CN109999027A

CN109999027A - 褪黑素的新用途

Info

Publication number: CN109999027A
Application number: CN201910404182.1A
Authority: CN
Inventors: 刘源; 王志强; 李瑞超; 肖霞; 贾瑜倩; 杨康妮
Original assignee: Yangzhou University
Current assignee: Yangzhou University
Priority date: 2019-05-15
Filing date: 2019-05-15
Publication date: 2019-07-12
Anticipated expiration: 2039-05-15
Also published as: CN109999027B

Abstract

本发明公开了褪黑素或其可接受的盐在制备细菌感染性疾病药物或制备抗生素增效剂中的应用。本发明还公开了组合物，所述组合物包括褪黑素或其可接受的盐和抗生素。本发明还公开了组合物在制备细菌感染性疾病的药物或抗生素增效剂中的应用。本发明具体阐明了褪黑素可以恢复耐药细菌对多种抗生素特别是多粘菌素的敏感性，并系统评价了其与抗生素联合使用在体内外的有效性，有助于开发出一类新型的抗生素增效剂，缓解危害日趋严重的MCR‑1介导的多粘菌素耐药问题。

Description

褪黑素的新用途

技术领域

本发明属于药物技术领域，具体涉及褪黑素的新用途。

背景技术

多粘菌素是于1947年发现的一类阳离子肽类抗生素，在20世纪70年代之前被广泛应用于治疗细菌性感染疾病。但是由于潜在的神经毒性和肾毒性，多粘菌素在临床中使用大量减少。然而，近年来多重耐药革兰氏阴性细菌的大量产生和传播，使得多粘菌素被重新启用并被认为是应对超级细菌，尤其是碳青霉素类抗生素耐药菌的最后一道防线。但是，多粘菌素在畜禽和水产养殖业中的大规模和不合理使用导致了细菌耐药性的产生和扩散。质粒介导的多黏菌素耐药基因mcr-1及其耐药突变体(mcr-2/3/4/5/6/7/8)的发现和鉴定显著的降低了其临床疗效，给人类和畜禽耐药细菌感染的预防和治疗带来巨大的挑战。尤其在畜禽养殖业中，针对MCR阳性肠杆菌科细菌已面临无药可用的局面。因此，迫切需要新型的策略去控制MCR介导的细菌耐药性，进而保障人类健康和畜禽养殖业的可持续发展。

一种有效的策略去延长现有抗生素使用寿命的策略是使用抗生素的增效剂。抗生素增效剂是指通过抑制细菌的耐药机制或与抗生素的互补杀菌机制，从而增强抗生素抗菌活性的一类化合物。最经典的抗生素增效剂是β-内酰胺酶的抑制剂，如克拉维酸。克拉维酸和β-内酰胺类抗生素的联合使用可以有效治疗产β-内酰胺酶耐药细菌引起的感染因此，本发明期望从FDA已批准使用的非抗菌用途化合物中筛选得到一种安全有效的抗生素增效剂去逆转MCR介导的多粘菌素耐药性。

褪黑素(N-乙酰基-5-甲氧基色胺，melatonin)是由哺乳动物松果体产生的一种胺类激素。近年来被发现可以作用于哺乳动物全身的多个器官组织和细胞，具有延缓衰老、增强免疫力、改善睡眠、调控生殖活动、抗击肿瘤及清除体内自由基等多种生理和药理作用。由于其众多的用途及安全性高等优点，褪黑素被美国FDA(食品药品监督管理局)和中国卫生部批准允许作为膳食补充剂和保健品使用。但其在细菌性疾病治疗领域的潜在应用在国内外还未见相关报道。本发明首次阐明了将褪黑素作为抗生素尤其是多粘菌素增效剂的潜在应用价值。

发明内容

发明目的：为了解决现有技术存在的问题，本发明通过棋盘肉汤稀释法从已批准上市且非抗菌用途的化合物中筛选抗生素特别是多粘菌素的增效剂，以恢复其对耐药细菌的抗菌活性。因此，本发明所要解决的技术问题是提供了褪黑素的新用途。本发明的褪黑素可以有效恢复和增强多种抗生素特别是多粘菌素的抗菌活性。

技术方案：为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案为：褪黑素或其可接受的盐在制备细菌感染性疾病药物或制备抗生素增效剂中的应用。

其中，所述细菌感染性疾病药物或抗生素增效剂为单组分或复方制剂。

本发明内容还包括一种组合物，所述组合物包括褪黑素或其可接受的盐和抗生素。

其中，所述抗生素包括但不仅限于氨苄西林、利福平、美罗培南、多西环素、环丙沙星和多粘菌素中的一种或几种。

其中，所述褪黑素或其可接受的盐和抗生素的质量比为1-1000∶1。

作为优选，所述褪黑素或其可接受的盐和抗生素的质量比为5-20∶1。

其中，所述褪黑素或其可接受的盐的浓度为0.12mg/mL～16mg/mL。

其中，所述抗生素的浓度为0.12μg/mL～32μg/mL。

本发明内容还包括所述的组合物在制备细菌感染性疾病的药物中的应用。

其中，所述细菌感染性疾病的药物或抗生素增效剂的剂型包括但不仅限于片剂、胶囊、缓释片、控释片、口服液、糖浆、滴丸、注射液剂型、冻干粉针剂型。

本发明还提供褪黑素和多粘菌素的组合物在生物体内或体外的协同抗菌的应用。所述的生物指畜禽，主要包括但不仅限于猪牛羊、鸡鸭鹅等常见畜禽。

本发明还提供褪黑素和多粘菌素的组合物在制备细菌感染性疾病的药物中的应用。

有益效果：与现有技术相比，本发明的优点是：

1)本发明首次发现褪黑素可以用于细菌感染性疾病中的治疗，属于褪黑素的新用途。

2)本发明具体阐明了褪黑素可以恢复耐药细菌对多种抗生素特别是多粘菌素的敏感性，并系统评价了其与抗生素联合使用在体内外的有效性，有助于开发出一类新型的抗生素增效剂，缓解危害日趋严重的MCR-1介导的多粘菌素耐药问题。

附图说明

图1、褪黑素与6种抗生素(氨苄西林、利福平、美罗培南、多西环素、环丙沙星和多粘菌素)对MCR-1阳性大肠杆菌的协同杀菌作用。

图2、多粘菌素和褪黑素联合使用的时间杀菌曲线；Colistin，多粘菌素(4μg/mL)；Melatonin，褪黑素(2mg/mL)；Colistin+Melatonin，多粘菌素(4μg/mL)+褪黑素(2mg/mL)；

图3、多粘菌素和褪黑素联合使用治疗大蜡螟幼虫耐药细菌感染。

具体实施方式

下面通过具体的实施例对本发明进一步说明，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干变型和改进，这些也应视为属于本发明的保护范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量实验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

MHB肉汤培养基为含牛肉粉1.5g/L、可溶性淀粉1.5g/L和酸水解酪蛋白17.5g/L的水溶液。

0.01mol/L磷酸盐缓冲液中(PBS)配制：称取8g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na₂HPO₄和0.24g KH₂PO₄，溶于800mL蒸馏水中，用HCl调节溶液的pH值后，加蒸馏水定容至1L。

褪黑素与抗生素母液的配置方法：

褪黑素母液(200mg/mL)：称取2.0g药物定容于10mL的DMSO中；

氨苄西林母液(5120μg/mL)：称取51.2mg药物定容于10mL 0.01mol/L磷酸盐缓冲液中(PBS，pH＝8)；

利福平母液(5120μg/mL)：称取51.2mg药物定容于10mL甲醇中；

美洛培南母液(5120μg/mL)：称取51.2mg药物定容于10mL 0.01mol/L磷酸盐缓冲液中(PBS，pH＝7.2)；

多西环素母液(5120μg/mL)：称取51.2mg药物定容于10mL无菌水中；

环丙沙星母液(5120μg/mL)：称取51.2mg药物定容于10mL无菌水中；

多粘菌素母液(5120μg/mL)：称取51.2mg药物定容于10mL无菌水中；

以上母液配制好后，过0.22μM滤膜并分装于2mL离心管中(每管1mL)。所有母液冻存于-20℃冰箱中，备用。

实施例1褪黑素与抗生素的组合物

组合物1：按照褪黑素与抗生素母液配制组合物1，其中，褪黑素终浓度为0.12mg/mL、多粘菌素终浓度为0.12μg/mL；即褪黑素与多粘菌素的质量比为1000∶1；

组合物2：按照褪黑素与抗生素母液配制组合物2，其中，褪黑素终浓度为0.25mg/mL、氨苄西林终浓度为0.5μg/mL；

组合物3：按照褪黑素与抗生素母液配制组合物3，其中，褪黑素终浓度为0.25mg/mL、利福平终浓度为0.5μg/mL；

组合物4：按照褪黑素与抗生素母液配制组合物4，其中，褪黑素终浓度为0.25mg/mL、美洛培南终浓度为0.5μg/mL；

组合物5：按照褪黑素与抗生素母液配制组合物5，其中，褪黑素终浓度为0.12mg/mL、多西环素终浓度为0.5μg/mL；

组合物6：按照褪黑素与抗生素母液配制组合物6，其中，褪黑素终浓度为0.12mg/mL、环丙沙星终浓度为0.25μg/mL。

实施例2褪黑素与抗生素的组合物

组合物1：按照褪黑素与抗生素母液配制组合物1，其中，褪黑素终浓度为0.12mg/mL、多粘菌素终浓度为8μg/mL；

组合物2：按照褪黑素与抗生素母液配制组合物2，其中，褪黑素终浓度为16mg/mL、氨苄西林终浓度为32μg/mL；

组合物3：按照褪黑素与抗生素母液配制组合物3，其中，褪黑素终浓度为16mg/mL、利福平终浓度为32μg/mL；

组合物4：按照褪黑素与抗生素母液配制组合物4，其中，褪黑素终浓度为16mg/mL、美洛培南终浓度为32μg/mL；

组合物5：按照褪黑素与抗生素母液配制组合物5，其中，褪黑素终浓度为8mg/mL、多西环素终浓度为32μg/mL；

组合物6：按照褪黑素与抗生素母液配制组合物6，其中，褪黑素终浓度为8mg/mL、环丙沙星终浓度为16μg/mL。

实施例3褪黑素与抗生素的组合物

组合物1：按照褪黑素与抗生素母液配制组合物1，其中，褪黑素终浓度为2mg/mL、多粘菌素终浓度为4μg/mL；

组合物2：按照褪黑素与抗生素母液配制组合物2，其中，褪黑素终浓度为8mg/mL、氨苄西林终浓度为8μg/mL；

组合物3：按照褪黑素与抗生素母液配制组合物3，其中，褪黑素终浓度为8mg/mL、利福平终浓度为8μg/mL；

组合物4：按照褪黑素与抗生素母液配制组合物4，其中，褪黑素终浓度为8mg/mL、美洛培南终浓度为8μg/mL；

组合物5：按照褪黑素与抗生素母液配制组合物5，其中，褪黑素终浓度为8mg/mL、多西环素终浓度为8μg/mL；

组合物6：按照褪黑素与抗生素母液配制组合物6，其中，褪黑素终浓度为8mg/mL、环丙沙星终浓度为8μg/mL。

实施例4褪黑素与抗生素的组合物

组合物1：按照褪黑素与抗生素母液配制组合物1，其中，褪黑素终浓度为0.12mg/mL、多粘菌素终浓度为24μg/mL；

组合物2：按照褪黑素与抗生素母液配制组合物2，其中，褪黑素终浓度为16mg/mL、氨苄西林终浓度为4μg/mL；

组合物3：按照褪黑素与抗生素母液配制组合物3，其中，褪黑素终浓度为16mg/mL、利福平终浓度为4μg/mL；

组合物4：按照褪黑素与抗生素母液配制组合物4，其中，褪黑素终浓度为16mg/mL、美洛培南终浓度为4μg/mL；

组合物5：按照褪黑素与抗生素母液配制组合物5，其中，褪黑素终浓度为16mg/mL、多西环素终浓度为4μg/mL；

组合物6：按照褪黑素与抗生素母液配制组合物6，其中，褪黑素终浓度为4mg/mL、环丙沙星终浓度为8μg/mL。

实施例5：褪黑素与抗生素的协同杀菌作用

采用棋盘分析法测定褪黑素和不同类别抗生素对耐药细菌的协同抗菌活性，测试菌株为一株临床自行分离得到的MCR-1阳性大肠杆菌E.coli(mcr-1)(该菌株来源于Liu YY，Wang Y，Walsh T R，et a1.Emergence of plasmid-mediated colistin resistancemechanism MCR-1 in animals and human beings in China：a microbiological andmolecular biological study.The Lancet infectious diseases，2016，16(2)：161-168.)。

棋盘分析法具体步骤如下：

1)用MHB肉汤培养基悬浮测试菌株，得到菌浓度为1×10⁸CFU/mL的菌悬液。

2)取褪黑素母液，用MHB肉汤培养基稀释后，得到浓度为128mg/mL的褪黑素溶液。

3)分别取抗生素母液，用MHB肉汤培养基稀释后，得到浓度为128μg/mL的抗菌药物溶液。

4)取96孔板，每孔加入100μL MHB肉汤培养基，最后一行每孔加入100μL步骤2)制备的六种抗生素溶液，自第八行倍比稀释至第二行；第一列每孔加入步骤3)制备的抗菌药物溶液(每孔100μL)，倍比稀释至第十列，之后每孔加入100μL步骤1)制备的菌悬液，37℃静置培养16h-20h后，测定每个培养孔的OD₆₀₀(600nm的吸光值)，绘制细菌量热图。并计算两者联合使用的分级抑菌浓度(FIC指数)。

分级抑菌浓度FIC指数按照以下公式进行计算：

FIC＝MIC(A联合应用)/MIC(A单用)+MIC(B联合应用)/MIC(B单用)

FIC指数判读标准：当FIC指数小于0.5时，两种药为协同作用；当FIC指数为0.5～1时，两种药为相加作用；当FIC指数大于1且小于2时，两种药为无关作用；当FIC指数大于2时，两种药为拮抗作用。

试验结果见图1和表1。结果表明褪黑素可以显著增强多西环素、环丙沙星和多粘菌素对MCR-1阳性大肠杆菌的抗菌活性，增效的倍数为16-64倍；联合使用的分级抑菌浓度指数(FIC index)小于0.5，表明褪黑素和这三种抗生素联合使用具有显著的协同作用。而对氨苄西林、利福平和美罗培南三种抗生素不具有协同杀菌作用(FIC＝2)。

表1褪黑素增强抗生素对MCR-1阳性大肠杆菌的抗菌活性。

^a多粘菌素单独使用时对耐药菌的最小抑菌浓度；^b加入褪黑素后多粘菌素对耐药菌的最小抑菌浓度；^c多粘菌素的抗菌活性提高倍数。

实施例6：多粘菌素与褪黑素的时间杀菌曲线

大肠杆菌E.coli(mcr-1)过夜培养后，按照1/100的稀释倍数加入1mL新鲜的MHB肉汤培养基中。于37℃，200rpm的摇床中生长2h(指数生长期)或5h(稳定期)后，加入20μL0.01mol/L PBS(pH＝7.2)、多粘菌素(200μg/mL)、褪黑素(100mg/mL)和两者混合液(10μL400μg/mL多粘菌素+10μL 200mg/mL褪黑素)，使得药物终浓度为多粘菌素(4μg/mL)、褪黑素(2mg/mL)和混合浓度(4μg/mL多粘菌素+2mg/mL褪黑素)。而后，分别于加药后0h、6h、12h和24h取菌液100μL涂布于MHA培养基上，37度培养过夜后进行菌落计数。

实验结果见图2。结果表明，与多粘菌素相比，两者联合使用对指数生长期和稳定期细菌都具有显著的杀菌作用，细菌数降低了超过2log₁₀CFU/mL。

实施例7：多粘菌素与褪黑素联合使用治疗大蜡螟幼虫细菌感染

多粘菌素溶液：将3mg多粘菌素溶于1mL无菌水后，加入适量无菌水定容到10mL得到。

褪黑素溶液：将15mg褪黑素溶于1mL DMSO后，加入适量无菌水定容到10mL得到。

混合溶液：将3mg多粘菌素和15mg褪黑素溶于1mL DMSO后，加入适量无菌水定容到10mL得到。

大肠杆菌悬浮液：用PBS缓冲液重悬大肠杆菌(Escherichia coli)MCR-1，得到大肠杆菌悬浮液；该大肠杆菌悬浮液中，大肠杆菌(Escherichia coli)MCR-1的浓度为1.0×10⁸CFU/mL。

1、大蜡螟幼虫分组处理

取40只体重为300mg的大蜡螟幼虫，随机分成PBS组、多粘菌素治疗组、褪黑素治疗组和协同治疗组(每组10只)，分别进行如下处理：

PBS组：大蜡螟幼虫左下第二腹足注射10μL大肠杆菌悬浮液；1h后右下第二腹足注射10μL PBS缓冲液；

多粘菌素治疗组：大蜡螟幼虫左下第二腹足注射10μL大肠杆菌悬浮液；1h后右下第二腹足注射10μL多粘菌素溶液；

褪黑素治疗组：大蜡螟幼虫左下第二腹足注射10μL大肠杆菌悬浮液；1h后右下第二腹足注射10μL褪黑素溶液；

协同治疗组：大蜡螟幼虫左下第二腹足注射10μL大肠杆菌悬浮液；1h后右下第二腹足注射10μL混合溶液。

2、统计存活率

分别于完成步骤1后第1天、第2天和第3天，统计大蜡螟幼虫的存活率。

实验结果见图3。结果表明，PBS组和褪黑素单独给药组24小时内大蜡螟幼虫的死亡率为100％；多粘菌素单独给药组的大蜡暝幼虫在48小时内全部死亡；而两者协同治疗组的大蜡螟幼虫存活率显著提高，72小时后大蜡螟幼虫存活率可达到70％，显著高于多粘菌素单独给药组(P＝0.002)。

上述仅为本发明优选的实施例，并不限制于本发明。对于所属领域的技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其他不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施例来举例说明。而由此方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之内。

Claims

1.褪黑素或其可接受的盐在制备细菌感染性疾病药物或制备抗生素增效剂中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述细菌感染性疾病药物或抗生素增效剂为单组分或复方制剂。

3.一种组合物，其特征在于，所述组合物包括褪黑素或其可接受的盐和抗生素。

4.根据权利要求3所述的组合物，其特征在于，所述抗生素为氨苄西林、利福平、美罗培南、多西环素、环丙沙星和多粘菌素中的一种或几种。

5.根据权利要求3所述的组合物，其特征在于，所述褪黑素或其可接受的盐和抗生素的质量比为1~1000:1。

6.根据权利要求3所述的组合物，其特征在于，所述褪黑素或其可接受的盐的浓度为0.12 mg/mL~ 16mg/mL。

7.根据权利要求3所述的组合物，其特征在于，所述抗生素的浓度为0.12μg/mL ~ 32μg/mL。

8.权利要求3~6任一项所述的组合物在制备细菌感染性疾病的药物或抗生素增效剂中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述细菌感染性疾病的药物或抗生素增效剂的剂型为片剂、胶囊、缓释片、控释片、口服液、糖浆、滴丸、注射液剂型、冻干粉针剂型。