JPH0394682A - ペプチドの製造法 - Google Patents
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Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
Ｌ皇上空紅肚允見
本発明はエンドセリンファミリーおよびその前駆体を、
培養上清中に分泌生産できるように構築した組換えＤＮ
Ａ、該組換えＤＮＡを保持する形質転換体，およびそれ
を用いるエンドセリンファミリーまたはその前邪体ポリ
ペプチドの効率的な製造方法に関する。
培養上清中に分泌生産できるように構築した組換えＤＮ
Ａ、該組換えＤＮＡを保持する形質転換体，およびそれ
を用いるエンドセリンファミリーまたはその前邪体ポリ
ペプチドの効率的な製造方法に関する。
更来立捜比
エンドセリンは強い血管収縮活性を有する２１個のアミ
ノ酸残基を有するペプチドである〔柳沢ら，ネイチ’ｒ
（Ｎａｔｕｒｅ），３３２，４１１（１９８ｇ）
） ．エンドセリンはそのアミノ酸配列のＮ末端から数
えて第１番目，第３番目、第１１番目、第１５番目に位
置する４個のシステイン基を含み、それらは２組のジス
ルフィド結合を形威している。このジスルフィド結合の
組合せとしては、１−１５． ３−１１の組合せ、およ
び１−１１．３−１５の組合せが考えられるが、天然型
エンドセリンは前者の組合せであり，またそのものの方
が活性が高い。
ノ酸残基を有するペプチドである〔柳沢ら，ネイチ’ｒ
（Ｎａｔｕｒｅ），３３２，４１１（１９８ｇ）
） ．エンドセリンはそのアミノ酸配列のＮ末端から数
えて第１番目，第３番目、第１１番目、第１５番目に位
置する４個のシステイン基を含み、それらは２組のジス
ルフィド結合を形威している。このジスルフィド結合の
組合せとしては、１−１５． ３−１１の組合せ、およ
び１−１１．３−１５の組合せが考えられるが、天然型
エンドセリンは前者の組合せであり，またそのものの方
が活性が高い。
ブタ大動脈内皮細胞から単離・精製されたエンドセリン
のうちの一つは，アミノ酸分析（ニンヒドリン法），分
子量測定およびその他のデータから、次のアミノ酸２１
個からなるペプチド（以後，エンドセリンー１と表す）
であることが分かっている。エンドセリンー１のアミノ
酸配列はＣｙｓ Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ｓｅｒ Ｓ
ｅｒ Ｌｅｕ ＭｅｔＡｓｐ Ｌｙｓ Ｇｌｕ
Ｃｙｓ Ｖａｌ Ｔｙｒ ＰｈｅＣｙｓ
Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｉｌｅ Ｉｌｅ
Ｔｒｐであり．ＣｙｓとＣｙｓの間でＳ−Ｓ結合が２組
存在する。分子量は２，４９２である。
のうちの一つは，アミノ酸分析（ニンヒドリン法），分
子量測定およびその他のデータから、次のアミノ酸２１
個からなるペプチド（以後，エンドセリンー１と表す）
であることが分かっている。エンドセリンー１のアミノ
酸配列はＣｙｓ Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ｓｅｒ Ｓ
ｅｒ Ｌｅｕ ＭｅｔＡｓｐ Ｌｙｓ Ｇｌｕ
Ｃｙｓ Ｖａｌ Ｔｙｒ ＰｈｅＣｙｓ
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Ｔｒｐであり．ＣｙｓとＣｙｓの間でＳ−Ｓ結合が２組
存在する。分子量は２，４９２である。
最近、ヒト遺伝子ＤＮＡを探索することによって，エン
ドセリンー１以外に、アミノ酸配列と生理活性がわずか
に異なるエンドセリンー２およびエンドセリンー３が存
在することが確認されている〔井上ら，プロシージング
ス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエ
ンス・ユーエスエー（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ１．Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．ＵＳＡ），８６．２８６３（１９８９））。
ドセリンー１以外に、アミノ酸配列と生理活性がわずか
に異なるエンドセリンー２およびエンドセリンー３が存
在することが確認されている〔井上ら，プロシージング
ス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエ
ンス・ユーエスエー（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ１．Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．ＵＳＡ），８６．２８６３（１９８９））。
ここではエンドセリンー１、エンドセリンー２およびエ
ンドセリンー３をエンドセリンファミリーと総称する。
ンドセリンー３をエンドセリンファミリーと総称する。
これらのエンドセリンファミリーは、高等動物のエンド
セリン産生細胞（例えば血管内皮細胞や腎臓細胞）の染
色体上に存在するそれぞれのエンドセリン遺伝子により
ごくわずかに産生されていると考えられている。エンド
セリンファミリーは血管平滑筋や腸管を強力にまた持続
的に収縮させることから、このペプチド自体や、そのア
ンタゴニストは医学への応用が考えられている。エンド
セリンファミリーの合或法としては、従来，化学合戒に
より調製されているが，エンドセリンファミリー中の２
組のジスルフイド結合を正確に行わせることができない
点や，よりアミノ酸残基の多いエンドセリン前邸体の化
学合成が困難な点で、満足な方法とは言えず、より効率
的な生産方法の開発が望まれている。なお、本発明にお
いて，エンドセリン前駆体とはアミノ酸２１個から或る
エンドセリンファミリー（或熟）のＮ末端またはＣ末端
またはその両方に１つ以上の任意のアミノ酸が付加した
構造のものをいう。
セリン産生細胞（例えば血管内皮細胞や腎臓細胞）の染
色体上に存在するそれぞれのエンドセリン遺伝子により
ごくわずかに産生されていると考えられている。エンド
セリンファミリーは血管平滑筋や腸管を強力にまた持続
的に収縮させることから、このペプチド自体や、そのア
ンタゴニストは医学への応用が考えられている。エンド
セリンファミリーの合或法としては、従来，化学合戒に
より調製されているが，エンドセリンファミリー中の２
組のジスルフイド結合を正確に行わせることができない
点や，よりアミノ酸残基の多いエンドセリン前邸体の化
学合成が困難な点で、満足な方法とは言えず、より効率
的な生産方法の開発が望まれている。なお、本発明にお
いて，エンドセリン前駆体とはアミノ酸２１個から或る
エンドセリンファミリー（或熟）のＮ末端またはＣ末端
またはその両方に１つ以上の任意のアミノ酸が付加した
構造のものをいう。
明が解決しようとする
本発明は、遺伝子組換え技術を用いることにより、エン
ドセリンファミリーとエンドセリン前駆体を，大量にし
かも効率よく製造する方法を提供するものである。
ドセリンファミリーとエンドセリン前駆体を，大量にし
かも効率よく製造する方法を提供するものである。
を するための一
本発明者らの一部は、すでにヒト・エンドセリンー１の
相補ＤＮＡのクローニングに或功しており、その全塩基
配列を同定し、ヒ１〜・エンドセリンー１を遺伝子組換
え技術によって生産する道を開くことに或功していたが
（特願昭６３−１４８１５８号、同６３−２７４４５４
号）、さらに効率的な、高産生量が得られる生産方法を
提供すべく研究を重ねた結果、エンドセリンファミリー
およびエンドセリン前駆体の高分泌生産を可能とするた
めに，シグナル配列をコードするＤＮＡを、エンドセリ
ンファミリーまたはその前駆体をコードするＤＮＡの５
′末端に付加した組換えＤＮＡが適していることを見出
し、本発明に到達したものである。
相補ＤＮＡのクローニングに或功しており、その全塩基
配列を同定し、ヒ１〜・エンドセリンー１を遺伝子組換
え技術によって生産する道を開くことに或功していたが
（特願昭６３−１４８１５８号、同６３−２７４４５４
号）、さらに効率的な、高産生量が得られる生産方法を
提供すべく研究を重ねた結果、エンドセリンファミリー
およびエンドセリン前駆体の高分泌生産を可能とするた
めに，シグナル配列をコードするＤＮＡを、エンドセリ
ンファミリーまたはその前駆体をコードするＤＮＡの５
′末端に付加した組換えＤＮＡが適していることを見出
し、本発明に到達したものである。
すなわち、本発明はエンドセリンファミリーおよびその
前邸体を、培養上清中に分泌生産できるように構築した
組換えＤＮＡを保持する形質転換体を培養し、培養液中
にエンドセリンファミリーまたはエンドセリン前駆体を
生産蓄積せしめ、これを採取することを特徴とするエン
ドセリンファミリーおよびエンドセリン前腫体の製造方
法に関するものである。
前邸体を、培養上清中に分泌生産できるように構築した
組換えＤＮＡを保持する形質転換体を培養し、培養液中
にエンドセリンファミリーまたはエンドセリン前駆体を
生産蓄積せしめ、これを採取することを特徴とするエン
ドセリンファミリーおよびエンドセリン前腫体の製造方
法に関するものである。
本発明のエンドセリンファミリーをコードするＤＮＡと
しては，エンドセリンファミリーをコードする塩基配列
を含有するものであればいかなるものであってもよい。
しては，エンドセリンファミリーをコードする塩基配列
を含有するものであればいかなるものであってもよい。
エンドセリンファミリーまたはエンドセリン前腿体の発
現ベクターは、例えば、 （イ）ヒト・プレプロエンドセリンー１をコードする相
補ＤＮＡ （伊藤ら．ＦＥＢＳ・レターズ（ＦＥＢＳ
Ｌｅｔｔｅｒｓ）．２３１，４４０（１９８８））やヒ
ト・エンドセリンー２および−３をコードする遺伝子Ｄ
ＮＡ〔井上ら，プロシージングス・オブ・ザ・ナショナ
ル・アカデミー・オブ・サイエンス・ユーエス二一 （
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ），８
６．２８６３（１９８９））から目的とするＤＮＡ断片
を切り出し，（口）該ＤＮＡ断片を適当な発現ベクター
中のプロモーターの下流に連結することにより製造する
ことができる。この時，先に述べたように効率的に分泌
生産させるために、エンドセリンファミリーをコードす
るＤＮＡの上流側に適当なシグナル配列をコードするＤ
ＮＡを付加する。
現ベクターは、例えば、 （イ）ヒト・プレプロエンドセリンー１をコードする相
補ＤＮＡ （伊藤ら．ＦＥＢＳ・レターズ（ＦＥＢＳ
Ｌｅｔｔｅｒｓ）．２３１，４４０（１９８８））やヒ
ト・エンドセリンー２および−３をコードする遺伝子Ｄ
ＮＡ〔井上ら，プロシージングス・オブ・ザ・ナショナ
ル・アカデミー・オブ・サイエンス・ユーエス二一 （
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ），８
６．２８６３（１９８９））から目的とするＤＮＡ断片
を切り出し，（口）該ＤＮＡ断片を適当な発現ベクター
中のプロモーターの下流に連結することにより製造する
ことができる。この時，先に述べたように効率的に分泌
生産させるために、エンドセリンファミリーをコードす
るＤＮＡの上流側に適当なシグナル配列をコードするＤ
ＮＡを付加する。
クローン化されたエンドセリンファミリーをコードする
ＤＮＡは目的によりそのまま，または所望により制限酵
素で消化したり，リンカーを付加したりして使用するこ
とができる。
ＤＮＡは目的によりそのまま，または所望により制限酵
素で消化したり，リンカーを付加したりして使用するこ
とができる。
該ＤＮＡはその５″末端側に翻訳開始コドンとしてのＡ
ＴＧを有し，また３′末端側には翻訳終止コドンとして
のＴＡＡ，ＴＧＡまたはＴＡＧを有していてもよい。こ
れらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、適当な合成
ＤＮＡアダプターを用いて付加することもできる．さら
に該ＤＮＡを発現させるにはその上流にプロモーターを
接続する。
ＴＧを有し，また３′末端側には翻訳終止コドンとして
のＴＡＡ，ＴＧＡまたはＴＡＧを有していてもよい。こ
れらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、適当な合成
ＤＮＡアダプターを用いて付加することもできる．さら
に該ＤＮＡを発現させるにはその上流にプロモーターを
接続する。
ベクターとしては，大腸菌由来のプラスミド（例． ｐ
Ｂ Ｒ ３ ２ ２ ， ｐ Ｂ Ｒ ３ ２ ５
， ｐ Ｕ Ｃ １ ２ ，ｐＵｃ１３），枯草菌由来
プラスミド（例、ｐｔｒＢＩＩＯ．ｐＴＰ５，ｐｃ１９
４），酵母由来プラスミド（例、ｐｓＨ１９，ｐｓＨ１
５），あるいはλファージなどのバクテリオファージお
よびレトロウィルス、ワクシニアウィルス，バキュロウ
ィルスなどの動物ウィルスなどが挙げられる。
Ｂ Ｒ ３ ２ ２ ， ｐ Ｂ Ｒ ３ ２ ５
， ｐ Ｕ Ｃ １ ２ ，ｐＵｃ１３），枯草菌由来
プラスミド（例、ｐｔｒＢＩＩＯ．ｐＴＰ５，ｐｃ１９
４），酵母由来プラスミド（例、ｐｓＨ１９，ｐｓＨ１
５），あるいはλファージなどのバクテリオファージお
よびレトロウィルス、ワクシニアウィルス，バキュロウ
ィルスなどの動物ウィルスなどが挙げられる。
本発明で用いられるプロモーターとしては、遺伝子の発
現に用いる宿主に対応して適切なプロモーターであれば
いかなるものでもよい。
現に用いる宿主に対応して適切なプロモーターであれば
いかなるものでもよい。
形質転換する際の宿主がエシエリヒア属菌である場合は
．ｔｒｐプロモーター， Ｑａｃプロモーター ｒｅｃ
Ａプロモーター λＰＬプロモータ＊ Ｑｐｐプロモー
ターなどが、宿主がバチルス属菌である場合は，ＳＰＯ
Ｌプロモーター，ＳＰＯ２プロモーター，ｐｅｎＰプロ
モーターなど，宿主が酵母である場合は、ＰＨ０５プロ
モーターＰＧＫプロモーター，ＧＡＰプロモーター，Ａ
ＤＨプロモーターなどが好ましい。
．ｔｒｐプロモーター， Ｑａｃプロモーター ｒｅｃ
Ａプロモーター λＰＬプロモータ＊ Ｑｐｐプロモー
ターなどが、宿主がバチルス属菌である場合は，ＳＰＯ
Ｌプロモーター，ＳＰＯ２プロモーター，ｐｅｎＰプロ
モーターなど，宿主が酵母である場合は、ＰＨ０５プロ
モーターＰＧＫプロモーター，ＧＡＰプロモーター，Ａ
ＤＨプロモーターなどが好ましい。
宿主が動物細胞である場合には、ＳＶ４０由来のプロモ
ーター、レトロウィルスのプロモーターメタロチオネイ
ンプロモーター，ヒートシコックプロモーターなどがそ
れぞれ利用できる。
ーター、レトロウィルスのプロモーターメタロチオネイ
ンプロモーター，ヒートシコックプロモーターなどがそ
れぞれ利用できる。
なお、発現にエンハンサーの利用も効果的である。
また、分泌発現をより効果的に行わせるために、宿主に
合ったシグナル配列を、エンドセリンファミリーのＮ末
端側に付加するものである。宿主がエシェリヒア属菌で
ある場合は、アルカリフオスファターゼ・シグナル配列
．ＯｍｐＡ・シグナル配列などが，宿主がバチルス属菌
である場合は、α−アミラーゼ・シグナル配列、サブチ
リシン・シグナル配列などが、宿主が酵母である場合は
，メイテイングファクターα・シグナル配列、インベル
ターゼ・シグナル配列など、宿主が動物細胞である場合
には、プレプロエンドセリン自体のシグナル配列を用い
ることができるが、その他にもインシュリン・シグナル
配列、α−インターフェロン・シグナル配列、抗体分子
・シグナル配列などがそれぞれ利用できる。
合ったシグナル配列を、エンドセリンファミリーのＮ末
端側に付加するものである。宿主がエシェリヒア属菌で
ある場合は、アルカリフオスファターゼ・シグナル配列
．ＯｍｐＡ・シグナル配列などが，宿主がバチルス属菌
である場合は、α−アミラーゼ・シグナル配列、サブチ
リシン・シグナル配列などが、宿主が酵母である場合は
，メイテイングファクターα・シグナル配列、インベル
ターゼ・シグナル配列など、宿主が動物細胞である場合
には、プレプロエンドセリン自体のシグナル配列を用い
ることができるが、その他にもインシュリン・シグナル
配列、α−インターフェロン・シグナル配列、抗体分子
・シグナル配列などがそれぞれ利用できる。
このようにして構築されたエンドセリンの前邸体たんぱ
くや成熟ペプチド（エンドセリンファミリー）をコード
するＤＮＡを含有するベクターを用いて、形質転換体を
製造する。
くや成熟ペプチド（エンドセリンファミリー）をコード
するＤＮＡを含有するベクターを用いて、形質転換体を
製造する。
宿主としては、たとえばエシエリヒア属菌、バチルス属
菌、酵母，昆虫、動物細胞などが挙げられる。
菌、酵母，昆虫、動物細胞などが挙げられる。
上記エシェリヒア属菌、パチルス属菌の具体例としては
，エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏ
ｌｉ）Ｋ１２・ＤＨＩ ［プロシージングス・オブ・ザ
・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・ユーエ
スエー（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ），６０，１６０（１９６８）） ，Ｊ Ｍｌ０３
［ヌクレイツク・アシツズ・リサーチ，（Ｎｕｃｌｅｉ
ｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ），９３０９（１９
８１）］，ＪＡ２２１（ジャーナル・オブ・モレキュラ
ー・バイオロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）），１２０５１７（１９７
ｇ））， ＨＢＩＯＩ（ジャーナル・オブ・モレキュラ
ー・バイオ口ジーりユ４５９（１９６９）］，Ｃ６００
（ジエネティックス（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ） ，影程４４
０（１９５４））などが挙げられる。
，エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏ
ｌｉ）Ｋ１２・ＤＨＩ ［プロシージングス・オブ・ザ
・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・ユーエ
スエー（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ），６０，１６０（１９６８）） ，Ｊ Ｍｌ０３
［ヌクレイツク・アシツズ・リサーチ，（Ｎｕｃｌｅｉ
ｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ），９３０９（１９
８１）］，ＪＡ２２１（ジャーナル・オブ・モレキュラ
ー・バイオロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）），１２０５１７（１９７
ｇ））， ＨＢＩＯＩ（ジャーナル・オブ・モレキュラ
ー・バイオ口ジーりユ４５９（１９６９）］，Ｃ６００
（ジエネティックス（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ） ，影程４４
０（１９５４））などが挙げられる。
上記バチルス属菌としては、たとえばバチルス・サチル
ス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）Ｍ Ｉ
１１４（ジーン，２４，２５５（１９８３）），２０７
− ２１（ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊ
ｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）９ｉ
Ｌ８７（１９８４））などが挙げられる。
ス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）Ｍ Ｉ
１１４（ジーン，２４，２５５（１９８３）），２０７
− ２１（ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊ
ｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）９ｉ
Ｌ８７（１９８４））などが挙げられる。
上記酵母としては、たとえばサツ力ロマイセスセレビシ
エ（Ｓａｃｃａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ
） Ａ Ｈ ２ ２ ，ＡＨ２２Ｒ−，ＮＡ８７−１１
Ａ，ＤＫＤ−５Ｄ，２０Ｂ−１２などが挙げられる。
エ（Ｓａｃｃａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ
） Ａ Ｈ ２ ２ ，ＡＨ２２Ｒ−，ＮＡ８７−１１
Ａ，ＤＫＤ−５Ｄ，２０Ｂ−１２などが挙げられる。
昆虫としては、例えばカイコの幼虫などが挙げられる〔
前田ら、ネイチャ−（Ｎａｔｕｒｅ） ，３１５，５９
２（１９８５）］ ． 動物細胞としては、たとえばサル細胞ＣＯＳ一７，Ｖｅ
ｒｏ，チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ，マウスＬ細
胞，ヒトＦＬ細胞などが挙げられる。
前田ら、ネイチャ−（Ｎａｔｕｒｅ） ，３１５，５９
２（１９８５）］ ． 動物細胞としては、たとえばサル細胞ＣＯＳ一７，Ｖｅ
ｒｏ，チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ，マウスＬ細
胞，ヒトＦＬ細胞などが挙げられる。
上記エシェリヒア属菌を形質転換するには，たとえばプ
ロシージング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オ
ブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ），６９．２１１０（１９７２）やジーン，
１７，１０７（１９８２）などに記載の方法に従って行
なわれる。
ロシージング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オ
ブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ），６９．２１１０（１９７２）やジーン，
１７，１０７（１９８２）などに記載の方法に従って行
なわれる。
パチルス属菌を形質転換するには，たとえばモレキュラ
ー・アンド・ジェネラル・ジェネテイックス（Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ ＆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）
，１６８，１１１（１９７９）などに記載の方法に従
って行なわれる。
ー・アンド・ジェネラル・ジェネテイックス（Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ ＆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）
，１６８，１１１（１９７９）などに記載の方法に従
って行なわれる。
酵母を形質転換するには、たとえばプロシージング・オ
ブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ），７
５，１９２９（１９７８）に記載の方法に従って行なわ
れる。
ブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ），７
５，１９２９（１９７８）に記載の方法に従って行なわ
れる。
動物細胞を形質転換するには、たとえばヴイロロジー（
Ｖｉｒｏ１ｏｇｙ）５２，４５６（１９７３）に記載の
方法に従って行なわれる。
Ｖｉｒｏ１ｏｇｙ）５２，４５６（１９７３）に記載の
方法に従って行なわれる。
このようにして、エンドセリンの前岨体蛋白質や或熟ペ
プチド（エンドセリンファミリー）をコードするＤＮＡ
を含有する発現ベクターで形質転換された形質転換体が
得られる。
プチド（エンドセリンファミリー）をコードするＤＮＡ
を含有する発現ベクターで形質転換された形質転換体が
得られる。
宿主がエシエリヒア属菌、バチルス属菌である形質転換
体を培養する際、培養に使用される培地としては液体培
地が適当であり，その中には該形質転換体の生育に必要
な炭素源、窒素源、無機物その他が含有せしめられる。
体を培養する際、培養に使用される培地としては液体培
地が適当であり，その中には該形質転換体の生育に必要
な炭素源、窒素源、無機物その他が含有せしめられる。
炭素源としては，たとえばグルコース、デキストリン、
可溶性澱粉、シヨ糖など，窒素源としては，たとえばア
ンモニウム塩類，硝酸塩類、コーンスチープ・リカーペ
プトン，カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出
液などの無機または有機物質、無機物としてはたとえば
塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネ
シウムなどが挙げられる。
可溶性澱粉、シヨ糖など，窒素源としては，たとえばア
ンモニウム塩類，硝酸塩類、コーンスチープ・リカーペ
プトン，カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出
液などの無機または有機物質、無機物としてはたとえば
塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネ
シウムなどが挙げられる。
また，酵母、ビタミン類，生長促進因子などを添加して
もよい。
もよい。
培地のｐＨは約５〜８が望ましい。
エシェリヒア属菌を培養する際の培地としては、例えば
グルコース、カザミノ酸を含むＭ９培地〔ミラー（Ｍｉ
ｌｌｅｒ） ，ジャーナル・オブ・エクスペリメンツ・
イン・モレキュラー・ジエネテイツクス（Ｊｏｕｒｎａ
ｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ），４３１−４３３，Ｃｏ
ｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ ｝Ｉａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ， ＮｅｗＹｏｒｋ １９７２）が好ましい。こ
こに必要によりプロモーターを効率よく働かせるために
、たとえば３β−インドリルアクリル酸のような薬剤を
加えることができる。
グルコース、カザミノ酸を含むＭ９培地〔ミラー（Ｍｉ
ｌｌｅｒ） ，ジャーナル・オブ・エクスペリメンツ・
イン・モレキュラー・ジエネテイツクス（Ｊｏｕｒｎａ
ｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ），４３１−４３３，Ｃｏ
ｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ ｝Ｉａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ， ＮｅｗＹｏｒｋ １９７２）が好ましい。こ
こに必要によりプロモーターを効率よく働かせるために
、たとえば３β−インドリルアクリル酸のような薬剤を
加えることができる。
宿主がエシェリキア属菌の場合，培養は通常約ｌ５〜４
３℃で約３〜２４時間行い、必要により，通気や攪拌を
加えることもできる。
３℃で約３〜２４時間行い、必要により，通気や攪拌を
加えることもできる。
宿主がバチルス属菌の場合、培養は通常約３０〜４０℃
で約６〜２４時間行ない、必要により通気や攪拌を加え
ることもできる。
で約６〜２４時間行ない、必要により通気や攪拌を加え
ることもできる。
宿主が酵母である形質転換体を培養する際、培地として
は、たとえばパークホールダ−（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒ
）最小培地（Ｂｏｓｔｉａｎ， Ｋ． Ｌ．ら、『プロ
シージング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ
・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ
．υＳＡ）７７．４５０５（１９８０））や０．５％カ
ザミノ酸を含有するＳＤ培地（Ｂｉｔｔｅｒ＋Ｇ．Ａ．
ら、ｒプロシージング・オブ・ザ・ナショナル・アカデ
ミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ，Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵｓＡ）８１，５３３０（１９８４））が
挙げられる。培地のｐＨは約５〜８に調整するのが好ま
しい．培養は通常約２０℃〜３５℃で約２４〜７２時間
行い、必要に応じて通気や攪拌を加える。
は、たとえばパークホールダ−（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒ
）最小培地（Ｂｏｓｔｉａｎ， Ｋ． Ｌ．ら、『プロ
シージング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ
・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ
．υＳＡ）７７．４５０５（１９８０））や０．５％カ
ザミノ酸を含有するＳＤ培地（Ｂｉｔｔｅｒ＋Ｇ．Ａ．
ら、ｒプロシージング・オブ・ザ・ナショナル・アカデ
ミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ，Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵｓＡ）８１，５３３０（１９８４））が
挙げられる。培地のｐＨは約５〜８に調整するのが好ま
しい．培養は通常約２０℃〜３５℃で約２４〜７２時間
行い、必要に応じて通気や攪拌を加える。
宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、培地と
しては，たとえば約５〜２０％の胎児牛血清を含むＭＥ
Ｍ培地（サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）１２２，５０１
（１９５２））， ＤＭＥＭ培地〔ヴイロロジー（Ｖｉ
ｒｏ−１ｏｇｙ），８，３９６（１９５９））， Ｒ
Ｐ Ｍ Ｉ １ ６ ４ ０培地〔ジャーナノレ・オブ
・ザ・アメリカン・メディカル゜アソシエーション（Ｔ
ｈｅ Ｊｏｕｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ
Ｍｅｄｉｃａｌ ＡｓｓｏＣｉａｔｉｏｎ） １９９，
５１９（１９６７））， １ ９ ９培地〔プロシージ
ング・オブ・ザ・ソサイエテイ・フォー・ザ・バイオロ
ジカル・メディスン（Ｐｒｏ−ｃｅｅｄｉｎｇ ｏｆ
ｔｈｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｂｉｏｌｏ
ｇｉｃａｌＭｅｄｉｃｉｎｅ）７３， １ （１９５０
））などが挙げられる．ｐＨは約６〜８であるのが好ま
しい。培養は通常約３０℃〜４０℃で約１５〜６０時間
行い、必要に応じて通気や攪拌を加える． 上記培養物からエンドセリンの前駆体蛋白質や成熟エン
ドセリンファミリーを分離精製するには、例えば下記の
方法により行なうことができる。
しては，たとえば約５〜２０％の胎児牛血清を含むＭＥ
Ｍ培地（サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）１２２，５０１
（１９５２））， ＤＭＥＭ培地〔ヴイロロジー（Ｖｉ
ｒｏ−１ｏｇｙ），８，３９６（１９５９））， Ｒ
Ｐ Ｍ Ｉ １ ６ ４ ０培地〔ジャーナノレ・オブ
・ザ・アメリカン・メディカル゜アソシエーション（Ｔ
ｈｅ Ｊｏｕｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ
Ｍｅｄｉｃａｌ ＡｓｓｏＣｉａｔｉｏｎ） １９９，
５１９（１９６７））， １ ９ ９培地〔プロシージ
ング・オブ・ザ・ソサイエテイ・フォー・ザ・バイオロ
ジカル・メディスン（Ｐｒｏ−ｃｅｅｄｉｎｇ ｏｆ
ｔｈｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｂｉｏｌｏ
ｇｉｃａｌＭｅｄｉｃｉｎｅ）７３， １ （１９５０
））などが挙げられる．ｐＨは約６〜８であるのが好ま
しい。培養は通常約３０℃〜４０℃で約１５〜６０時間
行い、必要に応じて通気や攪拌を加える． 上記培養物からエンドセリンの前駆体蛋白質や成熟エン
ドセリンファミリーを分離精製するには、例えば下記の
方法により行なうことができる。
エンドセリンの前邸体たんぱくや成熟エンドセリンファ
ミリーを培養菌体あるいは細胞から抽出するに際しては
，培養後、公知の方法で菌体あるいは細胞を集め，これ
を適当な緩衝液に懸濁し，超音波、リゾチームおよび／
または凍結融解などによって菌体あるいは細胞を破壊し
たのち、遠心分離やろ過によりエンドセリンの前郷体蛋
白質や成熟ペプチド（エンドセリンファミリー）の粗抽
出液を得る方法などが適宜用い得る。緩衝液の中に尿素
や塩酸グアニジンなどのたんぱく変性剤や，トリトンＸ
−１００などの界面活性剤が含まれていてもよい。
ミリーを培養菌体あるいは細胞から抽出するに際しては
，培養後、公知の方法で菌体あるいは細胞を集め，これ
を適当な緩衝液に懸濁し，超音波、リゾチームおよび／
または凍結融解などによって菌体あるいは細胞を破壊し
たのち、遠心分離やろ過によりエンドセリンの前郷体蛋
白質や成熟ペプチド（エンドセリンファミリー）の粗抽
出液を得る方法などが適宜用い得る。緩衝液の中に尿素
や塩酸グアニジンなどのたんぱく変性剤や，トリトンＸ
−１００などの界面活性剤が含まれていてもよい。
培養液中にエンドセリン前都体蛋白質や或熟ペプチド（
エンドセリンファミリー）が分泌される場合には、培養
終了後、それ自体公知の方法で菌体あるいは細胞と上清
とを分離し、上清を集める。
エンドセリンファミリー）が分泌される場合には、培養
終了後、それ自体公知の方法で菌体あるいは細胞と上清
とを分離し、上清を集める。
このようにして得られた培養上清、あるいは抽出液中に
含まれるエンドセリン前駆体蛋白質や成熟ペプチド（エ
ンドセリンファミリー）の精製は、自体公知の分離・精
製法を適切に組み合わせて行なうことができる。、これ
らの公知の分離，精製法としては，塩析や溶媒沈澱法な
どの溶解度を利用する方法，透析法、限外ろ過法、ゲル
ろ過法、およびＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳
動法などの主として分子量の差を利用する方法，イオン
交換クロマトグラフイーなどの荷電の差を利用する方法
，アフイニテイーク口マトグラフイーなどの特異的親和
性を利用する方法，逆相高速液体クロマトグラフイーな
どの疎水性の差を利用する方法，等電点電気泳動法など
の等電点の差を利用する方法などが挙げられる． なお、組換え体が産生するエンドセリン前郭体蛋白質や
成熟ペプチド（エンドセリンファミリー）を，精製前ま
たは精製後に適当な蛋白修飾酵素を作用させることによ
り，任意に修飾を加えたり，ポリペプチドを部分的に除
去することもできる。
含まれるエンドセリン前駆体蛋白質や成熟ペプチド（エ
ンドセリンファミリー）の精製は、自体公知の分離・精
製法を適切に組み合わせて行なうことができる。、これ
らの公知の分離，精製法としては，塩析や溶媒沈澱法な
どの溶解度を利用する方法，透析法、限外ろ過法、ゲル
ろ過法、およびＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳
動法などの主として分子量の差を利用する方法，イオン
交換クロマトグラフイーなどの荷電の差を利用する方法
，アフイニテイーク口マトグラフイーなどの特異的親和
性を利用する方法，逆相高速液体クロマトグラフイーな
どの疎水性の差を利用する方法，等電点電気泳動法など
の等電点の差を利用する方法などが挙げられる． なお、組換え体が産生するエンドセリン前郭体蛋白質や
成熟ペプチド（エンドセリンファミリー）を，精製前ま
たは精製後に適当な蛋白修飾酵素を作用させることによ
り，任意に修飾を加えたり，ポリペプチドを部分的に除
去することもできる。
蛋白修飾酵素としては，トリプシン、キモトリプシン，
アルギニルエンドペプチダーゼ，プロテインキナーゼな
どが挙げられる。
アルギニルエンドペプチダーゼ，プロテインキナーゼな
どが挙げられる。
かくして生成するエンドセリン前駆体蛋白質や成熟ペプ
チド（エンドセリンファミリー）の活性は特異抗体を用
いたエンザイムイムノアツセイなどにより測定すること
ができる。また生成物に血管収縮活性がある場合は、該
活性を指標にして測定することもできる。
チド（エンドセリンファミリー）の活性は特異抗体を用
いたエンザイムイムノアツセイなどにより測定すること
ができる。また生成物に血管収縮活性がある場合は、該
活性を指標にして測定することもできる。
走里騒凱果
本発明のエンドセリンファミリー発現ベクターでＤＮＡ
感染または形質転換した菌体や細胞では、大量のエンド
セリンー１，エンドセリンー２およびエンドセリンー３
前關体たんぱくや成熟ペプチド（エンドセリンファミリ
ー）を産生せしめることができ、エンドセリン前駆体た
んぱくや成熟ペプチド生産を有利に導くことができる。
感染または形質転換した菌体や細胞では、大量のエンド
セリンー１，エンドセリンー２およびエンドセリンー３
前關体たんぱくや成熟ペプチド（エンドセリンファミリ
ー）を産生せしめることができ、エンドセリン前駆体た
んぱくや成熟ペプチド生産を有利に導くことができる。
本発明の記載の組換えＤＮＡプラスミドは新規なもので
あり、前記の先願（特願昭６３−１４８１５８号，同６
３−２７４４５４号）に記載の酵母形質転換体に比べ、
本発明記載の酵母形質転換体では少なくとも５０倍のエ
ンドセリンの産生量の増加が得られ、動物細胞によって
も産生量の増加が得られる。
あり、前記の先願（特願昭６３−１４８１５８号，同６
３−２７４４５４号）に記載の酵母形質転換体に比べ、
本発明記載の酵母形質転換体では少なくとも５０倍のエ
ンドセリンの産生量の増加が得られ、動物細胞によって
も産生量の増加が得られる。
ここに製造されーるエンドセリン前駆体やエンドセリン
ファミリーは低血圧治療剤や局所血管収縮剤としても利
用することができるのみならず、生体の血管収縮反応の
メカニズムの解析や血管収縮因子のアンタゴニストの解
明の手掛かりを与えるものである。
ファミリーは低血圧治療剤や局所血管収縮剤としても利
用することができるのみならず、生体の血管収縮反応の
メカニズムの解析や血管収縮因子のアンタゴニストの解
明の手掛かりを与えるものである。
例えば、エンドセリンファミリーは血管収縮剤として種
々の出血、例えば胃や食道の出血を防止するような効果
を有する。また腸管に作用し腸管の運動を調節する効果
を有する。またこのものは種々のショック症状を回復さ
せる効果をも有する。
々の出血、例えば胃や食道の出血を防止するような効果
を有する。また腸管に作用し腸管の運動を調節する効果
を有する。またこのものは種々のショック症状を回復さ
せる効果をも有する。
このペプチドは経口的、局所的、静注もしくは非経口的
に投与することができるが、局所もしくは静注投与が好
ましい。投与量は０．００１μｇ−１００μｇ／ｋｇ．
好ましくは０．Ｏｌμｇ〜１０μｇ／ｋｇであり、体重
に応じた投与量を１〜ｌｏｍＱの生理的食塩水中に溶解
して用いる。
に投与することができるが、局所もしくは静注投与が好
ましい。投与量は０．００１μｇ−１００μｇ／ｋｇ．
好ましくは０．Ｏｌμｇ〜１０μｇ／ｋｇであり、体重
に応じた投与量を１〜ｌｏｍＱの生理的食塩水中に溶解
して用いる。
エンドセリンファミリーは副或分を含む乳剤、水和剤、
錠剤、水溶剤、粉剤、粒剤，カプセル剤，丸刑などの種
々の形態に製剤化したものとして使用できる。副成分と
しては、薬理的に許容され得る賦形剤、崩壊剤、滑沢剤
、結合剤、分散剤、可塑剤、充填剤、担体などが用いら
れる。これらの副成分の例としては、賦形剤としては乳
糖、ぶどう糖、白糖などが、崩壊剤としては澱粉，アル
ギン酸ナトリウム、寒天末，カルボキシメチルセルロー
ズカルシウムなどが，滑沢剤としてはステアリン酸マグ
ネシウム，タルク、流動パラフィンなどが、結合剤とし
ては単シロップ，ゼラチン溶液，エタノール，ポリビニ
ルアルコールなどが，分散剤としてはメチルセルロース
，エチルセルロース、セラックなどが，可塑剤としては
グリセリン、澱粉などが挙げられる． 以上，エンドセリン前駆体および成熟ペプチド（エンド
セリンファミリー）の発現ベクターの作製と、それらに
よる形質転換体の製造、該形質転換体を用いたエンドセ
リン前駆体たんぱくおよび或熟ペプチド（エンドセリン
ファミリー）の製造及びその有用性等について詳細に述
べた。
錠剤、水溶剤、粉剤、粒剤，カプセル剤，丸刑などの種
々の形態に製剤化したものとして使用できる。副成分と
しては、薬理的に許容され得る賦形剤、崩壊剤、滑沢剤
、結合剤、分散剤、可塑剤、充填剤、担体などが用いら
れる。これらの副成分の例としては、賦形剤としては乳
糖、ぶどう糖、白糖などが、崩壊剤としては澱粉，アル
ギン酸ナトリウム、寒天末，カルボキシメチルセルロー
ズカルシウムなどが，滑沢剤としてはステアリン酸マグ
ネシウム，タルク、流動パラフィンなどが、結合剤とし
ては単シロップ，ゼラチン溶液，エタノール，ポリビニ
ルアルコールなどが，分散剤としてはメチルセルロース
，エチルセルロース、セラックなどが，可塑剤としては
グリセリン、澱粉などが挙げられる． 以上，エンドセリン前駆体および成熟ペプチド（エンド
セリンファミリー）の発現ベクターの作製と、それらに
よる形質転換体の製造、該形質転換体を用いたエンドセ
リン前駆体たんぱくおよび或熟ペプチド（エンドセリン
ファミリー）の製造及びその有用性等について詳細に述
べた。
本発明明細書および図面において，塩基やアミノ酸など
を略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵ Ｂ Ｃｏｍ
ｍｉｓｉｏｎ ｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏａ
＋ｅｎｃｌａｔｕｒｅによる略号あるいは当該分野にお
ける慣用略号に基づくものであり，その例を下記する。
を略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵ Ｂ Ｃｏｍ
ｍｉｓｉｏｎ ｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏａ
＋ｅｎｃｌａｔｕｒｅによる略号あるいは当該分野にお
ける慣用略号に基づくものであり，その例を下記する。
またアミノ酸に関し光学異性体があり得る場合は、特に
明示しなければＬ一体を示すものとする。
明示しなければＬ一体を示すものとする。
ＤＮＡ ：デオキシリボ核酸
ｃＤＮＡ：相補的デオキシリボ核酸
Ａ ：アデニン
Ｔ ：チミン
Ｇ ：グアニン
Ｃ ：シトシン
ＲＮＡ ：リボ核酸
ｍＲＮＡ ：メッセンジャーリボ核酸
ｄＡＴＰ：デオキシアデノシン三リン酸ｄＴＴＰ：デオ
キシチミジン三リン酸 ｄＧＴＰ：デオキシグアノシン三リン酸ｄＣＴＰ：デオ
キシシチジン三リン酸 ＡＴＰ ：アデノシン三リン酸 ＥＤＴＡ：エチレンジアミン四酢酸 ＳＤＳ ：ドデシル硫酸ナトリウム ＥＩＡ ：エンザイムイムノアッセイＧｌｙまたはＧ
：グリシン ＡｌａまたはＡ ：アラニン ＶａｌまたはＶ ：バリン ＬｅｕまたはＬ ：ロイシン Ｉ１ｅまたは工 ：インロイシン ＳｅｒまたはＳ ：セリン ＴｈｒまたはＴ ：スレオニン ＣｙｓまたはＣ ：システイン ＭｅｔまたはＭ ：メチオニン ＧｌｕまたはＥ ：グルタミン酸 ＡｓｐまたはＤ ：アスパラギン酸 ＬｙｓまたはＫ ：リジン ＡｒｇまたはＲ ：アルギニン ＨｉｓまたはＨ ：ヒスチジン ＰｈｅまたはＦ ：フェニールアラニンＴｙｒまたはＹ
：チロシン ＴｒｐまたはＷ ：トリプトファン ＰｒｏまたはＰ ：プロリン ＡｓｎまたはＮ ：アスパラギン ＧｌｎまたはＱ ：グルタミン なお、本発明のヒト・エンドセリン前駆体や或熟ペプチ
ド（エンドセリンファミリー）においては，そのアミノ
酸配列の一部が修飾（付加，除去、その他のアミノ酸へ
の置換など）されていてもよい。
キシチミジン三リン酸 ｄＧＴＰ：デオキシグアノシン三リン酸ｄＣＴＰ：デオ
キシシチジン三リン酸 ＡＴＰ ：アデノシン三リン酸 ＥＤＴＡ：エチレンジアミン四酢酸 ＳＤＳ ：ドデシル硫酸ナトリウム ＥＩＡ ：エンザイムイムノアッセイＧｌｙまたはＧ
：グリシン ＡｌａまたはＡ ：アラニン ＶａｌまたはＶ ：バリン ＬｅｕまたはＬ ：ロイシン Ｉ１ｅまたは工 ：インロイシン ＳｅｒまたはＳ ：セリン ＴｈｒまたはＴ ：スレオニン ＣｙｓまたはＣ ：システイン ＭｅｔまたはＭ ：メチオニン ＧｌｕまたはＥ ：グルタミン酸 ＡｓｐまたはＤ ：アスパラギン酸 ＬｙｓまたはＫ ：リジン ＡｒｇまたはＲ ：アルギニン ＨｉｓまたはＨ ：ヒスチジン ＰｈｅまたはＦ ：フェニールアラニンＴｙｒまたはＹ
：チロシン ＴｒｐまたはＷ ：トリプトファン ＰｒｏまたはＰ ：プロリン ＡｓｎまたはＮ ：アスパラギン ＧｌｎまたはＱ ：グルタミン なお、本発明のヒト・エンドセリン前駆体や或熟ペプチ
ド（エンドセリンファミリー）においては，そのアミノ
酸配列の一部が修飾（付加，除去、その他のアミノ酸へ
の置換など）されていてもよい。
実１１肚
以下の参考例および実施例により本発明をより具体的に
説明するが，本発明はこれらに限定されるものではない
。
説明するが，本発明はこれらに限定されるものではない
。
後述の実施例ｌ及び２で得られた形質転換体サツ力口ミ
セスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍ ｃｅｓ ｃｅｒ
ｅｖｉｓｉａｅ） ２０Ｂ −１２／ ｐ Ｔ Ｓ ２
０１３およびＳａｃｃｈａｒｏｍ ｃｅｓ ｃｅｒｅｖ
ｉｓｉａｅ ２ＯＢ −１２／ ｐ Ｔ Ｓ ２０１４
は平或ｌ年６月２３日に通商産業省工業技術院微生物工
業技術研究所（Ｆ Ｒ Ｉ ）に各々受託番号Ｆ．ＥＲ
ＭＢＰ−２４８７、ＦＥＲＭ ＢＰ−２４８８として寄
託され，また該微生物は平或ｌ年６月９日から財団法人
発酵研究所（ＩＦＯ）に各々受託番Ｈｐｏ１０４７１、
ＩＦＯ １０４７２として寄託されている。
セスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍ ｃｅｓ ｃｅｒ
ｅｖｉｓｉａｅ） ２０Ｂ −１２／ ｐ Ｔ Ｓ ２
０１３およびＳａｃｃｈａｒｏｍ ｃｅｓ ｃｅｒｅｖ
ｉｓｉａｅ ２ＯＢ −１２／ ｐ Ｔ Ｓ ２０１４
は平或ｌ年６月２３日に通商産業省工業技術院微生物工
業技術研究所（Ｆ Ｒ Ｉ ）に各々受託番号Ｆ．ＥＲ
ＭＢＰ−２４８７、ＦＥＲＭ ＢＰ−２４８８として寄
託され，また該微生物は平或ｌ年６月９日から財団法人
発酵研究所（ＩＦＯ）に各々受託番Ｈｐｏ１０４７１、
ＩＦＯ １０４７２として寄託されている。
参】Ｌ倒一
（１）動物細胞を宿主とするヒト・エンドセリン−１発
現ベクターの構築 プラスミドｐＨＥＴ４−３ （伊藤ら，ＦＥＢＳレター
ズ（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ），２３１，４４０（１
９８８）］を制限酵素Ｅ ｃ ｏ Ｒ ．１で消化し、
ヒト・エンドセリン−１ ｃＤＮＡを含有するＤＮＡ
断片を得た。このようにして得られた１．１７ｋｂ断片
２．５μｇをＴ４ＤＮＡポリメラーゼで処理して平滑末
端とし、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いてＢｇｌ ＩＩリ
ンカーｄ（ＣＡＧＡＴＣＴＣ）と結合させた。このよう
にして得られたＤＮＡをＢｇｌ ＩＩで消化してＤＮ
Ａ断片の両端部にＢｇｌ Ｉ１部位を設けた。このＤ
ＮＡＩ片を、ＳＶ４０プロモーターおよびポリアデニル
化シグナル部位を有するｐ Ｔ Ｂ ５５１のＢｇｌ
■部位にＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて柿人した。この結
合されたＤＮＡ生成物を、ＬＢ培養液を含有するｌ．５
％アガー板上でアンピシリンの存在下（５０ｕ ｇ ／
ｍｌ）でＥ．ｃｏｌｉ ＤＨＩを形質転換するのに用
いた．ＳＶ４０プロモーターの下、正常な読取り枠でヒ
ト・プレプロ・エンドセリンｃＤＮＡを有するプラスミ
ドをｐＴｓ６００３と命名した（第１図）。
現ベクターの構築 プラスミドｐＨＥＴ４−３ （伊藤ら，ＦＥＢＳレター
ズ（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ），２３１，４４０（１
９８８）］を制限酵素Ｅ ｃ ｏ Ｒ ．１で消化し、
ヒト・エンドセリン−１ ｃＤＮＡを含有するＤＮＡ
断片を得た。このようにして得られた１．１７ｋｂ断片
２．５μｇをＴ４ＤＮＡポリメラーゼで処理して平滑末
端とし、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いてＢｇｌ ＩＩリ
ンカーｄ（ＣＡＧＡＴＣＴＣ）と結合させた。このよう
にして得られたＤＮＡをＢｇｌ ＩＩで消化してＤＮ
Ａ断片の両端部にＢｇｌ Ｉ１部位を設けた。このＤ
ＮＡＩ片を、ＳＶ４０プロモーターおよびポリアデニル
化シグナル部位を有するｐ Ｔ Ｂ ５５１のＢｇｌ
■部位にＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて柿人した。この結
合されたＤＮＡ生成物を、ＬＢ培養液を含有するｌ．５
％アガー板上でアンピシリンの存在下（５０ｕ ｇ ／
ｍｌ）でＥ．ｃｏｌｉ ＤＨＩを形質転換するのに用
いた．ＳＶ４０プロモーターの下、正常な読取り枠でヒ
ト・プレプロ・エンドセリンｃＤＮＡを有するプラスミ
ドをｐＴｓ６００３と命名した（第１図）。
（２）ｐＧＬＤ９０６−２０の構築
参考例１に記載のプラスミドｐＨＥＴ４−３（１０μｇ
）を制限酵素ＢｇＱＩ１とＥｃｏＲＩ （ともに宝酒
造（株）〕で消化した後、アガロースゲル電気泳動を用
いて、ヒト・プレプロ・エンドセリンー１のコード領域
を含む１．０１Ｋｂ ＤＮＡ断片を分離した。本ＤＮＡ
断片（２μｇ）に１ユニットのＤＮＡポリメラーゼ■・
Ｋｌｅｎｏｗフラグメント〔宝酒造（株）〕を加え、反
応液（７ ａ＋Ｍ Ｔｒｉｓ−Ｈ ＣＱ，ｐｉ｛７．５
／２０ｍＭ ＮａＣｆｌ／７ｍＭ ＭｇＣＱ，／０．１
ｍＭ ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＴＴＰ）中で
３７℃、１時間反応させ、ＤＮＡ末端の平滑化を行った
．次にＸｈｏｌリンカー，ｄ（ＣＣＴＣＧＡＧＧ）［宝
酒造（株）］を０．１μｇ加え．Ｔ４ＤＮＡリガーゼ〔
宝酒造（株） ）１００ユニットを用いて反応液（６６
ｍＭ Ｔｒｉｓ−｝｛ Ｃ Ｑ ， ｐ Ｈ７．６／
６．６ｍ Ｍ ＭｇＣ Ｑ ．／ １０ｍ Ｍジチオス
レイトール／０．１ｍＭ ＡＴＰ）中で１４℃、１６時
間反応させ、Ｘｈｏｌリンカーを付加した。さらに２０
ユニットの制限酵素ｘｈｏｌ（（株）ニツボンジーン〕
を加え、３７℃，３時間反応を行い，ＤＮＡ断片のトリ
ミングを行った。本ＤＮＡ断片０．５μｇと、酵母用発
現ベクターｐＧ Ｌ Ｄ９０６− １ （特開昭６１−
４３９９１号）を制限酵素Ｓａｌｌで切断して得られた
９．４Ｋｂ ＤＮＡ断片０．１μｇを２０ユニットのＴ
４ＤＮＡリガーゼを用いて上記の反応液中で連結し、Ｅ
．ｃｏ１ｉＤＨ１（モレキュラークローニング（Ｍｏｌ
ｅｅｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒ
ｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， １９
８２〕の形質転換を行った。得られたアンピシリン耐性
の形質転換体からプラスミドｐＧ Ｌ Ｄ９０６− ２
０を分離した（第２図）。
）を制限酵素ＢｇＱＩ１とＥｃｏＲＩ （ともに宝酒
造（株）〕で消化した後、アガロースゲル電気泳動を用
いて、ヒト・プレプロ・エンドセリンー１のコード領域
を含む１．０１Ｋｂ ＤＮＡ断片を分離した。本ＤＮＡ
断片（２μｇ）に１ユニットのＤＮＡポリメラーゼ■・
Ｋｌｅｎｏｗフラグメント〔宝酒造（株）〕を加え、反
応液（７ ａ＋Ｍ Ｔｒｉｓ−Ｈ ＣＱ，ｐｉ｛７．５
／２０ｍＭ ＮａＣｆｌ／７ｍＭ ＭｇＣＱ，／０．１
ｍＭ ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＴＴＰ）中で
３７℃、１時間反応させ、ＤＮＡ末端の平滑化を行った
．次にＸｈｏｌリンカー，ｄ（ＣＣＴＣＧＡＧＧ）［宝
酒造（株）］を０．１μｇ加え．Ｔ４ＤＮＡリガーゼ〔
宝酒造（株） ）１００ユニットを用いて反応液（６６
ｍＭ Ｔｒｉｓ−｝｛ Ｃ Ｑ ， ｐ Ｈ７．６／
６．６ｍ Ｍ ＭｇＣ Ｑ ．／ １０ｍ Ｍジチオス
レイトール／０．１ｍＭ ＡＴＰ）中で１４℃、１６時
間反応させ、Ｘｈｏｌリンカーを付加した。さらに２０
ユニットの制限酵素ｘｈｏｌ（（株）ニツボンジーン〕
を加え、３７℃，３時間反応を行い，ＤＮＡ断片のトリ
ミングを行った。本ＤＮＡ断片０．５μｇと、酵母用発
現ベクターｐＧ Ｌ Ｄ９０６− １ （特開昭６１−
４３９９１号）を制限酵素Ｓａｌｌで切断して得られた
９．４Ｋｂ ＤＮＡ断片０．１μｇを２０ユニットのＴ
４ＤＮＡリガーゼを用いて上記の反応液中で連結し、Ｅ
．ｃｏ１ｉＤＨ１（モレキュラークローニング（Ｍｏｌ
ｅｅｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒ
ｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， １９
８２〕の形質転換を行った。得られたアンピシリン耐性
の形質転換体からプラスミドｐＧ Ｌ Ｄ９０６− ２
０を分離した（第２図）。
（３ ） ｐＧ Ｌ Ｄ９０６−２１の構築プラスミド
ｐ Ｇ Ｌ Ｄ９０６−２０ （参考例２）をＢａｍＨ
ＩおよびＨｉｎｄ ｍで消化し、この断片をＭ１３ｍ
ｐ１ｇのＢａｍ ＨｌおよびＨｉｎｄＩ［［部位に挿入
した。次いで，合戒プライマー ｄ （ＣＧＧＧＡＧＴ
ＧＴＴＴＴＡＣＣＡＡＡＴＧＡＴＧ）を用いて特定部位
指向性変異を行い，エンドセリンの第２２番目のアミノ
酸であるパリンを停止コドンＴＡＡに変換させた。この
ＤＮＡ断片をｐＧＬＤ９０６−２０のＢａｍ ＨＩおよ
びＨｉｎｄ ＩＩ１部位に挿入した。このようにして
得られたプラスミドをｐ Ｇ Ｌ Ｄ９０６−２１ （
第３図）と命名した。
ｐ Ｇ Ｌ Ｄ９０６−２０ （参考例２）をＢａｍＨ
ＩおよびＨｉｎｄ ｍで消化し、この断片をＭ１３ｍ
ｐ１ｇのＢａｍ ＨｌおよびＨｉｎｄＩ［［部位に挿入
した。次いで，合戒プライマー ｄ （ＣＧＧＧＡＧＴ
ＧＴＴＴＴＡＣＣＡＡＡＴＧＡＴＧ）を用いて特定部位
指向性変異を行い，エンドセリンの第２２番目のアミノ
酸であるパリンを停止コドンＴＡＡに変換させた。この
ＤＮＡ断片をｐＧＬＤ９０６−２０のＢａｍ ＨＩおよ
びＨｉｎｄ ＩＩ１部位に挿入した。このようにして
得られたプラスミドをｐ Ｇ Ｌ Ｄ９０６−２１ （
第３図）と命名した。
去４４例」一 酵母を宿主とするエンドセリン分泌発現
ベクターｐ Ｔ Ｓ ２０１３の構築と酵母への導入プ
ラスミドｐ Ｍ Ｆ ａ ８ （Ｍｉｙａｊｉｍａ Ａ
．ら，ジーン（Ｇｅｎｅ）３７，１５５（１９８５））
２ ｐ ｇを、制限酵素Ｓｔｕ亙 〔宝酒造（株）〕
で消化し、ｐＭＦα８の線状ＤＮＡ断片を得た。
ベクターｐ Ｔ Ｓ ２０１３の構築と酵母への導入プ
ラスミドｐ Ｍ Ｆ ａ ８ （Ｍｉｙａｊｉｍａ Ａ
．ら，ジーン（Ｇｅｎｅ）３７，１５５（１９８５））
２ ｐ ｇを、制限酵素Ｓｔｕ亙 〔宝酒造（株）〕
で消化し、ｐＭＦα８の線状ＤＮＡ断片を得た。
参考例（２）に記載のプラスミドｐ Ｇ Ｌ Ｄ９０６
−２０ ２０μｇを制限酵素Ｘｈｏｌ（宝酒造（株）〕
で消化した後、１％のアガロース電気泳動を用いてヒト
・プレプロエンドセリンー■のコード領域を含む１．０
２ ｋｂ Ｄ Ｎ Ａ断片を分離した。本ＤＮＡ断片（
１ μｇ）を制限酵素Ｈａｅ■とＨ ａ ｅ ｍ〔とも
に宝酒造（株）〕で消化し、次にＴ４ＤＮＡポリメラー
ゼ〔宝酒造（株）〕を作用させ，ＤＮＡ末端の平滑化を
行った。次にこれを１．２％のアガロース電気泳動にか
け、ヒト・エンドセリン一１と前邸体のＣＯＯＨ一末端
側のコード領域を含む０．５ ｋｂ ＤＮＡ断片を分離
した．上記のＳｊｕｌ消化したｐＭＦａ８ ０．１μｇ
と、０．５ ｋｂ ＤＮＡ断片０．０５μｇをＴ４ＤＮ
Ａリガーゼ〔宝酒造（株）〕を用いて連結し．Ｅ．ｃｏ
ｌｉＤＨ１（モレキュラークローニング（Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，（１９８
９））の形質転換を行った。得られたアンピシリン耐性
の形質転換体から、プラスミドｐ Ｔ Ｓ ２０１３を
分離した（第４図）。
−２０ ２０μｇを制限酵素Ｘｈｏｌ（宝酒造（株）〕
で消化した後、１％のアガロース電気泳動を用いてヒト
・プレプロエンドセリンー■のコード領域を含む１．０
２ ｋｂ Ｄ Ｎ Ａ断片を分離した。本ＤＮＡ断片（
１ μｇ）を制限酵素Ｈａｅ■とＨ ａ ｅ ｍ〔とも
に宝酒造（株）〕で消化し、次にＴ４ＤＮＡポリメラー
ゼ〔宝酒造（株）〕を作用させ，ＤＮＡ末端の平滑化を
行った。次にこれを１．２％のアガロース電気泳動にか
け、ヒト・エンドセリン一１と前邸体のＣＯＯＨ一末端
側のコード領域を含む０．５ ｋｂ ＤＮＡ断片を分離
した．上記のＳｊｕｌ消化したｐＭＦａ８ ０．１μｇ
と、０．５ ｋｂ ＤＮＡ断片０．０５μｇをＴ４ＤＮ
Ａリガーゼ〔宝酒造（株）〕を用いて連結し．Ｅ．ｃｏ
ｌｉＤＨ１（モレキュラークローニング（Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，（１９８
９））の形質転換を行った。得られたアンピシリン耐性
の形質転換体から、プラスミドｐ Ｔ Ｓ ２０１３を
分離した（第４図）。
プラスミドｐＴ８２０１３３μｇを用いて、プロトプラ
スト法（ ｌ｛ｉｎｎｅｎら、プロシージングス・オブ
・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・ユ
ーエスエー（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ１．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
ｔｌＳＡ），７５， １９２７（１９８９））によりサ
ツ力口ミセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍ ｃｅｓ
ｃｅｒｅｖｉｓＬａｅ）２０Ｂ−１２（Ｍｉｙａｊｉ
ｍａ Ａ．ら，ジーン（Ｇｅｎｅ）３７． １５５（１
９８５））の形質転換を行った。その結果、トリプトフ
ァンを含まない培地で生育する形質転換体サツカロミセ
スセレビシエ２０Ｂ −１２／ ｐ Ｔ Ｓ ２０１３
を分離した。
スト法（ ｌ｛ｉｎｎｅｎら、プロシージングス・オブ
・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・ユ
ーエスエー（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ１．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
ｔｌＳＡ），７５， １９２７（１９８９））によりサ
ツ力口ミセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍ ｃｅｓ
ｃｅｒｅｖｉｓＬａｅ）２０Ｂ−１２（Ｍｉｙａｊｉ
ｍａ Ａ．ら，ジーン（Ｇｅｎｅ）３７． １５５（１
９８５））の形質転換を行った。その結果、トリプトフ
ァンを含まない培地で生育する形質転換体サツカロミセ
スセレビシエ２０Ｂ −１２／ ｐ Ｔ Ｓ ２０１３
を分離した。
去１虹鯉』ユ 酵母を宿主とするエンドセリン分泌発現
ベクターｐ Ｔ Ｓ ２０１４の構築と酵母への導入プ
ラスミドｐ Ｔ Ｓ ２０１４は、実施例１に記載した
構築と同じ方法で構築した（第４図）。異なるところは
、実施例１でプラスミドｐ Ｇ Ｌ Ｄ ９０６−２０
を用いたところを、代りに参考例（３）に記載のｐＧ
Ｌ Ｄ ９０６−２１を使用したことである。ｐＧＬＤ
９０６−２１は，成熟ペプチド（エンドセリンーエ）の
コード領域直後にストップコドンが存在する。したがっ
て，これを用いて構築されたｐ Ｔ Ｓ ２０１４は、
同様にエンドセリンー１のコード領域直後にストップコ
ドンが存在している． プラスミドｐＴ８２０１４３μｇを用いて、実施例１に
記載の方法で形質転換体サツカロミセスセレビシエ２０
Ｂ −１２／ ｐ Ｔ Ｓ ２０１４を分離した。
ベクターｐ Ｔ Ｓ ２０１４の構築と酵母への導入プ
ラスミドｐ Ｔ Ｓ ２０１４は、実施例１に記載した
構築と同じ方法で構築した（第４図）。異なるところは
、実施例１でプラスミドｐ Ｇ Ｌ Ｄ ９０６−２０
を用いたところを、代りに参考例（３）に記載のｐＧ
Ｌ Ｄ ９０６−２１を使用したことである。ｐＧＬＤ
９０６−２１は，成熟ペプチド（エンドセリンーエ）の
コード領域直後にストップコドンが存在する。したがっ
て，これを用いて構築されたｐ Ｔ Ｓ ２０１４は、
同様にエンドセリンー１のコード領域直後にストップコ
ドンが存在している． プラスミドｐＴ８２０１４３μｇを用いて、実施例１に
記載の方法で形質転換体サツカロミセスセレビシエ２０
Ｂ −１２／ ｐ Ｔ Ｓ ２０１４を分離した。
夾旌鮭１ ヒト・エンドセリンー１前駆体の分泌生産
実施例１で得られた形質転換体Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａ
ｅ２０Ｂ −１２／ ｐ Ｔ ８ ２σ１３と実施例２
で得られた形質転換体Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ２０
Ｂ −１２／ ｐ Ｔ Ｓ ２０１４にっいて以下の方
法によりこれらのヒト・エンドセリン生産能を調べた。
ｅ２０Ｂ −１２／ ｐ Ｔ ８ ２σ１３と実施例２
で得られた形質転換体Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ２０
Ｂ −１２／ ｐ Ｔ Ｓ ２０１４にっいて以下の方
法によりこれらのヒト・エンドセリン生産能を調べた。
１．５％平板培地に生育させた各形質転換体のコロニー
を５ｍｌの培養液（０，６７％ｙｅａｓｔ ｎｉｔｒｏ
ｇｅｎ ｂａｓｅ（Ｗ／Ｄアミノ酸） （ＤＩＦＣＯ
ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ），２％グルコース，０．
５％カザミノ酸， （ＤＩＦＣＯ ＬＡＢＯＲＡＴＯ
ＲＩＥＳ））に懸濁した後、３０℃． ２５０ｒｐｎ＋
で２日間培養した。さらにそのｌｍｌを９ｍｌの新鮮培
養液に入れ、３０℃、２５０ｒｐａ＋で２日間培養した
。得られた培養液を４℃、３０００ｒｐｍで１０分間遠
心分画し、培養上清を得た。
を５ｍｌの培養液（０，６７％ｙｅａｓｔ ｎｉｔｒｏ
ｇｅｎ ｂａｓｅ（Ｗ／Ｄアミノ酸） （ＤＩＦＣＯ
ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ），２％グルコース，０．
５％カザミノ酸， （ＤＩＦＣＯ ＬＡＢＯＲＡＴＯ
ＲＩＥＳ））に懸濁した後、３０℃． ２５０ｒｐｎ＋
で２日間培養した。さらにそのｌｍｌを９ｍｌの新鮮培
養液に入れ、３０℃、２５０ｒｐａ＋で２日間培養した
。得られた培養液を４℃、３０００ｒｐｍで１０分間遠
心分画し、培養上清を得た。
エンドセリンー１およびその前酩体の定量は、サンドイ
ッチ法に基づ＜ＥＩＡ（鈴木ら，ジャーナル・オブ・イ
ムノロジカル・メソズ（Ｊ，Ｉｍｍｕｎｏ１． Ｍｅｔ
ｈｏｄｓ） １１８，２４５（１９８９））によって行
った。
ッチ法に基づ＜ＥＩＡ（鈴木ら，ジャーナル・オブ・イ
ムノロジカル・メソズ（Ｊ，Ｉｍｍｕｎｏ１． Ｍｅｔ
ｈｏｄｓ） １１８，２４５（１９８９））によって行
った。
その結果各形質転換体は、いずれも培養上清中に相当量
のヒト・エンドセリンー１の抗原性を有する産物を生産
していることが判明した。
のヒト・エンドセリンー１の抗原性を有する産物を生産
していることが判明した。
形質転換体培養上清中のエンドセリン（ρＩＩｌｏｌｅ
／ｍｌ ｂｒｏｔｈ） ２０Ｂ −１２／ ｐ Ｔ Ｓ ２０１３
１５０２０Ｂ −１２／ ｐ Ｔ Ｓ ２０１４
７２０形質転換体２０Ｂ −１２／ ｐ Ｔ Ｓ
２０１３の産物は、エンドセリンー１の抗原性ととも
にプレプロエンドセリンー１の相補ＤＮＡによりコード
されるエンドセリンー１から下流の抗原性も有している
ことがＥＩＡで確認された。該産物は、その存在が推定
されているエンドセリン変換酵素の探索や、性質解明の
ための基質としても有用である。
／ｍｌ ｂｒｏｔｈ） ２０Ｂ −１２／ ｐ Ｔ Ｓ ２０１３
１５０２０Ｂ −１２／ ｐ Ｔ Ｓ ２０１４
７２０形質転換体２０Ｂ −１２／ ｐ Ｔ Ｓ
２０１３の産物は、エンドセリンー１の抗原性ととも
にプレプロエンドセリンー１の相補ＤＮＡによりコード
されるエンドセリンー１から下流の抗原性も有している
ことがＥＩＡで確認された。該産物は、その存在が推定
されているエンドセリン変換酵素の探索や、性質解明の
ための基質としても有用である。
一方形質転換体サツ力口ミセスセレビシエ２０Ｂ −１
２／ ｐ Ｔ Ｓ ２０１４の産物のＣ末端は、ｐ Ｔ
Ｓ ２０１４には人工的なストップコドンがあること
から予想されるように，エンドセリンー１のＣ末端と同
一であることがＥＩＡで確認された。
２／ ｐ Ｔ Ｓ ２０１４の産物のＣ末端は、ｐ Ｔ
Ｓ ２０１４には人工的なストップコドンがあること
から予想されるように，エンドセリンー１のＣ末端と同
一であることがＥＩＡで確認された。
失襄鮭土 酵母培養上清中のヒト・エンドセリンの精製
と、Ｎ末端およびＣ末端アミノ酸分析酵母形質転換体サ
ツ力口ミセスセレビシエ２０Ｂ −１２／ ｐ Ｔ Ｓ
２０１４の培養上清８ｍｌを減圧乾固した後，５００
μ１の６０％ＣＨ．ＣＮ，０．０５％ＴＦＡに溶かし、
その全量を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で
分画した。カラムはＴＳＫ．．ＯＤＳ ． ８０ＴＭ．
４．６Ｘ２５０ｎｖ＋を使用し，溶出液はＡ液として
５％Ｃ Ｈ．Ｃ Ｎ ， ０．０５％ＴＦＡ，Ｂ液とし
て６０％ＣＨ，ＣＮ，０．０５％ＴＦＡを使用し、Ｂ液
の割合がＯ、５、３０、３５、４５、４５．１分の時、
１０、５０． ８０、１００． １００、ｌＯ％にそれ
ぞれなるように４０’Ｃ，ｌｍｌ／分でｍ出した。その
結果、２４分後にＥＩＡによるエンドセリン活性が認め
られた．本活性画分についてＮ末端アミノ酸分析を行っ
たところ．Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−
Ｔｈ ｒ−Ｔｈ ｒ−Ｇ ｌ ｕ−Ａｓ ｐ−Ｇ ｌ
ｕ−Ｔｈ ｒ−Ａ ｌａ−Ｇｌｎ−Ｉ１ｅ−Ｐｒｏ−Ａ
ｌａ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｖａｔ−Ｉ１ｅ・・・であった
。これはヒト・エンドセリンー１のＮ末端側に，ベクタ
ーｐＭＦα８由来のリーダー配列が付加されていること
を示すものである（第５図）。
と、Ｎ末端およびＣ末端アミノ酸分析酵母形質転換体サ
ツ力口ミセスセレビシエ２０Ｂ −１２／ ｐ Ｔ Ｓ
２０１４の培養上清８ｍｌを減圧乾固した後，５００
μ１の６０％ＣＨ．ＣＮ，０．０５％ＴＦＡに溶かし、
その全量を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で
分画した。カラムはＴＳＫ．．ＯＤＳ ． ８０ＴＭ．
４．６Ｘ２５０ｎｖ＋を使用し，溶出液はＡ液として
５％Ｃ Ｈ．Ｃ Ｎ ， ０．０５％ＴＦＡ，Ｂ液とし
て６０％ＣＨ，ＣＮ，０．０５％ＴＦＡを使用し、Ｂ液
の割合がＯ、５、３０、３５、４５、４５．１分の時、
１０、５０． ８０、１００． １００、ｌＯ％にそれ
ぞれなるように４０’Ｃ，ｌｍｌ／分でｍ出した。その
結果、２４分後にＥＩＡによるエンドセリン活性が認め
られた．本活性画分についてＮ末端アミノ酸分析を行っ
たところ．Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−
Ｔｈ ｒ−Ｔｈ ｒ−Ｇ ｌ ｕ−Ａｓ ｐ−Ｇ ｌ
ｕ−Ｔｈ ｒ−Ａ ｌａ−Ｇｌｎ−Ｉ１ｅ−Ｐｒｏ−Ａ
ｌａ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｖａｔ−Ｉ１ｅ・・・であった
。これはヒト・エンドセリンー１のＮ末端側に，ベクタ
ーｐＭＦα８由来のリーダー配列が付加されていること
を示すものである（第５図）。
一方カルボキシペプチダーゼ法によるＣ末端アミノ酸分
析の結果、産物のＣ末端アミノ酸が予想通り、トリプト
ファンであることが判明した。
析の結果、産物のＣ末端アミノ酸が予想通り、トリプト
ファンであることが判明した。
叉凰鮭ｉ 酵母由来エンドセリン前駐体の成熟ペプチド
（エンドセリンー１）への変換 実施例４に記載の酵母由来のエンドセリン前駆体の成熟
ペプチドは直前が、Ａｒｇであるため（第５図）、トリ
プシンまたはアルギニンエンドペプチダーゼを作用させ
ることによって、産物に付加しているベクター由来のリ
ーダー配列を除去することができる。
（エンドセリンー１）への変換 実施例４に記載の酵母由来のエンドセリン前駆体の成熟
ペプチドは直前が、Ａｒｇであるため（第５図）、トリ
プシンまたはアルギニンエンドペプチダーゼを作用させ
ることによって、産物に付加しているベクター由来のリ
ーダー配列を除去することができる。
これを実証するため実施例４に記載のエンドセリン活性
部分（０．８μｇ）を１００μＭの５０ｍＭＴｒｉ ｓ
−ＨＣＱ （ｐＨ８．０）に溶解し、２Ｊｊｇのトリプ
シンまたはｌＯμｇのアルギニンエンドペプチダーゼ〔
宝酒造（株）〕を加え、３７℃で１０時間処理した。こ
れらを実施例４に記載の方法でＨＰＬＣで分画した結果
、化学合威したエンドセリンー１（ペプチド研究所）と
同一の挙動を示した。
部分（０．８μｇ）を１００μＭの５０ｍＭＴｒｉ ｓ
−ＨＣＱ （ｐＨ８．０）に溶解し、２Ｊｊｇのトリプ
シンまたはｌＯμｇのアルギニンエンドペプチダーゼ〔
宝酒造（株）〕を加え、３７℃で１０時間処理した。こ
れらを実施例４に記載の方法でＨＰＬＣで分画した結果
、化学合威したエンドセリンー１（ペプチド研究所）と
同一の挙動を示した。
これは、分子内の２組のジスルフィド結合も正しく形威
された或熟ペプチド（エンドセリンー１）が得られるこ
とを示すものである。また該ペプチドは、実施例６で記
載した通り生理活性を有していた。
された或熟ペプチド（エンドセリンー１）が得られるこ
とを示すものである。また該ペプチドは、実施例６で記
載した通り生理活性を有していた。
失笈鮭見 酵母由来エンドセリンー１の生物活性雄性
ウィスター（１＋ｌｉｓｔａｒ）系ラット（体重約３０
０ｇ）に右大腿静脈カニューレと左大腿静脈カニューレ
を挿入し、右大腿静脈カニューレを通じて検体を投与、
右大腿静脈圧を測定した。実施例５で得られた酵母由来
エンドセリンー１は、１ ｎ ｍｏｌ／瞳の投与量で３
０〜５０ｍｎ＋Ｈｇの血圧上昇作用を示した。これは，
化学合成したエンドセリンー１と同程度の生物活性であ
る。
ウィスター（１＋ｌｉｓｔａｒ）系ラット（体重約３０
０ｇ）に右大腿静脈カニューレと左大腿静脈カニューレ
を挿入し、右大腿静脈カニューレを通じて検体を投与、
右大腿静脈圧を測定した。実施例５で得られた酵母由来
エンドセリンー１は、１ ｎ ｍｏｌ／瞳の投与量で３
０〜５０ｍｎ＋Ｈｇの血圧上昇作用を示した。これは，
化学合成したエンドセリンー１と同程度の生物活性であ
る。
ｍ工 酵母培養上清中のヒト・エンドセリンの精製と、
Ｎ末端及びＣ末端アミノ酸 分析 酵母形質転換体サッカロミセスセレビシエ２０Ｂ−１２
／ｐＴｓ２０１３の培養上清４００ｍＱを限外ろ過（
Ａｍｉｃｏｎ ＹＭＩＯメンプラン）で約７ｍＱにまで
濃縮した後、これを０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ４．
８） ，０．１ｄ ＺｎＣＱ．．０．０１ｍＭ ＡＰＭ
ＳＦに対して４℃で５時間透折した。この透析内液にエ
ンドグリコシダーゼＨ（生化学工業）を０６２ユニット
加え、３７℃で一晩反応させることにより産物に付加し
ている糖鎖を除去した。次に２０ｍＭ Ｔ ｒ ｉ ｓ
−Ｈ Ｃ Ｑ（ｐ Ｈ８．０） ， １００ｍＭ Ｎ
ａ Ｃ Ｑ ， ０．１％ＣＨＡＰＳ，０．ＯｌｍＭ
Ａ Ｐ Ｍ Ｓ Ｆに対して４℃で５時間透析し、こ
れをＭ ｏ ｎ ｏ Ｑ力ラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）
を用いてイオン交換クロマトグラフィーを行い，エンド
セリンの抗原活性を有する両分を回収した。溶出はＮａ
ＣＱの濃度勾配（０．１ＭからＬＭ）によって行った。
Ｎ末端及びＣ末端アミノ酸 分析 酵母形質転換体サッカロミセスセレビシエ２０Ｂ−１２
／ｐＴｓ２０１３の培養上清４００ｍＱを限外ろ過（
Ａｍｉｃｏｎ ＹＭＩＯメンプラン）で約７ｍＱにまで
濃縮した後、これを０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ４．
８） ，０．１ｄ ＺｎＣＱ．．０．０１ｍＭ ＡＰＭ
ＳＦに対して４℃で５時間透折した。この透析内液にエ
ンドグリコシダーゼＨ（生化学工業）を０６２ユニット
加え、３７℃で一晩反応させることにより産物に付加し
ている糖鎖を除去した。次に２０ｍＭ Ｔ ｒ ｉ ｓ
−Ｈ Ｃ Ｑ（ｐ Ｈ８．０） ， １００ｍＭ Ｎ
ａ Ｃ Ｑ ， ０．１％ＣＨＡＰＳ，０．ＯｌｍＭ
Ａ Ｐ Ｍ Ｓ Ｆに対して４℃で５時間透析し、こ
れをＭ ｏ ｎ ｏ Ｑ力ラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）
を用いてイオン交換クロマトグラフィーを行い，エンド
セリンの抗原活性を有する両分を回収した。溶出はＮａ
ＣＱの濃度勾配（０．１ＭからＬＭ）によって行った。
この時、エンドセリンの最大抗原活性は，ＮａＣＱ濃度
が０．３Ｍ付近のところに溶出された。
が０．３Ｍ付近のところに溶出された。
次にＳａｐｈａｄｅｘ Ｇ−５０ ｓｕｐｅｒｆｉｎｅ
（ ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いてゲルろ過（１．５
Ｘ６４ａｎ）を行った。溶出液として１０ｍＭ Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣＱ （ｐＨ８．０） ， ５０ｍＭ Ｎａ
ｃＱ，０．１％ＣＨＡＰＳ，０，０１ｍＭ ＡＰＭＳＦ
を用い，流速は０．５ｍＱｌ分であった。エンドセリン
の抗原活性を有する画分７ｍｌｌを回収し，限外ろ過（
Ａｍｉｃｏｎ Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ １０）で．１．
５ｍＱにまで濃縮した。続いて２５μＱの濃縮液を高速
液体クロマトグラフィー（Ｈ Ｐ Ｌ Ｃ）で分画した
。カラムはＧ−３０００ ＰＷＸＬ． ７．８Ｘ３００
ｍｍを使用し、溶媒として２８．７％ＣＨ，ＣＮ，１４
．３％イソプロバノール，０．１％ＴＦＡ、流速は０．
７ｍ Ｑ ／分、また温度は室温で行った。この時エン
ドセリンの抗原活性はｌｌ分付近に溶出された。本活性
画分についてＮ末端アミノ酸分析を行ったところ，Ａｌ
ａ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ
−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−
Ｉ １ｅ−Ｐｒｏ−Ａ１ａ・●・ であった。これはヒト・エンドセリンー１のＮ末端側に
、ｐＭＦα８由来のリーダー配列が付加されていること
を示すものである。一方、カルボキシペプチダーゼ法に
よるＣ末端アミノ酸分析の結果，産物のＣ末端側からＳ
ｅｐ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ・・●
であることが判明した。これは、本産物のＣ末端が天然
に存在する ビッグーエンドセリンー１のＣ末端と同一
であることを示すものである。
（ ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いてゲルろ過（１．５
Ｘ６４ａｎ）を行った。溶出液として１０ｍＭ Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣＱ （ｐＨ８．０） ， ５０ｍＭ Ｎａ
ｃＱ，０．１％ＣＨＡＰＳ，０，０１ｍＭ ＡＰＭＳＦ
を用い，流速は０．５ｍＱｌ分であった。エンドセリン
の抗原活性を有する画分７ｍｌｌを回収し，限外ろ過（
Ａｍｉｃｏｎ Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ １０）で．１．
５ｍＱにまで濃縮した。続いて２５μＱの濃縮液を高速
液体クロマトグラフィー（Ｈ Ｐ Ｌ Ｃ）で分画した
。カラムはＧ−３０００ ＰＷＸＬ． ７．８Ｘ３００
ｍｍを使用し、溶媒として２８．７％ＣＨ，ＣＮ，１４
．３％イソプロバノール，０．１％ＴＦＡ、流速は０．
７ｍ Ｑ ／分、また温度は室温で行った。この時エン
ドセリンの抗原活性はｌｌ分付近に溶出された。本活性
画分についてＮ末端アミノ酸分析を行ったところ，Ａｌ
ａ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ
−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−
Ｉ １ｅ−Ｐｒｏ−Ａ１ａ・●・ であった。これはヒト・エンドセリンー１のＮ末端側に
、ｐＭＦα８由来のリーダー配列が付加されていること
を示すものである。一方、カルボキシペプチダーゼ法に
よるＣ末端アミノ酸分析の結果，産物のＣ末端側からＳ
ｅｐ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ・・●
であることが判明した。これは、本産物のＣ末端が天然
に存在する ビッグーエンドセリンー１のＣ末端と同一
であることを示すものである。
夫見鮭ｌ 酵母由来のエンドセリン前邸体のビッグーエ
ンドセリンー１への変換 実施例７に記載の産物は、ビッグーエンドセリンー１の
Ｎ末端側にｐＭＦα８由来のリーダー配列が付加した構
造であるため、このリーダー配列を除去することによっ
てビッグーエンドセリン−１を得ることができる。これ
を実証するため実施例５に記載の方法と同様の方法でト
リプシン処理を行った。これを実施例４に記載の方法で
ＨＰＬＣで分画した結果、化学合成したヒト・ビッグー
エンドセリンー１（ペプチド研究所）と同一のピークの
位置を示し、ビッグーエンドセリンー１が得られること
が確認された。
ンドセリンー１への変換 実施例７に記載の産物は、ビッグーエンドセリンー１の
Ｎ末端側にｐＭＦα８由来のリーダー配列が付加した構
造であるため、このリーダー配列を除去することによっ
てビッグーエンドセリン−１を得ることができる。これ
を実証するため実施例５に記載の方法と同様の方法でト
リプシン処理を行った。これを実施例４に記載の方法で
ＨＰＬＣで分画した結果、化学合成したヒト・ビッグー
エンドセリンー１（ペプチド研究所）と同一のピークの
位置を示し、ビッグーエンドセリンー１が得られること
が確認された。
ｇｍ一 動物細胞ＣＨＯ−Ｋｌにおけるヒト・エンドセ
リンの発現 参考例（１）に記載のプラスミドｐ Ｔ Ｓ ６００３
５／ｊｇと＋ ｐ Ｓ Ｖ ２ − ｎ ｅ ｏ ［
Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｐ．Ｉ．ら、ジャーナル・オブ・モ
レキュラー・アンド・アプライド・ジェネティクス（Ｊ
．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．） １ ，３２７（
１９８２）１０．２μｇを同時に５Ｘ１０’個のＣＨＯ
−Ｋ１細胞（Ｃｈｉｎｅｓｅ ｈａｍｓｔｅｒ ｏｖａ
ｌｌｙ ｃｅｌｌ）にエレクトロポレーション法〔高山
ら、細胞工学６，７７１（１９８７））により導入し、
Ｇ４１８に耐性を持った形質転換体を多数得た。これら
の形質転換体の一つを，１０％胎児牛血清を含有するＨ
ａｍ’ｓ ＦＩＺ培地で３７℃、５％ＣＯ２の条件で培
養した時のエントセリン蓄積量の変化を第６図に示す。
リンの発現 参考例（１）に記載のプラスミドｐ Ｔ Ｓ ６００３
５／ｊｇと＋ ｐ Ｓ Ｖ ２ − ｎ ｅ ｏ ［
Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｐ．Ｉ．ら、ジャーナル・オブ・モ
レキュラー・アンド・アプライド・ジェネティクス（Ｊ
．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．） １ ，３２７（
１９８２）１０．２μｇを同時に５Ｘ１０’個のＣＨＯ
−Ｋ１細胞（Ｃｈｉｎｅｓｅ ｈａｍｓｔｅｒ ｏｖａ
ｌｌｙ ｃｅｌｌ）にエレクトロポレーション法〔高山
ら、細胞工学６，７７１（１９８７））により導入し、
Ｇ４１８に耐性を持った形質転換体を多数得た。これら
の形質転換体の一つを，１０％胎児牛血清を含有するＨ
ａｍ’ｓ ＦＩＺ培地で３７℃、５％ＣＯ２の条件で培
養した時のエントセリン蓄積量の変化を第６図に示す。
第１図は動物細胞を用いたヒト・エンドセリンー１の発
現ベクターｐ Ｔ Ｓ ６００３の構築図である。 第２図は実施例１で使用したプラスミドｐＧＬＤ９０６
−２０の構築図である。第３図は実施例２で使用したプ
ラスミドｐ Ｇ Ｌ ０９０６−２１の構築図である。 第４図は酵母を用いたヒト・エンドセリンー１の発現ベ
クターｐ Ｔ Ｓ ２０１３と２０１４の構築図である
。 第５図は発現ベクターｐ Ｔ Ｓ ２０１４がコードす
るポリペプチドの一次構造を示したものである。第６図
はｐ Ｔ Ｓ ６００３で形質転換されたＣＨＯ−Ｋ１
細胞のヒト・エンドセリンー１産生を示すグラフである
。
現ベクターｐ Ｔ Ｓ ６００３の構築図である。 第２図は実施例１で使用したプラスミドｐＧＬＤ９０６
−２０の構築図である。第３図は実施例２で使用したプ
ラスミドｐ Ｇ Ｌ ０９０６−２１の構築図である。 第４図は酵母を用いたヒト・エンドセリンー１の発現ベ
クターｐ Ｔ Ｓ ２０１３と２０１４の構築図である
。 第５図は発現ベクターｐ Ｔ Ｓ ２０１４がコードす
るポリペプチドの一次構造を示したものである。第６図
はｐ Ｔ Ｓ ６００３で形質転換されたＣＨＯ−Ｋ１
細胞のヒト・エンドセリンー１産生を示すグラフである
。
Claims (14)
- （１）エンドセリンファミリーおよびその前駆体を、培
養上清中に分泌生産できるように構築した組換えＤＮＡ
。 - （２）シグナル配列をコードするＤＮＡを、エンドセリ
ンファミリーまたはその前駆体をコードするＤＮＡの５
′末端に付加した、請求項１記載の組換えＤＮＡ。 - （３）シグナル配列が酵母で機能するものである、酵母
用の請求項２記載の組換えＤＮＡ。 - （４）シグナルペプチドが酵母のメイティングファクタ
ーαである請求項３記載の酵母用組換えＤＮＡ。 - （５）シグナル配列がプレプロエンドセリン自体のもの
である動物細胞用の請求項２記載の組換えＤＮＡ。 - （６）請求項１または２記載のＤＮＡを保持する形質転
換体。 - （７）請求項３または４記載のＤＮＡを保持する形質転
換体酵母。 - （８）請求項５記載のＤＮＡを保持する形質転換動物細
胞。 - （９）動物細胞がＣＨＯ細胞である請求項８記載の形質
転換動物細胞。 - （１０）請求項６、７、８または９記載の形質転換体を
培養し、培養上清中にエンドセリンファミリーの抗原性
または生理活性を有するポリペプチドを生成蓄積せしめ
、これを採取することを特徴とする、該ポリペプチドの
製造方法。 - （１１）エンドセリン前駆体ポリペプチドから成熟型エ
ンドセリンを製造する工程を有する請求項１０記載のポ
リペプチドの製造方法。 - （１２）精製工程を更に付加した請求項１０または１１
記載のポリペプチドの製造方法。 - （１３）前駆体から成熟型エンドセリンを製造する方法
がプロテアーゼ処理である請求項１２記載の方法。 - （１４）請求項１０、１１、１２または１３記載の方法
で得られる、組換え体由来のエンドセリンファミリーま
たはその前駆体ポリペプチド。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP16390389 | 1989-06-28 | ||
| JP1-163903 | 1989-06-28 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0394682A true JPH0394682A (ja) | 1991-04-19 |
Family
ID=15783020
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1292284A Pending JPH0394682A (ja) | 1989-06-28 | 1989-11-13 | ペプチドの製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0394682A (ja) |
-
1989
- 1989-11-13 JP JP1292284A patent/JPH0394682A/ja active Pending
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