JPH0372884A - Ｄｎａおよびその用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はヒト血管収縮ペプチドたるエンドセリン−２を
コードするＤＮＡを含有するＤＮＡ、エンドセリン−２
の前駆体蛋白質（前駆体ポリペプチドともいう）および
成熟蛋白質（成熟ポリペプチドともいう）、該前駆体蛋
白質と成熟蛋白質〔エンドセリン−２〕の製造方法に関
し、またヒト・エンドセリン−３をコードするＤＮＡを
含有するＤＮＡ、ヒト・エンドセリン−３の前駆体蛋白
質およびエンドセリン−３の製造方法に関する。

本明細書において、前駆体蛋白質とは、成熟ペプチドの
アミノ酸配列を持ち、かつそのＮ末端側もしくはＣ末端
側、またはその両方に該ペプチドＤＮＡによってコード
されるアミノ酸配列の一部又は全部を持つような蛋白質
をさす。

〔従来の技術〕

内皮依存性の血管拡張反応とならんで、種々の刺激に対
する内皮依存性の血管収縮反応が報告されている。血管
の伸張や内圧の先進といった機械的負荷による収縮、ト
ロンビンによる収縮、血中酸素の減少による収縮、さら
にはニューロペプチドＹ〔プロシーディングズ・オブ・
ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンス・オブ
・ザ・ニー・ニス・ニー（Ｐｒｏｃ、　ＮａｔＬ、　Ａ
ｃａｄ、　Ｓｃｉ、、Ｕ、Ｓ。

Ａ、、）、７９．５４８５（１９８２）：同、　８１．
４５７７（１９８４））によるノルアドレナリン収縮の
増強などがその例である。

アメリカン・ジャーナル・オブ・フイジオロジー（Ａｍ
ｅｒ、　Ｊ、　Ｐｈｙｓｉｏｌ、）、２４８．Ｃ５５０
（１９８５）およびジャーナル・オブ・セル・フィジオ
ロジー（Ｊ、　Ｃｅ１ｌＰｈｙｓｉｏ１．）、１３２，
２６３（１，９８７）には内皮細胞由来の冠血管収縮因
子（分子量はそれぞれ８，５００．３，０００）が記載
されているが構造は不明である。また、ジャーナル・オ
ブ・ファーマコロジー・アンド・エクスペリメンタル・
セラビューティクス（Ｊ、　Ｐｈａｒｍａｃｌ。

Ｅｘｐ、　Ｔｈｅｒ、）　２３６．３３９　（１９８５
）にも内皮細胞由来のペプチド様物質が記載されている
が、これも構造は不明である。

一方、血管収縮作用を有するペプチドとしてバソプレッ
シン（Ｖａｓｏｐｒｅｓｓｉｎ）が知られていて、その
アミノ酸配列も明確にされているが、バソプレッシンが
哺乳類または鳥類の血管内皮細胞をオリジンとして得ら
れたという報告はない。また、血管収縮作用を有するア
ンジオテンシン（Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ）がウシ大動
脈の内皮細胞から得られるという報告〔サーキュレーシ
ョン・リサーチ（ＣｉｒｃｕｌａｔｉｏｎＲｅｓｅａｒ
ｃｈ）、６０，４２２（１９８７））があるが、アンジ
オテンシンは分子量約１　、０００のペプチドである。

また本発明者等の一部は同様の血管収縮作用を有するペ
プチドとして、先にブタ大動脈内皮細胞よりブタ・エン
ドセリンを単離することに成功しく特開平１−２０６９
９７号）、また本発明者等の一部はヒト・エンドセリン
の単離、ブタ・エンドセリンおよびヒト・エンドセリン
の相補ＤＮＡのクローニングにも成功している（特願昭
６２−２７５６１３号、同６２−３１３１５５号、同６
３−１４８１５８号および同６３−２７４４５４号）。

このブタおよびヒト・エンドセリンの成熟ポリペプチド
のアミノ酸配列は同一で、これをエンドセリン−１と呼
ぶ。

更に、本出願人は、ラット・エンドセリンの単離、相補
ＤＮＡのクローニングについても出願を行っており（特
願昭６３−１７４９３５号、および特願昭６３−１８８
０８３号）、これをエンドセリン−３と呼ぶ。

更に本出願人はマウス・エンドセリンの単離、相補ＤＮ
Ａのクローニングについても出願を行っており（特願昭
６３−２２３３８９号）、これをエンドセリンＢと呼ぶ
。

これらエンドセリン−１，Ｂ、−３のアミノ酸配列につ
いては、第３図にそれらを比較して示す。

なお、ここでエンドセリンは総称して、分子量２５００
±３００で、アミノ酸２１個からなるペプチドであり、
そのアミノ酸配列のＮ末端から数えで第１番目、第３番
目、第１１番目、第１５番目に位置する４個のＣｙｓが
２組のＳ−８結合を形成している構造を有するものであ
る。このジスルフィド結合の組合せとしては、１−１５
．３−１１の組合せ、および１−１１．３−１５の組合
せがあるが、前者の組合せのものの方が生成の割合が高
く、また活性も高い。

なお、これまで各種エンドセリンについては種々の呼び
方がされていたが、今回この呼び方を統一したもので、
以下に従来の呼び方と比較して示す。

生見獣　　　　　　毘米 エンドセリン−１エンドセリンＡ （ヒト・エンドセリン。

ブタ・エンドセリン） エンドセリンα エンドセリン−Ｂ　　エンドセリンＢ エンドセリンβ マウス・エンドセリン エンドセリン−３エンドセリンＣ エンドセリンγ ラット・エンドセリン 〔発明が解決しようとする課題〕 上記のように、各種動物より相同型のエンドセリンが見
出されているが同一動物種からの新規な相同型遺伝子は
見出されていない。そこで更に新規な相同型エンドセリ
ンを検索し、それらエンドセリンの構造、及び活性等の
研究を深め、それらの有用性について検討すること、及
び該新規ペプチドを遺伝子組み換え技術によりクローニ
ングし。

大量生産の道を拓くことが現在の課題である。

〔課題を解決するための手段〕

本発明者らは上記血管収縮作用を有するエンドセリンの
新規相同型遺伝子を採取し、しかもそれを遺伝子組み換
え技術によって製造することができれば、今後の研究、
治療に多大な効果を奏することができると考え、研究を
重ねた結果１次のような知見を得、本発明に到達したも
のである。

即ち、本発明者らは先に出願したヒト・エンドセリンの
一部をコードする合成ＤＮＡをプローブとして使用して
、ヒトゲノムＤＮＡライブラリーから、先のエンドセリ
ン−１〔ヒト・エンドセリン（エンドセリンＡ）］とは
異なるアミノ酸配列をもつエンドセリンをコードするＤ
ＮＡをクローニングすることに成功した。その結果、こ
れらを遺伝子組み換え技術によって大量に生産する道を
拓くことに成功したものである。本発明者等はこの新規
なアミノ酸配列のヒト・エンドセリンをエンドセリン−
２（ヒト・エンドセリンＡ−１１と呼ぶこともある）と
命名した。

更に本発明者等は上記のクローニングにおいて。

前記エンドセリン−３〔ラット・エンドセリン（エンド
セリンＣ））と成熟部分のアミノ酸配列は同一であるも
のの、それをコードする塩基配列が異なり、また前廓体
としてはアミノ酸配列の異なるエンドセリンを見出し、
該ＤＮＡをヒト・エンドセリン−３ＤＮＡ、前翻体をヒ
ト・エンドセリン−３前岨体蛋白質と名づけた。

本発明は（１）エンドセリン−２をコードするＤＮＡを
含有するＤＮＡ、（２）エンドセリン−２の前郷体蛋白
質および成熟ペプチド、（３）エンドセリン−２をコー
ドするＤＮＡを含有するＤＮＡを保持する形質転換体、
および（４）上記（３）の形質転換体の培養、培養物中
への蛋白質の生産蓄積、採取を包含する成熟エンドセリ
ン−２の製造方法に関するものであり、更に（５）ヒト
・エンドセリン−３をコードするＤＮＡを含有するＤＮ
Ａ、（６）工ノドセリン−３前邸体、（７）エンドセリ
ン−３をコードするＤＮＡ＆含有するＤＮＡを保持する
形質転換体、および（８）上記（７）の形質転換体の培
養、培養物中への蛋白質の生産蓄積、採取を包含する成
熟エンドセリン−３の製造方法に関するものである。本
発明のエンドセリン−２前邸体は式２のアミノ酸配列を
有するものである。

〔式２〕 １、　　２　　３　　４　　５　　６　　７　　８　　
９　　１０Ｈｉｓ　Ａｌａ　Ｇｉｎ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　
Ｈｉｓ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ａｒｇｌｌ、　　　
１２　１３　　１４　　１５　　１．６　　１７　１８
　　１９　２０Ａｒｇ　Ｃｙｓ　Ｓｅｒ　Ｃｙｓ　Ｓｅ
ｒ　Ｓｅｒ　Ｔｒｐ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　Ｌｙｓ２１　２
２　２３　２４　２５　２６　２７　２８　２９　３０
Ｇｌｕ　　Ｃｙｓ　　Ｖａｌ　　Ｔｙｒ　　Ｐｈｅ　　
Ｃｙｓ　　Ｈｉｓ　　Ｌｅｕ　　Ａｓｐ　　ｌ１ｅ３１
　　３２　３３　３４　　３５　３６　３７Ｉ］、ｅ　
　Ｔｒｐ　　Ｖａｌ　　Ａｓｎ　　Ｔｈｒ　　Ｐｒｏ　
　Ｇｌｕ本発明の、ヒト由来の成熟エンドセリンー１に
相当する、２１個のペプチドたる成熟エンドセリン−２
は〔式２〕の１２〜３２番目のアミノ酸配列からなるも
ので、これは即ち、〔式２′〕で表わされるものであり
、 〔式２′〕 Ｌｅｕ　Ａｓｐ　Ｉｌｅ　Ｉｌｅ　Ｔｒｐ　　　　　　
　　Ｍ、Ｗ、＝２５４７上記式中のアミノ酸の番号は成
熟エンドセリン−２のアミノ酸配列に関して第１番のＣ
ｙｓから番号をつけたものであり、前翻体エンドセリン
ー２の番号とは異なる。

上記式中、アンダーラインを施したアミノ酸がエンドセ
リンＡと異なるもので、エンドセリンー−１、ｅｕなる
アミノ酸を有している。

またＤＮＡ配列については、本発明のエンドセリン−２
をコードするＤＮＡは〔式１〕の塩基配列を含有するも
のであるかあるいはその一部であり、このものは公知の
エンドセリン−１，−３のＤＮＡ配列とは第２図に示す
ように大巾に異なっている。

〔式↓〕エンドセリンー２ ＣＧＴ　　ＴＧＣＴＣＣＴＧＣＡＧＣＴＣＣＴＧＧ　　
ＣＴＣＧＡＣＡＡＧＡＴＣＴＧＧ　　ＧＴＧ　　ＡＡＣ
ＡＣＴ　　ＣＣＴ　　ＧＡまた本発明のヒト・エンドセ
リン−３をコードするＤＮＡは〔式３〕の塩基配列を含
有するものであるか或いはその一部であり、これも公知
のものとは異なる新規なものである事は第２図に示す通
りである。

〔式３〕エンドセリンー３　　ＤＮＡ ＣＧＣＴＧＣＡＣＧ　　ＴＧＣＴＴＣＡＣＣＴＡＣＡＡ
Ｇ　　ＧＡＣＡＡＧＡＴＴ　　ＴＧＧ　　ＡＴＣＡＡＣ
ＡＣＴ　　ＣＣＣＧＡ成熟ペプチドに関する部分（式］
１，３のＮｏ　、　３４〜９６に当る）についても公知
のエンドセリンのＤＮＡとは異なっており１本発明のＤ
ＮＡは新規なものである。

本発明のヒト・エンドセリン−３前邸体は式（４）のア
ミノ酸配列を有し、このものは第２図からも判るように
ラット・エンドセリン−３前踵体とは異なるアミノ酸配
列を有する新規なものである。

〔式４〕 １　　２　　３　　４　　５　　６　　７　　８　　９
　　１０Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｈ
ｉｓ　Ｈｉｓ　Ａｒｇ　Ｓｅｒ　Ａｒｇｌｌ　　１２　
１３　１．４　１５　１６　１７　１８　１９　２０Ａ
ｒｇ　Ｃｙｓ　Ｔｈｒ　Ｃｙｓ　Ｐｈｅ　Ｔｈｒ　Ｔｙ
ｒ　Ｌｙｓ　Ａｓｐ　Ｌｙｓ２１　２２　２３　２４　
２５　２６　２７　２８　２９　３０Ｇｌｕ　Ｃｙｓ　
Ｖａｌ　Ｔｙｒ　Ｔｙｒ　Ｃｙｓ　Ｈｉｓ　Ｌｅｕ　Ａ
ｓｐ　ｌ１ｅ３１　３２　３３　３４　３５　３６　３
７ＩＩｓ　　Ｔｒｐ　　ＩＩｓ　　Ａｓｎ　　Ｔｈｒ　
Ｐｒｏ　Ｇｌｕ本発明のエンドセリン−２成熟ペプチド
（エンドセリン−２）をコードするＤＮＡとしては、エ
ンドセリン−２成熟ペプチドのアミノ酸配列（式２の１
２〜３２）をコードする塩基配列を含有するものであれ
ばいかなるものであってもよいが、たとえば〔式１〕の
塩基配列を含有するＤＮＡあるいはその一部のＤＮＡで
あることが好ましい。

〔式１〕の塩基配列は本発明で得られたエンドセリン−
２ＤＮＡ配列であり、〔式２′〕の成熟エンドセリン−
２アミノ酸をコードする塩基配列の一例としては〔式ｌ
〕のＮｏ、３４〜９６で表わされるものが挙げられる。

本発明方法におけるエンドセリン−２の成熟エンドセリ
ン−２をコードする塩基配列を有するＤＮＡを含有する
発現型ベクターは、例えば、（ｉ）エンドセリン−２産
生細胞からメツセンジャーＲＮ　Ａ　（ｍＲＮＡ）を分
離し、（ｉｔ）該ｍＲＮＡ　から単鎖の相補Ｄ　Ｎ　Ａ
　（ｅＤＮＡ）を、次いで二重鎖ＤＮＡを合成し、（ｊ
ｉｉ）該相補ＤＮＡをファージまたはプラスミドに組み
込み、（ｔｖ）得られた組み換えファージまたはプラス
ミドで宿主を形質転換し、（ｖ）得られた形質転換体を
培養後、形質転換体から適当な方法、例えばエンドセリ
ン−２の一部をコードするＤＮＡプローブとのハイブリ
ダイゼーションにより、あるいは抗エンドセリンー２抗
体を用いたイムノアッセイ法により目的とするＤＮＡを
含有するファージあるいはプラスミドを単離し。

（ｖｉ）その組み換えＤＮＡから目的とするクローン化
ＤＮＡを切り出し、（ｖＭ）該クローン化ＤＮＡまたは
その一部を発現ベクター中のプロモーターの下流に連結
する、ことにより製造することができる。

エンドセリン−２をコードするｍＲＮＡは１種々のエン
ドセリン産生細胞、例えばヒト大動脈内皮細胞、ヒト胎
盤などから得る事ができる。

エンドセリン−２産生細胞からＲＮＡを調製する方法と
しては、グアニジンチオシアネート法〔（ジェー・エム
・チルブライン（Ｊ、Ｍ、、Ｃｈｉｒｇｖｉｎ）ら、バ
イオケミストリー（ＢＩＯ−Ｃｈｅｍｌｓｔｒｙ）ｐ　
１８ｊ２９４（１，９７９）〕などが挙げられる。

このようにして得られたｍＲＮＡを鋳型とし、逆転写酵
素を用いて、例えば岡山（Ｈ，Ｏｋａｙａｍａ）らの方
法〔モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー（
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ａｎｄ　Ｃｅ１ｌｕｌａｒ　Ｂｉ
ｏｌｏｇｙ）２１６１（１９８２）および同誌３　２８
０（１９１３３））に従いｃ　Ｄ　Ｎ　Ａを合成し、得
られたｃＤＮＡをプラスミドに組み込む。

ｃＤＮＡを組み込むプラスミドとしては、たとえば大腸
菌由来のｐＢ　Ｒ３２２（ジーン（ｇｅｎｅ）　、２．
９５（１９７７））、ＰＢ　Ｒ３２５（ジーン、４Ｌ１
２１　（１９７８））　、ｐＵ　Ｃ１２〔ジーン、月■
、２５９（１９８２））、ｐＵｃ１３（ジーン、月桂２
５９（１９８２））、枯草菌由来のｐＵＢｌｌｏ（バイ
オケミカル・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケ
ーヨン（Ｂｉｏｃｈｅ＋＋１ｃａｌ　ａｎｄ　Ｂｉｏｐ
ｈｙｓｉｃａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｃ。

ｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ）、旦２６７８　（１９８３）
　）などが挙げられるが、その他のものであっても、宿
主内で複製増殖されるものであれば、いずれをも用いる
ことができる。またｃＤＮＡを組み込むファージベクタ
ーとしては、たとえばλｇｔｌｌ　（ヤング及びデーヴ
イス（Ｙｏｕｎｇ、　Ｒ，、ａｎｄ　Ｄａｖｉｓ、　Ｒ
，、）プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカ
デミ−・オブ・サイエンス・オブ・ザ・ニー・ニス・ニ
ー（Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、Ｕ、Ｓ、Ａ、）、８
０，１１９４（１９８３）３などが挙げられるが、その
他のものであっても宿主内で増殖できるものであれば用
いることができる。

プラスミドに組み込む方法としては、たとえば、ティー
・マニアティス（７Ｊａｎｉａｔｉｓ）ら、モレキュラ
ー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎ
ｇ）コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−（
ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　）［ａｒｂｏｒ　Ｌａ−ｂｏｒ
ａｔｏｒｙ）、第２３９頁（１９８２）に記載の方法な
どが挙げられる。またファージベクターにｃＤＮＡを組
み込む方法としては、たとえばヒューン（Ｉ（ｙｕｎｈ
、Ｔ、Ｖ、）らの方法〔デイ−・エヌ・ニークローニン
グアプラクティカルアプローチ（ＤＮＡ　Ｃｌｏｎｉｎ
ｇ、　Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ）　
１　、４９（１９８５））などが挙げられる。

このようにして得られたプラスミドは、適当な宿主たと
えばエシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属菌。

バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属菌などに導入する。

上記エシェリキア属菌の例としては、エシェリキア・コ
リ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）　Ｋ　１２Ｄ
　Ｈ１（プロシージング・オブ・ザ・ナショナル・アカ
デミ−・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　
Ａｃａｄ、　Ｓｃｊ、、υ、Ｓ。

Ａ、）１１６０（１９６８））、Ｍ２Ｏ３（ヌクレイツ
ク・アシッズ・リサーチｔ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ
ｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）、９３０９（１９８１））、Ｊ
Ａ２２１［ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロ
ジー（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂ
ｉｏｌｏｇｙ）］、１２０５１７（１９７８））、　Ｈ
ＢＩＯＩ（ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロ
ジーリユ４５９（１９６９））、Ｃ６００（ジェネティ
ックス（Ｇ　ｅ　ｎ　ｅ　ｔ　ｘ　ｃ　ｓ　）　ｐ　影
シ４４０　（１９５４）　３などが挙げられる。

上記バチルス属菌としては、たとえばバチルス・サチリ
ス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　　５ｕｂｔｉｌｉｓ）　Ｍ　Ｉ
　１１４（ジーン。

２Ａ、２５５（１９８３））、２０７−２１（ジャーナ
ル・オブ・バイオケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ
　Ｂｉｏｃｈｅａ＋１ｓｔｒｙ％８７（１９８４）３な
どが挙げられる。

プラスミドで宿主を形質転換する方法としては、たとえ
ばティー・マニアティス（Ｔ、　Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら
。

モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃ
ｌｏｎｉｎｇ）、コールド・スプリング・ハーバ−・ラ
ボラトリ−（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）　、第２４９頁（１９８２）に
記載のカルシウムクロライド法あるいはカルシウムクロ
ライド／ルビジウムクロライド法などが挙げられる。

またファージ・ベクターを用いる場合には、たとえば増
殖させた大腸菌にインビトロパッケージング法を用いて
導入することができる。

エンドセリン−２ｃＤＮＡを含有するヒト・ｃＤＮＡラ
イブラリーは上記の方法などで得ることが出来るが、市
販品として購入することも可能であり、例えばヒトのｃ
　Ｄ　Ｎ　Ａライブラリーはクローンチックラボラトリ
ーズ（Ｃ１ｏｎｔｅｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、
　Ｉｎｃ、、米国）から入手することができる。

ヒト・ＤＮＡライブラリーからエンドセリン−２ＤＮＡ
をクローニングする方法としては、例えばファージベク
ターλｃｈａｒｏｎ４　Ａとエンドセリン−２のアミノ
酸配列に基づいて化学合成したオリゴヌクレオチドをプ
ローブとして用いたプラークハイブリダイゼーション法
〔ティー・マニアティス（Ｔ、Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら、
モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃ
ｌｏｎｉｎｇ）コールド・スプリング・ハーバ−・ラボ
ラトリ−（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌ
ａ−ｂｏｒａｔｏｒｙ）　、　（１９８２）　）などが
挙げられる。このようにしてクローン化されたエンドセ
リン−２ＤＮＡは必要があればプラスミド、例えばｐＢ
Ｒ３２２゜ｐＵｃ１２．　ｐＵｃ１３．　ｐＵｃ１８．
　ｐＵｃ１９．　ｐＵｃｌｌｇ、ｐＵｃ１１９などにサ
ブクローニングしてエンドセリン−２ＤＮＡを得ること
ができる。

このようにして得られたＤＮＡの塩基配列を、たとえば
マキサム・ギルバート（Ｍａｘａｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔ）
法（Ｍａｘａｍ、　Ａ、　Ｍ、　ａｎｄ　Ｇ１１ｂｅｒ
ｔ、　Ｗ、、プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナ
ル・アカデミ−・オブ・サイエンス・オブ・ザ・ニー・
ニス・ニー（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓ
ｃｉ、、Ｕ、Ｓ、Ａ、）、７４，５６０（１９７７））
あるいはジデオキシ法（Ｍｅｓｓｉｎｇ、　Ｊ、ら、ヌ
クレイツク・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａ
ｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）９３０９（１９８１））
によって決定し、既知のアミノ酸配列との比較からエン
ドセリン−２ＤＮＡの存在を確認する。

以上のようにして、エンドセリン−２をコードするＤＮ
Ａ　（エンドセリン−２ＤＮＡ）（式上）が得られる。

後述の実施例２で得られたエンドセリン−２をコードす
るＤＮＡを含むＤＮＡおよびエンドセリン−３ＤＮＡを
含むＤＮＡの制限酵素断片地図を第１図に示す、またジ
デオキシ法で決定したＤＮＡの塩基配列を第２図に、そ
の塩基配列から判明したアミノ酸配列を第３図に示す。

上記のようにしてクローン化されたエンドセリン−２を
コードするＤＮＡは目的によりそのまま、または所望に
より制限酵素で消化して使用することが出来る。

クローン化されたＤＮＡから発現させたい領域を切り出
し、発現に適したビークル（ベクター）中のプロモータ
ーの下流に連結して発現型ベクターを得ることができる
。

該ＤＮＡはその５′末端に翻訳開始コドンとしてのＡＴ
Ｇを有し、また３′末端には翻訳終止コドンとしてのＴ
ＡＡ、ＴＧＡまたはＴＡＧを有していてもよい。これら
の翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、適当な合成りＮ
Ａアダプターを用いて付加することもできる。さらに該
ＤＮＡを発現させるにはその上流にプロモーターを接続
する。

ベクターとしては、上記の大腸菌由来のプラスミド（例
、ｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３２５，ｐＵＣ１２、ｐＵｃ１
３）、枯草菌由来プラスミド（例、ｐＵＢｌｌｏ、ｐＴ
Ｐ５．ｐｃ１９４）、酵母由来プラスミド（例、ｐｓＨ
１９，ｐｓＨ１５）。

あるいはλファージなどのバクテリオファージおよびレ
トロウィルス、ワクシニアウィルスなどの動物ウィルス
などが挙げられる。

本発明で用いられるプロモーターとしては、遺伝子の発
現に用いる宿主に対応して適切なプロモーターであれば
いかなるものでもよい。

形質転換する際の宿主がエシェリキア属菌である場合は
、ｔｒｐプロモーター　Ｑａｃプロモーター　ｒｅｃＡ
プロモーター　λＰＬプロモータ＋　ＱｐＰプロモータ
ーなどが、宿主がバチルス属菌である場合は、５ＰＯＬ
プロモーター、５ＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモ
ーターなど。

宿主が酵母である場合は、ＰＨ０５プロモーターＰＧＫ
プロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモータ
ーなどが好ましい。とりわけ宿主がエシェリキア属菌で
プロモーターがｔｒｐプロモーターまたはλＰＬプロモ
ーターであることが好ましい。

宿主が動物細胞である場合には、ＳＶ４０由来のプロモ
ーター、レトロウィルスのプロモーターメタロチオネイ
ンプロモーター、ヒートショックプロモーターなどがそ
れぞれ利用できる。

なお、発現にエンハンサ−の利用も効果的である。

このようにして構築されたエンドセリン−２の成熟ペプ
チド（エンドセリン−２）をコードするＤＮＡを含有す
るベクターを用いて、形質転換体を製造する。

宿主としては、たとえばエシェリキア属菌、バチルス属
菌、酵母、動物細胞などが挙げられる。

上記エシェリキア属菌、バチルス属菌の具体例としては
、前記したものと同様のものが挙げられる。

上記酵母としては、たとえばサツカロマイセスセレビシ
ェ（Ｓａｃｃａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ
）　Ａ　Ｈ２２＋ＡＨ２２Ｒ”−、ＮＡ、８７−１１Ａ
、ＤＫＤ−５Ｄなどが挙げられる。

動物細胞としては、たとえばサル細胞ＣＯ５−７、Ｖｅ
ｒｏ、チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ。

マウスＬ細胞、ヒトＦＬ細胞などが挙げられる。

上記エシェリキア属菌を形質転換するには、たとえばプ
ロシージング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オ
ブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、ＵＳＡ）　、６９．２１１０（１９７２）やジ
ーン、１７，１０７（１９８２）などに記載の方法に従
って行なわれる。

バチルス属菌を形質転換するには、たとえばモレキュラ
ー・アンド・ジェネラル・ジェネテイックス（Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ　＆　ＧｅｎｅｒａＩ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）
　、１６８，１１１（１９７９）などに記載の方法に従
って行なわれる。

酵母を形質転換するには、たとえばプロシージング・オ
ブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンス（
Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、ｓｃｉ、ＵｓＡ）　、
７５，１９２９（１９７８）に記載の方法に従って行な
われる。

動物細胞を形質転換するには、たとえばヴイロロジー（
ＶｉｒｏＬｏｇｙ）５２，４５６（１９７３）に記載の
方法に従って行なわれる。

このようにして、エンドセリン−２成熟ペプチド（エン
ドセリン−２）をコードするＤＮＡを含有する発現ベク
ターで形質転換された形質転換体が得られる。

宿主がエシェリキア属菌、バチルス属菌である形質転換
体を培養する際、培養に使用される培地としでは液体培
地が適当であり、その中には該形質転換体の生育に必要
な炭素源、窒素源、無機物その他が含有せしめられる。

炭素源としては、たとえばグルコース、デキストリン、
可溶性澱粉、シ５ｔｊＮなど、窒素源としては、たとえ
ばアンモニウム塩類、硝酸塩類、コーンスチープ・リカ
ーペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ
抽出液などの無機または有機物質、無機物としてはたと
えば塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マ
グネシウムなどが挙げられる。

また、酵母、ビタミン類、生長促進因子などを添加して
もよい。

培地のＰＨは約５〜８が望ましい。

エシェリキア属菌を培養する際の培地としては、例えば
グルコース、カザミノ酸を含むＭ９培地（ミラー（Ｍｉ
ｌｌｅｒ）　＋ジャーナル・オブ・エクスペリメンツ・
イン・モレキュラー・ジェネティックス（Ｊ。

ｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ　ｉｎ　Ｍ
ｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）。

４３１−４３３．Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏ
ｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　ＮｅｗＷｏｒｋ　１９７
２］が好ましい。ここに必要によりプロモーターを効率
よく働かせるために、たとえば３β−インドリルアクリ
ル酸のような薬剤を加えることができる。

宿主がエシェリキア属菌の場合、培養は通常約１５〜４
３℃で約３〜２４時間行い、必要により、通気や攪拌を
加えることもできる。

宿主がバチルス属菌の場合、培養は通常約３０〜４０℃
で約６〜２４時間行ない、必要により通気や攪拌を加え
ることもできる。

宿主が酵母である形質転換体を培養する際、培地として
は、たとえばパークホールダー（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒ
）最小培地（Ｂｏｓｔｉａｎ、　Ｋ、　Ｌ、ら、「プロ
シージング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ
・サイエンス（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ
、ＵＳＡ）７７．４５０５（１９８０））が挙げられる
。培地のｐＨは約５〜８に調整するのが好ましい。培養
は通常約２０℃〜３５℃で約２４〜７２時間行い、必要
に応じて通気や攪拌を加える。

宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、培地と
しては、たとえば約５〜２０％の胎児牛血清を含むＭＥ
Ｍ培地〔サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）１２２゜５０１
（１９５２））、　Ｄ　Ｍ　Ｅ　Ｍ培地〔ヴイロロジー
（Ｖｉｒｏ−１ｏｇｙ）、８，３９６（１９５９））、
　ＲＰ　Ｍ　Ｉ　１６４０培地〔ジャーナル・オブ・ザ
・アメリカン・メディカル・アソシエーション（Ｔｈｅ
　Ｊｏｕｎａｌ　ｏｆ　ｔｈｅ　ＡｍｅｒｉｃａｎＭｅ
ｄｉｃａｌ　Ａｓ５ｏｃｉａｔｉｏｎ）　１９９，５１
９（１９６７））、　１９９培地〔プロシージング・オ
ブ・ザ・ソサイエティ・フォー・ザ・バイオロジカル・
メディスン（Ｐｒｏ−ａｓｅｄｉｎｇ　ｏｆ　ｔｈｅ　
５ｏｃｉｅｔｙ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａ
ｌＭｅｄｉａｉｎｓ）７３．１　（１９５０））などが
挙げられる。ＰＨは約６〜８であるのが好ましい、培養
は通常約３０〜４０℃で約１５〜６０時間行い、必要に
応じて通気や攪拌を加える。

上記培養物からエンドセリン−２の成熟ペプチド（エン
ドセリン−２）を分離精製するには１例えば下記の方法
により行なうことができる。

エンドセリン−２の成熟ペプチドを培養菌体あるいは細
胞から抽出するに際しては、培養後、公知の方法で菌体
あるいは細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、超
音波、リゾチームおよび／または凍結融解などによって
菌体あるいは細胞を破壊したのち、遠心分離やろ過によ
りヒト・エンドセリンＡ−ＩＩの成熟ペプチドの粗抽出
液を得る方法などが適宜用い得る。緩衝液の中に尿素や
塩酸グアニジンなどのたんばく変性剤や、トリトンｘ−
ｉｏｏなどの界面活性剤が含まれていてもよい６培養液
中にエンドセリン−２前輛体たんばくや成熟ペプチドが
分泌される場合には、培養終了後、それ自体公知の方法
で菌体あるいは細胞と上清とを分離し、上清を集める。

このようにして得られた培養上清、あるいは抽出液中に
含まれるエンドセリン−２前駐体たんばくや成熟ペプチ
ドは、自体公知の分離・精製法を適切に組み合わせて行
なうことができる。これらの公知の分離、精製法として
は、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、透
析法、限外ろ適法、ゲルろ適法、および５ＤＳ−ポリア
クリルアミドゲル電気泳動法などの主として分子量の差
を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーなどの
荷電の差を利用する方法、アフィニティークロマトグラ
フィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液
体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法
、等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法な
どが挙げられる。

かくして生成するエンドセリン−２前駆体たんばくや成
熟ペプチドは特異抗体を用いたエンザイムイムノアッセ
イなどにより測定することができる。また生成物に血管
収縮活性がある場合は、該活性を指標にして測定するこ
ともできる。

なお、以上エンドセリン−２について詳しく述べたが、
エンドセリン−３についても同様のことが言える。

〔作用・効果〕

本発明のＤＮＡでＤＮＡ感染または形質転換した菌体や
細胞では、大量のエンドセリン−２やエンドセリン−３
成熟ペプチドを産生せしめることができ、これらのペプ
チド生産を有利に導くことができる。

ここに製造されるエンドセリン−２成熟ペプチド、エン
ドセリン−３は他のエンドセリン同様、低血圧治療剤や
局所血管収縮剤としても利用することができるのみなら
ず、生体の血管収縮反応のメカニズムの解析や血管収縮
因子のアンタゴニストの解明の手掛かりを与えるもので
ある。なお血管収縮性については、エンドセリン−２の
活性が高く、例えば従来のエンドセリンの２倍の活性を
有する。またこれらのエンドセリンは、血管収縮剤とし
て種々の出血、例えば胃や食道の出血を防止するような
効果を有する。またこのものは種々のショック症状を回
復させる効果をも有する。このペプチドは経口的、局所
的、静注もしくは非経口的に投与することができるが、
局所もしくは静注投与が好ましい。投与量は０．００１
μｇ〜１００μｇ／ｋｇ、好ましくは０．０１μｇ〜１
０μｇ／ｋｇであり、体重に応じた投与量を１〜１０ｍ
ｆｉの生理的食塩水中に溶解して用いる。

本発明のペプチドは該ペプチドおよび副成分を含む乳剤
、水和剤、錠剤、水溶剤、粉剤１粒剤、カプセル剤、丸
刑などの種々の形態に製剤化したものとして使用できる
。副成分としては、薬理的に許容され得る賦形剤、崩壊
剤、滑沢剤、結合剤、分散剤、可塑剤、充填剤、担体な
どが用いられる。

これらの副成分の例としては、賦形剤としては乳糖、ぶ
どう糖、白糖などが、崩壊剤としては澱粉。

アルギン酸ナトリウム、寒天末、カルボキシメチルセル
ローズカルシウムなどが、滑沢剤としてはステアリン酸
マグネシウム、タルク、流動パラフィンなどが、結合剤
としては単シロップ、ゼラチン溶液、エタノール、ポリ
ビニルアルコールなどが、分散剤としてはメチルセルロ
ース、エチルセルロース、セラックなどが、可塑剤とし
てはグリセリン、澱粉などが挙げられる。

本発明明細書および図面において、塩基やアミノ酸など
を略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−ＴＵ　Ｂ　Ｃｏｍ
ｍ１ｓｉｏｎ　ｏｎ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｎｏｍ
ｅｎｃｌａｔｕｒｅによる略号あるいは当該分野におけ
る慣用略号に基づくものであり、その例を下記する。ま
たアミノ酸に関し光学異性体があり得る場合は、特に明
示しなければＬ一体を示すものとする。

ＤＮＡ　　：デオキシリボ核酸 ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ　：相補的デオキシリポ核酸Ａ　　：ア
デニン Ｔ　　：チミン Ｇ　　ニゲアニン Ｃ：シトシン ＲＮＡ　　：リボ核酸 ｍＲＮＡ：メツセンジャーリポ核酸 ｄＡＴＰ：デオキシアデノシン三すン酸ｄＴＴＰ：デオ
キシチミジン三すン酸 ｄＧＴＰ：デオキシグアノシン三すン酸ｄＣＴＰ：デオ
キシシチジン三すン酸 ＡＴＰ　　：アデノシン三リン酸 ＥＤＴＡ：エチレンジアミン四酢酸 ＳＤＳ　　ニドデシル硫酸ナトリウム Ｇ１ｙまたはＧ　ニゲリシン ＡｌａまたはＡ　：アラニン ＶａｌまたはＶ　：バリン ＬｅｕまたはＬ　：ロイシン ＩＩｓまたは工　：イソロイシン ＳｅｒまたはＳ　：セリン ＴｈｒまたはＴ　：スレオニン ＣｙｓまたはＣニジスティン ＭｅｔまたはＭ　：メチオニン ＧｌｕまたはＥ　：グルタミン酸 ＡｓｐまたはＤ　＝アスパラギン酸 ＬｙｓまたはＫ　：リジン ＡｒｇまたはＲ：アルギニン ＨｉｓまたはＨ：ヒスチジン ＰｈｅまたはＦ　：フェニールアラニンＴｙｒまたはＹ
　：チロシン ＴｒｐまたはＷ　ニトリブトファン ＰｒｏまたはＰ　ニブロリン ＡｓｎまたはＮ　：アスパラギン ＧｌｎまたはＱ　：グルタミン なお、本発明のエンドセリン−２成熟ペプチド、エンド
セリン−３においては、そのアミノ酸配列の一部が修飾
（付加、除去、その他のアミノ酸への置換など）されて
いてもよい。

失髪旌 以下の参考例および実施例により本発明をより具体的に
説明するが１本発明はこれらに限定されるものではない
。

なお、実施例２で得られた形質転換体Ｅｓｃｈｅｒｉｃ
ｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＸＬ−１／ｐｇｈεＴ２Ｏ５Ｇ１お
よび実施例３で得られたＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏ
ｌｉ　ＸＬ−１／ｐｇｈＥＴ３Ｅ１は、昭和６３年１０
月２４日から通商産業省工業技術院微生物工業技術研究
所（ＦＲＩ）に各々、受託番号ＦＥＲＭ　　ＢＰ−２１
１８およびＦＥＲＭ　　ＢＰ−２１１９として寄託され
保管されている。

見象旌 （１）血管平滑筋収縮作用のアッセイ法内皮を注射針に
よる擦過にて除去したブタ右冠状動脈スパイラル標本（
０，５Ｘ２０　ｗｅ）を炭酸ガスと酸素の混合ガス（５
：９５、Ｖ／Ｖ）で飽和した３７℃のクレブス−リンゲ
ル液（３ｍ１２）中に懸垂する。刺激前張力（ｂａｓａ
ｌ　ｔｅｎｓｉｏｎ）を２ｇに設定したのち、張カドラ
ンスデューサーで等尺性張力を測定する。

（２）強心作用のアッセイ法 前記（１）のアッセイ法で用いたブタ右冠状動脈スパイ
ラル標本のかわりにモルモットの右心房の懸垂標本を使
用し、（１）と同じ操作を行って張力および毎分の心脈
数を測定する。

エンドセリン−１（ヒト・エンドセリンＩ）の７〜２０
残基目のアミノ酸配列 Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ｔ
ｙｒ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ、−Ａｓｐ−１
１ｅ−１１ｅ から予想されるメツセンジャーＲＮＡの配列を推定し、
次のような配列を持つ、ＤＮＡプローブを化学合成した
。

５′ ＡＴＧ　　ＧＡＣＡＡＧ　　ＧＡＧ　　ＴＧＴ　　ＧＴ
ＣＴＡＣＴＴＣＴＧＣＣＡＴ　　ＣＴＧ　　ＧＡＣ３′ ＡＴＣＡＴに のＤＮＡプローブの５′端をＴ４ポリヌクレオチドキナ
ーゼを用いて〔γ−”Ｐ）ＡＴＰ−りん酸化し、ゲノム
ＤＮＡライブラリーのスクリーニングに用いた。

大腸菌Ｌｅ３９２に前述のヒトゲノムＤＮＡライブラリ
ー（Ｃ１ｏｎｔｅｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　
Ｉｎｃ、製）を感染させてブレーティングし、ファージ
プラークを出現せしめた。ベントンとデイビス（Ｂｅｎ
ｔ。

ｎ、　Ｌｖ　Ｄａｖｉｓ、　Ｒ，）の報告〔サイエンス
（ＳｃｉｅｎｃｓＨ９６，１８０−１８２（１９７７）
）に従って、プラークＤＮＡの一部をナイロン膜にうつ
しとり、３２Ｐで標識した前項のＤＮＡプローブとプラ
ークハイブリダイゼーションを行なった。ハイブリダイ
ゼーションは２０％ホルムアミドの存在下、４２℃で行
ない該膜は０．２Ｘ　Ｓ　Ｓ　Ｃ、０，１％ＳＤＳ中で
２０℃で洗浄した。ハイブリダイゼーション陽性のクロ
ーンを単離し、そのうちのひとつであるλｇｈＥＴ２０
の戒熟体コード域を５ａｃｌで切り出してプラスミドｐ
Ｕｃ１１８にサブクローニングした。このプラスミドで
大腸菌ＸＬ−ｌを形質転換し、形質転換体エシェリキア
・コリＸＬ−１／　ｐ　ｇｈＥ　Ｔ　２０ＳＧ１を得た
。

このプラスミドに含まれるヒトゲノムＤＮＡ断片の簡単
な制限酵素地図を第１図に示した。図中の区域は以下の
ものを示す。

■　：エンドセリンー２７９熟体コード域この成熟体コ
ード域とその周辺の塩基配列をサンｊｆ　−（Ｓａｎｇ
ｅｒ）の方法〔プロシージングオブザナショナルアカデ
ミーオブサイエンス（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ、、　Ａｃａ
ｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、）７４．５４６３−５４
６７　（１９７７）〕によって決定した。この塩基配列
およびそれから推定されるアミノ酸配列を第２図（枠で
囲んだ部分が成熟ペプチド部）に示した。また第３図に
はこのヒト・エンドセリンＡ−１１成熟ペプチドのアミ
ノ酸配列と共に、先に見出しているエンドセリン−１，
−３の成熟ペプチドのアミノ酸配列を比較の為に示しで
ある。

実施例２と同様にして、ハイブリダイゼーション陽性の
クローンを単離し、そのうちのひとつであるλｇｈＥＴ
　３の成熟体コード域をＥｃｏＲＩで切り出してプラス
ミドｐＵｃ１１８にサブクローニングした。このプラス
ミドで大腸菌ＸＬ−ｌを形質転換し、形質転換体エシェ
リキア・コリＸＬ−１／　ｐ　ｇｈＥＴ３Ｅ１を得た。

このプラスミドに含まれるヒトゲノムＤＮＡ断片の簡単
な制限酵素地図を第１図に示した６図中の区域は以下の
ものを示す。

■　：エンドセリンー３ｔｉ、熟体コード域この成熟体
コード域とその周辺の塩基配列をサンガー（Ｓａｎｇｅ
ｒ　）の方法〔プロシージングオブザナショナルアカデ
ミーオブサイエンス（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ、　Ａｃａｄ
、　Ｓｃｉ、　Ｌｌ、Ｓ、Ａ、）７４．５４６３−５４
６７　（１９７７）〕によって決定した。この塩基配列
およびそれから推定されるアミノ酸配列を第２図に示し
た。

枠で囲った領域が、エンドセリン−３成熟ペプチド部で
ある。

実施例４ １）エンドセリン−２合成 市販のＢｏｃ−Ｔｒｐ　（ＣＨＯ）　−Ｐ　Ａ　Ｍ樹脂
、（アプライド・バイオシステムズ社製）　０．７ｇ　
（０，５ｍ　ｍｏｌｅ）を用い、ペプチド合成機（アプ
ライド・バイオシステムズ社製・モデル４３０Ａ）を使
用し、通常の方法により合成した。縮合方法は、樹脂上
のＢｏＣ基を塩化メチレン中５０％トリフルオロ酢酸で
処理し、末端アミノ基を遊離させ、この遊離のアミノ基
にＢｏｃ−ＩＩｓ、Ｂｏｃ−Ａｓｐ　（ＯＢｚｌ）、Ｂ
ｏＣ−Ｌｅｕ、Ｂｏｃ−Ｈｉｓ　（Ｔｏｓ）、Ｂｏａ−
Ｃｙｓ　（Ａｃｍ）、Ｂｏｃ−Ｔｙｒ（Ｂｒ−ｚ）＋　
Ｂｏｃ−Ｖａ　ｌ、Ｂｏｃ−Ｐｈｅ。

Ｂｏｃ−Ｇｌｕ　（ＯＢｚｌ）、Ｂｏｃ−Ｌｙｓ（ＣＱ
−Ｚ）、Ｂｏｃ−Ｔｒｐ　（ＣＨＯ）、Ｂ。

ｃ−８ｅｒ　（Ｂｚｌ）をＣ末端側よりエンドセリン−
２のアミノ酸配列通りに、ＤＣＣの存在下に縮合させる
反応をくり返した。

この様にして得られた保護エンドセリン−２樹脂２．５
３ｇのうち８９０■をアニソールＩＩＩＱ、工。

２−エタンジチオール１ｍＱで膨張させ、０℃でフッ化
水素１０ｍ　Ｑと６０分間処理した後、過剰のフッ化水
素を減圧留去した。残査をジエチルエーテル５ｍｆｌで
洗った後、トリフルオロ酢酸に抽出し、樹脂をろ去した
。トリフルオロ酢酸を減圧留去したのち、５０％−酢酸
水に溶解し、デキストランゲル〈セファデックスＧ−５
０）カラム（２Ｘ９０Ｑ１）に付し、同溶媒で溶出した
主分画を集め凍結乾燥し、１８０■の白色粉末を得た。

これの３１．を５％％−酢酸水４ｍＱに溶解し、トリフ
ルオロ酢酸第二水銀１９■を加え、室温で１６時間攪拌
したのち、ｎ−ブタノール１００ｍ１２．メタノール５
０ｒｎＱ。

水５０ｍＭを加え希釈し、硫化水素ガスを通じた。

これに５％−ＮＨ，ＯＨを加えてＰＨ８に調節したのち
、６時間空気酸化に付し、酢酸を加えｐＨ３としたのち
、凍結乾燥した。これを５０％−酢酸で充填したセファ
デックスＧ−５０のカラム（２×９０ａｍ）に付し、主
要分画を集め、さらにＨＰＬ、Ｃ（カラム：　ＹＭＣ，
溶媒：０．１％−トリフルオロ酢酸水と０．１％−トリ
フルオロ酢酸含有アセトニトリルの直線型濃度勾配溶出
）で分取し目的物１゜０■を得た。

合成エンドセリン−２は、ＨＰＬＣでエンドセリン−１
４０，２分に対し、４１．４分に溶出された。

カラム条件 Ｗａｋｏｓｉｌ　　５Ｃ１８（４，６Ｘ２５０ｎａ）溶
離液：Ａ液（０，１％−トリフルオロ酢酸水）Ｂ液（０
，１％−トリフルオロ酢酸含有アセトニトリル） を用いＡ液からＢ液へ直線型濃度勾配 溶出（５０分） 流速：　１．Ｏｍ　Ｑ　７分 アミノ酸分析値二　分析値（合成品中の個数）Ａｓｘ　
１．９２（２）　　　Ｓｅｒ　２．３１（３）　　　Ｇ
ｌｘ　１，０４（１）Ｃｙｓ　１．３０（１）　　　Ｖ
ａｌ　１．１６（１）　　　Ｉｌｅ　１．３５（１）Ｌ
ｅｕ　１．８５（２）　　　Ｔｙｒ　Ｏ，８９（１）　
　　Ｐｈｅ　１．０１（１））１ｉｓ　　１．１０（１
）　　　　　Ｌｙｓ　　１．０３（１）　　　　　Ｔｒ
ｐ　　（＊）　　（２）木酸氷解のためデータなし ここでのＳ−８結合位置は成熟エンドセリン−２のＣｙ
ｓの番号で示して、１−１５．３−１１の組合せであっ
た。

（ｉｔ）アッセイ 上記（ｉ）で得られたエンドセリン−２の活性が参考例
（１）の方法で測定された。

アッセイ法（１）（ブタ冠状動脈によるアッセイ）によ
るＥＤ、。は８〜１０　ＸＩＯ”’モル／Ｑであった・ （ｉｎ）注射剤の製造 （ｉ）で得られたエンドセリン−２１２μｇを生理的食
塩水に溶解し、ミリポアフィルタ−でろ過、次いで凍結
乾燥した。使用時に静注剤を製造するに当り、上記凍結
乾燥物を生理的食塩水に溶解し、全量を５ｍｆｌとして
注射剤とした。

第３図は第２図の塩基配列より推定されるエンドセリン
−２成熟ペプチドのアミノ酸配列、エンドセリン−１，
−３のアミノ酸配列を示す。

Claims (13)

【特許請求の範囲】
1. （１）エンドセリン−２をコードするＤＮＡを含有する
   ＤＮＡ。
2. （２）エンドセリン−２をコードするＤＮＡが〔式１〕
   の塩基配列を含有あるいはその一部で表わされる、請求
   項１記載のＤＮＡ。 〔式１〕 【遺伝子配列があります】
3. （３）エンドセリン−２の蛋白質。
4. （４）エンドセリン−２の前駆体が〔式２〕のアミノ酸
   配列で表される請求項３記載の蛋白質。 〔式２〕 【遺伝子配列があります】
5. （５）エンドセリン−２の成熟蛋白質が請求項４記載の
   〔式２〕の１２〜３２番目のアミノ酸配列で表される、
   請求項３記載の蛋白質。
6. （６）エンドセリン−２をコードするＤＮＡを含有する
   ＤＮＡを保持する形質転換体。
7. （７）請求項６記載の形質転換体を培養し、培養物中に
   成熟エンドセリン−２を生成蓄積せしめ、これを採取す
   ることを特徴とする成熟エンドセリン−２蛋白質の製造
   方法。
8. （８）ヒト・エンドセリン−３をコードするＤＮＡを含
   有するＤＮＡ。
9. （９）ヒト・エンドセリン−３をコードするＤＮＡが〔
   式３〕の塩基配列を含有あるいはその一部で表わされる
   、請求項８記載のＤＮＡ。 〔式３〕 【遺伝子配列があります】
10. （１０）ヒト・エンドセリン−３の前駆体蛋白質。
11. （１１）〔式４〕のアミノ酸配列で表される請求項１０
    記載の前駆体蛋白質。 〔式４〕 【遺伝子配列があります】
12. （１２）ヒト・エンドセリン−３をコードするＤＮＡを
    含有するＤＮＡを保持する形質転換体。
13. （１３）請求項１２記載の形質転換体を培養し、培養物
    中に成熟エンドセリン−３を生成蓄積せしめ、これを採
    取することを特徴とする成熟エンドセリン−３蛋白質の
    製造方法。