CN118064385A - 大肠杆菌噬菌体、噬菌体组合物、制剂及应用 - Google Patents

大肠杆菌噬菌体、噬菌体组合物、制剂及应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物制剂技术领域，具体涉及大肠杆菌噬菌体、噬菌体组合物、制剂及应用。本发明提供了大肠杆菌噬菌体DH5a‑HM‑25，其保藏编号为CGMCC No.45666。所述噬菌体基因组不含耐药基因、抗性基因、整合酶基因，具有安全性高、效价高、稳定性好、裂解谱广和裂解活性高的特点，将其用于大肠杆菌引起的疾病的防治，可代替抗生素用于大肠肝菌引起的猪仔的腹泻和脱水的治疗，并且在体外对大肠杆菌载量有很好的控制，可作为消毒剂广泛用于养殖业，具有较高的应用价值和前景。

Description

大肠杆菌噬菌体、噬菌体组合物、制剂及应用
技术领域
本发明涉及生物制剂技术领域，具体涉及大肠杆菌噬菌体、噬菌体组合物、制剂及应用。
背景技术
大肠杆菌属于肠杆菌科，需氧或兼性厌氧的革兰氏阴性杆菌。一些致病性菌株在绵羊血平板上呈β溶血性，大肠杆菌的致病能力与毒力因子密切相关，主要可分为黏附素和肠毒素两大类。引起断奶后仔猪腹泻的大肠杆菌主要携带K88或F18黏附素，产肠毒素性大肠杆菌(ETEC)能产生一种或多种肠毒素，如热稳定性肠毒素Sta、STb，热不稳定性肠毒素LTⅠ、LTⅡ等。大肠杆菌引发的仔猪断奶后腹泻综合征临床表现为腹泻、脱水和死亡，轻则出现生长性能下降，重则导致严重减重或死亡。
目前临床上对仔猪大肠杆菌腹泻的防治主要依靠抗生素等抗菌药物，初期抗生素大剂量使用的时候在养猪业有效的控制了大肠杆菌的扩散，对我国养殖业的发展起到了很大的促进作用。但是长期、大剂量滥用抗生素，再加上临床盲目使用，会导致猪肠道菌群失调，机体抵抗力下降。随着时间推移，抗生素滥用导致的细菌交叉耐药和多重耐药的问题日益凸显，严重威胁着人们的健康和公共卫生安全。
噬菌体是一类细菌病毒，广泛分布于自然界中，可以特异性感染并杀灭细菌。噬菌体疗法与传统抗生素相比，具有自我复制能力强、宿主专一性高、安全、研发成本低等优势，是理想的抗生素替代品。但是噬菌体疗法也存在裂解谱过于狭窄、作用效果不稳定、裂解活性不强等问题。开发新的广谱烈性噬菌体可以有效扩展产品的抗菌谱，具有良好的应用价值，是目前噬菌体治疗的主要发展方向之一。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供大肠杆菌噬菌体、噬菌体组合物、制剂及应用。
本发明提供了大肠杆菌噬菌体DH5a-HM-25，其特征在于，保藏编号为CGMCCNo.45666。
本发明提供了所述的大肠杆菌噬菌体在制备预防和/或治疗大肠杆菌感染引起的疾病的药物中的应用。
进一步的，所述大肠杆菌感染引起的疾病包括腹泻和/或脱水。
本发明从南阳养猪场污水中分离获得一株新的大肠杆菌噬菌体，命名为DH5a-HM-25。经鉴定该噬菌体基因组中无毒力基因、抗性基因和整合酶基因，具有安全性高的特点，应用于动物肠道中的生物安全防控中没有潜在的风险；且该噬菌体裂解普广，对测试的170株致病性大肠杆菌(包含不同大肠杆菌分型)的裂解率均在96％以上，有效解决了单个噬菌体裂解谱窄的问题；将其应用于养殖中大肠杆菌引起的大肠杆菌导致的腹泻和脱水，实验结果表明，其可快速改善由大肠杆菌导致的腹泻和脱水死亡症状，3～5天后腹泻完全恢复，实现对大肠杆菌腹泻的有效防治。
且结合对所述的大肠杆菌噬菌体的生物学特性研究发现，该噬菌体热稳定性和pH稳定性良好，适用于仔猪大肠杆菌腹泻治疗的所需条件，可代替抗生素用于大肠肝菌引起的猪仔的腹泻和脱水的治疗。
本发明提供了噬菌体组合物，其包括本发明所述的大肠杆菌噬菌体和其他噬菌体。
本发明所述其他噬菌体包括与本发明所述的大肠杆菌噬菌体功能相同或不同、没有相互竞争关系的噬菌体，它们可以与本发明所述的大肠杆菌噬菌体组合用于细菌或病毒的抑制和/或杀灭。
本发明提供了制剂，其包括本发明所述的大肠杆菌噬菌体或本发明所述的噬菌体组合物中的至少一种和药学上可接受的辅料。
进一步的，所述的辅料用于保持所述大肠杆菌噬菌体或所述噬菌体组合的活性或帮助它们发挥作用；所述辅料包括培养液、佐剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、润滑剂、崩解剂、稳定剂和/或缓冲液中的至少一种。
更进一步的，所述制剂，其剂型包括溶液剂、粉剂、凝胶剂、颗粒剂或冻干剂中的至少一种。
本发明提供了所述的制剂的制备方法，其包括将本发明所述的大肠杆菌噬菌体或本发明所述的噬菌体组合物中的至少一种和辅料混合。
本发明提供了预防和/或治疗大肠杆菌感染引起的疾病的方法，其为使用I)～III)所示中的至少一种：
I)、本发明所述的大肠杆菌噬菌体；
II)、本发明所述的噬菌体组合物；
III)、本发明所述的制剂。
进一步的，所述使用的方式包括口服和/或注射等。
本发明提供了消毒剂，其包括本发明所述的大肠杆菌噬菌体或本发明所述的噬菌体组合物中的至少一种和用于环境中病毒、细菌的抑制或消灭的成分。
进一步的，所述用于环境中病毒、细菌的抑制或消灭的成分与本发明所述的大肠杆菌噬菌体或噬菌体组合中的任意噬菌体不发生拮抗。
进一步的，本发明所述的消毒剂，其剂型包括溶液剂、粉剂、凝胶剂、颗粒剂或冻干剂中的至少一种。
本发明提供了一种消毒的方法，其为使用本发明所述的消毒剂。
进一步的，所述使用的方法包括喷雾或浸泡等。
更进一步的，所述消毒的对象包括养殖环境、饲养器具和饲料等。
本发明的一些具体的实施例中，所述制剂或消毒剂用于对大肠杆菌的杀灭，试验结果表明，体外对大肠杆菌处理2h后起到完全杀菌作用，说明该噬菌体潜伏期短，爆发强，符合治疗用噬菌体特性，可作为一种降低环境中大肠杆菌载量的消毒剂。
本发明提供了大肠杆菌噬菌体DH5a-HM-25，其保藏编号为CGMCCNo.45666。所述噬菌体基因组不含耐药基因、抗性基因、整合酶基因，具有安全性高、效价高、稳定性好、裂解谱广和裂解活性高的特点，将其用于大肠杆菌引起的疾病的防治，可代替抗生素用于大肠肝菌引起的猪仔的腹泻和脱水的治疗，并且在体外对大肠杆菌载量有很好的控制，可作为消毒剂广泛用于养殖业，具有较高的应用价值和前景。
生物保藏说明
生物材料DH5a-HM-25，分类命名:大肠杆菌噬菌体，于2023年08月14日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为:北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCCNo.45666。
附图说明
图1示双层平板法DH5a-HM-25噬菌斑形态；
图2示噬菌体DH5a-HM-25电镜形态；
图3示噬菌体DH5a-HM-25温度稳定性；
图4示噬菌体DH5a-HM-25pH稳定性；
图5示大肠杆菌噬菌体制剂对仔猪大肠杆菌腹泻的治疗效果。
具体实施方式
本发明提供了大肠杆菌噬菌体、噬菌体组合物、制剂及应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
专用的术语：
噬菌体效价：1ml培养液中所含活噬菌体的数量。效价测定的方法，一般应用双层琼脂平板法。在含有特异宿主细菌的琼脂平板上，噬菌体产生肉眼可见的噬菌斑，因此，能进行噬菌体的计数，但因噬菌斑计数方法实际效率难以接近100％(一般偏低，因为有少数活噬菌体可能未引起感染)，所以为了准确地表达病毒悬液的浓度(效价或滴度)一般不用病毒粒子的绝对数置而是用噬菌斑形成单位(plague-forming units，简写成pfu)表示。
病毒感染复数(MOI)：MOI概念起源于噬菌体感染细菌的研究。其含义是感染时噬菌体与细菌的数量比值，也就是平均每个细菌感染噬菌体的数量。
CFU：菌落形成单位(Colony-Forming Units)，是指在琼脂平板上经过一定温度和时间培养后形成的每一个菌落，是计算细菌或霉菌数量的单位。
本发明提供了一种新的针对耐药性大肠杆菌的噬菌体制剂。该制剂中含有一株大肠杆菌噬菌体DH5a-HM-25。大肠杆菌噬菌体DH5a-HM-25基因组中无毒力基因、抗性基因和整合酶基因，具有安全性高的特点，表明将该混合噬菌体应用于动物肠道中的生物安全防控中没有潜在的风险；
大肠杆菌噬菌体DH5a-HM-25裂解谱宽，对测试的170株致病性大肠杆菌(包含不同大肠杆菌分型)的裂解率均在96％以上，有效解决了单个噬菌体裂解谱窄的问题；
本发明提供的大肠杆菌噬菌体制剂体外杀菌效果明显，可用作环境消毒剂的活性成分，降低养殖环境中的病原载量。也可以作为一种口服制剂快速改善由大肠杆菌导致的腹泻和脱水死亡症状，实现对大肠杆菌腹泻的有效防治。
本发明的技术方案如下：
一、本发明提供了自南阳某猪场的养殖污水中分离得到的一株新的具有广谱性的烈性大肠菌噬菌体。该噬菌体被命名为DH5a-HM-25，噬菌体基因组测序及结果拼接由华中农业大学基因组资源实验室完成。噬菌体DH5a-HM-25基因组为线性双链DNA，对噬菌体进行基因组学分析，未预测到已知相关毒力基因、抗生素耐药基因和整合酶基因，表明噬菌体基因组安全。文末附噬菌体DH5a-HM-25基因组序列。透射电镜下，该噬菌体头部呈多面体结构，头部连接有可收缩的尾部。根据病毒分类国际委员会(ICTV)的分类方法，该噬菌体形态符合肌尾噬菌体科的特征，属于肌尾噬菌体。
二、本发明对噬菌体DH5a-HM-25生物学特性做了相应研究。温度稳定性结果显示噬菌体DH5a-HM-25在温度为20～60℃时相对稳定；70℃时噬菌体开始出现效价衰减，80℃时噬菌体无法存活。pH稳定性结果显示噬菌体DH5a-HM-25在pH为3～10时稳定，在pH为2的酸性环境和pH为12的碱性环境有轻微衰减，在pH为13碱性环境时，噬菌体无法存活。该噬菌体热稳定性和pH稳定性良好，适用于仔猪大肠杆菌腹泻治疗的所需条件。
三、本发明还提供一种噬菌体制剂方法，该制剂中主成分为大肠杆菌基础培养基和噬菌体DH5a-HM-25。该噬菌体制剂中不含抗生素，无抗生素残留和耐药风险，可作为一种治疗仔猪大肠杆菌腹泻的替抗产品，专门针对引起仔猪腹泻的产肠毒素大肠杆菌、多重耐药大肠杆菌。
四、本发明提供的大肠噬菌体制剂，体外对大肠杆菌处理2h后起到完全杀菌作用，说明该噬菌体潜伏期短，爆发强，符合治疗用噬菌体特性，可作为一种降低环境中大肠杆菌载量的环境清洁剂。
五、本发明提供的大肠噬菌体制剂，体外裂解结果显示对测试的170株致病性大肠杆菌(包含不同大肠杆菌分型)的裂解率在96％以上，有效解决了单个噬菌体裂解谱窄的问题。该噬菌体制剂对仔猪大肠杆菌腹泻的治疗应用中效果明显。噬菌体口服使用后当天腹泻情况得到改善，3～5天后腹泻完全恢复，可以实现对大肠杆菌腹泻的有效防治。
本发明采用的试剂耗材皆为普通市售品，皆可于市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例一噬菌体的分离与纯化、基因组分析、电镜形态观察
1、噬菌体的分离与纯化
采集养猪场污水用滤纸过滤，去除固体杂质后，取污水样50mL，12000r·min-1离心5min，0.22μm滤膜过滤得上清液；取上清液10mL加入10mL TSB液体培养基和0.2mL处于对数期大肠杆菌宿主菌液ETEC K88，混匀后于37℃，160r·min-1恒温摇床培养过夜；取1mL培养液，12000r·min-1离心5min，0.22μm滤膜过滤得上清液，即为噬菌体原液。取100μL噬菌体原液与200μL对数期宿主菌ETEC K88混合，加入约8mL半固体TSB培养基中，混合均匀后倒入含有TSB固体培养基平板，待上层凝固后，37℃恒温箱过夜培养。双层平板出现透明斑，则说明噬菌体存在(图1)。通过连续3次单斑分离，获得纯化后噬菌体，在双层平板上产生形状均一的噬菌斑，命名为DH5a-HM-25。
2、噬菌体基因组分析
噬菌体基因组提取采用病毒基因组提取试剂盒。噬菌体基因组测序及结果拼接由华中农业大学基因组资源实验室完成。噬菌体EcP1基因组为线性双链DNA，对噬菌体DH5a-HM-25进行基因组学分析，未预测到已知相关毒力基因、抗生素耐药基因和整合酶基因，表明噬菌体基因组安全，无用于噬菌体疗法的潜在风险。
3、噬菌体电镜形态观察
首先将噬菌体制备成浓缩颗粒，制备噬菌体浓缩颗粒步骤如下：在噬菌体原液中加入NaCl，使其终浓度为1mol·L-1，搅拌充分溶解后冰浴1h，12000r·min-1离心5min，得到上清液，然后加入PEG 8 000浓度达10％(w/v)，玻璃棒缓慢搅拌使其充分溶解，冰浴过夜，10000r·min-1离心5min，弃上清，将离心管倒置20min至管内液体全部流干，然后5mL SM缓冲液重悬，4℃保存。电镜观察步骤如下：将制备重悬液10μL滴于铜网上，待其自然沉淀10min，滤纸从侧面小心吸干多余液体，加少量2％(w/v)磷钨酸到铜网上，染色3min，待铜网干燥后电镜观察。透射电镜下(图2)，噬菌体头部呈多面体结构，头部连接有可收缩的尾部。根据病毒分类国际委员会(ICTV)的分类方法，噬菌体形态符合肌尾噬菌体科的特征，属于肌尾噬菌体。
实施例二噬菌体生物学特性研究
1、温度稳定性
取1mL噬菌体DH5a-HM-25，分别放置在20～80℃的水浴锅中恒温作用1h，样品水浴完成后迅速取出放置在冰块中冷却，使用双层平板法测定不同温度处理后的样品中噬菌体效价。温度稳定性结果(图3)显示噬菌体DH5a-HM-25在温度为20～60℃时相对稳定；70℃时噬菌体开始出现效价衰减，80℃时噬菌体无法存活；噬菌体EcF3在温度为20～50℃时相对稳定，60℃时出现轻微衰减。
2、pH稳定性
取100μL噬菌体DH5a-HM-25，加入到提前用HCl/NaOH调节pH至2～13的TSB培养基中，混合均匀后置于37℃中恒温水浴1h，使用双层平板法测定不同pH处理后的样品中噬菌体效价。pH稳定性结果(图4)显示噬菌体DH5a-HM-25在pH为3～11时相对稳定，在pH为2的酸性环境和pH为12的碱性环境有衰减死亡，在pH为13碱性环境时，噬菌体无法存活。噬菌体热稳定性和pH稳定性良好，适用于仔猪大肠杆菌腹泻治疗的所需条件。
3、最佳MOI
将噬菌体以感染复数(multiplicity of infection，MOI)102:1、10:1、1:1、10-1：1、10-2：1、10-3：1、10-4：1分别接种至处于对数期大肠杆菌宿主菌Ec88中，37℃培8h，得到噬菌体效价最高的MOI即为最佳MOI。当噬菌体DH5a-HM-25以MOI＝0.001时，收获噬菌体效价最高可达5×1011pfu·mL-1。实施例三大肠杆菌噬菌体制剂方法
挑选DH5a-HM-25宿主菌ETEC K88，平板活化后挑取单菌落接种到5ml TSB液体培养基中，37℃、180rpm振荡培养12h，得到对数期菌悬液。在装有20mL TSB培养基的50mL离心管中加入200μL对数期菌液和10μL效价为109pfu·mL-1的噬菌体种毒，静置10min后，37℃、180rpm振荡培养8h，5000g离心5min，收集上清过0.22μL无菌滤器后得到DH5a-HM-25噬菌体制剂，成品噬菌体效价保证不少于1011pfu·mL-1。
该噬菌体制剂仅含TSB液体培养基成分和噬菌体DH5a-HM-25，不含任何抗生素，可作为一种降低环境中致病性大肠杆菌的环境改良剂和治疗仔猪大肠杆菌腹泻的替抗产品。
实施例四大肠杆菌噬菌体制剂对非宿主菌体外裂解验证
取实施例三中获得的大肠杆菌噬菌体制剂和临床分离的来自河南、安徽、山东、江苏、湖北等不同地区养殖的170株不同分型大肠杆菌。采用双层平板法测定大肠杆菌噬菌体制剂的裂解谱，170株大肠杆菌分型如表1，裂解结果如表2。步骤如下：大肠杆菌菌种平板活化培养后，挑取单菌落接种到5ml TSB液体培养基中，37℃、180rpm振荡培养12h，得到对数期菌悬液，取200μl的菌悬液与8mL TSB半固体培养基倒双层平板。上层板凝固后滴加10μL噬菌体制剂，待液体吸收后置于37℃的恒温箱中倒置培养过夜观察结果。通过点板法对170株不同分型大肠杆菌进行裂解试验，总体裂解率达到96％，有效解决了单个噬菌体裂解谱窄的问题。
170株大肠杆菌分型
大肠杆菌菌株分型 裂解率
K88(53株) 100％(53/53)
F18(66株) 97％(64/66)
K99(20株) 95％(19/20)
F41(16株) 94％(15/16)
987P(15株) 80％(12/15)
总计(170株) 96％(163/170)
表2.170株不同分型大肠杆菌裂解情况
实施例五大肠杆菌噬菌体制剂体外杀菌效果
挑选宿主菌ETEC K88平板活化后液体转接获得100μL对数期菌液，分别与900μL的下述混合：无菌生理盐水、大肠杆菌噬菌体制剂(效价不低于1010pfu·mL-1)，阿莫西林可溶性粉-50％(w/w)、庆大可溶性粉-5％(w/w)、硫酸黏杆菌素-10％(w/w)充分混匀，37℃振荡培养2h后进行菌落计数，结果如表3。
表3.大肠杆菌噬菌体制剂体外杀菌效果
处理组 菌落数
大肠杆菌菌液+生理盐水 菌落计数结果2×108CFU
大肠杆菌菌液+噬菌体制剂 菌落计数结果2CFU
大肠杆菌菌液+阿莫西林可溶性粉-50％ 菌落计数结果5.8×105CFU
大肠杆菌菌液+庆大可溶性粉-5％ 菌落计数结果6.4×103CFU
大肠杆菌菌液+硫酸黏杆菌素-10％ 菌落计数结果103CFU
本发明提供的大肠杆菌噬菌体制剂处理2h后菌落数降为2(生理盐水组2×108CFU)，说明该噬菌体潜伏期短，爆发强，符合治疗用噬菌体特性。
实施例六大肠杆菌噬菌体制剂对仔猪大肠杆菌腹泻的治疗效果
首先挑选25日龄断奶后腹泻仔猪，病原检出致病性大肠杆菌，猪只均重5～6kg，各组间均重差异≤0.5kg。攻毒剂量为大肠杆菌F18和K88混合菌液109CFU，攻毒后根据猪群腹泻情况，分3组，每组5头。大肠杆菌噬菌体制剂治疗方案为：口服灌服，1010pfu/头/天，1次/天，治疗3天；抗生素治疗组治疗方案为：口服灌服硫酸黏杆菌素可溶性粉-10％(w/w)，0.04g/kg，1次/天，治疗3天。治疗后每天逐头对粪便进行评分，评分规则为水样粪便—10分，稀便—7分，糊状粪便—3分，正常—0分。治疗结果如图5和下述所示：
(1)大肠杆菌噬菌体治疗组：噬菌体制剂植入后腹泻情况明显改善，3天后腹泻评分基本在3分以下，过程中无死亡猪；
(2)抗生素治疗组：硫酸黏杆菌素可溶性粉-10％灌服后，第4天腹泻得到改善，5天后腹泻评分基本在4分左右，过程中无死亡猪；
(3)不治疗对照组：过程中腹泻脱水死亡3头，第6天仅剩下两头猪，平均腹泻评分基本在6分左右；
噬菌体治疗组和抗生素治疗组均能改善不同程度的腹泻，噬菌体治疗组从第3天到第7天腹泻评分基本控制在3分以下，说明本发明提供的大肠杆菌噬菌体制剂产品能够有效防治大肠杆菌引起的仔猪的腹泻。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.大肠杆菌噬菌体DH5a-HM-25，其特征在于，保藏编号为CGMCCNo.45666。
2.权利要求1所述的大肠杆菌噬菌体在制备预防和/或治疗大肠杆菌感染引起的疾病的药物中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述大肠杆菌感染引起的疾病包括腹泻和/或脱水。
4.噬菌体组合物，其特征在于，包括如权利要求1所述的大肠杆菌噬菌体和其他噬菌体。
5.制剂，其特征在于，包括如权利要求1所述的大肠杆菌噬菌体或如权利要求3所述的噬菌体组合物中的至少一种和药学上可接受的辅料。
6.根据权利要求5所述的制剂，其特征在于，所述辅料包括培养液、佐剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、润滑剂、崩解剂、稳定剂和/或缓冲液中的至少一种。
7.根据权利要求5或6所述的制剂，其特征在于，其剂型包括溶液剂、粉剂、凝胶剂、颗粒剂或冻干剂中的至少一种。
8.权利要求5～7任一项所述的制剂的制备方法，其特征在于，包括将如权利要求1所述的大肠杆菌噬菌体或如权利要求4所述的噬菌体组合物中的至少一种和辅料混合。
9.消毒剂，其特征在于，包括如权利要求1所述的大肠杆菌噬菌体或权利要求4所述的噬菌体组合物中的至少一种和用于环境中病毒、细菌的抑制或消灭的成分。
10.根据权利要求9所述的消毒剂，其特征在于，其剂型包括溶液剂、粉剂、凝胶剂、颗粒剂或冻干剂中的至少一种。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN118546916A (zh) * 2024-07-30 2024-08-27 江西农业大学 一种产肠毒素性大肠杆菌噬菌体、制剂及其应用

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