CN112851822A - 一种人重组乙型干扰素融合蛋白 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种人重组乙型干扰素融合蛋白。所述人重组乙型干扰素融合蛋白为人乙型干扰素与抗人血清白蛋白重链单域抗体的融合蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。所述抗人血清白蛋白重链单域抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明通过构建抗人血清白蛋白的重链单域抗体与乙型干扰素融合表达克隆，导入到宿主细胞进行表达，获得具有较长作用时间的重链单域抗体‑乙型干扰素融合蛋白。
Description
本申请是申请日为2014年4月9日、中国申请号为201410140796.0、发明名称为“一种人重组乙型干扰素融合蛋白”的发明申请的分案申请。
技术领域
本发明属于生物医药领域，涉及一种人重组乙型干扰素融合蛋白。
背景技术
乙型干扰素(又称为β干扰素，Interferon-β，IFN-β)是由体内纤维细胞和巨噬细胞分泌的细胞因子，是一种糖蛋白，含166个氨基酸，分子量约为20,500道尔顿，具有抗炎症功能，抗病毒、抗增殖以及免疫调节活性，其作为药物可广泛用于抗感染、抗肿瘤和拮抗自身免疫性疾病。然而，乙型干扰素血浆半衰期短，只有频繁给药才能获得令人满意的疗效。但如此频繁给药再加上较长的治疗周期，使得病人难以承受，迫切需要研制作用时间长的乙型干扰素。
人血清白蛋白(HSA)是人体血液中天然的物质输送载体，血清中含量最高，其相对分子量约为65kDa，由585个氨基酸组成的单链球型蛋白质，无酶学及免疫学活性，体内半衰期长达19天。
骆驼和鲨鱼类动物体内存在着天然缺失轻链的重链抗体(heavy-chainantibody，HCAb)，这种抗体只包含一个重链可变区(variable domain of heavy chain ofHCAb，VHH)和两个常规的CH2与CH3区，单独克隆并表达出来的VHH区，称为重链单域抗体，具有很好的结构稳定性与抗原结合活性，分子量只有15kDa，可溶性极高，不易聚集，能耐高温等致变性条件。
噬菌体表面呈现技术是一种应用最广泛的抗体库技术，该技术通过构建抗体文库，然后将抗体基因表达于噬菌体表面，用固相化抗原对表达产物的载体进行淘筛，能够获得高度特异性的抗体。
发明内容
本发明的目的在于提供一种重组乙型干扰素融合蛋白，该融合蛋白具有较长的半衰期。
本发明所述的一种人重组乙型干扰素融合蛋白，为人乙型干扰素与抗人血清白蛋白重链单域抗体的融合蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
根据本发明所述的融合蛋白的进一步特征，所述抗人血清白蛋白重链单域抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明采用羊驼作为免疫动物，运用噬菌体表面呈现技术，从免疫羊驼外周血收集淋巴细胞，构建了库容量为5×107的抗人血清白蛋白(HSA)重链抗体文库。通过HSA筛选，获得1株抗HSA的重链抗体。克隆该抗体的VHH获得重链单域抗体，然后构建重链单域抗体与乙型干扰素融合表达克隆，导入到宿主细胞进行表达，获得具有较长作用时间的重链单域抗体-乙型干扰素融合蛋白。
附图说明
图1为在酵母细胞重组表达重链单域抗体-人乙型干扰素融合蛋白流程图。
图2为pPicZα-6His-Zipper1-CTHS-VHH-IFN转化酵母菌后，挑取4单菌落的诱导表达结果。
图3为重链单域抗体-人乙型干扰素融合蛋白细胞病变抑制结果。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明做进一步说明，目的在于解释本发明的内容而非限制发明的保护范围。下面实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，如Sambrook等人著，分子克隆：试验指南(New York，Cold Spring Habour LaboratoryPress)中所述条件，或按照制造厂商建议条件进行。
1.抗HSA重链单域抗体(VHH)的筛选
(1)羊驼的免疫
用人血清白蛋白(HSA)免疫两只羊驼，免疫方案如下：
免疫羊驼抗原用量：0.5mg，0.5mg，1.0mg，1.0mg，2.0mg，2.0mg，4.0mg，4.0mg。
免疫间隔时间：2周。
免疫方法：
第一次免疫：抗原加弗式完全佐剂研磨混匀，皮下多点注射。
后续免疫：抗原加弗式不完全佐剂，皮下多点注射，0.5ml/点，4点/次。每次免疫前取少量血，用ELISA方法检测羊驼血中抗HSA抗体的滴度。
(2)抗HSA免疫噬菌体抗体库的构建
收集免疫羊驼外周血，分离淋巴细胞，提取总RNA，反转录合成cDNA。用特异性引物，采用巢氏PCR方法扩增重链可变区片段。构建库容量为5×107的抗HSA免疫噬菌体抗体库，酶切鉴定重组率为90％。
第一轮PCR引物：
5’引物：5’-GATGTGCAGCTGCAGGCGTCTGGRGGAGG-3’SEQ ID NO.3
5’-GTCCTGGCTCTCTTCTACAAGG-3’SEQ ID NO.4
3’引物：5’-CGCCATCAAGGTACCAGTTGA-3’SEQ ID NO.5
5’-GGTACGTGCTGTTGAACTGTTCC-3’SEQ ID NO.6
第二轮PCR引物：
5’引物：
5’-GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCGAGGTGCAGCTGGTGGAGTGTGG-3’SEQ IDNO.7
5’-GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGGTRCAGCTGGTGGAGTCTGG-3’SEQ IDNO.8
5’-GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGGTAAAGCTGGAGGAGTCTGG-3’SEQ IDNO.9
5’-GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCGATGTGCAGCTGGTGGAGTCTGG-3’SEQ IDNO.10
5’-GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCGCCGTGCAGCTGGTGGATTCTGG-3’SEQ IDNO.11
5’-GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCGCGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGG-3’SEQ IDNO.12
3’引物：
5’-GGACTAGTGCGGCCGCGTGAGGAGACGGTGACCTG-3’SEQ ID NO.13
5’-GGACTAGTGCGGCCGCTATGAGGAGACGGTGACCTG-3’SEQ ID NO.14
第一轮PCR反应条件：94℃ 5分钟预变性，94℃ 30秒，56℃ 30秒，72℃ 50秒，35个循环，72℃ 10分钟。
第二轮PCR反应条件：94℃ 5分钟预变性，94℃ 30秒，56℃ 30秒，72℃ 50秒，30个循环，72℃ 10分钟。
(3)抗HSA免疫噬菌体抗体库的富集筛选
筛选抗原为HSA，用pH9.6的碳酸盐缓冲液稀释抗原，浓度为5μg/ml，取2ml包被免疫试管，对抗体库进行3轮富集筛选后，用噬菌体-ELASA方法筛选阳性克隆。
(4)抗HSA免疫噬菌体抗体库的筛选
挑选192个富集筛选后的单菌落，37℃振摇过夜。然后按1∶100转接于新鲜200ul2YTGA中，37℃振摇2.5小时，M13K07超感染。3,500rpm，10min收集菌体，然后用200ul2YTGAK重悬细菌沉淀。30℃振摇过夜，次日11,000rpm离心15min，取上清进行鉴定。用HSA包被ELISA板，加入上述上清，HRP标记鼠抗噬菌体M13单抗(GE Healthcare)为二杭，TMB显色。M13K07为阴性对照，免疫羊驼血清为阳性对照。对抗体库进行筛选，获得1株阳性克隆。然后对阳性克隆进行测序，获得抗HAS的VHH序列，其序列为SEQ ID NO.2。
2.表达VVH-IFN的酵母表达载体的构建
His-Zipper2-CTHS的DNA序列通过分别通过EcoRI和XhoI位点插入到pPicZα中，再通过BsaI和Xhol位点插入抗HAS的VHH，最后通过XhoI和XbaI位点插入乙型干扰素IFN，构建酵母表达质粒pPicZα-6His-Zipper1-CTHS-VHH-IFN，其中，6His-Zipper1-CTHS-VHH-IFN的序列为SEQ ID NO.1。
其中，CTHS是SUMO的C末端(C-SUMO)的简写。对应的SUMO的N端简称为NTHS(或NT)，Zipper是指亮氨酸拉链。
实施例2.酵母表达和蛋白纯化
将质粒pPicZα-6His-Zipper1-CTHS-IFN转化到毕赤酵母，挑取单克隆，接种至含100ml BMGY培养基的1L隔板摇瓶中。在摇床中28-30℃，250-300rpm生长至OD600＝2-6，以1500-3000g离心5min收集细胞，去除上清，用1/5-1/10原培养基体积的BMMY重悬细胞(约10-20ml)，在接种于100ml隔板摇瓶中，用2层灭菌纱布或干酪包布盖住瓶口，放入摇床继续培养。每隔24小时，加入甲醇至终浓度为0.5％以诱导。
诱导结束后，以12,000rpm离心30min，取上清，用孔径为0.45μm滤膜过滤，然后进行Ni-NTA亲和层析，采用连续梯度洗脱方式(平衡液：50mM Tris(pH8.0)，50mM NaCl，2.5％Glycerol；洗脱液：50mM Tris(pH8.0)，50mM NaCl，2.5％Glycerol，500mM Imidazol)，按峰收集，每个收集样品进行SDS-PAGE电泳检测。
将含有目的蛋白的收集样品合并，加入6His-NTHS-Zipper2蛋白混匀，6His-Zipper1-CTHS和6His-NTHS-Zipper2能够重建SUMO蛋白分子(该方法见专利ZL200810036879.X)。然后将混合物进行SUMO酶切，切除重组成为完整的SUMO分子酶切的反应条件是按照Genecopoeoia公司CoolcutTM protease产品说明书建议进行。
然后，将酶切产物进行Ni-NTA亲和层析(平衡液：50mM Tris(pH8.0)，50mM NaCl，2.5％Glycerol，洗脱液：50mM Tris(pH8.0)，50mM NaCl，2.5％Glycerol，500mMImidazol)，收集穿透液，随后进行SDS-PAGE电泳检测，获得了VHH-IFN蛋白。
实施例3.乙型干扰素细胞病变抑制法(cytopathic effect inhibition，CPEI)
将不同稀释度的乙型干扰素样品加入96孔平底培养板中，100μl/孔；将不同稀释度的标准品加入96孔平底培养板中，100μl/孔；每孔加4X106/ml Wish细胞，100μl/孔；除Wish细胞对照孔外，每孔加VSV病毒，50μl/孔；置5％CO2，37℃培养箱培养48-52小时；镜下观察病毒对照孔出现细胞病变时，弃上清，加入结晶紫染液染色5分钟；用流水冲洗培养板，直到冲洗液无色为止，晾干培养板；每孔加入70％乙醇150μl/孔。使结晶紫充分溶解；酶标仪上比色，读取600nm波长的数值。
采用Avonex(美国BIOGEN公司生产的乙型干扰素)作为对照，该药于1995年通过美国FDA批准使用的用于多发性硬化病的治疗药，结果显示，本发明所述的人重组乙型干扰素融合蛋白(VHH-IFN蛋白)具有与对照相似的活性。
Claims (2)
1.一种人重组乙型干扰素融合蛋白，为人乙型干扰素与抗人血清白蛋白重链单域抗体的融合蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于：所述抗人血清白蛋白重链单域抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
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