CN111544430B - 褪黑素在制备抑制和/或杀灭细菌的药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种褪黑素在制备抑制和/或杀灭细菌的药物中的应用，涉及医药技术领域。本发明的研究发现，小分子物质褪黑素(melatonin)，它具有显著的抑菌或杀菌作用，褪黑素通过特异地靶向革兰氏阴性菌中柠檬酸合酶破坏细菌的代谢通量，在多杀性巴氏杆菌的体内感染模型中，褪黑激素有效地降低了肺中的细菌定殖并提高了小鼠的存活率，为病原菌感染类疾病的预防和/或治疗提供有效保障，为无害无污染、安全有效新药的开发提供了理论依据。

Description

褪黑素在制备抑制和/或杀灭细菌的药物中的应用
技术领域
本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种褪黑素在制备抑制和/或杀灭细菌的药物中的应用。
背景技术
在人类和动物疾病中，病原菌引起的传染病范围最广，严重威胁着全世界的公共健康。迄今为止，抗生素的发现和应用无疑在抗细菌感染中起着重要作用。然而，由于抗生素在医药行业或畜牧业中的过度使用和滥用不可逆转地导致了人类、动物和生态环境中抗生素耐药性的出现和盛行。令人震惊的是，质粒介导的抗生素抗性基因在种间和种间的水平转移加速了抗性遗传元件的快速传播，此外，兽药、动物性等产品中残留的抗生素也会导致严重的环境污染，均对人类健康构成巨大威胁。因此，迫切需要更环保、安全和有效的化合物来治疗细菌感染性疾病。
对于细菌感染性疾病，特别是由革兰氏阴性菌感染引发的疾病，治疗药物十分有限，其主要原因包括：1)革兰氏阴性菌细胞膜的外层由脂多糖构成，可以作为一个渗透屏障防止抗生素进入细菌内部；2)革兰氏阴性菌具有获得性多药耐药性。因此，寻找一种安全、有效的化合物抑制革兰氏阴性菌仍是目前医学领域亟待解决的问题。
褪黑素(N-乙酰基-5-甲氧基色胺)是一种天然化合物，主要是从脊椎动物的松果体中分泌的激素。目前研究发现，褪黑素通过抑制下丘脑中与MT1受体相互作用的食欲素神经元而广泛用于睡眠促进剂。但迄今为止，褪黑素抑制细菌及细菌感染性疾病的研究尚未报道。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供了一种安全无毒的褪黑素在制备抑制和/或杀灭细菌的药物中的应用，尤其是褪黑素能够有效抑制和/或杀灭革兰氏阴性菌。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种褪黑素在制备抑制和/或杀灭细菌的药物中的应用。
优选地，上述的细菌为革兰氏阳性菌或革兰氏阴性菌。
优选地，革兰氏阳性菌包括蜡样芽孢杆菌、肺炎链球菌、肺炎球菌、李斯特菌、约翰逊乳杆菌或金黄色葡萄球菌。
优选地，革兰氏阴性菌包括多杀性巴氏杆菌、肺炎克雷伯菌、禽致病性大肠杆菌、阪崎肠杆菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、肠炎沙门氏菌、牛脑膜炎大肠杆菌或溶血性曼氏杆菌。
本发明提供了一种褪黑素在制备损伤细菌细胞膜的药物中的应用。
本发明提供了一种褪黑素在制备细菌代谢阻断剂中的应用。
优选地，上述的细菌代谢阻断的途径包括丙酮酸代谢、柠檬酸循环和色氨酸代谢。
本发明提供了一种褪黑素在制备抑制革兰氏阴性菌中柠檬酸合酶活性的药物中的应用。
本发明提供了一种褪黑素在制备预防和/或治疗细菌感染疾病的药物中的应用。
本发明提供了一种褪黑素在制备抑制肺部炎症的药物中的应用。
与现有技术相比，本发明技术方案的有益效果为：
本发明首次提出一种褪黑素新用途即抑制和/或杀灭细菌，尤其是能够抑制和/或杀灭革兰氏阴性菌。褪黑素抑菌或杀菌机制表明褪黑素通过特异地靶向革兰氏阴性菌中柠檬酸合酶破坏细菌的代谢通量，导致膜损伤和细胞内容物的释放。褪黑素还可以降低宿主组织器官病变，抑制病原菌在宿主体内定殖，从而有效改善病原菌感染动物的存活，为病原菌感染类疾病的预防和/或治疗提供有效保障，为新药的开发提供了理论依据。此外，天然抑菌物质褪黑素无害无污染、安全有效，解决了抗生素滥用带来的耐药、污染等问题。
附图说明
附图中的CA表示柠檬酸，MT表示褪黑素；
图1为褪黑素的抑菌活性图；
图2为褪黑素在杀菌浓度下的细菌生长曲线图；
图3为褪黑素在杀菌浓度下的细菌计数图；
图4为褪黑素引起细菌细胞中蛋白质释放图；
图5为褪黑素引起细菌细胞中ATPase释放图；
图6为褪黑素引起细菌细胞中碱性磷酸酶释放图；
图7为褪黑素引起细菌细胞中β-半乳糖苷酶释放图；
图8为褪黑素引起细菌细胞中还原糖释放图；
图9为褪黑素破坏细菌细胞膜图；
图10为褪黑素处理后细菌的形态变化的SEM图；
图11为褪黑素处理后细菌的形态变化的TEM图；
图12为在存在和不存在褪黑素的情况下，多杀性巴氏杆菌的OPLS-DA评分图，其中D表示DMSO溶剂对照组，M表示褪黑素；
图13为通过非靶标代谢组学，对褪黑素处理后的显著性差异代谢物的热图分析图；
图14为褪黑素处理后，基于显著差异代谢物的KEGG通路富集分析图；
图15为褪黑素显著性抑制多杀性巴氏杆菌柠檬酸合酶的活性图；
图16为柠檬酸促进多杀性巴氏杆菌生长图；
图17为柠檬酸的添加后，褪黑素对多杀性巴氏杆菌的生长曲线图，其中CA表示柠檬酸；
图18为柠檬酸的添加后，褪黑素对多杀性巴氏杆菌形态的TEM图，其中CA表示柠檬酸；
图19为柠檬酸显著性降低了由褪黑素引起的还原糖的释放图，其中CA表示柠檬酸；
图20为柠檬酸显著性降低了由褪黑素引起的蛋白质的释放图，其中CA表示柠檬酸；
图21为柠檬酸显著性降低了由褪黑素引起的碱性磷酸酶释放图，其中CA表示柠檬酸；
图22为柠檬酸显著性降低了由褪黑素引起的β-半乳糖苷酶释放图，其中CA表示柠檬酸；
图23为柠檬酸显著性降低了由褪黑素引起的ATPase释放图，其中CA表示柠檬酸；
图24为褪黑素对小鼠腹腔原代巨噬细胞的乳酸脱氢酶检测图；
图25为褪黑素对小鼠肺上皮细胞的乳酸脱氢酶检测图；
图26为褪黑素对肺上皮细胞柠檬酸合酶的酶活性影响图；
图27为柠檬酸对褪黑素处理后的革兰氏阴性细菌、革兰氏阳性细菌的抗菌活性图；
图28为柠檬酸对褪黑素处理后的革兰氏阴性细菌、革兰氏阳性细菌中柠檬酸合酶活性影响图；
图29为多杀性巴氏杆菌感染前后，褪黑素处理后小鼠的存活率图；
图30为多杀性巴氏杆菌感染前后，褪黑素处理后小鼠的肺组织中的定殖量图；
图31为褪黑素对感染细菌后的预防效果图；
图32为褪黑素对感染细菌后的小鼠肺组织中的定殖量图；
图33为在感染多杀性巴氏杆菌前24小时不再注射褪黑素，对细菌感染后预防效果图；
图34为在感染多杀性巴氏杆菌前24小时不再注射褪黑素，对细菌感染后的小鼠肺组织中的定殖量图；
图35为在感染多杀性巴氏杆菌后，褪黑素处理后对小鼠治疗效果图；
图36为在感染多杀性巴氏杆菌后，褪黑素处理后对小鼠肺组织中的定殖量图；
图37为感染多杀性巴氏杆菌后，通过RT-PCR检测褪黑素对IL-1β表达量的影响图；
图38为感染多杀性巴氏杆菌后，通过RT-PCR检测褪黑素对IL-6表达量的影响图；
图39为感染多杀性巴氏杆菌后，通过RT-PCR检测褪黑素对IFN-γ的表达量的影响图；
图40为感染多杀性巴氏杆菌后，通过RT-PCR检测褪黑素对TNF-α的表达量的影响图；
图41为感染多杀性巴氏杆菌后，通过RT-PCR检测褪黑素对IL-4的表达量的影响图；
图42为感染多杀性巴氏杆菌后，通过RT-PCR检测褪黑素对IL-10的表达量的影响图；
图43为感染多杀性巴氏杆菌后，通过ELISA试剂盒检测褪黑素对小鼠肺组织中IL-1β含量的影响图；
图44为感染多杀性巴氏杆菌后，通过ELISA试剂盒检测褪黑素对小鼠肺组织中IL-6含量的影响图；
图45为感染多杀性巴氏杆菌后，通过ELISA试剂盒检测褪黑素对小鼠肺组织中IFN-γ含量的影响图；
图46为感染多杀性巴氏杆菌后，通过ELISA试剂盒检测褪黑素对小鼠肺组织中TNF-α含量的影响图；
图47为感染多杀性巴氏杆菌后，通过ELISA试剂盒检测褪黑素对小鼠肺组织中IL-4含量的影响图；
图48为感染多杀性巴氏杆菌后，通过ELISA试剂盒检测褪黑素对小鼠肺组织中IL-10含量的影响图；
图49为感染多杀性巴氏杆菌后，通过ELISA试剂盒检测褪黑素对小鼠血清中IL-1β含量的影响图；
图50为感染多杀性巴氏杆菌后，通过ELISA试剂盒检测褪黑素对小鼠血清中IL-6含量的影响图；
图51为感染多杀性巴氏杆菌后，通过ELISA试剂盒检测褪黑素对小鼠血清中IFN-γ含量的影响图；
图52为感染多杀性巴氏杆菌后，通过ELISA试剂盒检测褪黑素对小鼠血清中TNF-α含量的影响图；
图53为感染多杀性巴氏杆菌后，通过ELISA试剂盒检测褪黑素对小鼠血清中IL-4含量的影响图；
图54为感染多杀性巴氏杆菌后，通过ELISA试剂盒检测褪黑素对小鼠血清中IL-10含量的影响图；
图55为褪黑素在抑制和/或杀灭细菌的通路图。
具体实施方式
本发明提供了一种褪黑素在制备抑制和/或杀灭细菌的药物中的应用。
在本发明中，所述抑制和/或杀灭细菌的药物优选的包括活性成分褪黑素以及药学上可接受载体。在本发明中，所述药物中褪黑素的含量优选为1.5625mg/mL；本发明中，所述的药学上可接受的载体例包括如稀释剂、着色剂、甜味剂、包衣剂、粘合剂、吸收剂、崩解剂、释放剂、分散剂、湿润剂、助溶剂、缓冲剂和表面活性剂中的一种或几种；所述药物的剂型优选为固体、液体或气体制剂，其中所述固体制剂优选为粉末剂、片剂、颗粒剂、丸剂、硬胶囊、乳膏剂、软膏剂、硬膏剂、凝胶剂、糊剂、散剂或贴剂；所述液体制剂优选为溶液剂、混悬剂、注射剂、糖浆剂、搽剂、乳剂、酊剂、散剂或贴剂；所述气体制剂优选为气雾剂或喷雾剂；本发明中所述的药物可经口服、经直肠、腹腔内、皮下、肌肉内、静脉内、鼻腔施用。
优选地，上述的细菌为革兰氏阳性菌或革兰氏阴性菌。
优选地，上述革兰氏阳性菌包括蜡样芽孢杆菌、肺炎链球菌、肺炎球菌、李斯特菌、约翰逊乳杆菌或金黄色葡萄球菌。
优选地，革兰氏阴性菌包括多杀性巴氏杆菌、肺炎克雷伯菌、禽致病性大肠杆菌、阪崎肠杆菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、肠炎沙门氏菌、牛脑膜炎大肠杆菌或溶血性曼氏杆菌。
本发明提供了一种褪黑素在制备损伤细菌细胞膜的药物中的应用。
在本发明中，所述损伤细菌细胞膜的药物优选的包括活性成分褪黑素以及药学上可接受载体。在本发明中，所述药物中褪黑素的含量优选为1.5625mg/mL；本发明中，所述的药学上可接受的载体例包括如稀释剂、着色剂、甜味剂、包衣剂、粘合剂、吸收剂、崩解剂、释放剂、分散剂、湿润剂、助溶剂、缓冲剂和表面活性剂中的一种或几种；所述药物的剂型优选为固体、液体或气体制剂，其中所述固体制剂优选为粉末剂、片剂、颗粒剂、丸剂、硬胶囊、乳膏剂、软膏剂、硬膏剂、凝胶剂、糊剂、散剂或贴剂；所述液体制剂优选为溶液剂、混悬剂、注射剂、糖浆剂、搽剂、乳剂、酊剂、散剂或贴剂；所述气体制剂优选为气雾剂或喷雾剂；本发明中所述的药物可经口服、经直肠、腹腔内、皮下、肌肉内、静脉内、鼻腔施用。
本发明提供了一种褪黑素在制备细菌代谢阻断剂中的应用。
在本发明中，所述细菌代谢阻断剂优选的包括活性成分褪黑素以及药学上可接受载体。在本发明中，所述阻断剂中褪黑素的含量优选为1.5625mg/mL；本发明中，所述的药学上可接受的载体例包括如稀释剂、着色剂、甜味剂、包衣剂、粘合剂、吸收剂、崩解剂、释放剂、分散剂、湿润剂、助溶剂、缓冲剂和表面活性剂中的一种或几种；所述阻断剂的剂型优选为固体、液体或气体制剂，其中所述固体制剂优选为粉末剂、片剂、颗粒剂、丸剂、硬胶囊、乳膏剂、软膏剂、硬膏剂、凝胶剂、糊剂、散剂或贴剂；所述液体制剂优选为溶液剂、混悬剂、注射剂、糖浆剂、搽剂、乳剂、酊剂、散剂或贴剂；所述气体制剂优选为气雾剂或喷雾剂；本发明中所述的阻断剂可经口服、经直肠、腹腔内、皮下、肌肉内、静脉内、鼻腔施用。
优选地，上述的细菌代谢阻断的途径包括丙酮酸代谢、柠檬酸循环和色氨酸代谢。
本发明提供了一种褪黑素在制备抑制革兰氏阴性菌中柠檬酸合酶活性的药物中的应用。
在本发明中，所述抑制革兰氏阴性菌中柠檬酸合酶活性的药物优选的包括活性成分褪黑素以及药学上可接受载体。在本发明中，所述药物中褪黑素的含量优选为1.5625mg/mL；本发明中，所述的药学上可接受的载体例包括如稀释剂、着色剂、甜味剂、包衣剂、粘合剂、吸收剂、崩解剂、释放剂、分散剂、湿润剂、助溶剂、缓冲剂和表面活性剂中的一种或几种；所述药物的剂型优选为固体、液体或气体制剂，其中所述固体制剂优选为粉末剂、片剂、颗粒剂、丸剂、硬胶囊、乳膏剂、软膏剂、硬膏剂、凝胶剂、糊剂、散剂或贴剂；所述液体制剂优选为溶液剂、混悬剂、注射剂、糖浆剂、搽剂、乳剂、酊剂、散剂或贴剂；所述气体制剂优选为气雾剂或喷雾剂；本发明中所述的药物可经口服、经直肠、腹腔内、皮下、肌肉内、静脉内、鼻腔施用。
本发明提供了一种褪黑素在制备预防和/或治疗细菌感染疾病的药物中的应用。
在本发明中，所述预防和/或治疗细菌感染疾病的药物优选的包括活性成分褪黑素以及药学上可接受载体。在本发明中，所述药物中褪黑素的含量优选为1.5625mg/mL；本发明中，所述的药学上可接受的载体例包括如稀释剂、着色剂、甜味剂、包衣剂、粘合剂、吸收剂、崩解剂、释放剂、分散剂、湿润剂、助溶剂、缓冲剂和表面活性剂中的一种或几种；所述药物的剂型优选为固体、液体或气体制剂，其中所述固体制剂优选为粉末剂、片剂、颗粒剂、丸剂、硬胶囊、乳膏剂、软膏剂、硬膏剂、凝胶剂、糊剂、散剂或贴剂；所述液体制剂优选为溶液剂、混悬剂、注射剂、糖浆剂、搽剂、乳剂、酊剂、散剂或贴剂；所述气体制剂优选为气雾剂或喷雾剂；本发明中所述的药物可经口服、经直肠、腹腔内、皮下、肌肉内、静脉内、鼻腔施用。
本发明提供了一种褪黑素在制备抑制肺部炎症的药物中的应用。
在本发明中，所述抑制肺部炎症的药物优选的包括活性成分褪黑素以及药学上可接受载体。在本发明中，所述药物中褪黑素的含量优选为1.5625mg/mL；本发明中，所述的药学上可接受的载体例包括如稀释剂、着色剂、甜味剂、包衣剂、粘合剂、吸收剂、崩解剂、释放剂、分散剂、湿润剂、助溶剂、缓冲剂和表面活性剂中的一种或几种；所述药物的剂型优选为固体、液体或气体制剂，其中所述固体制剂优选为粉末剂、片剂、颗粒剂、丸剂、硬胶囊、乳膏剂、软膏剂、硬膏剂、凝胶剂、糊剂、散剂或贴剂；所述液体制剂优选为溶液剂、混悬剂、注射剂、糖浆剂、搽剂、乳剂、酊剂、散剂或贴剂；所述气体制剂优选为气雾剂或喷雾剂；本发明中所述的药物可经口服、经直肠、腹腔内、皮下、肌肉内、静脉内、鼻腔施用。
实验材料
1、实施例中所主要使用菌株
本发明对菌种的来源没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的菌种即可。
2、实施例中主要使用的材料
褪黑素购自Sangon Biotech，货号A600605。
邻硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷购自Sangon Biotech，货号A602361。
检测蛋白质的试剂盒购自Beyotime，货号P0006C。
碱性磷酸酶试剂盒购自南京建成生物工程研究所有限公司，货号A059-1-1。
还原糖试剂盒购自Solarbio，货号BC0230。
LIVE/DEAD BacLight细菌检测试剂盒购自Invitrogen，货号L7012。
柠檬酸合酶活性使用测定试剂盒购自Sigma，货号MAK193。
LDH检测试剂盒购自Beyotime，货号C0017。
小鼠为雌性C57BL/6小鼠，购自中国重庆第三军医大学实验动物中心，所述的小鼠体重18～22g、6～8周龄，并饲养在单独通风且无病原体的笼子中(温度为20～30℃，相对湿度为50～60％，照明周期为每天12小时)，可以自由获取食物和水。
在本发明中，统计学方法采用单向方差分析进行分析，并表示为平均值±SD，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001，其中P<0.05为差异有统计学意义。
在本发明中，若无特殊说明，所有的原料组分均为本领域技术人员熟知的市售商品。
下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1褪黑素广谱抑菌和/或杀菌的试验
将1mL新鲜对数期生长的细菌悬浮液(1×109CFU)分别添加到100mL含有不同浓度褪黑素(50mg/mL，25mg/mL，12.5mg/mL，6.25mg/mL，3.125mg/mL，1.5625mg/mL，0.78125mg/mL，0.390625mg/mL)，用不含褪黑素(MT)的DMSO稀释液作为对照组，于37℃，120r/min转速下避光摇动12小时，进行MT对细菌的最小抑菌浓度MIC的检测。然后，将0.1mL上述透明细菌溶液吸至灭菌的特定培养基琼脂平板上并涂布均匀，在37℃培养箱中孵育24小时，进行MT对病原体的最小杀菌浓度MBC的检测，其中无细菌生长的最低浓度为MT对病原体的MBC。每个实验进行3次，每组3个重复。
褪黑素对革兰氏阴性菌、革兰氏的阳性菌的MIC和MBC结果见表1：
表1褪黑素对革兰氏阴性菌、革兰氏的阳性菌的MIC和MBC结果
Figure BDA0002495888490000091
Figure BDA0002495888490000101
由表1可知，褪黑素对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌均表现出抑菌或杀菌活性，MIC值为1.5625至50mg/mL，MBC值为3.125至50mg/mL。尤其是，褪黑素对多杀性巴氏杆菌表现出最有效的抑菌或杀菌活性，MIC和MBC分别为1.5625和3.125mg/mL。
实施例2褪黑素对细菌的抑菌活性试验
为了进一步验证褪黑素对多杀性巴氏杆菌的抑菌活性，在褪黑素浓度增加的情况下确定了细菌生长曲线。将1mL对数期多杀性巴氏杆菌(1.0×109CFU)添加到100mL新鲜的无菌马丁肉汤培养基中，该培养基含有低于MBC(1mg/mL，1.5mg/mL和2mg/mL)的MT浓度，不含褪黑素的DMSO作为溶剂对照组。然后将细菌在37℃恒温摇床中220rpm培养，并使用紫外分光光度计每隔2小时测定一次细菌培养物的OD600，检测褪黑素对细菌生长曲线的影响。每个实验进行了三次，每组3个重复。
由图1结果表明，褪黑素能显著性抑制细菌生长。
实施例3褪黑素杀灭细菌
将1mL对数生长期的多杀性巴氏杆菌(1×109CFU)加入100mL新鲜的无菌马丁肉汤培养基中。将细菌在恒温摇床中于37℃，220rpm的条件下培养8小时。随后，将高于MBC的不同浓度的MT(4mg/mL，8mg/mL和10mg/mL)添加到细菌培养物中，同时将不含MT的DMSO作为溶剂对照组，加入MT后每20分钟连续测量一次细菌培养物的OD600，绘制高于最小杀菌浓度褪黑素作用下的生长曲线。同时，将100μL的细菌培养物均匀地涂布在Martin琼脂平板上，将其在37℃下孵育24h以计算活细菌的数量，进行细菌计数。
结果见图2和图3，结果表明，4mg/mL褪黑素需要10小时才能杀死所有细菌，而更高浓度的褪黑素仅需要4小时，因此高于MBC浓度的褪黑素表现出剂量依赖性的显著杀菌作用。
实施例4褪黑素导致细菌细胞内容物外泄
将1mL对数生长的多杀性巴氏杆菌(1×109CFU)添加到100mL新鲜的无菌马丁氏肉汤培养基中，该培养基含有不同浓度的MT(1mg/mL，2mg/mL，3mg/mL，4mg/mL，6mg/mL，8mg/mL和10mg/mL)。不含褪黑素的DMSO作为溶剂对照组，氨苄青霉素(100μg/mL)作为阳性对照组，细菌细胞在37℃、220rpm的摇床中培养12h。之后，取1mL细菌溶液以3000r/min离心10分钟，并分别收集上清液和细胞。同时加入2.5mmol/mL邻硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷(ONPG)和多杀性巴氏杆菌以检测β-半乳糖苷酶。依次使用各自的测定试剂盒测定上清液中蛋白质，碱性磷酸酶(AKP)，还原糖的浓度。通过测量420nm处的光密度(OD420)来确定上清液中的β-半乳糖苷酶。每个实验进行三次，每组3个重复。
结果见图4-8，由结果可知，褪黑素导致了细胞外蛋白质、还原糖和碱性磷酸酶(该酶位于细胞壁和细胞膜之间)含量以及细胞外β-半乳糖苷酶(该酶位于细胞内)和ATPase活性增加。上述结果表明褪黑素破坏了细胞膜的完整性，从而引起细胞内容物的泄漏。
实施例5褪黑素导致细菌细胞膜的破坏
使用LIVE/DEAD BacLight细菌检测试剂盒评估细菌细胞膜的完整性。将1mL细菌培养物以3000rpm离心10分钟，除去上清液，并用10mL 0.85％NaCl洗涤细胞3次。将沉淀的细胞重悬，并与1mL的0.85％NaCl混合。然后将SYTO 9荧光核酸染料和碘化丙啶等体积混合物(各3μL)添加到重悬液中。将混合液彻底混匀并在室温下于黑暗中孵育15分钟。在载玻片和18mm正方形盖玻片之间添加5μL染色细菌悬浮液。该试剂盒中两种核酸染色剂的组合可区分具有完整膜的活细菌和具有损坏膜的死细菌。活细菌用SYTO9染成绿色，而死细菌则由于碘化丙啶与细菌双链DNA的相互作用而显红色。使用OLYMPUS IX51倒置显微镜拍摄染色细菌的荧光显微照片。每个实验进行三次，重复三次。
由图9可知，在DMSO对照组中，只有少量的红色荧光在16小时出现，但在8或12小时没有出现。相比之下，褪黑素的添加量大于MIC浓度会导致红色荧光升高，绿色荧光降低，且呈现时间和剂量依赖性，因此，褪黑素对细菌细胞膜的损伤具有时间和剂量依赖性。
实施例6褪黑素破坏细菌细胞膜完整性的扫描电子显微镜(SEM)图和透射电子显微镜(TEM)图
采用SEM和TEM评估了褪黑素对P.multocida细胞形态的影响。将1mL新鲜对数期生长的多杀性巴氏杆菌(1×109CFU)添加到100mL含有不同浓度MT(1、2或3mg/mL)的新鲜Martin液体培养基中，以不含MT的DMSO为溶剂对照组，氨苄西林(100μg/mL)为阳性对照组。将所有培养物在37℃摇床中以220rpm摇动8小时，12小时或16小时。细菌样品以3000r/min离心10分钟，除去上清液，收集细胞，用PBS洗涤3次。然后用2.5％新鲜戊二醛固定液固定细胞6小时，PBS洗涤3次，每次10分钟。接着将SEM样品分别用50％，70％，80％，90％乙醇脱水15分钟，然后用100％乙醇脱水3次，每次30分钟。通过叔丁醇洗涤三遍，每次30分钟来去掉乙醇。使用冷冻干燥机将样品干燥，并使用离子溅射装置镀上10nm的金膜。使用场扫描电子显微镜(FESEM，Hitch SU8010)检测样品。
TEM样品用1％-2％柠檬酸固定2-3小时，并用苯基-5-(4-二苯基)-1,3,4恶唑(PBD)洗涤3次，每次10分钟。将样品分别用30％，50％，70％，80％，90％乙醇脱水20分钟，然后用100％乙醇脱水3次，每次30分钟。用丙酮替换乙醇三次，每次30分钟。将细菌样品放在带有formvar膜的铜网格上，并用磷钨酸(2％v/v，pH＝6.7)进行负染。样品表面积小于0.2mm×0.2mm，切片厚度在50至90nm之间(Lycra UC7)。使用TEM(Hitachi H-7650)在80kV下对样品进行检测，并使用Gatan832 CCD相机(Gatan)拍摄照片。每个实验进行两次，每组3个重复。
由图10-11可知，在褪黑素处理之前，所有细菌细胞均显示有完整的外膜(OM)和细胞质膜(CM)。经褪黑素处理的细胞在SEM分析中显示出许多穿过OM，肽聚糖(PG)层和CM的孔。有趣的是，在TEM图中(见图11)，发现褪黑素处理过的细胞中明显存在细胞质空化，这可能是由于细胞内蛋白质聚集或细胞内容物泄漏造成的。
因此，由图4-11结果表明褪黑素通过破坏细菌膜并诱导细胞内容物的泄漏而杀死细菌。
实施例7代谢组分析试验
将1mL新鲜对数期生长的多杀性巴氏杆菌(P.multocida)添加到100mL含1mg/mLMT的新鲜Martin液体培养基中，不含MT的DMSO用作溶剂对照组。将所有培养物在37℃下220rpm摇动孵育12小时。细菌样品在4℃下以3000rpm/min的速度离心10分钟，除去上清液，收集细菌细胞并用PBS洗涤3次。细菌细胞在液氮中快速冷冻，转移至干冰中，送至上海百趣生物技术有限公司进行代谢组分析(Q Exactive Orbitrap，Thermo Fisher Scientific，美国)。通过进行褪黑素处理前后多杀性巴氏杆菌细胞的非靶向代谢组学研究，阐明细菌的具体哪个代谢通路受到褪黑素的影响而发挥其抗菌活性。
通过图12-13结果表明，褪黑素处理后存在大量显著差异代谢产物。由图14可以看出，这些代谢物主要集中在丙酮酸代谢，柠檬酸循环和色氨酸代谢中，基于这些发现，进一步集中研究了TCA循环中相关代谢产物的变化，有趣的是，发现褪黑素处理过的细菌细胞中丙酮酸和乙酰辅酶A显著性上调，而柠檬酸显著性下调，该结果表明褪黑素阻断了从乙酰辅酶A到柠檬酸的途径，从而导致丙酮酸和乙酰辅酶A的积累。
实施例8褪黑素抑制多杀性巴氏杆菌柠檬酸合酶的活性试验
基于代谢组的发现，进行了褪黑素处理后柠檬酸合酶的酶活性的研究。将1mL对数期生长的多杀性巴氏杆菌(1×109CFU)添加到100mL新鲜的无菌马丁氏肉汤培养基中，该培养基含有不同浓度的MT(1mg/mL，2mg/mL，3mg/mL)。不含褪黑素的DMSO作为溶剂对照组，细菌细胞在220rpm的恒温摇床中于37℃培养12h。之后，将1mL细菌溶液以3000r/min离心10分钟，并分别收集上清液和细胞。柠檬酸合酶活性使用测定试剂盒，根据说明书方案测定。每个实验重复三次，每组3个重复。
为了探究褪黑素引起的柠檬酸减少是否是其抑菌的关键环节，研究了外源柠檬酸对褪黑素抑菌作用的影响。
将1mL对数期生长的多杀性巴氏杆菌(1×109CFU)添加到100mL新鲜的无菌马丁氏肉汤培养基中，该培养基含有不同浓度柠檬酸(CA)中(CA-1mg/mL，CA-2mg/mL，CA-3mg/mL)，不含柠檬酸的DMSO作为溶剂对照组，细菌细胞在220rpm的恒温摇床中于37℃培养，测定其生长曲线，每个实验重复三次，每组3个重复。
将1mL对数生长的多杀性巴氏杆菌(1×109CFU)添加到100mL新鲜的无菌马丁氏肉汤培养基中，该培养基含有不同浓度的褪黑素和柠檬酸(CA)中(MT-1mg/mL，MT-2mg/mL，MT-3mg/mL，CA-1mg/mL，CA-2mg/mL，CA-3mg/mL，MT-1mg/mL-CA-1mg/mL，MT-2mg/mL-CA-2mg/mL，MT-3mg/mL-CA-3mg/mL)。不含褪黑素的DMSO作为溶剂对照组，细菌细胞在37℃、220rpm的摇床中培养12h。之后，取1mL细菌溶液以3000r/min离心10分钟，并分别收集上清液和细胞。同时加入2.5mmol/mL邻硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷(ONPG)和多杀性巴氏杆菌以检测β-半乳糖苷酶。依次使用各自的测定试剂盒测定上清液中蛋白质，碱性磷酸酶(AKP)，还原糖的浓度。通过测量420nm处的光密度(OD420)来确定上清液中的β-半乳糖苷酶。每个实验进行三次，每组3个重复。
将1mL对数期生长的多杀性巴氏杆菌(1×109CFU)添加到100mL新鲜的无菌马丁氏肉汤培养基中，该培养基含有不同浓度的褪黑素和柠檬酸(CA)中(MT-1mg/mL，MT-1mg/mL-CA-1mg/mL，MT-1mg/mL-CA-2mg/mL，MT-1mg/mL-CA-3mg/mL；MT-2mg/mL，MT-2mg/mL-CA-1mg/mL，MT-2mg/mL-CA-2mg/mL，MT-2mg/mL-CA-3mg/mL；MT-3mg/mL，MT-3mg/mL-CA-1mg/mL，MT-3mg/mL-CA-2mg/mL MT-3mg/mL-CA-3mg/mL)，不含褪黑素和柠檬酸的DMSO作为溶剂对照组，细菌细胞在220rpm的恒温摇床中于37℃培养12h后，测定其生长曲线。每个实验进行三次，每组3个重复。
将1mL对数期生长的多杀性巴氏杆菌(1×109CFU)添加到100mL新鲜的无菌马丁氏肉汤培养基中，该培养基含有不同浓度的褪黑素和柠檬酸(MT-1mg/mL，MT-2mg/mL，MT-3mg/mL，CA-1mg/mL，CA-2mg/mL，CA-3mg/mL，MT-1mg/mL-CA-1mg/mL，MT-2mg/mL-CA-2mg/mL，MT-3mg/mL-CA-3mg/mL)。不含褪黑素的DMSO作为溶剂对照组，细菌细胞在220rpm的恒温摇床中于37℃培养12h。之后，将1mL细菌溶液以3000r/min离心10分钟，并分别收集上清液和细胞。柠檬酸合酶活性使用测定试剂盒，根据说明书方案测定。每个实验重复三次，每组3个重复。
由图15可知，褪黑素显著性降低了细菌和培养基中的柠檬酸合酶活性。根据图16可见，柠檬酸的添加促进了多杀性巴氏杆菌的生长，表明柠檬酸是细菌正常生长的重要代谢产物。图17结果发现柠檬酸的添加会降低褪黑素对多杀性巴氏杆菌的抗菌活性，TEM分析还显示(见图18)，在褪黑素和柠檬酸的联合作用下，仅由褪黑素引起的细菌细胞质空化和不规则的细胞膜消失了。此外，由图19-23表明，柠檬酸显著性降低了由褪黑素引起的还原糖，蛋白质，AKP酶和β-半乳糖苷酶的释放，以及ATPase的活性，表明柠檬酸拮抗了褪黑素对细菌细胞膜的破坏作用。
实施例9褪黑素对哺乳动物和其他细菌柠檬酸合酶的影响试验
鉴于柠檬酸合酶在哺乳动物细胞中具有重要作用，因此探讨了褪黑素在小鼠腹腔原代巨噬细胞和小鼠肺上皮细胞BNCC341334中的细胞毒性。
每孔接种5×105个细胞于24孔的细胞培养板中，置于37℃，5％CO2培养箱中培养使细胞完全贴壁，用PBS洗去未贴壁的细胞，依次加入终浓度为1，2，3，10mg/mL的褪黑素的培养基，以不含褪黑素的DMSO溶剂作为对照组，褪黑素处理12h后收集上清进行LDH试验，具体试验步骤参照LDH检测试剂盒，每个实验重复三次，每组6个重复。
48孔的微孔板中每孔接种2×105个小鼠肺上皮细胞，置于37℃5％CO2培养箱中培养使细胞完全贴壁后；用1×PBS洗去未贴壁的细胞并加入终浓度为1，2，3，10，20,40mg/mL的褪黑素，对照组加相同体积的DMSO；褪黑素处理30min后，加入1MOI多杀性巴氏杆菌于培养基中继续培养；12h后收集细菌细胞，低温超声裂解细菌细胞后检测柠檬酸合成酶的酶活，具体试验步骤参照柠檬酸合酶酶活检测试剂盒，每个实验重复3次，每组6个重复。
将1mL对数期生长的克雷伯格杆菌，铜绿假单胞菌，肺炎双球菌，肺炎链球菌添加到100mL新鲜的无菌马丁氏肉汤培养基中，该培养基含有不同浓度的褪黑素和柠檬酸(CA)(MT-1mg/mL，MT-1mg/mL-CA-1mg/mL，MT-1mg/mL-CA-2mg/mL，MT-1mg/mL-CA-3mg/mL；MT-2mg/mL，MT-2mg/mL-CA-1mg/mL，MT-2mg/mL-CA-2mg/mL，MT-2mg/mL-CA-3mg/mL；MT-3mg/mL，MT-3mg/mL-CA-1mg/mL，MT-3mg/mL-CA-2mg/mL MT-3mg/mL-CA-3mg/mL)，不含褪黑素和柠檬酸的DMSO作为溶剂对照组，细菌细胞在220rpm的恒温摇床中于37℃培养，12h后测定其生长曲线。
将1mL对数期生长的克雷伯格杆菌，铜绿假单胞菌，肺炎双球菌，肺炎链球菌添加到100mL新鲜的无菌马丁氏肉汤液体培养基中，该培养基含有不同浓度的褪黑素和柠檬酸(MT-1mg/mL，MT-2mg/mL，MT-3mg/mL，CA-1mg/mL，CA-2mg/mL，CA-3mg/mL，MT-1mg/mL-CA-1mg/mL，MT-2mg/mL-CA-2mg/mL，MT-3mg/mL-CA-3mg/mL)。不含褪黑素的DMSO作为溶剂对照组，细菌细胞在220rpm的恒温摇床中于37℃培养12h后，吸取1mL细菌溶液以3000r/min离心10分钟，收集细菌细胞进行柠檬酸合酶活性测定，根据试剂盒说明书方案测定。每个实验重复三次，每组3个重复。
由图24-25可知，在暴露于不同浓度的褪黑素后，在小鼠腹腔原代巨噬细胞和小鼠肺上皮细胞中没有观察到任何增强的细胞毒性；相反，经褪黑素处理的哺乳动物细胞在培养24小时后显示出更高的存活率。另外，褪黑素高达40mg/mL不会影响肺上皮细胞中柠檬酸合酶的酶活性(见图26)，这表明褪黑素对于哺乳动物是安全。由图27-28可知，尽管褪黑素对革兰氏阴性菌(克雷伯氏菌和铜绿假单胞菌)和革兰阳性菌(链球菌和肺炎球菌)均有抗菌活性，但褪黑素仅在克雷伯氏菌和铜绿假单胞菌中显著性降低了柠檬酸合酶的酶活性，且外源添加柠檬酸可以降低褪黑素对克雷伯氏菌和铜绿假单胞菌的抑菌作用，而链球菌和肺炎球菌的柠檬酸合酶酶活不受影响，外源添加柠檬酸也无影响。综上所述，上述数据表明褪黑素通过特异性地抑制细菌柠檬酸合酶的活性并减少柠檬酸的合成而发挥了针对革兰氏阴性细菌的抗菌活性。
实施例10褪黑素预防和治疗细菌感染的试验
鉴于褪黑素显著的体外抑菌活性和新颖的抑菌机制，研究褪黑素在体内的预防和治疗潜力。
1、褪黑素对多杀性巴氏杆菌感染的预防试验：
将购买自第三军医大学的C57小鼠并随机分为四组(每组10只)：多杀性巴氏杆菌+溶剂对照组，多杀性巴氏杆菌+MT(30mg/kg)组，多杀性巴氏杆菌+MT(60mg/kg)组和多杀性巴氏杆菌+MT(120mg/kg)组。在多杀性巴氏杆菌感染前，连续7天(P)或者6天(P-1)腹腔注射MT(早晨注射一次)给予实验组，而对照小鼠接受等量的DMSO。然后，通过腹腔内注射多杀性巴氏杆菌悬浮液(2.2×105CFU)感染小鼠。监测并记录小鼠在7天内的存活率。收集小鼠血样，并将血清保存在-20℃下，供以后进行ELISA测试。收集肺样品，进行无菌匀浆，并通过系列稀释，平板接种和CFU计数对细菌载量进行定量。
2、褪黑素对多杀性巴氏杆菌感染中的治疗试验：
将小鼠随机分为如1所述的四组(每组10只)。实验组通过腹腔注射感染了2.2×105CFU的多杀性巴氏杆菌后，四次腹腔注射MT，首先在多杀性巴氏杆菌感染后30分钟，随后每6小时注射一次，共3次。在相同的四个时间点用给予对照小鼠等量的DMSO。随后，记录小鼠在7天内的存活率。同时，在感染后12h，16h，24h和32h对小鼠进行安乐死以收集组织和血清样品，以用于以后的ELISA和细菌计数分析。
3、褪黑素处理前后小鼠肺部细菌定殖的试验：
为了测量褪黑素处理前后小鼠肺部细菌定殖，在感染后24小时和32小时收集小鼠的肺组织。将组织在无菌条件下匀浆，并通过在盐水中连续稀释10倍来测定细菌含量。将这些不同的稀释液一式三份涂布在马丁氏肉汤琼脂上，并在37℃恒温培养箱中孵育24小时以计数细菌CFU。
4、RT-PCR分析：
采集小鼠肺组织样品，按照总RNA提取试剂盒(Invitrogen)说明书提取小鼠肺组织总RNA的。参照TaKaRa反转录试剂盒说明书制备并反转录cDNA，大致过程如下：
1)基因组DNA消除反应：
反应体系如下：
Figure BDA0002495888490000181
Figure BDA0002495888490000191
反应程序为42℃2min，4℃保存。
2)反转录反应：
反应体系如下：
Figure BDA0002495888490000192
反应程序为37℃15min，85℃5s，4℃保存。
3)qRT-PCR
qRT-PCR的过程参照前期研究进行，β-肌动蛋白被用作参考基因以标准化靶基因的转录水平。特异性引物序列如表2所示。基因的相对表达水平参照公式2-(ΔΔCt)进行，其中ΔΔCt＝(Ct靶基因-Ct内参)实验组-Ct靶基因-Ct内参)对照组。
表2炎性细胞因子引物
Figure BDA0002495888490000193
Figure BDA0002495888490000201
5、酶联免疫吸附测定(ELISA)：
ELISA样品分为血清样品与肺组织匀浆液样品。其中，血清的收集过程为眼球采集小鼠全血，4℃过夜后，5000rpm，离心10min，收集上清于-20℃保存备用。而小鼠肺组织匀浆液制备过程为采集肺组织，加入2mL无菌生理盐水制备匀浆液，再将匀浆液于液氮(5min)和冰水浴中反复冻融3次，然后，于4℃12000rpm，离心10min，收集上清，备用。制备好的血清与肺组织匀浆液上清按试剂盒说明书进行IL-1β，IL-4，IL-6，IL-10，TNF-α和IFN-γ(eBioscience)检测。
结果可知，由图29-34可知，与DMSO组(所有小鼠均在感染100小时内死亡)相比，预防和治疗组显著性提高了小鼠的存活率，显著性降低感染后24小时和32小时小鼠肺组织中的细菌定殖，在120mg/kg的剂量下，细菌定殖量(CFU/g)降低了约2-log10；此外，在多杀性巴氏杆菌感染之前，所有小鼠连续7天腹腔内注射褪黑素其对细菌感染的预防作用。由图35-36结果表明，与对照组相比，当褪黑素的预防剂量提高到60mg/kg或以上时，小鼠的存活率显着提高，肺中的细菌计数显著降低。甚至在多杀性巴氏杆菌感染前24小时撤掉褪黑素，褪黑素对细菌的感染仍然有显著地预防作用(见图33-34)。最后，我们分别在细菌感染后30分钟，6小时，12小时和18小时腹腔注射四次褪黑素来探讨褪黑素对多杀性巴氏杆菌感染的治疗作用。结果发现具有明显的保护作用，包括提高存活率和减轻小鼠肺部细菌定殖(见图35,36)。肺部炎症是多杀性巴氏杆菌感染的最重要病理特征。有趣的是，在感染后24小时，RT-PCR和ELISA分析发现褪黑素显著性降低了IL-1β，IL-6，IFN-γ和TNF-α的表达，而促进了IL-4和IL-10的转录和表达(见图37-54)。这些数据证明褪黑素通过抑制促炎因子和激活抗炎来减轻炎症反应。总体而言，这些数据表明褪黑素除了具有直接的抗菌作用外，还通过多种作用方式控制细菌感染，包括降低体内的炎症反应和细菌毒力。总的来说，这些数据表明褪黑素可以有效预防和治疗多杀性巴氏杆菌疾病。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 华南农业大学
<120> 褪黑素在制备抑制和/或杀灭细菌的药物中的应用
<160> 14
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> IL-1β上游引物(Artificial Sequence)
<400> 1
atgaaagacg gcacacccac 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> IL-1β下游引物(Artificial Sequence)
<400> 2
gcttgtgctc tgcttgtgag 20
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> TNF-α上游引物(Artificial Sequence)
<400> 3
aggcactccc ccaaaagat 19
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> TNF-α下游引物(Artificial Sequence)
<400> 4
tgagggtctg ggccatagaa 20
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> IFN-γ上游引物(Artificial Sequence)
<400> 5
gctttgcagc tcttcctca 19
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> IFN-γ下游引物(Artificial Sequence)
<400> 6
cttttgccag ttcctccag 19
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> IL-6上游引物(Artificial Sequence)
<400> 7
tgcaagagac ttccatccag t 21
<210> 8
<211> 18
<212> DNA
<213> IL-6下游引物(Artificial Sequence)
<400> 8
gtgaagtagg gaaggccg 18
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> IL-4上游引物(Artificial Sequence)
<400> 9
ccatatccac ggatgcgaca 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> IL-4下游引物(Artificial Sequence)
<400> 10
aagcaccttg gaagccctac 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> IL-10上游引物(Artificial Sequence)
<400> 11
ggcgctgtca tcgatttctc 20
<210> 12
<211> 21
<212> DNA
<213> IL-10下游引物(Artificial Sequence)
<400> 12
atggccttgt agacaccttg g 21
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> Beta-actin上游引物(Artificial Sequence)
<400> 13
gtccaccttc cagcagatgt 20
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> Beta-actin下游引物(Artificial Sequence)
<400> 14
gaaagggtgt aaaacgcagc 20

Claims (7)

1.褪黑素在制备抑制和/或杀灭细菌的药物中的应用，其特征在于，所述细菌为多杀性巴氏杆菌。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，褪黑素用于制备损伤细菌细胞膜的药物。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，褪黑素用于制备细菌代谢阻断剂。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的细菌代谢阻断的途径包括丙酮酸代谢、柠檬酸循环和色氨酸代谢。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，褪黑素用于制备抑制多杀性巴氏杆菌中柠檬酸合酶活性的药物。
6.褪黑素在制备预防和/或治疗多杀性巴氏杆菌感染疾病的药物中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，褪黑素用于制备抑制肺部炎症的药物。
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