JP2023504887A - サルモネラ菌ｉｉｉ型分泌系阻害剤の製造におけるミリセチンの使用 - Google Patents
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Abstract
本発明は、サルモネラ菌ＩＩＩ型分泌系阻害剤の製造におけるミリセチンの使用に関する。ヒト子宮頸がん細胞（ＨｅＬａ）を感染ベクターとし、インビトロ試験及びインビボ試験によりミリセチンがＩＩＩ型分泌系の機能を阻害することによりサルモネラ菌感染に対して顕著な阻害作用を発揮することが証明された。従来の抗生物質がサルモネラ菌を直接殺す作用メカニズムと比較して、漢方薬化合物ミリセチンは、サルモネラ菌ＩＩＩ型分泌系の機能を直接阻害することで抗感染の作用を発揮するため、細菌に加える選択圧が小さく、細菌の薬剤耐性が発生しにくく、由来源が広く、小外が低く、治癒率が高いという利点を有する。
Description
本発明は、サルモネラ菌三型分泌系（Ｔ３ＳＳ）に対するミリセチンの阻害及びサルモネラ菌感染の治療薬の製造におけるミリセチンの使用に関し、医学製薬技術分野に属する。
１８８５年、サルモネラらは最初にサルモネラコレラエスイスを分離し、サルモネラ菌と名付けた。サルモネラ菌はグラム陰性桿菌で、両端が鈍く、胞子がなく、通常は莢膜がない。これは、人間や動物に食中毒を引き起こす主要な食品媒介性病原体の１つであり、世界の公衆衛生において非常に重要な人獣共通感染症の病原体でもある。サルモネラ菌は、人間に感染するだけでなく、多くの動物にも感染する可能性がある。人間や動物が感染した後に無症状又は保菌状態にある場合もあれば、臨床症状を伴う致命的な疾患として現れる場合もあり、罹患率又は死亡率を増加させたり、動物の生殖生産性を低下させたりする可能性がある。現在、サルモネラ感染は臨床的に制御することが困難であり、治療効果はしばしば不十分であり、家畜及び家禽の繁殖産業に莫大な経済的損失を引き起こし、公衆衛生及び食品安全を深刻に脅かしている。現在、抗生物質はサルモネラ感染の治療に一般的に使用されているが、抗生物質の長期使用と乱用により、サルモネラ菌の耐性が高まり、薬剤耐性の範囲が広くなる問題がある。そこで、サルモネラ感染を予防及び治療するための新しい抗感染戦略及び薬物を開発する必要がある。
近年の研究により、病原菌の病原性は、それが分泌する様々な毒性タンパク質又はエフェクタータンパク質に緊密に関連していることが発見された。しかし、これらのタンパク質分子は、細菌の生命に必須な成分ではない。ＩＩＩ型分泌系（Ｔ３ＳＳ）は、グラム陰性菌に広く分布しており、その主な機能は、病原性因子を分泌及び輸送することである。サルモネラ菌は、その病原性が２つのＴ３ＳＳシステムによりエフェクタータンパク質を分泌し、それぞれ細菌の侵入及び細胞内での増殖を媒介し、その病原性過程において決定的な役割を果たしている。そのため、Ｔ３ＳＳエフェクタータンパク質又はタンパク質複合体を標的とする薬物スクリーニング戦略は、新しい研究方向になっており、抗感染作用を発揮するだけでなく、細菌に対する選択圧が小さく、薬剤耐性を誘発しにくい。
ミリセチンは、黄色針状結晶であり、ヤマモモ科ヤマモモ属植物であるヤマモモの葉、皮、根の抽出物であり、様々な薬理学的活性、例えば、血糖降下、抗酸化、肝臓保護、抗血栓、微小循環改善などの作用を有する。現在、国内にも海外にもミリセチンがサルモネラ菌ＩＩＩ型分泌系の機能を阻害することでサルモネラ菌感染に対抗できるという報告はない。
本発明のミリセチンのＣＡＳ登録番号は５２９－４４－２であり、分子式はＣ１５Ｈ１０Ｏ８であり、分子量は３１８．２４である。
ミリセチンの化学構造式は、下式である。
本発明では、サルモネラ菌ＩＩＩ型分泌系エフェクタータンパク質を薬物標的としてスクリーニングして得られた天然化合物ミリセチンは、比較的低濃度でＴ３ＳＳの重要なエフェクタータンパク質ＳｉｐＡの輸送を遮断することによりサルモネラ菌Ｔ３ＳＳの機能を阻害し、細菌の増殖に影響を与えることなく、エフェクタータンパク質（ＳｉｐＡ、ＳｉｐＢ及びＳｉｐＣ）の発現レベルを低下させる。インビトロ試験により、有効濃度範囲内でミリセチンは細胞毒性を有さず、ミリセチンでサルモネラ菌を前処理した後、サルモネラ菌がＨｅＬａ細胞に侵入する能力が顕著に低下することが示されている。インビボ試験では、ミリセチンで治療した後、サルモネラ菌感染マウスの生存率は４２．８６％に達し、標的臓器（肝臓、脾臓及び盲腸）でのコロニー定着数は顕著に減少した。
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明はこれらの実施例により制限されない。本発明の技術的手段から逸脱しない範囲で本発明に加えた当業者によって実現されやすい任意の変更又は変化は全て本発明の特許請求の範囲内に含まれる。
実施例１
ミリセチンは、サルモネラ菌Ｔ３ＳＳ阻害剤としてサルモネラ菌感染の治療薬の製造に使用され、薬学的に許容可能な任意の担体に使用される。
ミリセチンは、サルモネラ菌Ｔ３ＳＳ阻害剤としてサルモネラ菌感染の治療薬の製造に使用され、薬学的に許容可能な任意の担体に使用される。
実施例２
ミリセチンは、サルモネラ菌Ｔ３ＳＳ阻害剤として感染性疾患の治療薬の製造に使用される。
ミリセチンは、サルモネラ菌Ｔ３ＳＳ阻害剤として感染性疾患の治療薬の製造に使用される。
実施例３
ミリセチンは、サルモネラ菌Ｔ３ＳＳ阻害剤として細菌による感染性疾患、特にサルモネラ菌による人獣共通感染症（腸チフス、パラチフス、胃腸炎及びひな白痢などの疾患を含む）の治療に使用される。
ミリセチンは、サルモネラ菌Ｔ３ＳＳ阻害剤として細菌による感染性疾患、特にサルモネラ菌による人獣共通感染症（腸チフス、パラチフス、胃腸炎及びひな白痢などの疾患を含む）の治療に使用される。
１．サルモネラ菌ＩＩＩ型分泌系阻害剤のスクリーニング
β－ラクタマーゼ－ＳｉｐＡ融合レポータープラスミドシステム及びその蛍光基質ＣＣＦ－４を用いてサルモネラ菌III型分泌系の機能に対する試験化合物の影響を調べた。天然化合物とサルモネラ菌を事前に共インキュベートした後、細胞に感染させ、次に、細胞に感染させた後に異なる色の蛍光信号に応じて阻害剤のスクリーニングを行い、ウエスタンブロットによりＴ３ＳＳ侵入関連エフェクタータンパク質の発現に対するミリセチンの影響を調べた。
β－ラクタマーゼ－ＳｉｐＡ融合レポータープラスミドシステム及びその蛍光基質ＣＣＦ－４を用いてサルモネラ菌III型分泌系の機能に対する試験化合物の影響を調べた。天然化合物とサルモネラ菌を事前に共インキュベートした後、細胞に感染させ、次に、細胞に感染させた後に異なる色の蛍光信号に応じて阻害剤のスクリーニングを行い、ウエスタンブロットによりＴ３ＳＳ侵入関連エフェクタータンパク質の発現に対するミリセチンの影響を調べた。
結果：β－ラクタマーゼ－ＳｉｐＡ融合レポータープラスミドシステム及び免疫蛍光図から分かるように、陽性対照群（Ｔ３ＳＳエフェクタータンパク質ＳｉｐＡは細胞内に正常に輸送することができ、細胞は青色蛍光を呈する）と比較して、ミリセチンは、濃度が８μｇ／ｍｌである場合に細胞外から細胞内へのサルモネラ菌Ｔ３ＳＳエフェクタータンパク質ＳｉｐＡの輸送を顕著に阻害でき、正常機能を失い（視野内のほとんどの細胞は緑色蛍光を呈する）、サルモネラ菌ｉｎｖＡ遺伝子ノックアウト株感染群の結果と同様であった（ｉｎｖＡはＴ３ＳＳシステムエフェクタータンパク質の輸送を媒介する重要な遺伝子であり、ノックアウトされると正常機能を失うため、細胞は緑色蛍光を呈する）。ウエスタンブロットの結果から分かるように、ミリセチンで前処理した後、サルモネラ菌Ｔ３ＳＳ侵入関連エフェクタータンパク質（ＳｉｐＡ、ＳｉｐＢ及びＳｉｐＣ）の発現レベルは、さまざまな程度に低下し、ミリセチンがサルモネラ菌ＩＩＩ型分泌系エフェクタータンパク質ＳｉｐＡの輸送及び侵入関連エフェクタータンパク質（ＳｉｐＡ、ＳｉｐＢ及びＳｉｐＣ）の発現を阻害することによりサルモネラ菌Ｔ３ＳＳの機能に影響を与えることを示している（図１）。
２．サルモネラ菌増殖に対するミリセチンの影響
サルモネラ菌をＬＢ液体培地（０．３ＭのＮａＣｌ）に接種し、一晩培養し（３７℃、２００ｒｐｍ）、翌日、ＯＤ ６００ｎｍが約０．３となるように１：１００で拡大培養した後、三角フラスコ（２０ｍｌ／本）に分注し、薬物非添加群及び各濃度ミリセチン処理群をそれぞれ設けた。３７℃、２００ｒｐｍで引き続き培養し、細菌がプラトー段階に増殖するまで３０ｍｉｎごとに各群サンプルのＯＤ ６００ｎｍを測定して記録した。
サルモネラ菌をＬＢ液体培地（０．３ＭのＮａＣｌ）に接種し、一晩培養し（３７℃、２００ｒｐｍ）、翌日、ＯＤ ６００ｎｍが約０．３となるように１：１００で拡大培養した後、三角フラスコ（２０ｍｌ／本）に分注し、薬物非添加群及び各濃度ミリセチン処理群をそれぞれ設けた。３７℃、２００ｒｐｍで引き続き培養し、細菌がプラトー段階に増殖するまで３０ｍｉｎごとに各群サンプルのＯＤ ６００ｎｍを測定して記録した。
結論：７ｈの培養期間内では、ミリセチン処理群（０～３２μｇ／ｍｌ）は、薬物非添加処理群と比較して、細菌がプラトー段階に増殖したときのＯＤ ６００ｎｍ値に有意差がなく、ミリセチンが有効濃度の範囲内に細菌の正常増殖に影響を与えないことを示している（表１）。
３．サルモネラ菌侵入宿主細胞に対するミリセチンの影響
３．１ミリセチンは宿主細胞に対して細胞毒性がない。
ＨｅＬａ細胞を９６ウェルプレート（２．０×１０４個／ウェル）に接種して一晩培養し、翌日にそれぞれ各濃度ミリセチン処理群、ＤＭＥＭ群（ＤＭＥＭ処理群；薬物を添加しない）及び０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ群（ミリセチンを添加しない。細胞が完全に溶解して死亡することを確保できる）に加え、各群について３回繰り返し、１０００ｒｐｍで１０ｍｉｎ遠心分離し、３７℃インキュベータで８ｈ培養した後、１０００ｒｐｍで１０ｍｉｎ遠心分離し、細胞培養上清を取って新しい９６ウェルプレートに移し、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）キットの説明書に従って４９２ｎｍでの吸光度を測定し、各群のＬＤＨ放出率を算出した。算式はＬＤＨ放出率（％）＝（試験群－ＤＭＥＭ対照群）／（０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ群－ＤＭＥＭ対照群）である。
３．１ミリセチンは宿主細胞に対して細胞毒性がない。
ＨｅＬａ細胞を９６ウェルプレート（２．０×１０４個／ウェル）に接種して一晩培養し、翌日にそれぞれ各濃度ミリセチン処理群、ＤＭＥＭ群（ＤＭＥＭ処理群；薬物を添加しない）及び０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ群（ミリセチンを添加しない。細胞が完全に溶解して死亡することを確保できる）に加え、各群について３回繰り返し、１０００ｒｐｍで１０ｍｉｎ遠心分離し、３７℃インキュベータで８ｈ培養した後、１０００ｒｐｍで１０ｍｉｎ遠心分離し、細胞培養上清を取って新しい９６ウェルプレートに移し、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）キットの説明書に従って４９２ｎｍでの吸光度を測定し、各群のＬＤＨ放出率を算出した。算式はＬＤＨ放出率（％）＝（試験群－ＤＭＥＭ対照群）／（０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ群－ＤＭＥＭ対照群）である。
結論：ミリセチン非添加処理群と比較して、０～４μｇ／ｍｌの濃度範囲内である場合、ミリセチンはＨｅＬａ細胞に対してほとんど毒性を有しない（表２）。
３．２サルモネラ菌に媒介されるＨｅＬａ細胞損傷に対するミリセチンの保護作用
ＨｅＬａ細胞を９６ウェルプレート（２×１０４個／ウェル）に接種し、一晩培養し、ΔｉｎｖＡ－ＳＬ１３４４、サルモネラ菌を新鮮なＬＢ（０．３ＭのＮａＣｌを含む）培地に接種して一晩培養（３７℃，２００ｒｐｍ）し、翌日に１：１００で拡大培養し、それぞれブランク対照群、ΔｉｎｖＡ－ＳＬ１３４４及び各濃度ミリセチン処理群に分け、３７℃、２００ｒｐｍで４ｈインキュベートした後、各群のＯＤ ６００ｍを測定し、ＤＭＥＭで菌液の濃度を調整し、ＭＯＩ＝１００で細胞に感染させ、各群について３回繰り返し、１０００ｒｐｍで１０ｍｉｎ遠心分離した後、３７℃インキュベータで５ｈ培養し、１０００ｒｐｍで１０ｍｉｎ遠心分離した後、細胞培養上清を取って新しい９６ウェルプレートに移し、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）キットの説明書に従って４９２ｎｍでの吸光度を測定し、各群のＬＤＨ放出率を算出した。
ＨｅＬａ細胞を９６ウェルプレート（２×１０４個／ウェル）に接種し、一晩培養し、ΔｉｎｖＡ－ＳＬ１３４４、サルモネラ菌を新鮮なＬＢ（０．３ＭのＮａＣｌを含む）培地に接種して一晩培養（３７℃，２００ｒｐｍ）し、翌日に１：１００で拡大培養し、それぞれブランク対照群、ΔｉｎｖＡ－ＳＬ１３４４及び各濃度ミリセチン処理群に分け、３７℃、２００ｒｐｍで４ｈインキュベートした後、各群のＯＤ ６００ｍを測定し、ＤＭＥＭで菌液の濃度を調整し、ＭＯＩ＝１００で細胞に感染させ、各群について３回繰り返し、１０００ｒｐｍで１０ｍｉｎ遠心分離した後、３７℃インキュベータで５ｈ培養し、１０００ｒｐｍで１０ｍｉｎ遠心分離した後、細胞培養上清を取って新しい９６ウェルプレートに移し、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）キットの説明書に従って４９２ｎｍでの吸光度を測定し、各群のＬＤＨ放出率を算出した。
結論：ＳＬ１３４４群と比較して、各濃度ミリセチン（２μｇ／ｍｌ～８μｇ／ｍｌ）処理群では、ＬＤＨ放出率は、それぞれ６１．５６％±０．０６３、３４．３０％±０．００８及び１３．０３％±０．０１６に低下し、ミリセチンがサルモネラ菌に媒介されるＨｅＬａ細胞の損傷を効果的に緩和できることを示している（表３）。
４．マウスサルモネラ菌感染に対するミリセチンの保護作用
４．１サルモネラ菌感染マウスモデルの構築
６－８週齢の雌Ｂａｌｂ／ｃマウス（体重１６～１８ｇ）を２～３日間適応飼育し、５ｇ／Ｌストレプトマイシン飲料水で２４ｈ前処理し、感染前に１２ｈ絶食させ、強制経口投与によりサルモネラ菌（５×１０７ＣＦＵ／匹）を投与してマウス感染サルモネラ菌腸炎モデルを構築した。
４．１サルモネラ菌感染マウスモデルの構築
６－８週齢の雌Ｂａｌｂ／ｃマウス（体重１６～１８ｇ）を２～３日間適応飼育し、５ｇ／Ｌストレプトマイシン飲料水で２４ｈ前処理し、感染前に１２ｈ絶食させ、強制経口投与によりサルモネラ菌（５×１０７ＣＦＵ／匹）を投与してマウス感染サルモネラ菌腸炎モデルを構築した。
４．２保護率試験
ストレプトマイシンで前処理したマウスを健康対照群、サルモネラ菌感染＋生理食塩水処理群、サルモネラ菌感染＋ミリセチン処理群、欠失株感染＋生理食塩水処理群にランダムに分けた。サルモネラ菌感染＋ミリセチン処理群に対して、細菌でマウスを感染させた後、１００ｍｇ／ｋｇミリセチンを強制経口投与（３回／日、５日間連続）した。サルモネラ菌感染＋生理食塩水処理群及び欠失株感染＋生理食塩水処理群に対しては、同じ時間内で対応体積の生理食塩水を強制経口投与し、健康対照群に対しては、何も処理しなかった。異なる処理群マウスの精神状態及び死亡状況を１０日間連続して統計をとった。
ストレプトマイシンで前処理したマウスを健康対照群、サルモネラ菌感染＋生理食塩水処理群、サルモネラ菌感染＋ミリセチン処理群、欠失株感染＋生理食塩水処理群にランダムに分けた。サルモネラ菌感染＋ミリセチン処理群に対して、細菌でマウスを感染させた後、１００ｍｇ／ｋｇミリセチンを強制経口投与（３回／日、５日間連続）した。サルモネラ菌感染＋生理食塩水処理群及び欠失株感染＋生理食塩水処理群に対しては、同じ時間内で対応体積の生理食塩水を強制経口投与し、健康対照群に対しては、何も処理しなかった。異なる処理群マウスの精神状態及び死亡状況を１０日間連続して統計をとった。
結論：ｉｎｖＡ欠失株群及び健康対照群は、１０ｄ内でいずれも死亡が発生せず、生存率が１００．００％であった。感染群は、６日目及び８日目の死亡率がそれぞれ５７．１４％及び１００．００％であった。感染治療群は、７日目の生存率が４２．８６％であり、保護率が感染群よりも顕著に高かった（図２）。
４．４標的臓器でのコロニー定着数の測定
感染後の５日目に、頸椎脱臼でマウスを安楽死させ、各群マウスの肝臓、脾臓及び盲腸組織を取り、重量を量り、研磨して組織ホモジネートを調製し、ＰＢＳで倍加希釈した後、ストレプトマイシン耐性ＬＢ寒天細菌培養プレートを塗布し、３７℃で１２ｈ培養した後、コロニーを計数した。
感染後の５日目に、頸椎脱臼でマウスを安楽死させ、各群マウスの肝臓、脾臓及び盲腸組織を取り、重量を量り、研磨して組織ホモジネートを調製し、ＰＢＳで倍加希釈した後、ストレプトマイシン耐性ＬＢ寒天細菌培養プレートを塗布し、３７℃で１２ｈ培養した後、コロニーを計数した。
結論：感染群と比較して、ミリセチンで治療した後、マウス標的臓器（肝臓、脾臓、肺）は顕著に減少した（図３）。
以上より、本発明は、サルモネラ菌に哺乳動物細胞（ＨｅＬａ）を感染させ、細胞レベルの薬物保護効果評価モデルを構築し、経口投与でサルモネラ菌に感染する方式によりサルモネラ菌感染マウスモデルの確立に成功した結果、ミリセチンはサルモネラ菌感染マウスの死亡率を低下させ、肝臓、脾臓及び盲腸でのコロニー定着を阻害することを発見した。これらの研究は、サルモネラ菌感染治療薬の研究開発に対してアイデア及び基礎を提供する。
Claims (3)
- サルモネラ菌ＩＩＩ型分泌系阻害剤及びサルモネラ菌感染の治療物の製造におけるミリセチンの使用。
- 前記治療薬ミリセチンは、薬学的に許容可能な担体であることを特徴とする、請求項１に記載のサルモネラ菌感染の治療薬の製造におけるミリセチンの使用。
- 前記感染は、サルモネラ菌による感染であることを特徴とする、請求項１に記載のサルモネラ菌感染の治療薬の製造におけるミリセチンの使用。
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| CN201911243651.2A CN110859832A (zh) | 2019-12-06 | 2019-12-06 | 杨梅素在制备沙门氏菌ⅲ型分泌系统抑制剂中的应用 |
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| TSOU, LUN K ET AL., JOURNAL OF THE AMERICAN CHEMICAL SOCIETY, vol. 138, JPN6023022960, 2016, pages 2209 - 2218, ISSN: 0005079120 * |
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