CN113735962B - 一种从猪血中纯化重组人血清白蛋白的方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种从猪血中纯化重组人血清白蛋白的方法及应用。所述方法包括以下步骤：(1)含有人血清白蛋白的猪血上清经阴离子交换层析后，得到第一层析产物；(2)所述第一层析产物经复合型离子交换层析，得到第二层析产物；(3)所述第二层析产物经疏水层析，得到纯化的重组人血清白蛋白。所述方法在阴离子交换层析步骤之前还存在前处理操作，以除去部分杂质。本发明提供的方法高效，简便，能够得到高纯度的重组人血清白蛋白以应用于临床治疗，且三步层析操作所使用的层析介质已经实现商业化，能够更好地进一步实现工业化，具有重大的现实意义。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，特别涉及一种从猪血中纯化重组人血清白蛋白的方法及应用。
背景技术
人血清白蛋白(human serum albumin,HSA)是由585个氨基酸组成的单链非糖基化的可溶性多肽，分子量为66.6kDa，等电点在4.7-4.9之间。整个单链蛋白分子共有17对二硫键，1个半胱氨酸位点和1个色氨酸位点。HAS作为血浆中含量最丰富的蛋白质，在维持血浆血压、抗凝血等方面发挥重要作用，能够保护和稳定血液中的免疫球蛋白，具有重要的医用价值，在临床上需求量很大。
目前，临床上使用的HSA主要从人血中进行提取、分离而得到。然而该方法存在着供应原料不足的缺点，且血液本身可能存在携带肝炎病毒或HIV病毒的风险，使得人们对采用血浆中提取的HAS有着巨大的担忧。因此，采用DNA重组技术生产人血清白蛋白得到了开发利用。
研究人员利用CRISPR/Cas9技术对猪受精卵的基因组进行编辑，在猪白蛋白基因区域插入人血清白蛋白基因，使猪血中只产生重组人血清白蛋白(recombinant humanserum albumin,rHSA)，通过纯化猪血浆获得大量高纯度的rHSA。由于转基因猪血中分离纯化的rHSA必须符合临床用药和生化研究的要求，因此，分离纯化rHSA是从转基因猪血中制备rHSA的关键步骤。
CN112210002A公开了一种重组人血清白蛋白的纯化方法，包括以下步骤：将含重组人血清白蛋白的发酵液依次进行除杂、第一浓缩换液、第一阳离子交换层析、疏水层析、第二浓缩换液、阴离子交换层析、亲和层析、第三浓缩换液和第二阳离子交换层析，经过五步层析纯化后，重组人血清白蛋白的纯度能达到99.97％。但该研究中采用的纯化方法比较复杂，步骤较多。
CN110092827A公开了一种获得高纯度重组人血清白蛋白的纯化方法，该方法包括：除杂处理和依次进行的阳离子交换层析、阴离子交换层析及疏水层析步骤，得到的重组人血清白蛋白具有纯度高、杂质少、不易降解、稳定性高等优势，具有良好的应用前景。但该研究中的除杂处理包括依次进行的初级超滤、二级超滤、杂质去除、蛋白复性、洗脱及透析步骤，过程较为繁琐，耗时耗力。
CN102532254A公开了一种从转基因水稻中分离纯化重组人血清白蛋白的方法，依次包括：阳离子交换层析、阴离子交换层析和疏水层析，方法简单易行，经济成本低，获得的重组人血清白蛋白的纯度能够达到99％以上。但该研究中并没有公开从猪血白蛋白中纯化rHSA的方法。
基于以上研究，得到高纯度的重组人血清蛋白是满足临床用药的关键所在，以上研究虽然都能够得到纯度在99％以上的rHSA，但CN112210002A和CN110092827A都存在着步骤繁琐的问题，CN102532254A虽然分离纯化rHSA的方法简便，但并没有公开从猪血白蛋白中纯化rHSA的方法，且以上研究采用的均为依次进行阳离子层析、阴离子层析及疏水层析的步骤，没有公开其他的层析操作。
因此，找到一种高效、简便的从猪血白蛋白中分离、纯化重组人血清白蛋白的方法，获得高纯度的重组人血清白蛋白，对临床治疗和生化研究具有重大的现实意义。
发明内容
针对现有技术的不足和现实的实际需求，本发明的目的在于提供一种从猪血中纯化重组人血清白蛋白的方法及应用。所述的方法依次通过阴离子交换层析、复合型离子交换层析和疏水层析得到重组人血清白蛋白，方法高效、简便，得到的重组人血清白蛋白纯度达标，对临床治疗具有重大的现实意义。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种从猪血中纯化重组人血清白蛋白的方法，所述方法包括如下步骤：
(1)含有人血清白蛋白的猪血上清经阴离子交换层析后，得到第一层析产物；
(2)所述第一层析产物经复合型离子交换层析，得到第二层析产物；
(3)所述第二层析产物经疏水层析，得到纯化的重组人血清白蛋白。
本发明采用阴离子交换层析，捕获猪血上清中重组人血清白蛋白；随后采用复合型离子交换层析对得到的重组人血清白蛋白进行中度纯化；最终采用疏水层析对中度纯化的重组人血清白蛋白进行精细纯化。
需要说明的是本发明依次采用阴离子交换层析、复合型离子交换层析和疏水层析捕获重组人血清白蛋白并进行纯化，通过三步层析之间的协调复配作用提高纯化效果，最终得到高纯度的重组人血清白蛋白。若改变三步层析之间的顺序将导致纯化效果差，无法得到合格的重组人血清白蛋白样品。
优选地，步骤(1)所述阴离子交换层析使用的介质为阴离子交换层析介质。
优选地，所述阴离子交换层析介质包括NanoGel 50Q。
优选地，步骤(2)所述复合型离子交换层析使用的介质为复合型离子交换层析介质。
优选地，所述复合型离子交换层析介质包括Agrose HCM。
优选地，步骤(3)所述疏水层析使用的介质为疏水层析介质。
优选地，所述疏水层析介质包括聚丙烯。
本发明中采用的NanoGel 50Q层析介质，机械强度优异、化学稳定性好、粒径均一，其以聚苯乙烯/二乙烯基苯微球为基质，通过表面亲水性改性降低非特异性吸附，具有高流速、高分辨率、高载量和低反压的层析优势；Agrose HCM层析介质是在高交联琼脂糖微球上键合了疏水基团和离子基团的复合型离子交换层析介质，具有不同于传统离子交换层析介质的优异选择性；聚丙烯疏水层析介质机械强度高，分辨率高，在高盐条件下吸附生物分子，低盐下洗脱，具有卓越吸附载量和低非特异性吸附，适用于离子交换过程之后产品的继续分离纯化。
本发明中将NanoGel 50Q、Agrose HCM和聚丙烯疏水层析介质联合使用，按照特定顺序使用所述三种层析介质，三者之间协同配合达到洗脱和纯化的效果，最终得到纯度较高、产量也较高的重组人血清白蛋白。
优选地，步骤(1)所述阴离子交换层析包括装柱、上样和洗脱。
优选地，所述阴离子交换层析的具体操作包括：
将阴离子交换层析介质装柱后得到阴离子交换层析柱，加入缓冲溶液A，随后，加入所述含有人血清蛋白的猪血上清，再向所述阴离子交换层析柱中加入淋洗液，而后，依次加入洗脱液A和洗脱液B进行一次洗脱和二次洗脱，收集所述二次洗脱后的液体作为第一层析产物。
优选地，所述缓冲溶液A包括磷酸缓冲溶液。
优选地，所述淋洗液包括含有氯化钠的磷酸缓冲溶液。
所述淋洗液可以改善选择性，洗脱部分杂质，方便产品后续的分离、纯化。
优选地，所述一次洗脱采用洗脱液A，所述洗脱液A包括含有氯化钠的磷酸缓冲溶液。
优选地，所述洗脱液A中的氯化钠溶液的电导率为19～21mS/cm，例如可以是19.2mS/cm、19.4mS/cm、19.5mS/cm、19.6mS/cm、19.8mS/cm、20mS/cm、20.2mS/cm、20.4mS/cm、20.5mS/cm、20.6mS/cm、20.8mS/cm或21mS/cm，但并不仅限于所列举的数值，上述各数值范围内其他未列举的数值同样适用。
优选地，所述二次洗脱采用洗脱液B，所述洗脱液B包括含有氯化钠的磷酸缓冲溶液。
优选地，所述洗脱液B中的氯化钠溶液的摩尔浓度为0.8～1.2M，例如可以是0.85M、0.9M、0.95M、1M、1.05M、1.1M、1.15M或1.2M，但并不仅限于所列举的数值，上述各数值范围内其他未列举的数值同样适用。
所述淋洗液、洗脱液A和洗脱液B中均加入了氯化钠，能够提供生理盐浓度，保证猪血在一定的生理条件下，避免猪血中的蛋白发生溶解或构象的改变。
优选地，所述缓冲溶液A、淋洗液、洗脱液A和洗脱液B的pH值相同或不同，所述pH值为7.2～7.6，例如可以是7.2、7.3、7.4、7.5或7.6，但并不仅限于所列举的数值，上述各数值范围内其他未列举的数值同样适用。
优选地，所述缓冲溶液A、淋洗液、洗脱液A和洗脱液B的pH值相同。
所述缓冲溶液A、淋洗液、洗脱液A和洗脱液B的pH值相同，使得猪血始终在同样的pH环境下，能够保证蛋白的稳定性。
优选地，步骤(2)所述复合型离子交换层析包括装柱、上样和洗脱。
优选地，所述复合型离子交换层析的具体操作包括：
将复合型离子交换层介质装柱后得到复合型离子交换层柱，加入缓冲溶液B，随后，加入所述第一层析产物，而后，加入洗脱液C进行洗脱，收集所述洗脱后的液体作为第二层析产物。
优选地，所述复合型离子交换层析中的洗脱为等度洗脱。
本发明中所述等度洗脱采用的洗脱液包括体积分数为20％、80％或100％的缓冲溶液B。
所述等度洗脱过程中流动相的比例不发生变化，条件单一，方法简单，且对仪器的要求不高，方便分离、纯化过程的实现。
优选地，所述缓冲溶液B包括磷酸缓冲溶液。
优选地，洗脱液C为含有氯化钠溶液的磷酸缓冲溶液。
优选地，所述缓冲溶液B和洗脱液C的pH值相同或不同，所述pH值为5.7～6.3，例如可以是5.7、5.75、5.8、5.85、5.9、5.95、6、6.05、6.1、6.15、6.2、6.25、6.3，但并不仅限于所列举的数值，上述各数值范围内其他未列举的数值同样适用。
优选地，所述缓冲溶液B和洗脱液C的pH值相同。
优选地，步骤(3)所述疏水层析包括装柱、上样和洗脱。
优选地，所述疏水层析的具体操作包括：
将疏水层析介质装柱后得到疏水层析柱，加入缓冲溶液C，随后，加入所述第二层析产物，而后，加入洗脱液D进行洗脱，收集所述洗脱后的液体，得到所述纯化的重组人血清白蛋白。
优选地，所述疏水层析中的洗脱为梯度洗脱。
本发明所述梯度洗脱液为不同体积分数是的洗脱液D。
所述梯度洗脱通常设置为变化的流动相比例，使得洗脱强度越来越强，从而保证在较短的时间内，样品中的强保留组分也能被洗脱出来。
优选地，所述缓冲溶液C为含有氯化钠溶液的磷酸缓冲溶液。
优选地，所述洗脱液D包括磷酸缓冲溶液。
优选地，所述缓冲溶液C和洗脱液D的pH值相同或不同，所述pH值为6.7～7.3，例如可以是6.7、6.75、6.8、6.85、6.9、6.95、7、7.05、7.1、7.15、7.2、7.25或7.3，但并不仅限于所列举的数值，上述各数值范围内其他未列举的数值同样适用。
优选地，所述缓冲溶液C和洗脱液D的pH值相同。
优选地，步骤(1)所述含有人血清白蛋白基因的猪血在上样前还包括前处理的步骤。
优选地，所述前处理步骤包括：取含有人血清蛋白的猪血上清加水进行稀释，随后加入稳定剂，调节pH，并进行热处理，得到除杂的猪血。
所述前处理操作能够达到猪血中病毒灭活并除去部分杂质的效果，方便后续的分离、纯化。
优选地，所述稳定剂包括辛酸和/或辛酸钠。
所述稳定剂能够在前处理过程中起到保护蛋白的作用，避免蛋白发生降解。
优选地，所述稳定剂的摩尔浓度为45～55mM，例如可以是45mM、46mM、47mM、48mM、49mM、50mM、51mM、52mM、53mM、54mM或55mM，但并不仅限于所列举的数值，上述各数值范围内其他未列举的数值同样适用。
优选地，所述热处理的温度为65～75℃，例如可以是65℃、66℃、67℃、68℃、69℃、70℃、71℃、72℃、73℃、74℃或75℃，但并不仅限于所列举的数值，上述各数值范围内其他未列举的数值同样适用。
优选地，所述热处理的时间为3.5～4.5h，例如可以是3.5h、3.6h、3.7h、3.8h、3.9h、4.0h、4.1h、4.2h、4.3h、4.4h或4.5h，但并不仅限于所列举的数值，上述各数值范围内其他未列举的数值同样适用。
优选地，所述前处理步骤得到的含有人血清蛋白的猪血上清的电导率为4～5mS/cm，例如可以是4mS/cm、4.1mS/cm、4.2mS/cm、4.3mS/cm、4.4mS/cm、4.5mS/cm、4.6mS/cm、4.7mS/cm、4.8mS/cm、4.9mS/cm或5mS/cm，但并不仅限于所列举的数值，上述各数值范围内其他未列举的数值同样适用。
优选地，所述第一层析产物在上样前经过稀释处理。
优选地，稀释所述第一层析产物使用的溶液为含有氯化钠溶液的磷酸缓冲溶液。
优选地，所述稀释后的第一层析产物的电导率为7.6～8.4mS/cm，例如可以是7.6mS/cm、7.65mS/cm、7.7mS/cm、7.75mS/cm、7.8mS/cm、7.85mS/cm、7.9mS/cm、7.95mS/cm、8mS/cm、8.05mS/cm、8.1mS/cm、8.15mS/cm、8.2mS/cm、8.25mS/cm、8.3mS/cm、8.35mS/cm或8.4mS/cm，但并不仅限于所列举的数值，上述各数值范围内其他未列举的数值同样适用。
优选地，所述第二层析产物在上样前经过稀释处理。
优选地，稀释所述第二层析产物使用的溶液为含有氯化钠溶液的磷酸缓冲溶液。
优选地，所述稀释后的第二层析产物的电导率为155～165mS/cm，例如可以是155mS/cm、156mS/cm、157mS/cm、158mS/cm、159mS/cm、160mS/cm、161mS/cm、162mS/cm、163mS/cm、164mS/cm或165mS/cm，但并不仅限于所列举的数值，上述各数值范围内其他未列举的数值同样适用。
需要说明的是，本发明依次采用的阴离子交换层析、复合型离子交换层析和疏水层析步骤中，上样溶液均需要预先稀释，从而防止上样溶液的盐浓度过高降低层析的纯化效果。
作为优选技术方案，本发明提供了一种从猪血中纯化重组人血清白蛋白的方法，所述方法包括以下步骤：
(1)稀释含有人血清蛋白的猪血上清，加入摩尔浓度为45～55mM的稳定剂，调节pH，65～75℃加热3.5～4.5h，得到除杂的猪血；
向NanoGel 50Q阴离子交换层析柱中加入缓冲溶液A，并将除杂的猪血进行稀释作为阴离子交换层析的上样溶液，所述稀释后含有人血清蛋白的猪血上清的电导率范围为4～5mS/cm；
随后依次加入淋洗液、洗脱液A和洗脱液B，其中，洗脱液A用于一次洗脱，洗脱液B用于二次洗脱，而后收集所述二次洗脱后的液体，得到第一层析产物；
(2)向Agrose HCM复合型离子交换层析柱中加入缓冲溶液B，并将步骤(1)所述的第一层析产物进行稀释作为复合型离子交换层析柱的上样溶液，随后加入洗脱液C进行等度洗脱，收集所述等度洗脱后的液体，得到第二层析产物；
(3)向聚丙烯疏水层析柱中加入缓冲溶液C，并将步骤(2)所述的第二层析产物进行稀释作为疏水层析柱的上样溶液，随后加入洗脱液D进行梯度洗脱，收集所述梯度洗脱后的液体，得到纯化的重组人血清白蛋白。
第二方面，本发明提供一种利用如第一方面所述的方法制备得到的重组人血清白蛋白。
本发明获得的重组人血清白蛋白纯度较高，可用于临床治疗和生物研究。
第三方面，本发明提供一种如第一方面所述的方法在制备重组人血清白蛋白中的应用。
本发明获得的重组人血清白蛋白纯度较高，应用范围较广。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明提供了一种从猪血中纯化重组人血清白蛋白的方法，在第一步使用阴离子交换层析后得到的重组人血清白蛋白的纯度可达到80～90％，在第二步使用复合型离子交换层析后得到的重组人血清白蛋白的纯度可达到90～97％，最终经疏水层析得到的重组人血清白蛋白的纯度可达到99.9％，得到的高纯度重组人血清白蛋白能够用于临床治疗，具有重要的现实意义。
(2)本发明提供的纯化重组人血清白蛋白的方法高效，简便，三步层析操作所使用的层析介质已经实现商业化，能够更好地进一步实现工业化，从而更好的地应用于医疗行业。
附图说明
图1是实施例1中阴离子交换层析色谱图；
图2是实施例1中阴离子交换层析电泳图(1-Marker，2-上样溶液，3-穿透液1，4-穿透液2，5-淋洗液1，6-淋洗液2，7-洗脱液1，8-洗脱液2，9-洗脱液3，10-洗脱液4，11-再生液)；
图3是实施例1中复合型离子交换层析色谱图；
图4是实施例1中复合型离子交换层析电泳图(1-Marker，2-上样溶液，3-穿透液，4-淋洗液，5-洗脱液1，6-洗脱液2，7-洗脱液3，8-再生液)；
图5是实施例1中疏水层析色谱图；
图6是实施例1中疏水层析电泳图(1-Marker，2-上样溶液，3-穿透液1，4-穿透液2，5-洗脱液1，6-洗脱液2，7-洗脱液3，8-洗脱液4，9-洗脱液5，10-洗脱液6，11-再生液)；
图7是实施例1中阴离子交换层析得到的产物的HPLC谱图；
图8是实施例1中复合型离子交换层析得到的产物的HPLC谱图；
图9是实施例1中疏水层析得到的产物的HPLC谱图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
实施例1
本实施例提供一种从猪血中纯化重组人血清白蛋白的方法，具体步骤如下：
(1)稀释含有人血清蛋白的猪血上清，加入摩尔浓度为55mM的辛酸钠，调节pH，75℃加热4.5h，得到除杂的猪血；
向NanoGel 50Q阴离子交换层析柱中加入pH值为7.4的磷酸缓冲溶液A，并将除杂的猪血用水稀释作为阴离子交换层析的上样溶液，稀释后含有人血清蛋白的猪血上清的电导率范围为5mS/cm；
随后依次加入pH值为7.4的淋洗液(20mM的磷酸缓冲溶液，80mM的氯化钠溶液)、洗脱液A(20mM的磷酸缓冲溶液，19.8ms/cm的氯化钠溶液)和洗脱液B(20mM的磷酸缓冲溶液，1M的氯化钠溶液)，其中，洗脱液A用于一次洗脱，洗脱液B用于二次洗脱，而后收集所述二次洗脱后的液体，得到第一层析产物；
在步骤(1)中分别收集上样溶液、穿透液1(即上样中层析柱中流出的液体)、穿透液2(即上样结束后层析柱中流出的液体)、淋洗液1(即第一次淋洗后层析柱中流出的液体)、淋洗液2(即第一次淋洗后层析柱中流出的液体)、洗脱液1(即洗脱液A洗脱峰前半峰)、洗脱液2(即洗脱液A洗脱峰后半峰)、洗脱液3(即洗脱液B洗脱峰前半峰)、洗脱液4(即洗脱液B洗脱峰后半峰)和再生液(即氢氧化钠洗脱峰)进行凝胶电泳。
(2)向Agrose HCM复合型离子交换层析柱中加入pH值为6的磷酸缓冲溶液B，并对步骤(1)得到的第一层析产物采用磷酸缓冲溶液B进行稀释作为复合型离子交换层析柱的上样溶液，稀释后的溶液电导率为8mS/cm，随后加入pH值为6，体积分数为50％的洗脱液C(20mM的磷酸缓冲溶液，1M的氯化钠溶液)进行等度洗脱，收集所述等度洗脱后的液体，得到第二层析产物；
在步骤(2)中分别收集上样溶液、穿透液1(即上样中层析柱中流出的液体)、穿透液2(即上样结束后层析柱中流出的液体)、洗脱液1(即体积分数20％的洗脱液C洗脱液)、洗脱液2(即体积分数50％的洗脱液C洗脱液)、洗脱液3(即洗脱液C洗脱液)、和再生液(即氢氧化钠洗脱峰)进行凝胶电泳。
(3)向聚丙烯疏水层析柱中加入pH值为7的缓冲溶液C(20mM的磷酸缓冲溶液，2M的氯化钠溶液)，并对步骤(2)得到的第二层析产物采用4M的氯化钠溶液进行等体积稀释，并作为疏水层析柱的上样溶液，稀释后溶液的电导率为162mS/cm，随后加入pH值为7，体积分数为0～100％的洗脱液D(20mM的磷酸缓冲溶液)进行梯度洗脱，收集所述梯度洗脱后的液体，得到纯化的重组人血清白蛋白；
在步骤(3)中分别收集上样溶液、穿透液1(即上样中层析柱中流出的液体)、穿透液2(即上样后层析柱中流出的液体)、洗脱液1(即体积分数10％的洗脱液D洗脱峰前半峰)、洗脱液2(即体积分数10％的洗脱液D洗脱峰后半峰)、洗脱液3(即体积分数30％的洗脱液D洗脱峰前半峰)、洗脱液4(即体积分数30％的洗脱液D洗脱峰后半峰)、洗脱液5(即洗脱液D洗脱峰前半峰)、洗脱液6(即洗脱液D洗脱峰后半峰)和再生液(即氢氧化钠洗脱峰)进行凝胶电泳。
阴离子交换层析、复合型离子交换层析和疏水层析得到的产物的色谱图和电泳结果分别如图1-6所示。其中，图1、图3和图5为产物的色谱结果，说明三步层析的可操作性及后续放大性；图2、图4和图6为产物的电泳结果，可以看到经过三步层析获得的重组人血清白蛋白纯度较高。三步层析的HPLC谱图如图7-9所示，三步层析产物的纯度分别为88％、97％及99.9％，可以看出依次经过阴离子交换层析、复合型离子交换层析和疏水层析分离、纯化，能够得到高纯度重组人血清白蛋白，可以满足行业使用标准。
实施例2
本实施例提供一种从猪血中纯化重组人血清白蛋白的方法，具体步骤如下：
(1)稀释含有人血清蛋白的猪血上清，加入摩尔浓度为45mM的辛酸，调节pH，65℃加热3.5h，得到除杂的猪血；
向NanoGel 50Q阴离子交换层析柱中加入pH值为7的磷酸缓冲溶液A，并将除杂的猪血用水稀释作为阴离子交换层析的上样溶液，稀释后含有人血清蛋白的猪血上清的电导率范围为4mS/cm；
随后依次加入pH值为7的淋洗液(20mM的磷酸缓冲溶液，78mM的氯化钠溶液)、洗脱液A(20mM的磷酸缓冲溶液，19.5ms/cm的氯化钠溶液)和洗脱液B(20mM的磷酸缓冲溶液，0.9M的氯化钠溶液)，其中，洗脱液A用于一次洗脱，洗脱液B用于二次洗脱，而后收集所述二次洗脱后的液体，得到第一层析产物；
(2)向Agrose HCM复合型离子交换层析柱中加入pH值为6.2的磷酸缓冲溶液B，并对步骤(1)得到的第一层析产物采用磷酸缓冲溶液B进行稀释作为复合型离子交换层析柱的上样溶液，稀释后的溶液电导率为7mS/cm，随后加入pH值为6.2，体积分数为50％的洗脱液C(20mM的磷酸缓冲溶液，0.9M的氯化钠溶液)进行等度洗脱，收集所述等度洗脱后的液体，得到第二层析产物；
(3)向聚丙烯疏水层析柱中加入pH值为7.2的缓冲溶液C(20mM的磷酸缓冲溶液，1.8M的氯化钠溶液)，并对步骤(2)得到的第二层析产物采用4M的氯化钠溶液进行等体积稀释，并作为疏水层析柱的上样溶液，稀释后溶液的电导率为158mS/cm，随后加入pH值为7.2，体积分数为0～100％的洗脱液D进行梯度洗脱，收集所述梯度洗脱后的液体，得到纯化的重组人血清白蛋白。
实施例3
本实施例提供一种从猪血中纯化重组人血清白蛋白的方法，具体步骤如下：
(1)稀释含有人血清蛋白的猪血上清，加入摩尔浓度为50mM的辛酸钠，调节pH，70℃加热4h，得到除杂的猪血；
向NanoGel 50Q阴离子交换层析柱中加入pH值为7.2的磷酸缓冲溶液，并将除杂的猪血用水稀释作为阴离子交换层析的上样溶液，稀释后含有人血清蛋白的猪血上清的电导率范围为4.5mS/cm；
随后依次加入pH值为7.2的淋洗液(20mM的磷酸缓冲溶液，82mM的氯化钠溶液)、洗脱液A(20mM的磷酸缓冲溶液，20ms/cm的氯化钠溶液)和洗脱液B(20mM的磷酸缓冲溶液，1.2M的氯化钠溶液)，其中，洗脱液A用于一次洗脱，洗脱液B用于二次洗脱，而后收集所述二次洗脱后的液体，得到第一层析产物；
(2)向Agrose HCM复合型离子交换层析柱中加入pH值为5.9的磷酸缓冲溶液，并对步骤(1)得到的第一层析产物采用磷酸缓冲溶液进行稀释作为复合型离子交换层析柱的上样溶液，稀释后的溶液电导率为7.5mS/cm，随后加入pH值为5.9，体积分数为100％的洗脱液C进行等度洗脱，收集所述等度洗脱后的液体，得到第二层析产物；
(3)向聚丙烯疏水层析柱中加入pH值为6.8的缓冲溶液(20mM的磷酸缓冲溶液，2.1M的氯化钠溶液)，并对步骤(2)得到的第二层析产物采用4M的氯化钠溶液进行等体积稀释，并作为疏水层析柱的上样溶液，稀释后溶液的电导率为160mS/cm，随后加入pH值为6.8，体积分数为0～100％的洗脱液D(20mM的磷酸缓冲溶液)进行梯度洗脱，收集所述梯度洗脱后的液体，得到纯化的重组人血清白蛋白。
实施例4
本实施例提供一种从猪血中纯化重组人血清白蛋白的方法，具体步骤如下：
(1)稀释含有人血清蛋白的猪血上清，加入摩尔浓度为55mM的辛酸，调节pH，75℃加热4.5h，得到除杂的猪血；
向NanoGel 50Q阴离子交换层析柱中加入pH值为7.4的磷酸缓冲溶液A，并将除杂的猪血用水稀释作为阴离子交换层析的上样溶液，稀释后含有人血清蛋白的猪血上清的电导率范围为5mS/cm；
随后依次加入pH为7的淋洗液(20mM的磷酸缓冲溶液，80mM的氯化钠溶液)、pH为7.2的洗脱液A(20mM的磷酸缓冲溶液，19.8ms/cm的氯化钠溶液)和pH为7.2的洗脱液B(20mM的磷酸缓冲溶液，1M的氯化钠溶液)，其中，洗脱液A用于一次洗脱，洗脱液B用于二次洗脱，而后收集所述二次洗脱后的液体，得到第一层析产物；
(2)向Agrose HCM复合型离子交换层析柱中加入pH值为6的磷酸缓冲溶液B，并对步骤(1)得到的第一层析产物采用磷酸缓冲溶液B进行稀释作为复合型离子交换层析柱的上样溶液，稀释后的溶液电导率为8mS/cm，随后加入pH值为6.2，体积分数为50％的洗脱液C(20mM的磷酸缓冲溶液，1M的氯化钠溶液)进行等度洗脱，收集所述等度洗脱后的液体，得到第二层析产物；
(3)向聚丙烯疏水层析柱中加入pH值为7的缓冲溶液C(20mM的磷酸缓冲溶液，2M的氯化钠溶液)，并对步骤(2)得到的第二层析产物采用4M的氯化钠溶液进行等体积稀释，并作为疏水层析柱的上样溶液，稀释后溶液的电导率为162mS/c，随后加入pH值为7.2，体积分数为0～100％的洗脱液D(20mM的磷酸缓冲溶液)进行梯度洗脱，收集所述梯度洗脱后的液体，得到纯化的重组人血清白蛋白。
实施例5
本实施例提供一种从猪血中纯化重组人血清白蛋白的方法，与实施例1相比所述步骤中不包含前处理步骤，具体步骤如下：
(1)向NanoGel 50Q阴离子交换层析柱中加入pH值为7.4的磷酸缓冲溶液A，并将猪血用水稀释作为阴离子交换层析的上样溶液，稀释后含有人血清蛋白的猪血上清的电导率范围为5mS/cm；
随后依次加入pH值为7.4的淋洗液(20mM的磷酸缓冲溶液，80mM的氯化钠溶液)、洗脱液A(20mM的磷酸缓冲溶液，19.8ms/cm的氯化钠溶液)和洗脱液B(20mM的磷酸缓冲溶液，1M的氯化钠溶液)，其中，洗脱液A用于一次洗脱，洗脱液B用于二次洗脱，而后收集所述二次洗脱后的液体，得到第一层析产物；
(2)向Agrose HCM复合型离子交换层析柱中加入pH值为6的磷酸缓冲溶液B，并对步骤(1)得到的第一层析产物采用磷酸缓冲溶液B进行稀释作为复合型离子交换层析柱的上样溶液，稀释后的溶液电导率为8mS/cm，随后加入pH值为6，体积分数为50％的洗脱液C(20mM的磷酸缓冲溶液，1M的氯化钠溶液)进行等度洗脱，收集所述等度洗脱后的液体，得到第二层析产物；
(3)向聚丙烯疏水层析柱中加入pH值为7的缓冲溶液C(20mM的磷酸缓冲溶液，2M的氯化钠溶液)，并对步骤(2)得到的第二层析产物采用4M的氯化钠溶液进行等体积稀释，并作为疏水层析柱的上样溶液，稀释后溶液的电导率为162mS/c，随后加入pH值为7，体积分数为0～100％的洗脱液D(20mM的磷酸缓冲溶液)进行梯度洗脱，收集所述梯度洗脱后的液体，得到纯化的重组人血清白蛋白。
实施例6
本实施例提供一种从猪血中纯化重组人血清白蛋白的方法，与实施例1相比区别仅在于，阴离子交换层析介质为UniGel 80Q，复合型离子交换层析介质为Agrose HAM，疏水层析介质为聚丙烯疏水层析丁基，其余工艺参数和步骤均与实施例1保持一致。
实施例7
本实施例提供一种从猪血中纯化重组人血清白蛋白的方法，除步骤(1)阴离子交换层析过程中不进行淋洗操作外，其余工艺参数和步骤均与实施例1保持一致。
实施例8
本实施例提供一种从猪血中纯化重组人血清白蛋白的方法，其与实施例1的区别仅在于，阴离子交换层析过程中上样溶液的电导率为6mS/cm，复合型离子交换层析过程中上样溶液的电导率为10mS/cm，疏水层析过程中上样溶液的电导率为180mS/cm；其余工艺参数和步骤均与实施例1保持一致。
实施例9
本实施例提供一种从猪血中纯化重组人血清白蛋白的方法，其与实施例1的区别仅在于，阴离子交换层析过程中上样溶液的电导率为3.5mS/cm，复合型离子交换层析过程中上样溶液的电导率为7mS/cm，疏水层析过程中上样溶液的电导率为150mS/cm；其余工艺参数和步骤均与实施例1保持一致。
实施例10
本实施例提供一种从猪血中纯化重组人血清白蛋白的方法，除阴离子交换层析过程中缓冲溶液A、淋洗液、洗脱液A和洗脱液B的pH为8，复合型离子交换层析过程中缓冲溶液B和洗脱液C的pH为7，疏水层析过程中缓冲溶液C洗脱液D的pH为7.8外，其余工艺参数和步骤均与实施例1保持一致。
实施例11
本实施例提供一种从猪血中纯化重组人血清白蛋白的方法，除阴离子交换层析过程中缓冲溶液A、淋洗液、洗脱液A和洗脱液B的pH为6.8，复合型离子交换层析过程中缓冲溶液B和洗脱液C的pH为5，疏水层析过程中缓冲溶液C洗脱液D的pH为6外，其余工艺参数和步骤均与实施例1保持一致。
对比例1
本对比例提供一种从猪血中纯化重组人血清白蛋白的方法，除层析步骤省略疏水层析外，其余工艺参数和步骤均与实施例1保持一致。
对比例2
本对比例提供一种从猪血中纯化重组人血清白蛋白的方法，除层析步骤省略复合型离子交换层析外，其余工艺参数和步骤均与实施例1保持一致。
对比例3
本对比例提供一种从猪血中纯化重组人血清白蛋白的方法，所述方法中层析顺序与实施例1不同；
所述方法依次设置为复合型离子交换层析、阴离子交换层析和疏水层析，其中各层析步骤中的工艺参数均与实施例1保持一致。
对比例4
本对比例提供一种从猪血中纯化重组人血清白蛋白的方法，所述方法中层析顺序与实施例1不同；
所述方法依次设置为阴离子交换层析、疏水层析和复合型离子交换层析外，其余工艺参数和步骤均与实施例1保持一致。
实施例1-11和对比例1-4得到的重组人血清白蛋白的产量、纯度和外观如表1所示，其中重组人血清白蛋白的外观采用标准比色液进行颜色对比。本发明根据《中国药典》2005年版附录“溶液颜色检查法”配制标准比色液，每套50支(附空白安瓶8支)，包括以下五种色调：YG-1～10表示黄绿色标准比色液1～10号；Y-1～10表示黄色标准比色液1～10号；OY-1～10表示橙黄色标准比色液1～10号；OR-1～10表示橙红色标准比色液1～10号；BR-1～10表示红棕色标准比色液1～10号。
表1
结合上表可知，实施例1与对比例1-2比较，对比例1-2得到的重组人血清白蛋白的纯度偏低，说明阴离子交换层析、复合型离子交换层析和疏水层析之间是相辅相成的，省略任意一个层析过程会影响整个分离、纯化过程的效率；
实施例1与对比例3-4相比，依次采用阴离子交换层析、复合型离子交换层析和疏水层析分离、纯化得到的重组人血清白蛋白的纯度更高，说明三种层析过程之间是相互协同配合的，不能随意更换三种层析过程之间的顺序；
实施例1与实施例4相比，实施例1获得的重组人血清白蛋白的纯度更高，说明层析过程中缓冲液和洗脱液的pH值相同时，层析过程能够得到更好的分离效果；
实施例1与实施例5相比，实施例5获得的重组人血清白蛋白的纯度明显偏低，说明层析过程之前的前处理操作对分离、纯化过程有着重要的作用，能够对猪血进行粗略的纯化，有利于后续层析过程更好的进行，以得到高纯度的重组人血清白蛋白；
实施例1与实施例6相比，实施例1获得的重组人血清白蛋白的纯度更高，说明NanoGel 50Q、Agrose HCM和聚丙烯三种层析介质是分离、纯化猪血以得到重组人血清白蛋白的最优组合；
实施例1与实施例7相比，实施例7获得的重组人血清白蛋白的纯度偏低，说明阴离子交换层析过程中的淋洗操作是不可缺少的，淋洗操作能够改善阴离子交换层析的选择性，洗脱部分杂质，方便后续层析过程的进行；
实施例1与实施例8-9相比，实施例1获得的重组人血清白蛋白的纯度更高，说明层析过程中上样溶液的电导率需要在一定的范围内才能够保证层析过程的有序进行，达到更好的分离、纯化效果；
实施例1与实施例10-11相比，实施例1获得的重组人血清白蛋白的纯度更高，说明层析过程中缓冲溶液、淋洗液和洗脱液的pH需要保持在一定的范围区间内，以保证蛋白的稳定性，从而保证分离、纯化过程的效率，得到高纯度的重组人血清白蛋白。
综上所述，依次经过阴离子交换层析、复合型离子交换层析和疏水层析，通过层析过程中上样溶液在特定的电导率范围内，所用的缓冲溶液、淋洗液和洗脱液的pH在特定范围内的协同复配作用，分离、纯化得到的重组人血清白蛋白具有较高的纯度，对临床用药和生化研究具有重大意义。
申请人声明，以上所述仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，所属技术领域的技术人员应该明了，任何属于本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
Claims (30)
1.一种从猪血中纯化重组人血清白蛋白的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)向NanoGel 50Q阴离子交换层析柱中加入缓冲溶液A，并将除杂的猪血进行稀释作为阴离子交换层析的上样溶液，稀释后含有人血清蛋白的猪血上清的电导率范围为4～5mS/cm；
随后依次加入淋洗液、洗脱液A和洗脱液B，其中，洗脱液A用于一次洗脱，洗脱液B用于二次洗脱，而后收集所述二次洗脱后的液体，得到第一层析产物；
所述除杂的猪血为采用包括如下前处理步骤处理得到的；所述前处理步骤包括：取含有人血清蛋白的猪血上清加水进行稀释，随后加入稳定剂，调节pH，并进行热处理，得到除杂的猪血；所述稳定剂包括辛酸和/或辛酸钠；
所述缓冲溶液A为磷酸缓冲溶液；所述淋洗液为含有氯化钠的磷酸缓冲溶液；所述洗脱液A为含有氯化钠的磷酸缓冲溶液；所述洗脱液B为含有氯化钠的磷酸缓冲溶液；所述缓冲溶液A、淋洗液、洗脱液A和洗脱液B的pH值相同，所述pH值为7.2～7.6；
(2)向Agrose HCM复合型离子交换层析柱中加入缓冲溶液B，并将步骤(1)所述的第一层析产物进行稀释作为复合型离子交换层析柱的上样溶液，稀释后的第一层析产物的电导率为7.6～8.4mS/cm，随后加入洗脱液C进行等度洗脱，收集所述等度洗脱后的液体，得到第二层析产物；
所述缓冲溶液B为磷酸缓冲溶液；所述洗脱液C为含有氯化钠溶液的磷酸缓冲溶液；所述缓冲溶液B和洗脱液C的pH值相同，所述pH值为5.7～6.3；
(3)向聚丙烯疏水层析柱中加入缓冲溶液C，并将步骤(2)所述的第二层析产物进行稀释作为疏水层析柱的上样溶液，稀释后的第二层析产物的电导率为155～165mS/cm，随后加入洗脱液D进行梯度洗脱，收集所述梯度洗脱后的液体，得到纯化的重组人血清白蛋白；
所述缓冲溶液C为含有氯化钠溶液的磷酸缓冲溶液；所述洗脱液D为磷酸缓冲溶液；所述缓冲溶液C和洗脱液D的pH值相同，所述pH值为6.7～7.3。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述洗脱液A中的氯化钠溶液的电导率为19～21mS/cm。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述洗脱液A中的氯化钠溶液的电导率为19.5～20.5mS/cm。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述洗脱液A中的氯化钠溶液的电导率为19.8mS/cm。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述洗脱液B中的氯化钠溶液的摩尔浓度为0.8～1.2M。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述洗脱液B中的氯化钠溶液的摩尔浓度为0.9～1.1M。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述洗脱液B中的氯化钠溶液的摩尔浓度为1M。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述缓冲溶液A、淋洗液、洗脱液A和洗脱液B的pH值为7.3～7.5。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述pH值为7.4。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述缓冲溶液B和洗脱液C的pH值为5.8～6.2。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述pH值为6。
12.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述缓冲溶液C和洗脱液D的pH值为6.8～7.2。
13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，所述pH值为7。
14.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述稳定剂的摩尔浓度为45～55mM。
15.根据权利要求14所述的方法，其特征在于，所述稳定剂的摩尔浓度为48～52mM。
16.根据权利要求15所述的方法，其特征在于，所述稳定剂的摩尔浓度为50mM。
17.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述热处理的温度为65～75℃。
18.根据权利要求17所述的方法，其特征在于，所述热处理的温度为68～72℃。
19.根据权利要求18所述的方法，其特征在于，所述热处理的温度为70℃。
20.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述热处理的时间为3.5～4.5h。
21.根据权利要求20所述的方法，其特征在于，所述热处理的时间为3.8～4.2h。
22.根据权利要求21所述的方法，其特征在于，所述热处理的时间为4h。
23.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，对第一层析产物进行稀释使用的溶液为含有氯化钠溶液的磷酸缓冲溶液。
24.根据权利要求23所述的方法，其特征在于，稀释后的第一层析产物的电导率为7.8～8.2mS/cm。
25.根据权利要求24所述的方法，其特征在于，稀释后的第一层析产物的电导率为8mS/cm。
26.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，对第二层析产物进行稀释使用的溶液为含有氯化钠溶液的磷酸缓冲溶液。
27.根据权利要求26所述的方法，其特征在于，稀释后的第二层析产物的电导率为158～163mS/cm。
28.根据权利要求27所述的方法，其特征在于，稀释后的第二层析产物的电导率为162mS/cm。
29.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)稀释含有人血清蛋白的猪血上清，加入摩尔浓度为45～55mM的稳定剂，调节pH，65～75℃加热3.5～4.5h，得到除杂的猪血；所述除杂的猪血为采用包括如下前处理步骤处理得到的；所述前处理步骤包括：取含有人血清蛋白的猪血上清加水进行稀释，随后加入稳定剂，调节pH，并进行热处理，得到除杂的猪血；所述稳定剂包括辛酸和/或辛酸钠；
向NanoGel 50Q阴离子交换层析柱中加入缓冲溶液A，并将除杂的猪血进行稀释作为阴离子交换层析的上样溶液，稀释后含有人血清蛋白的猪血上清的电导率范围为4～5mS/cm；
随后依次加入淋洗液、洗脱液A和洗脱液B，其中，洗脱液A用于一次洗脱，洗脱液B用于二次洗脱，而后收集所述二次洗脱后的液体，得到第一层析产物；
所述缓冲溶液A为磷酸缓冲溶液；所述淋洗液为含有氯化钠的磷酸缓冲溶液；所述洗脱液A为含有氯化钠的磷酸缓冲溶液；所述洗脱液B为含有氯化钠的磷酸缓冲溶液；所述缓冲溶液A、淋洗液、洗脱液A和洗脱液B的pH值相同，所述pH值为7.2～7.6；
(2)向Agrose HCM复合型离子交换层析柱中加入缓冲溶液B，并将步骤(1)所述的第一层析产物进行稀释作为复合型离子交换层析柱的上样溶液，稀释后的第一层析产物的电导率为7.6～8.4mS/cm，随后加入洗脱液C进行等度洗脱，收集所述等度洗脱后的液体，得到第二层析产物；
所述缓冲溶液B为磷酸缓冲溶液；所述洗脱液C为含有氯化钠溶液的磷酸缓冲溶液；所述缓冲溶液B和洗脱液C的pH值相同所述pH值为5.7～6.3；
(3)向聚丙烯疏水层析柱中加入缓冲溶液C，并将步骤(2)所述的第二层析产物进行稀释作为疏水层析柱的上样溶液，稀释后的第二层析产物的电导率为155～165mS/cm，随后加入洗脱液D进行梯度洗脱，收集所述梯度洗脱后的液体，得到纯化的重组人血清白蛋白；
所述缓冲溶液C为含有氯化钠溶液的磷酸缓冲溶液；所述洗脱液D为磷酸缓冲溶液；所述缓冲溶液C和洗脱液D的pH值相同，所述pH值为6.7～7.3。
30.一种如权利要求1-29中任一项所述的方法在制备重组人血清白蛋白中的应用。
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