CN116392478A - 脱水穿心莲内酯协同增效多黏菌素在制备抗革兰氏阴性菌感染药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了脱水穿心莲内酯协同增效多黏菌素在制备抗革兰氏阴性菌感染药物中的应用。所述革兰氏阴性菌包括大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌和沙门氏菌。本发明还公开了脱水穿心莲内酯和抗生素多黏菌素E的抗菌组合配比和治疗动物感染的最佳配比，本发明为临床治疗细菌感染性疾病提供了新的治疗策略。
Description
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及脱水穿心莲内酯协同增效多黏菌素在制备抗革兰氏阴性菌感染药物中的应用。
背景技术
细菌耐药性问题已经成为一个全球性公共卫生问题，遏制细菌耐药性已经迫在眉睫。特别是近年来人类医学和动物临床由于耐碳青霉烯类革兰氏阴性菌的快速传播，导致临床可用的抗生素越来越少。尤其是一些多重耐药革兰阴性菌的出现，导致临床近乎无药可用，并造成一系列的公共卫生安全问题。近年来，国家各部门都对畜禽养殖业的健康可持续发展相当关注，我国近期出台了《遏制细菌耐药国家行动计划(2016-2020年)》、《全国遏制动物源细菌耐药行动计划(2017-2020年)》等一系列的政策和“行动计划”来遏制细菌耐药性的发展。
多黏菌素(又称多粘菌素，polymyxin)类抗菌药物包含多黏菌素A、B、C、D、E等五种。其中，多黏菌素B和E应用于临床，对革兰氏阴性细菌作用较强，如大肠杆菌、肺炎杆菌、绿脓杆菌等。其中，多黏菌素E，又称为黏菌素，CAS号:1066-17-7，商品名抗敌素、可立斯丁、粘菌素。临床应用主要是硫酸盐或甲磺酸盐形式，即硫酸多黏菌素E和甲磺酸盐多黏菌素E。目前，多黏菌素E被认为是临床治疗耐碳青霉烯类大肠杆菌、多重耐药铜绿假单胞菌及多重耐药肺炎克雷伯等感染的最重要的抗菌药物之一。近年来大肠杆菌等致病菌携带多黏菌素耐药基因(MCR)质粒的出现和传播，导致部分革兰氏阴性菌对多黏菌素产生耐药。这些因素严重限制了多黏菌素在临床上的应用。因此，开发有效的多黏菌素增效剂，开发多黏菌素复方制剂，已经成为临床治疗多重耐药革兰阴性杆菌感染的重要策略。之前已有研究报道，黏菌素和万古霉素联合使用具有明显的协同抗菌作用(Antimicrob AgentsChemother.2010Dec；54(12):5316-22.)，但临床治疗试验证实二者联合用药并没有发挥明显的优势，反而可能增加肾毒性影响(Pharmaceutics.2021Jan 26；13(2):162)。因而，我们仍需寻找新的有效联合治疗策略。
脱水穿心莲内酯，CAS号为134418-28-3，分子式C20H28O4，分子量为332.43。脱水穿心莲内酯是植物穿心莲提取物的主要活性物质之一，具有明显的抗炎解热作用。脱水穿心莲内酯能抑制炎症时毛细血管通透性的增高和炎性水肿的发展，并能减少炎性渗出量，但对增生性炎症则无明显影响。《中国药典》2020年版本已经批准穿心莲胶囊用于清热解毒，凉血消肿等治疗用途。
目前，虽然现有技术已经公开了黏菌素联合其它抗菌药物，但大多数成药性很差，本发明不仅提供了脱水穿心莲内酯和多黏菌素联合使用的体外协同增效实验，还进一步提供动物水平实验证实其较好的协同杀菌效果。至今尚无研究报道关于脱水穿心莲内酯作为多黏菌素增效剂在增强多黏菌素抗菌活性中及联合治疗中的应用。
发明内容
本发明的一个目的是提供脱水穿心莲内酯的药物新用途。
本发明所提供的脱水穿心莲内酯的药物新用途是其在制备多黏菌素类抗菌药物抗细菌感染增效剂中的应用，即在制备增强多黏菌素类抗菌药物抗细菌活性的产品中的应用。
所述产品为人用药品、兽药、禽药等。
进一步地，所述多黏菌素类抗菌药物为多黏菌素E(即黏菌素)或其药学上可接受的盐(如硫酸多黏菌素E(硫酸黏菌素)、甲磺酸盐多黏菌素E)或多黏菌素B或其药学上可接受的盐(如硫酸多黏菌素B)。
进一步地，所述脱水穿心莲内酯为脱水穿心莲内酯。
进一步地，所述细菌包含含有多黏菌素耐药基因(MCR)的细菌。
进一步地，所述细菌为革兰氏阴性杆菌。
进一步地，所述革兰氏阴性杆菌包含多重耐药革兰阴性杆菌。
进一步地，所述细菌为大肠杆菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌和沙门氏菌中的一种或多种；优选地，所述大肠杆菌、肺炎克雷伯、沙门氏菌中的一种或多种为存在多黏菌素耐药基因(MCR)的或多重耐药的菌株。
进一步地，所述细菌为肺炎克雷伯菌；优选地，所述细菌为存在多黏菌素耐药基因(MCR)的或多重耐药的肺炎克雷伯菌。
本发明的另一个目的是提供一种抗细菌感染组合物。
本发明所提供的抗细菌感染组合物，包括脱水穿心莲内酯和多黏菌素类抗菌药物，
进一步的，所述多黏菌素类抗菌药物与脱水穿心莲内酯的质量比为1:40-640；具体如1:40-160、1:40-320、1:160-320、1:320-640、1:160-640、1:40、1:160、1:320、1：640。
上述抗细菌感染组合物中，所述抗细菌感染的组合物的活性成分可以仅为脱水穿心莲内酯和所述多黏菌素类抗菌药物；也可以进一步包括其它活性成分，其它活性成分的选择本领域技术人员可根据抗菌效果确定。
上述组合物可对细菌具有杀灭和/或抑制作用；
所述细菌包含含有多黏菌素耐药基因(MCR)的细菌。
进一步地，所述细菌为革兰氏阴性杆菌。
进一步地，所述革兰氏阴性杆菌包含多重耐药革兰阴性杆菌。
进一步地，所述细菌为大肠杆菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌和沙门氏菌中的一种或多种；优选地，所述大肠杆菌、肺炎克雷伯、沙门氏菌中的一种或多种为存在多黏菌素耐药基因(MCR)的或多重耐药的菌株。
进一步地，所述细菌为肺炎克雷伯菌；优选地，所述细菌为存在多黏菌素耐药基因(MCR)的或多重耐药的肺炎克雷伯菌。
所述抗细菌感染组合物剂型为片剂、胶囊、缓释片、控释片、口服液、糖浆、注射液剂型、滴丸、冻干粉针剂型中的一种。
此外，含有上述抗细菌感染组合物的抗细菌产品也属于本发明的保护范围。
所述抗细菌产品的剂型为片剂、胶囊、缓释片、控释片、口服液、糖浆、注射液剂型、滴丸、冻干粉针剂型中的一种。
其中，所述多黏菌素类抗菌药物和所述脱水穿心莲内酯的最终治疗剂量分别为1mg/kg和20mg/kg体重。
为了解决多重耐药革兰阴性细菌耐药及缺乏有效药物的问题，本发明提供了一种增强多黏菌素抗菌活性及其联合治疗的方法，具体采用脱水穿心莲内酯联用多黏菌素，多黏菌素优选多黏菌素E，二者不是简单的功能相加，而是达到协同抗菌作用。本发明还公开了脱水穿心莲内酯和多黏菌素E的抗菌组合配比，为临床治疗细菌感染，特别是多重耐药革兰氏阴性细菌感染，具体如存在多黏菌素耐药基因(MCR)的细菌感染提供了新的治疗策略。
本发明通过棋盘法最小抑菌浓度试验、体外杀菌曲线证明脱水穿心莲内酯协同增效多黏菌素的抗菌活性。区别于已有的多黏菌素与抗生素联用，本发明给出了小鼠耐药细菌感染模型实验，在动物水平证实了脱水穿心莲内酯可以有效增强多黏菌素以及在体内的有效性，对下一步临床应用更有证明力。本发明阐明了脱水穿心莲内酯可以恢复耐多黏菌素细菌的敏感性，并进一步评价了两者联合使用在体内外的有效性，有助于开发出一类新型复方制剂，提高治疗治疗效果，克服多重耐药革兰阴性感染问题。
附图说明
图1为本发明实施例3中脱水穿心莲内酯联合多黏菌素E对大肠杆菌E.coli B2的时间杀菌曲线。
图2为本发明实施例3中脱水穿心莲内酯联合多黏菌素E对大肠杆菌ATCC25922的时间杀菌曲线。
图3为本发明实施例4中多黏菌素E、脱水穿心莲内酯单独及联合使用对多重耐药菌致小鼠腹泻的治疗效果。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中采用的脱水穿心莲内酯，CAS号为134418-28-3，分子式C20H28O4，分子量为332.43，购买于阿拉丁试剂公司，纯度≥98％。
硫酸黏菌素购买自阿拉丁试剂公司，货号C114323，活性>19000U/mg。
硫酸多黏菌素B购自阿拉丁试剂公司，效价大于等于6000U/mg。
称取一定量的硫酸黏菌素或硫酸多黏菌素B配置成母液浓度为16mg/mL。脱水穿心莲内酯使用DMSO配置成母液浓度40mg/mL浓度的母液。制备好后储存在-20度冰箱。
大肠杆菌标准菌株为大肠杆菌(Escherichia coli)ATCC 25922(以下简称E.coli25922)购自中国兽医监察所菌种保存中心(中国兽医微生物菌种保藏管理中心)；
大肠杆菌B2(E.coli B2)携带黏菌素耐药基因1(MCR-1)质粒和新德里金属－β－内酰胺酶5(NDM-5)质粒,具体信息已在下列文献中记载：Song M,LiuY,Huang X,Ding S,Wang Y,Shen J,Zhu K.A broad-spectrum antibiotic adjuvant reverses multidrug-resistant Gram-negative pathogens.Nat Microbiol.2020Aug；5(8):1040-1050.
肺炎克雷伯菌K.pneumoniae1202(ST11,KPC-2-producer)+pHNSHP45(mcr-1)具体信息已在下列文献中记载：LiuYY,WangY,Walsh TR,Yi LX,Zhang R,Spencer J,Doi Y,Tian G,Dong B,Huang X,Yu LF,Gu D,Ren H,Chen X,Lv L,He D,Zhou H,Liang Z,LiuJH,Shen J.Emergence of plasmid-mediated colistin resistance mechanism MCR-1inanimals and human beings in China:a microbiological and molecular biologicalstudy.Lancet Infect Dis.2016Feb；16(2):161-8。该菌株携因带MCR-1质粒，耐多黏菌素。
铜绿假单胞菌标准菌株ATCC15692(即铜绿假单胞菌PA01)购买自美国典型培养物保藏中心(ATCC)。
沙门氏菌SH16SF0764(Salmonella SH16SF0764)，分离自临床，携带MCR-1质粒，由中国农业大学国家兽药安全评价中心提供。
鲍曼不动杆菌标准菌株ATCC 19606购买自美国典型培养物保藏中心(ATCC)。
大肠杆菌E.coli09b19、E.coli13h1、E.coli GZP080-8记载于下列文献：Lu Yang,Yingbo Shen,Junyao Jiang,Xueyang Wang,Dongyan Shao,Margaret M.C.Lam,KathrynE.Holt,Bing Shao,Congming Wu,Jianzhong Shen,Timothy R.Walsh,Stefan Schwarz,Yang Wang&Zhangqi Shen,Distinct increase in antimicrobial resistance genesamong Escherichia coli during 50years of antimicrobial use in livestockproduction in China,Nature Food，2022,3：197–205；均携带MCR-1质粒，耐多黏菌素。
下述试验中使用细菌培养基：
MHB肉汤培养基购自北京陆桥技术股份有限公司，配制方法如下：称取25.0g于1L蒸馏水中，加热煮沸至完全溶解，121℃高压灭菌15min，备用。
MHA培养基购自北京陆桥技术股份有限公司，配制方法如下：称取38.0g于1L蒸馏水中，加热煮沸至完全溶解，121℃高压灭菌15min，冷至55℃倾注平板备用。
脑心浸液培养基(BHI)购自北京陆桥技术股份有限公司，配制方法如下：称取本品38.5g，加热搅拌溶解于1000mL蒸馏水中，调节pH至7.3，121℃高压灭菌15分钟，备用。
BHI固体培养基购自北京路桥技术股份有限公司，配制方法如下：称取本品50.0g于1000mL蒸馏水中，加热煮沸至完全溶解，121℃高压灭菌20min，冷却至55℃倾注平板备用。
实施例1、脱水穿心莲内酯、多黏菌素B和多黏菌素E最小抑菌浓度评价
(1)脱水穿心莲内酯、多黏菌素B和多黏菌素E单独用药的抗菌活性最低抑菌浓度(MIC)的测定
按照美国临床和实验室标准协会(Clinical and Laboratory StandardsInstitute,CLSI)的标准方法检测不同菌株对脱水穿心莲内酯、多黏菌素B和多黏菌素E的最小抑菌浓度(MIC)。具体操作如下：挑取细菌单菌落于BHI肉汤中，在37℃摇床培养细菌至对数生长期，用麦氏比浊仪调节菌液浓度至0.5麦氏浊度待用。用MHB培养基分别将脱水穿心莲内酯、多黏菌素B和多黏菌素E倍比稀释多个浓度梯度。取100μL菌液(每孔菌液终浓度为1.0x106 CFUs/mL)加入96孔U型板中，随后每孔加入不同药物。脱水穿心莲内酯药物终浓度依次为500μg/mL、250μg/mL、125μg/mL和62.5μg/mL；多黏菌素B和多黏菌素E的最终药物浓度均设置为16μg/mL、8μg/mL、4μg/mL、2μg/mL、1μg/mL、0.5μg/mL、0.25μg/mL、0.125μg/mL、0.0625μg/mL。阴性对照组为只含有MHB培养基；阳性对照组为含有100μL的待测菌液，同时每孔加入1μLDMSO。加药后培养板放置37℃培养箱中恒温培养18h后观察结果，96孔板中，肉眼澄清的孔的所含药物浓度即为最低抑菌浓度(Minimal Inhibitory Concentration，MIC)。试验结果见表1。
表1脱水穿心莲内酯、多黏菌素E、多黏菌素B对各菌的MIC值(μg/mL)
由表1可知，脱水穿心莲内酯对所测试菌株E.coli 25922、E.coli B2、ATCC15692、K.pneumoniae1202(ST11,KPC-2-producer)+pHNSHP45(mcr-1)、E.coli 09b19、E.coli13h1、E.coli GZP080-8、ATCC 19606、Salmonella SH16SF0764等革兰氏阴性菌的抗菌活性菌均大于所测最大浓度，即＞500μg/mL；多黏菌素E对上述革兰氏阴性菌的MIC分别为0.25μg/mL、8μg/mL、1μg/mL、8μg/mL、4μg/mL、8μg/mL、8μg/mL、0.5μg/mL、8μg/mL；多黏菌素B对上述革兰氏阴性菌的MIC分别为0.25μg/mL、8μg/mL、1μg/mL、8μg/mL、4μg/mL、4μg/mL、4μg/mL、0.5μg/mL、8μg/mL。
实施例2、脱水穿心莲内酯和抗菌药物多黏菌素联合应用抑菌活性试验
脱水穿心莲内酯和抗菌药物多黏菌素联合应用对病原菌的联合用药指数(FICI)测定：使用棋盘法测定脱水穿心莲内酯与抗菌药物联合应用对E.coli 25922、E.coli B2、ATCC15692、K.pneumoniae1202(ST11,KPC-2-producer)+pHNSHP45(mcr-1)、E.coli09b19、E.coli 13h1、E.coli GZP080-8、ATCC 19606、Salmonella SH16SF0764等菌株的FICI值。具体操作如下：
抗菌药物多黏菌素E(作为甲药)和脱水穿心莲内酯(作为乙药)分别以各自的2MIC为最高浓度，使用MHB肉汤培养基倍比稀释成8-11个浓度，分别沿96微孔培养板横轴、纵轴加入含有不同浓度两药的MHB肉汤培养基50μL，然后分别加入各种病原菌菌液50μL，使最终每孔细菌数为1×106CFU，37℃恒温培养18～24h，观察结果。记录两药分别单用和联用时各自的MIC，按下述公式计算FICI值(部分抑菌浓度指数)。
FICI＝MIC甲药联合/MIC甲药单用+MIC乙药联合/MIC乙药单用
判断标准：FICI≤0.5，协同作用；0.5＜FICI≤1，相加作用；1﹤FICI≤2，无关作用；FICI＞2，拮抗作用。即：脱水穿心莲内酯和多黏菌素E的FICI＝MIC(多黏菌素E联合)/MIC(多黏菌素E单用)+MIC(脱水穿心莲内酯联合)/MIC(脱水穿心莲内酯单用)。实验结果见表2。
表2脱水穿心莲内酯与抗菌药物联合应用对大肠杆菌标准菌株E.coli25922、E.coliB2、ATCC15692、K.pneumoniae1202(ST11,KPC-2-producer)+pHNSHP45(mcr-1)、E.coli09b19、E.coli 13h1、E.coliGZP08-8、ATCC 19606、Salmonella SH16SF0764等菌株的FICI值
由表2可知：体外MIC测定结果显示，脱水穿心莲内酯单独用药对上述革兰氏阴性菌的MIC均大于最大测试浓度，即>500μg/mL。脱水穿心莲内酯与多黏菌素E联用能够提高多黏菌素的抗菌活力：
针对大肠杆菌标准菌株ATCC25922，多黏菌素E和脱水穿心莲内酯联合应用时，在脱水穿心莲内酯浓度为40μg/mL，多黏菌素E浓度为0.0625μg/mL，二者发挥最大协同作用，FICI为0.33，判定为协同作用。即，多黏菌素E与脱水穿心莲内酯的质量比为1:640，两者的协同增效效果最好。
针对K.pneumoniae1202(ST11,KPC-2-producer)+pHNSHP45(mcr-1)菌株，多黏菌素E和脱水穿心莲内酯联合应用时，在脱水穿心莲内酯浓度为20μg/mL，多黏菌素E浓度为0.5μg/mL，二者发挥最大协同作用，FICI为0.1025，判定为协同作用。即，多黏菌素E与脱水穿心莲内酯的质量比为1:40，两者的协同增效效果最好。
针对ATCC15692菌株，多黏菌素E和脱水穿心莲内酯联合应用时，在脱水穿心莲内酯浓度为40μg/mL，多黏菌素E浓度为0.25μg/mL，二者发挥最大协同作用，FICI为0.33，判定为协同作用。即，多黏菌素E与脱水穿心莲内酯的质量比为1:160，两者的协同增效效果最好。
针对临床大肠杆菌E.coli B2菌株，多黏菌素E和脱水穿心莲内酯联合应用时，在脱水穿心莲内酯浓度为20μg/mL，多黏菌素E浓度为0.5μg/mL，二者发挥最大协同作用，FICI为0.1025，判定为协同作用。即，多黏菌素E与脱水穿心莲内酯的质量比为1:40，两者的协同增效效果最好。
针对临床大肠杆菌E.coli 09b19菌株，多黏菌素E和脱水穿心莲内酯联合应用时，在脱水穿心莲内酯浓度为40μg/mL，多黏菌素E浓度为0.25μg/mL，二者发挥最大协同作用，FICI为0.205，判定为协同作用。即，多黏菌素E与脱水穿心莲内酯的质量比为1:160，两者的协同增效效果最好。
针对临床大肠杆菌E.coli 13h1菌株，多黏菌素E和脱水穿心莲内酯联合应用时，在脱水穿心莲内酯浓度为40μg/mL，多黏菌素E浓度为0.25μg/mL，二者发挥最大协同作用，FICI为0.142，判定为协同作用。即，多黏菌素E与脱水穿心莲内酯的质量比为1:160，两者的协同增效效果最好。
针对临床大肠杆菌E.coli GZP08-8菌株，多黏菌素E和脱水穿心莲内酯联合应用时，在脱水穿心莲内酯浓度为20μg/mL，多黏菌素E浓度为0.5μg/mL，二者发挥最大协同作用，FICI为0.1025，判定为协同作用。即，多黏菌素E与脱水穿心莲内酯的质量比为1:40，两者的协同增效效果最好。
针对ATCC 19606菌株，多黏菌素E和脱水穿心莲内酯联合应用时，在脱水穿心莲内酯浓度为20μg/mL，多黏菌素E浓度为0.0625μg/mL，二者发挥最大协同作用，FICI为0.165，判定为协同作用。即，多黏菌素E与脱水穿心莲内酯的质量比为1:320，两者的协同增效效果最好。
针对临床Salmonella SH16SF0764菌株，多黏菌素E和脱水穿心莲内酯联合应用时，在脱水穿心莲内酯浓度为20μg/mL，多黏菌素E浓度为1μg/mL，二者发挥最大协同作用，FICI为0.165，判定为协同作用。即，多黏菌素E与脱水穿心莲内酯的质量比为1:20，两者的协同增效效果最好。
综上，脱水穿心莲内酯在20-40μg/mL添加时显著增效多黏菌素E的抗菌活性。
实施例3、多黏菌素联合脱水穿心莲内酯联合使用的协同杀菌曲线
2.1试验材料
脱水穿心莲内酯和多黏菌素E购买同实施例1。
2.2体外杀菌曲线试验
分别在EcoliB2、ATCC25922于BHI肉汤中培养6小时后加入等体积的DMSO(终浓度为0.1％)、多黏菌素E、脱水穿心莲内酯、多黏菌素E和脱水穿心莲内酯混合液。
(1)针对EcoliB2菌株，分组和剂量如下：
对照组：0.1％的DMSO；
多黏菌素E组：硫酸多黏菌素E终浓度为4μg/mL；
脱水穿心莲内酯组：脱水穿心莲内酯终浓度为40μg/mL；
脱水穿心莲内酯和多黏菌素E联合组：脱水穿心莲内酯终浓度为40μg/mL，硫酸多黏菌素E终浓度为4μg/mL。
然后分别于1h、3h、6h、12h和24h取100μL菌液涂布于直径为10cm的MHA琼脂培养板上，培养过夜后进行菌落计数。
(2)针对大肠杆菌ATCC25922菌，分组和剂量如下：
对照组：0.1％的DMSO；
多黏菌素E组：硫酸多黏菌素E终浓度为0.25μg/mL；
脱水穿心莲内酯组：脱水穿心莲内酯终浓度为40μg/mL；
脱水穿心莲内酯和多黏菌素E联合组：脱水穿心莲内酯终浓度为40μg/mL，硫酸多黏菌素E终浓度为0.25μg/mL。
然后分别于1h、3h、6h、12h和24h取100μL菌液涂布于直径为10cm的MHA琼脂培养板上，培养过夜后进行菌落计数。
2.3试验结果
如图1所示，针对E.coli B2菌株，在第24h，与对照组相比，多黏菌素E和脱水穿心莲内酯单独处理对细菌菌落数没有显著影响。当脱水穿心莲内酯和多黏菌素E联合处理时，在处理第3h时，菌落数为2.41Log10 CFU/mL，直至第24h，菌落数均为1.32Log10 CFU/mL。
如图2所示，针对ATCC25922菌株，与对照组相比，在第24h，多黏菌素E处理组，菌落数降低至5.82Log10CFU/mL，脱水穿心莲内酯对细菌菌落数没有显著影响。当脱水穿心莲内酯和多黏菌素E联合处理时，在第1h、3h、6h、12h、24h时，菌落数降低至3.6Log10CFU/mL、2.4Log10CFU/mL、1.8Log10CFU/mL、1.2Log10CFU/mL、0.3Log10CFU/mL。
实施例4、多黏菌素E联合脱水穿心莲内酯对小鼠创伤感染细菌清除率的治疗效果
雄性BALB/c小鼠，体重18～20g，购买自北京维通利华有限公司。小鼠饲养于中国农业大学动物医学院国家兽药安全中心实验动物房，室温(25±2℃，相对湿度50±10％，采用常规光照，昼：夜＝12h:12h，饲喂常规小鼠维持颗粒饲料。正式试验前小鼠在动物房适应性饲养1周。所有动物实验全部经过中国农业大学动物伦理道德委员会批准。
56只小鼠，随机平均分为7组，每组8只，分别设为空白对照组(生理盐水)、感染模型组(注射生理盐水)、多黏菌素E单独治疗组(腹腔注射1mg/kg)、脱水穿心莲内酯20mg/kg单独治疗组(腹腔注射脱水穿心莲内酯20mg/kg)、多黏菌素E联合脱水穿心莲内酯联合治疗组(腹腔注射硫酸黏菌素E1mg/kg+脱水穿心莲内酯20mg/kg)。感染模型和各治疗组每只小鼠接种量为2×109CFU的大肠杆菌E.coli B2，感染后，分别于感染后第2小时和第24小时各治疗一次，最后一次治疗3小时后检测腹泻指数。统计各组小鼠的稀便次数、总便次数、稀便大小，计算出稀便率、稀便级和腹泻指数。稀便级：稀便的程度，以稀便污染滤纸形成污迹面积的大小分为4级。直径＜1cm为1级，1～＜2cm为2级，2～＜3cm为3级，≥3cm为4级。污迹为较规则圆形者测其直径，不规则形状则测量其最长和近似圆的直径的平均数。计算公式如下：
稀便率＝稀便次数/总便次数×100％；
平均稀便级＝稀便级数之和/稀便次数；
腹泻指数＝稀便率×平均稀便级。
试验结果如下：
如图3所示，与对照组(非感染组)相比，大肠杆菌E.coli B2感染之后，小鼠腹泻指数增加至0.93，多黏菌素E1mg/kg治疗组腹泻指数无显著变化，脱水穿心莲内酯20mg/kg治疗组腹泻指数降低至0.59，多黏菌素E联合脱水穿心莲内酯治疗组腹泻指数显著降低至0.18。表明，多黏菌素E联合脱水穿心莲内酯联合治疗对大肠杆菌感染导致的腹泻较多黏菌素E和脱水穿心莲内酯单独治疗均具有明显的增效作用。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。
Claims (10)
1.脱水穿心莲内酯在制备多黏菌素类抗菌药物抗细菌感染增效剂中的应用。
2.脱水穿心莲内酯在制备增强多黏菌素类抗菌药物抗细菌活性的产品中的应用。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述多黏菌素类抗菌药物为多黏菌素E或其药学上可接受的盐、多黏菌素B或其药学上可接受的盐；
所述脱水穿心莲内酯为脱水穿心莲内酯或或其药学上可接受的盐。
4.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述细菌包含含有多黏菌素耐药基因的细菌；
所述细菌为革兰氏阴性杆菌。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述细菌为大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌和沙门氏菌中的一种或多种。
6.一种抗细菌感染组合物，包括脱水穿心莲内酯和多黏菌素类抗菌药物。
7.根据权利要求6所述的抗细菌感染组合物，其特征在于：所述组合物中，所述多黏菌素类抗菌药物与脱水穿心莲内酯的质量比为1:40-640。
8.根据权利要求7所述的抗细菌感染组合物，其特征在于：所述细菌包含含有多黏菌素耐药基因的细菌；所述细菌为革兰氏阴性杆菌。
9.含有权利要求7或8所述的抗细菌感染组合物的抗细菌产品。
10.根据权利要求9所述的抗细菌产品，其特征在于：所述抗细菌产品的剂型为片剂、胶囊、缓释片、控释片、口服液、糖浆、注射液剂型、滴丸、冻干粉针剂型中的一种。
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