WO2018160104A1 - Композиция антимикробных препаратов для лечения инфекционных заболеваний людей и животных и способ её применения - Google Patents

Композиция антимикробных препаратов для лечения инфекционных заболеваний людей и животных и способ её применения Download PDF

Info

Publication number
WO2018160104A1
WO2018160104A1 PCT/RU2018/050008 RU2018050008W WO2018160104A1 WO 2018160104 A1 WO2018160104 A1 WO 2018160104A1 RU 2018050008 W RU2018050008 W RU 2018050008W WO 2018160104 A1 WO2018160104 A1 WO 2018160104A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
antibiotic
pharmaceutical composition
mic
antibiotics
alkylresorcinol
Prior art date
Application number
PCT/RU2018/050008
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Юрий Александрович НИКОЛАЕВ
Галина Ивановна ЭЛЬ-РЕГИСТАН
Наталия Геннадиевна ЛОЙКО
Original Assignee
Юрий Александрович НИКОЛАЕВ
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Юрий Александрович НИКОЛАЕВ filed Critical Юрий Александрович НИКОЛАЕВ
Publication of WO2018160104A1 publication Critical patent/WO2018160104A1/ru

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/045—Hydroxy compounds, e.g. alcohols; Salts thereof, e.g. alcoholates
    • A61K31/047—Hydroxy compounds, e.g. alcohols; Salts thereof, e.g. alcoholates having two or more hydroxy groups, e.g. sorbitol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/41—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with two or more ring hetero atoms, at least one of which being nitrogen, e.g. tetrazole
    • A61K31/425—Thiazoles
    • A61K31/429—Thiazoles condensed with heterocyclic ring systems
    • A61K31/43—Compounds containing 4-thia-1-azabicyclo [3.2.0] heptane ring systems, i.e. compounds containing a ring system of the formula, e.g. penicillins, penems
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/63—Compounds containing para-N-benzenesulfonyl-N-groups, e.g. sulfanilamide, p-nitrobenzenesulfonyl hydrazide
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/65—Tetracyclines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/10—Antimycotics

Definitions

  • the invention relates to the field of medicine, pharmacology and veterinary medicine, namely to the treatment of infectious diseases through the use of combined antimicrobial agents (AMP).
  • New AMPs can be used to treat infectious diseases caused by microorganisms, both in humans (cholera, plague, anthrax, pneumonia, wound infections, nosocomial infections, intestinal infections, etc.), and in animals (anthrax, foot and mouth disease, glanders , brucellosis, pneumonia, etc.).
  • ADB is formed in two ways:
  • the transition to the state of persisters and their germination is associated with the acceleration of adaptive resistance processes, including antibiotics, which is considered as a path to genetically inherited antibiotic resistance (Cohen, NR et al. Microbial persistence and the road to drug resistance. Cell Host Microbe. 2013; 13: 632-642).
  • pathogenic bacteria can form the so-called biofilms, a special extracellular state of bacteria, when the cells are joined by an extracellular matrix of extracellular polymers and attached to the surface of organs. In this state, microbial cells are extremely resistant to antibiotics. Therefore, the following approaches are promising for antibiotic therapy:
  • the third area is the use of non-antibiotic supplements that enhance the action of AB, which is promising for combating ADB (Brown D. Antibiotic resistance breakers: can repurposed drugs fill the antibiotic discovery void? Nat Rev Drug Discov. 2015 Dec; 14 (12) : 821-32).
  • One of the four classes of antibiotic enhancers are substances that weaken the defense mechanisms of microorganisms. To this class belong the substances described in the present invention.
  • Known drugs containing one antimicrobial drug and a substance that prevents its destruction by bacteria for example, a beta-lactam antibiotic and an inhibitor of the enzyme that destroys this antibiotic, beta-lactamase.
  • Brown D. Antibiotic resistance breakers can repurposed drugs fill the antibiotic discovery void? Nat Rev Drag Discov. 2015 Dec; 14 (12): 821-32) discusses drug compounds that are used for other purposes, which enhance the effect of antibiotics. This direction is considered as very promising because for such combinations of two previously registered compounds, both the time to implementation in medical practice and the cost of developing and bringing to practice are reduced. It is this approach to the creation of new batteries that we took as the basis for this development. Thus, an analysis of the scientific and patent literature indicates that none of the known AMPs ensures the absence of development of resistance to it from pathogenic bacteria. In addition, many antibiotics can cause side effects, and the urgent task of lowering the dosage used.
  • the present invention is the development and creation of an antimicrobial drug for the treatment of infectious diseases of microbial etiology caused by both antibiotic-sensitive and antibiotic-resistant bacteria, as well as to prevent the development of resistance of pathogenic bacteria.
  • the technical result of this invention is the development and creation of a pharmaceutical composition, which is a combined antimicrobial drug, which
  • compositions for systemic administration consisting of at least a therapeutically effective amount of an antibiotic and C 4 _7-alkylresorcinol, and further comprising a pharmaceutically acceptable solvent and / or excipient.
  • the pharmaceutical composition of the invention may further comprise other pharmaceutically acceptable excipients.
  • the specified composition may be present additional pharmacologically active medicinal substances, in addition to the specified antibiotic and C4_7-alkylresorcinol. Examples of such substances are additional antibiotics (when using a combination of antibiotics), or other substances that enhance the therapeutic (or antimicrobial) effect of the composition according to the invention, or provide its reduced toxicity to humans and animals.
  • the C 4 _7-alkylresorcinol is 4-n-butylresorcinol, 4-hexylresorcinol, or 5 geptilrezortsin.
  • the solvent, or solubilizer is ethyl alcohol, dimethyl sulfoxide, or a detergent.
  • the antibiotic is selected from the group of polypeptides, aminoglycosides, tetracyclines, macrolides of glycopeptides, chloramphenicol, beta-lactams, rubomycin, quinolones, oxazolidinones, lincosamides, cyclolipopeptides, cephalosporins, anti-fusidic acid, sulfanic acid, or sulfanic acid.
  • the mass fraction of C4-7-alkylresorcinol in the composition is not more than 0.1%. In some other preferred embodiments, the mass fraction of C4-7-alkylresorcinol in the composition is not less than 0.001%.
  • the antibiotic and C 4 _7-alkylresorcinol are taken in a ratio that provides at least a two-fold reduction in the minimum inhibitory concentration of the antibiotic.
  • the infectious disease of microbial etiology is caused by a bacterial infection, protozoal infection or fungal infection.
  • the infectious disease of microbial etiology is caused by gram-positive bacteria.
  • the infectious disease of microbial etiology is caused by gram-negative bacteria.
  • the infectious disease of microbial etiology is caused by fungi.
  • the infectious disease of microbial etiology is caused by protozoa.
  • the subject is a human or animal.
  • the invention also provides for the preparation of compositions of the invention.
  • the invention also includes the use of the compositions of the invention for the treatment of infectious diseases of microbial etiology in a subject in need of such treatment.
  • Another aspect of the present invention is a method of treating infectious diseases of microbial etiology, comprising administering to the subject the compositions of the invention.
  • the specified technical result is also achieved using a method of treating an infectious disease, comprising systemically administering the above pharmaceutical composition to a subject in need of such treatment.
  • a pharmaceutical composition in the method, can be prepared immediately prior to its administration by mixing the components in the required proportions.
  • the components of the pharmaceutical composition may be separately administered to the subject.
  • composition and method of the present invention are also applicable for the treatment of an infectious disease in a subject caused by a relatively antibiotic-resistant strain of microorganisms.
  • the resistance of the microorganism strain to the antibiotic can be tested before the introduction of the pharmaceutical composition to the subject.
  • the treatment method is characterized in that the pharmaceutical composition can be obtained immediately before its introduction by mixing the components in the required proportions.
  • the subject is a human or animal.
  • Figure 1 Diagram showing the content of M.smegmatis bacteria in the spleen of white mice (CFU / g of spleen) in different variants of adding antimicrobial agents.
  • Figure 2 Diagram showing the efficacy of 4-hexylresorcinol (GH) in the treatment of mouse klebsial infection. A) The proportion of mice surviving at the late start of treatment for infection,%. B) The value of fully cured mice at an early onset of infection,%.
  • GH 4-hexylresorcinol
  • Resorcinol (resorcinol, 1,3-dihydroxybenzene) - meta-dihydroxybenzene:
  • alkyl as used herein means a radical of a number of saturated hydrocarbons, and includes both straight and branched alkyl groups. Also, the term “alkyl” as used herein refers to groups typically having four to seven carbon atoms. For example, the term —C 4 _7-alkyl means butyl, hexyl, etc.
  • C ⁇ -alkylresorcinol refers in particular to 4-n-butylresorcinol, 4-hexylresorcinol or 5-heptylresorcinol.
  • 4-hexylresorcinol is 1,3-dioxi-4-n-hexylbenzene, which can be represented by the following structural formula:
  • solvent and / or excipient refers to those solvents and / or excipients which, being inactive ingredients, within the framework of a medical opinion, are suitable for use in contact with human and animal tissues without undue toxicity, irritation, allergic reaction and etc. and meet a reasonable balance of benefits and risks.
  • “Inactive ingredients” are part of the drug to improve its solubility, pharmacokinetic data and / or stability. Inactive ingredients include many substances known to those skilled in the pharmaceutical art, such as substances for controlling pH or osmotic pressure, antibacterial agents, antioxidants, surfactants, cryostabilizers, preservatives, solvents, thickeners, disintegrants, and other substances.
  • terapéuticaally effective amount means that amount of a pharmaceutical composition that will effectively inhibit the growth and / or viability of the microorganisms that caused the infection, and thus lead to the recovery of the subject having the infection.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is intended for systemic administration to a subject in need of treatment of an infectious disease of microbial etiology.
  • Systemic administration means a medicine with blood flow is transported throughout the body. Options for this administration are enteral, oral or parenteral administration.
  • subject encompasses all types of mammals, preferably humans.
  • the resistance (including relative) of the microorganism to the antibiotic can be determined by any method known to specialists in microbiology.
  • compositions in which at least two components are combined, one of which is one of the known antibiotics approved for use in medical or veterinary practice, and the second is one of C 4 _7-alkylresorcinol, preferably selected from 4- hexylresorcinol, 5-heptylresorcinol or 4-n-butylresorcinol.
  • the composition includes a pharmaceutically acceptable carrier, diluent and / or excipient. These can be substances that promote the solubilization of components, for example, ethyl alcohol, dimethyl sulfoxide or detergents.
  • the amount and ratio of active substances depends on the type of microorganism and the type of antibiotic used.
  • the composition according to the invention contains 4-hexylresorcinol and one of the antibiotics selected from the group of betalactams, macrolides, aminoglycosides, tetracyclines, chloramphenicol, glycopeptides, polypeptides, quinolones, rubomycin, sulfanilamides, isoniazid, antifungal or antifungal antibiotics.
  • the composition contains a solubilizing agent
  • the mass ratio of AR: antibiotic mainly lies in the range of 1000-0.05: 1.
  • the percentage of solubilizing agents in the composition should be sufficient to dissolve the components, for example, the content of ethyl alcohol can be 0.5-50%.
  • Studies have shown that the use of the new combined AMP according to the invention is effective against gram-positive and gram-negative bacteria, as well as fungi and protozoa.
  • the new AMPs of the invention effectively prevent or minimize the development of microbial forms of experience (persistence) - cells remaining after exposure to an antibiotic, and also prevent or minimize the development of resistance (resistance) of microorganisms to the antimicrobial agents used.
  • alkylresorcinol has a polymodal effect on bacterial cells: they can modify the structure of membranes, proteins, nucleic acids, and thus change their functional activity.
  • a malfunction of the membranes occurs: the membranes pass from a physiological liquid crystalline state to a solid crystalline state, which leads to a decrease in the respiratory activity of the cell, to a violation of other membrane functions of the cell.
  • the activity of membrane molecular pumps that remove antibiotics from the cell may also decrease (one of the main mechanisms of ADB).
  • AR can directly bind to DNA, changing their topology and, therefore, functional properties
  • ARs reduce the activity of enzymes that serve DNA (replication, repair, transcription, topology, storage)
  • ARs are inducers of stress regulons, for example, poS and SOS-response, which, in view of the effects of AR on the cell noted above, causes an inadequate development of the stress response.
  • stress regulons for example, poS and SOS-response
  • a decrease in the MIC indicator defined as the minimum concentration of an antibiotic or AMP, at which there is no growth of the test organism in liquid media for 24 hours;
  • test objects were selected: non-pathogenic (conditionally pathogenic) representatives of pathogenic bacteria - gram-negative bacterium Escherichia coli, gram-positive bacterium Staphylococcus aureus, and yeast Candida utilis, ciliates Paramecium caudatum, as well as clinical isolates of pathogenic bacteria.
  • Mycobacterium smegmatis and Klebsiella pneumonia bacteria were used.
  • compositions of the invention studied in these experiments included, in particular, the antibiotics shown in Table 1, as well as alkylresorcinol (AR) - 4-n- butylresorcinol, 4-hexylresorcinol, 5-heptylresorcinol.
  • Solubilizing agents in the studied compositions of the invention are, in particular, ethanol, dimethyl sulfoxide with a content of 10-50% or surfactants, for example, Tween 80.
  • surfactants for example, Tween 80.
  • bacterial cultures of E. coli and S. aureus were grown on LB medium for 18–20 h (to the stationary phase), then used as an inoculum (5%).
  • the culture was grown for 1 h before the start of active growth in a 250 ml flask with 50 ml of bacterial culture. Then the culture was poured into 2 ml in glass tubes with cotton plugs, where antibiotic and AR solutions were previously added to appropriate quantities.
  • Antibiotics and AMPs were introduced as individual solutions in water with 10-50% ethanol or DMSO or 1-5% Tween-80. The final ethanol or DMSO did not exceed 3%, and Tween-80 0.05% .
  • antibiotics and AR should be brought into contact with the cells of microorganisms at the same time. To do this, first an aliquot, for example, 20 ⁇ l of an antibiotic solution was added, then an aliquot, for example, 20 ⁇ l, additives, AP, the solutions were mixed, after which 1960 ⁇ l of a suspension of bacteria was added. Thus, the antibiotic and AR began to act on microorganisms simultaneously.
  • Ciliates were grown on a mineral-yeast medium of Lozin-Lozinsky composition, g: NaCl - 1.0; KC1 - 0.1; MgS0 4 - 0, 1; CaCl * 2H 2 0 — OD; NaHCO 3 - 0.2; distilled water up to 1 l .; the concentration of ciliates (cells / ml) was determined microscopically with an increase in hbOO.
  • the criterion for the antiprotozoal effect of antibiotics in their pure form and in the composition of drugs combined with AR was a decrease in the number of ciliates by 50% or more in 24 hours in the test sample.
  • the inoculum cultures of test objects of bacteria and fungi were grown for 18 h on LB medium at 30 ° C on a shaker at 100 rpm. 2 ml of the inoculum culture was added to 50 ml of LB medium, grown for 1 h at 30 ° ⁇ on a shaker, and then 2 ml were poured into sterile glass tubes where the compositions of the invention, including antibiotics and 4-hexylresorcinol (GR), were added in advance . The total volume of the composition according to the invention was not more than 100 ⁇ l.
  • the final concentration of ethanol or dimethyl sulfoxide was not more than 3%, which did not affect the growth of test organisms.
  • GR was added in the amount of V. MIC, as determined in preliminary experiments on the study of MIC for GR. This concentration did not prevent the growth of bacteria.
  • the tubes were placed on a shaker at a temperature of 30 ° ⁇ for 24 hours. The presence of growth was recorded on an FEK-56 M photoelectrocolorimeter at a wavelength of 540 nm.
  • Table 2 shows the effects of the addition of GH (at a fixed concentration of 1/2 MIC) on the antimicrobial efficacy of various classes of antibiotics. Table 2. MIC for various antibiotics, as well as for compositions according to the invention, including 4-hexylresorcinol in 100 ⁇ g / ml GH (1/2 MIC), determined for E. coli.
  • MIC for various antibiotics, as well as for compositions according to the invention, including 15 ⁇ g / ml 4-hexylresorcinol (1/2 MIC), specific for S. aureus.
  • Table 4 shows the increase in the action of S. utilis yeast on two antifungal (antifungal) antibiotics under the action of 4-hexylresorcinol in a concentration that does not affect the growth of yeast. Therefore, 4-hexylresorcinol can also effectively enhance the action of antifungal antibiotics.
  • MIC for various antibiotics, as well as for compositions according to the invention, including 10 ⁇ g / ml 4-hexylresorcinol (1/2 MIC), specific for C. utilis. MIC, ⁇ g / ml
  • Antibiotic of the invention resorcinol and
  • MIC for various antibiotics, as well as for compositions according to the invention, comprising 15 ⁇ g / ml 4-hexylresorcinol (1/2 MIC), as determined for Paramecium caudatum.
  • the determination of the minimum inhibitory concentration of AMP for clinical isolates was determined by serial microdilution in 96-well plates in accordance with the recommendations of EUCAST 2016 and CLSI 2016. For the experiment, daily cultures grown on blood agar were used. Immediately prior to serial micro-dilutions, a bacterial suspension was prepared according to a turbidity standard of 0.5 McF in sterile saline. Next, the resulting cell suspension was diluted 10 times with MX broth, and used for inoculation with the tested antibiotics. The final inoculum concentration was 5x10 4 CFU / ml.
  • the MIC reduction for the antibiotic was calculated in the presence of V. MIC MIC, i.e. at concentrations when GR itself did not inhibit bacterial growth.
  • Tables 6-11 present data for the clinical isolates of E. coli, K. pneumoniae, A. baumannii, P. aeruginosa, S. aureus and E. faecalis, respectively.
  • the concentration of GR (V. MIC) was selected experimentally for each test isolate. As a rule, this value was in the range 32-64 ⁇ g / ml for isolates
  • E. coli 32-256 ⁇ g / ml for K. pneumoniae isolates, 64 ⁇ g / ml for A. baumannii isolates, 32-256 ⁇ g / ml for P. aeruginosa isolates, 16 ⁇ g / ml for 5. aureus and 32 ⁇ g isolates / ml isolates for E. faecalis.
  • Ciprofloxacin R 128 128 1 Ciprofloxacin R 128 128 1
  • antibiotics including 5-heptylresorcinol (GPR) and 4-n-butylresorcinol (BR)
  • compositions of the invention including other alkylresorcinol - 5-heptylresorcinol and 4-n-butylresorcinol, was tested on E. coli and S. aureus.
  • the results of these experiments are presented in Tables 12-15.
  • concentrations of HPR and BR MIC were selected experimentally for each strain tested.
  • MIC for various antibiotics, as well as for compositions according to the invention, including 100 ⁇ g / ml 5-heptylresorcinol (1/2 MIC), specific for E. coli.
  • Table 14 MIC for different antibiotics, as well as for compositions according to the invention, including 80 ⁇ g / ml 4-n-butylresorcinol (1/2 MIC), specific for E. coli.
  • an antibiotic comprising an antibiotic composition
  • Ciprofloxacin 1 0.15 6 533: 1
  • Table 15 MIC for different antibiotics, as well as ⁇ e for compositions according to the invention, including 30 ⁇ g / ml 4-n-butylresorcinol (1/2 MI C), specific for S.aureus.
  • Antibiotic of the invention resorcinol and
  • antibiotic in antibiotic composition including antibiotic in antibiotic composition and BR
  • E.coI the biocidal effect on E.coI
  • two antibiotics - ampicillin and ciprofloxacin they were used in high concentrations, i.e. larger than MICs, respectively, 10 and 100 ⁇ g / ml.
  • Hexylresorcinol was added at a concentration of V. MIC (100 mg / L).
  • the number of CFU was determined after different incubation times. CFU was determined by plating the decimal dilutions on solid nutrient medium LB.
  • the results (Table 16) demonstrate the potentiation of the antibiotic biocidal action with alkylresorcinol.
  • the number of CFUs is lower after 3 hours of incubation by 4-5 orders of magnitude in the variants of the combined use of the antibiotic and alkylresorcinol compared to the action of the antibiotic alone.
  • compositions of the invention which, when applied to these compositions, will not develop resistance in pathogenic bacteria, because it does not have time to form, and will not be transmitted to subsequent generations of bacteria due to the lack of surviving cells.
  • the frequency of formation of antibiotic-resistant spontaneous mutants was determined on Muller-Hinton agar (MCA) with antibiotics.
  • MCA Muller-Hinton agar
  • a culture of K. pneumoniae KPM9 was grown on MXA medium at 35 ° C for 20 hours.
  • a suspension was prepared in a physiological saline solution of 10 10 L / ml and serial ten-fold dilutions were made.
  • the initial suspension and its dilutions 1: 10, 1: 100 and 1: 1000 were sown on the surface of Muller-Hinton agar containing the appropriate preparations in an amount of from 1 to 128 MPC. Cups with crops were placed in a thermostat (35 ° C) and incubated for 48 hours.
  • the frequency of spontaneous mutants was determined as the ratio of the average number grown on agar with the corresponding addition of colonies to the initial number of seeded cells, determined by the method of counting colony forming units (CFU).
  • CFU colony forming units
  • the concentration of polymyxin B alone for K. pneumoniae blocking growth of the 'spontaneous polymyxin-resistant mutants is 128 MIC (128 ⁇ g / ml).
  • spontaneous mutants were detected with a frequency of 1,] x 10 "7 to 1.8 x 10 " 8 .
  • the mutant-converting amikacin concentration for K.pnewnoniae was 64 MIC.
  • the frequency of spontaneous mutants to amikacin ranged from 1.5x 10 " * - 2.8 10 " 7 .
  • mutant-converting concentration was 4 MIC, which was 32 or 16 times lower than for polymyxin or amikacin, respectively, in the absence of an additive.
  • the frequency of formation of mutants resistant to lower concentrations varied from 1.3 x 10 '' to 6.7 x 10 '' .
  • alkylresorcinol determines the impossibility of developing antibiotic resistance over a wide range of combinations of GR with antibiotics.
  • antibiotic resistance to this drug will never develop, unlike conventional ABs, for example, amikacin or polymyxin, when to prevent the occurrence of antibiotic-resistant mutants, it is necessary to use more than 64 or 128 MIC of the antibiotic, respectively.
  • compositions according to the invention including 4-hexylresorcinol
  • M. smegmatis bacteria were grown on Soton's medium for in vivo experiments.
  • compositions according to the invention including antibiotic and alkylresorcinol, were added to the drink of mice at the rate of 75 mg of GR / kg of mouse weight per day, 15 mg of isoniazid / kg of mouse weight per day. Antibiotic and GH were also tested separately. The method of detection of mycobacteria after extraction and homogenization of the spleen on the 6th day of incubation - seeding on a selective dense Soton medium. The results of this study are presented in Figure 1.
  • compositions of the invention including 4-hexylresorcinol and the anti-TB drug isoniazid, reduces the number of bacteria in the spleen of white mice from 13,500 / g of spleen to 610, i.e. 20 times, whereas individually taken tested antibiotic and alkylresorcinol almost did not affect the number of bacteria in the spleen of mice under experimental conditions compared with the control within the error in determining the number of mycobacteria.
  • Such data confirm the high efficiency of the compositions of the invention under conditions of use in a living organism.
  • a model of lethal Klebsiella infection of mice was used.
  • a femoral Klebsiella infection was modeled on outbred mice, infecting them intramuscularly at a dose of -5.4x 10 K. pneumoniae KPM9 cells in a volume of 0.1 ml.
  • a bacterial suspension for infection of animals was prepared from a 16-hour agar culture of K.
  • mice with the composition of the invention including the antibiotic amikacin and GR, was started 2 hours after infection (early treatment) or 24 hours after infection (late treatment) and was administered for 5 days.
  • Amikacin was administered subcutaneously at a rate of 5 mg / kg
  • GR was administered intraperitoneally at a rate of 15 mg / kg.
  • Fig. 2B illustrates that with a late start of treatment for infection, when antibiotic administration is ineffective and all mice die, the addition of GH saves the life of 20% of the tested animals. If antibiotic therapy with amikacin was started in a timely manner, 2 hours after infection, then all animals survive, but only 10% of mice are completely cured (after treatment of pathogens in the organs). Adding GR increases the proportion of fully cured animals by 2 times, up to 20% (Fig. 2A).
  • Example 1 For processing a culture of E. coli, a composition was created in the form of a solution consisting of: water and ethanol in a volume ratio of 7: 3, with a concentration of polymyxin 10 ⁇ g / ml and hexylresorcinol 10 mg / ml. When adding a 1% solution of such a composition (1: 100 dilution), no bacterial culture growth was observed (Table 2).
  • Example 2 For processing a culture of S. aureus, a composition was created in the form of a solution consisting of: water and dimethyl sulfoxide in a volume ratio of 1: 1, with a concentration of doxycycline 10 ⁇ g / ml and hexylresorcinol 1.5 mg / ml. When adding A 1% solution of such a composition (1: 100 dilution), no bacterial culture growth was observed (Table 3).
  • Example 3 To enhance the action of antibiotics in the body of a warm-blooded animal against Gram-positive mycobacteria M.smegmatis, a composition was created for administration to mice through the stomach (for watering mice). The composition was an aqueous solution of ethanol (3-5%), sucrose (1%), GR and isoniazid at the rate of 75 mg GR / kg of mouse weight per day, 15 mg of isoniazid / kg of mouse weight per day. The use of compositions of the invention, including 4-hexylresorcinol and the anti-TB drug isoniazid, reduces the number of bacteria in the spleen of white mice from 13500 / g of spleen to 610, i.e.
  • Example 4 To enhance the action of antibiotics in the body of a warm-blooded animal against Gram-negative bacteria K.pneumonia, a composition was created from a solution of GR in a solvent water + DMSO (50%) and an aqueous solution of the antibiotic amikacin, administered separately.
  • Fig. 2B illustrates that at the late start of treatment for infection, when antibiotic administration is ineffective and all mice die, the addition of GH saves life for 20% of the tested animals. If antibiotic therapy with amikacin was started in a timely manner, 2 hours after infection, then all animals survive, but are completely cured (i.e. when no pathogens were found in the organs after treatment), only 10% of mice. The addition of GR increases the proportion of fully cured animals by 2 times, up to 20%. These data confirm the high efficiency of the compositions of the invention under conditions of use in a living organism.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

Изобретение относится к области медицины, фармакологии и ветеринарии, а именно к лечению инфекционных заболеваний посредством применения комбинированных антимикробных препаратов (АМП). Новые АМП могут быть использованы для лечения инфекционных заболеваний, вызываемых микроорганизмами, как у человека, так и у животных. АПМ по изобретению представляет собой композицию, включающую антибиотик и С4-7-алкилрезорцин, а также фармацевтически приемлемый растворитель. Новые антимикробные препараты проявляют в несколько раз большую эффективность против грамположительных и грамотрицательных бактерий, грибов, простейших по сравнению с применением только соответствующих антибиотиков. Изобретение позволяет простым способом получать и применять антимикробное средство, эффективно подавляющее развитие микроорганизмов, добиваться их полной гибели, а также замедлять или предотвращать развитие резистентности микроорганизмов к этому средству.

Description

КОМПОЗИЦИЯ АНТИМИКРОБНЫХ ПРЕПАРАТОВ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ИНФЕКЦИОННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ ЛЮДЕЙ И ЖИВОТНЫХ И СПОСОБ ЕЁ
ПРИМЕНЕНИЯ Область техники
Изобретение относится к области медицины, фармакологии и ветеринарии, а именно - к лечению инфекционных заболеваний посредством применения комбинированных антимикробных препаратов (АМП). Новые АМП могут быть применены для лечения инфекционных заболеваний, вызываемых микроорганизмами, как у человека (холера, чума, сибирская язва, пневмония, раневые инфекции, внутрибольничные инфекции, кишечные инфекции и др.), так и у животных (сибирская язва, ящур, сап, бруцеллез, пневмония, и др.).
Уровень техники
По данным Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ), четыре пункта в списке десяти ведущих причин смерти в мире занимают бактериальные инфекции или болезни, ими опосредованные (респираторные инфекции нижних дыхательных путей, диарейные болезни, туберкулез) От них умирает каждый десятый человек в мире (около 10 млн. в год). Основным способом лечения инфекционных заболеваний являются антибиотики (АБ), вещества микробного, животного или растительного происхождения, способные подавлять рост микроорганизмов или вызывать их гибель. Однако, в последние годы эффективность применения АБ снижается вследствие развития устойчивости к ним со стороны патогенных бактерий (так называемого явления антибиотикорезистентности, АБР). Неэффективность известных лекарственных средств при лечении инфекционных заболеваний, обусловленная быстрорастущей лекарственной устойчивостью (резистентностью) к ним микроорганизмов, возбудителей инфекционных заболеваний, постоянно возрастает (Guilfoile P.G., Alcamo I.E., Heymann D. (editors). Antibiotic-Resistant Bacteria. Infobase Publishing. 2007).
Эксперты ВОЗ считают, что человечество скоро может остаться без эффективных лекарств против инфекций. Сейчас уже появилась устойчивость к самым часто используемым антибиотикам, и даже антибиотики последнего поколения перестают работать. Глобальную ежегодную смертность от самых распространенных лекарственно- устойчивых штаммов инфекций оценивают в 700 тысяч человек (7% от всех смертей, связанных или вызванных инфекциями) (https://amr-review.org/). Прогнозируется, что если ситуация не изменится, то к 2030 году 100 миллионов человек умрут преждевременно, а мировая ежегодная смертность из-за АБР достигнет к 2050-му году 10 миллионов человек. В медицинской практике нет ни одного АБ, к которому не существовало бы АБР, поскольку устойчивость к АБ может возникать спонтанно и затем распространяться среди микроорганизмов. Такая ситуация отражает объективную реальность Природы - у бактерий эволюционно сформирована способность адаптироваться к постоянно меняющимся условиям окружения и стрессорам, включая антибиотики, существовавшая со времени возникновения бактерий. Эта система адаптации сформировалась в биосфере задолго до антропогенного давления, которое является лишь селектирующим фактором. Подтверждением этому является обнаружение детерминант АБР, форм межклеточного переноса АБР и переживающих антибиотикорезистентных клеток бактерий в вечной мерзлоте Арктики и Антарктиды возрастом сотни тысяч - миллионы лет.
АБР формируется двумя путями:
1. Приобретением и наследованием генетических детерминант антибиотикорезистентности за счёт их горизонтального переноса между микроорганизмами;
2. Образованием неделящихся антибиотикотолерантных клеток-персистеров, переживающих лекарственную атаку и затем прорастающих такой же популяцией, как родительская (Helaineemail S., Kugelberg Е. Bacterial persisters: formation, eradication, and experimental systems. Trends in microbiol. 2014. V. 22 (7), p.17^424).
При этом переход в состояние персистеров и их прорастание сопряжены с акселерацией процессов адаптивной устойчивости, в том числе к антибиотикам, что рассматривается как дорога к генетически наследуемой антибиотикорезистентности (Cohen, N.R. et al. Microbial persistence and the road to drug resistance. Cell Host Microbe. 2013; 13: 632-642). Кроме того, в организме хозяина патогенные бактерии могут образовывать так называемые биопленки, особое надклеточное состояние бактерий, когда клетки объединены внеклеточным матриксом из внеклеточных полимеров и прикреплены к поверхности органов. В этом состоянии клетки микробов чрезвычайно устойчивы к действию антибиотиков. Поэтому перспективными для антибиотикотерапии являются следующие подходы:
1. Снижение у клеток патогенов метаболической активности с целью подавления механизмов антибиотикорезистентности;
2. Минимизация (до полной элиминации) числа выживающих клеток-персистеров с целью как снижения бактерионосительства, так и обмена генетическими детерминантами устойчивости между клетками.
Исследования по разработке новых антимикробных препаратов развиваются в трёх направлениях: 1) поиска новых антибиотиков, 2) создания комбинированных препаратов из уже известных антибиотиков (Kishor С. et al., Burden of Antibiotic Resistance in Common Infectious Diseases: Role of Antibiotic Combination Therapy Journal of Clinical and Diagnostic Research. 2014 Jun, Vol-8(6): ME05-ME08), 3) создания комбинированных препаратов из антибиотиков и вспомогательных соединений, так называемых «разрушителей резистентности» (resistance breakers) или «потенциаторов» (от английского potentiate, усиливать) или адьювантов, соединений, усиливающих действие АБ.
Применение первых двух направлений не гарантирует неразвития АБР у патогенных бактерий. Факт невозможности преодолеть/победить АБР необходимо признать и искать реалистичные способы борьбы с инфекционными заболеваниями, учитывающие законы природы. Поиск новых АБ или использование их комбинаций не могут рассматриваться как основные пути преодоления АБР и гарантировать победу над инфекционными заболеваниями. С 2000 по 2013 гг. введено в практику только два новых антибиотика (Butler M.S., Blaskovich М.А., Cooper M.A. Antibiotics in the clinical pipeline in 2013 J. Antibiot (Tokyo). 2013. 66(10):571-91).
Третье направление - использование добавок, не являющихся антибиотиками, которые усиливают действие АБ, является перспективным для борьбы с АБР (Brown D. Antibiotic resistance breakers: can repurposed drugs fill the antibiotic discovery void? Nat Rev Drug Discov. 2015 Dec; 14(12):821-32). Один из четырех классов усилителей антибиотиков составляют вещества, ослабляющие защитные механизмы микроорганизмов. Именно к этому классу относятся вещества, описываемые в настоящем изобретении. Известны препараты, содержащие один антимикробный препарат и вещество, препятствующее его разрушению бактериями, например, антибиотик бета-лактамного ряда и ингибитор фермента, разрушающего этот антибиотик, бета-лактамазу. В патентах РФ 2152213 и ЕР 1142574 описана комбинация амоксициллина и клавулановой кислоты. Аналогичным образом действуют комбинации piperacillin/tazobactam (Tazocin) и ceftazidime/avibactam (Avycaz).
В работе (Brown D. Antibiotic resistance breakers: can repurposed drugs fill the antibiotic discovery void? Nat Rev Drag Discov. 2015 Dec;14(12):821-32) рассматриваются лекарственные соединения, используемые не по назначению, которые усиливают действие антибиотиков. Это направление рассматривают как весьма перспективное потому, что для таких комбинаций двух ранее зарегистрированных соединений сокращается как время до внедрения в медицинскую практику, так и затраты на разработку и доведение до практики. Именно такой подход к созданию новых АБ мы взяли за основу настоящей разработки. Таким образом, анализ научной и патентной литературы свидетельствует, что ни один из известных АМП не обеспечивает отсутствия развития к нему резистентности со стороны патогенных бактерий. Кроме того, многие антибиотики могут вызвать побочные эффекты, и актуальна задача понижения применяемых дозировок. Поэтому остается актуальной задача разработки новых эффективных АМП, не вызывающих развитие резистентности к ним со стороны патогенных бактерий, а также обладающих низкой токсичностью. Ни в одном из рассмотренных источников не рассматриваются вещества, предлагаемые в настоящем изобретении, а также нет указаний на то, что новое комбинированное средство не допускает развития АБР, что является результатом и отличительной особенностью настоящего изобретения.
Раскрытие изобретение
Задачей настоящего изобретения является разработка и создание антимикробного лекарственного средства для лечения инфекционных заболеваний микробной этиологии, вызванных как антибиотико-чувствительными, так и антибиотикорезистентными бактериями, а также для предотвращения развития резистентности патогенных бактерий.
Техническим результатом данного изобретения является разработка и создание фармацевтической композиции, представляющей собой комбинированное антимикробное лекарственное средство, которое
- обладает повышенной антимикробной эффективностью по отношению к широкому спектру микроорганизмов, в том числе микроорганизмов, резистентных к антибиотикам,
- обладает пониженной токсичностью,
- характеризуется тем, что один из компонентов данного комбинированного средства усиливает действие другого,
- характеризуется тем, что предотвращает или понижает вероятность развития резистентности микроорганизмов к этому средству.
Указанный технический результат достигается посредством разработки и применения фармацевтической композиции для системного введения, состоящей, по меньшей мере, из терапевтически эффективного количества антибиотика и С4_7- алкилрезорцина, и дополнительно включающей фармацевтически приемлемый растворитель и/или наполнитель.
В некоторых вариантах воплощения изобретения фармацевтическая композиция по изобретению может дополнительно содержать другие фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества. В некоторых частных вариантах воплощения изобретения в указанной композиции могут присутствовать дополнительные фармакологически активные лекарственные вещества, кроме указанного антибиотика и С4_7-алкилрезорцина. Примерами таких веществ могут служить дополнительные антибиотики (при использовании комбинации антибиотиков), или другие вещества, усиливающие лечебный (или антимикробный) эффект композиции по изобретению, или обеспечивающие ее пониженную токсичность для человека и животных.
В некоторых частных вариантах воплощения изобретения С4_7-алкилрезорцин представляет собой 4-н-бутилрезорцин, 4-гексилрезорцин или 5-гептилрезорцин.
В некоторых частных вариантах воплощения изобретения растворитель, или солюбилизатор, представляет собой этиловый спирт, диметилсульфоксид или детергент.
В некоторых частных вариантах воплощения изобретения антибиотик выбирают из группы полипептидов, аминогликозидов, тетрациклинов, макролидов гликопептидов, левомицетина, бета-лактамов, рубомицина, хинолонов, оксазолидинонов, линкозамидов, циклолипопептидов, цефалоспоринов, фузидиевой кислоты, сульфаниламидов, изониазида, антигрибковых или противопротозойных препаратов.
В некоторых предпочтительных вариантах воплощения изобретения массовая доля С4-7-алкилрезорцина в композиции составляет не более 0.1%. В некоторых других предпочтительных вариантах воплощения изобретения массовая доля С4-7- алкилрезорцина в композиции составляет не менее 0.001%. В других вариантах осуществления изобретения антибиотик и С4_7-алкилрезорцин берутся в соотношении, которое обеспечивает, по меньшей мере, двукратное снижение минимальной ингибирующей концентрации антибиотика. В некоторых частных вариантах воплощения изобретения инфекционное заболевание микробной этиологии вызвано бактериальной инфекцией, протозойной инфекцией или грибковой инфекцией.
В некоторых частных вариантах воплощения изобретения инфекционное заболевание микробной этиологии вызвано грамположительными бактериями.
В некоторых частных вариантах воплощения изобретения инфекционное заболевание микробной этиологии вызвано грамотрицательными бактериями.
В некоторых частных вариантах воплощения изобретения инфекционное заболевание микробной этиологии вызвано грибами.
В некоторых частных вариантах воплощения изобретения инфекционное заболевание микробной этиологии вызвано простейшими.
В некоторых частных вариантах воплощения изобретения субъект представляет собой человека или животное.
Изобретение также предусматривает получение композиций по изобретению. Изобретение также включает применение композиций по изобретению для лечения инфекционных заболеваний микробной этиологии у субъекта, нуждающегося в таком лечении.
Ещё одним аспектом настоящего изобретения является способ лечения инфекционных заболеваний микробной этиологии, включающий введение субъекту композиций, являющихся предметом изобретения.
Указанный технический результат также достигается с помощью способа лечения инфекционного заболевания, включающего системное введение вышеуказанной фармацевтической композиции субъекту, нуждающемуся в таком лечении.
В некоторых частных вариантах воплощения изобретения в указанном способе фармацевтическая композиция может быть получена непосредственно перед ее введением путем смешивания компонентов в необходимых пропорциях. В других вариантах воплощения изобретения компоненты фармацевтической композиции могут быть введены в организм субъекта раздельно.
Композиция и способ по настоящему изобретению также применимы для лечения инфекционного заболевания у субъекта, вызванного относительно устойчивым к антибиотику штаммом микроорганизмов. При этом, устойчивость штамма микроорганизмов к антибиотику может быть протестирована до введения субъекту фармацевтической композиции.
В частных вариантах воплощения изобретения способ лечения характеризуется тем, что фармацевтическая композиция может быть получена непосредственно перед ее введением путем смешивания компонентов в необходимых пропорциях.
В частных вариантах воплощения изобретения субъект представляет собой человека или животное.
Краткое описание рисунков.
Рисунок 1. Диаграмма, отражающая содержание бактерий M.smegmatis в селезенке белых мышей (КОЕ/г селезёнки) в разных вариантах добавления антимикробных средств.
Рисунок 2. Диаграмма, отражающая эффективность применения 4-гексилрезорцина (ГР) при лечении клебсиелезной инфекции мышей. А) Доля мышей, выживших при позднем начале лечения инфекции, %. Б) Величина полностью вылеченных мышей при раннем начале инфекции, %.
Определения и термины
Резорцин (Резорцинол, 1,3-дигидроксибензол)— мета-дигидроксибензол:
Figure imgf000009_0001
Термин «алкил» в настоящем документе означает радикал ряда насыщенных углеводородов, причем включает как неразветвленные, так и разветвленные алкильные группы. Также термин «алкил» в настоящем документе относится к группам, обычно имеющим от четырех до семи атомов углерода. Например, термин -С4_7-алкил означает бутил, гексил и т.д.
В настоящем документе под термином «С^-алкилрезорцин» понимаются, в частности, 4-н-бутилрезорцин, 4-гексилрезорцин или 5-гептилрезорцин. Согласно номенклатуре ИЮПАК, 4-гексилрезорцин - это 1,3-диокси-4-н-гексилбензол, который может быть представлен следующей структурной формулой:
Figure imgf000009_0002
Термин «фармацевтически приемлемый растворитель и/или наполнитель» относится к таким растворителям и/или наполнителям, которые, являясь неактивными ингредиентами, в рамках проведенного медицинского заключения, пригодны для использования в контакте с тканями человека и животных без излишней токсичности, раздражения, аллергической реакции и т.д. и отвечают разумному соотношению пользы и риска. «Неактивные ингредиенты» входят в состав лекарственного средства для улучшения его растворимости, фармакокинетических данных и/или стабильности. Неактивные ингредиенты включают в себя множество веществ, известных специалистам в области фармацевтики, таких как вещества для контроля рН или осмотического давления, антибактериальные агенты, антиоксиданты, поверхностно активные вещества, криостабилизаторы, консерванты, растворители, загустители, разрыхлители и другие вещества.
Термин «терапевтически эффективное количество» подразумевает такое количество фармацевтической композиции, которое будет эффективно подавлять рост и/или жизнеспособность микроорганизмов, вызвавших инфекцию, и, таким образом, приводить к выздоровлению субъекта, имеющего инфекцию.
Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению предназначена для системного введения в организм субъекта, нуждающегося в лечении инфекционного заболевания микробной этиологии. Системное введение означает, что лекарство с кровотоком транспортируется по всему организму. Вариантами такого введения являются энтеральное, пероральное или парентеральное введение.
Термин «субъект» охватывает все виды млекопитающих, предпочтительно человека.
Устойчивость (в том числе относительная) микроорганизма к антибиотику может быть определена любым методом, который известен специалистам в микробиологии.
В описании данного изобретения термины «включает», «включающий» и «включает в себя» интерпретируются как означающие «включает, помимо всего прочего». Указанные термины не предназначены для того, чтобы их истолковывали как «состоит только из».
Если не определено отдельно, технические и научные термины в данной заявке имеют стандартные значения, общепринятые в научной и технической литературе.
Подробное раскрытие изобретения
Характеристика биологической активности композиций по изобретению
Поставленная задача решается путем создания фармацевтических композиций, в которых комбинируется не менее двух компонентов, одним из которых является один из известных антибиотиков, разрешенных к применению в медицинской или ветеринарной практике, а вторым - один из С4_7-алкилрезорцинов, предпочтительно выбранный из 4- гексилрезорцина, 5-гептилрезорцина или 4-н-бутилрезорцина. Кроме того, композиция включает фармацевтически приемлемый носитель, растворитель и/или наполнитель. Это могут быть вещества, способствующие солюбилизации компонентов, например, этиловый спирт, диметилсульфоксид или детергенты.
Количество и соотношение действующих веществ зависит от вида микроорганизма и типа используемого антибиотика.
Предпочтительно, композиция по изобретению содержит 4-гексилрезорцин и один из антибиотиков, выбираемых из группы беталактамов, макролидов, аминогликозидов, тетрациклинов, хлорамфеникола, гликопептидов, полипептидов, хинолонов, рубомицина, сульфаниламидов, изониазида, антигрибных (противогрибковых) антибиотиков или антибиотиков против простейших. А также композиция содержит солюбилизирующий агент
Массовое соотношение АР:антибиотик преимущественно лежит в пределах 1000- 0.05:1. Процентное содержание солюбилизирующих агентов в композиции должно быть достаточным для растворения компонентов, например, содержание этилового спирта может составлять 0.5-50%. Проведенные исследования показали, что применение новых комбинированных АМП по изобретению эффективно против грамположительных и грамотрицательных бактерий, а также грибов и простейших. Новые АМП по изобретению эффективно предотвращают или минимизируют развитие микробных форм переживания (персистенции) - клеток, остающихся после воздействия антибиотика, а также предотвращают или минимизируют развитие устойчивости (резистентности) у микроорганизмов к используемым антимикробным средствам.
Авторами, а также другими исследователями, было установлено, что алкилрезорцины (АР) имеют полимодальное действие на клетки бактерий: они могут модифицировать структуру мембран, белков, нуклеиновых кислот, и таким образом, изменять их функциональную активность. При определенных концентрациях АР происходит нарушение работы мембран: мембраны переходят из физиологического жидкокристаллического состояния в твердокристаллическое, что приводит к снижению дыхательной активности клетки, к нарушению других мембранных функций клетки. Тем самым снижается энергообеспеченность клеток и, следовательно, может снижаться их стрессоустойчивость. Также может снижаться активность мембранных молекулярных помп, выводящих антибиотики из клетки (один из основных механизмов АБР). Высокие концентрации АР могут приводить к снижению (до полной потери) активности ферментов разных типов, гидролаз, оксидаз и других ферментов, в том числе, и разрушающих АБ (это представляет собой другой механизм АБР). Тем самым, в клетках в условиях стресса понижается активность основных рабочих механизмов, ферментов, что дополнительно снижает их стрессоустойчивость. Активность ферментов снижается из-за нековалентного (обратимого) связывания АР с функциональными группами и доменами белковых глобул. Влияние АР на нуклеиновые кислоты происходит по трем путям: 1) АР могут напрямую связываться с ДНК, изменяя их топологию и, следовательно, функциональные свойства; 2) АР снижают активность ферментов, обслуживающих ДНК (репликация, репарация, транскрипция, топология, хранение); 3) АР являются индукторами стрессовых регулонов, например, poS и SOS-ответа, что, ввиду отмеченных выше следствий влияния АР на клетку, вызывает неадекватное развитие стрессового ответа. В итоге действие АР на клетки микроорганизмов может приводить к потенцированию их гибели в присутствии летальных стрессоров, таких как антибиотики.
Вышеописанный механизм действия АР на мембраны клеток бактерий обеспечивает затруднение развития устойчивости к ним бактерий в такой же мере, как к антибиотикам, когда рост-подавляющие концентрации АБ увеличиваются в десятки и сотни раз. Так, противодействием повышению степени кристаллизации мембраны является заранее сформированное понижение её жидкостности, что возможно лишь в очень узком физиологически приемлемом диапазоне, выход за границы которого означает невозможность роста бактерий в организме человека при температуре 36-37 °С. Поэтому адаптация к композициям, включающим АР, может быть весьма умеренной, аналогично адаптации к температуре.
Важным моментом является обратимость связывания АР с белками, нуклеиновыми кислотами и мембранами (ввиду нековалентного связывания АР с этими структурами), что обусловливает обратимость его возможного негативного действия на клетки макроорганизма (человека) и более низкую токсичность АР на организм человека по сравнению с клетками бактерий.
Нижеследующие примеры приведены в целях раскрытия характеристик настоящего изобретения и их не следует рассматривать как каким-либо образом ограничивающие объем изобретения.
Для подтверждения заявленного технического результата были проведены in vitro и in vivo исследования антимикробной активности известных антибиотиков, а также фармацевтических композиций по изобретению, включающих комбинации этих же антибиотиков с алкилрезорцинами (АР). АР в композициях по изобретению использовали в концентрациях, равных Vi минимальной рост-ингибирующей концентрации (МИК) или ниже. МИК для тестируемых вариантов АР и микроорганизмов были заранее подобраны в отсутствие антибиотиков. Об антимикробной активности фармацевтических композиций по изобретению в опытах in vitro судили по двум показателям:
1) снижению показателя МИК, определяемого как минимальная концентрация антибиотика или АМП, при которой отсутствует рост тест-организма на жидких средах в течение 24 ч;
2) снижению количества жизнеспособных клеток бактерий, как числа колониеобразующих единиц (КОЕ), остающихся после инкубации тест-культур с заранее определенными, высокими концентрациями антибактериального препарата (более высоких, чем 1 МИК). Тест- объектами были выбраны: непатогенные (условно патогенные) представители патогенных бактерий - грамотрицательная бактерия Escherichia coli, грамположительная бактерия Staphylococcus aureus, и дрожжевые грибы Candida utilis, инфузории Paramecium caudatum, а также клинические изоляты патогенных бактерий. В опытах in vivo были использованы бактерии Mycobacterium smegmatis и Klebsiella pneumonia.
Исследуемые в данных экспериментах композиции по изобретению включали, в частности, антибиотики, представленные в Таблице 1 , а также алкилрезорцины (АР) - 4-н- бутилрезорцин, 4-гексилрезорцин, 5-гептилрезорцин. Солюбилизирующими агентами в исследуемых композициях по изобретению являются, в частности, этанол, диметилсульфоксид с содержанием 10-50% или поверхностно-активные вещества, например, Твин 80. Результат применения композиций по изобретению не зависел от способа солюбилизации, что было проверено в специальных экспериментах.
Таблица 1. Примеры некоторых антимикробных веществ, исследованных в настоящей работе.
Figure imgf000013_0001
Для опытов in vitro культуры бактерий E.coli и S. aureus выращивали на среде LB в течение 18-20 ч (до стационарной фазы), затем использовали как инокулят (5%). Культуру выращивали в течение 1 ч до начала активного роста в колбе объёмом 250 мл с 50 мл культуры бактерий. Затем культуру разливали по 2 мл в стеклянные пробирки с ватными пробками, куда предварительно были внесены растворы антибиотиков и АР в соответствующих количествах. Антибиотики и АМП вносили в виде индивидуальных растворов в воде с 10-50%-содержанием этанола или ДМСО или 1-5%-содержанием Твин- 80. Конечное содержание этанола или ДМСО не превышало 3%, а Твин-80 - 0,05%. Важно отметить, что антибиотики и АР должны быть приведены в контакт с клетками микроорганизмов одновременно. Для этого в пустую пробирку сначала вносили аликвоту, например, 20 мкл раствора антибиотика, затем - аликвоту, например, 20 мкл, добавки, АР, растворы перемешивали, после чего добавляли 1960 мкл суспензии бактерий. Тем самым антибиотик и АР начинали действовать на микроорганизмы одновременно. Причем неожиданно было обнаружено, что при ином способе подачи веществ в культуру бактерий результаты экспериментов были значительно хуже (например, внесение АР без солюбилизаторов было невозможным ввиду их низкой растворимости; внесение АР перед антибиотиком за 30-60 мин не усиливало действия антибиотика, а наоборот, ослабляло его по сравнению с действием одного лишь антибиотика). Антибиотики и АР могут быть также внесены в виде композиции, содержащей и антибиотик, и АР. Причем и внесение раствора, содержащего антибиотик и АР, и внесение двух индивидуальных растворов, антибиотика и АР, с последующим внесением суспензии бактерий, приводили к одинаковым результатам. Пробирки инкубировали при 30°С и качании на круговом шейкере (100 об/мин). Рост оценивали через 24 ч на фотоэлектроколориметре ФЭК 56М при длине волны 540 нм. Рост считали отсутствующим, если оптическая плотность (ОП) была не выше, чем исходная.
Действие АМП на инфузорий Paramecium caudatum оценивали по снижению интенсивности их размножения (Руководство по определению методом биотестирования токсичности вод, донных отложений, загрязняющих веществ и буровых растворов. - М. : РЭФИЯ, НИА-Природа. - 2002. - 61 с). Инфузории выращивали на минерально- дрожжевой среде Лозина- Лозинского состава, г: NaCl - 1,0; КС1 - 0,1 ; MgS04 - 0, 1 ; СаС1*2Н20 - ОД ; NaHC03 - 0,2; вода дистиллированная до 1 л.; концентрацию инфузорий (кл/мл) определяли микроскопически при увеличении хбОО. Критерием антипротозойного действия антибиотиков в чистом виде и в составе комбинированных с АР препаратов служило снижение численности инфузорий на 50% и более за 24 часа в исследуемой пробе.
Опыты проводили не менее чем в трёх повторах по три параллельных опыта в каждом. Сравнение эффективности известных антибиотиков и композиций по изобретению против коллекционных штаммов микроорганизмов
Для исследования эффективности композиций по изобретению инокулят культур тест-объектов бактерий и грибов выращивали в течение 18 ч на среде LB при 30°С на качалке (шейкере) 100 об/мин. 2 мл культуры-инокулята вносили в 50 мл среды LB, выращивали 1 ч при 30°С на качалке, после чего разливали по 2 мл в стерильные стеклянные пробирки, куда заранее были добавлены композиции по изобретению, включающие антибиотики и 4-гексилрезорцин (ГР). Общий объём композиции по изобретению составлял не более 100 мкл. Конечная концентрация этанола или диметилсульфоксида (используемых как солюбилизирующие агенты), составляла не более 3%, что не влияло на рост тест-организмов. ГР был добавлен в количестве V. МИК, определенном в предварительных опытах по исследованию МИК для ГР. Эта концентрация не предотвращала роста бактерий. Пробирки ставили на качалку при температуре 30°С на 24 ч. Наличие роста регистрировали на фотоэлектроколориметре ФЭК-56 М при длине волны 540 нм.
В Таблице 2 показаны эффекты добавления ГР (в фиксированной концентрации 1/2 МИК) на противомикробную эффективность антибиотиков разных классов. Таблица 2. МИК для разных антибиотиков, а также для композиций по изобретению, включающих в своем составе 4-гексилрезорцин в 100 мкг/мл ГР (1/2 МИК), определенные для E.coli.
Figure imgf000015_0001
Таким образом, неожиданно было обнаружено, что для E.coli наблюдается значительное усиление антимикробного действия всех без исключения протестированных антибиотиков (причем антибиотиков разных типов действия и разной структуры) в присутствии V. МИК 4-гексилрезорцина. В наибольшей степени усиливается действие полимиксина, гентамицина, и левомицетина (МИК снижается в 10-50 раз), в несколько меньшей степени - для циклоспорина, ванкомицина, рубомицина (в 2-3 раза). При этом соотношение масс ГР:антибиотик в композиции варьирует в пределах 1000-0.05: 1.
Таблица 3. МИК для разных антибиотиков, а также для композиций по изобретению, включающих 15 мкг/мл 4-гексилрезорцина (1/2 МИК), определенные для S. aureus.
Figure imgf000016_0001
Как следует из Таблицы 3, для S.aureus неожиданно было обнаружено значительное усиление антимикробного действия всех без исключения протестированных антибиотиков (причем антибиотиков разных типов действия и разной структуры) в присутствии Vi МИК ГР. В наибольшей степени усиливается действие полимиксина, капремабола, левомицетина и ампициллина (в 5- 10 раз). При этом соотношение масс ГР:антибиотик в композиции варьирует в пределах 600-0.75: 1.
В Таблице 4 представлено усиление действия на дрожжи С. utilis двух антигрибных (противогрибковых) антибиотиков под действием 4-гексилрезорцина в концентрации, не влияющей на рост дрожжей. Следовательно, 4-гексилрезорцин также может эффективно усиливать действие противогрибковых антибиотиков.
Таблица 4. МИК для разных антибиотиков, а также для композиций по изобретению, включающих 10 мкг/мл 4-гексилрезорцина (1/2 МИК), определенные для C. utilis. МИК, мкг/мл
Композиция Соотношение по масс 4-гексил-
Снижение
Антибиотик изобретению, резорцина и
Антибиотик МИК, раз
включающая антибиотика в антибиотик композиции и ГР
Ципрофлоксацин 300 75 4 0.13 : 1
Нафтифин
100 25 4 0.4: 1 гидрохлорид Действие индивидуальных антибиотиков и композиций по изобретению на инфузории Paramecium caudatum оценивали по снижению интенсивности их размножения. Минимальную концентрацию, при которой развития инфузорий не происходило, считали за МИК. Результаты представлены в Таблице 5. Представленные данные показывают, что 4-гексилрезорцин также эффективно усиливает действие и антипротозойных антибиотиков тоже.
Таблица 5. МИК для разных антибиотиков, а также для композиций по изобретению, включающих 15 мкг/мл 4-гексилрезорцина (1/2 МИК), определенные для Paramecium caudatum.
Figure imgf000017_0001
Приведенные примеры иллюстрируют усиление антимикробного действия всех испытанных антибиотиков в присутствии 4-гексилрезорцина, взятого в концентрациях, не подавляющих рост тест-организмов четырёх основных групп - грамположительных и грамотрицательных бактерий, грибов и простейших. Сравнение эффективности известных антибиотиков и композиций по изобретению против штаммов микроорганизмов - клинических изолятов
Определение минимальной ингибирующей концентрации АМП для клинических изолятов определяли методом серийных микроразведений в 96 - луночных планшетах в соответствии с рекомендациями EUCAST 2016 и CLSI 2016. Для постановки опыта использовали суточные культуры, выращенные на кровяном агаре. Непосредственно перед постановкой серийных микроразведений готовили бактериальную суспензию по стандарту мутности 0,5 McF в стерильном физиологическом растворе. Далее полученную взвесь клеток разводили в 10 раз бульоном MX, и использовали для инокуляции с тестируемыми антибиотиками. Конечная концентрация инокулята составляла 5х104 КОЕ/мл.
Исследование антимикробной активности АР в комбинации с различными антибиотиками в отношении бактериальных изолятов проводили с применением 96- луночных планшетов, когда испытывали композиции, включающие различные комбинации антибиотиков и ГР от 1/8 МИК и выше. Рост оценивали через 24 ч. Рост считали отсутствующим, если оптическая плотность (ОП) была не выше, чем исходная. Эксперименты проводили не менее чем в трёх повторах по три параллельных опыта в каждом.
По итогам испытаний рассчитывали величину снижения МИК для антибиотика в присутствии V. МИК ГР, т.е. при концентрациях, когда сам ГР не подавлял роста бактерий.
В Таблицах 6- 11 представлены данные для клинических изолятов Е. coli, К. pneumoniae, A. baumannii, P. aeruginosa, S. aureus и Е. faecalis, соответственно.
Использовали как штаммы чувствительные (S), так и резистентные (R) к испытываемому антибиотику. Следует отметить, что в данных экспериментах тестировались антибиотики, использующиеся в клинической практике против тестируемых микроорганизмов.
Концентрацию ГР (V. МИК) подбирали экспериментально для каждого тестируемого изолята. Как правило, эта величина находилась в диапазоне 32-64 мкг/мл для изолятов
E.coli, 32-256 мкг/мл для изолятов К. pneumoniae, 64 мкг/мл для изолятов A. baumannii, 32- 256 мкг/мл для изолятов P. aeruginosa, 16 мкг/мл для изолятов 5. aureus и 32 мкг/мл изолятов для Е. faecalis.
Таблица 6. Влияние МИК ГР на МИК разных антибиотиков против клинических изолятов Е. coli. Антибиотик Фенотип МИК АБ, МИК АБ в Снижение
патогена мкг/мл присутствии МИК, раз
ГР,
мкг/мл
Цефотаксим R 16 2 8
S 0,25 0,125 2
Меропенем R 128 256 1
S 0,125 0,06 2
Амикацин R 16 16 1
S 2 0,5 4
Ципрофлоксацин R 128 32 4
S 0,25 0,015 17
Полимиксин R 8 2 4
S 0,06 0,06 1
Тигециклин S 0,06 0,03 2
S-чувствительный к антибиотику, R-резистентный к антибиотику.
Таблица 7. Влияние МИК ГР на МИК разных антибиотиков против клинических изолятов К. pneumoniae.
Антибиотик МИК АБ в
Фенотип присутствии
патогена МИК АБ, +ГР, Снижение
(S/R) мкг/мл мкг/мл МИК, раз
Цефотаксим R 128 16 8
S 0,5 0,25 2
Меропенем R 16 8 2
S 0,03 0,03 1
Амикацин R 128 8 16
S 1 1 1
Ципрофлоксацин R 128 8 16
S 0,06 0,015 4
Полимиксин S 0,25 0,015 17
Тигециклин R 2 1 2
S 0,125 0,125 1
S-чувствительный к антибиотику, R-резистентный к антибиотику.
Таблица 8. Влияние Х МИК ГР на МИК разных антибиотиков против клинических изолятов А. Ъаитаппи.
Антибиотик МИК АБ в
Фенотип присутствии
патогена МИК АБ, +ГР, Снижение
(S/R) мкг/мл мкг/мл МИК, раз
Цефтазидим S 8 4 2
Цефопер/сульб R 64 16 4 S 2 0,25 8
Меропенем R 16 4 4
S 0,5 0,06 8
Амикацин R 128 128 1
S 2 0,25 8
Ципрофлоксацин R 128 128 1
S 0,015 0,015 1
Полимиксин S 0,25 0,015 17
R 2 0,015 133
Тигециклин R 2 0,12 17
S 0,5 0,06 8
S-чувствительный к антибиотику, R-резистентный к антиб иотику.
Таблица 9. Влияние Уг МИК ГР на МИК разных антибиотиков против Р. а
Антибиотик МИК АБ в
Фенотип присутствии
патогена МИК АБ, ГР, Снижение
(S/R) мкг/мл мкг/мл МИК, раз
Цефтазидим R 128 8 16
S 4 1 4
Меропенем R 16 8 2
S 0,5 0,125 4
Амикацин R 64 64 1
S 4 0,5 8
Ципрофлоксацин S 32 8 4
R 128 0,25 512
Полимиксин S 0,25 0,015 17
R 1 0,06 17
S-чувствительный к антибиотику, R-резистентный к антибиотику.
Таблица 10. Влияние Х МИК ГР на МИК разных антибиотиков против S. ι
Антибиотик МИК АБ в
Фенотип присутствии
патогена МИК АБ, ГР, Снижение
(S/R) мкг/мл мкг/мл МИК, раз
Ванкомицин S 2 1 2
Линезолид S 1 0,5 2
Тигециклин S 0,125 0,016 8
Цефтаролин S 1 0,06 17
Даптомицин S 0,5 0,06 8
Гентамицин R 128 4 32
S 0,5 0,03 17
Клиндамицин S 0,125 0,02 6
R 128 2 64
Ко-тримоксазол S 0,125 0,004 31 R 32 0,25 128
Оксациллин R 512 4 128
S 0,125 0,016 8
Ципрофлоксацин S 0,25 0,016 16
R 8 0,5 16
Фузидиевая к-та S 0,06 0,004 15
S 0,25 0,06 4
R 8 8 1
S-чувствительный к антибиотику, R-резистентный к антибиотику.
Таблица 11. Влияние Уг МИК ГР на МИК разных антибиотиков против Е. faecalis.
Антибиотик МИК АБ в
Фенотип присутствии
патогена МИК АБ, ГР, Снижение
(S/R) мкг/мл мкг/мл МИК, раз
Ампициллин S 0,5 0,5 1
R 32 32 1
Ципрофлоксацин S 0,25 0,25 1
R 32 16 2
Линезолид S 2 2 1
Тигециклин S 0,03 0,016 2
Даптомицин S 2 0,06 33
Ванкомицин S 2 0,06 33
Гентамицин S 8 1 8
R 1024 8 128
S-чувствительный к антибиотику, R-резистентный к антибиотику.
Анализ таблиц показывает, что в случае Грамотрицательных бактерий в большей части экспериментов (70-90%) добавление ГР в концентрации ХА МИК усиливало действие антибиотиков, МИК снижался в 2 и более раз. В случае грамположительных бактерий добавление ГР усиливало действие антибиотиков несколько реже - в 50-70% случаев. Важно, что усиление действия антибиотика происходило как против чувствительных, так и резистентных форм бактерий. В некоторых случаях МИК для антибиотикорезистентных бактерий снижался до величины МИК чувствительных бактерий или был ниже (для полимиксина и ципрофлоксацина для P. aeruginosa, для тигециклина и полимиксина для A. baumannii, гентамицина для Е. faecalis). Еще в 8 случаях МИК для антибиотикорезистенных штаммов приблизился к МИК чувствительного штамма, отличаясь от него в 2-8 раз. Максимальная зафиксированная величина снижения МИК составляла 100-500 раз.
Приведенные примеры показывают эффективность применения гексилрезорцина для усиления действия антибиотиков, применяемых в клинической практике, против клинических изолятов грамположительных и грамотрицательных бактерий, в том числе - против штаммов, обладающих резистентностью к испытываемым антибиотикам.
Сравнение эффективности антибиотиков и композиций по изобретению, включающих 5-гептилрезорцин (ГПР) и 4-н-бутилрезорцин (БР)
Эффективность композиций по изобретению, включающих другие алкилрезорцины - 5-гептилрезорцин и 4-н-бутилрезорцин, была исследована на E.coli и S. aureus. Результаты данных экспериментов представлены в Таблицах 12- 15. Концентрации ГПР и БР МИК) подбирали экспериментально для каждого тестируемого штамма.
Таблица 12. МИК для разных антибиотиков, а также для композиций по изобретению, включающих 100 мкг/мл 5-гептилрезорцина (1/2 МИК), определенные для E.coli.
Figure imgf000022_0001
Таблица 13. МИК для разных антибиотиков, а также для композиций по изобре' включающих 15 мкг/мл 5-гептилрезорцина (1/2 МИК), определенные для S.aureus.
Figure imgf000022_0002
Таблица 14. МИК для разных антибиотиков, а также для композиций по изобретению, включающих 80 мкг/мл 4-н-бутилрезорцина (1/2 МИК), определенные для E.coli.
МИК, мкг/мл Соотношение
Снижение
Антибиотик Композиция масс 4 -бутил-
Антибиотик МИК, раз
по резорцина и изобретению, антибиотика в включающая композиции антибиотик и
БР
Полими син 5 0.2 25 400: 1
Доксициклин 6 1.5 4 53: 1
Ампициллин 50 10 5 80: 1
Ципрофлоксацин 1 0.15 6 533: 1
Таблица 15. МИК для разных антибиотиков, а так» <е для композиций по изобретению, включающих 30 мкг/мл 4-н-бутилрезорцина (1/2 МИ С), определенные для S.aureus.
МИК, мкг/мл
Композиция Соотношение по масс 4-н-бутил-
Снижение
Антибиотик изобретению, резорцина и
Антибиотик МИК, раз
включающая антибиотика в антибиотик омпозиции и БР
Полимиксин 20 2 10 15: 1
Доксициклин 0.5 0.1 5 300: 1
Ампицилин 0.5 0.1 5 300: 1
Ципрофлоксацин 2 0.2 10 150: 1 В результате проведенных экспериментов неожиданно было обнаружено, что в присутствии 2 МИК бутилрезорцина и гептилрезорцина для обоих испытанных штаммов бактерий наблюдается значительное усиление антимикробного действия всех испытанных антибиотиков. Исследование биоцидного действия композиций по изобретению,
включающих антибиотик и 4-гексилрезорцин
Для определения биоцидного действия на Е.соИ, в частности двух антибиотиков - ампициллина и ципрофлоксацина, их использовали в высоких концентрациях, т.е. больших, чем МИК, - соответственно, 10 и 100 мкг/мл. Гексилрезорцин добавляли в концентрации V. МИК (100 мг/л). Количество КОЕ определяли через разное время инкубации. КОЕ определяли путем высева десятичных разведений на плотную питательную среду LB.
Таблица 16. Содержание КОЕ Е.соИ после инкубации с антибиотиком и в присутствии композиции, включающей тот же антибиотик и ГР (100 мг/л, Vi МИК). Исходное содержание клеток - 10 КОЕ/мл.
Время инкубации с антибиотиком, Контроль Композиция по ч (без ГР) изобретению
Ампициллин, 3 2.5 х 10s 1.1 х 103
Figure imgf000024_0001
Приведенные результаты (Таблица 16) демонстрируют потенцирование алкилрезорцином биоцидного действия антибиотика. Например, численность КОЕ ниже через 3 ч инкубации на 4-5 порядков в вариантах совместного применения антибиотика и алкилрезорцина по сравнению с действием одного лишь антибиотика. Через 2-е суток (для ампициллина) и через 7 суток (для ципрофлоксацина) в варианте совместного применения антибиотика и алкилрезорцина жизнеспособные клетки не обнаруживались, тогда как в присутствии одного лишь антибиотика их концентрация составляла 108 и 103 кл/мл, для ампициллина и ципрофлоксацина, соответственно.
Отсутствие выживающих клеток обусловливает уникальную особенность композиций по изобретению, заключающуюся в том, что при их применении к данным композициям не будет развиваться резистентность у патогенных бактерий, т.к. она не успевает сформироваться, и не будет передаваться последующим поколениям бактерий ввиду отсутствия выживающих клеток.
Аналогичные данные получены в другой серии опытов - с культурой К. pneumoniae. Бактерицидную активность препаратов оценивали в эксперименте по изучению выживаемости бактериальных клеток в бульоне Мюллера Хинтона, содержащего антибиотик полимиксин (1 мкг/мл) с или без добавления 1Л МИК ГР (Таблица 17).
Таблица 17. Динамика гибели клеток A', pneumoniae в бульоне Мюллера Хинтона в присутствии поли иксина В (0.5 мкг/мл) и полимиксина В (0.5 мкг/мл) с Уг МИК ГР (64 мкг/мл)..
Количество клеток К. pneumoniae (КОЕ/мл) через N часов экспозиции с
полимиксином В
0 ч 0,5 ч 1 ч 2 ч 3 ч 6 ч 24 ч 48 ч
400000 1920 70 20 <10 <10 <10 <10
Количество клеток К. pneumoniae (КОЕ/мл) через N часов экспозиции с
полимиксином и ГР
400000 <10 <10 <10 <10 <10 <10 <10
Уже через 30 мин инкубации бактерий в присутствии комбинированного препарата антибиотик+ГР живые клетки не обнаруживались, тогда как в присутствии одного антибиотика они выживали в течение 2 часов.Продемонстрированные примеры показывают, что добавление ГР усиливает не только рост-превентирующее действие АБ (МИК), но и биоцидное действие, что выражается в более высоких скоростях гибели бактерий в присутствии АР. Определение частоты образования спонтанных мутантов штамма К. pneumoniae, устойчивых к полими сину, амикацину, и комбинированным
препаратам на основе этих антибиотиков и ГР
В специальной серии экспериментов были определены частоты образования спонтанных мутантов, устойчивых к антибиотикам полимиксину, амикацину и их комбинациям с ГР.
Частоту образования антибиотикоустойчивых спонтанных мутантов определяли на агаре Мюллера-Хинтона (МХА) с антибиотиками. Культуру К. pneumoniae КРМ9 выращивали на среде МХА при 35°С в течение 20 часов. Готовили суспензию в физиологическом растворе 1010 л/мл и делали последовательные десятикратные разведения. Исходную суспензию и её разведения 1 : 10, 1 : 100 и 1 : 1000 высевали на поверхность агара Мюллера-Хинтона, содержащего соответствующие препараты в количестве от 1 до 128 МПК. Чашки с посевами помещали в термостат (35 °С) и инкубировали в течение 48 часов. Частоту спонтанных мутантов определяли, как отношение среднего количества выросших на агаре с соответствующими добавками колоний к исходному количеству высеваемых клеток, определяемому методом подсчета колониеобразующих единиц (КОЕ). За 1 МИК комбинированного препарата «полимиксин+ГР» или «амикацин+ГР» считали препарат, содержащий V. МИК (половинную концентрацию) антибиотика (0.5 мкг/мл для полимиксина и 1 мкг/мл для амикацина) и 1А МИК ГР (64 мкг/мл). Результаты представлены в Таблице 18.
Концентрация одного лишь полимиксина В для К. pneumoniae, блокирующа рос/' спонтанных полимиксин-резистентных мутантов, составляет 128 МИК (128 мкг/мл). При более низких концентрациях антибиотика спонтанные мутанты выявлялись с частотой от 1 , ] х 10"7 до 1,8x 10"'8.
Таблица 18. Частота встречаемости спонтанных мутантов К. pneumoniae, устойчивых к антибиотикам полимиксину и амикацину и их комбинациям с ГР (концентрация препаратов выражена в МИК).
Figure imgf000026_0001
Мутант-превентирующая концентрация амикацина для K.pnewnoniae составляла 64 МИК, Частота спонтанных мутантов к амикацину колебалась в пределах 1,5x 10"* - 2,8 10"7.
Для комбинированных препаратов ГР+(полимиксин или амикацин) мутант- превентирующая концентрация составляла 4 МИК, что было ниже в 32 или 16 раз, чем для полимиксина или амикацина, соответственно, в отсутствие добавки. Частота образования устойчивых к оолее низким концентрациям мутантов варьировала от 1,3 х 10'' до 6,7x 10"' .
Следовательно, сам механизм действия алкилрезорцинов, описанный выше, предопределяет невозможность развития антибиотикорезистентности в широких пределах к комбинациям ГР с антибиотиками.
Соответственно, при грамотном применении новой композиции по изобретению, например, когда к культуре патогена добавляется концентрация комбинированного препарата, равная или большая, чем 4 МИК, антибиотикорезистентность к этому препарату не разовьётся никогда, в отличие от обычных АБ, например, амикацина или полимиксина, когда для недопущения появления антибиотикорезистентных мутантов надо использовать более 64 или 128 МИК антибиотика, соответственно.
Исследование эффективности композиций по изобретению, включающих 4- гексилрезорцин, против бактерий in vivo
Эффективность комбинаций ГР и антибиотиков in vivo была продемонстрирована на двух моделях.
Для проведения испытаний эффективности добавления ГР для лечения инфекций, вызванных микобактериями, была использована экспериментальная модель быстрого тестирования противотуберкулезных антимикробных препаратов (Jhamb SS et al. A short- term model for preliminary screening of potential anti-tubercular compounds // Scand J Infect Dis. 2009, 41(11- 12): 886-889). При этом определяли содержание бактерий Mycobacterium smegmatis в селезенке белых мышей инбредной линии BALBc через 3-е суток после введения суспензии бактерий в хвостовую вену.
Для опытов in vivo бактерии М. smegmatis выращивали на среде Сотона в течение
3-х суток. 100 мкл суспензии бактерий вводили в хвостовую вену белых мышей линии BALB. На 3-й сутки извлекали селезенку мыши, взвешивали, гомогенизировали, десятичные разведения гомогената высевали на плотную среду Сотона, инкубировали 5 суток и подсчитывали количество выросших бактерий. Концентрации антибиотиков пересчитывали на кг веса мышей исходя из коэффициентов поверхности тела человека и мыши (Гуськова Т. А. Токсикология лекарственных средств. М. : Русский врач, 2003. 154 с.) и доз антибиотиков, рекомендованных для человека. Концентрацию ГР рассчитывали из предельных разрешенных доз для человека и коэффициентов поверхности тела человека и мыши.
Композиции по изобретению, включающие антибиотик и алкилрезорцин, добавляли в питьё мышей из расчёта 75 мг ГР/кг веса мыши в сутки, 15 мг изониазида/кг веса мыши в сутки. Также были испытаны отдельно антибиотик и ГР. Метод детекции микобактерий после извлечения и гомогенизирования селезёнки на 6й день инкубации - высев на селективную плотную среду Сотона. Результаты данного исследования представлены на Рисунке 1.
Приведенный пример иллюстрирует, что использование композиций по изобретению, включающих 4-гексилрезорцин и противотуберкулёзный препарат изониазид, снижает количество бактерий в селезёнке белых мышей с 13500/г селезёнки до 610, т.е. в 20 раз, тогда как взятые по отдельности тестируемые антибиотик и алкилрезорцин практически не влияли на количество бактерий в селезенке мышей в условиях опыта по сравнению с контролем в пределах погрешности определения количества микобактерий. Такие данные подтверждают высокую эффективность композиций по изобретению в условиях применения в живом организме.
Для испытания эффективности добавления ГР к антибиотикам для лечения клебсиелёзных инфекций была использована модель летальной клебсиелёзнойной инфекции мышей. Бедренную клебсиеллёзную инфекцию моделировали на белых беспородных мышах, заражая их внутримышечно в дозе -5,4x 10 клеток К. pneumoniae КРМ9 в объеме 0,1 мл. Бактериальную суспензию для инфицирования животных готовили из 16 часовой агаровой культуры К. pneumoniae КРМ9, которую суспендировали в физиологическом растворе до мутности эквивалентной 0,5 по стандарту МакФарланда, что соответствует 1 * 108 кл/мл, а затем титровали её до конечной концентрации 5 х 104 кл/мл. Контроль количества клеток во взвеси осуществляли путём высева по 0, 1 мл из соответствующих разведений приготовленной суспензии на плотную питательную среду JVe 1 ГРМ (ГНЦ ПМБ, Оболенск). Посевы инкубировали в течение 24 часов при температуре 36°С. Лечение мышей композицией по изобретению, включающий антибиотик амикацин и ГР, начинали через 2 часа после заражения (раннее начало лечения) или через 24 ч после заражения (позднее начало лечения) и вводили в течение 5 суток. Амикацин вводили подкожно из расчета 5 мг/кг, ГР вводили внутрибрюшинно из расчета 15 мг/кг.
У выживших животных проводили количественный бактериологический анализ селезёнки, мягких тканей левого бедра (место введения патогена) и крови. Селезёнки и ткани бедра в асептических условиях растирали пестиками в фарфоровых ступках с добавлением стерильного кварцевого песка. В гомогенаты органов добавляли по 1 мл физиологического раствора и тщательно перемешивали. Кровь и образцы суспензий титровали в физиологическом растворе и высевали на ГРМ-агар. Чашки с посевами инкубировали в течение суток при температуре 36°С и подсчитывали количество выросших колоний.
Результаты, представленные на Рис. 2Б, иллюстрируют, что при позднем начале лечения инфекции, когда применение антибиотика неэффективно и погибают все мыши, добавление ГР сохраняет жизнь 20% тестируемых животных. Если антибиотикотерапия амикацином начата своевременно, через 2 ч после заражения, то выживают все животные, но полностью излечиваются (после лечения патогенов в органах не было обнаружено) только 10% мышей. Добавление ГР повышает долю полностью излеченных животных в 2 раза, до 20% (Рис. 2А).
Примеры композиций по изобретению
Пример 1. Для обработки культуры E.coli была создана композиция в виде раствора, состоящего из: воды и этанола в объемном соотношении 7:3, с концентрацией полимиксина 10 мкг/мл и гексилрезорцина 10 мг/мл. При добавлении 1%-го раствора такой композиции (разведение 1 : 100), роста бактериальной культуры не наблюдали (Таблица 2).
Пример 2. Для обработки культуры S. aureus, была создана композиция в виде раствора, состоящего из: воды и диметилсульфоксида в объемном соотношении 1 : 1 , с концентрацией доксициклина 10 мкг/мл и гексилрезорцина 1.5 мг/мл. При добавлении 1%-го раствора такой композиции (разведение 1 : 100), роста бактериальной культуры не наблюдали (Таблица 3).
Пример 3. Для усиления действия антибиотиков в теле теплокровного животного против Грамположительных микобактерий M.smegmatis была создана композиция для введения мышам через желудок (для поения мышей). Композиция представляла водный раствор этанола (3-5%), сахарозы (1%), ГР и изониазида из расчета 75 мг ГР/кг веса мыши в сутки, 15 мг изониазида/кг веса мыши в сутки. Использование композиций по изобретению, включающих 4-гексилрезорцин и противотуберкулёзный препарат изониазид, снижает количество бактерий в селезёнке белых мышей с 13500/г селезёнки до 610, т.е. в 20 раз, тогда как взятые по отдельности тестируемые антибиотик и алкилрезорцин практически не влияли на количество бактерий в селезенке мышей в условиях опыта по сравнению с контролем в пределах погрешности определения количества микобактерий (Рис. 1). Эти данные подтверждают высокую эффективность композиций по изобретению в условиях применения в живом организме.
Пример 4. Для усиления действия антибиотиков в теле теплокровного животного против Грамотрицательных бактерий K.pneumonia была создана композиция из раствора ГР в растворителе вода+ДМСО (50%) и водного раствора антибиотика амикацина, вводимых раздельно. Лечение мышей композицией по изобретению, включающей амикацин и ГР, начинали через 2 часа после заражения (раннее начало лечения) или через 24 ч после заражения (позднее начало лечения). Амикацин вводили подкожно из расчета 5 мг/кг, ГР вводили внутрибрюшинно из расчета 15 мг/кг.
Результаты, представленные на Рис. 2 Б, иллюстрируют, что при позднем начале лечения инфекции, когда применение антибиотика неэффективно и погибают все мыши, добавление ГР сохраняет жизнь для 20% тестируемых животных. Если антибиотикотерапия амикацином начата своевременно, через 2 ч после заражения, то выживают все животные, но полностью излечиваются (т.е. когда после лечения патогенов в органах не было обнаружено), только 10% мышей. Добавление ГР повышает долю полностью излеченных животных в 2 раза, до 20%. Эти данные подтверждают высокую эффективность композиций по изобретению в условиях применения в живом организме.
Несмотря на то, что изобретение описано со ссылкой на раскрываемые варианты воплощения, для специалистов в данной области должно быть очевидно, что конкретные подробно описанные эксперименты приведены лишь в целях иллюстрирования настоящего изобретения, и их не следует рассматривать как каким-либо образом ограничивающие объем изобретения. Должно быть понятно, что возможно осуществление различных модификаций без отступления от сути настоящего изобретен

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Фармацевтическая композиция для системного введения субъекту, предназначенная для лечения инфекционного заболевания микробной этиологии у субъекта, состоящая, по меньшей мере, из терапевтически эффективного количества антибиотика и С4_7-алкилрезорцина, и дополнительно включающая фармацевтически приемлемый растворитель и/или наполнитель.
2. Фармацевтическая композиция по п.1, характеризующаяся тем, что С4_7- алкилрезорцин представляет собой 4-н-бутилрезорцин, 4-гексилрезорцин или 5- гептилрезорцин.
3. Фармацевтическая композиция по п.1, характеризующаяся тем, что фармацевтически приемлемый растворитель представляет собой этиловый спирт, диметилсульфоксид или детергент.
4. Фармацевтическая композиция по п.1, характеризующаяся тем, что массовая доля С4_7-алкилрезорцина в композиции составляет не более 0.1%.
5. Фармацевтическая композиция по п.1, характеризующаяся тем, что массовая доля С4-7-алкилрезорцина в композиции составляет не менее 0.001%.
6. Фармацевтическая композиция по п.1, характеризующаяся тем, что антибиотик выбирают из группы полипептидов, аминогликозидов, тетрациклинов, макролидов, гликопептидов, левомицетина, рубомицина, бета-лактамов, хинолонов, сульфаниламидов, изониазида, полипептидов, аминогликозидов, тетрациклинов, макролидов, гликопептидов, оксазолидинонов, бета-лактамов, хинолонов, сульфаниламидов, линкозамидов, фузидиевой кислоты, антигрибных или противопротозойных препаратов.
7. Фармацевтическая композиция по п.1, характеризующаяся тем, что инфекционное заболевание микробной этиологии вызвано бактериальной инфекцией, протозойной инфекцией или грибковой инфекцией.
8. Фармацевтическая композиция по п.1, характеризующаяся тем, что инфекционное заболевание микробной этиологии вызвано грамположительными бактериями или грамотрицательными бактериями.
9. Способ лечения инфекционного заболевания, включающий системное введение фармацевтической композиции по любому из пп. 1-8 субъекту, нуждающемуся в таком лечении.
10. Способ лечения инфекционного заболевания у субъекта, вызванного штаммом микроорганизмов, устойчивым к антибиотику, включающий системное введение этому субъекту фармацевтической композиции, состоящей из указанного антибиотика и С4_7-алкилрезорцина, а также дополнительно включающей фармацевтически приемлемый растворитель и/или наполнитель.
11. Способ по п. , характеризующийся тем, что фармацевтическая композиция может быть получена непосредственно перед ее введением путем смешивания компонентов в необходимых пропорциях.
12. Способ по п.9, характеризующийся тем, что компоненты фармацевтической композиции могут быть введены в организм субъекта раздельно.
13. Способ по п.10, характеризующийся тем, что устойчивость штамма микроорганизмов к антибиотику тестируется до введения субъекту фармацевтической композиции.
PCT/RU2018/050008 2017-02-28 2018-02-08 Композиция антимикробных препаратов для лечения инфекционных заболеваний людей и животных и способ её применения WO2018160104A1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2016131199 2017-02-28
RU2016131199A RU2665006C1 (ru) 2017-02-28 2017-02-28 Композиция антимикробных препаратов для лечения инфекционных заболеваний людей и животных и способ её применения

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2018160104A1 true WO2018160104A1 (ru) 2018-09-07

Family

ID=63286912

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/RU2018/050008 WO2018160104A1 (ru) 2017-02-28 2018-02-08 Композиция антимикробных препаратов для лечения инфекционных заболеваний людей и животных и способ её применения

Country Status (2)

Country Link
RU (1) RU2665006C1 (ru)
WO (1) WO2018160104A1 (ru)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2021076020A2 (ru) * 2019-10-14 2021-04-22 Андрей Михайлович ГАПОНОВ Фармацевтическая композиция для лечения и профилактики инфекционно-воспалительных заболеваний

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2001302506A (ja) * 2000-04-21 2001-10-31 Pola Chem Ind Inc 好中球抑制剤及び抗掻痒用の皮膚外用剤
WO2011040495A1 (ja) * 2009-09-30 2011-04-07 株式会社資生堂 ヘパラナーゼ活性阻害剤並びにそれを含有するしわ改善剤及び医薬組成物
US20130023512A1 (en) * 2004-12-02 2013-01-24 Venus Remedies Limited Compositions for Combating Beta-Lactamase-Medicated Antibiotic Resistance Using Beta-Lactamase Inhibitors Useful For Injection
WO2013058441A1 (ko) * 2011-10-17 2013-04-25 성균관대학교 산학협력단 비유전성 항생제 내성 저해제

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2001302506A (ja) * 2000-04-21 2001-10-31 Pola Chem Ind Inc 好中球抑制剤及び抗掻痒用の皮膚外用剤
US20130023512A1 (en) * 2004-12-02 2013-01-24 Venus Remedies Limited Compositions for Combating Beta-Lactamase-Medicated Antibiotic Resistance Using Beta-Lactamase Inhibitors Useful For Injection
WO2011040495A1 (ja) * 2009-09-30 2011-04-07 株式会社資生堂 ヘパラナーゼ活性阻害剤並びにそれを含有するしわ改善剤及び医薬組成物
WO2013058441A1 (ko) * 2011-10-17 2013-04-25 성균관대학교 산학협력단 비유전성 항생제 내성 저해제

Also Published As

Publication number Publication date
RU2665006C1 (ru) 2018-08-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP2736508A1 (en) Pharmaceutical compositions comprising sulbactam and beta-lactamase inhibitor
US10758529B2 (en) Pharmaceutical compositions containing azaquinone for inhibiting clostridium difficile activity
Bruns et al. Modulation of the multidrug efflux pump EmrD-3 from Vibrio cholerae by Allium sativum extract and the bioactive agent allyl sulfide plus synergistic enhancement of antimicrobial susceptibility by A. sativum extract
US20220117924A1 (en) Compositions of Glycerol and /or Non-Toxic Amino Acids for Inhibiting and Destroying Biofilm, including Related Methods
US20160213626A1 (en) Methods for microbial biofilm destruction
Priya et al. Tachyplesin and CyLoP-1 as efficient anti-mycobacterial peptides: A novel finding
Waisbren et al. Nitrofurantoin: Clinical and laboratory evaluation
WO2018160104A1 (ru) Композиция антимикробных препаратов для лечения инфекционных заболеваний людей и животных и способ её применения
CN113082026A (zh) 一种青蒿素衍生物在制备多粘菌素抗菌增效剂中的应用
CN102099027B (zh) 富里酸及抗生素组合物
CN108186617B (zh) 香叶醇及其衍生物在制备mrsa感染性疾病药物中的新用途
CN105792827A (zh) 抗菌组合物
CN114989165A (zh) 一种抗持留菌和生物膜菌的化合物或组合物及其用途
US20170065566A1 (en) Pharmaceutical combinations comprising antibacterial agents
CN106132411A (zh) 包含抗菌剂的药物组合物
CN106102741A (zh) 包含抗菌剂的药物组合物
CN106794250A (zh) 包含抗菌剂的药物组合物
US20160287571A1 (en) Pharmaceutical compositions comprising antibacterial agents
CN115414342B (zh) 芬布芬在制备杀灭革兰氏阴性菌药物中的应用
KR20160138304A (ko) 항균 물질들을 포함하는 약학 조성물
Hernandez-Romero et al. Rifampicin and N-acteylcisteyne inhibit oral bacterial growth and biofilm formation
US20150224177A1 (en) Methods for therapeutic or prophylactic treatment of melioidosis and/or associated diseases
KR20220151426A (ko) 병원성 비브리오균의 병원성인자 발현 억제용 약학적 조성물
Cieslak et al. Essential oils and methylglyoxal: a possible alternative treatment for antibiotic resistant bacterial infections
Josephs et al. Drug-drug interaction may explain failed antibiotic effectiveness-an in vivo study

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 18761478

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 18761478

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1