CN105754977B - 一种同时制备人尿激肽原酶粗制品和人尿胰蛋白酶抑制剂粗制品的方法 - Google Patents

一种同时制备人尿激肽原酶粗制品和人尿胰蛋白酶抑制剂粗制品的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种尿蛋白的提取方法，尤其涉及一种制备人尿激肽原酶粗制品的方法。本发明提供的制备人尿激肽原酶粗制品的方法是采用阴离子交换树脂作为吸附剂吸附尿液中的尿蛋白，然后收集吸附尿蛋白的树脂，集中洗脱，接着将洗脱液通过阳离子交换树脂吸附人尿激肽原酶，从而实现人尿激肽原酶和人尿胰蛋白酶抑制剂的分离。本发明提供的制备人尿激肽原酶粗制品的方法可以有效的分离人尿激肽原酶和人尿胰蛋白酶抑制剂，便于人尿激肽原酶和人尿胰蛋白酶抑制剂后续的纯化处理，提高纯化率，而且该方法实现了两种蛋白粗制品的联产，可以大大的降低生产成本。

Description

一种同时制备人尿激肽原酶粗制品和人尿胰蛋白酶抑制剂粗 制品的方法
技术领域
本发明涉及一种尿蛋白的提取方法，尤其涉及一种制备人尿激肽原酶粗制品的方法。
背景技术
人尿中含有三百多种蛋白质，目前已开发提取的主要有尿激酶、人尿胰蛋白酶抑制剂和人尿激肽原酶等，这些组分在临床上具有重要的治疗价值。
人尿激肽原酶（Urinary Kallidinogenase，简称为KN），是从人尿中分离提取的一种由238个氨基酸组成的糖蛋白，等电点在4左右，分子量约54000D，属于丝氨酸蛋白酶。它能够激活人血浆激肽原转化为激肽。目前，已经被开发成用于治疗急性脑梗死的药物。
人尿胰蛋白酶抑制剂（Urinary trypsin inhibitor，简称为UTI）是一种从人尿中分离纯化的由143个氨基酸组成的糖蛋白，等电点在2左右，分子量65000D，具有抑制多种蛋白酶、糖酶和脂酶等水解酶的活性，从而抑制炎症介质的过度释放，改善微循环和组织灌注。而且在机体受到严重损伤时还可以起抑制全身性炎症反应的发生，阻断多脏器功能障碍，保护脏器功能等作用。
尿蛋白产品目前主要的生产过程是：首先，在各地经过尿蛋白的吸附、洗脱、沉淀等步骤制备尿蛋白粗制品；其次，尿蛋白粗制品经过下游的分离纯化和精制，制备尿蛋白原料药，最后灌装成品制剂，用于临床。
我国的尿蛋白产业从上世纪七十年代末就已经开始发展起来，目前尿蛋白粗制品的方法已经越来越规模化生产了。中国专利CN101134952B公开了一种人尿激肽原酶及其制备方法，所述的人尿激肽原酶粗制品的制备方法为：将新鲜的男性尿液加入3%脱乙酰甲壳素吸附，用1-25%的硫酸铵洗脱，接着加入50%硫酸铵沉淀蛋白，即可得到人尿激肽原酶粗制品。但是，该方法需要收集大量尿液，运输到加工点，不仅增加工作量，而且还增加了生产成本，加上城市卫生改造，收集尿液越来越困难，大大的限制了该方法的推广和应用。
中国专利CN102660525B公开了一种制备人尿激肽原酶粗制品的方法，所述的人尿激肽原酶粗制品的制备方法为：采用阴离子树脂作为吸附剂，放置尿斗或尿池中，收集尿蛋白后，集中洗脱，将洗脱液上样金属螯合亲和层析住，从而实现KN和UTI的分离。该方法具有迅速固定KN，提高KN的稳定性的优点。但是，该方法得到的KN收率较低，不利于工业化生产。
发明内容
为了解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种KN和UTI分离效果好，KN粗制品收率高，可以有效保持KN粗制品活性的人尿激肽原酶粗制品的制备方法。
本发明提供了一种制备人尿激肽原酶粗制品的方法，包括以下步骤：
S1将阴离子交换树脂作为吸附剂放置尿池或尿斗中，收集已吸附尿蛋白的阴离子交换树脂；
S2将步骤S1得到的阴离子交换树脂用NaCl溶液进行洗脱，收集洗脱液；
S3将步骤S2得到的洗脱液进行超滤浓缩，调节超滤浓缩液的pH值为3.2-4.2，电导为0.05-8Ms/cm；
S4将步骤S3得到的浓缩液上样已经用平衡液平衡好的阳离子交换树脂，冲洗，所述阳离子交换树脂的平衡液为0.01-0.5mol/L的醋酸-醋酸钠缓冲液，电导为0.05-8Ms/cm，pH值为3.2-4.2；
S5用洗脱液洗脱步骤S4得到的阳离子交换树脂，收集洗脱液，在洗脱液中加入65%硫酸铵粉末搅拌20-30min，静置3-4h后，收集沉淀，得人尿激肽原酶粗制品。
进一步地，所述步骤S1中的阴离子交换树脂为强碱型阴离子交换树脂。所述强碱型阴离子交换树脂为强阴离子交换柱Q Sepharose H.p，Q Sepharose F.F，Q Sepharose 4F.F，Q Sepharose XL，QAE Sephadex A-25，QAE Sephadex A-50或STREAMLINE。
进一步地，所述步骤S2中NaCl溶液的浓度为0.6-0.8mol/L，优选为0.72mol/L。
进一步地，所述步骤S3中超滤浓缩液的pH值为3.4-4.0，电导为1-4Ms/cm。
进一步地，所述步骤S4中阳离子交换树脂为强酸型阳离子交换树脂，其强酸性的反应基为磺酸基。
进一步地，所述步骤S4中的冲洗液为0.01-0.5mol/L醋酸-醋酸钠缓冲液，电导为0.05-8Ms/cm，pH值为3.2-4.2。
进一步地，所述步骤S4中平衡液的pH值为3.4-4.0，进一步优选pH值为3.9。
进一步地，所述步骤S5中的洗脱液为0.01-0.5mol/L醋酸-醋酸钠缓冲液，0.01-0.5mol/L的NaCl溶液，pH值为4-7。
进一步地，在步骤S4中收集上样穿透液和冲洗穿透液，加入60%硫酸铵粉末搅拌20-30min，静置3-4h后，收集沉淀，得人尿胰蛋白酶抑制剂粗制品。
本发明提供的制备人尿激肽原酶粗制品的方法是采用阴离子交换树脂作为吸附剂吸附尿液中的尿蛋白，收集吸附尿蛋白的阴离子交换树脂，集中洗脱，将洗脱液通过阳离子交换树脂，在特定的条件下和一定的pH值范围内，阳离子交换树脂可以快速有效的吸附住人尿激肽原酶，而不吸附人尿胰蛋白酶抑制剂，从而实现人尿激肽原酶和人尿胰蛋白酶抑制剂的分离，便于人尿激肽原酶和人尿胰蛋白酶抑制剂后续的纯化处理，提高纯化率，而且该方法实现了两种蛋白粗制品的联产，可以大大的降低生产成本。
经试验发现：本发明采用的阳离子交换树脂在特定的条件下和一定的pH值范围内对人尿激肽原酶的吸附率大于72%，当平衡液的pH值为3.9时，尿激肽原酶的吸附率为98.8%，而且使用本发明提供的制备人尿激肽原酶粗制品的方法制备的人尿激肽原酶的活性大于5 PNA单位／g粗制品，是一种较为理想的人尿激肽原酶粗制品的制备方法。
进一步地，使用本发明的制备人尿激肽原酶粗制品的方法制备的人尿激肽原酶和人尿胰蛋白酶抑制剂粗制品，人尿胰蛋白酶抑制剂全部集中在人尿胰蛋白酶抑制剂粗制品中，而人尿激肽原酶基本集中在人尿激肽原酶粗制品中，说明本发明提供的制备人尿激肽原酶粗制品的方法可以有效的实现人尿激肽原酶和人尿胰蛋白酶抑制剂的分离，便于人尿激肽原酶和人尿胰蛋白酶抑制剂后续的纯化处理，提高纯化率。
与现有技术相比，本发明提供的制备人尿激肽原酶粗制品的方法具有以下优势：
（1） 本发明提供的制备人尿激肽原酶粗制品的方法可以有效的分离KN和UTI，大大降低了两种产品后续纯化的难度；
（2）本发明提供的制备人尿激肽原酶粗制品的方法可以实现两种蛋白粗制品的联产，大大降低生产成本；
（3）本发明提供的制备人尿激肽原酶粗制品的方法制备得到的KN和UTI活性高，收率高，有利于规模化生产。
具体实施方式
以下通过具体实施方式的描述对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。
实施例1、
S1将100公斤的强碱型阴离子交换树脂作为吸附剂放置在尿池或尿斗中，收集已吸附尿蛋白的强碱型阴离子交换树脂；
S2将步骤S1得到的强碱型阴离子交换树脂用浓度为0.72mol/L的NaCl溶液进行洗脱，收集洗脱液；
S3将步骤S2得到的洗脱液进行超滤浓缩，调节超滤浓缩液的pH值为3.9，电导为2.3Ms/cm；
S4将步骤S3得到的浓缩液上样已经用平衡液平衡好的强酸型阳离子交换树脂，用0.1mol/L醋酸-醋酸钠缓冲液，电导为3Ms/cm，pH值为3.9的冲洗液冲洗，所述强酸型阳离子交换树脂的平衡液为0.1mol/L醋酸-醋酸钠缓冲液，电导为2.3Ms/cm，pH值为3.9；
S5用0.1mol/L醋酸-醋酸钠缓冲液，0.1mol/L的NaCl溶液，pH值为5的洗脱液洗脱，收集洗脱液，在洗脱液中加入65%硫酸铵粉末搅拌25min，静置4h后，收集沉淀，得人尿激肽原酶粗制品；
S6在步骤S4中收集上样穿透液和冲洗穿透液，加入60%硫酸铵粉末搅拌25min，静置4h后，收集沉淀，得人尿胰蛋白酶抑制剂粗制品。
实施例2、
S1将100公斤的强碱型阴离子交换树脂作为吸附剂放置在尿池或尿斗中，收集已吸附尿蛋白的强碱型阴离子交换树脂；
S2将步骤S1得到的强碱型阴离子交换树脂用浓度为0.6mol/L的NaCl溶液进行洗脱，收集洗脱液；
S3将步骤S2得到的洗脱液进行超滤浓缩，调节超滤浓缩液的pH值为3.2，电导为4.3Ms/cm；
S4将步骤S3得到的浓缩液上样已经用平衡液平衡好的强酸型阳离子交换树脂，用0.3mol/L醋酸-醋酸钠缓冲液，电导为4.1Ms/cm，pH值为3.2的冲洗液冲洗，所述强酸型阳离子交换树脂的平衡液为0.3mol/L醋酸-醋酸钠缓冲液，电导为4.1Ms/cm，pH值为3.2；
S5用0.3mol/L醋酸-醋酸钠缓冲液，0.5mol/L的NaCl溶液，pH值为4的洗脱液洗脱，收集洗脱液，在洗脱液中加入65%硫酸铵粉末搅拌20min，静置4h后，收集沉淀，得人尿激肽原酶粗制品；
S6在步骤S4中收集上样穿透液和冲洗穿透液，加入60%硫酸铵粉末搅拌20min，静置4h后，收集沉淀，得人尿胰蛋白酶抑制剂粗制品。
实施例3、
S1将100公斤的强碱型阴离子交换树脂作为吸附剂放置在尿池或尿斗中，收集已吸附尿蛋白的强碱型阴离子交换树脂；
S2将步骤S1得到的强碱型阴离子交换树脂用浓度为0.8mol/L的NaCl溶液进行洗脱，收集洗脱液；
S3将步骤S2得到的洗脱液进行超滤浓缩，调节超滤浓缩液的pH值为4.2，电导为1.3Ms/cm；
S4将步骤S3得到的浓缩液上样已经用平衡液平衡好的强酸型阳离子交换树脂，用0.02mol/L醋酸-醋酸钠缓冲液，电导为1.2Ms/cm，pH值为4.2的冲洗液冲洗，所述强酸型阳离子交换树脂的平衡液为0.02mol/L醋酸-醋酸钠缓冲液，电导为1.2Ms/cm，pH值为4.2；
S5用0.02mol/L醋酸-醋酸钠缓冲液，0.1mol/L的NaCl溶液，pH值为7的洗脱液洗脱，收集洗脱液，在洗脱液中加入65%硫酸铵粉末搅拌30min，静置3h后，收集沉淀，得人尿激肽原酶粗制品；
S6在步骤S4中收集上样穿透液和冲洗穿透液，加入60%硫酸铵粉末搅拌30min，静置3h后，收集沉淀，得人尿胰蛋白酶抑制剂粗制品。
对比例1、
制备方法：所述步骤S4中平衡液的pH值调节为3.0，其余步骤如实施例1。
对比例2、
制备方法：所述步骤S4中平衡液的pH值调节为4.5，其余步骤如实施例1。
对比例3、
制备方法：所述步骤S4中冲洗液的pH值调节为5，其余步骤如实施例1。
试验例一、人尿激肽原酶吸附率的测定试验
1、试验材料：
实施例1中的步骤S4、实施例2中的步骤S4、实施例3中的步骤S4、对比例1中的步骤S4和对比例2中的步骤S4的强酸型阳离子交换树脂。
2、试验方法：
采用荧光法测定人尿激肽原酶的活性，并计算实施例1中的步骤S4、实施例2中的步骤S4、实施例3中的步骤S4、对比例1中的步骤S4和对比例2中的步骤S4的强酸型阳离子交换树脂的人尿激肽原酶（KN）的吸附百分率，其中：吸附KN百分率=（原粗酶活-残留酶活/原粗酶活）×100%。
3、试验结果
试验结果如表1所示。
表1 人尿激肽原酶吸附率的测定试验
由表1可知，本发明实施例1-3的强酸型阳离子交换树脂的KN吸附率大于72%，其中实施例1的强酸型阳离子交换树脂的KN吸附率为98.8%，为最佳实施例。而对比例1的强酸型阳离子交换树脂的KN吸附率为26.9%，对比例2的强酸型阳离子交换树脂的KN吸附率为1.2%，说明本发明采用的阳离子交换树脂在特定的pH值范围内可以快速有效的吸附KN，从而实现KN和UTI的分离。
试验例二、人尿激肽原酶粗制品的活性测定试验
1、试验材料：
实施例1中的步骤S5、实施例2中的步骤S5、实施例3中的步骤S5、对比例1中的步骤S5、对比例2中的步骤S5和对比例3中的步骤S5制备的人尿激肽原酶粗制品。
2、试验方法：
采用荧光法测定实施例1中的步骤S5、实施例2中的步骤S5、实施例3中的步骤S5、对比例1中的步骤S5、对比例2中的步骤S5和对比例3中的步骤S5制备的人尿激肽原酶粗制品的活性。
3、试验结果：
试验结果如表2所示。
表2 人尿激肽原酶（KN）粗品的活性测定试验
由表2可知，本发明提供的制备人尿激肽原酶粗制品的方法制备的人尿激肽原酶的活性大于5PNA单位／g粗制品，其中实施例1的人尿激肽原酶的活性为5.62PNA单位／g粗制品，为最佳实施例。
试验例三、人尿激肽原酶和人尿激肽原酶抑制剂粗制品的分离效果试验
1、试验材料：实施例1、实施例2和实施例3制备的人尿激肽原酶和人尿激肽原酶抑制剂粗制品。
2、试验方法：
采用紫外分光光度测定（A280）测定实施例1、实施例2和实施例3制备的人尿激肽原酶和人尿激肽原酶抑制剂粗制品的含量。
3、试验结果：
试验结果如表3所示。
表3 人尿激肽原酶和人尿激肽原酶抑制剂粗制品得分离效果试验
由表3可知，使用本发明提供的制备人尿激肽原酶粗制品的方法制备的KN和UTI粗制品，UTI全部集中在UTI粗制品中，KN基本集中在KN粗制品中，说明发明提供的制备人尿激肽原酶粗制品的方法可以有效的实现KN和UTI的分离，便于KN和UTI后续的纯化处理，提高纯化率。

Claims (2)

1.一种同时制备人尿激肽原酶粗制品和人尿胰蛋白酶抑制剂粗制品的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1将阴离子交换树脂作为吸附剂放置尿池或尿斗中，收集已吸附尿蛋白的阴离子交换树脂，其中，S1中的阴离子交换树脂为强碱型阴离子交换树脂；
S2将步骤S1得到的阴离子交换树脂用浓度为0.6-0.8mol/L的NaCl溶液进行洗脱，收集洗脱液；
S3将步骤S2得到的洗脱液进行超滤浓缩，调节超滤浓缩液的pH值为3.4-4.0，电导为1-4Ms/cm；
S4将步骤S3得到的浓缩液上样已经用平衡液平衡好的阳离子交换树脂，冲洗，所述阳离子交换树脂的平衡液为0.01-0.5mol/L的醋酸-醋酸钠缓冲液，电导为0.05-8Ms/cm，pH值为3.9；
S5用洗脱液洗脱步骤S4得到的阳离子交换树脂，收集洗脱液，在洗脱液中加入65%硫酸铵粉末搅拌20-30min，静置3-4h后，收集沉淀，得人尿激肽原酶粗制品，其中，S5中的洗脱液为0.01-0.5mol/L醋酸-醋酸钠缓冲液，0.01-0.5mol/L的NaCl溶液，pH值为4-7；
S6在步骤S4中收集上样穿透液和冲洗穿透液，加入60%硫酸铵粉末搅拌20-30min，静置3-4h后，收集沉淀，得人尿胰蛋白酶抑制剂粗制品。
2.如权利要求1所述的同时制备人尿激肽原酶粗制品和人尿胰蛋白酶抑制剂粗制品的方法，其特征在于，所述步骤S4中阳离子交换树脂为强酸型阳离子交换树脂，其强酸性的反应基为磺酸基。
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