纳抗生素的50ml液体培养基中，培养条件为：30℃，100rpm振荡培养，这时得到的突变株为完整的重组质粒pKuTBInCd整合到MSR-1基因组上的单交换菌株。

3、将步骤2中的单交换菌株转接到只含有10％蔗糖的乳酸钠半固体培养基中，培养条件为：30℃恒温静置培养至出现菌体，这时长出来的菌可能为同源双交换的混合菌株，将这些混合菌株转接到无抗生素的50ml乳酸钠培养基中，培养条件为：30℃，100rpm振荡培养，待OD₅₆₅为0.8-1.0时，于无抗生素的固体谷氨酸钠选择性培养基上稀释涂布或划线分离得单菌落，确定单菌落只在无抗生素的固体谷氨酸钠选择型培养基上生长，而不在含有卡纳抗生素的固体谷氨酸钠选择型培养基上生长，最终通过菌落PCR验证确定为同源双交换的阳性单克隆，并对该菌株磁小体岛上的基因进行PCR验证和该菌株的磁响应验证(Cmag值)，当磁小体岛上的基因没有丢失，且Cmag值在0.8-1.2之间，确定为成功构建了重组菌株1，并将该重组菌株命名为TBInC。重组磁螺菌的电镜照片见图1。

实施例3重组穿梭质粒的构建

1、利用表2引物、高保真pfu酶，分别PCR扩增裂解酶基因和核酸酶基因。PCR体系和条件如下：

PCR体系(50μl)：

PCR条件(变性→退火→延伸：30个循环)：

表2 PCR扩增所用引物

注：下划线为酶切位点序列。

2、按照天根生化科技(北京)有限公司的琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒的说明书将步骤1中的PCR扩增产物进行切胶回收；

3、采用融合PCR技术对步骤2中回收获得的核酸酶基因加信号肽以及裂解酶基因加启动子，信号肽序列和启动子序列见表2：

反应体系和条件如下：

PCR体系(或者正向引物13-1、反向引物14、信号肽1和核酸酶基因或者正向引物13-2、反向引物14、信号肽2和核酸酶基因)(50μl)：

PCR条件(变性→退火→延伸：30个循环)：

最后是裂解酶基因和核酸酶基因的3′末端加上“A(腺嘌呤核苷酸残基)”，供后续实验备用，即在上述反应体系中加10μl的2×Taq PCR Mix于72℃条件下反应30min。

4、将步骤3中的基因分别连接到pMD19-T simple(购自TaKaRa)质粒上，通过化学转化的方法，将连接产物转化进DH5α细胞中，涂布于含有氨苄抗生素的LB固体平板进行筛选，挑取单克隆，菌落PCR验证后，送公司测序，验证基因的正确性。

裂解酶基因和核酸酶基因连接到pMD19-T simple上的反应体系为：4.5μl PCR产物；5μl Solution I；0.5μl pMD19-T simple。

裂解酶基因和核酸酶基因连接到pMD19-T simple上的反应条件为：16℃2h。

LB培养基的配方(1L)：10g蛋白胨；5g酵母粉；10g NaCl；15g琼脂粉。

5、BamH I、Bgl II和Xba I(购自TaKaRa)双酶切得裂解酶基因、核酸酶基因片段和pBBR1MCS-2载体片段。

酶切体系：

反应条件：30℃，约3h。

酶切体系：

反应条件：30℃，约3h。

酶切体系：

反应条件：37℃，约3h。

6、T4 DNA Ligase(购自TaKaRa)连接核酸酶基因、裂解酶基因与pK18mobSacB得重组质粒pBNuLy。

连接体系：

反应条件：16℃，约20h。

7、最后将重组质粒通过化学转化的方法，转化进供体菌株E.coli S17-1中。

实施例4产物自动提纯的智能重组表达菌株2的筛选

1、通过双亲接合实验将实施例3中供体菌株E.coli S17-1胞内的重组质粒pBNuLy转化至实施例2中的重组菌株1中。具体为：1)S17-1单菌落接种于4ml液体LB中，37℃，200rpm培养过夜；2)S17-1按10％的比例接种于无抗生素的液体LB中(200μl S17-1+2mlLB)，30℃，150rpm，培养3h；3)重组菌株1在乳酸钠培养基中活化2次，第三次培养至OD₅₆₅为0.8-1.0；4)分别取2)中300μl S17-1和3)中1ml重组菌株1进行混合，12,000rpm离心1min，在超净工作台中弃上清；5)用1ml谷氨酸钠选择性培养基洗菌体，12,000rpm离心1min，在超净工作台中弃上清，重复一次；6)用50μl谷氨酸钠选择培养基重悬5)中的菌体，然后将菌体重悬液滴在没有抗生素的谷氨酸钠固体选择性培养基上的微孔滤膜上，Parafilm封口，于30℃正置接合过夜；7)用1ml谷氨酸钠选择性培养基洗下微孔滤膜上的菌体，于30℃，100rpm的摇床中复壮2h；8)12,000rpm离心1min，留约100μl的上清重悬菌体，并将重悬好的菌体涂于含有卡纳抗生素的谷氨酸钠固体选择培养基上，Parafilm封口，于30℃恒温箱中，正置培养5-7天。

乳酸钠培养基的配方(1L)：

注：半固体培养基中加入终浓度为0.2％的琼脂粉；固体培养基中加入终浓度为1.5％的琼脂粉。

矿质元素混合液的配方(1L)：

谷氨酸钠选择性培养基配方(1L)：

注：固体培养基中加入终浓度为1.5％的琼脂粉。

2、菌落PCR验证步骤1中的单克隆，挑取阳性单克隆于含有卡纳抗生素的半固体乳酸钠培养基中进行穿刺培养，培养条件为：30℃恒温静置培养；接着将半固体培养基中的菌体转接到含有卡纳抗生素的50ml液体培养基中，培养条件为：30℃，100rpm振荡培养，这时得到的重组菌株即为产物自动提纯的智能重组菌株2，即智能细菌表达系统，并将重组菌株命名为TBInC-NuLy。

实施例5 TBInC-NuLy自动提纯四溴双酚A特异性纳米抗体

1、智能重组菌株TBInC-NuLy培养条件的确定：

1)将冻纯的重组菌TBInC-NuLy在乳酸钠普通培养基中连续活化两次；

2)按照10％(v/v)的接种量分别接种于300mL乳酸钠培养基血清瓶中进行摇瓶培养和4.5L初始培养基发酵罐中进行发酵培养；

3)摇瓶培养条件为：30℃，100rpm；发酵罐发酵培养条件为：培养温度30℃，初始转速为100rpm，初始通气量为1L/min，补料与调节pH偶联使pH保持在6.9。随着细胞的生长氧气消耗增多，溶氧逐渐下降，当溶氧首次降至15％-30％之间时，手动调节通气量(增加一倍)，当溶氧再次降低，并降至0.5％时，先维持转速100rpm约4-6h不变，细胞合成四溴双酚A纳米抗体-磁小体复合物，之后，每2h提高10rpm，溶氧维持在0.5％；两种培养条件下，卡纳抗生素的终浓度均为5μg/L；并且在细胞生长的中后期添加诱导剂IPTG，诱导核酸酶的表达，终浓度为0.03mM。

4)两种培养条件下，均在磁响应(Cmag值)最高时收集细胞，在细胞自裂解后提取四溴双酚A纳米抗体-磁小体复合物，热诱导四溴双酚A纳米抗体的释放，ELISA检测四溴双酚A纳米抗体的功能。

提取四溴双酚A纳米抗体-磁小体复合物的主要步骤如下：1，培养收集菌体细胞，2，用化学试剂(比如氯仿)破坏少量细胞或者物理方法(如超声破碎)破坏少量细胞，释放溶解细胞的核酸酶-裂解酶物质，诱导细胞发生自我融化分解的级联放大反应，使得菌体细胞最后全部自溶，释放不溶的磁小体物质，3、通过磁性吸附磁小体，反复洗涤，洗掉杂质，最后得到纯化的磁小体复合物。

发酵培养的初始培养基的配方(4.5L)：

补料培养基(500mL)：

2、纳米抗体-磁小体免疫磁珠复合物纯化条件的确定：

1)细胞重悬：按照1g菌泥：100μL缓冲液(10mM CaCl+10mM PBS pH 7.4)的比例重悬菌体；

2)破碎细胞：

滴加一滴氯仿于步骤1)中，震荡加速细胞的裂解；

3)纳米抗体-磁小体复合物的纯化：

将步骤2)中的细胞破碎液用40mL的PBS(pH 7.4)重悬后，静置在强力磁铁上(4℃)，待复合物已被吸附至容器底部后，测定上清的OD₂₆₀和OD₂₈₀值，弃上清，用等体积的PBS重悬沉淀，重复磁铁吸附的过程，待上清OD₂₆₀和OD₂₈₀低于0.05时，说明复合物已经纯化好。

4)纳米抗体的收集：

将步骤3)中的复合物用PBS重悬，40℃恒温孵育至四溴双酚A纳米抗体的释放，ELISA检测。

实施例6四溴双酚A纳米抗体在四溴双酚A检测中的应用

1、包被：包被抗原T5-BSA 100μL/孔于96孔酶标板，4℃包被过夜。其中，用碳酸钠缓冲液(0.05M，pH 9.6)稀释包被原。

碳酸钠缓冲液的配方为(1L)：1.59g Na₂CO₃，2.93g NaHCO₃，pH 9.6。

2、洗脱：次日，直接甩掉酶标板中的包被液，用PBST再洗涤3次，每次1min。

PBST：在PBS(0.01M，pH 7.4)中添加终浓度为0.05％的吐温20。

3、封闭：在步骤2)中的包被孔中各加入150μL 1％的明胶，室温封闭1h。其中，用碳酸钠缓冲液(0.05M，pH 9.6)配置1％的明胶。

4、洗脱：弃封闭液，用PBST再洗涤3次，每次1min。

5、竞争反应：在步骤4)的奇数孔中加50μL的PBS，偶数孔中加50μL的1mg/L的TBBPA标准液，然后各孔中再加入50μL实施例5纯化收集的四溴双酚A纳米抗体，室温孵育1h。

6、洗脱：弃反应液，用PBST再洗涤3次，每次1min。

7、二抗：在步骤6)各孔中加入His-HRP的二抗，室温孵育1h。其中，用PBS(pH 7.4)稀释His-HRP二抗。

8、洗脱：弃反应液，用PBST再洗涤3次，每次1min。

9、显色：各孔中添加100μL等体积混匀的A液和B液，避光显色10-15min，50μL 2MH₂SO₄终止反应，于酶标仪上测定OD₄₅₀的值，结果表明(图2)，纳米抗体能够识别TBBPA。

A液(1L)：1g过氧化脲，35.8g Na₂HPO₄·12H₂O，10.3g柠檬酸，0.1mL吐温20。

B液(1L)：0.7g TMB，10.3g柠檬酸，40mL无水DMSO。

2M H₂SO₄：将22.2mL浓H₂SO₄(98％)缓慢加入177.8mL蒸馏水中。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<120> 靶蛋白-内含肽-磁小体融合蛋白及其构建的产物自动提纯的智能细菌和制备方法

<160> 11

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1089

<212> DNA

<213> λ噬菌体(λphage)

<400> 1

ttagcagcat gattgccacg gatggcaaca tattaacggc atgatattga cttattgaat 60

aaaattgggt aaatttgact caacgatggg ttaattcgct cgttgtggta gtgagatggt 120

agaaatcaat aatcaacgta aggcgttcct cgatatgctg gcgtggtcgg agggaactga 180

taacggacgt cagaaaacca gaaatcatgg ttatgacgtc attgtaggcg gagagctatt 240

tactgattac tccgatcacc ctcgcaaact tgtcacgcta aacccaaaac tcaaatcaac 300

aggcgccgga cgctaccagc ttctttcccg ttggtgggat gcctaccgca agcagcttgg 360

cctgaaagac ttctctccga aaagtcagga cgctgtggca ttgcagcaga ttaaggagcg 420

tggcgcttta cctatgattg atcgtggtga tatccgtcag gcaatcgacc gttgcagcaa 480

tatctgggct tcactgccgg gcgctggtta tggtcagttc gagcataagg ctgacagcct 540

gattgcaaaa ttcaaagaag cgggcggaac ggtcagagag attgatgtat gagcagagtc 600

accgcgatta tctccgctct ggttatctgc atcatcgtct gcctgtcatg ggctgttaat 660

cattaccgtg ataacgccat tacctacaaa gcccagcgcg acaaaaatgc cagagaactg 720

aagctggcga acgcggcaat tactgacatg cagatgcgtc agcgtgatgt tgctgcgctc 780

gatgcaaaat acacgaagga gttagctgat gctaaagctg aaaatgatgc tctgcgtgat 840

gatgttgccg ctggtcgtcg tcggttgcac atcaaagcag tctgtcagtc agtgcgtgaa 900

gccaccaccg cctccggcgt ggataatgca gcctcccccc gactggcaga caccgctgaa 960

cgggattatt tcaccctcag agagaggctg atcactatgc aaaaacaact ggaaggaacc 1020

cagaagtata ttaatgagca gtgcagaagt tgcccatatc gagattacaa ggacgacgat 1080

gacaagtag 1089

<210> 2

<211> 504

<212> DNA

<213> 金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)

<400> 2

tcacaaacag ataatggcgt aaatagaagt ggttctgaag atccaacagt atatagtgca 60

acttcaacta aaaaattaca taaagaacct gcgacattaa ttaaagcgat tgatggtgat 120

acggttaaat taatgtacaa aggtcaacca atgacattca gactattatt ggttgataca 180

cctgaaacaa agcatcctaa aaaaggtgta gagaaatatg gtcctgaagc aagtgcattt 240

acgaaaaaaa tggtagaaaa tgcaaagaaa attgaagtcg agtttgacaa aggtcaaaga 300

actgataaat atggacgtgg cttagcgtat atttatgctg atggaaaaat ggtaaacgaa 360

gctttagttc gtcaaggctt ggctaaagtt gcttatgttt ataaacctaa caatacacat 420

gaacaacttt taagaaaaag tgaagcacaa gcaaaaaaag agaaattaaa tatttggagc 480

gaagacaacg ctgattcagg tcaa 504

<210> 3

<211> 2989

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ggcgcagttt cgtctcagga aaggccaata ccatgcagga cctttttctc gccaaggtcg 60

aaagcgccat gcaggcgtcc caggtcgggg cacttgccgg tcagacggcg acggtctcgt 120

cagtctcggc cacgaccaat ctggccacca taaccccaac caccgccggg caggccccta 180

tcatcgtcaa actggacgcg gcacggcagg tgacggagtt gcaggccctg atgggaaaga 240

ccgtgctggt cggaaagacc ccgaccacca tcggcggcat cggaaactgg attgccttga 300

ccccggcggc gggagccaag accggcgctg ccgtggccgg aaccggtcag ctggtcatga 360

tgaaggtcga gggcaccggc gcggccatca agcttcccgc cctggcgggt aagagcttca 420

tcgtcgccca gccccccgta gccgccggaa ccaaagcggc gggcatgctc tatctgaatc 480

cggttggcgg tggtgatatg gtggccatca acattcagaa cgccatgacc cagaccggcg 540

gcttggtcgg caagaccttc accgtcgccc ccagccccgt cattggcggc accaccggta 600

aattcctggt cctgaagccc atggcgaccg gggtcggcaa ggcggtgggc agcggcgccg 660

tcgtcgccaa gttcgtaccc gccgccgtca ccggcacggg cggagcggcg gctatcgggg 720

ccggatccgc caccaccctg atggccacgg gcgccagtac gatcaccccc gtcactgccg 780

ccgccgctgg cagcgccatg ctgacagcca aaggtgttgg cctcgggctt ggcctgggcc 840

tcggcgcctg ggggccgttc gccctagggg ctatcggcct agcgggtgtt gtcgcgcttt 900

atacctgggc gcgccgccgc catggcgctc ccgatgtttc cgatgacgct cttctggcgg 960

ctgtcggcga ggaataagcc tgacccttga attaaggaca acagcgatga tgcagttgca 1020

gctcgtggag tctgggggag gcttggtgca acctgggggg tctctgagac tctcctgtgc 1080

agcctctcga agcatcttca gtacgtatac catgggctgg taccgccagc ctccagggag 1140

ggggcgcgag ttggtcgcag ctagtaatag ttttggtacc acatactacg caaactctgt 1200

gaagggccga ttcgccatct ccagagacaa tgccaagaac accgtgtatc tgcaaatgaa 1260

cagcctgaaa cctgaggaca cggctatgta ttactgtacg gcacgcgaca gaagcgacgc 1320

gactattcgt gtctggggcc aggggaccca ggtcaccgtc tcctcagaac ccaagacacc 1380

aaaaccacaa gacggccagg ccggccagca ccatcaccat caccattccg gcggtggtgg 1440

acacgctgcg aagaggagat tctgcttccc gggtgatact aggattctcg tccaaataga 1500

tggagttcca cagaagataa ctctaaggga gctgtatgag ctgttcgagg atgaaaggta 1560

cgaaaatatg gtttacgtta ggaagaagcc caagagggaa attaaggttt attccattga 1620

cctcgaaact ggcaaagttg tattgacgga tatagaggat gtcataaagg ctccggccac 1680

ggatcatttg ataaggttcg agcttgaaga tggaagaagt tttgaaacca ccgtagatca 1740

tccagtttta gtttatgaaa acggcagatt tattgagaaa agggcctttg aagttaagga 1800

gggggataaa gtactcgtct ctgagctcga gttagttgaa caatcaagct cgtcccagga 1860

taaccccaag aacgagaact taggatcccc tgagcatgac caactcttag agatcaagaa 1920

tatcaaatac gttagagcta atgatgactt tgtgttctct cttaatgcta agaaatacca 1980

taacgttata ataaatgaga atattgtaac gcatgcagct gatggagatg aagacgaaca 2040

gaaactgatt agcgaagaag atctgtctgg tggcggcggt tccggtggcg gtggcagctt 2100

tcaacttgcg ccgtacttgg cgaaatccgt ccctggaatc ggcattctcg gcggcattgt 2160

cggtggcgcc gccgcccttg ccaagaatgc ccgccttttg aaggacaagc agataaccgg 2220

cacagaagcg gccatcgaca ccggcaagga agccgccggc gccgggcttg ccaccgcttt 2280

ctccgccgtc gccgccaccg ccgtcggcgg tgggttggtg gtctcgttgg gagccgccct 2340

aatcgccggc gtcgccgcca aatacgcctg ggacctgggt gtcgatttca tcgagaagga 2400

attgcgtcac ggcaagtccg ccgaggcgac agcgtccgac gaagacattc tgagggaaga 2460

attggcctga aatattgggc tggttcacgg cattcagaca ccggcggagg ccagggcgtt 2520

ggttgttatc taaacaacgc cctggcagaa ccgaacaaga acactgtcgt cattcacccc 2580

gatgtgctct ctctgcccca ctctctgcct ctgaccgctg tgcccccgac agcggccatc 2640

cggcgggaac gtccgctgag gcccttgtgt gccaagaacg ggcattcatg atggcgccgc 2700

gccggcgtgg ggcgctccga tgccccttag gttcaatccg gggcgcgcac aatttcgttg 2760

gaagattacc cccagccaac ccgatcaaag atacgaatag attggacgtt gttctctccc 2820

aacatggcga cgttgatcgt ctcctccttg aaatctcccc aggacgatac gagctgcgag 2880

cgcttggccc caggaagaac ggggaactcg ttgttggcct cggcgtaaaa ctgctgcgct 2940

tcggcccctg agaggaactc caccagcttg atcgcctctg ccttgttct 2989

<210> 4

<211> 402

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atgcagttgc agctcgtgga gtctggggga ggcttggtgc aacctggggg gtctctgaga 60

ctctcctgtg cagcctctcg aagcatcttc agtacgtata ccatgggctg gtaccgccag 120

cctccaggga gggggcgcga gttggtcgca gctagtaata gttttggtac cacatactac 180

gcaaactctg tgaagggccg attcgccatc tccagagaca atgccaagaa caccgtgtat 240

ctgcaaatga acagcctgaa acctgaggac acggctatgt attactgtac ggcacgcgac 300

agaagcgacg cgactattcg tgtctggggc caggggaccc aggtcaccgt ctcctcagaa 360

cccaagacac caaaaccaca agaccatcat caccatcacc at 402

<210> 5

<211> 594

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cacgctgcga agaggagatt ctgcttcccg ggtgatacta ggattctcgt ccaaatagat 60

ggagttccac agaagataac tctaagggag ctgtatgagc tgttcgagga tgaaaggtac 120

gaaaatatgg tttacgttag gaagaagccc aagagggaaa ttaaggttta ttccattgac 180

ctcgaaactg gcaaagttgt attgacggat atagaggatg tcataaaggc tccggccacg 240

gatcatttga taaggttcga gcttgaagat ggaagaagtt ttgaaaccac cgtagatcat 300

ccagttttag tttatgaaaa cggcagattt attgagaaaa gggcctttga agttaaggag 360

ggggataaag tactcgtctc tgagctcgag ttagttgaac aatcaagctc gtcccaggat 420

aaccccaaga acgagaactt aggatcccct gagcatgacc aactcttaga gatcaagaat 480

atcaaatacg ttagagctaa tgatgacttt gtgttctctc ttaatgctaa gaaataccat 540

aacgttataa taaatgagaa tattgtaacg catgcagctg atggagatga agac 594

<210> 6

<211> 375

<212> DNA

<213> 磁螺菌(Magnetospirillum gryphiswaldensense)

<400> 6

agctttcaac ttgcgccgta cttggcgaaa tccgtccctg gaatcggcat tctcggcggc 60

attgtcggtg gcgccgccgc ccttgccaag aatgcccgcc ttttgaagga caagcagata 120

accggcacag aagcggccat cgacaccggc aaggaagccg ccggcgccgg gcttgccacc 180

gctttctccg ccgtcgccgc caccgccgtc ggcggtgggt tggtggtctc gttgggagcc 240

gccctaatcg ccggcgtcgc cgccaaatac gcctgggacc tgggtgtcga tttcatcgag 300

aaggaattgc gtcacggcaa gtccgccgag gcgacagcgt ccgacgaaga cattctgagg 360

gaagaattgg cctga 375

<210> 7

<211> 1009

<212> DNA

<213> 磁螺菌(Magnetospirillum gryphiswaldensense)

<400> 7

ggcgcagttt cgtctcagga aaggccaata ccatgcagga cctttttctc gccaaggtcg 60

aaagcgccat gcaggcgtcc caggtcgggg cacttgccgg tcagacggcg acggtctcgt 120

cagtctcggc cacgaccaat ctggccacca taaccccaac caccgccggg caggccccta 180

tcatcgtcaa actggacgcg gcacggcagg tgacggagtt gcaggccctg atgggaaaga 240

ccgtgctggt cggaaagacc ccgaccacca tcggcggcat cggaaactgg attgccttga 300

ccccggcggc gggagccaag accggcgctg ccgtggccgg aaccggtcag ctggtcatga 360

tgaaggtcga gggcaccggc gcggccatca agcttcccgc cctggcgggt aagagcttca 420

tcgtcgccca gccccccgta gccgccggaa ccaaagcggc gggcatgctc tatctgaatc 480

cggttggcgg tggtgatatg gtggccatca acattcagaa cgccatgacc cagaccggcg 540

gcttggtcgg caagaccttc accgtcgccc ccagccccgt cattggcggc accaccggta 600

aattcctggt cctgaagccc atggcgaccg gggtcggcaa ggcggtgggc agcggcgccg 660

tcgtcgccaa gttcgtaccc gccgccgtca ccggcacggg cggagcggcg gctatcgggg 720

ccggatccgc caccaccctg atggccacgg gcgccagtac gatcaccccc gtcactgccg 780

ccgccgctgg cagcgccatg ctgacagcca aaggtgttgg cctcgggctt ggcctgggcc 840

tcggcgcctg ggggccgttc gccctagggg ctatcggcct agcgggtgtt gtcgcgcttt 900

atacctgggc gcgccgccgc catggcgctc ccgatgtttc cgatgacgct cttctggcgg 960

ctgtcggcga ggaataagcc tgacccttga attaaggaca acagcgatg 1009

<210> 8

<211> 539

<212> DNA

<213> 磁螺菌(Magnetospirillum gryphiswaldensense)

<400> 8

tgagggaaga attggcctga aatattgggc tggttcacgg cattcagaca ccggcggagg 60

ccagggcgtt ggttgttatc taaacaacgc cctggcagaa ccgaacaaga acactgtcgt 120

cattcacccc gatgtgctct ctctgcccca ctctctgcct ctgaccgctg tgcccccgac 180

agcggccatc cggcgggaac gtccgctgag gcccttgtgt gccaagaacg ggcattcatg 240

atggcgccgc gccggcgtgg ggcgctccga tgccccttag gttcaatccg gggcgcgcac 300

aatttcgttg gaagattacc cccagccaac ccgatcaaag atacgaatag attggacgtt 360

gttctctccc aacatggcga cgttgatcgt ctcctccttg aaatctcccc aggacgatac 420

gagctgcgag cgcttggccc caggaagaac ggggaactcg ttgttggcct cggcgtaaaa 480

ctgctgcgct tcggcccctg agaggaactc caccagcttg atcgcctctg ccttgttct 539

<210> 9

<211> 134

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

Met Gln Leu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly

1 5 10 15

Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Arg Ser Ile Phe Ser Thr

20 25 30

Tyr Thr Met Gly Trp Tyr Arg Gln Pro Pro Gly Arg Gly Arg Glu Leu

35 40 45

Val Ala Ala Ser Asn Ser Phe Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Asn Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Ala Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Ala Arg Asp Arg Ser Asp Ala Thr Ile Arg Val Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Glu Pro Lys Thr Pro Lys Pro Gln Asp

115 120 125

His His His His His His

130

<210> 10

<211> 198

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

His Ala Ala Lys Arg Arg Phe Cys Phe Pro Gly Asp Thr Arg Ile Leu

1 5 10 15

Val Gln Ile Asp Gly Val Pro Gln Lys Ile Thr Leu Arg Glu Leu Tyr

20 25 30

Glu Leu Phe Glu Asp Glu Arg Tyr Glu Asn Met Val Tyr Val Arg Lys

35 40 45

Lys Pro Lys Arg Glu Ile Lys Val Tyr Ser Ile Asp Leu Glu Thr Gly

50 55 60

Lys Val Val Leu Thr Asp Ile Glu Asp Val Ile Lys Ala Pro Ala Thr

65 70 75 80

Asp His Leu Ile Arg Phe Glu Leu Glu Asp Gly Arg Ser Phe Glu Thr

85 90 95

Thr Val Asp His Pro Val Leu Val Tyr Glu Asn Gly Arg Phe Ile Glu

100 105 110

Lys Arg Ala Phe Glu Val Lys Glu Gly Asp Lys Val Leu Val Ser Glu

115 120 125

Leu Glu Leu Val Glu Gln Ser Ser Ser Ser Gln Asp Asn Pro Lys Asn

130 135 140

Glu Asn Leu Gly Ser Pro Glu His Asp Gln Leu Leu Glu Ile Lys Asn

145 150 155 160

Ile Lys Tyr Val Arg Ala Asn Asp Asp Phe Val Phe Ser Leu Asn Ala

165 170 175

Lys Lys Tyr His Asn Val Ile Ile Asn Glu Asn Ile Val Thr His Ala

180 185 190

Ala Asp Gly Asp Glu Asp

195

<210> 11

<211> 124

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

Ser Phe Gln Leu Ala Pro Tyr Leu Ala Lys Ser Val Pro Gly Ile Gly

1 5 10 15

Ile Leu Gly Gly Ile Val Gly Gly Ala Ala Ala Leu Ala Lys Asn Ala

20 25 30

Arg Leu Leu Lys Asp Lys Gln Ile Thr Gly Thr Glu Ala Ala Ile Asp

35 40 45

Thr Gly Lys Glu Ala Ala Gly Ala Gly Leu Ala Thr Ala Phe Ser Ala

50 55 60

Val Ala Ala Thr Ala Val Gly Gly Gly Leu Val Val Ser Leu Gly Ala

65 70 75 80

Ala Leu Ile Ala Gly Val Ala Ala Lys Tyr Ala Trp Asp Leu Gly Val

85 90 95

Asp Phe Ile Glu Lys Glu Leu Arg His Gly Lys Ser Ala Glu Ala Thr

100 105 110

Ala Ser Asp Glu Asp Ile Leu Arg Glu Glu Leu Ala

115 120

Claims (10)

1.一种靶蛋白-内含肽-磁小体融合基因，其特征在于，所述融合基因包括磁小体膜蛋白基因的上游序列、靶蛋白基因、内含肽基因、磁小体膜蛋白基因和磁小体膜蛋白基因的下游序列，优选地，所述融合基因的结构为：磁小体膜蛋白基因的上游序列-纳米抗体基因-内含肽基因-磁小体膜蛋白基因-磁小体膜蛋白基因的下游序列；优选地，所述靶蛋白-内含肽-磁小体融合基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。

2.一种权利要求1所述的靶蛋白-内含肽-磁小体融合基因编码的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白是由靶蛋白、内含肽以及磁小体膜蛋白之间依次直接串联连接或通过柔性Linker可操作地连接构成；所述靶蛋白包括利用噬菌体展示技术获得的能够特异性识别抗原的纳米抗体，所述内含肽来自于嗜热菌；所述磁小体膜蛋白来自于趋磁细菌。

3.含有权利要求1所述靶蛋白-内含肽-磁小体融合基因的生物材料，所述生物材料还包括重组DNA、表达盒、转座子、质粒载体、噬菌体载体、病毒载体或工程菌中的一种或多种。

4.一种智能细菌表达系统，其特征在于，所述智能细菌表达系统是在磁螺菌中整合靶蛋白-内含肽-磁小体融合基因、表达裂解酶的基因和表达核酸酶的基因，所述裂解酶的基因具有如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，所述核酸酶的基因具有如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。

5.如权利要求4所述的智能细菌表达系统，其特征在于，所述智能细菌表达系统通过以下方法构建：(1)将所述靶蛋白-内含肽-磁小体融合基因插入到自杀质粒的多克隆位点处得重组质粒1，(2)将重组质粒1转移至野生型磁螺菌中，制得重组磁螺菌；(3)将裂解酶基因以及核酸酶基因串联插入到穿梭质粒的多克隆位点处得重组质粒2；(4)将重组质粒2转移至所述重组磁螺菌中，得智能细菌表达系统。

6.如权利要求5所述的智能细菌表达系统，其特征在于，步骤(3)所述重组质粒2的制备方法如下：PCR扩增分别获得核酸酶基因和裂解酶基因，并分别插入到穿梭质粒中，制得重组质粒2，步骤(4)所述制备智能细菌的具体步骤为：将重组质粒2转化进供体菌株E.coliS17-1中，再将供体菌株E.coli S17-1胞内的重组质粒转化至步骤(2)制得的重组质粒1中，抗性筛选，得智能细菌表达系统。

7.靶蛋白-内含肽-磁小体免疫磁珠复合物，其特征在于，所述靶蛋白-磁小体复合物是对权利要求4-6任一所述智能细菌表达系统进行培养，并从培养物中通过磁性吸附得到的。

8.利用权利要求4-6任一所述智能细菌表达系统制备的靶蛋白-内含肽-磁小体免疫磁珠复合物，其特征在于，所述复合物的制备方法包括以下步骤：对智能细菌进行培养，离心收集细胞，在细胞自裂解后提取靶蛋白-内含肽-磁小体免疫磁珠复合物。

9.利用权利要求8所述靶蛋白-内含肽-磁小体免疫磁珠复合物纯化靶蛋白的方法，其特征在于，所述方法将靶蛋白-内含肽-磁小体免疫磁珠复合物重悬，30℃-50℃恒温孵育至靶蛋白释放。

10.应用权利要求4所述的智能细菌表达系统自动提纯四溴双酚A特异性纳米抗体的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

A、智能细菌表达系统培养条件的确定：

1)将冻纯的智能细菌表达系统在乳酸钠普通培养基中连续活化两次；

2)对活化后的智能细菌表达系统进行培养；

3)在磁响应(Cmag值)最高时收集细胞，细胞自裂解后提取四溴双酚A纳米抗体-磁小体复合物，热诱导四溴双酚A纳米抗体的释放，ELISA检测四溴双酚A纳米抗体的功能；

B、纳米抗体-磁小体免疫磁珠复合物纯化条件的确定：

1)细胞重悬：按照1g菌泥：100μL缓冲液(10mM CaCl+10mM PBS pH 7.4)的比例重悬菌体(菌体刚好能重悬)；

2)破碎细胞：

滴加一滴氯仿于步骤1)中，震荡加速细胞的裂解；

3)纳米抗体-磁小体复合物的纯化：

将步骤2)制得的细胞破碎液用40mL的PBS(pH 7.4)重悬后，静置在强力磁铁上(4℃)，待复合物已被吸附至容器底部后，测定上清的OD₂₆₀和OD₂₈₀值，弃上清，用等体积的PBS重悬沉淀，重复磁铁吸附的过程，待上清OD₂₆₀和OD₂₈₀低于0.05时，说明复合物已经纯化好。

4)纳米抗体的收集：

将步骤3)中的复合物用PBS重悬，40℃恒温孵育至四溴双酚A纳米抗体的释放，ELISA检测。

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