BR112014005788B1

BR112014005788B1 - variante de antitrispsina alfa-1, método de preparação da mesma, composição farmacêutica compreendendo a mesma fusão de variante de antitrispsina alfa-1

Info

Publication number: BR112014005788B1
Application number: BR112014005788-5A
Authority: BR
Inventors: Soon Jae Park; Hye-Shin Chung; Sang Mee Lee; Ji Sun Kim
Original assignee: Alteogen, Inc
Priority date: 2011-09-15
Filing date: 2012-08-13
Publication date: 2021-01-12
Also published as: JP2014534166A; EP2757110A1; KR101402702B1; AU2012309292A1; EP2757110B1; WO2013039295A1; CA2848919A1; MX349364B; CA2848919C; RU2567007C1; CN103827141B; BR112014005788A2; MX2014003183A; RU2014114790A; EP2757110A4; KR20130029713A; AU2012309292B2; US20140371160A1; JP6001074B2; CN103827141A

Abstract

Variante de antitripsina alfa-1, método de preparação da mesma e aplicação da mesma Uma nova variante de antitripsina alfa-1, um método de preparação da mesma e aplicação da mesma são fornecidos. A variante de antitripsina alfa-1 tem excelente estabilidade no corpo e mantém um efeito inibitório sobre atividades de elastase porque a meia-vida (t1/2) no sangue e a área sob a curva (AUC) de concentração de droga no sangue versus tempo são notavelmente aumentadas por adição de um sítio de N-glicosilação em células animais, através de mutação de aminoácido entre a 1ª e a 25ª posições do N-terminal de antitripsina alfa-1. Portanto, a variante de antitripsina alfa-1 pode ser útil na prevenção ou no tratamento da deficiência de antitripsina alfa-1.

Description

VARIANTE DE ANTITRISPSINA ALFA-1, MÉTODO DE PREPARAÇÃO DA MESMA, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA COMPREENDENDO A MESMA FUSÃO DE VARIANTE DE ANTITRISPSINA ALFA-1

Campo técnico

[001] A presente invenção se refere a uma nova variante de antitripsina alfa-1, a um método de preparação da mesma e à aplicação da mesma.

Antecedentes da Técnica

[002] A antitripsina alfa-1 é uma proteínas que é composta por 394 resíduos de aminoácidos, tem um peso molecular de aproximadamente 50, 000 Dalton (Da) e está presente no sangue de mamíferos. A antitripsina alfa-1 é uma das principais proteínas do sangue, cuja concentração no sangue importa em aproximadamente 2 mg/mL (Robin W. C. et. al, Nature, 298, 329-334, 1982), e também a ela se refere como um inibidor de protease alfa-1. A antitripsina alfa-1 tem pelo menos cerca de 100 alelos que ocorrem naturalmente, e seus fenótipos são classificados em categorias de A a Z, de acordo com os perfis de focalização isoelétrica (IEF). Dentre esses, sabe-se que o mais abundante alelo, tipo M, está presente no sangue da maioria dos seres humanos e tem pelo menos aproximadamente 75 isoformas diferentes (Brantley, M. et. al., Am. J. Med., 84(suppl. 6A), 13-31, 1988), e mantém uma função principal como um inibidor de protease.

[003] Em geral, sabe-se que aproximadamente 90 % das isoformas de antitripsina alfa-1 estão presentes como cinco subtipos PiM, tais como M1, M2, M3, M4 e M5. Dentre esses, M1, M2 e M3 estão distribuídos em aproximadamente 67 %, em aproximadamente 16 % e em aproximadamente 11 %, respectiva mente (Jan-Olof Jeppsson e Carl-Bertil Laurell, FEBS Lett., 231, 327-330, 1988). Dentre esses, sabe-se que os subtipos M2 e M3 têm histidina (His) e arginina (Arg) em uma 101a posição a partir do N-terminal, respectiva mente, e sabe-se que esta diferença de aminoácidos não tem efeito em atividades inatas da antitripsina alfa-1.

[004] A antitripsina alfa-1 é uma glicoproteína, que está glicosilada em 3 sítios (Mega, T. et. al., J. Biol. Chem., 255, 4057-4061, 1980). A estrutura cristalina por raios X mostra que ela é composta por 3 folhas beta e 8 hélices alfa, de maneira similar a outros inibidores de protease (serpinas) presentes no sangue (Elliot P. R., et. al., JMB, 275, 419-425, 1998). A antitripsina alfa-1 funciona para inibir vários tipos de proteases no corpo, e sua principal função in vivo associada com doenças, atualmente conhecida na técnica relacionada, é inibir as atividades de elastase de neutrófilos (Beatty et. al., J. Biol. Chem., 255, 3931~3934, 1980). A deficiência de antitripsina alfa-1 causa severas doenças, tal como enfisema pulmonar, na qual as funções pulmonares são prejudicadas devido à decomposição da elastina. Além disso, há um relato clínico mostrando que proteínas modificadas de antitripsina alfa-1 não são normalmente secretadas pelo fígado, mas que se acumulam no fígado, o que conduz ao início de cirrose hepática.

[005] Em anos recentes, vários produtos extraídos do sangue humano têm sido aprovados pela US Food and Drug Administration (FDA), e têm estado no mercado como agentes terapêuticos para tratar a deficiência de antitripsina alfa-1. Exemplos representativos dos produtos incluem Prolastin (comercialmente disponível a partir de Talecris Plasma Resources Inc), Aralast (comercialmente disponível a partir de Baxter Inc) e Zemaira (comercialmente disponível a partir de CSL Behring Inc), que são, de maneira geral, administrados em uma dose de 60 mg/Kg a um corpo humano, por injeção intravenosa, em intervalos de uma semana. Portanto, a proteína deve ser administrada semanalmente a um paciente adulto em uma grande dose de 4 a 5 g, durante um longo período de tempo.

[006] De acordo com a análise do Data Monitor (DMHC2364), provavelmente existem 200. 000 pacientes com problemas genéticos associados com antitripsina alfa-1 nos Estados Unidos e na Europa, mas somente alguns destas pacientes têm sido tratados, porque diagnósticos apropriados não são feitos. Todos os produtos atualmente desenvolvidos como finalidade médica são antitripsina alfa-1 extraída do sangue humano. Tal antitripsina alfa-1 extraída do sangue humano pode ter o risco de incluir vírus derivados do corpo humano, que podem causar doenças fatais aos seres humanos, tais como o vírus da imunodeficiência humana (HIV), vírus da hepatite B ou vírus da hepatite C, mesmo se eles forem completamente eliminados durante um procedimento de produção. Mesmo quando a antitripsina alfa-1 for submetida a um teste de seleção de sangue para detecção de vários patógenos e a um procedimento de inativação viral, é impossível erradicar patógenos raros que ainda não sejam conhecidos. Portanto, existe sempre um risco de infecção, por uso de antitripsina alfa-1 extraída do sangue, de patógenos desconhecidos no corpo humano. Além disso, o suprimento estável de sangue não contaminado usado para produzir uma quantidade comercialmente necessária de antitripsina alfa-1 tem sido problemático.

[007] Como uma alternativa para solucionar os problemas anteriormente mencionados, a tecnologia do ADN recombinante pode ser usada para desenvolver antitripsina alfa-1 como um agente terapêutico. Portanto, a tecnologia do ADN recombinante tem sido continuamente pesquisada, mas ainda não há antitripsina alfa-1 recombinante comercialmente disponível devido a vários fatores limitantes.

[008] Sabe se que a antitripsina alfa-1 humana tem 3 porções de N glicana, já que ela está glicosilada em 3 sítios (asparagina em uma 46ª posição, asparagina em uma 83ª posição e asparagina em uma 247ª posição). Uma vez que a antitripsina alfa-1 produzida por um método de ADN recombinante, usando um micro organismo tal como E. coli, não está glicosilada, sabe se que ela tem uma curta meia vida in vivo, quando administrada ao corpo (Karnaukhova et. al., Amino Acids, 30, 317 332, 2006, Garver Jr. et. al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 84, 1050 1054, 1987). Para solucionar esse problema e também produzir, de maneira efetiva, uma grande quantidade de antitripsina alfa-1, tem sido conduzida pesquisa pela expressão de antitripsina alfa-1 em plantas. No entanto, relatou se que, embora a antitripsina alfa-1 recombinante expressa em plantas contivesse glicosilação derivada de planta, ela tinha uma meia vida mais curta no corpo do que a antitripsina alfa-1 humana (Huang et. al., Biotechnol. Prog., 17, 126 133, 2001).

[009] Para aumentar a meia vida de antitripsina alfa-1 no corpo, Cantin et. al. relataram uma proteína de fusão, por conjugação de um poli(etileno glicol) a um resíduo de cisteína de antitripsina alfa-1 expressa em micro organismos (Cantin et. al., Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol., 27, 659 665, 2002). O artigo demonstrou que, quando um poli(etileno glicol) tendo um peso molecular de 20 a 40 KDa era conjugado ao resíduo de cisteína de antitripsina alfa-1 expressa em um micro organismo, a antitripsina alfa-1 conjugada tinha uma meia vida aumentada no corpo, comparada com a antitripsina alfa-1 expressa no micro organismo, resultando na meia vida substancialmente similar àquela da antitripsina alfa-1 humana. No entanto, quando um poli(etileno glicol) é conjugado a uma proteína, vários produtos de reação heterogêneos podem ser formados por reações químicas colaterais. Como um resultado, são necessários processos adicionais para remover os produtos de reação heterogêneos. Além disso, porque não há porções de N glicana em uma antitripsina alfa-1 conjugada a PEG, isso pode provocar problema de imunogenicidade pelas sequências de aminoácidos expostas, quando tratadas para seres humanos.

[0010] Sabe se que a antitripsina alfa-1 derivada de células animais tem substancialmente a mesma meia vida no corpo que a antitripsina alfa-1 humana (Garver Jr. et. al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 84, 1050 1054, 1987). Portanto, um método de produção de antitripsina alfa-1, tendo uma estrutura similar à antitripsina alfa-1 humana, em células animais, pode ser preferível. Apesar da vantagem de antitripsina alfa-1 derivada de células animais, a produção de antitripsina alfa-1 usando células animais tem um problema, no fato de que ela é, em geral, mais cara do que um método de produção de antitripsina alfa-1 em micro organismos.

[0011] Enquanto isso, a tecnologia de adicionar um sítio de glicosilação a uma região de laço de antitripsina alfa-1 tem sido sugerida para aumentar a meia vida in vivo de antitripsina alfa-1. Em geral, pode se presumir que, quando uma proteína expressa em células animais estiver glicosilada, a proteína pode ser considerada como tendo uma meia vida aumentada no corpo, devido ao volume hidrodinâmico aumentado da proteína glicosilada, quando administrada ao corpo humano, comparada com as proteínas que não estiverem glicosiladas. No entanto, conforme pode ser visto a partir dos exemplos de eritropoietinas, a alteração ou a adição de um sítio de glicosilação a uma proteína fisiologicamente ativa tem uma grande influência sobre a meia vida in vivo da proteína, dependendo das posições de glicosilação (Eliott et. al., Nat. Biotechnol., 21, 414 421, 2003). Portanto, quando um sítio de glicosilação for adicionado à antitripsina alfa-1, a fim de aumentar a meia vida in vivo e a estabilidade fisiológica, tem que se comprovar extensivamente a qual(is) posição(ões) da antitripsina alfa-1 um sítio de glicosilação é adicionado.

[0012] Em conclusão, houve vários métodos tentados para preparar antitripsina alfa-1 usando a tecnologia do ADN recombinante, a fim de intensificar a estabilidade in vivo de antitripsina alfa-1. No entanto, tais métodos existentes não são adequados para o desenvolvimento de antitripsina alfa-1 como um medicamento, devido a vários problemas, conforme descrito acima. Portanto, existe uma demanda urgente por um novo método para se desenvolver uma antitripsina alfa-1 recombinante tendo excelente estabilidade no corpo.

Problema Técnico

[0013] Para preparar uma antitripsina alfa-1 recombinante tendo utilidade clínica, os presentes inventores prepararam variantes de antitripsina alfa-1, por adição de sítios de glicosilação à antitripsina alfa-1 em várias posições específicas, e constataram que a variante de antitripsina alfa-1 tem excelente estabilidade no corpo e mantém um efeito inibitório sobre elastase com aumentos notáveis na meia vida no sangue (t1/2) e a área sob a curva (AUC) de concentração da droga no sangue versus tempo. Portanto, a presente invenção tinha sido completada com base nesses fatos.

Solução Técnica

[0014] De acordo com um aspecto da presente invenção, é fornecida uma variante de antitripsina alfa-1 preparada por substituição de um aminoácido em um sítio específico entre a 1ª e a 25ª posições do N terminal da antitripsina alfa-1, para adicionar um sítio de glicosilação.

[0015] De acordo com uma modalidade exemplificativa da presente invenção, a variante de antitripsina alfa-1 pode ter 1 a 3 sítios de glicosilação a ela adicionados.

[0016] De acordo com outra modalidade exemplificativa da presente invenção, o sítio específico pode estar presente entre a 3ª e a 13ª posições do N terminal.

[0017] De acordo com ainda outra modalidade exemplificativa da presente invenção, o sítio específico pode estar presente em uma 9ª ou 12ª posição do N terminal.

[0018] De acordo com ainda outra modalidade exemplificativa da presente invenção, os sítios específicos podem estar presentes nas 4ª e 9ª posições, nas 4ª e 12ª posições ou nas 9ª e 12ª posições.

[0019] De acordo com outro aspecto da presente invenção, é fornecido um método de preparação de uma variante de antitripsina alfa-1, que inclui a substituição de um aminoácido em um sítio específico entre a 1ª e 25ª posições do N terminal da antitripsina alfa-1, para adicionar um sítio de glicosilação; o cultivo de células transformadas com um vetor de expressão de antitripsina alfa-1, tendo o sítio de glicosilação a ele adicionado, em um meio de cultura; a expressão de uma proteína de variante de antitripsina alfa-1 a partir das células e a purificação e a recuperação da proteína de variante de antitripsina alfa-1 expressa.

[0020] De acordo com ainda outro aspecto da presente invenção, é fornecida uma composição para prevenção ou tratamento da deficiência de antitripsina alfa-1, que inclui uma variante de antitripsina alfa-1 como um ingrediente ativo, sendo que a variante de antitripsina alfa-1 é preparada por substituição de um aminoácido em um sítio específico entre a 1ª e 25ª posições do N terminal da antitripsina alfa-1, para adicionar um sítio de glicosilação.

[0021] De acordo com uma modalidade exemplificativa da presente invenção, a deficiência de antitripsina alfa-1 pode ser uma doença pulmonar obstrutiva crônica ou cirrose hepática.

[0022] De acordo com ainda outro aspecto da presente invenção, é fornecido um método de prevenção ou tratamento da deficiência de antitripsina alfa-1, que inclui a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma variante de antitripsina alfa-1 a um paciente, sendo que a variante de antitripsina alfa-1 é preparada por substituição de um aminoácido em um sítio específico entre a 1ª e 25ª posições do N terminal da antitripsina alfa-1, para adicionar um sítio de glicosilação.

[0023] De acordo com ainda outro aspecto da presente invenção, é fornecida uma proteína de fusão de variante de antitripsina alfa-1 tendo uma meia vida aumentada no corpo, sendo que a proteína de fusão é preparada por ligação de duas variantes de antitripsina alfa-1, cada uma das quais é preparada por substituição de um aminoácido em um sítio específico entre a 1ª e 25ª posições do N terminal da antitripsina alfa-1, para adicionar um sítio de glicosilação.

[0024] De acordo com ainda outro aspecto da presente invenção, é fornecida uma proteína de fusão de variante de antitripsina alfa-1 incluindo uma proteína heteróloga tendo uma meia vida aumentada no corpo, sendo que a proteína de fusão é preparada por ligação de uma variante de antitripsina alfa-1 à proteína heteróloga, e a variante de antitripsina alfa-1 é preparada por substituição de um aminoácido em um sítio específico entre a 1ª e 25ª posições do N terminal da antitripsina alfa-1, para adicionar um sítio de glicosilação.

[0025] De acordo com uma modalidade exemplificativa da presente invenção, a variante de antitripsina alfa-1 pode ter um aminoácido prolina em uma 357ª posição, que é uma posição P2, adicionalmente substituída com asparagina.

Efeitos Vantajosos

[0026] A variante de antitripsina alfa-1 de acordo com a presente invenção tem excelente estabilidade no corpo e mantém um efeito inibitório sobre atividades de elastase, uma vez que a meia vida (t1/2) no sangue e a área sob a curva (AUC) de concentração da droga no sangue versus tempo são notavelmente aumentadas por adição de um sítio de N glicosilação através de mutação de aminoácido entre a 1ª e a 25ª posições do N terminal de antitripsina alfa-1. Portanto, a variante de antitripsina alfa-1 de acordo com a presente invenção pode ser útil na prevenção ou no tratamento da deficiência de antitripsina alfa-1. Além disso, a variante de antitripsina alfa-1 de acordo com a presente invenção pode ser usada para tratar a deficiência de antitripsina alfa-1, e pode ser usada para aumentar a meia vida de uma proteína heteróloga no corpo, quando a proteína heteróloga estiver ligada à variante de antitripsina alfa-1.

Descrição dos Desenhos

[0027] Essas e outras características, aspectos e vantagens de modalidades preferidas da presente invenção serão mais completamente descritos na descrição detalhada seguinte e nos desenhos acompanhantes. Nos desenhos:
A FIG. 1 é uma diagrama esquemático mostrando um vetor (pT003) de acordo com a presente invenção;
A FIG. 2 é um diagrama mostrando sequências e posições de variantes de antitripsina alfa-1 de acordo com a presente invenção;
A FIG. 3 um diagrama mostrando os resultados de SDS PAGE de antitripsina alfa-1 purificada e variantes da mesma de acordo com a presente invenção;
A FIG. 4 é um gráfico fármaco cinético traçado para uma antitripsina alfa-1 derivada de plasma e uma antitripsina alfa-1 recombinante expressa em células animais, quando da administração subcutânea de acordo com a presente invenção;
A FIG. 5 é um gráfico fármaco cinético traçado para antitripsina alfa-1 e variantes da mesma, quando da administração subcutânea de acordo com a presente invenção;
A FIG. 6 é um gráfico fármaco cinético traçado para antitripsina alfa-1 derivada de plasma e variantes de antitripsina alfa-1 recombinante, quando da administração subcutânea de acordo com a presente invenção;
A FIG 7 é um gráfico fármaco cinético traçado para variantes de antitripsina alfa-1, quando da administração subcutânea e intravenosa de acordo com a presente invenção;
A FIG. 8 é um gráfico fármaco cinético traçado para antitripsina alfa-1 e um dímero da mesma, quando da administração intravenosa de acordo com a presente invenção;
A FIG. 9 é um gráfico fármaco cinético traçado para uma fusão de hormônio de crescimento humano / variante de antitripsina alfa-1, quando da administração subcutânea de acordo com a presente invenção; e
A FIG. 10 é um gráfico fármaco cinético traçado para uma fusão de fator estimulante de colônia de granulócitos / variante de antitripsina alfa-1, quando da administração subcutânea de acordo com a presente invenção.

Modo para a Invenção

[0028] A presente invenção é dirigida a uma variante de antitripsina alfa-1 preparada por substituição de um aminoácido em um sítio específico entre a 1ª e a 25ª posições do N terminal de antitripsina alfa-1, para adicionar um sítio de glicosilação.

[0029] A variante de antitripsina alfa-1 de acordo com a presente invenção é caracterizada pelo fato de que, em adição aos três sítios de glicosilação (asparagina em uma 46ª posição, asparagina em uma 83ª posição e asparagina em uma 247ª posição) de antitripsina alfa-1, um aminoácido em um sítio específico entre a 1ª e a 25ª posições do N terminal da antitripsina alfa-1 é substituído para adicionar um sítio de N glicosilação. O número de sítios de glicosilação a serem adicionados não é limitado. Por exemplo, o número dos sítios de glicosilação pode estar em uma faixa de 1 a 3.

[0030] A adição do sítio de N glicosilação ao sítio específico do N terminal da antitripsina alfa-1 humana pode ser realizada para formar uma sequência de Asn X Thr/Ser, que é uma sequência que codifica um sítio de ligação de N glicana entre a 1ª e a 25ª posições do N terminal. De preferência, glutamina, que é um aminoácido presente entre a 3ª e a 13ª posições do N terminal da antitripsina alfa-1 humana, e, de preferência, presente em uma 9ª ou 12ª posição do N terminal, é substituído por asparagina para adicionar um sítio de glicosilação. Variantes formadas por adição do sítio de glicosilação podem ter uma estrutura, na qual açúcares são adicionados nas 4ª e 9ª posições, nas 4ª e 12ª posições ou nas 9ª e 12ª posições. Em adição aos sítios específicos aqui descritos, as variantes de antitripsina alfa-1 podem ser glicosiladas em outro sítio dentro da 25ª posição do N terminal.

[0031] Além disso, a presente invenção é dirigida a um método de preparação de uma variante de antitripsina alfa-1, que inclui a substituição de um aminoácido em um sítio específico entre a 1ª e a 25ª posições do N terminal de antitripsina alfa-1 para adicionar um sítio de glicosilação; o cultivo de células transformadas com um vetor de expressão de antitripsina alfa-1 tendo o sítio de glicosilação a ele adicionado em um meio de cultura; e a expressão de uma proteína de variante de antitripsina alfa-1 a partir da solução de cultura e a purificação e a recuperação da proteína de variante de antitripsina alfa-1 expressa.

[0032] A tecnologia de ADN recombinante pode ser usada como a tecnologia anteriormente mencionada de adição de um sítio de N glicosilação, e um aminoácido pode ser substituído, inserido e removido através de manipulação genética, para adicionar o sítio de N glicosilação. Aproximadamente 20 aminoácidos do N terminal da antitripsina alfa-1 humana constituem uma região, que não foi facilmente detectada na estrutura cristalina por raios X de antitripsina alfa-1 (código PDB: 1QLP, 2QUG, 3CWL, 1PSI, 7API, 1KCT (www.pdb.org)). Nesse caso, a região N terminal de antitripsina alfa-1 tinha uma estrutura tridimensional, que era muito flexível e não era organizada.

[0033] A variante de antitripsina alfa-1 de acordo com a presente invenção pode ser preparada por mutação de pelo menos um aminoácido usando um método de mutagênese sítio dirigida. Por exemplo, quando glutamina em uma 9ª posição da antitripsina alfa-1 humana for substituída por asparagina, ou glicina em uma 148ª posição for substituída por asparagina, e a antitripsina alfa-1 humana modificada for expressa em células animais, um sítio de glicosilação é formado no resíduo de asparagina que substituiu glutamina (9ª) ou glicina (148ª). Além disso, quando glicina, em uma 148ª posição, for substituída por treonina, um novo sítio de glicosilação será formado em asparagina em uma 146ª posição. Dessa maneira, sítios de glicosilação podem ser adicionados em várias porções da antitripsina alfa-1.

[0034] Na presente invenção, uma variante de antitripsina alfa-1 é preparada por adição de um sítio de N glicosilação através da substituição do aminoácido no sítio específico entre a 1ª e a 25ª posições do N terminal da antitripsina alfa-1 humana, que não era organizado na estrutura cristalina por raios X de antitripsina alfa-1 (A1AT), em adição aos três sítios de glicosilação (asparagina em uma 46ª posição, asparagina em uma 83ª posição e asparagina em uma 247ª posição) da antitripsina alfa-1 humana. Então, a variante de antitripsina alfa-1 é expressa em células de ovário de hâmster chinês, e purificada com elevada pureza usando se um método de cromatografia.

[0035] A variante de antitripsina alfa-1 purificada, tendo o sítio de N glicosilação a ela adicionado, é observada em uma banda de tingimento, que é corrida em uma posição relativamente mais elevada do que a antitripsina alfa-1 de tipo selvagem em um teste SDS PAGE. Isso demonstra que o peso molecular da variante de antitripsina alfa-1 é aumentado por glicosilação.

[0036] Além disso, a variante de antitripsina alfa-1 purificada tem excelente estabilidade no sangue, devido a notáveis aumentos na área sob a curva (AUC) de concentração da droga no sangue versus tempo e da meia vida (t1/2) in vivo. No entanto, no caso da variante (I26T), na qual o aminoácido na 26ª posição de antitripsina alfa-1 é substituído por treonina, a estabilidade in vivo não foi aperfeiçoada, mesmo por adição do sítio de N glicosilação. Além disso, as variantes de antitripsina alfa-1, nas quais um sítio de glicosilação é adicionado a uma região de laço (laço A, laço B, laço C, laço D ou laço E), conforme descrito no documento WO 2008/151845, ou a vizinhança da região de laço não tem efeito significativo em aperfeiçoar a estabilidade in vivo. Em adição, porque a glicosilação da região de laço pode afetar as atividades de antitripsina alfa-1, que essencialmente funciona como um inibidor de protease, é muito importante selecionar uma posição de glicosilação, que não afete as atividades de antitripsina alfa-1.

[0037] Também foi confirmado que a variante de antitripsina alfa-1 purificada manteve um efeito inibitório em face de elastase. Em adição, sabe se que uma constante de taxa de associação da antitripsina alfa-1 humana estava, de maneira geral, em uma faixa de 1,0 ± 0,2 × 105 (Boudier C., 1994) a 1,67 × 106 M-1s-1 (Terashima M, et. al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 52(4), 516 523, 1999). A antitripsina alfa-1 humana de tipo selvagem e variantes da mesma, de acordo com a presente invenção, têm constantes de taxa de associação e constantes de equilíbrio similares àquelas da antitripsina alfa-1 humana. Portanto, pôde ser visto que a glicosilação do N terminal de antitripsina alfa-1 não afetou a inibição das atividades de elastase.

[0038] Além disso, a presente invenção é dirigida a uma proteína de fusão de variante de antitripsina alfa-1 tendo uma meia vida aumentada no corpo. Aqui, a proteína de fusão é preparada por ligação das duas variantes de antitripsina alfa-1 uma à outra.

[0039] Os presente inventores prepararam uma variante dupla de antitripsina alfa-1, na qual um aminoácido, prolina, em uma 357ª posição, que era uma posição P2 da variante de antitripsina alfa-1, foi adicionalmente substituída por asparagina, prepararam uma proteína de fusão, na qual um fator estimulante de colônia de granulócitos estava ligado a uma variante dupla de antitripsina alfa-1, realizaram um teste fármaco cinético e confirmaram que a proteína de fusão aumentou a estabilidade no corpo (ver Exemplo Experimental 5). A partir dos resultados, pôde ser visto que a meia vida in vivo de uma proteína heterogênea, tal como uma proteína fisiologicamente ativa, foi aumentada, quando a proteína fisiologicamente ativa estivesse ligada à variante dupla de antitripsina alfa-1.

[0040] Portanto, a presente invenção é dirigida a uma proteína de fusão de variante de antitripsina alfa-1, na qual a meia vida in vivo de outra proteína heterogênea é aumentada por ligação da proteína heterogênea à variante de antitripsina alfa-1. O tipo da proteína heterogênea não é limitado, mas pode ser um peptídeo fisiologicamente ativo ou uma proteína fisiologicamente ativa.

[0041] A proteína de fusão de variante de antitripsina alfa-1, tendo uma meia vida aumentada, pode ser preparada por ligação das duas ou mais variantes de antitripsina alfa-1 purificadas. Nos estudos prévios, Sytkowski, A.J. et. al. relataram que, quando eritropoietina (EPO) estivesse ligada usando um ligador apropriado, para preparar uma proteína de fusão EPO EPO, a proteína de fusão tinha atividades notavelmente aumentadas e meia vida mais longa no corpo do que um monômero de EPO (Sytkowski, A.J., et. al., J. Biol. Chem., 274, 24773 24778, 1999). Portanto, quando as duas ou mais variantes de antitripsina alfa-1 da presente invenção estiverem ligadas uma à outra, espera se que a meia vida da proteína de fusão aumente, comparadas ao monômero de variante de antitripsina alfa-1. Além disso, quando um peptídeo fisiologicamente ativo ou um fator regulador imunológico ou uma citocina e os similares, com uma curta meia vida no corpo, estiver ligado à variante de antitripsina alfa-1 de acordo com a presente invenção, espera se que a meia vida in vivo seja notavelmente aumentada, por meio disto exibindo um efeito de estabilidade suficiente.

[0042] Além disso, a presente invenção é dirigida a uma composição para prevenção ou tratamento da deficiência de antitripsina alfa-1, que inclui a variante de antitripsina alfa-1 como um ingrediente ativo.

[0043] Em adição, a presente invenção é dirigida a um método de prevenção ou de tratamento da deficiência de antitripsina alfa-1, que inclui a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz da variante de antitripsina alfa-1 a um paciente.

[0044] Conforme descrito acima, a variante de antitripsina alfa-1 de acordo com a presente invenção tem excelente estabilidade no corpo e mantém um efeito inibitório em face de elastase, porque a meia vida (t1/2) no sangue e a área sob a curva (AUC) de concentração da droga no sangue versus tempo são notavelmente aumentadas por adição de um sítio de N glicosilação através de mutação de aminoácido entre a 1ª e a 25ª posições do N terminal de antitripsina alfa-1. Portanto, a variante de antitripsina alfa-1, de acordo com a presente invenção, pode ser útil na prevenção ou no tratamento da deficiência de antitripsina alfa-1. A deficiência de antitripsina alfa-1 inclui uma doença pulmonar obstrutiva crônica (COPD) ou cirrose hepática, de preferência enfisema pulmonar, mas a presente invenção não está a elas limitada.

[0045] Em adição à variante de antitripsina alfa-1, a composição de acordo com a presente invenção pode incluir pelo menos um ingrediente ativo tendo um efeito de prevenção ou tratamento da deficiência de antitripsina alfa-1.

[0046] A composição de acordo com a presente invenção pode ser preparada para incluir adicionalmente pelo menos um veículo farmaceuticamente disponível em adição ao ingrediente ativo, conforme descrito acima, para a finalidade de administração. O veículo farmaceuticamente disponível pode ser usado em combinação com pelo menos um selecionado a partir do grupo consistindo em salina, água estéril, uma solução de Ringer, salina tamponada, uma solução de dextrose, uma solução de maltodextrina, glicerol, etanol e uma mistura dos mesmos. Conforme necessário, outro aditivo típico, tais como um antioxidante, um tampão e um agente bacteriostático, pode ser adicionado. Além disso, um diluente, um agente dispersante, um aglutinante e um lubrificante são adicionalmente adicionados à composição, que pode, então, ser formulada em uma formulação injetável, uma pílula, uma cápsula, um grânulo ou um tablete. Além disso, a composição pode ser desejavelmente formulada de acordo com as doenças ou os ingredientes, usando um método conhecido na técnica relacionada, ou um método revelado em Remington’s Pharmaceutical Science (a versão mais recente), Mack Publishing Company, Easton PA.

[0047] A composição de acordo com a presente invenção pode ser administrada oralmente ou parenteralmente (por exemplo, injeção intravenosa, subcutânea ou intraperitoneal, inalação ou aplicação local) de acordo com um método desejado, e pode ser usado para terapia com gene usando a variante de antitripsina alfa-1 de acordo com a presente invenção. A dose da composição pode variar de acordo com o peso do corpo, a idade, o sexo e a condição de saúde de um paciente, a dieta, um tempo de administração, um método de administração, uma taxa de liberação e a severidade de uma doença. A dose da variante de antitripsina alfa-1 administrada uma vez por semana é uma dose mais baixa do que 60 mg/Kg, que é uma dose da antitripsina alfa-1, mas permite que a composição exiba substancialmente a mesma eficácia clínica. Além disso, quando a variante de antitripsina alfa-1 for administrada na mesma dose que a antitripsina alfa-1 de tipo selvagem, espera se que a composição exiba a mesma eficácia clínica, mesmo quando a duração da administração seja adicionalmente estendida.

[0048] A composição da presente invenção pode ser usada isoladamente ou em combinação com cirurgia, terapia com hormônio, tratamento com droga e métodos usando um modificador de resposta biológica.

[0049] Nas partes que se seguem, Exemplos e Exemplos Experimentais preferidos são fornecidos para auxiliar no entendimento da presente invenção. No entanto, deve ser entendido que se pretende que a descrição detalhada aqui fornecida seja meramente para fornecer um melhor entendimento da presente invenção, e que não se pretende que limite o escopo da presente invenção.

Exemplo 1: Preparação de antitripsina alfa-1 e variante e dímero do mesmo 1 1. Construção de vetor de expressão pAV1

[0050] Um vetor pAV1, desenvolvido por modificação de um vetor parental, pSGHV0 (No. de Acesso ao GenBank AF285183), para a finalidade de uso industrial, foi usado como um vetor de expressão necessário para a clonagem na presente invenção. O vetor parental era um vetor de laboratório construído para purificar facilmente uma proteína tendo atividades fisiológicas, quando uma proteína originada humana fosse superexpressa em uma elevada concentração e liberada a partir de células animais, mas que não exibisse atividades quando a proteína fosse expressa em bactérias, tal como E. coli. No entanto, porque o vetor parental tinha várias limitações no uso para a produção em indústrias, o vetor parental foi modificado para ser usado nas indústrias tendo um elevado nível de expressão da proteína, que é o mais elevado mérito do vetor pSGHV0.

1 2. Construção de vetor (pT003) de antitripsina alfa-1 (subtipo M3)

[0051] Para construir um vetor de antitripsina alfa-1, um vetor de antitripsina alfa-1 (pT003) foi construído por clonagem de um gene de antitripsina alfa-1 (M3) em um vetor pAV1, usando hMU001448 (KRIBB) como um molde. Na descrição detalhada, o molde de hMU001448 (KRIBB) foi amplificado por uma reação em cadeia por polimerase (PCR) usando se dos iniciadores: iniciador para frente XhoAT (5’ CCC TCC TCG AGA ATG CCG TCT TCT GTC TCG 3’, SEQ ID NO: 1) e iniciador reverso ATNot (5’ GGG CCC GCG GCC GCA GTT ATT TTT GGG TGG G 3’, SEQ ID NO: 2). Ambas as extremidades do nucleotídeo amplificado foram digeridas com duas enzimas de restrição XhoI e NotI, e fundidas com um vetor de expressão pAV1 tendo um sítio de restrição XhoI/NotI, resultando na construção de um vetor de antitripsina alfa-1 (pT003, SEQ ID NO: 39). Esse vetor de antitripsina alfa-1 (pT003) é mostrado esquematicamente na FIG. 1.

1 3. Preparação de variante de antitripsina alfa-1 (M3)

[0052] Para preparar muitas variantes de antitripsina alfa-1 tendo um sítio de glicosilação a elas adicionado, o vetor de antitripsina alfa-1 (pT003), preparado no Exemplo 1 2, foi usado como um molde. Pares de iniciadores para frente e de iniciadores reversos, listados na seguinte Tabela 1, e um kit de mutagênese (Enzynomix, EZchange™ Site Directed Mutagenesis Kit) foram usados para preparar variantes de antitripsina alfa-1. As sequências e as posições das variantes de antitripsina alfa-1 são mostradas na FIG. 2.

[0053] Porque a finalidade das mutações de todas as variantes de antitripsina alfa-1 era adicionar um sítio de N glicosilação, um aminoácido original foi, de maneira geral, substituído por asparagina, para formar uma sequência Asn X Thr, a qual era conhecida como sendo um sítio de N glicosilação em células animais. Em alguns casos, no entanto, um aminoácido adjacente ao resíduo de asparagina foi substituído por treonina, a fim de usar um resíduo de asparagina aparecendo em uma sequência de ADN original.

1 4. Construção de vetor (pT006) de antitripsina alfa-1 (subtipo M2)

[0054] Para construir um vetor de antitripsina alfa-1, um vetor de antitripsina alfa-1 (pT006) foi construído por clonagem de um gene de antitripsina alfa-1 em um vetor pAV1, usando pEAT8 (que codifica cADN a1 AT (M2)) como um molde. Na descrição detalhada, o molde pEAT8 (que codifica cADN a1 AT(M2)) foi amplificado por PCR usando dois iniciadores: iniciador para frente XhoAT (5’ CCC TCC TCG AGA ATG CCG TCT TCT GTC TCG 3’, SEQ ID NO: 1) e iniciador reverso ATNot (5’ GGG CCC GCG GCC GCA GTT ATT TTT GGG TGG G 3’, SEQ ID NO: 2). Ambas as extremidades do nucleotídeo amplificado foram digeridas com duas enzimas de restrição XhoI e NotI, e fundidas com um vetor de expressão pAV1 tendo um sítio de restrição XhoI/NotI, resultando na construção de um vetor de antitripsina alfa-1 (pT006, SEQ ID NO: 40).

1 5. Preparação de variante de antitripsina alfa-1 (M2)

[0055] Para preparar uma variante de antitripsina alfa-1 (M2) tendo um sítio de glicosilação a ela adicionado, o vetor de antitripsina alfa-1 (pT006) preparado no Exemplo 1 4 foi usado como um molde. O par de dois iniciadores (isto é, um iniciador para frente (SEQ ID NO: 5) e um iniciador reverso (SEQ ID NO: 6)) e um kit de mutagênese (Enzynomix, EZchange™ Site Directed Mutagenesis Kit) foram usados para preparar um vetor de variante de antitripsina alfa-1 (M2) (AT9N (M2)). A sequência de aminoácidos da variante de antitripsina alfa-1 resultante foi mostrada em SEQ ID NO: 42.

1 6. Preparação de dímeros de antitripsinas alfa-1 e variantes das mesma

[0056] Para preparar um dímero de variante de antitripsina alfa-1, o pAT9N (subtipo M2) foi usado como a variante de antitripsina alfa-1. Para construir um vetor de dímero, o pAT9N (M2), usado como molde, foi amplificado por PCR usando dois iniciadores: iniciador para frente XhoAT 2 (5’ GGG CCC CTC GAG GCC ACC ATG CCG TCT TCT GTC TCG TGG GGC ATC CTC CTG CTG GCA GGC CTG TGC TGC CTG GTC CCT GTC TCC CTG GCT GAA GAT CCC CAG GGA 3’, SEQ ID NO: 31) e iniciador reverso ATBam 2 (5’ GGG GGG ATC CTC TTT TTG GGT GGG ATT CAC 3’, SEQ ID NO: 32). Ambas as extremidades do nucleotídeo amplificado foram digeridos com duas enzimas de restrição XhoI e BamHI, e fundidas com um vetor de expressão pAT9N (M2) tendo um sítio de restrição XhoI/BamHI, resultando na construção de um vetor de dímero de antitripsina alfa-1 (pAT9N (M2) AT9N (M2)).

1 7. Expressão de dímeros de antitripsinas alfa-1 e variantes das mesmas

[0057] Células de ovário de hâmster chinês (CHO K1) foram usadas para expressar as proteínas da antitripsina alfa-1 (T003, T006) e variantes das mesmas e o dímero preparados nos Exemplos 1 2, 3, 4, 5 e 6. As CHO K1 foram incubadas em um Meio de Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado com soro bovino fetal à 10% (FBS) e um antibiótico, sob condições de CO2 à 5 % e à 37°C. Um dia antes da introdução dos vetores de expressão contendo a antitripsina alfa-1 e variante da mesma, as células foram semeadas em uma densidade de 5 × 106 células em uma placa de cultura de 100 mm, e cultivadas. Depois disso, 800 μL de DMEM, desprovido de FBS, e um antibiótico e 10 μg de cada um dos vetores de expressão, contendo antitripsina alfa-1 e uma variante da mesma, e o dímero foram misturados, e mantidos à temperatura ambiente durante um minuto. A mistura resultante foi, então, misturada com 20 μg de polietilenimina (PEI, linear, Polysciences Inc. (No. Cat.: 23966, PM: cerca de 25.000)), e mantidos à temperatura ambiente durante aproximadamente 10 a 15 minutos. Nesse caso, as células cultivadas um dia antes foram lavadas com PBS, e foram adicionados 6 mL de um caldo de cultura com DMEM fresco. Depois de 10 a 15 minutos, cada um dos vetores de expressão, contendo a antitripsina alfa-1 e variante da mesma, e o dímero, mantido em temperatura ambiente, foi adicionado à placa de cultura. No dia seguinte, as células foram lavadas com PBS, e colocadas em um Meio de Dulbecco Modificado por Iscove (IMDM, No. Cat. 12200 028, Gibco), desprovido de FBS, e a expressão da proteína foi confirmada.

1 8. Purificação de antitripsina alfa-1 e variante da mesma e dímero

[0058] A antitripsina alfa-1 e variante da mesma e o dímero expresso no Exemplo 1 7 foram purificados como se segue. Mais particularmente, para purificar a antitripsina alfa-1 e a variante da mesma e o dímero, secretado em um caldo de cultura de células, o caldo de cultura foi centrifugado para remover as células, e somente um sobrenadante com células foi recuperado, e diluído com um tampão de equilíbrio (fosfato de sódio 20 mM, pH 8,0). Depois disso, o sobrenadante com células, diluído com o tampão de equilíbrio, foi colocado em uma coluna Q Sepharose (GE Healthcare, EUA) equilibrada com um tampão de equilíbrio, e completamente lavada com um tampão de equilíbrio. A seguir, uma proteína foi eluída em uma concentração crescente (NaCl 0 a 400 mM, fosfato de sódio 20 mM, pH 8,0) de cloreto de sódio. A proteína eluída foi colocada em uma coluna Alpha 1 Antitrypsin Select (GE Healthcare, EUA) equilibrada com um tampão de equilíbrio (Tris 50 mM, cloreto de sódio 0,15 M, pH 7,5), e, então, lavada completamente com um tampão de equilíbrio. A seguir, a proteína foi eluída em uma concentração crescente de MgCl2. A solução resultante foi dialisada em salina tamponada com fosfato, e, então, concentrada usando Vivaspin20 (GE Healthcare, EUA), para se obter a proteína purificada com elevada pureza. Os resultados de SDS PAGE, da antitripsina alfa-1 e da variante da mesma e do dímero purificados, são mostrados na FIG. 3.

[0059] Conforme mostrado na FIG. 3, confirmou se que as variantes de antitripsina alfa 1, tendo o sítio de N glicosilação a elas adicionado, foram observadas em uma posição relativamente mais elevada do que a antitripsina alfa-1 de tipo selvagem (T003 ou T006), o que indicou que o peso molecular da variante de antitripsina alfa-1 foi aumentado por glicosilação. Além disso, revelou se que o dímero foi observado em uma posição correspondendo ao peso molecular do dímero, e que houve uma leve diferença na posição do peso molecular, de acordo com um nível de glicosilação.

Exemplo 2: Preparação de proteína de fusão de hormônio de crescimento humano / variante de antitripsina alfa-1

[0060] Para preparar uma proteína de fusão de hormônio de crescimento humano / variante de antitripsina alfa-1 (AT9N), o pAT9N (subtipo M2) foi usado como a variante de antitripsina alfa-1. Para construir um vetor de fusão, um gene do hormônio de crescimento humano (IOH45734, Invitrogen), usado como um molde, foi amplificado por PCR usando dois iniciadores: iniciador para frente XhoGH (5’ GGG CCC CTC GAG GCC ACC ATG GCT ACA GGC TCC CGG 3’, SEQ ID NO: 33) e iniciador reverso GHBam (5’ GGG GGG ATC CTC GAA GCC ACA GCT GCC CTC 3’, SEQ ID NO: 34). Ambas as extremidades do nucleotídeo amplificado foram digeridas com duas enzimas de restrição XhoI e BamHI, e, então, fundidas com um vetor de expressão pAT9N (M2) tendo um sítio de restrição XhoI/BamHI, resultando na construção de um vetor de fusão de hormônio de crescimento humano / variante de antitripsina alfa-1 (phGH AT9N (M2), SEQ ID NO: 43).

Exemplo 3: Preparação de proteína de fusão de fator estimulante de colônia de granulócitos / variante dupla de antitripsina alfa-1 3 1. Preparação de variante dupla de antitripsina alfa-1

[0061] O vetor de variante de antitripsina alfa-1 (AT9N), construído da mesma maneira que no Exemplo 1 5, foi usado como o molde, e os dois iniciadores seguintes: iniciador para frente (5’ CCA TGT TTT TAG AGG CCA TAA ACA TGT CTA TCC CCC CC 3’, SEQ ID NO: 35) e iniciador reverso (5’ GGG GGG GAT AGA CAT GTT TAT GGC CTC TAA AAA CAT GG 3’, SEQ ID NO: 36), e um kit de mutagênese (Enzynomix, EZchange™ Site Directed Mutagenesis Kit) foram usados para construir um vetor pT004N (Q9N, P357N) contendo uma variante dupla de antitripsina alfa-1, na qual glutamina em uma 9ª posição do N terminal de antitripsina alfa-1 foi substituída por asparagina e prolina, em uma 357ª posição foi também substituída por asparagina. A sequência de aminoácidos da variante dupla de antitripsina alfa-1 resultante foi mostrada em SEQ ID NO: 44.

3 2. Preparação de proteína de fusão de fator estimulante de colônia de granulócitos / variante dupla de antitripsina alfa-1

[0062] Para preparar uma proteína de fusão de fator estimulante de colônia de granulócitos / variante dupla de antitripsina alfa-1, foi usado o pT004N (Q9N, P357N), contendo a variante dupla de antitripsina alfa-1 preparado pelo método no Exemplo 3 1. Para construir um vetor de fusão, um fator estimulante de colônia de granulócitos (IHS1380 97652343, Open Biosystems), usado como o molde, foi amplificado por PCR usando dois iniciadores: iniciador para frente XhoCSF (5’ GGG CCC CTC GAG ATG GCT GGA CCT GCC ACC 3’, SEQ ID NO: 37) e iniciador reverso CSFBam (5’ GGG GGG ATC CTC GGG CTG GGC AAG GTG GCG 3’, SEQ ID NO: 38). Ambas as extremidades do nucleotídeo amplificado foram digeridas com duas enzimas de restrição XhoI e BamHI, e fundidas com um vetor de expressão pT004N tendo um sítio de restrição XhoI/BamHI, resultando na construção de um vetor de fusão de fator estimulante de colônia de granulócitos / variante dupla de antitripsina alfa-1 (pT603N, SEQ ID NO: 45). Subsequentemente, a proteína de fusão de fator estimulante de colônia de granulócitos / variante dupla de antitripsina alfa-1 foi expressa e purificada a partir do vetor de fusão resultante (pT603N) da mesma maneira que nos Exemplos 1 7 e 1 8.

Exemplo Experimental 1: Fármaco-cinética de antitripsina alfa-1 derivada do plasma, antitripsina alfa-1 preparada em células de ovário de hamster chinês, e variantes das mesmas

[0063] Para determinar a fármaco cinética da antitripsina alfa-1 derivada do plasma e da antitripsina alfa-1 preparada em células de ovário de hâmster chinês, de acordo com a presente invenção, foram realizados experimentos, como se segue.

[0064] Ratos Sprague Dawley machos foram usados como animais de laboratório, e alocados em vários grupos experimentais (N = 3 a 5). Uma antitripsina alfa-1 humana derivada do plasma (Calbiochem, EUA), uma antitripsina alfa-1 recombinante e variantes das mesmas foram injetadas, subcutaneamente ou intravenosamente, nos ratos Sprague Dawley em cada grupo em uma dose de 445 μg por rato, e salina tamponada com fosfato foi usada como uma solução diluída. O sangue foi tirado depois de cada administração, e, então, centrifugado para se obter os soros. Os soros a partir de cada administração foram armazenados em um freezer até que a análise fosse realizada, e as concentrações no sangue da antitripsina alfa-1 e de variante da mesma foram medidas usando se um ensaio imunossorbente ligado à enzima (ELISA). O ELISA foi realizado usando dois métodos. Um método foi realizado como se segue. Uma placa (Nunc, Dinamarca) foi revestida com um anticorpo monoclonal (Medix Biochemica, Finlândia) contra a antitripsina alfa-1 humana, e tratada com salina tamponada com fosfato, na qual estava dissolvido albumina de soro bovino à 1 %. Uma amostra foi diluída com salina tamponada com fosfato, na qual estava dissolvida albumina de soro bovino à 1 %, e usada. Um conjugado de anticorpo monoclonal anti(antitripsina alfa-1) – biotina, fundido usando sulfo NHS niotina (Pierce Biotechnology, EUA), e estreptavidina – HRP, foram usados para detectar a antitripsina alfa-1. Foi realizada uma reação colorimétrica usando 3,3’,5,5’ tetrametil benzidina (TMB) e uma solução colorimétrica de peróxido de hidrogênio. A seguir, foi adicionado ácido sulfúrico a cada cavidade para parar a reação, e a solução de reação foi medida para absorbância em 450 nm, usando se uma leitora de microplacas (Molecular Device, EUA). O outro método foi realizado como se segue. Uma placa (Nunc, Dinamarca) foi revestida com um anticorpo monoclonal (Medix Biochemica, Finlândia) contra a antitripsina alfa-1 humana, e tratada com salina tamponada com fosfato, na qual foi dissolvida albumina de soro bovino à 1 %. Uma amostra foi diluída com salina tamponada com fosfato, na qual estava dissolvida albumina de soro bovino à 1 %, e usada. Um conjugado de anticorpo policlonal anti(antitripsina alfa-1) – biotina (Abcam, Reino Unido) e estreptavidina – HRP foram usados para detectar a antitripsina alfa-1. Foi realizada uma reação colorimétrica usando 3,3’,5,5’ tetrametil benzidina (TMB) e uma solução colorimétrica de peróxido de hidrogênio. A seguir, foi adicionado ácido sulfúrico a cada cavidade para parar a reação, e a solução de reação foi medida para absorbância em 450 nm, usando se uma leitora de microplacas (Molecular Device, EUA). A placa foi lavada com uma solução de lavagem (Tween 20 à 0,05 %, salina tamponada com fosfato) em cada etapa. Um valor quantitativo de cada amostra foi calculado através de análise de regressão, depois que uma curva padrão foi traçada para um material de referência padrão.

[0065] Os gráficos fármaco cinéticos traçados para a antitripsina alfa-1 derivada do plasma, para a antitripsina alfa-1 derivada de células de ovário de hâmster chinês, e de variantes das mesmas, quando da administração subcutânea e da administração intravenosa, são mostrados nas FIGs 4 7.

[0066] Conforme mostrado nas FIGs. 4 e 5, as fármaco cinéticas da antitripsina alfa-1 derivada do plasma, da antitripsina alfa-1 recombinante e das variantes das mesmas, quando da administração subcutânea, foram observadas em vários aspectos. Conforme mostrado na FIG. 4, foi revelado que a antitripsina alfa-1 derivada do plasma tinha uma meia vida (t1/2) no corpo de aproximadamente 15,2 horas, Tmáx de 16,8 horas e um valor de AUC (hr*μg/mL) de 113,1, e que a antitripsina alfa-1 recombinante (T003) tinha uma meia vida (t1/2) no corpo de aproximadamente 16,5 horas, Tmáx de 20,8 horas e um valor de AUC (hr*μg/mL) de 156,6 horas. Portanto, a antitripsina alfa-1 preparada nas células de ovário de hâmster chinês exibiu perfis fármaco cinéticos similares àqueles da antitripsina alfa-1 derivada do plasma. A meia vida (t1/2) e o Tmáx da antitripsina alfa-1 recombinante foram levemente aumentados, e a AUC (hr*μg/mL) foi também aumentada em aproximadamente 40 %, comparada àquelas da antitripsina alfa-1 derivada do plasma. Além disso, foi revelado que as isoformas de antitripsina alfa-1 do tipo M2 (His101) e do tipo M3 (Arg101) exibiram perfis similares, dentro de uma faixa de erro experimental, no teste de fármaco cinética usando animais.

[0067] Por outro lado, a fármaco cinética das variantes de antitripsina alfa-1, preparadas nas células de ovário de hâmster chinês, exibiu diferentes perfis dependendo dos sítios de glicosilação a serem adicionados.

[0068] Conforme mostrado na FIG. 5, foi revelado que a AUCINF_obs (hr*μg/mL) de AT70N, AT178N, AT201N e AT212N foram mais baixas, com aproximadamente 50 a 70 %, do que aquela da antitripsina alfa-1 (T003), preparada nas células de ovário de hâmster chinês. No entanto, foi revelado que as meias vidas das variantes no corpo foram aumentadas em aproximadamente 15 a 90 %, comparadas àquela da antitripsina alfa-1 de tipo selvagem, preparada nas células de ovário de hâmster chinês, demonstrando que a adição do sítio de glicosilação foi considerado a ter uma influência nas meias vidas no corpo. Por outro lado, a AUC (hr*μg/mL) da AT148T era similar àquela da antitripsina alfa 1 preparada nas células de ovário de hâmster chinês, mas a meia vida in vivo era de 24,6 horas, a qual foi aumentada em aproximadamente 50 %, comparada àquela da antitripsina alfa-1 recombinante. Isso indicou que a fármaco cinética da AT148T foi aperfeiçoada, devido à adição do sítio de glicosilação.

[0069] Conforme mostrado na FIG. 5, foi revelado que a meia vida in vivo de AT26T foi levemente aumentada, comparada àquela da antitripsina alfa-1 (T003) preparada nas células de ovário de hâmster chinês, mas a AUC (hr*μg/mL) de AT26T foi de meramente aproximadamente 17 % da antitripsina alfa-1 (T003) preparada nas células de ovário de hâmster chinês, e a taxa de eliminação in vivo (CL/F; mL/hr/kg) de AT26T foi também aproximadamente 6 vezes mais elevada do que aquela da antitripsina alfa-1 (T003), indicando que a adição do sítio de glicosilação na 26ª posição teve a pior influência sobre a fármaco cinética.

[0070] A FIG. 6 é um gráfico de fármaco cinética traçado para a antitripsina alfa-1 derivada do plasma e para as variantes de antitripsina alfa-1 recombinante, quando da administração subcutânea. Conforme mostrado na FIG. 6, foi revelado que a antitripsina alfa-1 derivada do plasma tinha uma meia vida (t1/2) in vivo de aproximadamente 15,2 horas, e, entre as variantes de antitripsina alfa-1, AT148T tinha uma meia vida in vivo de 24,6 horas, AT9N tinha uma meia vida in vivo de 37,7 horas e AT212N tinha uma meia vida in vivo de 19,1 horas, indicando que a fármaco cinética das variantes de antitripsina alfa-1 exibiu vários perfis dependendo dos sítios de glicosilação adicionais.

[0071] A partir dos resultados anteriormente mencionados, foi confirmado que as meias vidas das variantes de antitripsina alfa-1 (AT26T, AT148T, AT178N, AT201N e AT212N), que foram adicionalmente glicosiladas por mutação de uma região de laço de antitripsina alfa-1, foram levemente aumentadas, comparadas à antitripsina alfa-1 recombinante, que não foi adicionalmente glicosilada, mas os outros perfis fármaco cinéticos foram muito inferiores aos da antitripsina alfa-1 recombinante de tipo selvagem (T003). Consequentemente, poder se ia concluir que essas variantes glicosiladas na região de laço não foram clinicamente superiores à antitripsina alfa-1 de tipo selvagem.

[0072] No entanto, poder se ia concluir que, entre as variantes obtidas por glicosilação adicional da antitripsina alfa-1 recombinante, a variante na qual o sítio de glicosilação foi adicionado na 9ª posição do N terminal tinha notavelmente aperfeiçoado a sustentabilidade no corpo, comparada às variantes, nas quais o sítio de glicosilação foi adicionado nas outras posições, e tinha uma taxa de eliminação a partir do corpo notavelmente baixa. Portanto, as mudanças nos parâmetros fármaco cinéticos foram confirmadas por adição de glicosilação em uma posição à jusante de um 25º resíduo de aminoácido na estrutura do peptídeo N terminal da antitripsina alfa-1.

[0073] A FIG. 7 mostra os resultados do teste fármaco cinético nas variantes, que foram obtidas por adição de sítios de glicosilação nas 4ª, 9ª e 12ª posições do N terminal de antitripsina alfa-1. Conforme mostrado na FIG. 7, foi mostrado que, quando os sítios de glicosilação foram adicionados na 9ª ou 12ª posições, a variante tinha uma excelente meia vida in vivo ou Área sob a Curva (AUC), comparada à variante, na qual o sítio de glicosilação foi adicionado em uma 4ª posição. A região N terminal da antitripsina alfa-1 não foi observada na estrutura cristalina por raios X, dando, portanto, uma estrutura amorfa em uma solução, e movendo se livremente. Quando a região N terminal estava glicosilada, pôde se inferir que o aumento no volume hidrodinâmico causou o aumento da meia vida in vivo de antitripsina alfa-1, e também essas variantes tiveram biodisponibilidade aumentada no corpo depois de injeção.

Exemplo Experimental 2: Fármaco-cinética de antitripsina alfa-1 derivada do plasma, antitripsina alfa-1 preparada em células de ovário de hamster chinês e dímeros das mesmas

[0074] Para determinar a fármaco cinética do dímero de antitripsina alfa-1 preparado nas células de ovário de hâmster chinês, de acordo com a presente invenção, foram realizados experimentos como se segue. Sequências que codificam proteínas, nas quais um sítio de glicosilação foi adicionado em um 9ª posição da antitripsina alfa-1, foram ligadas em paralelo e clonadas. Depois disso, o dímero AT9N (M2) AT9N (M2) e o monômero T003 expressos em células CHO foram purificados e submetidos a um teste de fármaco cinética.

[0075] Conforme mostrado na FIG. 8, foi mostrado que a meia vida in vivo do dímero AT9N (M2) AT9N (M2) foi de 32,8 horas, o que era duas vezes a meia vida in vivo (16,5 horas) da T003, e o valor de AUC do dímero AT9N (M2) AT9N (M2) também aumentou duas vezes. Também foi revelado que um valor de eliminação do dímero AT9N (M2) AT9N (M2) era notavelmente reduzido. A partir desses resultados, foi confirmado que o monômero de variante de antitripsina alfa-1, assim como o dímero de variante de antitripsina alfa-1 tendo a estabilidade in vivo aumentada, eram capazes de serem usados como uma droga.

Exemplo Experimental 3: Efeito inibitório de antitripsina alfa-1 e de variantes da mesma sobre atividades de elastase

[0076] Para determinar um efeito inibitório da antitripsina alfa-1 e de variantes da mesma, de acordo com a presente invenção, sobre atividades de elastase, foram realizados experimentos como se segue.

[0077] Elastase pancreática porcina (Calbiochem, Cat. 324682) e AAA pNA (N Succinil Ala Ala Ala p nitro anilida, Sigma, S4760) foram usados como uma enzima e um substrato, respectivamente, para medir as constantes de velocidade da antitripsina alfa-1 e de variantes da mesma. Mais particularmente, a elastase pancreática porcina e a antitripsina alfa-1 e variantes da mesma foram misturadas na mesma razão molar, e reagidas à 25ºC durante 120 segundos, 300 segundos e 600 segundos. Depois disso, a AAA pNA foi adicionada à mistura de reação resultante, e mediu se para cinética durante 5 minutos em intervalos de um minuto. Na reação final, as concentrações da elastase pancreática porcina e da antitripsina alfa-1 e de variantes da mesma eram de 10 nM, e a concentração da AAA pNA era de 1 mM.

[0078] Porque a reação da elastase pancreática porcina com a antitripsina alfa-1 e com variantes da mesma era uma reação secundária irreversível (Levenspiel O. Chemical reaction engineering, 2ª edição. 1972, Wiley, New York), a constante de velocidade foi calculada pela equação: 1/R = kaCE0t+1 [R = Atividade de PPE remanescente, ka = Constante de velocidade (M 1s 1), CE0 = Concentração inicial de AAT (M) e t = Tempo de reação (segundos)]. A constante de taxa de associação (ka) foi calculada usando as atividades de elastase pancreática porcina restando em cada tempo de reação. Os resultados estão listados na Tabela 2.

[0079] Além disso, a constante de equilíbrio da antitripsina alfa-1 e de variantes da mesma foi calculada usando se a seguinte equação. Os resultados estão listados na Tabela 3.
Ka (M-1) = [EI]/[E]f/[I]f × 109
[E]T = Concentração Inicial de Enzima
[I]T = Concentração Inicial de Inibidor
[E]f = [E]T×(Ateste / Acontrole)
[EI] = [E]T–[E]f = [E]T×(1–Ateste/Acontrole)
[I]f = [I]T–[EI]
A = Inclinação de t (Tempo de Medição) versus Absorbância

[0080] Conforme listado nas Tabelas 2 e 3, foi observado que as constantes de taxa de associação e as constantes de equilíbrio da antitripsina alfa-1 humana de tipo selvagem (T003) e a variante de antitripsina alfa-1 AT9N eram substancialmente similares àquelas da antitripsina alfa-1 humana derivada do plasma. Portanto, foi confirmado que a glicosilação N terminal da antitripsina alfa-1 não teve uma influência sobre as atividades de inibidor de elastase de antitripsina alfa-1. No entanto, quando os efeitos inibitórios da AT148T e a da antitripsina alfa-1 derivada de plasma contra elastase foram comparados, AT148T tinha uma afinidade de ligação de metade daquela da antitripsina alfa-1 de tipo selvagem. Portanto, pôde ser visto que, mesmo se AT148T tivesse uma influência sobre a meia vida no corpo devido à adição da glicosilação, porém, a glicosilação na 148ª posição de antitripsina alfa-1 teve um efeito negativo sobre a ligação de antitripsina alfa-1 a uma enzima proteolítica (isto é, protease).

[0081] As variantes, tais como AT70N e AT178N, tinham afinidade de ligação com elastase notavelmente reduzida, comparadas à antitripsina alfa-1 derivada do plasma de tipo selvagem. A partir desses fatos, poder se ia concluir que, quando um sítio de glicosilação foi adicionado em uma posição específica de antitripsina alfa-1, foi muito importante selecionar posição(ões) de glicosilação, que não afete(m) as atividades de antitripsina alfa-1, embora a glicosilação fosse capaz de afetar a fármaco cinética no corpo.

Exemplo Experimental 4: Teste de fármaco-cinética em fusão de hormônio de crescimento humano / variante de antitripsina alfa-1

[0082] para determinar a fármaco cinética da proteína de fusão do hormônio de crescimento humano / variante de antitripsina alfa-1, de acordo com a presente invenção, foram realizados experimentos como se segue. Ratos Sprague Dawley foram usados como animais de laboratório e alocados em um grupo administrado com hormônio de crescimento humano (N = 3) e um grupo administrado como fusão (N = 5). A proteína de fusão de hormônio de crescimento humano / variante de antitripsina alfa-1 preparada no Exemplo 2 foi injetada subcutaneamente nos ratos Sprague Dawley em uma dose de 720 μg por rato, e salina tamponada com fosfato foi usada como uma solução diluída. Depois dos pontos de tempo de 0; 0,33; 1; 2; 5; 8; 12; 18; 24; 30 e 48 horas, o sangue foi tirado, e, então, centrifugado para se obter os soros. Cada amostra foi analisada usando um ELISA conforme será descrito abaixo. Um anticorpo monoclonal (Medix Biochemica, Finlândia) contra um hormônio de crescimento humano foi diluído com salina tamponada com fosfato em uma concentração de 1 a 5 μg/mL, e dividido para cada cavidade de uma placa com 96 cavidades (Nunc, Dinamarca) em uma quantidade de 100 μL. Depois disso, a solução resultante foi mantida à temperatura ambiente durante 15 a 18 horas. O anticorpo que não estava fixado à placa com cavidades foi removido, e salina tamponada com fosfato, na qual foi dissolvida albumina de soro bovino à 1%, foi dividida em uma quantidade de 250 μL, mantida à temperatura ambiente durante 2 horas, e, então, lavada 3 vezes com uma solução de lavagem (Tween 20 à 0,05 %, salina tamponada com fosfato) para remover a solução. Uma amostra foi diluída com salina tamponada com fosfato, na qual foi dissolvida albumina de soro bovino à 1 %, foi adicionada à placa com 96 cavidades, e reagida à temperatura ambiente durante 2 horas. A placa com 96 cavidades foi lavada 5 vezes com uma solução de lavagem, e um conjugado de anticorpo monoclonal anti (hormônio de crescimento humano) – biotina, conjugado usando sulfo NHS biotina (Pierce Biotechnology, EUA), foi diluído com uma solução diluente, e dividido para cada cavidade da placa com 96 cavidades em uma quantidade de 100 μL. Subsequentemente, a placa com 96 cavidades foi reagida, à temperatura ambiente durante 2 horas, e lavada 5 vezes com uma solução de lavagem. A seguir, uma solução de estreptavidina HRP foi adicionada à placa com 96 cavidades e reagida à temperatura ambiente durante 30 minutos. A placa com 96 cavidades foi lavada 5 vezes com uma solução de lavagem, e 100 μL de uma solução colorimétrica de 3,3’,5,5’ tetrametil benzidina (TMB) e peróxido de hidrogênio foram colocados em cada cavidade, e reagidos durante 30 minutos em um lugar escuro. 100 μL de ácido sulfúrico 1 M foram adicionados a cada cavidade para parar a reação, e mediu se para absorbância à 450 nm usando se uma leitora de microplacas VersaMax (Molecular Device, EUA). Um valor quantitativo de cada amostra foi calculado através de análise de regressão, depois que uma curva padrão foi traçada para um material de referência padrão.

[0083] O gráfico fármaco cinético da proteína de fusão de hormônio de crescimento humano / variante de antitripsina alfa-1, de acordo com a presente invenção, é mostrado na FIG. 9.

[0084] Conforme mostrado na FIG. 9, poderia ser visto que a meia vida (t1/2) no sangue da proteína de fusão de hormônio de crescimento humano / variante de antitripsina alfa-1, de acordo com a presente invenção, foi de aproximadamente 6 horas, o que foi mais do que 4 vezes aquela do hormônio de crescimento humano, indicando que a proteína de fusão com variante aumentou, de maneira notável, a estabilidade no corpo.

Exemplo Experimental 5: Teste fármaco-cinético em fusão de fator estimulante de colônia de granulócitos / variante dupla de antitripsina alfa-1

[0085] Para determinar a fármaco cinética da proteína de fusão de fator estimulante de colônia de granulócitos / variante dupla de antitripsina alfa-1, de acordo com a presente invenção, foram realizados experimentos como se segue. Ratos Sprague Dawley foram usados como animais de laboratório e alocados em um grupo administrado com fator estimulante de colônia de granulócitos (N = 5) e em um grupo administrado com proteína de fusão (N = 3). A proteína de fusão de fator estimulante de colônia de granulócitos / variante dupla de antitripsina alfa-1 (pT603N), preparada no Exemplo 3, foi injetada subcutaneamente nos ratos Sprague Dawley em uma dose de 340 μg por rato, e salina tamponada com fosfato (PBS) foi usada como uma solução diluída. Depois dos pontos de tempo de 0, 1, 2, 4, 8, 12, 16, 24, 36, 48, 60 e 72 horas, depois de injeção subcutânea, foi tirado sangue, e, então, centrifugados para se obter soros. Um fator estimulante de colônia de granulócitos, Grasin (Filgrastim), foi diluído com salina tamponada com fosfato, e injetado subcutaneamente como o controle em uma dose de 100 μg por rato. Depois dos pontos de tempo de 0; 0,5; 1; 2; 4; 8; 12; 16; 24; 36 e 48 horas, sangue foi retirado, e, então, centrifugado para se obter os soros. Cada amostra foi analisada usando um ELISA, conforme será descrito abaixo. Um anticorpo monoclonal (R&D Systems) contra o fator estimulante de colônia de granulócitos foi diluído com salina tamponada com fosfato em uma concentração de 1 a 10 μg/mL, e dividido em cada cavidade de uma placa com 96 cavidades (Nunc, Dinamarca) em uma quantidade de 100 μL. Depois disso, a solução resultante foi mantida à temperatura ambiente durante 15 a 18 horas. O anticorpo, que não estava fixado à placa com cavidades, foi, então, removido, e salina tamponada com fosfato, na qual foi dissolvida albumina de soro bovino à 1 %, foi dividida em uma quantidade de 250 μL, mantida à temperatura ambiente durante 2 horas, e, então, lavada 3 vezes com uma solução de lavagem (Tween 20 à 0,05 %, salina tamponada com fosfato) para remover a solução. Uma amostra foi diluída com salina tamponada com fosfato, na qual foi dissolvida albumina de soro bovino à 1 %, adicionada à placa com 96 cavidades e reagida à temperatura ambiente durante 2 horas. A placa com 96 cavidades foi lavada 5 vezes com uma solução de lavagem, e um conjugado de anticorpo monoclonal de fator estimulante de colônia de granulócitos – biotina (R&D Systems) foi diluído com uma solução diluente, e dividido e cada cavidade da placa com 96 cavidades em uma quantidade de 100 μL. Subsequentemente, a placa com 96 cavidades foi reagida à temperatura ambiente durante 2 horas, e lavada 5 vezes com uma solução de lavagem. A seguir, uma solução de estreptavidina HRP foi adicionada à placa com 96 cavidades, e reagida à temperatura ambiente durante 30 minutos. A placa com 96 cavidades foi lavada 5 vezes com uma solução de lavagem, e 100 μL de uma solução colorimétrica de 3,3’,5,5’ tetrametil benzidina (TMB) e peróxido de hidrogênio foram colocados em cada cavidade, e reagidos durante 30 minutos em um lugar escuro. 100 μL de ácido sulfúrico 1 M foram adicionados a cada cavidade para parar a reação, e mediu se para absorbância em 450 nm usando se uma leitora de microplacas VersaMax (Molecular Device, EUA). Um valor quantitativo de cada amostra foi calculado através de análise de regressão, depois que uma curva padrão foi traçada para um material de referência padrão. O gráfico fármaco cinético da proteína de fusão de fator estimulante de colônia de granulócitos / variante de antitripsina alfa-1, de acordo com a presente invenção, é mostrado na FIG. 10.

[0086] Conforme mostrado na FIG. 10, foi confirmado que a proteína de fusão de fator estimulante de colônia de granulócitos / variante dupla de antitripsina alfa-1, de acordo com a presente invenção, exibiu meia vida (t1/2) no sangue de aproximadamente 7,3 horas, que foi aproximadamente 3 vezes mais do que a meia vida (t1/2) no sangue (2,7 horas) do fator estimulante de colônia de granulócitos, e a AUC foi notavelmente aumentada para 3 vezes ou mais do que aquela do fator estimulante de colônia de granulócitos. A partir dos resultados, foi concluído que, quando uma proteína heterogênea, tal como uma proteína fisiologicamente ativa, foi ligada à variante dupla de antitripsina alfa-1, a meia vida da proteína heterogênea foi aumentada.

Aplicabilidade Industrial

[0087] Quando a variante de antitripsina alfa-1, tendo um sítio de N glicosilação adicionado a ela através de mutação de aminoácido entre a 1ª e a 25ª posições do N terminal, de acordo com a presente invenção, for usada para prevenir ou tratar a deficiência de antitripsina alfa-1, a meia vida (t1/2) no sangue e a área sob a curva (AUV) de concentração de droga no sangue versus tempo podem ser notavelmente aumentadas, para exibir excelente estabilidade no corpo e manter um efeito inibitório sobre as atividades de elastase. Portanto, a variante de antitripsina alfa-1 de acordo com a presente invenção pode ser usada para tratar a deficiência de antitripsina alfa-1, e pode ser útil no aumento da meia vida de uma proteína heterogêna no corpo, quando a proteína heterogênea estiver ligada à variante de antitripsina alfa-1. Consequentemente, a variante de antitripsina alfa-1 de acordo com a presente invenção pode ser útil na prevenção ou no tratamento da deficiência de antitripsina alfa-1.

[0088] A presente invenção foi descrita em detalhes. No entanto, deve ser entendido que a descrição detalhada e os exemplos específicos, embora indicando modalidades preferidas da invenção, são dados somente por meio de ilustração, e várias mudanças e modificações dentro do espírito e do escopo da invenção tornar se ão evidentes para os técnicos especializados no assunto a partir desta descrição detalhada.

Claims

Variante de antitripsina alfa-1, caracterizada por compreender uma substituição de um aminoácido em um sítio específico selecionado dentre, a 9ª ou 12ª posição do Nterminal da antitripsina alfa-1 do tipo selvagem, a fim de adicionar um sítio de glicosilação à antitripsina alfa-1, em que a variante compreendendo uma substituição de aminoácido na 9ª posição do N-terminal da antitripsina alfa-1 selvagem compreende a sequência de aminoácidos correspondente à SEQ ID NO: 42, e em que a variante compreendendo uma substituição de aminoácido na 12ª posição do N-terminal da antitripsina alfa-1 selvagem compreende a sequência de aminoácidos correspondente à SEQ ID NO: 46.
Variante de antitripsina alfa-1, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por os sítios específicos estarem presentes na 9ª e 12ª posições do N-terminal de antitripsina alfa-1 do tipo selvagem.
Método de preparação de uma variante de antitripsina alfa-1 conforme descrito na reivindicação 1 ou 2, caracterizado por compreender:
- a) a substituição de um aminoácido em um local específico selecionado da 9a e 12a posições do N-terminal da antitripsina alfa-1 de tipo selvagem, a fim de adicionar um local de glicosilação;
- b) o cultivo de células transformadas com um vetor de expressão de antitripsina alfa1, tendo o sítio de glicosilação a ele adicionado, em um meio de cultura;
- c) a expressão de uma proteína de variante de antitripsina alfa-1 a partir das células; e
- d) a purificação e a recuperação da proteína de variante de antitripsina alfa-1 expressa.
Composição farmacêutica compreendendo variante de antitripsina alfa-1 conforme descrito na reivindicação 1 ou 2, caracterizada por compreender a variante de antitripsina alfa-1 como ingrediente ativo e pelo menos um veículo farmaceuticamente aceitável.
Variante de antitripsina alfa-1, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada por ser usada no tratamento ou prevenção de deficiência de antitripsina alfa-1.
Variante de antitripsina alfa-1, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada por ser usada no tratamento ou prevenção de deficiência de antitripsina alfa-1 de acordo com reivindicação 5, sendo que a deficiência de antitripsina alfa-1 é doença pulmonar obstrutiva crônica ou cirrose hepática.
Fusão de variante de antitripsina alfa-1 compreendendo uma proteína heterogênea tendo uma meia-vida aumentada no corpo, caracterizada por compreender:
- (i) uma primeira variante de alfa-1 antitripsina como definida na reivindicação 1 ou 2 ligada a uma segunda primeira variante de alfa-1 antitripsina como definida na reivindicação 1 ou 2; ou
- (ii) uma primeira variante de alfa-1 antitripsina como definida na reivindicação 1 ou 2 ligada a uma proteína heterogênea.
Fusão de variante de antitripsina alfa-1, de acordo com a reivindicação 7, caracterizada por a variante de antitripsina alfa-1 do tipo selvagem tendo um aminoácido prolina em uma 357ª posição, que é uma posição P2, é adicionalmente substituído por asparagina.