CN117838676A - 黄腐酚在制备抗水产养殖动物嗜水气单胞菌感染药物中的应用 - Google Patents
黄腐酚在制备抗水产养殖动物嗜水气单胞菌感染药物中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了黄腐酚在制备抗水产养殖动物嗜水气单胞菌感染药物中的应用，黄腐酚可在亚抑菌浓度下抑制嗜水气单胞菌气溶素的活性，对嗜水气单胞菌气溶素介导的细胞毒性具有显著的抑制作用，进一步构建了嗜水气单胞菌感染动物模型发现黄腐酚治疗可显著提高感染动物的存活率。黄腐酚是中药蛇麻的主要成分之一，属于异戊烯基黄酮类化合物，具有抑菌、抗癌、抗氧化、抗病毒和降血糖等生物学功能，安全性较高，是一种理想的药物原料或饲料添加剂用于防治水产养殖动物嗜水气单胞菌感染。
Description
技术领域
本发明属于水产养殖技术领域，具体涉及黄腐酚在抗水产养殖动物嗜水气单胞菌感染中的应用。
背景技术
黄腐酚是一种天然来源的异戊烯基黄酮类化合物，是中药蛇麻的主要化学成分抑制，具有抑菌、抗病毒、抗癌和抗氧化等生物活性。蛇麻，又名啤酒花，味苦，性微凉；具有健胃消食、安神利尿和抗痨消炎的功效，常用于治疗消化不良、腹胀、肺结核、咳嗽和失眠等疾病。
嗜水气单胞菌是淡水养殖常见的一种病原菌，能导致多数淡水养殖鱼类发病，还能感染小龙虾、牛蛙等，对水产养殖业的健康发展危害较大。此外，嗜水气单胞菌还是一种人兽鱼共患病原菌，常导致人类的腹泻、败血症等。水产养殖业中嗜水气单胞菌的防控主要依赖于抗生素类药物，长期不合理使用导致了耐药菌的产生，严重影响了治疗效果。因此，急需研发新的抗耐药性嗜水气单胞菌感染的药物用于防控耐药菌所导致的鱼类疾病。
嗜水气单胞菌的致病力与其自身所携带的毒力因子的数量和种类密切相关，其中气溶素是嗜水气单胞菌的主要毒力因子。研究发现，气溶素缺失后的嗜水气单胞菌其体内外毒力显著下降。因此，气溶素成为研发抗嗜水气单胞菌感染的潜在靶标。
发明内容
本发明的目的在于提供了黄腐酚在制备抗水产养殖动物嗜水气单胞菌感染药物中的应用，黄腐酚在不抑制嗜水气单胞菌生长的浓度下，能直接抑制气溶素的活性，对气溶素介导的细胞毒性具有显著的抑制作用，可提高鲫嗜水气单胞菌感染模型的存活率。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
黄腐酚在制备抗水产养殖动物嗜水气单胞菌感染药物中的应用：经试验验证，黄腐酚对嗜水气单胞菌的最小抑菌浓度为128μg/mL，在本试验浓度下对嗜水气单胞菌的生长没有任何影响，但其能剂量依赖性的抑制嗜水气单胞菌培养上清液的溶血活性，当黄腐酚浓度达到4μg/mL及以上时在统计学上具有显著性。此外，通过纯化的气溶素蛋白发现，黄腐酚达到2μg/mL及以上时可显著降低纯化气溶素的活性。以上结果表明，黄腐酚可直接抑制气溶素的活性。进一步实验研究发现，2μg/mL及以上浓度的黄腐酚可显著抑制气溶素介导的A549细胞的细胞损伤，提示其对嗜水气单胞菌感染具有保护作用。另外，建立了斑点叉尾鮰嗜水气单胞菌感染模型，结果发现口灌20mg/kg剂量的黄腐酚，每12h使用一次，连续3天，可显著提高感染动物的存活率，其存活率可达到65％，而阳性对照组存活率仅10％。通过以上研究表明，黄腐酚可作为一种渔药用于治疗水产养殖动物的嗜水气单胞菌感染。
黄腐酚是一种来源于药用植物甘草的天然化合物，对动物和人没有毒副作用，可广泛用于制备抗水产养殖动物嗜水气单胞菌感染的药物和饲料添加剂。
与现有技术相比，本发明具有以下有点及有益效果：黄腐酚抗感染作用并非直接抑制病原菌的生长，因此不会对病原菌造成选择性压力，不易产生耐药性，此外由于该药的作用非抑菌，因此对耐药菌仍有较好的治疗作用；黄腐酚为天然化合物，对动物、人和生态环境均无毒性作用，药物残留风险较低。
附图说明
图1为黄腐酚与嗜水气单胞菌XS-91-4-1菌株共培养的生长曲线
图2为黄腐酚对嗜水气单胞菌培养物上清液溶血活性的影响
图3为黄腐酚对纯化气溶素溶血活性的影响
图4为黄腐酚对气溶素诱导的A549细胞损伤的影响
图5为黄腐酚对嗜水气单胞菌感染模型的治疗作用
具体实施方式
实施例1：
黄腐酚对嗜水气单胞菌最小抑菌浓度测定
本发明所涉及的嗜水气单胞菌XS-91-4-1菌株由长江水产研究所水产动物药理与药残控制技术实验室保存。采用CLSI推荐的肉汤微量稀释法测定了黄腐酚对XS-91-4-1的最小抑菌浓度。步骤如下：
(1)将配制好的黄腐酚(四川维克奇生物技术有限公司，纯度＞98％，CASNo.6754-58-1)在96孔细胞培养板中倍比稀释，使第1至10孔中浓度分别为512μg/mL、256μg/mL、128μg/mL、64μg/mL、32μg/mL、16μg/mL、8μg/mL、4μg/mL、2μg/mL、1μg/mL；每孔药物体积100μL；
(2)分别无菌接种XS-91-4-1菌株的单菌落至MH培养基中30℃培养过夜，离心取菌体用无菌生理盐水调整浓度为0.5麦氏比浊度，然后用培养基稀释至1×106CFU/mL，在96孔细胞培养板中加入菌液，使其最终浓度达到5×105CFU/mL，分别设置阴性和阳性对照组(阴性对照组不加药物不加菌液，阳性对照组只加菌液不加药物)，每个药物重复三次，在30℃生化培养箱中培养18-24h后观察结果，以没有细菌生长的最低药物浓度判定为该药物的最低抑菌浓度。结果发现，黄腐酚对嗜水气单胞菌XS-91-4-1菌株的最小抑菌浓度为128μg/mL。
实施例2：
黄腐酚对嗜水气单胞菌生长的影响
本发明所涉及的嗜水气单胞菌XS-91-4-1菌株由长江水产研究所水产动物药理与药残控制技术实验室保存。将XS-91-4-1菌株在BHI液体培养基中培养至对数生长前期(OD600nm＝0.3，28℃)，将培养菌分别置于6个50mL的锥形瓶中，每瓶20mL，分别加入不同浓度(0，2，4，8，16μg/mL)的黄腐酚，28℃条件下继续培养5h，每30min取菌液测定一次OD600nm的吸收值。附图1所示为不同浓度黄腐酚与嗜水气单胞菌XS-91-4-1菌株共培养的生长曲线，从图中可以看出黄腐酚在浓度为16μg/mL及以下时对嗜水气单胞菌的生长没有影响。
实施例3：
黄腐酚对嗜水气单胞菌培养物上清液溶血活性的影响
本发明所涉及的嗜水气单胞菌XS-91-4-1菌株由长江水产研究所水产动物药理与药残控制技术实验室保存。将嗜水气单胞菌XS-91-4-1在BHI液体培养基中培养至对数生长前期，将菌液分装于5个50mL的锥形瓶中，每瓶菌液10mL，然后分别加入黄腐酚，使菌液中药物浓度分别达到16，8，4，2，0μg/mL，28℃继续培养至OD600nm至1.5，12000g离心1min收集上清液。向上清液中加入胰蛋白酶在室温反应10min以激活上清液中的气溶素。向1.5mL离心管中加入100μL激活的上清液，875μL溶血缓冲液，25μL脱纤维绵羊红细胞，充分混匀，在37℃条件下孵育20min后10000g离心1min，取上清液测定OD543nm的吸收值。去离子水作为阳性对照(100％溶血组)，溶血缓冲液作为阴性对照(0％溶血组)。结果如附图2所示，4μg/mL及以上浓度的黄腐酚能显著降低嗜水气单胞菌共培养物上清液的溶血活性，且该抑制作用呈剂量依赖性。该结果提示黄腐酚可通过抑制气溶素表达或活性降低培养物上清液的溶血活性。
实施例4：
黄腐酚对嗜水气单胞菌气溶素溶血活性的影响
本发明中所涉及的气溶素由长江水产研究所水产动物药理与药残控制技术实验室制备并保存。具体步骤如下：975μL PBS溶液加至5个1.5mL离心管中，分别加入2μL浓度为100μg/mL纯化气溶素，然后加入黄腐酚使不同离心管中的浓度分别达到0，2，4，8，16μg/mL，混合均匀后放入37℃培养箱中；孵育15min后加入25μL脱纤维绵羊红细胞(上海源叶生物技术有限公司)，继续在37℃条件下孵育15min，高速离心后测量OD543nm吸收度，去离子水作为阳性对照。如附图3所示，随着黄腐酚浓度增加气溶素的溶血作用呈剂量依赖性的降低，当黄腐酚浓度达到2μg/mL及以上时能显著抑制气溶素的活性。结合实施例3和4可知黄腐酚可通过直接抑制气溶素活性降低嗜水气单胞菌培养物上清液的溶血活性。
实施例5：
黄腐酚对嗜水气单胞菌气溶素引起A549细胞损伤的保护作用
本发明所涉及的气溶素和A549细胞由长江水产研究所保存。A549细胞培养在含有5％二氧化碳的培养箱中，培养基为DMEM，添加10％胎牛血清，青链霉素双抗。试验时将细胞以1.5×105个/孔的浓度平铺于96孔细胞培养板上，在37℃二氧化碳培养箱中培养过夜。次日，向培养板中加入2μL浓度为100μg/mL纯化气溶素，随后分别加入黄腐酚，使其终浓度达到0，2，4，8，16μg/mL；细胞继续置于二氧化碳培养箱中培养2h后取上清采用乳酸脱氢酶(LDH)释放试剂盒测定不同处理组LDH释放量。结果如附图4所示，黄腐酚可剂量依赖性的降低气溶素诱导的A549细胞LDH释放，当浓度在2μg/mL及以上时能显著抑制A549细胞LDH的释放。结果表明，黄腐酚能抑制气溶素引起的A549细胞损伤。
实施例6：
黄腐酚对鲫嗜水气单胞菌感染模型的治疗作用
本发明所涉及的嗜水气单胞菌XS-91-4-1菌株由长江水产研究所水产动物药理与药残控制技术实验室保存。试验在100cm×50cm×60cm的玻璃水族箱中进行，每天换水并保持水温在28±2℃左右。100g左右的健康鲫经麻醉后通过腹腔注射嗜水气单胞菌XS-91-4-1菌株建立人工感染模型。感染后2h开始对感染鲫灌服20mg/kg剂量的黄腐酚，每12h给药一次，连续给药3d，阳性对照组感染后灌服PBS作为对照。每个试验组使用鲫20尾，感染后即开始记录死亡情况，结果见附图5。该结果表明，鲫人工感染嗜水气单胞菌后在8d内死亡率达到80％；给予20mg/kg黄腐酚治疗的鲫发生了35％的死亡；经分析发现，黄腐酚治疗组的存活率显著高于阳性对照组。通过以上研究表明，当鲫感染嗜水气单胞菌后可通过给予20mg/kg剂量的黄腐酚进行治疗，且该药物能取得较好的治疗效果。
小结：
嗜水气单胞菌是淡水养殖中最常见的致病菌，能导致多种水产养殖动物发病和死亡，是池塘养殖的烈性病害。近年来研究发现，嗜水气单胞菌的致病力与气溶素密切相关，因此气溶素成为研究抗嗜水气单胞菌感染药物的新靶标。本发明通过实施例1和2发现，黄腐酚对嗜水气单胞菌XS-91-4-1菌株的生长几乎没有抑菌作用；但实施例3和4表明，黄腐酚可剂量依赖性的抑制嗜水气单胞菌气溶素的溶血活性；以上实施例结果表明，黄腐酚可通过在不抑制嗜水气单胞菌生长的浓度下抑制气溶素的活性。通过实施例5和6研究了黄腐酚对嗜水气单胞菌体内外致病力的抑制作用，结果发现黄腐酚可降低气溶素介导的A549细胞损伤；提高鲫嗜水气单胞菌感染模型的存活率。以上实施例表明，黄腐酚可通过抑制气溶素活性降低嗜水气单胞菌的致病力，是一种具有潜力的抗嗜水气单胞菌感染的天然化合物。结合以上实施例，黄腐酚降低气溶素活性的浓度远低于其最小抑菌浓度，因此不易诱导嗜水气单胞菌产生耐药性。
嗜水气单胞菌的宿主广泛，能感染鱼类、蛙类、虾类等多种淡水养殖生物，而气溶素是其标志性毒力因子，在致病性嗜水气单胞菌中具有广泛性。由此可推断，黄腐酚对嗜水气单胞菌引起的感染均具有治疗作用。
Claims (3)
1.黄腐酚在制备预防或治疗水产养殖动物嗜水气单胞菌感染药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于黄腐酚的给药剂量大于20mg/kg。
3.一种抗嗜水气单胞菌感染的水产饲料添加剂，其特征在于，所述的添加剂为黄腐酚。
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