JP2022538355A

JP2022538355A - Ｃ１－ｉｎｈを精製する方法

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Publication number: JP2022538355A
Application number: JP2021577935A
Authority: JP
Inventors: ループシー・アナド; サブリーナ・フーネケ－フォクト; ジェニファー・クルプカ－クロース; マルティン・ヴァイ; ノルベルト・シュルツェ
Original assignee: ツェー・エス・エル・ベーリング・ゲー・エム・ベー・ハー
Priority date: 2019-07-04
Filing date: 2020-07-03
Publication date: 2022-09-01
Also published as: WO2021001525A1; US20220363715A1; EP3994165A1; CN114096558A; AU2020299425A1; KR20220029732A

Abstract

本発明は、Ｃ１エステラーゼ阻害剤（Ｃ１－ＩＮＨ）、より具体的にはＣ１－ＩＮＨ濃縮物を精製する方法に関する。

Description

補体活性化経路のタンパク質であるＣ１－ＩＮＨは、活性化型Ｃ１ｒおよびＣ１ｓと共有結合複合体を形成することによってＣ１の活性化を制御する血漿中に存在するプロテアーゼの阻害剤である。それは、血漿プレカリクレイン、因子ＸＩおよびＸＩＩのような重要な血液凝固酵素だけでなくプラスミンも「制御する」。

例えばＣ１－ＩＮＨ欠損は、Ｃ１－ＩＮＨの欠乏（ＨＡＥＩ型）またはＣ１－ＩＮＨの活性の減少（ＨＡＥＩＩ型）に起因する遺伝性血管浮腫（ＨＡＥ）と関連する。Ｃ１－ＩＮＨ欠損は、血液が人工心肺内のような表面と接触した際に生成される酵素の中和によるＣ１－ＩＮＨの消費だけでなく、慢性の状況で現れる免疫複合体、特にリウマチ性障害のような、凝固カスケードを開始する疾患経過にも起因する場合がある。現在のところ、Ｃ１－ＩＮＨタンパク質の置きかえは、急性ＨＡＥの予防または処置におけるゴールドスタンダードと考えられなければならない。このことは、商業的に入手可能なヒト血漿由来Ｃ１－ＩＮＨに特に当てはまり、報告によればそのＣ１－ＩＮＨは、ヒトＣ１－ＩＮＨタンパク質と同一でないトランスジェニックウサギにおいて作製された商業的に入手可能な組換えＣ１－ＩＮＨよりも自然な機能性を有する（非特許文献１）。考えられているさらなる治療適用には、虚血再灌流傷害の予防、減少および／または処置におけるＣ１－ＩＮＨの使用がある（参照特許文献１）。

ヒト血漿からのＣ１－ＩＮＨの単離および／または精製は公知であるが、多少高価であり、特にほとんどの場合非常に時間を要する方法である。血漿からＣ１－ＩＮＨを作製するために提案される異なる方法には、親和性クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過、沈殿および疎水性相互作用クロマトグラフィーのような様々な分離法がある。これら方法のいずれかを単独で使用することは、Ｃ１－ＩＮＨ、特にＣ１－ＩＮＨ濃縮物を精製するには一般に不十分であり、十分に、したがってその様々な組合せが先行技術において提案されてきた。

特許文献２は、陰イオン交換クロマトグラフィーに続く陽イオン交換クロマトグラフィーの使用について記載している。特許文献３は、収率約２０％で純度９０％のＣ１－ＩＮＨ調製物に到達するための沈殿工程とネガティブモードでの疎水性相互作用クロマトグラフィーとの組合せについて記載している。特許文献４は、ＰＥＧ沈殿ならびにジャカリンアガロースにおけるクロマトグラフィーおよびネガティブモードでの疎水性相互作用クロマトグラフィーについて記載している。

特許文献５は、Ｃ１－ＩＮＨ含有出発材料が、酸性条件下において陰イオン交換体で２回処理される方法について記載している（ｐＨはそれぞれｐＨ５．５に設定される）。第１のイオン交換工程後にＰＥＧ沈殿し、次いで、ＡＣＴをなお含むことが公知であるＣｉｎｒｙｚｅ（登録商標）の製造と同様に、第２のイオン交換工程を行う（非特許文献１）。

血管性浮腫を処置するための商業的に入手可能な４つのＣ１－ＩＮＨ濃縮物のうち、３つは血漿由来である。後者は、商品名Ｂｅｒｉｎｅｒｔ（登録商標）、Ｃｉｎｒｙｚｅ（登録商標）およびＣｅｔｏｒ（登録商標）で販売されている。これらＣ１－ＩＮＨ濃縮物は、所有権のある異なる方法によって調製される（参照非特許文献１）。これらの所有権のある方法が：寒冷沈降反応、イオン交換クロマトグラフィー、沈殿、低温殺菌、限外および／もしくは透析濾過、ならびに／または疎水性相互作用クロマトグラフィーを含むがそれだけには限らない一連の工程をそれぞれ含むことは公知である。これらの多段階方法は、よく確立されており、強力で、信頼性が高い。それら方法は、その中に検出可能な付属するタンパク質、特にアルファ－１－アンチキモトリプシン（ＡＣＴ）を極微量含むバルク産物を産する。

Ｃ１－ＩＮＨの半分の分子量しかないにもかかわらず、ＡＣＴは、上述したＢｅｒｉｎｅｒｔ（登録商標）だけでなくＨＡＥＧＡＲＤＡ（登録商標）、Ｃｉｎｒｙｚｅ（登録商標）またはＣｅｔｏｒ（登録商標）のような血漿由来Ｃ１－ＩＮＨ調製物の製造の間に共精製する。上述したものの中で、Ｂｅｒｉｎｅｒｔ（登録商標）［およびＨＡＥＧＡＲＤＡ（登録商標）］のＡＣＴレベルは最も低く（非特許文献１）、即ち５μｇ／ＩＵＣ１－ＩＮＨをはるかに下回る。

自明ながら、製造業者は、可能な限り高純度な産物を提供するよう努めている。付属するタンパク質が、実際の最終産物の効果および安全性に対して負の影響を有しない限り、微量のタンパク質は容認される。しかし、原理的には、微量の付属するタンパク質も不要である。

対応する調製物から純度１００％のＣ１－ＩＮＨを研究室規模で単離することは可能になる。さらに工業規模でそのような高純度を達成することは、経済的理由から容易および確実に実現可能ではなく、経済的理由は、時間を要する方法と関連する産物の損失だけによる。そのような調製物が得られる原材料、即ち血液は、換言すれば、極めて高い純度を達成するためだけに活性物質の過剰な損失を許容するほど十分に豊富ではない。

それにもかかわらず、製造業者はそれぞれの方法を改善するよう常に努めている。Ｂｅｒｉｎｅｒｔ（登録商標）の製造に使用される方法の様な確立されている多段階方法の改善における対応する試みは、個々の工程が再検討され、修正されることを意味する場合がある。そのような変更は、例えばより高い収率、より速い処理時間、等をもたらすことができる。または、小さな変更が、供給連鎖における変更（例えば、方法に使用される第三者の材料の利用可能性、等）のような他の理由に対して単純に必要になる場合もある。どんな小さな変更も、おそらく不便を伴う可能性がある。例えば、付属するタンパク質の量は、非常に少ないままであるが、対応する変更の前より少なくなる場合がある。

Ｃ１－ＩＮＨ調製物中の微量のＡＣＴの存在は、有害性を引き起こさないと長い間、および依然として考えられてきた。さらに、可能な限り高純度のＣ１－ＩＮＨ調製物を提供すること、したがって多段階方法によって血漿から得られたＣ１－ＩＮＨ調製物中ＡＣＴ含有量をさらに減少させることは、なお望ましい。

ＡＣＴタンパク質は、成熟タンパク質から切断されるアミノ末端に２５残基のシグナルペプチドを含む４２３アミノ酸から構成されている。ＡＣＴの全体の分子量は、複数部位における激しいグリコシル化のためおよそ５５～６６ｋＤａである。それは、典型的なセルピン構造を有する（非特許文献２）。ＡＣＴは、同族のプロテアーゼと出会って、セルピン：プロテアーゼ複合体を形成し、その複合体は、ＡＣＴ単独より１０～５０倍速い速度で肝臓によって循環血漿から取り除かれる（非特許文献３）。ＡＣＴは、炎症に応じて血漿レベルが増加する急性期タンパク質である。急性期応答におけるその役割は、いくつかのセリンプロテアーゼ、最も著しくは白血球カテプシンＧの阻害剤として作用することである（非特許文献４）。カテプシンＧは、炎症部位で放出され、病原体を死滅させ、分解し、組織を再形成し、炎症誘発性サイトカインおよび受容体を活性化する。カテプシンＧの過剰なまたは長期間にわたる活性、および結果として生じる組織損傷は、セルピン調節、例えばＡＣＴによって回避される。ヒト血漿中のＡＣＴの濃度は、通常約４００ｍｇ／ｌである（非特許文献５）。

商業的に入手可能なＡＣＴの調製物が、Ｃｉｎｒｙｚｅ（登録商標）の場合３１μｇ／ＩＵＣ１－ＩＮＨまたはＢｅｒｉｎｅｒｔ（登録商標）もしくＨＡＥＧＡＲＤＡ（登録商標）の場合５μｇ／ＩＵＣ１－ＩＮＨ以下の濃度でＡＣＴを含むことは公知である。

ＷＯ２００７／０７３１８６欧州特許第０６９８６１６Ｂ号欧州特許第０１０１９３５Ｂ号米国特許第５０３０５７８号ＷＯ０１／４６２１９

Ｆｅｕｓｓｎｅｒら、「Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ」２０１４年１０月；５４（１０）：２５６６～７３頁、ｄｏｉ：１０．１１１１／ｔｒｆ．１２６７８Ｂａｋｅｒら、ＳＥＲＰＩＮＡ３（ａｋａａｌｐｈａ－１－ａｎｔｉｃｈｙｍｏｔｒｙｐｓｉｎ）、Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．２００７年（１２）、２８２１～２８３５頁Ｍａｓｔら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９１年（３０）、１７２３～１７３０頁Ｃｒｉｓｐｅ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１６年（１９６）、１７～２１頁Ｈｏｌｌａｎｄｅｒら、ＢＭＣＰｕｌｍ．Ｍｅｄ．２００７年（２９）、７頁

５μｇ／ＩＵＣ１－ＩＮＨ以下またはさらに低いＡＣＴレベルを確実にするために、Ｃ１－ＩＮＨ産物の損失を最小限にしながら多段階方法によって血漿から得られるＣ１－ＩＮＨ調製物をさらに精製、または「最終精製」することを可能にする手段が必要とされている。ヒト血漿は、既存の必要性を満たすのに充分な量で入手することが一般に困難である。確立され、最適化された多段階方法で得られるＣ１－ＩＮＨ調製物は、高度に濃縮されている。したがって血漿から得られる既存のＣ１－ＩＮＨ調製物のさらなる精製または最終精製は、産物の損失、不必要な希釈、などのような不便を伴うべきでない。

本問題を解決するために、本発明は、いくつかの工程を含む先行する方法によって血漿から得られるＣ１－ＩＮＨ調製物から１－アンチキモトリプシン（ＡＣＴ）を枯渇させる方法であって、Ｃ１－ＩＮＨ調製物からのＡＣＴの枯渇は、陰イオン交換クロマトグラフィーによって実行される、方法を提供する。

出発材料を構成するＣ１－ＩＮＨ調製物中のＡＣＴ濃度は、例えば１００、５０、３５、３０、２５、２０、１５以下、好ましくは３５以下、より好ましくは１０以下、最も好ましくは５μｇ／ＩＵＣ１－ＩＮＨ以下であることができる。

発明者らは、Ｃ１－ＩＮＨ産物の損失または不必要な希釈を本質的に伴わずにＣ１－ＩＮＨ調製物中になお存在するＡＣＴ含有量の大幅な減少を達成し、医薬として使用することを意図する既存のＣ１－ＩＮＨ調製物の純度および安全性を増強する効果的な最終精製工程を提供することができた。

好ましくは、Ｃ１－ＩＮＨ調製物は：寒冷沈降反応、イオン交換クロマトグラフィー、沈殿、低温殺菌、限外濾過および／もしくは透析濾過ならびに／または疎水性相互作用クロマトグラフィーを含むがこれに限定されないいくつかの工程を含む先行する方法によって血漿から得られるものである。

対応するＣ１－ＩＮＨ調製物は、商品名Ｂｅｒｉｎｅｒｔ（登録商標）、Ｈａｅｇａｒｄａ（登録商標）、Ｃｉｎｒｙｚｅ（登録商標）およびＣｅｔｏｒ（登録商標）で公知である。それらを作製するために使用される製造方法は、すでに非常に低いＡＣＴ含有量で調製物を産する。

文脈において注目すべきは、Ｃｉｎｒｙｚｅ（登録商標）および／またはＣｅｔｏｒ（登録商標）の製造が、寒冷沈降反応、様々なイオン交換クロマトグラフィー工程、ＰＥＧ沈殿、低温殺菌、濾過および凍結乾燥を報告によれば含み、一方Ｂｅｒｉｎｅｒｔ（登録商標）の製造が、寒冷沈降反応、イオン交換クロマトグラフィー、第四級アミノエチル吸着、硫酸アンモニウム沈殿、低温殺菌、疎水性相互作用クロマトグラフィー、濾過および凍結乾燥を報告によれば含むことである。後者は、前者よりもいっそう高純度の、即ちＡＣＴ含有量がより低い産物を産するので、後者からＡＣＴをさらに枯渇させることにより、よりいっそう少ない資源でＢｅｒｉｎｅｒｔ（登録商標）製造方法の場合に既に得られたものよりさらに優れた血漿から得られるＣ１－ＩＮＨ調製物を産することができ、したがって特に好ましい。

それゆえ、Ｃ１－ＩＮＨ調製物は、疎水性相互作用クロマトグラフィーを含むがこれに限定されないいくつかの工程を含む先行する方法によって血漿から得られるものであることが特に好ましい。

好ましくは、本発明による方法は、以下の工程：
（ｉ）Ｃ１－ＩＮＨおよびＡＣＴが固定相に結合する第１の条件下でＣ１－ＩＮＨ調製物を、固定相を含む陰イオン交換クロマトグラフィーカラムにロードする工程と；
（ｉｉ）荷電しているカラムを洗浄する任意の工程と；
（ｉｉｉ）第２の条件を適用して移動相によってＡＣＴを溶出する工程と；
（ｉｖ）第３の条件を適用して移動相によってＣ１－ＩＮＨを溶出する工程とを含む。

好ましくは、上述した工程（ｉｉｉ）における第２の条件にはイオン強度Ａの溶出緩衝液の使用があり、上述した工程（ｉｖ）における第３の条件にはイオン強度Ｂの溶出緩衝液の使用があり、イオン強度ＡとＢは異なる。

イオン強度Ａからイオン強度Ｂへの移行は、異なる塩濃度Ｃ_ＡおよびＣ_Ｂを有する溶出緩衝液ＥＢ_ＡおよびＥＢ_Ｂを使用する塩濃度勾配によって、または段階溶出によって好ましくは達成される。

好ましくは、溶出緩衝液ＥＢ_Ａは、２５℃で１８．７～２０．２０ｍＳ／ｃｍ、好ましくは２５℃で１８．９～１９．８ｍＳ／ｃｍ、最も好ましくは２５℃で１９．２ｍＳ／ｃｍの伝導率、またはより好ましくは１０ｍＭトリス、１７５～１９０ｍＭＮａＣｌ、好ましくは１７５～１８５ｍＭＮａＣｌ、最も好ましくは１８０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．２を有する緩衝液からなる。

溶出緩衝液ＥＢ_Ａは、Ｃ１－ＩＨＮが荷電したカラムに結合し続けるが、少なくとも１つまたは複数の混入しているタンパク質が荷電したカラムに結合しないように選択され、溶出緩衝液ＥＢ_Ｂは、荷電したカラムに結合している本質的に全てのＣ１－ＩＮＨがもはや結合せず、溶出液中に採集できるように選択される。

溶出緩衝液ＥＢ_ＡおよびＥＢ_Ｂの的確な選択により、ＡＣＴの様な混入タンパク質の除去が、Ｃ１－ＩＮＨの損失なしにまたは最小限の損失だけで可能になる。

溶出緩衝液ＥＢ_Ｂは、２５℃で２５．３ｍＳ／ｃｍまたは２５℃で３０．４ｍＳ／ｃｍより高い、または２５℃で３８．５ｍＳ／ｃｍより高い、または２５℃で４７．７ｍＳ／ｃｍより高い、または２５℃で５４．８ｍＳ／ｃｍより高い、または２５℃で６３．４ｍＳ／ｃｍより高い、または２５℃で６９．７ｍＳ／ｃｍより高い、または２５℃で７７．８ｍＳ／ｃｍより高い、または２５℃で８４．４ｍＳ／ｃｍと同等もしくは高い伝導率を有し、溶出緩衝液ＥＢ_Ｂは、陰イオン交換クロマトグラフィーになお結合している本質的に全てのＣ１－ＩＮＨを溶出する。当業者は、必要条件を容易に決定することができる。

より好ましくは、溶出緩衝液ＥＢ_Ｂは、１０ｍＭトリス、２５０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．２；または１０ｍＭトリス、３００ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．２；または１０ｍＭトリス、４００ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．２；または１０ｍＭトリス、５００ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．２；または１０ｍＭトリス、６００ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．２；または１０ｍＭトリス、７００ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．２；または１０ｍＭトリス、８００ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．２；または１０ｍＭトリス、９００ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．２；または１０ｍＭトリス、１ＭＮａＣｌ、ｐＨ７．２からなる。

本発明の方法は、下記の緩衝液ＥＢ_ＡおよびＥＢ_Ｂ：
ａ）
（ｉ）溶出緩衝液ＥＢ_Ａは、２５℃で１８．７～２０．２ｍＳ／ｃｍ、好ましくは２５℃で１８．９～１９．８ｍＳ／ｃｍ、最も好ましくは２５℃で１９．２ｍＳ／ｃｍの伝導率を有し、
（ｉｉ）溶出緩衝液ＥＢ_Ｂは、２５℃で２５．３ｍＳ／ｃｍより高い、もしくは２５℃で３０．４ｍＳ／ｃｍより高い、もしくは２５℃で３８．５ｍＳ／ｃｍより高い、もしくは２５℃で４７．７ｍＳ／ｃｍより高い、もしくは２５℃で５４．８ｍＳ／ｃｍより高い、もしくは２５℃で６３．４ｍＳ／ｃｍより高い、もしくは２５℃で６９．７ｍＳ／ｃｍより高い、もしくは２５℃で７７．８ｍＳ／ｃｍより高い、もしくは２５℃で８４．４ｍＳ／ｃｍと同等もしくは高い伝導率を有し、
溶出緩衝液ＥＢ_Ｂは、溶出工程（ｉ）後に陰イオン交換クロマトグラフィーカラムになお結合している本質的に全てのＣ１－ＩＮＨを溶出する。
または
ｂ）
（ｉ）溶出緩衝液ＥＢ_Ａは、１０ｍＭトリス、１７５～１９０ｍＭＮａＣｌ、好ましくは１７５～１８５ｍＭＮａＣｌ、最も好ましくは１８０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．２からなり、
（ｉｉ）溶出緩衝液ＥＢ_Ｂは、２５℃で２５．３ｍＳ／ｃｍより高い、もしくは２５℃で３０．４ｍＳ／ｃｍより高い、もしくは２５℃で３８．５ｍＳ／ｃｍより高い、もしくは２５℃で４７．７ｍＳ／ｃｍより高い、もしくは２５℃で５４．８ｍＳ／ｃｍより高い、もしくは２５℃で６３．４ｍＳ／ｃｍより高い、もしくは２５℃で６９．７ｍＳ／ｃｍより高い、もしくは２５℃で７７．８ｍＳ／ｃｍより高い、もしくは２５℃で８４．４ｍＳ／ｃｍと同等もしくは高い伝導率を有し、
溶出緩衝液ＥＢ_Ｂは、溶出工程（ｉ）後に陰イオン交換クロマトグラフィーカラムになお結合している本質的に全てのＣ１－ＩＮＨを溶出する。
または
ｃ）
（ｉ）溶出緩衝液ＥＢ_Ａは、１０ｍＭトリス、１７５～１９０ｍＭＮａＣｌ、好ましくは１７５～１８５ｍＭＮａＣｌ、最も好ましくは１８０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．２からなり、
（ｉｉ）溶出緩衝液ＥＢ_Ｂは、１０ｍＭトリス、２５０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．２；もしくは１０ｍＭトリス、３００ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．２；もしくは１０ｍＭトリス、４００ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．２；もしくは１０ｍＭトリス、５００ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．２；もしくは１０ｍＭトリス、６００ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．２；もしくは１０ｍＭトリス、７００ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．２；もしくは１０ｍＭトリス、８００ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．２；もしくは１０ｍＭトリス、９００ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．２；もしくは１０ｍＭトリス、１ＭＮａＣｌ、ｐＨ７．２からなる
を組み合わせる。

本発明者らは、そのような条件がＡＣＴの枯渇を可能にするという点で特に有用であることを見出し、Ｃ１－ＩＮＨを本質的に損失することなしに、即ちそのような環境下でＣ１－ＩＮＨの回収率は９０％より高く、好ましくは少なくとも９５％であり、一方でＡＣＴは大幅に、即ち５０％またはより低く低下する。

陰イオン交換クロマトグラフィーに使用される固定相材料は、Ｃａｐｔｏ（登録商標）ＤＥＡＥ（ＧＥによって販売される、官能基としてジアミノエチルを使用する）のような弱陰イオン交換体か、または好ましくはＱＨＰ樹脂、Ｃａｐｔｏ（登録商標）ＱＩｍｐｒｅｓ樹脂、Ｃａｐｔｏ（登録商標）Ｑ樹脂（全てＧＥによって販売される、全てが官能基として第四級アンモニウムを有する）もしくはＦｒａｃｔｏｇｅｌ（登録商標）ＴＭＡＥ、Ｅｓｈｍｕｎｏ（登録商標）Ｈ（Ｍｅｒｃｋによって販売される、官能基としてトリメチルアミンエチルを有する）のような強陰イオン交換体かのいずれかの型に属する。

前述の中で、官能基として通常のアンモニウムを有する樹脂が、最も好ましい。

Ｃ１－ＩＮＨ調製物は、ヒト血漿から得られることが好ましい。

血漿は血液から得られ、血液とは、ヒトおよび他の動物中に見られる体液を意味するものと理解される。このことは、本発明による方法を、全種類の動物性血漿、さらに好ましくはヒト血漿から得られるＣ１－ＩＮＨ調製物を最終精製するために使うことができることを意味し、例えば血友病を患っているヒトの処置における重要性のためヒト血漿から得られるＣ１－ＩＮＨ調製物が特に好ましい。

Ｃ１－ＩＮＨ調製物は、媒体に溶解しているＣ１－ＩＮＨおよびＡＣＴから本質的になることがさらに好ましい。

本発明は、そのような調製物が得られた方法にかかわりなく、好ましくはそれのさらなる最終精製を目指す。好ましくは、ＡＣＴ含有量は、１００、５０、３５、３０、２５、２０、１５以下、好ましくは３５以下、より好ましくは１０μｇＡＣＴ／ＩＵＣ１－ＩＮＨ以下、最も好ましくは５μｇＡＣＴ／ＩＵＣ１－ＩＮＨ以下である。

本発明は、上に記載の方法のいずれか１つによる方法を使用することによって得ることができる血漿から得られるＣ１－ＩＮＨ調製物をさらに提供する。

血漿から得られるＣ１－ＩＮＨ調製物は、原理的に公知であるが、現在記載されているようにＡＣＴが枯渇した対応する調製物は、先行技術から公知でない。高度に精製された、即ちＡＣＴのいかなる存在の痕跡もないＣ１－ＩＮＨを得ることは原理的には可能であるが、本発明による方法は、ＡＣＴレベルを極めて大幅に減少させるが、ＡＣＴを完全には排除しない。

以下において、本発明は、図および例によってより詳細に記載されることになり、図は以下を図示する。

先行技術により商業的に入手可能なＣ１－ＩＮＨ調製物中のＡＣＴの存在を示す電気泳動ゲルを示す図である。工業的に確立された方法によって得られたＣ１－ＩＮＨ調製物に対して結合／溶出モードで実行したＡＥＸのクロマトグラムおよび同実験において得られた溶出液試料のＳＤＳページゲルを示す図である。工業的に確立された方法によって得られたＣ１－ＩＮＨ調製物に対して結合／溶出モードで実行したＡＥＸを使用して得られた溶出液試料のＳＤＳページゲルを示す図である。様々な溶出緩衝液を比較して、工業的に確立された方法によって得られたＣ１－ＩＮＨ調製物に対して結合／溶出モードで実行したＡＥＸから得られた溶出液試料のＳＤＳページゲルを示す図である。２５℃で伝導率１８．７～２０．７ｍＳ／ｃｍを有する緩衝液に相当するＮａＣｌ濃度１７０～１９５ｍＭで低イオン強度緩衝液を使用する第１の溶出に使用した溶出緩衝液の塩含有量に応じて、同じＡＥＸマトリックスからの高イオン強度の緩衝液を使用する第２のＡＥＸクロマトグラフィー溶出液中のＣ１－ＩＮＨ回収物の純度および程度を要約する線図である。２５℃で伝導率１８．６８～２０．７ｍＳ／ｃｍを有する緩衝液に相当するＮａＣｌ濃度１７０～１９５ｍＭで低イオン強度緩衝液を使用する第１の溶出に使用した溶出緩衝液の塩含有量に応じて、同じＡＥＸマトリックスからの高イオン強度の緩衝液を使用する第２のＡＥＸクロマトグラフィー溶出液中のＣ１－ＩＮＨおよびＡＣＴの量を示す線図である。

本発明の文脈において、以下の定義を適用する：

請求項および本発明の説明において、「Ｃ１－ＩＮＨ」、「Ｃ１－ＩＮＨ」、「Ｃ１－ＩＮＨ調製物」および「Ｃ１－ＩＮＨ調製物」は、タンパク質Ｃ１エステラーゼ阻害剤を含有する濃縮物、特に、タンパク質Ｃ１エステラーゼ阻害剤を含有する液体濃縮物を表すために同時に使用される。技術的背景および／または先行技術について言及する場合、「Ｃ１－ＩＮＨ」は、例えばＣ１－ＩＮＨ欠損を検討する文脈において、タンパク質それ自体を意味することもできる。

本出願／特許の全体を通じて、
「ＨＩＣ」は、疎水性相互作用クロマトグラフィーを意味する；
「ＡＥＸ」は、陰イオン交換クロマトグラフィーを意味する；
「ＡＥＸ樹脂」は、ＡＥＸにおいて固定相として使用した樹脂を意味する；
「強いＡＥＸ樹脂」は、幅広いｐＨ範囲に使用できる高度にイオン化されたＡＥＸ樹脂を意味する；
「弱いＡＥＸ樹脂」は、イオン化の程度がｐＨに強く依存する樹脂を意味する；
「ＢＣ」は、クロマトグラフィーカラムの結合能力を意味する；
「ネガティブモード」または「通過画分様式」または「通過画分」は、標的化合物（例えばＣ１－ＩＮＨ）がクロマトグラフィーカラムの固定相に結合しない条件下でクロマトグラフィーを実行する方法を示す；
「結合様式」、「結合および溶出」または「ポジティブモード」は、最初に、標的化合物（例えばＣ１－ＩＮＨ）がクロマトグラフィーカラムの固定相に結合する条件で、次いで同化合物がクロマトグラフィーカラムから溶出される条件で実行されるクロマトグラフィーを表す；
「化合物が固定相に結合する」場合、これは、化合物の構造的完全性が影響を受けることなく、好ましくは共有結合もしくは化学吸着ではなく、むしろ物理吸着によって固定相に吸着または保持されることを意味することを意図する；
「ＷＦＩ」は、「注射用蒸留水」を意味する；
「濃度勾配」は、高濃度から低濃度への、溶液に溶解している物質の濃度の漸進的変動を示す、
「段階溶出」は、濃度勾配の場合のような連続的移行ではなく、第１から第２の濃度への急な移行であり、濃度が徐々に低下することを意味する；
「％」は、特に明記しない限り「質量％」を意味する；
「沈殿剤」は、タンパク質の沈殿を誘発する薬剤である；
「溶出液画分」は、中に含まれている特定の分析物が、固定相に事前に結合または保持される（本明細書に言及されるポジティブモードの場合）、またはされない（本明細書に言及されるネガティブモードの場合）かに関わらずクロマトグラフィーカラムから出てくる移動相流の画分を表す。

以下において、本発明は、図を参照することによってより詳細に説明されることとなる。

図１は、先行技術から公知の商業的に入手可能なＣ１－ＩＮＨ調製物の電気泳動ゲルを示す。点線は、Ｃ１－ＩＮＨの分子量（１０５ｋＤ）を示す。商品名Ｂｅｒｉｎｅｒｔ（登録商標）、Ｃｅｔｏｒ（登録商標）およびＣｉｎｒｙｚｅ（登録商標）で公知の血漿から得られる商業的に入手可能なＣ１－ＩＮＨ調製物の間の差異は、明らかに区別可能である。このゲルにおいてレーン１～５は、Ｂｅｒｉｎｅｒｔ（登録商標）、Ｃｅｔｏｒ（登録商標）およびＣｉｎｒｙｚｅ（登録商標）が微量のＡＣＴを含むことを示し、Ｆｅｕｓｓｎｅｒらによってより詳細に述べられているように、Ｂｅｒｉｎｅｒｔ（登録商標）が含有するＡＣＴの量は最小である（図１、１）。Ｂｅｒｉｎｅｒｔ（登録商標）、Ｃｅｔｏｒ（登録商標）およびＣｉｎｒｙｚｅ（登録商標）だけでなくＨａｅｇａｒｄａ（登録商標）も、それぞれいくつかの工程を含む方法によって血漿から得られたＣ１－ＩＮＨ調製物である。Ｂｅｒｉｎｅｒｔ（登録商標）、Ｃｅｔｏｒ（登録商標）およびＣｉｎｒｙｚｅ（登録商標）の製造に含まれる工程は、これまでに記載されている（Ｆｅｕｓｓｎｅｒら、「Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ」２０１４年１０月；５４（１０）：２５６６～７３頁、ｄｏｉ：１０．１１１１／ｔｒｆ．１２６７８）。

図２は、本発明によるＡＥＸクロマトグラフィー実験のクロマトグラムおよびその実験からの溶出試料を分析するＳＤＳページゲルを表し；カラムロードは、Ｃ１－ＩＮＨ調製物Ｂｅｒｉｎｅｒｔ（登録商標）の生産から取り出されたＣ１－ＩＮＨ濃縮物、即ちＢｅｒｉｎｅｒｔ（登録商標）の調製物における最後の疎水性相互作用クロマトグラフィー工程の溶出液（１：２５希釈）であり；結合能力ＢＣは、１５ｍｇタンパク質／ｍＬ樹脂であり；分離は、３０ｍＭから１０００ｍＭのＮａＣｌ塩勾配によって実行された。前ピーク溶出液試料は、図２（参照レーン６）のＳＤＳページゲルに示すようにＡＣＴを明らかに含む。したがって、図２のクロマトグラムおよびＳＤＳページゲルは、ＡＥＸクロマトグラフィーを使用することによる、複数の工程に関連する方法によって得られ、既に極めて低濃度のＡＣＴを含むＣ１－ＩＮＨ調製物からのＡＣＴの枯渇を実証する。

図３は、図２に表される実験と同じカラムロードおよび結合能力を有するが、あまり急でない塩勾配、即ち３０ｍＭから５１５ｍＭＮａＣｌを使用するＡＥＸクロマトグラフィー実験から得られた溶出液試料のＳＤＳページゲルを表す。図３のＳＤＳページゲルは、ＡＥＸクロマトグラフィーを使用することによるＣ１－ＩＮＨ調製物からのＡＣＴの枯渇を実証する。

図４は、固定相からＡＣＴを溶出することになる様々な塩濃度の第１の溶出緩衝液を用いる段階溶出を使用してＡＥＸクロマトグラフィー実験から得られた溶出液試料のＳＤＳページゲルを表す。「Ｅ１」は、それぞれの溶出液１の試料に対応するレーンを示し、「Ｅ２」は、それぞれの溶出液２の試料に対応するレーンを示す。Ｃ１－ＩＮＨ調製物からのＡＣＴの枯渇の程度が、塩濃度の増大と共に増大し、溶出液２中のＣ１－ＩＮＨ回収の程度が、塩濃度の増大と共に減少することが明らかに見られる。

図５は、異なる溶出緩衝液１について、溶出緩衝液１の塩含有量に応じた溶出液２中のＣ１－ＩＮＨ回収物の純度および程度を比較して示す。図５から推測できるように、１７５～１９０、好ましくは１７５～１８５、最も好ましくは１８０ｍＭＮａＣｌのＮａＣｌ濃度の溶出緩衝液１は、Ｃ１－ＩＮＨ調製物からＣ１－ＩＮＨを本質的に損失することなくＡＣＴを最大限、枯渇させるのに最適である。

図６は、異なる溶出緩衝液１について、溶出緩衝液１の塩含有量に応じた溶出液２中のＣ１－ＩＮＨおよびＡＣＴの量を比較して示す。図６は、最終産物において溶出緩衝液１におけるより低イオン強度と比較して、第１の溶出に使用した緩衝液における１７５ｍＭまたはより高いＮａＣｌでＡＣＴの非常に優れた枯渇が達成され、１９０ｍＭを超えるイオン強度の溶出緩衝液１ではＣ１－ＩＮＨの収率が低すぎて商業的に実現不可能であることを示す。

動物血液、特にヒト血液から得られるＣ１－ＩＮＨ調製物は、今日では、様々な多段階方法によって得られる。ヒト血漿から始まる確立された方法は、寒冷沈降反応、イオン交換クロマトグラフィー、第四級アミノエチル吸着、硫酸アンモニウム沈殿、低温殺菌および疎水性相互作用クロマトグラフィー［Ｂｅｒｉｎｅｒｔ（登録商標）の製造に含まれる方法工程、Ｆｅｕｓｓｎｅｒらまたは欧州特許第０１０１９３５号を参照のこと］または寒冷沈降反応、イオン交換クロマトグラフィーの様々な工程、ＰＥＧ（特にＰＥＧ－４０００）による沈殿および低温殺菌［Ｃｉｎｒｙｚｅ（登録商標）／Ｃｅｔｏｒ（登録商標）の製造に含まれる方法工程］の工程を含む。これらの方法は、沈殿工程を含むことを共通して有する。さらなる最後の工程は、濾過および凍結乾燥である。本発明は、さらなる工程の陰イオン交換クロマトグラフィーを追加して、上述した様な多段階方法によって得られるＣ１－ＩＮＨ調製物をさらに精製することを提案し、したがって「最終精製」工程を提供してなおさらに既存の産物の安全性を増強する。その最終精製工程は、濾過および凍結乾燥の前に行うことができるが、他の場合には、最終産物にほぼ相当するＣ１－ＩＮＨ濃縮物またはＣ１－ＩＮＨ調製物を産する一連の他の工程に続く最終工程である。

驚くべきことに、さらなる最終精製工程におけるＡＥＸクロマトグラフィーの使用は、Ｃ１－ＩＮＨを本質的に損失することなく、および不必要な希釈なしにＣ１－ＩＮＨ調製物からＡＣＴをなおさらに枯渇させることを可能にする。ＡＥＸクロマトグラフィーは長い間公知であったが、また付属するタンパク質からＣ１－ＩＮＨを分離する文脈においてもＣ１－ＩＮＨ濃縮物の調製におけるその使用が時折言及されてきたにもかかわらず、それは、複数の工程方法によって得られるＣ１－ＩＮＨ調製物からＡＣＴを枯渇させる特定の目的にこれまで使用されてこず、本質的に高純度のＣ１－ＩＮＨ調製物を得るために多くの試みが過去に行われてきたにもかかわらず、ＡＣＴは不純物としてなお存在している。

この背景を鑑みると、これが本当に可能であることは予想できなかった。非常に驚くべきことに、工業規模でＣ１－ＩＮＨ調製物の生産を可能にするよく確立されている別の方法は、対応する最終精製工程を、即ちそれぞれの方法の同等に遅い段階で内包することによってさらに改善することができる。

以下において、本発明は、実施例を参照することにより詳細に記載されることになる。

Ｃ１－ＩＮＨ調製物Ｂｅｒｉｎｅｒｔ（登録商標）の生産から取り出されたＣ１－ＩＮＨ濃縮物、即ちＢｅｒｉｎｅｒｔ（登録商標）の調製物における最後の疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）工程の溶出液を１：２５に希釈して、先行するＨＩＣにおいて利用したカオトロピック剤である硫酸アンモニウム（ＡＳ）の濃度を低下させ、それによりタンパク質結合を可能にした。次いで、ＡＥＸクロマトグラフィーを、結合／溶出様式で実行した、即ち、出発材料を、結合緩衝液を使用してカラムにロードし、その後洗浄緩衝液で洗浄し、最後に塩勾配を適用することによって溶出した。緩衝液の組成および勾配ならびにさらなる詳細を、表２に開示し、対応するクロマトグラムおよびＳＤＳページゲルを図２に示した。

したがって実施例１は、ＡＥＸクロマトグラフィーを使用することによる、複数の工程に関連する方法によって得られ、既に極めて低濃度のＡＣＴを含むＣ１－ＩＮＨ調製物からのＡＣＴの枯渇を実証した。

ＡＥＸクロマトグラフィーを、実施例１に記載の通り、さらに１０ｍＭＮａＣｌから５１５ｍＭＮａＣｌの溶出勾配で実行した。対応するクロマトグラムを、本明細書において検討した図３に示した。したがって実施例２は、ＡＥＸクロマトグラフィーを使用することによる、複数の工程に関連する方法によって得られ、既に極めて低濃度のＡＣＴを含むＣ１－ＩＮＨ調製物からのＡＣＴの枯渇を実証した。

出発材料
Ｂｅｒｉｎｅｒｔの方法で得た産物、Ｆｅｕｓｓｎｅｒら（ｄｏｉ：１０．１１１１／ｔｒｆ．１２６７８）（バッチ番号２０１８１２１９－ＨＷ）によって記載されるものと類似の疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）によって得られ、－２０℃で貯蔵した高度に精製されたＣ１－ＩＮＨ濃縮物を使用した。この材料を、１０ｍＭトリス、３２ｍＭＡＳｐＨ７．２に対して４℃で終夜透析し、次いで、以下の表３に表した異なる塩濃度を有する溶出緩衝液１を比較する陰イオン交換クロマトグラフィー実験に供した。

物質および器材
物質：
Ｍｉｌｌｉ－Ｑによって得られる脱イオン水。
器材：
クロマトグラフィーデバイスＡＫＴＡａｖａｎｔ２５
ソフトウェアＵｎｉｃｏｍ６．４
ｐＨメータＫｎｉｃｋ
伝導率計Ｋｎｉｃｋ
計量秤Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ
マグネチックスターラＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ
カラムＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ、樹脂：ＱＨＰ、ロット番号１０２７０２３７
カラム寸法内径０．７７ｃｍ、ベッド高１０ｃｍ、カラム容積４．７ｍＬ

収率の算出は、それぞれのカラムロードａ～ｃ（上記表３を参照のこと）の容積ならびに溶出液１および２の容積（それぞれ２３．５ｍＬ）に基づく。

分析
「カラムロード」（Ｌ）、「溶出液１」（Ｅ１）および「溶出液２」（Ｅ２）からの試料を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分析した。対応するＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルを図４に表した。「カラムロード」および「溶出液２」からの試料を、品質管理研究室においてＣ１－ＩＮＨ活性についてさらに試験した。

比較の結果を図５に表されるグラフに要約し、それぞれの溶出液２に回収したＣ１－ＩＮＨの収率を％純度と比較して示した。それによると、１７５～１９０ｍＭＮａＣｌ、好ましくは１７５～１８５ｍＭＮａＣｌ、最も好ましくは１８０ｍＭＮａＣｌのＮａＣｌ濃度の溶出緩衝液１は、Ｃ１－ＩＮＨ調製物からＣ１－ＩＮＨを本質的に損失することなくＡＣＴを最大限、枯渇させるのに最適である。これは、２５℃で１８．７～２０．２ｍＳ／ｃｍ、好ましくは２５℃で１８．９～１９．８ｍＳ／ｃｍ、最も好ましくは２５℃で１９．２ｍＳ／ｃｍの溶出緩衝液１の伝導率に相当する。溶出緩衝液２は、陰イオン交換クロマトグラフィーカラムになお結合している全てのＣ１－ＩＮＨを溶出するのに十分高い必要があり、２５℃で２１．６ｍＳ／ｃｍより高い必要がある。溶出緩衝液２の一例は、１０ｍＭトリス、１ＭＮａＣｌ、ｐＨ７．２の緩衝液組成である。

図６は、１７０ｍＭＮａＣｌ（２５℃で１８．７ｍＳ／ｃｍ）の溶出緩衝液１を使用した場合、ＡＣＴの若干の減少が既にあるが、最終産物中にＡＣＴの出発量の４９％がなお存在し、一方で１７５ｍＭＮａＣｌ（２５℃で１８．９ｍＳ／ｃｍ）の溶出緩衝液１を使用した場合、最終産物中にＡＣＴの出発量のわずか１７％しか存在しないことを示す。これは、Ｃ１－ＩＮＨの最大収率およびＡＣＴの最小収率を可能にするために必要な溶出緩衝液１のイオン強度／伝導率の微調整が、いかに重要かについて例示している。

本発明は、特定の例に言及することにより上に記載されている。これらの例は、本発明を制限することを決して意図するものではなく、本発明が作用する方法を例示することを意図するものである。

Claims

疎水性相互作用クロマトグラフィーを含むがこれに限定されないいくつかの工程を含む先行する方法によって血漿から得られるＣ１－ＩＮＨ調製物から１－アンチキモトリプシン（ＡＣＴ）を枯渇させる方法であって、Ｃ１－ＩＮＨ調製物からのＡＣＴの枯渇は、陰イオン交換クロマトグラフィーによって実行され、以下の工程：
（ｉ）Ｃ１－ＩＮＨおよびＡＣＴが固定相に結合する第１の条件下でＣ１－ＩＮＨ調製物を、固定相を含む陰イオン交換クロマトグラフィーカラムにロードする工程と；
（ｉｉ）荷電しているカラムを洗浄する任意の工程と；
（ｉｉｉ）第２の条件を適用して移動相によってＡＣＴを溶出する工程と；
（ｉｖ）第３の条件を適用して移動相によってＣ１－ＩＮＨを溶出する工程とを含み、
第２の条件にはイオン強度Ａの溶出緩衝液の使用があり、
第３の条件にはイオン強度Ｂの溶出緩衝液の使用があり、イオン強度ＡとＢが異なり、
イオン強度Ａからイオン強度Ｂへの移行は、異なる塩濃度Ｃ_ＡおよびＣ_Ｂを有する溶出緩衝液ＥＢ_ＡおよびＥＢ_Ｂを使用する塩濃度勾配によって、または段階溶出によって達成され、
（ｉ）溶出緩衝液ＥＢ_Ａは、２５℃で１８．７～２０．２ｍＳ／ｃｍ、好ましくは２５℃で１８．９～１９．８ｍＳ／ｃｍ、最も好ましくは２５℃で１９．２ｍＳ／ｃｍの伝導率を有し、
（ｉｉ）溶出緩衝液ＥＢ_Ｂは、２５℃で２１．６ｍＳ／ｃｍより高い伝導率を有し、溶出緩衝液ＥＢ_Ｂは、溶出工程（ｉ）後に陰イオン交換クロマトグラフィーカラムになお結合しているＣ１－ＩＮＨを溶出することを特徴とする、前記方法。
（ｉ）溶出緩衝液ＥＢ_Ａは、１０ｍＭトリス、１７５～１９０ｍＭＮａＣｌ、好ましくは１７５～１８５ｍＭＮａＣｌ、最も好ましくは１８０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．２からなり、
（ｉｉ）溶出緩衝液ＥＢ_Ｂは、２５℃で２５．３ｍＳ／ｃｍより高い伝導率を有し、溶出緩衝液ＥＢ_Ｂは、溶出工程（ｉ）後に前記陰イオン交換クロマトグラフィーカラムになお結合しているＣ１－ＩＮＨを溶出する、
請求項１に記載の方法。
（ｉ）溶出緩衝液ＥＢ_Ａは、１０ｍＭトリス、１７５～１９０ｍＭＮａＣｌ、好ましくは１７５～１８５ｍＭＮａＣｌ、最も好ましくは１８０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．２からなり、
（ｉｉ）溶出緩衝液ＥＢ_Ｂは、１０ｍＭトリス、１ＭＮａＣｌ、ｐＨ７．２からなる、
請求項１および２のいずれか１項に記載の方法。
固定相材料が、Ｃａｐｔｏ（登録商標）ＤＥＡＥ（ＧＥによって販売される、官能基としてジアミノエチルを使用する）のような弱陰イオン交換体、または好ましくはＱＨＰ樹脂、Ｃａｐｔｏ（登録商標）ＱＩｍｐｒｅｓ樹脂、Ｃａｐｔｏ（登録商標）Ｑ樹脂（全てＧＥによって販売される、全てが官能基として第四級アンモニウムを有する）もしくはＦｒａｃｔｏｇｅｌ（登録商標）ＴＭＡＥ、Ｅｓｈｍｕｎｏ（登録商標）Ｈ（Ｍｅｒｃｋによって販売される、官能基としてトリメチルアミンエチルを有する）のような強陰イオン交換体の型に属する、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
前記Ｃ１－ＩＮＨ調製物は、ヒト血漿から得られる、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
前記Ｃ１－ＩＮＨ調製物は、媒体に溶解しているＣ１－ＩＮＨおよびＡＣＴから本質的になる、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
請求項１～６のいずれか１項に記載の方法を使用することによって得ることができるＣ１－ＩＮＨ調製物。