CN111494363B - 木犀草素在抗水产养殖动物嗜水气单胞菌感染中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了木犀草素在抗水产养殖动物嗜水气单胞菌感染中的应用，木犀草素通过抑制嗜水气单胞菌主要毒力因子气溶素的活性而降低嗜水气单胞菌的毒力，从而达到降低该菌致病力的作用。进一步通过构建试验动物模型发现木犀草素对斑点叉尾鮰嗜水气单胞菌人工感染模型有显著的治疗作用，8天后的死亡率由95%降至30%。木犀草素为植物提取物，可从多种中药材中提取获得，对动物和人安全性较高，可以作为水产养殖用药物制剂和饲料添加剂应用于治疗和预防水产养殖动物的嗜水气单胞菌感染。

Description

木犀草素在抗水产养殖动物嗜水气单胞菌感染中的应用

技术领域

本发明属于水产养殖技术领域，具体涉及木犀草素在抗水产养殖动物嗜水气单胞菌感染中的应用。

背景技术

木犀草素是一种黄酮类化合物，广泛分布于中药、蔬菜和水果中，是清热解毒类中药金银花和菊花的有效成分之一。现代药理研究发现，木犀草素具有多种生物学活性，如抗炎、抗肿瘤、抗氧化和神经保护功能等。作为其来源植物的金银花在我国大部分地区有分布，主要用于治疗外感风热或温病发热等症，已收入到中国药典。目前在临床中仍具有较多的应用。

嗜水气单胞菌是淡水水产养殖常见的一种条件性病原菌，此外还能感染陆生动物和人，是一种人-兽-鱼共患病原菌。嗜水气单胞菌对淡水养殖动物的致病范围十分广泛，可以导致多种鱼类、虾类、蛙类、鳖类等感染性疾病，是养殖鱼类腹水症和爆发性出血病的主要病原菌。嗜水气单胞菌对养殖鱼类的威胁极大，一旦感染其死亡率可达到80％甚至100％，短期内造成大量的鱼死亡，是池塘养殖的烈性病害。因此，加强对水产养殖环境中嗜水气单胞菌的控制对于淡水鱼类的健康养殖和动物性食品安全具有重要意义。化学抗菌药物是水产养殖业用于控制细菌性疾病的主要手段，长期不合理使用抗菌药物导致了耐药性嗜水气单胞菌菌株的产生，给嗜水气单胞菌感染的治疗带来困难。此外，化学抗菌药物的大量使用导致水产源动物性食品中兽药残留，给食品安全带来隐患。因此，全新机制的抗嗜水气单胞菌感染策略和抗感染药物亟待研发以应对耐药菌带来的种种问题。

气溶素是致病性嗜水气单胞菌分泌的一种成孔蛋白，是其主要的毒力因子，也是嗜水气单胞菌导致各种疾病的物质基础。气溶素具有溶血性、肠毒性和细胞毒性，是目前研究较多的成孔毒素之一。气溶素能结合到易感细胞的细胞膜上，形成带有孔道的七聚体，导致细胞内容物外流而引起细胞死亡。气溶素对多种动物的红细胞、上皮细胞敏感。因此，以气溶素为靶标的药物筛选对于耐药性嗜水气单胞菌感染的防控具有广阔前景和重要意义。

发明内容

本发明的目的在于提供了木犀草素在抗水产养殖动物嗜水气单胞菌感染中的应用，木犀草素通过抑制嗜水气单胞菌气溶素的活性，减轻嗜水气单胞菌引起的细胞损伤，对斑点叉尾鮰嗜水气单胞菌感染模型有显著的保护作用。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

木犀草素在抗水产养殖动物嗜水气单胞菌感染中的应用：经试验证实，当木犀草素浓度达到1μg/mL时其对气溶素的溶血活性有显著的抑制作用，达到2μg/mL以上时其对气溶素溶血活性具有极显著的抑制作用(p＜0.01)，但对嗜水气单胞菌的生长几乎没有影响；进一步发现1μg/mL木犀草素能显著抑制气溶素引起的A549细胞损伤；对感染嗜水气单胞菌的斑点叉尾鮰灌服25mg/kg剂量的木犀草素，12h使用一次，连续3天，可使其死亡率降低到30％，而阳性对照组死亡率为95％。

木犀草素为金银花和菊花等药用植物的主要化学成分，没有明显的毒副作用和残留，是一种理想的天然药物，可广泛用于制备抗水产养殖动物嗜水气单胞菌感染的中药制剂和饲料添加剂。

与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果：使用剂量低，治疗效果好，不直接抑制病原菌的生长因此不容易使病原菌产生耐药性，主要成分为中药来源的天然药物，对鱼体、人及环境没有毒性作用，没有药物残留的风险。

附图说明

图1为木犀草素与嗜水气单胞菌168菌株共培养的生长曲线。

图2为木犀草素对气溶素溶血活性的影响。

图3为木犀草素对气溶素引起的A549细胞损伤的影响。

具体实施方式

实施例1：木犀草素对嗜水气单胞菌最小抑菌浓度测定

本发明所涉及的嗜水气单胞菌168菌株由长江水产研究所水产动物药理与药残控制技术实验室保存。采用CLSI推荐的肉汤微量稀释法测定了木犀草素对168菌株的最小抑菌浓度，步骤如下：

(1)将配置好的木犀草素(购自四川维克奇生物科技有限公司，纯度大于98％，CASNo.：491-70-3)在96孔细胞培养板中倍比稀释，浓度分别为512μg/mL、256μg/mL、128μg/mL、64μg/mL、32μg/mL、16μg/mL、8μg/mL、4μg/mL、2μg/mL、1μg/mL；每孔药物体积100μL；

(2)分别无菌接种168菌株的单菌落至MH培养基中30℃培养过夜，离心取菌体用无菌生理盐水调整浓度为0.5麦氏比浊度，然后用培养基稀释至1×10⁶CFU/mL，在96孔细胞培养板中加入菌液，使其最终浓度达到5×10⁵CFU/mL，分别设置阴性和阳性对照组(阴性对照组不加药物不加菌液，阳性对照组只加菌液不加药物)，每个药物重复三次，在30℃生化培养箱中培养18-24h后观察结果，以没有细菌生长的最低药物浓度判定为该药物的最低抑菌浓度。结果发现，木犀草素对嗜水气单胞菌168菌株的最小抑菌浓度大于256μg/mL。

实施例2：木犀草素对嗜水气单胞菌生长的影响

本发明所涉及的嗜水气单胞菌168菌株由长江水产研究所水产动物药理与药残控制技术实验室保存。将168菌株在BHI液体培养基中培养至对数生长前期(OD600nm＝0.3，28℃)，将培养菌分别置于6个50mL的锥形瓶中，每瓶20mL，分别加入不同浓度(0，0.5，1，2，4，8μg/mL)的木犀草素，28℃条件下继续培养5h，每30min取菌液测定一次OD_600nm的吸收值。附图1所示为不同浓度木犀草素与嗜水气单胞菌168菌株共培养的生长曲线，从图中可以看出木犀草素在浓度为8μg/mL及以下时对嗜水气单胞菌的生长没有影响。

实施例3：木犀草素对嗜水气单胞菌气溶素溶血活性的影响

本发明中所涉及的气溶素由长江水产研究所水产动物药理与药残控制技术实验室制备并保存。具体步骤如下：975μLPBS溶液加至6个1.5mL离心管中，分别加入2μL浓度为100μg/mL纯化气溶素，然后加入木犀草素使不同离心管中的浓度分别达到0，0.5，1，2，4，8μg/mL，混合均匀后放入37℃培养箱中；孵育15min后加入25μL脱纤维绵羊红细胞(上海源叶生物科技有限公司)，继续在37℃条件下孵育15min，高速离心后测量OD_543nm吸收度，1％Triton X-100为阳性对照。如附图2所示，随着木犀草素浓度增加气溶素的溶血作用呈剂量依赖性的降低，当木犀草素浓度达到1μg/mL及以上时，木犀草素能显著抑制气溶素的活性(0.01＜p＜0.05)。当木犀草素浓度达到2μg/mL以上时其对气溶素溶血活性具有极显著的抑制作用(p＜0.01)。

实施例4：木犀草素对嗜水气单胞菌气溶素引起A549细胞损伤的保护作用

本发明所涉及的气溶素和A549细胞由长江水产研究所保存。A549细胞培养在37℃含有5％二氧化碳的细胞培养箱中，培养基为DMEM，添加10％胎牛血清，青链霉素双抗。试验时将细胞以1.5×10⁵个/孔的浓度平铺于96孔细胞培养板上，在37℃二氧化碳培养箱中培养过夜。次日，向培养板中加入2μL浓度为100μg/mL纯化气溶素，随后分别加入木犀草素，使其终浓度达到0，0.5，1，2，4，8μg/mL；细胞继续置于二氧化碳培养箱中培养2h后取上清采用乳酸脱氢酶(LDH)释放试剂盒测定不同处理组LDH释放量。结果如附图3所示，当木犀草素浓度在1μg/mL及以上时能显著抑制A549细胞LDH的释放。结果表明，木犀草素能抑制气溶素引起的A549细胞损伤。

实施例5：木犀草素对斑点叉尾鮰嗜水气单胞菌感染模型的治疗作用

本发明所涉及的嗜水气单胞菌168菌株由长江水产研究所水产动物药理与药残控制技术实验室保存。试验在100cm×50cm×60cm的水族箱中进行，每天换水并保持水温在28±2℃左右。100g左右的健康斑点叉尾鮰经麻醉后通过腹腔注射嗜水气单胞菌168菌株建立人工感染模型。感染后2h开始对感染斑点叉尾鮰灌服25mg/kg剂量的木犀草素，每12h给药一次，连续给药3d，阳性对照组感染后灌服PBS作为对照。每个实验组使用斑点叉尾鮰20尾，感染后即开始记录死亡情况，结果见表1。该结果表明，斑点叉尾鮰人工感染嗜水气单胞菌后在8d内死亡率为95％；给予25mg/kg木犀草素治疗的斑点叉尾鮰发生了30％的死亡；其存活率远高于阳性对照组。通过以上研究充分表明，当斑点叉尾鮰感染嗜水气单胞菌后可通过给予25mg/kg剂量的木犀草素进行治疗，且该药物能取得较好的治疗效果。

表1木犀草素治疗斑点叉尾鮰嗜水气单胞菌感染模型后的死亡率

通过实施例1和实施例2发现，木犀草素最小抑菌浓度大于256μg/mL，在本发明使用浓度(0-8μg/mL)下对嗜水气单胞菌的生长几乎没有影响。通过实施例3发现，木犀草素能剂量依赖性的降低纯化气溶素的溶血活性。气溶素是致病性嗜水气单胞菌的主要毒力因子，与嗜水气单胞菌的致病力密切相关。因此，气溶素成为近年来研究抗嗜水气单胞菌感染药物的新靶标。进一步通过细胞试验研究了木犀草素对气溶素诱导的A549细胞损伤的抑制作用，通过以上研究表明，木犀草素能在不抑制嗜水气单胞菌生长的前提下通过抑制气溶素的溶血活性和细胞毒性来减轻嗜水气单胞菌引起的细胞损伤。以上研究提示，木犀草素对嗜水气单胞菌引起的斑点叉尾鮰感染有潜在的治疗作用。因此，通过注射嗜水气单胞菌构建了斑点叉尾鮰嗜水气单胞菌感染模型，通过口灌25mg/kg剂量木犀草素研究其治疗作用。结果表明，木犀草素治疗后动物模型的死亡率可降低至30％，而模型动物组死亡率为95％，显著提升了动物模型的存活率。该结果表明，木犀草素能治疗嗜水气单胞菌引起的斑点叉尾鮰感染，是一种潜在的抗嗜水气单胞菌药物。嗜水气单胞菌广泛存在于淡水养殖环境中，对多种淡水养殖水生动物有致病力，而气溶素是广泛分布于具有致病力的嗜水气单胞菌中，具有普遍性，由此可推断木犀草素对水产养殖动物嗜水气单胞菌感染均具有治疗作用。

Claims (2)

1.木犀草素在制备预防或治疗水产养殖动物嗜水气单胞菌感染的药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，木犀草素的给药剂量大于25mg/kg。

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