JP2023549538A - インターアルファインヒビタータンパク質の精製方法 - Google Patents
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Abstract
本明細書では、エンドトキシン結合剤を用いて生物学的材料からＩαＩｐを精製する方法について記載する。本方法は、ＩαＩｐを含有する生物学的材料をエンドトキシン結合剤に適用し、フロースルーを破棄し、洗浄バッファーを適用し、エンドトキシン結合剤からＩαＩｐを溶出させることを含む。【選択図】なし
Description
インターアルファインヒビタータンパク質（ＩαＩｐ）は、すべての哺乳類の血液中に高濃度で循環する天然由来の免疫調節血漿タンパク質のファミリーである。ＩαＩｐは、感染、外傷、及び傷害により引き起こされる炎症に対して保護効果を促進する。ＩαＩｐの保護効果は、原因となる微生物又はトリガーから独立している。
このファミリーのメンバーは、グリコサミノグリカンと共有結合した重及び軽ポリペプチドのサブユニットで構成されている。ＩαＩｐは、インビボでは、２本の重鎖（Ｈ１及びＨ２）並びにビクニンと呼ばれる１本の軽鎖（Ｌ）からなる２５０ｋＤａの分子であるインターアルファインヒビター（ＩαＩ）と、１本の重鎖（Ｈ３）及び１本の軽鎖（Ｌ）からなる１２５ｋＤａの分子であるプレアルファインヒビター（ＰαＩ）として見出され得る。
傷害又は感染の間に誘発されるものなどの炎症シグナルが体内で生じると、ＩαＩｐは組織内に伝達され、炎症部位に直接到達する。ＩαＩｐの重鎖は、補体及び細胞外ヒストンなどの炎症カスケードの一部であるタンパク質（損傷シグナル）と結合することにより抗炎症応答を高め、それにより炎症プロセスを抑制し、一方、軽鎖のビクニンは、トリプシン、エラスターゼ、プラスミン、カテプシンＧ、及びフリンなどのセリンプロテアーゼの活性を阻害する。
ＩαＩｐは、インビトロ及びインビボの両方のモデルでは、傷害後の肺上皮の修復を促進することが示されており、またＩαＩｐは、複数のインビボモデルでは、ＴＮＦ－α及びＩＬ－６などの炎症性サイトカインを下方制御することが示されている。
健康な個体では、血液中に循環しているＩαＩｐの量は、比較的多い（
４００～８００ｍｇ／Ｌ）。新生児及び成人患者では、全身炎症／敗血症時には、ＩαＩｐレベルが急速に低下し（Ｂａｅｋ ＹＷ，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｐｅｄｉａｔｒ．２００３；１４３：１１－１５；Ｌｉｍ ＹＰ，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ．２００３；１８８：９１９－９２６ ａｎｄ Ｏｐａｌ ＳＭ，ｅｔ ａｌ．Ｃｒｉｔ Ｃａｒｅ Ｍｅｄ．２００７；３５：３８７－３９２）、低下したＩαＩｐレベルは、疾患の進行と強い相関があることが示されている。ＩαＩｐ療法は、敗血症並びに関連する臓器障害、肺炎、急性呼吸器疾患、壊死性腸炎（ＮＥＣ）、創傷、熱傷、がん、脳卒中、及びアルツハイマー病の治療として記載されている。
４００～８００ｍｇ／Ｌ）。新生児及び成人患者では、全身炎症／敗血症時には、ＩαＩｐレベルが急速に低下し（Ｂａｅｋ ＹＷ，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｐｅｄｉａｔｒ．２００３；１４３：１１－１５；Ｌｉｍ ＹＰ，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ．２００３；１８８：９１９－９２６ ａｎｄ Ｏｐａｌ ＳＭ，ｅｔ ａｌ．Ｃｒｉｔ Ｃａｒｅ Ｍｅｄ．２００７；３５：３８７－３９２）、低下したＩαＩｐレベルは、疾患の進行と強い相関があることが示されている。ＩαＩｐ療法は、敗血症並びに関連する臓器障害、肺炎、急性呼吸器疾患、壊死性腸炎（ＮＥＣ）、創傷、熱傷、がん、脳卒中、及びアルツハイマー病の治療として記載されている。
これまで、ＩαＩｐは、段階的な抽出、その後のクロマトグラフィーによる分離を用いて調製されていた。これらの方法は、高純度（例えば、９０％超の純度）を達成できる一方で、ＩαＩｐの収率が低い（例えば、２０～３０％（ｗ／ｗ））という問題がある。したがって、例えば治療用組成物の調製に使用するために、高収率及び高純度でＩαＩｐを精製又は調製する方法が必要とされている。
本開示は、ＩαＩｐ（例えば、ＩαＩ、ＰαＩ、及びビクニンのうちの１つ以上）を精製する方法を特徴とする。本方法は、精製プロセスの一工程として、対象（例えば、ヒト）から得られた生物学的材料などのＩαＩｐを含む生物学的材料（例えば、血液又は乳）を、エンドトキシン結合剤（例えば、エンドトキシン結合剤を含むクロマトグラフィーカラムなどの固体支持体）に適用する。
本開示の第１の態様は、（ａ）ＩαＩｐを含む前記生物学的材料をエンドトキシン結合剤に適用し、エンドトキシン結合剤に結合しない生物学的材料を含むフロースルーを分離することと、（ｂ）塩を含む溶出バッファーをエンドトキシン結合剤に適用し、ＩαＩｐを含む溶出液を回収することにより、生物学的材料からインターアルファインヒビタータンパク質（ＩαＩｐ）を精製することを特徴とする。
複数の実施形態では、エンドトキシン結合剤は、支持体（例えば、モノリシック支持体又は粒子ベースの支持体）上に固定される。複数の実施形態では、モノリシック支持体又は粒子ベースの支持体は、樹脂であるか、又は樹脂を含む。支持体は、例えば、カラム、メンブレン、ディスク、又はチップであり得る。
他の実施形態では、エンドトキシン結合剤は、ＥＴＯＸＩＣＬＥＡＲ（商標）、ＰＩＥＲＣＥ（商標）高容量エンドトキシン除去樹脂、ＴＯＸＩＮＥＲＡＳＥＲ（商標）エンドトキシン除去樹脂、ＰＵＲＫＩＮＥ（商標）エンドトキシン除去樹脂、ＤＥＴＯＸＩ－ＧＥＬ（商標）エンドトキシン除去ゲル、及びＰＲＯＭＥＧＡ（商標）エンドトキシン除去樹脂からなる群から選択される。特定の実施形態では、エンドトキシン結合剤は、ＤＥＴＯＸＩ－ＧＥＬ（商標）又はＥＴＯＸＩＣＬＥＡＲ（商標）である。
生物学的材料は、アルファ－１アンチトリプシン、Ｃ１－インヒビター、アルブミン、グロブリン（例えば、免疫グロブリン（例えば、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、及びＩｇＧ（例えば、静脈内Ｉｇ（ＩＶＩｇ）、抗Ｄ ＩｇＧ、Ｂ型肝炎ＩｇＧ、麻疹ＩｇＧ、狂犬病ＩｇＧ、破傷風ＩｇＧ、及び水痘帯状疱疹ＩｇＧ））、フィブリノーゲン（第Ｉ因子）、プロトロンビン（第ＩＩ因子）、トロンビン、抗トロンビンＩＩＩ、第ＩＩＩ因子、第Ｖ因子、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第ＸＩ因子、第ＸＩＩ因子、第ＸＩＩＩ因子、フィブロネクチン、アルファ－２アンチプラスミン、ウロキナーゼ、プロテインＣ、プロテインＳ、プロテインＺ、プロテインＺ関連プロテアーゼインヒビター、プラスミノーゲン、組織プラスミノーゲンアクチベーター、プラスミノーゲンアクチベーターインヒビター１、プラスミノーゲンアクチベーターインヒビター２、フォンビルブランド因子、Ｈ因子、プレカリクレイン、高分子キノーゲン、ヘパリンコファクターＩＩからなる群から選択される３つ以上のタンパク質を含有してもよい。
いくつかの実施形態では、生物学的材料は、３～１０、３～１５、３～２０、３～２５、３～３０、１０～２０、１０～２５、１０～３０、１５～２５、１５～３０、２０～３０、又は３０以上の異なるタンパク質を含む。
いくつかの実施形態では、生物学的材料は、約４０～約６５％のアルブミン（ｗ／ｗ）及び／又は約２５～約４５％のグロブリン（ｗ／ｗ）及び／又は約２～約１２％のフィブリノーゲン（ｗ／ｗ）を含む。
いくつかの実施形態では、方法は、工程（ａ）の後、かつ工程（ｂ）の前に、エンドトキシン結合剤に第１の洗浄バッファーを適用することを更に含む。いくつかの実施形態では、方法は、第１の洗浄バッファーを含むフロースルーを分離することを更に含む。いくつかの実施形態では、第１の洗浄バッファーは、約４．５～８．５のｐＨ（例えば、約ｐＨ５．２）を有する。いくつかの実施形態では、第１の洗浄バッファーは、グリシン、酢酸、クエン酸、リン酸塩、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、カルシウム、マグネシウム、ＥＤＴＡ、及びＴｒｉｓ－ＨＣｌのうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、第１の洗浄バッファーは、約１０～約２００ｍＭのグリシン及び／又は約２０～３００ｍＭの酢酸（例えば、７５ｍＭのグリシン及び約１００ｍＭの酢酸）を含む。いくつかの実施形態では、第１の洗浄バッファーは、約２００ｍＭ以下のＮａＣｌ（例えば、約５０～約１５０ｍＭのＮａＣｌ（例えば、約５０ｍＭのＮａＣｌ又は約１００ｍＭのＮａＣｌ））を含む。いくつかの実施形態では、第１の洗浄バッファーは、約１００～約３００ｍＭのＮａＣｌ（例えば、約２００ｍＭのＮａＣｌ）を含む。いくつかの実施形態では、第１の洗浄バッファーは、約７５ｍＭのグリシン、約１００ｍＭのＡｃＯＨ、及び約２００ｍＭのＮａＣｌを含む。いくつかの実施形態では、方法は、第１の洗浄バッファーを適用した後、エンドトキシン結合剤に第２の洗浄バッファーを適用することを更に含む。いくつかの実施形態では、方法は、第２の洗浄バッファーを含むフロースルーを分離することを更に含む。いくつかの実施形態では、第２の洗浄バッファーは、約４．５～約８．５のｐＨ（例えば、約ｐＨ７．２）を有する。いくつかの実施形態では、第２の洗浄バッファーは、グリシン、酢酸、クエン酸、リン酸塩、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、カルシウム、マグネシウム、ＥＤＴＡ、及びＴｒｉｓ－ＨＣｌのうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、第２の洗浄バッファーは、約５～約１００ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（例えば、約２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ）を含む。いくつかの実施形態では、第２の洗浄バッファーは、約５００ｍＭのＮａＣｌ以下（例えば、約１００～約５００ｍＭのＮａＣｌ（例えば、約３００ｍＭのＮａＣｌ））を含む。いくつかの実施形態では、第２の洗浄バッファーは、約２００～約４００ｍＭのＮａＣｌ（例えば、約３００ｍＭのＮａＣｌ））を含む。いくつかの実施形態では、第２の洗浄バッファーは、約２０ｍＭのＴｒｉｓ及び約３００ｍＭのＮａＣｌを含む。
いくつかの実施形態では、方法は、第２の洗浄バッファーを適用した後、エンドトキシン結合剤に第３の洗浄バッファーを適用することを更に含む。 いくつかの実施形態では、溶出バッファーは、約４．５～約８．５のｐＨ（例えば、約ｐＨ７．２）を有する。いくつかの実施形態では、溶出バッファーは、グリシン、酢酸、クエン酸、リン酸塩、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、カルシウム、マグネシウム、ＥＤＴＡ、及びＴｒｉｓ－ＨＣｌのうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、溶出バッファーは、約５～約１００ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（例えば、約２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ）を含む。いくつかの実施形態では、溶出バッファーは、約１，０００ｍＭ以下のＮａＣｌ（例えば、約５００～約１，０００ｍＭのＮａＣｌ（例えば、約５００ｍＭのＮａＣｌ又は約１，０００ｍＭのＮａＣｌ））を含む。いくつかの実施形態では、溶出バッファーは、約２０ｍＭのＴｒｉｓ及び約５００ｍＭのＮａＣｌを含む。
いくつかの実施形態では、方法は、溶出バッファーを適用した後に、第２の溶出バッファーをエンドトキシン結合剤に適用することを更に含み、第２の溶出バッファーは、約４．５～約８．５のｐＨ（例えば、約ｐＨ７．２）を有する。いくつかの実施形態では、第２の溶出バッファーは、グリシン、酢酸、クエン酸、リン酸塩、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、カルシウム、マグネシウム、ＥＤＴＡ、及びＴｒｉｓ－ＨＣｌのうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、第２の溶出バッファーは、約５～約１００ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（例えば、約２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ）を含む。いくつかの実施形態では、第２の溶出バッファーは、約１，０００ｍＭ以下のＮａＣｌ（例えば、約５００～約１，０００ｍＭのＮａＣｌ（例えば、約５００ｍＭのＮａＣｌ又は約１，０００ｍＭのＮａＣｌ））を含む。いくつかの実施形態では、第２の溶出バッファーは、約２０ｍＭのＴｒｉｓ及び約１，０００ｍＭのＮａＣｌを含む。
いくつかの実施形態では、方法は、工程（ａ）の前に、生物学的材料に希釈バッファーを適用することを更に含む。いくつかの実施形態では、希釈バッファーは、脱イオン水を含む。いくつかの実施形態では、希釈バッファーは、精製水を含む。いくつかの実施形態では、希釈バッファーは、約４．５～約８．５のｐＨ（例えば、約ｐＨ５．５、約ｐＨ７．２、又は約ｐＨ７．３）を有する。いくつかの実施形態では、生物学的材料は、希釈バッファーで１：１～１：１０（ｖ／ｖ）に希釈される。いくつかの実施形態では、希釈バッファーは、グリシン、酢酸、クエン酸、リン酸塩、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、カルシウム、マグネシウム、ＥＤＴＡ、及びＴｒｉｓ－ＨＣｌのうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、希釈バッファーは、約５～約１００ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（例えば、約２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ）を含む。いくつかの実施形態では、希釈バッファーは、約５０ｍＭ以下のＮａＣｌ（例えば、塩なし、ＮａＣｌなし、又は約５０ｍＭのＮａＣｌ）を含む。いくつかの実施形態では、希釈バッファーは、約５～約１００ｍＭのリン酸塩（例えば、１５ｍＭのリン酸塩）を含む。
いくつかの実施形態では、方法は、工程（ａ）の前に生物学的材料のｐＨを調整することを更に含む。いくつかの実施形態では、方法は、工程（ａ）の前に酢酸を添加することにより、生物学的材料のｐＨを約４．５～約８．５（例えば、約ｐＨ５．５、約ｐＨ７．２、又は約ｐＨ７．３）に調整することを含む。いくつかの実施形態では、方法は、工程（ａ）の前に生物学的材料の導電性を調整することを更に含む。いくつかの実施形態では、方法は、工程（ａ）の前に、生物学的材料の導電率を約１０～約３０ｍＳ／ｃｍ、約１５～約２５ｍＳ／ｃｍ（例えば、約２０ｍＳ／ｃｍ）に調整することを含む。
いくつかの実施形態では、方法は、フロースルー中のＩαＩｐの量を検出することを更に含む。いくつかの実施形態では、方法は、フロースルーを破棄することを含む。
いくつかの実施形態では、方法は、溶出液中のＩαＩｐの量を検出することを更に含む。
いくつかの実施形態では、方法は、約１～１０ｍＬ／分の流速を含む。
いくつかの実施形態では、方法は、クロマトグラフィー支持体（例えば、陰イオン交換クロマトグラフィー支持体、サイズ排除クロマトグラフィー支持体、イオン交換クロマトグラフィー支持体、アフィニティークロマトグラフィー支持体、又はそれらの組み合わせ）に生物学的材料を適用することを更に含む。いくつかの実施形態では、クロマトグラフィー支持体は、前述の陰イオン交換クロマトグラフィー支持体である。
いくつかの実施形態では、方法は、（ｉ）生物学的材料をクロマトグラフィー支持体に適用し、クロマトグラフィー支持体に結合しない生物学的材料を含む工程（ｉ）のフロースルーを分離することと、（ｉｉ）クロマトグラフィー支持体に溶出バッファーを適用し、ＩαＩｐを含む溶出液を回収することと、を更に含む。
いくつかの実施形態では、クロマトグラフィー支持体は、モノリシック支持体又は粒子ベースの支持体である。いくつかの実施形態では、モノリシック支持体又は粒子ベースの支持体は、固定化陰イオン交換樹脂（例えば、ジエチルアミノエタン（ＤＥＡＥ）樹脂又は四級アミン（Ｑ）樹脂）を含む。いくつかの実施形態では、モノリシック支持体又は粒子ベースの支持体は、四級アミン（Ｑ）樹脂を含む。いくつかの実施形態では、クロマトグラフィー支持体は、カラム、メンブレン、ディスク、又はチップである。
いくつかの実施形態では、方法は、工程（ｉ）の後、かつ工程（ｉｉ）の前に、クロマトグラフィー支持体に第１の洗浄バッファーを適用することを更に含む。いくつかの実施形態では、工程（ｉｉ）の前に、方法は、第１の洗浄バッファーを含むフロースルーを分離することを更に含む。いくつかの実施形態では、クロマトグラフィー支持体に適用された第１の洗浄バッファーは、約４．５～約８．５のｐＨ（例えば、７．２）を有する。いくつかの実施形態では、クロマトグラフィー支持体に適用された第１の洗浄バッファーは、グリシン、酢酸、クエン酸、リン酸塩、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、カルシウム、マグネシウム、ＥＤＴＡ、及びＴｒｉｓ－ＨＣｌのうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、クロマトグラフィー支持体に適用された第１の洗浄バッファーは、約５～約１００ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（例えば、約２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ）を含む。いくつかの実施形態では、クロマトグラフィー支持体に適用された第１の洗浄バッファーは、約４００ｍＭ以下のＮａＣｌ（例えば、約５０～約２５０ｍＭのＮａＣｌ（例えば、約２５０ｍＭのＮａＣｌ））を含む。いくつかの実施形態では、クロマトグラフィー支持体に適用された第１の洗浄バッファーは、約２０ｍＭのＴｒｉｓ及び約２５０ｍＭのＮａＣｌを含む。
いくつかの実施形態では、方法は、第１の洗浄バッファーを適用した後、クロマトグラフィー支持体に第２の洗浄バッファーを適用することを更に含む。いくつかの実施形態では、方法は、第２の洗浄バッファーを含むフロースルーを分離することを更に含む。いくつかの実施形態では、クロマトグラフィー支持体に適用される第２の洗浄バッファーは、約４．５～約８．５のｐＨ（例えば、約ｐＨ５．２）を有する。いくつかの実施形態では、クロマトグラフィー支持体に適用される第２の洗浄バッファーは、グリシン、酢酸、クエン酸、リン酸塩、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、カルシウム、マグネシウム、ＥＤＴＡ、ＮａＯＨ、及びＴｒｉｓ－ＨＣｌのうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、クロマトグラフィー支持体に適用される第２の洗浄バッファーは、約１０～約２００ｍＭのグリシン及び／又は約２０～約３００ｍＭの酢酸（例えば、約５０ｍＭのグリシン及び約１００ｍＭの酢酸）を含む。いくつかの実施形態では、クロマトグラフィー支持体に適用される第２の洗浄バッファーは、約１００～約５００ｍＭのＮａＣｌ（例えば、約１７５ｍＭのＮａＣｌ）を含む。
いくつかの実施形態では、方法は、第２の洗浄バッファーを適用した後、クロマトグラフィー支持体に第３の洗浄バッファーを適用することを更に含む。いくつかの実施形態では、方法は、第３の洗浄バッファーを含むフロースルーを分離することを更に含む。いくつかの実施形態では、クロマトグラフィー支持体に適用される第３の洗浄バッファーは、約４．５～約８．５のｐＨ（例えば、約ｐＨ７．２）を有する。いくつかの実施形態では、クロマトグラフィー支持体に適用される第３の洗浄バッファーは、約４．５～約８．５のｐＨ（例えば、７．２）を有する。いくつかの実施形態では、クロマトグラフィー支持体に適用される第３のウォッシュバッファーは、グリシン、酢酸、クエン酸、リン酸塩、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、カルシウム、マグネシウム、ＥＤＴＡ、及びＴｒｉｓ－ＨＣｌのうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、クロマトグラフィー支持体に適用される第３の洗浄バッファーは、約５～約１００ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（例えば、約２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ）を含む。いくつかの実施形態では、クロマトグラフィー支持体に適用される第１の洗浄バッファーは、約４００ｍＭ以下のＮａＣｌ（例えば、約５０～約２５０ｍＭのＮａＣｌ（例えば、約２００ｍＭのＮａＣｌ））を含む。いくつかの実施形態では、クロマトグラフィー支持体に適用される第１の洗浄バッファーは、約２０ｍＭのＴｒｉｓ及び約２００ｍＭのＮａＣｌを含む。いくつかの実施形態では、クロマトグラフィー支持体に適用される溶出バッファーは、約４．５～約８．５のｐＨ（例えば、約ｐＨ７．２）を有する。いくつかの実施形態では、クロマトグラフィー支持体に適用される溶出バッファーは、グリシン、酢酸、クエン酸、リン酸塩、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、カルシウム、マグネシウム、ＥＤＴＡ、及びＴｒｉｓ－ＨＣｌのうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、クロマトグラフィー支持体に適用される溶出バッファーは、約５～約１００ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（例えば、約２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ）を含む。いくつかの実施形態では、クロマトグラフィー支持体に適用される溶出バッファーは、約１，０００ｍＭ以下のＮａＣｌ（例えば、約７５０ｍＭのＮａＣｌ）を含む。
いくつかの実施形態では、方法は、工程（ｉ）の前に、生物学的材料に希釈バッファーを適用することを更に含む。いくつかの実施形態では、希釈バッファーは、脱イオン水を含む。いくつかの実施形態では、希釈バッファーは、精製水を含む。ある実施形態では、希釈バッファーは、約４．５～約８．５のｐＨ（例えば、約ｐＨ７．２）を有する。いくつかの実施形態では、生物学的材料は、希釈バッファーで１：１～１：１０（ｖ／ｖ）に希釈される。いくつかの実施形態では、希釈バッファーは、グリシン、酢酸、クエン酸、リン酸塩、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、カルシウム、マグネシウム、ＥＤＴＡ、及びＴｒｉｓ－ＨＣｌのうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、希釈バッファーは、約５～約１００ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（例えば、約２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ）を含む）。いくつかの実施形態では、希釈バッファーは、約３００ｍＭ以下のＮａＣｌ（例えば、塩なし、又は約２００ｍＭのＮａＣｌ）を含む。
いくつかの実施形態では、方法は、工程（ｉ）のフロースルー中のＩαＩｐの量を検出することを更に含む。いくつかの実施形態では、方法は、工程（ｉ）のフロースルーを破棄することを含む。
いくつかの実施形態では、方法は、工程（ｉｉ）の溶出液中のＩαＩｐの量を検出することを更に含む。
いくつかの実施形態では、方法は、約１～１０ｍＬ／分の流速を含む。
いくつかの実施形態では、工程（ｂ）の溶出液中に回収されたＩαＩｐは、生物学的材料中のＩαＩｐの純度に対して約５重量％～９９重量％以上の純度を有する。
いくつかの実施形態では、工程（ｂ）で回収された溶出液中のＩαＩｐの収率は、生物学的材料中に存在するＩαＩｐに対して約２０％（ｗ／ｗ）よりも大きい（例えば、３５％～約９０％以上（例えば、約９５％以上）。いくつかの実施形態では、生物学的材料からのＩαＩｐの収率は、少なくとも約５μｇ／ｍｌ、約５０μｇ／ｍｌ、約１００μｇ／ｍｌ、約３００μｇ／ｍｌ、約６００μｇ／ｍｌ、又は約９００μｇ／ｍｌ（例えば、約５μｇ／ｍｌ～約９００μｇ／ｍｌ）である。
いくつかの実施形態では、ＩαＩｐの純度は、少なくとも約５％（ｗ／ｗ）（例えば、少なくとも約２５％、約５０％（ｗ／ｗ）、又は約７５％（ｗ／ｗ）（例えば、約５％（ｗ／ｗ）～約７５％（ｗ／ｗ）以上（例えば、約９０％、９５％、９７％、９９％、又は１００％（ｗ／ｗ））である。
いくつかの実施形態では、ＩαＩｐは、インターアルファインヒビター（ＩαＩ）、プレアルファインヒビター（ＰαＩ）、及びビクニンの２つ以上を含む。
いくつかの実施形態では、生物学的材料中に存在するＩαＩｐは、６０％～８０％（ｗ／ｗ）のＩαＩｐ及び／若しくは２０％～４０％（ｗ／ｗ）のＰαＩを含み、かつ／又は工程（ｂ）の溶出液中に存在するＩαＩｐは、６０％～８０％（ｗ／ｗ）のＩαＩｐ及び／若しくは２０％～４０％（ｗ／ｗ）のＰαＩを含む。
いくつかの実施形態では、ＩαＩｐは、インターアルファインヒビター（ＩαＩ）、プレアルファインヒビター（ＰαＩ）、及びビクニンの２つ以上を含む。いくつかの実施形態では、ＩαＩｐは、インターアルファインヒビター（ＩαＩ）である。いくつかの実施形態では、ＩαＩｐは、プレアルファインヒビター（ＰαＩ）である。いくつかの実施形態では、ＩαＩｐは、インターアルファインヒビター（ＩαＩ）及びプレアルファインヒビター（ＰαＩ）である。
いくつかの実施形態では、生物学的材料中に存在するＩαＩｐは、６０％～８０％（ｗ／ｗ）のＩαＩｐ及び／若しくは２０％～４０％（ｗ／ｗ）のＰαＩを含み、かつ／又は工程（ｂ）の溶出液中に存在するＩαＩｐは、６０％～８０％（ｗ／ｗ）のＩαＩｐ及び／若しくは２０％～４０％（ｗ／ｗ）のＰαＩを含む。
いくつかの実施形態では、生物学的材料中に存在するＩαＩｐの本質的にすべてが、ＩαＩである。いくつかの実施形態では、生物学的材料中に存在するＩαＩｐの約９０％～約９９．５％（ｗ／ｗ）が、ＩαＩである。いくつかの実施形態では、生物学的材料中に存在するＩαＩｐの約８０％～約９０％（ｗ／ｗ）が、ＩαＩである。いくつかの実施形態では、生物学的材料中に存在するＩαＩｐの約７０％～約８０％（ｗ／ｗ）が、ＩαＩである。いくつかの実施形態では、生物学的材料中に存在するＩαＩｐの約６０％～約７０％（ｗ／ｗ）が、ＩαＩである。いくつかの実施形態では、生物学的材料中に存在するＩαＩｐの約５０％～約６０％（ｗ／ｗ）が、ＩαＩである。いくつかの実施形態では、生物学的材料中に存在するＩαＩｐの約４０％～約５０％（ｗ／ｗ）が、ＩαＩである。いくつかの実施形態では、生物学的材料中に存在するＩαＩｐの約３０％～約４０％（ｗ／ｗ）が、ＩαＩである。いくつかの実施形態では、生物学的材料中に存在するＩαＩｐの約２０％～約３０％（ｗ／ｗ）が、ＩαＩである。いくつかの実施形態では、生物学的材料中に存在するＩαＩｐの約１０％～約２０％（ｗ／ｗ）が、ＩαＩである。いくつかの実施形態では、生物学的材料中に存在するＩαＩｐの約１％～約１０％（ｗ／ｗ）が、ＩαＩである。
いくつかの実施形態では、生物学的材料中に存在するＩαＩｐの本質的にすべてが、ＰαＩである。いくつかの実施形態では、生物学的材料中に存在するＩαＩｐの約９０％～約９９．５％（ｗ／ｗ）が、ＰαＩである。いくつかの実施形態では、生物学的材料中に存在するＩαＩｐの約８０％～約９０％（ｗ／ｗ）が、ＰαＩである。いくつかの実施形態では、生物学的材料中に存在するＩαＩｐの約７０％～約８０％（ｗ／ｗ）が、ＰαＩである。いくつかの実施形態では、生物学的材料中に存在するＩαＩｐの約６０％～約７０％（ｗ／ｗ）が、ＰαＩである。いくつかの実施形態では、生物学的材料中に存在するＩαＩｐの約５０％～約６０％（ｗ／ｗ）が、ＰαＩである。いくつかの実施形態では、生物学的材料中に存在するＩαＩｐの約４０％～約５０％（ｗ／ｗ）が、ＰαＩである。いくつかの実施形態では、生物学的材料中に存在するＩαＩｐの約３０％～約４０％（ｗ／ｗ）が、ＰαＩである。いくつかの実施形態では、生物学的材料中に存在するＩαＩｐの約２０％～約３０％（ｗ／ｗ）が、ＰαＩである。いくつかの実施形態では、生物学的材料中に存在するＩαＩｐの約１０％～約２０％（ｗ／ｗ）が、ＰαＩである。いくつかの実施形態では、生物学的材料中に存在するＩαＩｐの約１％～約１０％（ｗ／ｗ）が、ＰαＩである。
いくつかの実施形態では、生物学的材料中に存在するＩαＩｐの本質的にすべてが、ＩαＩ及びＰαＩである。いくつかの実施形態では、生物学的材料中に存在するＩαＩｐの約９０％～約９９．５％（ｗ／ｗ）が、ＩαＩ及びＰαＩである。いくつかの実施形態では、生物学的材料中に存在するＩαＩｐの約８０％～約９０％（ｗ／ｗ）が、ＩαＩ及びＰαＩである。いくつかの実施形態では、生物学的材料中に存在するＩαＩｐの約９５％～約９９．５％（ｗ／ｗ）が、ＩαＩ及びＰαＩである。いくつかの実施形態では、生物学的材料中に存在するＩαＩｐの約９４％～約９８％（ｗ／ｗ）が、ＩαＩ及びＰαＩである。いくつかの実施形態では、生物学的材料中に存在するＩαＩｐの約９３％～約９７％（ｗ／ｗ）が、ＩαＩ及びＰαＩである。いくつかの実施形態では、生物学的材料中に存在するＩαＩｐの約９１％～約９６％（ｗ／ｗ）が、ＩαＩ及びＰαＩである。いくつかの実施形態では、生物学的材料中に存在するＩαＩｐの約９０％～約９５％（ｗ／ｗ）が、ＩαＩ及びＰαＩである。いくつかの実施形態では、生物学的材料中に存在するＩαＩｐの約８９％～約９４％（ｗ／ｗ）が、ＩαＩ及びＰαＩである。いくつかの実施形態では、生物学的材料中に存在するＩαＩｐの約８８％～約９３％（ｗ／ｗ）が、ＩαＩ及びＰαＩである。いくつかの実施形態では、生物学的材料中に存在するＩαＩｐの約８７％～約９２％（ｗ／ｗ）が、ＩαＩ及びＰαＩである。いくつかの実施形態では、生物学的材料中に存在するＩαＩｐの約８６％～約９１％（ｗ／ｗ）が、ＩαＩ及びＰαＩである。いくつかの実施形態では、生物学的材料中に存在するＩαＩｐの約８５％～約９０％（ｗ／ｗ）が、ＩαＩ及びＰαＩである。
いくつかの実施形態では、工程（ｂ）の溶出液中に存在するＩαＩｐの本質的にすべてが、ＩαＩである。いくつかの実施形態では、工程（ｂ）の溶出液中に存在するＩαＩｐの約９０％～約９９．５％（ｗ／ｗ）が、ＩαＩである。いくつかの実施形態では、工程（ｂ）の溶出液中に存在するＩαＩｐの約８０％～約９０％（ｗ／ｗ）が、ＩαＩである。いくつかの実施形態では、工程（ｂ）の溶出液中に存在するＩαＩｐの約７０％～約８０％（ｗ／ｗ）が、ＩαＩである。いくつかの実施形態では、工程（ｂ）の溶出液中に存在するＩαＩｐの約６８％～約７８％（ｗ／ｗ）が、ＩαＩである。いくつかの実施形態では、工程（ｂ）の溶出液中に存在するＩαＩｐの約６６％～約７６％（ｗ／ｗ）が、ＩαＩである。いくつかの実施形態では、工程（ｂ）の溶出液中に存在するＩαＩｐの約６４％～約７４％（ｗ／ｗ）が、ＩαＩである。いくつかの実施形態では、工程（ｂ）の溶出液中に存在するＩαＩｐの約６２％～約７２％（ｗ／ｗ）が、ＩαＩである。いくつかの実施形態では、工程（ｂ）の溶出液中に存在するＩαＩｐの約６０％～約６５％（ｗ／ｗ）が、ＩαＩである。いくつかの実施形態では、工程（ｂ）の溶出液中に存在するＩαＩｐの約６１％～約６６％（ｗ／ｗ）が、ＩαＩである。いくつかの実施形態では、工程（ｂ）の溶出液中に存在するＩαＩｐの約６２％～約６７％（ｗ／ｗ）が、ＩαＩである。いくつかの実施形態では、工程（ｂ）の溶出液中に存在するＩαＩｐの約６３％～約６８％（ｗ／ｗ）が、ＩαＩである。いくつかの実施形態では、工程（ｂ）の溶出液中に存在するＩαＩｐの約６４％～約６９％（ｗ／ｗ）が、ＩαＩである。いくつかの実施形態では、工程（ｂ）の溶出液中に存在するＩαＩｐの約６５％～約７０％（ｗ／ｗ）が、ＩαＩである。いくつかの実施形態では、工程（ｂ）の溶出液中に存在するＩαＩｐの約６６％～約７１％（ｗ／ｗ）が、ＩαＩである。いくつかの実施形態では、工程（ｂ）の溶出液中に存在するＩαＩｐの約６７％～約７２％（ｗ／ｗ）が、ＩαＩである。いくつかの実施形態では、工程（ｂ）の溶出液中に存在するＩαＩｐの約６８％～約７３％（ｗ／ｗ）が、ＩαＩである。いくつかの実施形態では、工程（ｂ）の溶出液中に存在するＩαＩｐの約６９％～約７４％（ｗ／ｗ）が、ＩαＩである。いくつかの実施形態では、工程（ｂ）の溶出液中に存在するＩαＩｐの約５９％～約６４％（ｗ／ｗ）が、ＩαＩである。いくつかの実施形態では、工程（ｂ）の溶出液中に存在するＩαＩｐの約５８％～約６３％（ｗ／ｗ）が、ＩαＩである。いくつかの実施形態では、工程（ｂ）の溶出液中に存在するＩαＩｐの約５７％～約６２％（ｗ／ｗ）が、ＩαＩである。いくつかの実施形態では、工程（ｂ）の溶出液中に存在するＩαＩｐの約５６％～約６１％（ｗ／ｗ）が、ＩαＩである。いくつかの実施形態では、工程（ｂ）の溶出液中に存在するＩαＩｐの約５５％～約６０％（ｗ／ｗ）が、ＩαＩである。いくつかの実施形態では、工程（ｂ）の溶出液中に存在するＩαＩｐの約５４％～約５９％（ｗ／ｗ）が、ＩαＩである。いくつかの実施形態では、工程（ｂ）の溶出液中に存在するＩαＩｐの約５４％～約５９％（ｗ／ｗ）が、ＩαＩである。いくつかの実施形態では、工程（ｂ）の溶出液中に存在するＩαＩｐの約５３％～約５８％（ｗ／ｗ）が、ＩαＩである。いくつかの実施形態では、工程（ｂ）の溶出液中に存在するＩαＩｐの約５２％～約５７％（ｗ／ｗ）が、ＩαＩである。いくつかの実施形態では、工程（ｂ）の溶出液中に存在するＩαＩｐの約５１％～約５６％（ｗ／ｗ）が、ＩαＩである。いくつかの実施形態では、工程（ｂ）の溶出液中に存在するＩαＩｐの約５０％～約５５％（ｗ／ｗ）が、ＩαＩである。いくつかの実施形態では、工程（ｂ）の溶出液中に存在するＩαＩｐの約４９％～約５４％（ｗ／ｗ）が、ＩαＩである。いくつかの実施形態では、工程（ｂ）の溶出液中に存在するＩαＩｐの約４８％～約５３％（ｗ／ｗ）が、ＩαＩである。いくつかの実施形態では、工程（ｂ）の溶出液中に存在するＩαＩｐの約４７％～約５２％（ｗ／ｗ）が、ＩαＩである。いくつかの実施形態では、工程（ｂ）の溶出液中に存在するＩαＩｐの約４６％～約５１％（ｗ／ｗ）が、ＩαＩである。いくつかの実施形態では、工程（ｂ）の溶出液中に存在するＩαＩｐの約４５％～約５０％（ｗ／ｗ）が、ＩαＩである。いくつかの実施形態では、工程（ｂ）の溶出液中に存在するＩαＩｐの約６０％～約７０％（ｗ／ｗ）が、ＩαＩである。いくつかの実施形態では、工程（ｂ）の溶出液中に存在するＩαＩｐの約５８％～約６８％（ｗ／ｗ）が、ＩαＩである。いくつかの実施形態では、工程（ｂ）の溶出液中に存在するＩαＩｐの約５６％～約６６％（ｗ／ｗ）が、ＩαＩである。いくつかの実施形態では、工程（ｂ）の溶出液中に存在するＩαＩｐの約５４％～約６４％（ｗ／ｗ）が、ＩαＩである。いくつかの実施形態では、工程（ｂ）の溶出液中に存在するＩαＩｐの約５２％～約６２％（ｗ／ｗ）が、ＩαＩである。いくつかの実施形態では、工程（ｂ）の溶出液中に存在するＩαＩｐの約５０％～約６０％（ｗ／ｗ）が、ＩαＩである。いくつかの実施形態では、工程（ｂ）の溶出液中に存在するＩαＩｐの約４８％～約５８％（ｗ／ｗ）が、ＩαＩである。いくつかの実施形態では、工程（ｂ）の溶出液中に存在するＩαＩｐの約４６％～約５６％（ｗ／ｗ）が、ＩαＩである。いくつかの実施形態では、工程（ｂ）の溶出液中に存在するＩαＩｐの約４４％～約５４％（ｗ／ｗ）が、ＩαＩである。いくつかの実施形態では、工程（ｂ）の溶出液中に存在するＩαＩｐの約４２％～約５２％（ｗ／ｗ）が、ＩαＩである。いくつかの実施形態では、工程（ｂ）の溶出液中に存在するＩαＩｐの約４０％～約５０％（ｗ／ｗ）が、ＩαＩである。いくつかの実施形態では、工程（ｂ）の溶出液中に存在するＩαＩｐの約３０％～約４０％（ｗ／ｗ）が、ＩαＩである。いくつかの実施形態では、工程（ｂ）の溶出液中に存在するＩαＩｐの約２０％～約３０％（ｗ／ｗ）が、ＩαＩである。いくつかの実施形態では、工程（ｂ）の溶出液中に存在するＩαＩｐの約１０％～約２０％（ｗ／ｗ）が、ＩαＩである。いくつかの実施形態では、工程（ｂ）の溶出液中に存在するＩαＩｐの約１％～約１０％（ｗ／ｗ）が、ＩαＩである。
いくつかの実施形態では、工程（ｂ）の溶出液中に存在するＩαＩｐの本質的にすべてが、ＰαＩである。いくつかの実施形態では、工程（ｂ）の溶出液中に存在するＩαＩｐの約９０％～約９９．５％（ｗ／ｗ）が、ＰαＩである。いくつかの実施形態では、工程（ｂ）の溶出液中に存在するＩαＩｐの約８０％～約９０％（ｗ／ｗ）が、ＰαＩである。いくつかの実施形態では、工程（ｂ）の溶出液中に存在するＩαＩｐの約７０％～約８０％（ｗ／ｗ）が、ＰαＩである。いくつかの実施形態では、工程（ｂ）の溶出液中に存在するＩαＩｐの約６０％～約７０％（ｗ／ｗ）が、ＰαＩである。いくつかの実施形態では、工程（ｂ）の溶出液中に存在するＩαＩｐの約５０％～約６０％（ｗ／ｗ）が、ＰαＩである。いくつかの実施形態では、工程（ｂ）の溶出液中に存在するＩαＩｐの約４０％～約５０％（ｗ／ｗ）が、ＰαＩである。いくつかの実施形態では、工程（ｂ）の溶出液中に存在するＩαＩｐの約３８％～約４８％（ｗ／ｗ）が、ＰαＩである。いくつかの実施形態では、工程（ｂ）の溶出液中に存在するＩαＩｐの約３６％～約４６％（ｗ／ｗ）が、ＰαＩである。いくつかの実施形態では、工程（ｂ）の溶出液中に存在するＩαＩｐの約３４％～約４４％（ｗ／ｗ）が、ＰαＩである。いくつかの実施形態では、工程（ｂ）の溶出液中に存在するＩαＩｐの約３２％～約４２％（ｗ／ｗ）が、ＰαＩである。いくつかの実施形態では、工程（ｂ）の溶出液中に存在するＩαＩｐの約３０％～約３５％（ｗ／ｗ）が、ＰαＩである。いくつかの実施形態では、工程（ｂ）の溶出液中に存在するＩαＩｐの約３１％～約３６％（ｗ／ｗ）が、ＰαＩである。いくつかの実施形態では、工程（ｂ）の溶出液中に存在するＩαＩｐの約３２％～約３７％（ｗ／ｗ）が、ＰαＩである。いくつかの実施形態では、工程（ｂ）の溶出液中に存在するＩαＩｐの約３３％～約３８％（ｗ／ｗ）が、ＰαＩである。いくつかの実施形態では、工程（ｂ）の溶出液中に存在するＩαＩｐの約３４％～約３９％（ｗ／ｗ）が、ＰαＩである。いくつかの実施形態では、工程（ｂ）の溶出液中に存在するＩαＩｐの約３５％～約４０％（ｗ／ｗ）が、ＰαＩである。いくつかの実施形態では、工程（ｂ）の溶出液中に存在するＩαＩｐの約３０％～約４０％（ｗ／ｗ）が、ＰαＩである。いくつかの実施形態では、工程（ｂ）の溶出液中に存在するＩαＩｐの約２８％～約３８％（ｗ／ｗ）が、ＰαＩである。いくつかの実施形態では、工程（ｂ）の溶出液中に存在するＩαＩｐの約２６％～約３６％（ｗ／ｗ）が、ＰαＩである。いくつかの実施形態では、工程（ｂ）の溶出液中に存在するＩαＩｐの約２４％～約３４％（ｗ／ｗ）が、ＰαＩである。いくつかの実施形態では、工程（ｂ）の溶出液中に存在するＩαＩｐの約２２％～約３２％（ｗ／ｗ）が、ＰαＩである。いくつかの実施形態では、工程（ｂ）の溶出液中に存在するＩαＩｐの約３０％～約３５％（ｗ／ｗ）が、ＰαＩである。いくつかの実施形態では、工程（ｂ）の溶出液中に存在するＩαＩｐの約２９％～約３４％（ｗ／ｗ）が、ＰαＩである。いくつかの実施形態では、工程（ｂ）の溶出液中に存在するＩαＩｐの約２８％～約３３％（ｗ／ｗ）が、ＰαＩである。いくつかの実施形態では、工程（ｂ）の溶出液中に存在するＩαＩｐの約２７％～約３２％（ｗ／ｗ）が、ＰαＩである。いくつかの実施形態では、工程（ｂ）の溶出液中に存在するＩαＩｐの約２６％～約３１％（ｗ／ｗ）が、ＰαＩである。いくつかの実施形態では、工程（ｂ）の溶出液中に存在するＩαＩｐの約２５％～約３０％（ｗ／ｗ）が、ＰαＩである。いくつかの実施形態では、工程（ｂ）の溶出液中に存在するＩαＩｐの約２４％～約２９％（ｗ／ｗ）が、ＰαＩである。いくつかの実施形態では、工程（ｂ）の溶出液中に存在するＩαＩｐの約２３％～約２８％（ｗ／ｗ）が、ＰαＩである。いくつかの実施形態では、工程（ｂ）の溶出液中に存在するＩαＩｐの約２２％～約２７％（ｗ／ｗ）が、ＰαＩである。いくつかの実施形態では、工程（ｂ）の溶出液中に存在するＩαＩｐの約２１％～約２６％（ｗ／ｗ）が、ＰαＩである。いくつかの実施形態では、工程（ｂ）の溶出液中に存在するＩαＩｐの約２０％～約２５％（ｗ／ｗ）が、ＰαＩである。いくつかの実施形態では、工程（ｂ）の溶出液中に存在するＩαＩｐの約２０％～約３０％（ｗ／ｗ）が、ＰαＩである。いくつかの実施形態では、工程（ｂ）の溶出液中に存在するＩαＩｐの約１０％～約２０％（ｗ／ｗ）が、ＰαＩである。いくつかの実施形態では、工程（ｂ）の溶出液中に存在するＩαＩｐの約１％～約１０％（ｗ／ｗ）が、ＰαＩである。
いくつかの実施形態では、工程（ｂ）の溶出液中に存在するＩαＩｐの本質的にすべてが、ＩαＩ及びＰαＩである。いくつかの実施形態では、工程（ｂ）の溶出液中に存在するＩαＩｐの約９０％～約９９．５％（ｗ／ｗ）が、ＩαＩ及びＰαＩである。いくつかの実施形態では、工程（ｂ）の溶出液中に存在するＩαＩｐの約８０％～約９０％（ｗ／ｗ）が、ＩαＩ及びＰαＩである。いくつかの実施形態では、工程（ｂ）の溶出液中に存在するＩαＩｐの約９５％～約９９．５％（ｗ／ｗ）が、ＩαＩ及びＰαＩである。いくつかの実施形態では、工程（ｂ）の溶出液中に存在するＩαＩｐの約９４％～約９８％（ｗ／ｗ）が、ＩαＩ及びＰαＩである。いくつかの実施形態では、工程（ｂ）の溶出液中に存在するＩαＩｐの約９３％～約９７％（ｗ／ｗ）が、ＩαＩ及びＰαＩである。いくつかの実施形態では、工程（ｂ）の溶出液中に存在するＩαＩｐの約９１％～約９６％（ｗ／ｗ）が、ＩαＩ及びＰαＩである。いくつかの実施形態では、工程（ｂ）の溶出液中に存在するＩαＩｐの約９０％～約９５％（ｗ／ｗ）が、ＩαＩ及びＰαＩである。いくつかの実施形態では、工程（ｂ）の溶出液中に存在するＩαＩｐの約８９％～約９４％（ｗ／ｗ）が、ＩαＩ及びＰαＩである。いくつかの実施形態では、工程（ｂ）の溶出液中に存在するＩαＩｐの約８８％～約９３％（ｗ／ｗ）が、ＩαＩ及びＰαＩである。いくつかの実施形態では、工程（ｂ）の溶出液中に存在するＩαＩｐの約８７％～約９２％（ｗ／ｗ）が、ＩαＩ及びＰαＩである。いくつかの実施形態では、工程（ｂ）の溶出液中に存在するＩαＩｐの約８６％～約９１％（ｗ／ｗ）が、ＩαＩ及びＰαＩである。いくつかの実施形態では、工程（ｂ）の溶出液中に存在するＩαＩｐの約８５％～約９０％（ｗ／ｗ）が、ＩαＩ及びＰαＩである。
いくつかの実施形態では、工程（ｂ）の溶出液中に存在するＩαＩｐは、約６０％～約７０％（ｗ／ｗ）のＩαＩ及び約２０％～約３０％（ｗ／ｗ）のＰαＩを含む。いくつかの実施形態では、工程（ｂ）の溶出液中に存在するＩαＩｐは、約６２％～約７２％（ｗ／ｗ）のＩαＩ及び約２８％～約３０％（ｗ／ｗ）のＰαＩを含む。
いくつかの実施形態では、ＩαＩｐは、約６０～約２８０ｋＤａの見かけの分子量を有する。
いくつかの実施形態では、ＩαＩｐは、生物学的活性（例えば、サイトカインインヒビター活性、ケモカインインヒビター活性、又はセリンプロテアーゼインヒビター活性）を有する。
いくつかの実施形態では、生物学的材料は、血液製剤材料（例えば、全血漿、クリオ貧血漿、液体血漿、凍結血漿（ＦＰ）（例えば、新鮮凍結血漿（ＦＦＰ）、ＦＦＰ２４、ＦＰ２４、解凍ＦＦＰ、解凍ＦＦＰ２４、解凍ＦＰ、解凍ＦＰ２４、及びそれらの希釈又は濃縮製剤）、原料血漿、回収した血漿、溶媒／界面活性剤処理した血漿（ＳＤＰ）、多血小板血漿（ＰＲＰ）、血小板貧血漿（ＰＰＰ）、血清、全血、及びそれらの希釈又は濃縮製剤）である。
いくつかの実施形態では、生物学的材料は、血液製剤材料から１つ以上のプロセス工程（例えば、濾過、遠心分離、沈降、クロマトグラフィー、吸着、単離、凍結、解凍、希釈、濃縮、ウイルスクリアランスなど）を経て製造される血漿画分中間体である。
いくつかの実施形態では、生物学的材料は、血液製剤材料から１つ以上のプロセス工程（例えば、濾過、遠心分離、沈降、クロマトグラフィー、吸着、単離、凍結、解凍、希釈、濃縮、ウイルスクリアランスなど）を経て製造される血液製剤である。 いくつかの実施形態では、生物学的材料は、乳又は初乳である。
いくつかの実施形態では、生物学的材料は、哺乳動物（例えば、ヒト、霊長類、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ネコ、又はイヌ）由来のものである。
いくつかの実施形態では、生物学的材料は、エンドトキシン結合剤への適用前に実質的に未加工である。
いくつかの実施形態では、方法は、１つ以上のクロマトグラフィー工程を行うことを更に含む（例えば、工程（ｂ）で回収した溶出液を使用して、第１の態様及び／又はその実施形態の方法を１回以上繰り返す）。
いくつかの実施形態では、工程（ｂ）でエンドトキシン結合剤に適用される溶出バッファーは、ｐＨ７．２を有し、かつ約２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ及び約５００ｍＭのＮａＣｌを含む。
いくつかの実施形態では、エンドトキシン結合剤に適用される第１の洗浄バッファーは、ｐＨ５．２を有し、かつ約７５ｍＭのグリシン、約１００ｍＭの酢酸、及び約１５０ｍＭのＮａＣｌを含む。
いくつかの実施形態では、エンドトキシン結合剤に適用される第２の洗浄バッファーは、ｐＨ７．２を有し、かつ約２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ及び約３００ｍＭのＮａＣｌを含む。
いくつかの実施形態では、クロマトグラフィー支持体に適用される溶出バッファーは、ｐＨ７．２を有し、かつ約２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ及び約７５０ｍＭのＮａＣｌを含む。
いくつかの実施形態では、クロマトグラフィー支持体に適用された第１の洗浄バッファーは、ｐＨ７．２を有し、かつ約２０ｍＭのＴｒｉｓ及び約２５０ｍＭのＮａＣｌを含む。
いくつかの実施形態では、クロマトグラフィー支持体に適用される第２の洗浄バッファーは、ｐＨ５．２を有し、かつ約５０ｍＭのグリシン、約１００ｍＭの酢酸、及び約１７５ｍＭのＮａＣｌを含む。
本開示の第２の態様は、第１の態様及びその実施形態の方法によって製造されたＩαＩｐを含む組成物を特徴とする。一実施形態では、組成物は、ヒトへの投与に適している。
本開示の第３の態様は、第２の態様及びその実施形態の組成物と、薬学的に許容される賦形剤とを含む薬学的組成物を特徴とする。
本開示の第４の態様は、疾患又は状態の治療を必要とする対象におけるそれを治療する方法であって、対象に、第２の態様の組成物若しくはその実施形態の１つ、又は第３の態様の薬学的組成物を投与することによる方法を特徴とする。
本開示の第５の態様は、第２の態様の組成物若しくはその実施形態の１つ、又は第３の態様の薬学的組成物を含むキットを特徴とする。一実施形態では、キットは、治療的使用のための指示書を更に含む。
本開示の第６の態様は、（ａ）脱イオン水を含む希釈バッファーで血漿を希釈して、希釈した血漿を形成することと、（ｂ）希釈した血漿をＥＴＯＸＩＣＬＥＡＲ（商標）樹脂に適用し、ＥＴＯＸＩＣＬＥＡＲ（商標）樹脂に結合しない希釈した血漿を含むフロースルーを分離することと、（ｃ）約７５ｍＭのグリシン、約１００ｍＭのＡｃＯＨ、及び約１５０ｍＭのＮａＣｌを含み、ｐＨ約５．２の第１の洗浄バッファーをＥＴＯＸＩＣＬＥＡＲ（商標）に適用して、第１の洗浄バッファーを含むフロースルーを分離することと、（ｄ）約２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ及び約３００ｍＭのＮａＣｌをｐＨ約７．２で含む第２の洗浄バッファーをＥＴＯＸＩＣＬＥＡＲ（商標）樹脂に適用し、第２の洗浄バッファーを含むフロースルーを分離することと、（ｅ）約２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ及び約５００ｍＭのＮａＣｌを含むｐＨ７．２の溶出バッファーをＥＴＯＸＩＣＬＥＡＲ（商標）樹脂に適用し、ＩαＩｐを含む溶出液を回収することにより、血漿からＩαＩｐを精製する方法を特徴とする。
本開示の第７の態様は、（ａ）１５ｍＭのリン酸塩をｐＨ約５．５で含む希釈バッファーで血漿を希釈して、希釈した血漿を形成することと、（ｂ）希釈した血漿をＤＥＴＯＸＩ－ＧＥＬ（商標）樹脂に適用し、ＤＥＴＯＸＩ－ＧＥＬ（商標）樹脂に結合しない希釈した血漿を含むフロースルーを分離することと、（ｃ）約１５ｍＭのリン酸塩及び約５０ｍＭのＮａＣｌを含み、ｐＨ約５．５の第１の洗浄バッファーをＤＥＴＯＸＩ－ＧＥＬ（商標）に適用して、 第１の洗浄バッファーを含むフロースルーを分離することと、（ｄ）約１５ｍＭのリン酸塩及び約１００ｍＭのＮａＣｌをｐＨ約５．５で含む第２の洗浄バッファーをＤＥＴＯＸＩ－ＧＥＬ（商標）樹脂に適用し、第２の洗浄バッファーを含むフロースルーを分離することと、（ｅ）約１５ｍＭのリン酸塩及び約１，０００ｍＭのＮａＣｌをｐＨ約５．５で含む溶出バッファーをＤＥＴＯＸＩ－ＧＥＬ（商標）樹脂に適用し、ＩαＩｐを含む溶出液を回収することにより、血漿からＩαＩｐを精製する方法を特徴とする。
定義
本明細書で使用する場合、単数形の「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」は、特に指示しない限り、複数の参照を含む。
本明細書で使用する場合、単数形の「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」は、特に指示しない限り、複数の参照を含む。
本明細書で使用する場合、用語「約」は、言及された値の＋／－１０％を意味する。
本明細書で使用する場合、「投与」とは、物質（例えば、ＩαＩｐ）又は組成物の投与量を対象に与える方法を意味する。本明細書に記載の方法で利用されるＩαＩｐは、例えば、経口、筋肉内、静脈内、皮内、経皮、動脈内、腹腔内、傷害内、脳内、関節内、前立腺内、胸膜内、気管内、鼻腔内、硝子体内、膣内、直腸内、局所、腫瘍内、腹腔内、皮下、結膜下、血管内（ｉｎｔｒａｖｅｓｉｃｕｌａｒｌｌｙ）、粘膜内、心膜内、臍帯内、眼内、局所、局部、吸入により、注射により、注入により、持続注入により、標的細胞を直接的に浸漬する局所灌流により、カテーテルにより、洗浄により、クリーム又は液体組成物中で、投与されることができる。投与方法は、様々な要因（例えば、投与される物質又は組成物、及び治療される状態、疾患、又は障害の重症度）に応じて変化し得る。
本明細書で使用する「生物学的材料」という用語は、ＩαＩｐを含有する対象（例えば、ヒトなどの哺乳類）からの試料を意味する。生物学的材料の例は、血液製剤材料、例えば、全血漿、クリオ貧血漿、液体血漿、新鮮凍結血漿（ＦＦＰ）、ＦＦＰ２４、凍結血漿（ＦＰ）、ＦＰ２４、解凍ＦＦＰ、解凍ＦＦＰ２４、解凍ＦＰ、解凍ＦＰ２４、原料血漿、回収した血漿、溶媒／界面活性剤処理した血漿（ＳＤＰ）、多血小板血漿（ＰＲＰ）、血小板貧血漿（ＰＰＰ）、血清、全血、及びそれらの希釈又は濃縮製剤、乳又は初乳、尿、痰、及び脳脊髄液を含む。生物学的材料の例は、１つ以上のプロセス工程（例えば、濾過、遠心分離、沈降、クロマトグラフィー、吸着、単離、凍結、解凍、希釈、濃縮、ウイルスクリアランスなど）を経て製造される血漿画分中間体又は血液製剤を含む。生物学的材料は、ヒト、霊長類、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ネコ、イヌ、又はそれらの組み合わせに由来し得る。また、生物学的材料は、ＩαＩｐを発現する細胞を用いて調製された抽出物であってもよいし、又はＩαＩｐを分泌する細胞、例えば、ＩαＩｐを発現するように組換え修飾された細胞であってもよいし、それを含んでいてもよい。
生物学的材料は、例えば、本明細書に記載のエンドトキシン結合剤を使用する精製工程の前に、他の精製工程が材料に適用されていない程度に、又は材料を用いて行われる任意の前の精製工程が１０％（ｗ／ｗ）未満（例えば、０．１％～１０％（ｗ／ｗ）未満、例えば、０．１％未満、０．５％未満、１％未満、２％未満、３％未満、４％未満、５％未満、６％未満、７％未満、８％未満、若しくは９％未満（ｗ／ｗ））の１つ以上の物質を材料からから取り除く程度に、実質的に未加工であり得る。生物学的材料はまた、本明細書に記載のように、例えばエンドトキシン結合剤を用いた精製工程の前に、処理又は調製されたものであることができる。例えば、生物学的材料は、デカンテーション工程、清澄化工程、クロマトグラフィー工程（例えば、陰イオン交換クロマトグラフィー）、遠心分離及び／又は沈降工程、凍結工程、乾燥工程、蒸発工程、抽出工程、濾過工程、沈殿工程、又は当該技術分野において公知の他の精製若しくは調製方法を用いて処理することができる。プロセス工程は、生物学的材料（例えば、ＩαＩｐ以外のタンパク質）から、最大で、例えば、１０％（ｗ／ｗ）以上（例えば、１０～３０％（ｗ／ｗ）以上、例えば、１５％、２０％、２５％、又は３０％（ｗ／ｗ））の１つ以上の物質を除去し得る。
本明細書で使用する場合、用語「クロマトグラフィー」又は「クロマトグラフィー工程」は、混合物の分析物が異なる速度で移動する媒体に、溶液中又は懸濁液中の混合物を通すことによって、混合物中の１つ以上の分析物を分離することを指す。例えば、クロマトグラフィー工程は、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、又は色素リガンドクロマトグラフィーであり得る。より具体的には、本明細書に記載のように、例えばエンドトキシン結合剤（樹脂など）を用いてクロマトグラフィー工程を実施し、ＩαＩｐを含む生物学的材料からＩαＩｐを分離することができる。
本開示において、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、及び「有する（ｈａｖｉｎｇ）」などは、米国特許法においてそれらに付与された意味を有し、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」などを意味し得る。「本質的にからなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」又は「本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ）」も同様に米国特許法において付与された意味を有し、この用語はオープンエンドであり、記載されているものの基本的又は新規な特性が記載されているもの以上のものの存在によって変化しない限り、記載されているもの以上のものの存在を許容するが、先行技術の実施形態は除外される。
本明細書で使用する場合、「溶出液」という用語は、精製工程（例えば、クロマトグラフィー工程）の間に媒体（例えば、支持体材料）から溶出する分析物材料（例えば、ＩαＩｐ）を含有する画分を指す。溶出液は、媒体に溶出液を適用することにより、媒体から放出され、それにより分析物を放出することができる。より具体的には、溶出液は、溶出液（例えば、塩を含むバッファーなどの溶出バッファー）を媒体に適用した後に培体（例えば、エンドトキシン結合剤）から放出されたＩαＩｐを含有する画分を指すことができる。
本明細書では、「エンドトキシン」という用語は、脂質及び多糖類を含む物質を指す。リポ多糖（ＬＰＳ）などのエンドトキシンは、典型的には、グラム陰性菌の細胞壁の外膜で見出される。エンドトキシンの大きさは約１０ｋＤａであり得るが、最大で１，０００ｋＤａの大きな凝集体を容易に形成することができる。ＬＰＳ（又はエンドトキシン）は、Ｅ． ｃｏｌｉだけでなく、他のグラム陰性細菌でも見出すことができる（例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＢｅｒｔａｎｉ ａｎｄ Ｒｕｉｚ，ＥｃｏＳａｌ Ｐｌｕｓ ｄｏｉ：１０．１１２８／ｅｃｏｓａｌｐｌｕｓ．ＥＳＰ－０００１－２０１８，２０１８を参照のこと）。
本明細書で使用する「エンドトキシン結合剤」とは、リポ多糖などのエンドトキシンを結合できる、又は結合することが知られている分子を意味する。エンドトキシン結合剤は、エンドトキシンに特異的に結合するものであってもよい。エンドトキシン結合剤は、例えば、生物学的材料又はタンパク質の混合物からリポ多糖を除去するために使用されることが知られている樹脂であり得る。例示的なエンドトキシン結合剤としては、ＥＴＯＸＩＣＬＥＡＲ（商標）（ｗｗｗ．ａｓｔｒｅａｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔ／ｅｔｏｘｉｃｌｅａｒ）、ＰＩＥＲＣＥ（商標）高容量エンドトキシン除去樹脂（ｗｗｗ．ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ．ｃｏｍ／ｏｒｄｅｒ／ｃａｔａｌｏｇ／ｐｒｏｄｕｃｔ／８８２７０＃／８８２７０）、ＴＯＸＩＮＥＲＡＳＥＲ（商標）エンドトキシン除去樹脂（ｗｗｗ．ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ．ｃｏｍ／ｋｉｔ／Ｌ００４０２－ＴｏｘｉｎＥｒａｓｅｒ＿ｓｕｐ＿ＴＭ＿ｓｕｐ＿Ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ＿Ｒｅｍｏｖａｌ＿Ｒｅｓｉｎ．ｈｔｍｌ）、ＰＵＲＫＩＮＥ（商標）エンドトキシン除去樹脂（ｗｗｗ．ａｂｂｋｉｎｅ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔ／ｐｕｒｋｉｎｅ－ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ－ｒｅｍｏｖａｌ－ｒｅｓｉｎ－ｂｍｒ２１４００／）、ＤＥＴＯＸＩ－ＧＥＬ（商標）エンドトキシン除去ゲル（ｗｗｗ．ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ．ｃｏｍ／ｏｒｄｅｒ／ｃａｔａｌｏｇ／ｐｒｏｄｕｃｔ／２０３３９＃／２０３３９）、ＰＲＯＭＥＧＡ（商標）エンドトキシン除去樹脂（ｗｗｗ．ｐｒｏｍｅｇａ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｎｕｃｌｅｉｃ－ａｃｉｄ－ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ／ｐｌａｓｍｉｄ－ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ／ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ－ｒｅｍｏｖａｌ－ｒｅｓｉｎ／？ｃａｔＮｕｍ＝Ａ２１９１）などが挙げられるが、これに限定されない。エンドトキシン結合剤は、分子、例えば、ポリミキシンＢ、ポリリジン又はその誘導体、又は合成模倣ペプチドであり得る。
本明細書で使用する場合、「フロースルー」という用語は、結合せずに媒体（例えば、エンドトキシン結合剤などのクロマトグラフィーに使用する媒体）を通過する物質の画分又は流体の体積を指す。媒体に適用される混合物の１つ以上の成分が媒体に完全に担持されるようにし、混合物中の他の成分からの分析物（例えば、ＩαＩｐ）の初期又は追加の分離を達成するために、追加の移動相（例えば、低い（例えば、５０ｍＭ未満の塩）又は無塩（例えば、塩化ナトリウム）のバッファーなどの流体）を添加することができる。
本明細書で使用する場合、用語「インターアルファインヒビタータンパク質」及び「ＩαＩｐ」及びその複数形は、構造的に関連するセリンプロテアーゼインヒビターのファミリーの多成分糖タンパク質を指す。ＩαＩｐは、好中球エラスターゼ、プラスミン、トリプシン、キモトリプシン、グランザイムＫ、プレタンパク質コンバーターゼ、フリン、カテプシンＧ、及びアクロシンを含む数々のプロテアーゼの阻害に重要であることが示されている。ヒト血漿中では、ＩαＩｐは比較的高濃度（４００～８００ｍｇ／Ｌ）で検出される。他のインヒビター分子とは異なり、このインヒビターファミリーは、典型的には、コンドロイチン硫酸鎖によって共有結合されたポリペプチド鎖（軽鎖及び重鎖）の組み合わせを含む。ＩαＩｐの重鎖（Ｈ１、Ｈ２、及びＨ３）は、ヒアルロン酸（ＨＡ）結合タンパク質とも呼ばれている。ヒト血漿中で見出されるＩαＩｐの主な形態は、２本の重鎖（Ｈ１及びＨ２）と１本の軽鎖（Ｌ）とを含有するインターアルファインヒビター（ＩαＩ）と、１本の重鎖（Ｈ３）と１本の軽鎖（Ｌ）とを含むプレアルファインヒビター（ＰαＩ）である。もう一つのＩαＩｐは、血漿セリンプロテアーゼを広く阻害することが知られている軽鎖（Ｋｕｎｉｔｚドメインを２つ持つビクニン（二重ｋｕｎｉｔｚインヒビター）とも呼ばれる）である。もう一つのＩαＩｐは、重鎖関連分子Ｈ４であり、これはビクニンと連動せずに血液中を循環している。更に別のＩαＩｐとして、重鎖関連分子Ｈ５がある。血漿画分に存在するＩαＩ及びＰαＩは、約６０ｋＤａ～約２８０ｋＤａの見かけの分子量を有する。
本明細書で使用する場合、用語「薬学的に許容される賦形剤」は、ヒトへの投与に適した１つ以上の適合する固体若しくは液体の充填剤、希釈剤、又はカプセル化物質を意味する。賦形剤には、等張性及び／又は化学的安定性を高める物質などの添加剤を含有させることができる。このような材料は、利用される量及び濃度においてレシピエントに対して無毒であり、バッファー、例えば、リン酸塩、クエン酸塩、コハク酸塩、酢酸塩、乳酸塩、酒石酸塩、及び他の有機酸若しくはそれらの塩；トリス－ヒドロキシメチルアミンメタン（Ｔｒｉｓ）、重炭酸塩、炭酸塩、及び他の有機塩基及びその塩；抗酸化剤、例えば、アスコルビン酸；低分子量の（例えば、約１０残基未満）ポリペプチド、例えば、ポリアルギニン、ポリリジン、ポリグルタミン酸、及びポリアスパラギン酸；タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチン、若しくは免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）、及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）；アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン酸、アスパラギン酸、ヒスチジン、リジン、若しくはアルギニン；単糖類、二糖類、及びセルロース若しくはその誘導体を含む他の炭水化物、グルコース、マンノース、スクロース、デキストリン、若しくはヘパリン、コンドロイチン硫酸、デキストラン硫酸などの硫酸化炭水化物誘導体；カルシウムイオン、マグネシウムイオン、及びマンガンイオンを含む２価の金属イオンなどの多価金属イオン；エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）などのキレート剤；マンニトール若しくはソルビトールなどの糖アルコール；ナトリウム若しくはアンモニウムなどの対イオン；及び／又はポリソルベート若しくはポロクサマーなどの非イオン性界面活性剤を含むことができる。他の添加剤、例えば、安定剤、抗菌剤、不活性ガス、流体及び栄養補給剤（すなわち、リンゲルデキストロース）、電解質補給剤なども含むことができ、これらは、従来の量で存在することができる。
本明細書で使用する場合、用語「予防（ｐｒｅｖｅｎｔ）」、「予防する（ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ）」、「予防的治療（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」などは、疾患、障害、又は状態を発症していないが、発症のリスクがある、又は発症しやすい対象において、障害又は状態を発症する確率を低減することを指す。
本明細書で使用する場合、用語「加工された」は、本明細書に記載の方法に従って材料をエンドトキシン結合剤に接触させる前に、１つ以上の試料調製工程（例えば、濾過、遠心分離、沈降、クロマトグラフィーなど）を使用して修飾された生物学的材料を指す。プロセスの他の例としては、デカンテーション工程、清澄化工程、凍結工程、乾燥工程、蒸発工程、抽出工程、濾過工程、沈殿工程、又は当技術分野で知られている別の精製又は調製方法が挙げられる。プロセス工程は、生物学的材料（例えば、ＩαＩｐ以外のタンパク質）から、最大で、例えば、１０％（ｗ／ｗ）以上（例えば、１０～３０％（ｗ／ｗ）以上、例えば、１５％、２０％、２５％、又は３０％（ｗ／ｗ））の１つ以上の物質を除去し得る。
本明細書で使用する場合、「精製（ｐｕｒｉｆｙ）」、「精製する（ｐｕｒｉｆｙｉｎｇ）」、「精製（ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）」などの用語は、タンパク質（例えば、ＩαＩｐ以外のタンパク質）及び／又は非タンパク質物質（例えば、リン脂質及び核酸）を、ＩαＩｐ及び他のタンパク質及び／又は物質を含有する異種混合物（例えば、生物学的材料（血液又は乳など）から除去して、元の混合物（例えば、生物学的材料）中に存在する他のタンパク質及び／又は物質を含まずＩαＩｐを含有する組成物を製造するか、又はＩαＩｐ以外のタンパク質及び／又は物質が、例えば、出発混合物（例えば、生物学的材料）と比較して４０重量％以上（例えば、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、又は９９％以上）低減されている組成物を製造する、１つ以上の工程又はプロセスを指す。ＩαＩｐを含有する混合物から除去され得るタンパク質の例は、アルファ－１アンチトリプシン、Ｃ１－インヒビター、アルブミン、グロブリン（免疫グロブリンを含む、例えば、ＩｇＡ、ＩｇＧ（例えば、静脈内Ｉｇ（ＩＶＩｇ）、抗Ｄ ＩｇＧ、Ｂ型肝炎ＩｇＧ、麻疹ＩｇＧ、狂犬病ＩｇＧ、破傷風ＩｇＧ、及び水痘帯状疱疹ＩｇＧ）、ＩｇＭ、ＩｇＤ、及びＩｇＥ）、フィブリノーゲン（第Ｉ因子）、プロトロンビン（第ＩＩ因子）、トロンビン、抗トロンビンＩＩＩ、第ＩＩＩ因子、第Ｖ因子、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第ＸＩ因子、第ＸＩＩ因子、第ＸＩＩＩ因子、フィブロネクチン、アルファ－２アンチプラスミン、ウロキナーゼ、プロテインＣ、プロテインＳ、プロテインＺ、プロテインＺ関連プロテアーゼインヒビター、プラスミノーゲン、組織プラスミノーゲンアクチベーター、プラスミノーゲンアクチベーターインヒビター１、プラスミノーゲンアクチベーターインヒビター２、フォンビルブランド因子、Ｈ因子、プレカリクレイン、高分子キノーゲン、ヘパリンコファクターＩＩを含むが、これらに限定されない。
本明細書で使用する場合、「純粋（ｐｕｒｅ）」又は「純度（ｐｕｒｉｔｙ）」という用語は、分析物が単離され、他の成分を含まない程度を意味する。タンパク質の文脈では、単離されたタンパク質の純度は、あらゆる汚染物質（例えば、１つ以上の無関係なタンパク質又は他の物質）を含まないタンパク質に関して表現することができる。例えば、ＩαＩｐ組成物の純度は、単離された物質の総重量に対して、組成物のどれだけがＩαＩｐであるかを示し、これは、例えば、純ＩαＩｐを基準として決定することができる。本開示で見出される純度のレベルは、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％以上、又は９９％（ｗ／ｗ）以上であり得る。本開示の「純粋な」ＩαＩｐ組成物は、２０重量％、２５重量％、３０重量％、３５重量％、４０重量％、４５重量％、５０重量％、５５重量％、６０重量％、６５重量％、又は最大７０重量％より純粋であり得る。「実質的に純粋な」ＩαＩｐ組成物は、汚染物質又は不純物を実質的に含まないことができ、例えば、７０重量％、７５重量％、８０重量％、８５重量％、９０重量％、９５重量％、又は９９重量％の純度より大きい。いくつかの実施形態では、汚染物質又は不純物のレベルは、約２０重量％、１５重量％、１２重量％、１０重量％、９重量％、８重量％、７重量％、６重量％、５重量％、４重量％、３重量％、２重量％、又は１重量％以下である。純度は、イムノアッセイ又は他の技術（例えば、ＭＡｂ ６９．２６－ヘパリン－ビオチンサンドイッチＥＬＩＳＡ、ＳＤＳ／ＰＡＧＥ、及び／又はウェスタンブロット）を用いて特定の分析物（例えば、ＩαＩｐ）のレベルを検出し、全タンパク質含有量に対する分析物の割合（ｗ／ｗ）を計算することによって決定することができる（例えば、総タンパク質アッセイ（例えば、ビシンコニン酸アッセイ（ＢＣＡ）、ブラッドフォードアッセイ、ビウレットテスト、又は当該分野で公知の別のアッセイ）により決定する）。
本明細書で使用する場合、用語「対象」は、ヒト又は非ヒト哺乳類、例えば、霊長類、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ネコ、又はイヌを含むが、これらに限定されない哺乳類を指す。対象は患者であり得る。
本明細書で使用する場合、「実質的に未加工」という用語は、元のソース材料（例えば、血液）に対して、あるとしても最小限に修正された生物学的材料を指す。例えば、実質的に未加工の生物学的材料は、元のソース材料の元の内容（例えば、同じタンパク質及び／若しくは物質、かつ／又は２つ以上のタンパク質又は物質の同じ比率）、並びに／又は元の特性（例えば、１つ以上の生物学的活性）を保持し得る。生物学的材料は、実質的に未加工であり得、その結果、その材料を用いて行われる任意の先行精製工程が、その材料から１つ以上のタンパク質又は物質の１０％（ｗ／ｗ）未満（例えば、０．１～１０％（ｗ／ｗ）未満、例えば０．１％、０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、又は９％（ｗ／ｗ）未満）が除去される。実質的に未加工の生物学的材料は、特に、例えば、本明細書に記載の方法に従って生物学的材料をエンドトキシン結合剤に接触させる前に、試料調製工程（例えば、濾過、遠心分離、沈降、クロマトグラフィーなど）を用いて修飾されていないものであってよい。
本明細書で使用する場合、「特異的に結合する」という文言は、分析物（例えば、ＩαＩｐなどのタンパク質）と結合剤（例えば、エンドトキシン結合剤）の間の結合反応を指す。特異的結合反応とは、タンパク質及び他の生体分子（例えば、生物学的材料中のＩαＩｐ以外のタンパク質）の不均一な集団の存在下でさえ、分析物と結合剤の間で起こる反応である。分析物（例えば、ＩαＩｐ）と結合剤（例えば、エンドトキシン結合剤）との間の特異的結合は、約１０００ｎＭ未満（例えば、１ｐＭ～１０００ｎＭ）のＫｄによって特徴付けることができる。結合剤（例えば、エンドトキシン結合剤）に特異的に結合しない分析物（例えば、ＩαＩｐ）は、約１０００ｎＭより大きい（例えば、１μＭ、１００μＭ、５００μＭ、又は１ｍＭより大きい）Ｋｄによって特徴付けることができる。
本明細書で使用する場合、用語「支持体」は、少なくとも１つの分析物（例えば、ＩαＩｐ）を含有する材料（例えば、生物学的材料）と接触できる薬剤（例えば、エンドトキシン結合剤）を含有する任意の器具を意味する。支持体は、カラム、メンブレン、ディスク、チップ、又はクロマトグラフィー若しくはアフィニティー捕捉のための他の装置であってもよく、その例は、当技術分野で知られており、本明細書に記載されている。
本明細書で使用する場合、「治療する」という用語は、障害及び／又はそれに関連する１つ以上の症状を低減又は改善することを指す。排除されるわけではないが、障害又は状態を治療することは、障害又はそれに関連する症状を完全に除去することを必要としないことが理解されるであろう。
本明細書で使用する場合、用語「収率」は、出発材料（例えば、生物学的材料）中の分析物の量（ｗ／ｗ）と比較して、精製工程又はプロセスの後に得られる分析物（例えば、ＩαＩｐ）の相対量を指す。収率は、パーセンテージとして表すことができる。本開示の文脈において、出発材料及び精製工程後に得られた分析物中の分析物（例えば、ＩαＩｐ）の量は、免疫測定法又はアッセイ（例えば、抗ＩαＩｐ抗体（例えば、ＭＡｂ ６９．２６）－ヘパリンビオチンサンドイッチＥＬＩＳＡ、ＳＤＳ／ＰＡＧＥ、及び／又はウェスタンブロット）を用いて測定することができる。本開示の方法は、元の生物学的材料中に存在する量に対して約２０％（ｗ／ｗ）以上の精製ＩαＩｐの収率をもたらすために使用され得る。例えば、方法は、約２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、又は９０％（ｗ／ｗ）以上の精製ＩαＩｐの収率をもたらすために使用できる。
本開示は、エンドトキシン結合剤を用いて、生物学的材料（例えば、血液）からＩαＩｐ（例えば、ＩαＩ、ＰαＩ、重鎖（例えば、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、及び／若しくはＨ５）、軽鎖（例えば、ビクニン）、又はこれらの組み合わせ）を精製する方法を特徴とする。本方法は、ＩαＩｐを含有する生物学的材料（例えば、血液又はミルクなどの加工済み又は実質的に未加工の生物学的材料）を、エンドトキシン結合剤に適用することを含む。本発明者らは、エンドトキシン特異的クロマトグラフィー樹脂（ＥＴＯＸＩＣＬＥＡＲ（商標）、及びＤＥＴＯＸＩ－ＧＥＬ（商標））のようなエンドトキシン結合剤が、予想外にも、ＩαＩｐと結合することを見出した。驚くべきことに、エンドトキシン結合剤は、ＩαＩｐを精製するプロセスで使用すると、精製プロセス中のＩαＩｐの損失を低減し、それによって他の方法と比較して、回収されるＩαＩｐの収率を保持又は改善する。加えて、ＩαＩｐの精製プロセスの一部としてエンドトキシン結合剤を使用することで、回収されるＩαＩｐの純度を維持又は向上させる。
そこで、本発明者らは、このようなエンドトキシン結合剤を用いて、例えば血液などの生物学的ソースからＩαＩｐを精製した。更に、精製プロセスの一部としてエンドトキシン結合剤を使用する場合、最大５０％以上（例えば、最大９０％以上）のＩαＩｐの収率及び純度を得ることができる。この知見は、本開示の方法を利用する際に、精製プロセスを簡略化し、同時にＩαＩｐの収率及び純度を高めるために使用することができる。
また、本明細書に記載の方法によって得られた精製されたＩαＩｐを用いて調製された薬学的組成物、並びに疾患若しくは状態の治療及び／又はその発症の可能性の低減を必要とする対象におけるそれを行うための方法であって、本明細書に記載の方法によって得られた精製されたＩαＩｐを用いて調製された薬学的組成物を投与することによる方法も特徴とする。
精製方法
エンドトキシン結合剤を用いて、生物学的材料（例えば、血液）からＩαＩｐ（例えば、ＩαＩ、ＰαＩ、重鎖（例えば、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、及び／若しくはＨ５）、軽鎖（例えば、ビクニン）、又はこれらの組み合わせ）を精製することができる。以下に記載される方法を用いて、生物学的材料中に存在する他の成分からＩαＩｐを分離することができる。本方法は、約５％～約９９％以上（例えば、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９５％より大きい、例えば、９７％若しくは９９％、又は９９％より大きい）の範囲の純度を有するＩαＩｐを調製するために使用することができる。加えて、本方法は、元の生物学的材料中に存在する量に対して約２０％（ｗ／ｗ）以上の精製ＩαＩｐの収率をもたらすために使用され得る。例えば、方法は、約２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、又は９０％（ｗ／ｗ）以上の精製ＩαＩｐの収率をもたらすために使用できる。
エンドトキシン結合剤を用いて、生物学的材料（例えば、血液）からＩαＩｐ（例えば、ＩαＩ、ＰαＩ、重鎖（例えば、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、及び／若しくはＨ５）、軽鎖（例えば、ビクニン）、又はこれらの組み合わせ）を精製することができる。以下に記載される方法を用いて、生物学的材料中に存在する他の成分からＩαＩｐを分離することができる。本方法は、約５％～約９９％以上（例えば、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９５％より大きい、例えば、９７％若しくは９９％、又は９９％より大きい）の範囲の純度を有するＩαＩｐを調製するために使用することができる。加えて、本方法は、元の生物学的材料中に存在する量に対して約２０％（ｗ／ｗ）以上の精製ＩαＩｐの収率をもたらすために使用され得る。例えば、方法は、約２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、又は９０％（ｗ／ｗ）以上の精製ＩαＩｐの収率をもたらすために使用できる。
生物学的材料
以下に記載される方法を用いて、生物学的材料からＩαＩｐを精製することができる。ＩαＩｐを含有する生物学的材料は、ヒト、霊長類、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ネコ、イヌ、又はそれらの組み合わせから得ることができる。生物学的材料としては、例えば、血液、乳（例えば、初乳）、尿、痰、及び脳脊髄液を挙げることができる。例えば、生物学的材料は、全血漿、クリオ貧血漿、液体血漿、新鮮凍結血漿（ＦＦＰ）、ＦＦＰ２４、凍結血漿（ＦＰ）、ＦＰ２４、解凍ＦＦＰ、解凍ＦＦＰ２４、解凍ＦＰ、解凍ＦＰ２４、原料血漿、回収した血漿、溶媒／界面活性剤処理した血漿（ＳＤＰ）、多血小板血漿（ＰＲＰ）、血小板貧血漿（ＰＰＰ）、血清、血液（例えば、全血）、及びそれらの希釈又は濃縮製剤であり得るが、これらに限定されない。ＩαＩｐを含有する生物学的材料は、血漿画分中間体であってもよいが、これに限定されるものではない。血漿画分中間体は、全血漿、クリオ貧血漿、液体血漿、新鮮凍結血漿（ＦＦＰ）、ＦＦＰ２４、凍結血漿（ＦＰ）、ＦＰ２４、解凍ＦＦＰ、解凍ＦＦＰ２４、解凍ＦＰ、解凍ＦＰ２４、原料血漿、回収した血漿、溶媒／界面活性剤処理した血漿（ＳＤＰ）、多血小板血漿（ＰＲＰ）、血小板貧血漿（ＰＰＰ）、血清、全血、及びそれらの希釈又は濃縮製剤から、１つ以上のプロセス工程を通して生成される（例えば、濾過、遠心分離、沈降、クロマトグラフィー、吸着、単離、凍結、解凍、希釈、濃縮、Ｓ／Ｄ処理など）。
以下に記載される方法を用いて、生物学的材料からＩαＩｐを精製することができる。ＩαＩｐを含有する生物学的材料は、ヒト、霊長類、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ネコ、イヌ、又はそれらの組み合わせから得ることができる。生物学的材料としては、例えば、血液、乳（例えば、初乳）、尿、痰、及び脳脊髄液を挙げることができる。例えば、生物学的材料は、全血漿、クリオ貧血漿、液体血漿、新鮮凍結血漿（ＦＦＰ）、ＦＦＰ２４、凍結血漿（ＦＰ）、ＦＰ２４、解凍ＦＦＰ、解凍ＦＦＰ２４、解凍ＦＰ、解凍ＦＰ２４、原料血漿、回収した血漿、溶媒／界面活性剤処理した血漿（ＳＤＰ）、多血小板血漿（ＰＲＰ）、血小板貧血漿（ＰＰＰ）、血清、血液（例えば、全血）、及びそれらの希釈又は濃縮製剤であり得るが、これらに限定されない。ＩαＩｐを含有する生物学的材料は、血漿画分中間体であってもよいが、これに限定されるものではない。血漿画分中間体は、全血漿、クリオ貧血漿、液体血漿、新鮮凍結血漿（ＦＦＰ）、ＦＦＰ２４、凍結血漿（ＦＰ）、ＦＰ２４、解凍ＦＦＰ、解凍ＦＦＰ２４、解凍ＦＰ、解凍ＦＰ２４、原料血漿、回収した血漿、溶媒／界面活性剤処理した血漿（ＳＤＰ）、多血小板血漿（ＰＲＰ）、血小板貧血漿（ＰＰＰ）、血清、全血、及びそれらの希釈又は濃縮製剤から、１つ以上のプロセス工程を通して生成される（例えば、濾過、遠心分離、沈降、クロマトグラフィー、吸着、単離、凍結、解凍、希釈、濃縮、Ｓ／Ｄ処理など）。
また、生物学的材料は、ＩαＩｐを発現する細胞を用いて調製された抽出物であってもよいし、又はＩαＩｐを分泌する細胞、例えば、ＩαＩｐを発現するように組換え修飾された細胞であってもよいし、それを含んでいてもよい。
生物学的材料は、ＩαＩｐに加えて、血液中で見出される３種以上のタンパク質又は乳（初乳など）中で見出される３種以上のタンパク質のようなタンパク質の混合物を含有していてもよい。例えば、生物学的材料は、アルファ－１アンチトリプシン、Ｃ１－インヒビター、アルブミン、グロブリン（例えば、免疫グロブリン、例えば、ＩｇＡ、ＩｇＧ（例えば、静脈内Ｉｇ（ＩＶＩｇ）、抗Ｄ ＩｇＧ、Ｂ型肝炎ＩｇＧ、麻疹ＩｇＧ、狂犬病ＩｇＧ、破傷風ＩｇＧ、及び水痘帯状疱疹ＩｇＧ）、ＩｇＭ、ＩｇＤ、及びＩｇＥ）、フィブリノーゲン（第Ｉ因子）、プロトロンビン（第ＩＩ因子）、トロンビン、抗トロンビンＩＩＩ、第ＩＩＩ因子、第Ｖ因子、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第ＸＩ因子、第ＸＩＩ因子、第ＸＩＩＩ因子、フィブロネクチン、アルファ－２アンチプラスミン、ウロキナーゼ、プロテインＣ、プロテインＳ、プロテインＺ、プロテインＺ関連プロテアーゼインヒビター、プラスミノーゲン、組織プラスミノーゲンアクチベーター、プラスミノーゲンアクチベーターインヒビター１、プラスミノーゲンアクチベーターインヒビター２、フォンビルブランド因子、Ｈ因子、プレカリクレイン、高分子キノーゲン、ヘパリンコファクターＩＩを含有してもよい。生物学的材料は、乳（例えば、初乳）であってもよく、これは、１種以上のホエイ（例えば、最大約５０～８０％（ｗ／ｗ）；例えば、ベータ－ラクトグロブリン（例えば、約１～５％（ｗ／ｗ））、アルファ－ラクトアルブミン（例えば、約０．５～２％（ｗ／ｗ））、アルブミン、オバルブミン、及びグロブリン（例えば、免疫グロブリン、例えば、ＩｇＡ、ＩｇＧ（例えば、ＩＶＩｇ）、ＩｇＭ、ＩｇＤ、及びＩｇＥ、例えば、約０．０１～１％（ｗ／ｗ））、カゼイン（例えば、アルファ－カゼイン及び／又はベータ－カゼイン；例えば、最大約３～３５％（ｗ／ｗ））、ラクトフェリン（例えば、約０．０１～０．２％（ｗ／ｗ））、ラクトース、アルファ－１アンチトリプシン、抗キモトリプシン、プラスミノーゲン、フィブリノーゲン、成長因子、及びサイトカイン）を含有してもよい。
以下に記載される方法に従って、エンドトキシン結合剤（又は陰イオン交換クロマトグラフィー支持体など、本明細書に記載の異なる支持体）に接触又は適用される生物学的材料は、実質的に未加工（例えば、元のソース材料）であるか、又は生物学的材料は、エンドトキシン結合剤に接触又は適用する前に、例えば、本明細書に記載の方法などの、１つ以上の試料調製方法又は他の既知の精製方法を用いて処理することができる。
実質的に未加工の生物学的材料は、生物学的材料がソース材料の元の特徴を維持するように、元のソース材料（例えば、血液又は本明細書に記載の別のソース）に対して、あるとしても最小限に修正された生物学的材料である。例えば、実質的に未加工の生物学的材料は、材料がエンドトキシン結合剤に接触又は適用される前に、材料から１０％（ｗ／ｗ）未満（例えば、０．１％～１０％（ｗ／ｗ）未満、例えば、０．１％未満、０．５％未満、１％未満、２％未満、３％未満、４％未満、５％未満、６％未満、７％未満、８％未満、若しくは９％未満（ｗ／ｗ））の１つ以上の物質を除去する試料調製又は精製工程に供することができる。あるいは、実質的に未加工の生物学的材料は、事前の精製工程からの溶出液又は画分であり得、この場合、事前の精製工程は、材料から１０％未満の不純物を除去する。
生物学的材料はまた、エンドトキシン結合剤（又は陰イオン交換クロマトグラフィー支持体など、本明細書に記載の異なる支持体）への適用前に、本明細書に記載のものなど、１つ以上のプロセス工程に供されてもよい。例えば、生物学的材料（例えば、血液又は乳）中で見出される１つ以上のタンパク質、例えば、アルファ－１アンチトリプシン、Ｃ１－インヒビター、アルブミン、グロブリン（例えば、免疫グロブリン、例えば、ＩｇＡ、ＩｇＧ（例えば、静脈内Ｉｇ（ＩＶＩｇ）、抗Ｄ ＩｇＧ、Ｂ型肝炎ＩｇＧ、麻疹ＩｇＧ、狂犬病ＩｇＧ、破傷風ＩｇＧ、及び水痘帯状疱疹ＩｇＧ）、ＩｇＭ、ＩｇＤ、及びＩｇＥ）、フィブリノーゲン（第Ｉ因子）、プロトロンビン（第ＩＩ因子）、トロンビン、抗トロンビンＩＩＩ、第ＩＩＩ因子、第Ｖ因子、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第ＸＩ因子、第ＸＩＩ因子、第ＸＩＩＩ因子、フィブロネクチン、アルファ－２アンチプラスミン、ウロキナーゼ、プロテインＣ、プロテインＳ、プロテインＺ、プロテインＺ関連プロテアーゼインヒビター、プラスミノーゲン、組織プラスミノーゲンアクチベーター、プラスミノーゲンアクチベーターインヒビター１、プラスミノーゲンアクチベーターインヒビター２、フォンビルブランド因子、Ｈ因子、プレカリクレイン、高分子キノーゲン、ヘパリンコファクターＩＩは、エンドトキシン結合剤を用いる精製工程の前に、生物学的材料から部分的に除去される（例えば、１％～７０％（ｗ／ｗ）が除去される）、又は実質的に除去される（例えば、７０％～１００％（ｗ／ｗ）が除去される）ことができる。
本開示の方法を用いて、３～１０種（又はそれ以上）の上記の血液タンパク質を含有する生物学的材料からＩαＩｐ（例えば、ＩαＩ、ＰαＩ、重鎖（例えば、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、及び／若しくはＨ５）、軽鎖（例えば、ビクニン）、又はこれらの組み合わせ）を精製することができる。開示される方法を用いて、３～１５、３～２０、３～２５、３～３０、１０～２０、１０～２５、１０～３０、１５～２５、１５～３０、２０～３０、又は３０以上の異なるタンパク質（例えば、血液又は乳タンパク質）を含有する生物学的材料からＩαＩｐを分離することができる。エンドトキシン結合剤に適用される生物学的材料は、ＩαＩｐに加えて、生物学的材料中のタンパク質の総重量で約４０～６５％（例えば、約５５％）のアルブミン、タンパク質の総重量で約２５～４５％（例えば、約３８％）のグロブリン、タンパク質の総重量で約２～１２％（例えば、約７％）のフィブリノーゲン、又はタンパク質の総重量でそれらの任意の組み合わせを含有してもよい。
エンドトキシン結合剤
本明細書に記載の方法は、エンドトキシン結合剤の使用を伴うが、これは、タンパク質の混合物中のＩαＩｐ（例えば、乳又は血液などの生物学的材料中に存在するＩαＩｐ）に結合するために使用することができる。エンドトキシン結合剤とは、リポ多糖などのエンドトキシンと結合することが知られている可能性のある分子である。エンドトキシン結合剤は、エンドトキシンに特異的に結合するものであってもよい。エンドトキシン結合剤は、例えば、支持体に組み込んだり、又は固定化したりすることができる。支持体は、モノリシック支持体又は粒子ベースの支持体であり得る。粒子は、例えば、樹脂であり得る。エンドトキシン結合剤は、任意の数の既知の支持体、例えば、カラム、メンブレン、ディスク、又はチップに充填又は固定化することができる。エンドトキシン結合剤は、分子、例えば、ポリミキシンＢ、ポリリジン又はその誘導体、又は合成模倣ペプチドであり得る。
本明細書に記載の方法は、エンドトキシン結合剤の使用を伴うが、これは、タンパク質の混合物中のＩαＩｐ（例えば、乳又は血液などの生物学的材料中に存在するＩαＩｐ）に結合するために使用することができる。エンドトキシン結合剤とは、リポ多糖などのエンドトキシンと結合することが知られている可能性のある分子である。エンドトキシン結合剤は、エンドトキシンに特異的に結合するものであってもよい。エンドトキシン結合剤は、例えば、支持体に組み込んだり、又は固定化したりすることができる。支持体は、モノリシック支持体又は粒子ベースの支持体であり得る。粒子は、例えば、樹脂であり得る。エンドトキシン結合剤は、任意の数の既知の支持体、例えば、カラム、メンブレン、ディスク、又はチップに充填又は固定化することができる。エンドトキシン結合剤は、分子、例えば、ポリミキシンＢ、ポリリジン又はその誘導体、又は合成模倣ペプチドであり得る。
本明細書に記載の方法で使用できるエンドトキシン結合剤の非限定的な例としては、例えば、ＥＴＯＸＩＣＬＥＡＲ（商標）、ＰＩＥＲＣＥ（商標）高容量エンドトキシン除去樹脂、ＴＯＸＩＮＥＲＡＳＥＲ（商標）エンドトキシン除去樹脂、ＰＵＲＫＩＮＥ（商標）エンドトキシン除去樹脂、ＤＥＴＯＸＩ－ＧＥＬ（商標）エンドトキシン除去ゲル、又はＰｒｏｍｅｇａ（商標）エンドトキシン除去樹脂が挙げられる。本方法は、例えば、エンドトキシン結合剤を含有する予め充填されたカラム又はカートリッジ（例えば、約０．１ｍＬ～約１００ｍＬの容量を有するカラム、又はより大きな容量を有するカラム）を用いて実施することができる。
エンドトキシン結合剤を含有するカラムは、例えば、バッファー（例えば、脱イオン水）に懸濁したエンドトキシン結合剤のスラリーをフィルターフリットカラム（例えば、約２～約１００ｍＬ、又はそれ以上のカラム）に適用し、エンドトキシン結合剤を約３０分間沈降させることにより調製できる。次に、生物学的材料を適用する前に、沈降した樹脂を約３～約５カラム容量の適切なパイロジェンフリーバッファー又は水（例えば、脱イオン水）で平衡化することができる。
いくつかの例では、ＤＥＴＯＸＩ－ＧＥＬ（商標）エンドトキシン除去ゲルが、エンドトキシン結合剤のソースとして使用される。ＤＥＴＯＸＩ－ＧＥＬ（商標）は、固定化されたポリミキシンＢを用いて、エンドトキシンの脂質Ａドメインと結合する。別の例では、エンドトキシン結合剤としてＥＴＯＸＩＣＬＥＡＲ（商標）が使用される。
精製方法で使用するための試薬
希釈バッファー
ＩαＩｐ（例えば、ＩαＩ、ＰαＩ）を含有する生物学的材料は、精製工程の前、例えば、エンドトキシン結合剤などの媒体に生物学的材料を接触又は適用する前に、希釈バッファーと組み合わされてもよい。希釈バッファーは、例えば、エンドトキシン結合剤からＩαＩｐが早期に溶出する可能性を回避又は低減するために、生物学的材料の塩（例えば、ＮａＣｌ）濃度を下げるために添加することができる。生物学的材料は、希釈バッファーを用いて、例えば、１：１～１：１０（ｖ／ｖ）（例えば、１：１、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、又は１：１０（ｖ／ｖ）、例えば１：３（ｖ／ｖ））に希釈し、次いで、媒体（例えばエンドトキシン結合剤）に接触又は適用してもよい。
希釈バッファー
ＩαＩｐ（例えば、ＩαＩ、ＰαＩ）を含有する生物学的材料は、精製工程の前、例えば、エンドトキシン結合剤などの媒体に生物学的材料を接触又は適用する前に、希釈バッファーと組み合わされてもよい。希釈バッファーは、例えば、エンドトキシン結合剤からＩαＩｐが早期に溶出する可能性を回避又は低減するために、生物学的材料の塩（例えば、ＮａＣｌ）濃度を下げるために添加することができる。生物学的材料は、希釈バッファーを用いて、例えば、１：１～１：１０（ｖ／ｖ）（例えば、１：１、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、又は１：１０（ｖ／ｖ）、例えば１：３（ｖ／ｖ））に希釈し、次いで、媒体（例えばエンドトキシン結合剤）に接触又は適用してもよい。
希釈バッファーは、約４．５～８．５のｐＨ範囲を有することができる（例えば、約４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５．０、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８．０、８．１、８．２、８．３、８．４、又は約８．５）。希釈バッファーは、脱イオン水、グリシン、酢酸、クエン酸、リン酸塩、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、カルシウム、マグネシウム、ＥＤＴＡ、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌのうち１つ以上を含有することができる。生物学的材料をロードするために使用される希釈バッファーは、ＮａＣｌなどの塩を低濃度（例えば、３００ｍＭ以下の塩（例えば、ＮａＣｌ、２００ｍＭ、１５０ｍＭ、１００ｍＭ、７５ｍＭ、５０ｍＭ、２５ｍＭ、１０ｍＭ、５ｍＭ、又は０ｍＭなどの塩（例えば、ＮａＣｌ）））で有することがある。例えば、ＩαＩｐを含有する生物学的材料を、２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌを含有するバッファーで１：３（ｖ／ｖ）に希釈し、次いで、希釈試料をエンドトキシン結合カラムに接触又は適用することができる。生物学的材料は、例えば、事前の精製工程（例えば、陰イオン交換支持体を用いる工程などのクロマトグラフィー工程）中に調製されたものであってもよい。希釈バッファーは水であり得る。
ローディングバッファー
ＩαＩｐ（例えば、ＩαＩ、ＰαＩ）を含有する生物学的材料は、精製工程の前、例えば、エンドトキシン結合剤、陰イオン交換体などの媒体に生物学的材料を接触又は適用する前に、ｐＨ及び導電率を調整されてもよい。生物学的材料を含有するローディングバッファーは、約４．５～８．５のｐＨ範囲を有してもよい（例えば、約４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５．０、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８．０、８．１、８．２、８．３、８．４、又は約８．５）。ローディングバッファーは、脱イオン水、グリシン、酢酸、クエン酸、リン酸塩、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、カルシウム、マグネシウム、ＥＤＴＡ、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌのうち１つ以上を含有することができる。ローディングバッファーは、ＮａＣｌなどの塩を低濃度（例えば、３００ｍＭ以下の塩（例えば、２００ｍＭ、１５０ｍＭ、１００ｍＭ、７５ｍＭ、５０ｍＭ、２５ｍＭ、１０ｍＭ、５ｍＭ、又は０ｍＭなどの塩（例えば、ＮａＣｌ）））で有することがある。バッファーは、約２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ及び２００ｍＭのＮａＣｌを含有してもよい。ローディングバッファーは、例えば、事前のプロセス工程（例えば、陰イオン交換支持体を用いる工程などのクロマトグラフィー工程、濾過工程）中に調製されたものであってもよい。ローディングバッファーは、約１０ｍＳ／ｃｍ～約３０ｍＳ／ｃｍ、約１５ｍＳ／ｃｍ～約２５ｍＳ／ｃｍ、又は約２０ｍＳ／ｃｍの導電率を有することができる。
ＩαＩｐ（例えば、ＩαＩ、ＰαＩ）を含有する生物学的材料は、精製工程の前、例えば、エンドトキシン結合剤、陰イオン交換体などの媒体に生物学的材料を接触又は適用する前に、ｐＨ及び導電率を調整されてもよい。生物学的材料を含有するローディングバッファーは、約４．５～８．５のｐＨ範囲を有してもよい（例えば、約４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５．０、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８．０、８．１、８．２、８．３、８．４、又は約８．５）。ローディングバッファーは、脱イオン水、グリシン、酢酸、クエン酸、リン酸塩、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、カルシウム、マグネシウム、ＥＤＴＡ、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌのうち１つ以上を含有することができる。ローディングバッファーは、ＮａＣｌなどの塩を低濃度（例えば、３００ｍＭ以下の塩（例えば、２００ｍＭ、１５０ｍＭ、１００ｍＭ、７５ｍＭ、５０ｍＭ、２５ｍＭ、１０ｍＭ、５ｍＭ、又は０ｍＭなどの塩（例えば、ＮａＣｌ）））で有することがある。バッファーは、約２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ及び２００ｍＭのＮａＣｌを含有してもよい。ローディングバッファーは、例えば、事前のプロセス工程（例えば、陰イオン交換支持体を用いる工程などのクロマトグラフィー工程、濾過工程）中に調製されたものであってもよい。ローディングバッファーは、約１０ｍＳ／ｃｍ～約３０ｍＳ／ｃｍ、約１５ｍＳ／ｃｍ～約２５ｍＳ／ｃｍ、又は約２０ｍＳ／ｃｍの導電率を有することができる。
フロースルーバッファー
フロースルーバッファーは、任意選択的に、精製工程中に生物学的材料のすべてが培体（例えば、エンドトキシン結合剤又は本明細書に記載の別の支持体）にロードされることを確実にするために使用することができる。フロースルーバッファーは、培体への適用後、生物学的材料中に存在する成分の初期分離又は追加分離を達成するために使用することもできる。フロースルーバッファーは、希釈バッファーを同じであり得る。代替的には、フロースルーバッファーは、希釈バッファーと異なっていてもよい。
フロースルーバッファーは、任意選択的に、精製工程中に生物学的材料のすべてが培体（例えば、エンドトキシン結合剤又は本明細書に記載の別の支持体）にロードされることを確実にするために使用することができる。フロースルーバッファーは、培体への適用後、生物学的材料中に存在する成分の初期分離又は追加分離を達成するために使用することもできる。フロースルーバッファーは、希釈バッファーを同じであり得る。代替的には、フロースルーバッファーは、希釈バッファーと異なっていてもよい。
例えば、フロースルーバッファーは、同じ又は異なるｐＨ（例えば、約４．５～約８．５の範囲内のｐＨ（例えば、約４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５．０、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８．０、８．１、８．２、８．３、８．４、又は約８．５））を有し、かつ生物学的材料を媒体にロードするために使用される希釈バッファーに対して、異なる構成の成分（例えば、グリシン、酢酸、クエン酸、リン酸塩、ＮａＣｌ、カルシウム、マグネシウム、ＥＤＴＡ、及びＴｒｉｓ－ＨＣｌのうちの１つ以上が約５ｍＭ～約３００ｍＭ）を有し得る。フロースルーバッファーは、希釈バッファーの濃度よりも高い塩濃度（例えば、希釈バッファーの濃度よりも５～約３００ｍＭ高い塩（例えば、ＮａＣｌ）濃度）を有することができる（例えば、この方法は、ＮａＣｌを含まない希釈バッファーなど、１５０ｍＭ未満のＮａＣｌの希釈バッファーの使用後に約１５０ｍＭのＮａＣｌのフロースルーバッファーの使用を伴う場合がある）。フロースルーバッファーの特性は、精製工程中（例えば、カラムクロマトグラフィー工程中）に生物学的材料の成分間の初期分離を改善するように選択することができる。
洗浄バッファー
精製方法は、本明細書に記載されるように、例えば、生物学的材料をエンドトキシン結合剤に接触若しくは適用した後、又は１つ以上の他の精製工程中に生じる１つ以上の洗浄工程（例えば、１、２、３、４、又はそれ以上の洗浄工程）において使用される洗浄バッファーを含むこともできる。洗浄工程は、エンドトキシン結合剤又は他の媒体（例えば陰イオン交換体）中に存在し得るが、強く結合しない（例えば、約１ｍＭ以上のＫｄを有するような弱い結合）成分（例えば、ＩαＩｐではない生物学的材料中に見い出されるタンパク質又は他の物質）を除去するために実施することができる。
精製方法は、本明細書に記載されるように、例えば、生物学的材料をエンドトキシン結合剤に接触若しくは適用した後、又は１つ以上の他の精製工程中に生じる１つ以上の洗浄工程（例えば、１、２、３、４、又はそれ以上の洗浄工程）において使用される洗浄バッファーを含むこともできる。洗浄工程は、エンドトキシン結合剤又は他の媒体（例えば陰イオン交換体）中に存在し得るが、強く結合しない（例えば、約１ｍＭ以上のＫｄを有するような弱い結合）成分（例えば、ＩαＩｐではない生物学的材料中に見い出されるタンパク質又は他の物質）を除去するために実施することができる。
培体（例えば、本明細書に記載のエンドトキシン結合剤又は他のタイプの支持体）に適用される洗浄バッファーは、培地のｐＨを変更するため、培地の塩濃度を変更するため、又は培地のｐＨ及び塩濃度の両方を変更するために使用できる。培体に適用される第１の洗浄バッファーはｐＨを変化させてもよく、培体に適用される第２の洗浄バッファーは塩濃度を変化させてもよく、又はその逆もあり得る。洗浄バッファーを用いた洗浄工程は、ＩαＩｐ以外のタンパク質の培体からの遊離を促進することにより、ＩαＩｐの精製を容易にすることができる。
洗浄バッファーは、成分又は他の特性（例えば、ｐＨ、導電率又は塩濃度）の点で、フロースルーバッファー、希釈バッファー、又はローディングバッファーと異なってもよい。例えば、洗浄バッファーは、フロースルー又は希釈バッファー中の塩の濃度よりも高い濃度の塩（例えば、ＮａＣｌ）を含有することができる。洗浄バッファー中の塩濃度がフロースルー又は希釈バッファーと同じである場合、洗浄バッファーは、そのｐＨ又はその成分の１つ以上が代わりに異なる場合がある。例えば、精製方法で使用するフロースルーバッファーは、２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ＋１５０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．２）を含有してもよく、一方、洗浄バッファーは、７５ｍＭのグリシン＋１００ｍＭの酢酸＋１５０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ ５．２）を含有してもよい。例えば、精製方法で使用するローディングバッファーは、約１８ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ＋約２ｍＭのＴｒｉｓ＋約２００ｍＭのＮａＣｌ（約ｐＨ７．２）を含有してもよく、一方、第１の洗浄バッファーは、約１８ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ＋約２ｍＭのＴｒｉｓ＋約２５０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ７，２）を含有してもよく、第２の洗浄バッファーは、約７５ｍＭのグリシン＋約１００ｍＭのＨＡｃ＋約１５０ｍＭのＮａＣｌ＋約９２．５ｍＭのＮａＯＨ（ｐＨ５．２）を含有してもよい。例えば、精製方法で使用するローディングバッファーは、約１８ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ＋約２ｍＭのＴｒｉｓ＋約２００ｍＭのＮａＣｌ（約ｐＨ７．２）を含有してもよく、一方、第１の洗浄バッファーは、約７５ｍＭのグリシン＋約１００ｍＭのＨＡｃ＋約２００ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ５．２）を含有してもよく、第２の洗浄バッファーは、（約１８ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ＋約２ｍＭのＴｒｉｓ＋約２５０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．２）を含有してもよい。
洗浄バッファーは、約４．５～８．５のｐＨ範囲を有してもよい（例えば、約４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５．０、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８．０、８．１、８．２、８．３、８．４、又は約８．５）。洗浄バッファーは、約．５．２のｐＨを有し得る。洗浄バッファーは、約．７．２のｐＨを有し得る。洗浄バッファーは、グリシン、酢酸、クエン酸、リン酸塩、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、カルシウム、マグネシウム、ＥＤＴＡ、及びＴｒｉｓ－ＨＣｌのうちの１つ以上を約５ｍＭ～約４００ｍＭで含有することができる。例えば、洗浄バッファーは、約５０～約４００ｍＭの塩（例えば、ＮａＣｌ）濃度を有することができる。例えば、洗浄バッファーは、約２００～約３００ｍＭの塩（例えば、ＮａＣｌ）濃度を有することができる。例えば、洗浄バッファーは、約２５０ｍＭ、約２５０ｍＭ、又は約３００ｍＭの塩（例えば、ＮａＣｌ）濃度を有することができる。例えば、洗浄バッファーは、約２００～約３００ｍＭのＮａＣｌを有してもよい。例えば、洗浄バッファーは、約２００ｍＭのＮａＣｌ、約２５０ｍＭのＮａＣｌ、又は約３００ｍＭのＮａＣｌを有してもよい。洗浄バッファーはまた、精製プロセスにおいて以前に使用された他のバッファー（例えば、希釈バッファー、フロースルーバッファー、及び／又は前洗浄バッファー）とは異なるｐＨで調製してもよい。
精製方法で使用される洗浄バッファーは、異なる塩濃度を含有してもよく、エンドトキシン結合剤、陰イオン交換樹脂などの媒体に、低塩濃度の洗浄バッファーを用いて開始し、その後、各洗浄工程で塩濃度が増加する洗浄バッファーを用いた洗浄工程に適用することができる。
例えば、第１の洗浄工程は、低いｐＨ（例えば、ｐＨ７．０未満、例えば、ｐＨ５．５以下（例えば、ｐＨ５．２））及び／又は塩濃度（例えば、１５０ｍＭ未満の塩（例えば、ＮａＣｌ）濃度）を有する第１の洗浄バッファーを、エンドトキシン結合剤などの媒体に適用することを含むことがあり（例えば、第１の洗浄バッファーは、７５ｍＭのグリシン＋１００ｍＭの酢酸＋１５０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ５．２）を含有し得る）、第２の洗浄工程は、より高いｐＨ（例えば、ｐＨ７．０を超えるｐＨ、例えば、ｐＨ７．２）及び／又は塩濃度（例えば、１５０ｍＭを超える（例えば、約３００ｍＭ）塩（例えば、ＮａＣｌ）濃度））を有する第２の洗浄バッファーを媒体に適用することを含むことがある（例えば、第２の洗浄バッファーは、２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ＋３００ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．２）を含み得る）。別の例では、第１の洗浄工程では、１５ｍＭのリン酸塩＋５０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ５．５）を含有する洗浄バッファーが使用され、その後の洗浄工程では、１５ｍＭのリン酸塩＋１００ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ５．５）を含有する第２の洗浄バッファーが使用される場合がある。
溶出バッファー
また、精製方法は、媒体（例えば、エンドトキシン結合剤又は他の剤、例えば、陰イオン交換樹脂）からＩαＩｐを含有する溶出液を回収することを含んでいてもよい。方法は、媒体（例えば、エンドトキシン結合剤、陰イオン交換樹脂）に溶出液又は溶出バッファーを接触又は適用し、溶出液を回収することを含む。
また、精製方法は、媒体（例えば、エンドトキシン結合剤又は他の剤、例えば、陰イオン交換樹脂）からＩαＩｐを含有する溶出液を回収することを含んでいてもよい。方法は、媒体（例えば、エンドトキシン結合剤、陰イオン交換樹脂）に溶出液又は溶出バッファーを接触又は適用し、溶出液を回収することを含む。
溶出バッファーは、結合したＩαＩｐが媒体（例えば、エンドトキシン結合剤、陰イオン交換樹脂）から放出できるように、十分に高い塩（例えば、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ））濃度（例えば、約２００ｍＭより大きい塩（例えば、ＮａＣｌ））（例えば、２５０ｍＭ、３００ｍＭ、３５０ｍＭ、３７５ｍＭ、４００ｍＭ、４５０ｍＭ、５００ｍＭ、５５０ｍＭ、６００ｍＭ、６５０ｍＭ、７００ｍＭ、７５０ｍＭ、８００ｍＭ、８５０ｍＭ、９００ｍＭ、９５０ｍＭ、又は１０００ｍＭの塩（例えばＮａＣｌ））を用いて調製されてもよい。溶出バッファーは、先に記載したバッファー（例えば、希釈バッファー、ローディングバッファー、フロースルーバッファー、及び洗浄バッファー）と同じ成分を含有してもよいし、又は溶出バッファーは、１つ以上の異なる成分を含有してもよい（例えば、溶出バッファーは、グリシン、酢酸、クエン酸、リン酸、及びＴｒｉｓ－ＨＣｌの１つ以上を約５ｍＭ～約３００ｍＭで含有してもよい）。ＮａＣｌの代わりに他の塩又は添加物、例えば、カルシウム、マグネシウム、ＥＤＴＡを同等の濃度で使用することができる。溶出バッファーのｐＨはまた、以前に媒体（例えば、エンドトキシン結合剤）に接触又は適用されたバッファー（例えば、希釈及び／又は洗浄バッファー）と同じであってもよく、又は溶出バッファーのｐＨは、異なってもよい（例えば、溶出バッファーは、約４．５～約８．５の範囲のｐＨを有し得る（例えば、約４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５．０、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８．０、８．１、８．２、８．３、８．４、又は約８．５））。溶出バッファー中の塩（例えば、ＮａＣｌ）濃度は、以前に媒体（例えば、エンドトキシン結合剤）に適用された洗浄バッファー中の塩（例えば、ＮａＣｌ）濃度より高くてもよい。溶出バッファーのｐＨは、約７．２であり得る。
例えば、溶出バッファーは、約４００ｍＭ～約１，０００ｍＭのＮａＣｌを含有してもよい。例えば、溶出バッファーは、約５００ｍＭのＮａＣｌ、約７５０ｍＭのＮａＣｌ、又は約１，０００ｍＭのＮａＣｌを含有してもよい。好ましい一実施例では、ＩαＩｐは、２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ＋５００ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．２）を含有するバッファーをエンドトキシン結合剤に適用することによって、エンドトキシン結合剤から溶出する。エンドトキシン結合剤への溶出バッファーの適用は、１回又は複数回繰り返すことができる。エンドトキシン結合剤に適用される溶出バッファーは、同一であっても異なっていてもよい。例えば、エンドトキシン結合剤に適用される第２又は後続の溶出バッファーは、第１又は先行する溶出バッファー（例えば、５００ｍＭのＮａＣｌ）に対してより高い塩濃度（例えば、１，０００ｍＭのＮａＣｌ）を含有することができる。所望により、溶出バッファーの適用後に回収された画分は、例えば、ＥＬＩＳＡ又は当該技術分野で既知の他の技術を使用して、ＩαＩｐの存在及び濃度について別々に分析され、次いで、任意選択的にプールされ得る。あるいは、画分をプールし、ＩαＩｐの存在及び濃度について分析することもできる。
清澄化バッファー
また、精製方法は、別のラウンドの精製に使用するための媒体（例えば、エンドトキシン結合剤）を再生するために、清澄化バッファーを媒体に適用する、任意の清澄化工程を含むことができる。清澄化バッファーは、十分に高いｐＨ（例えば、約１２～約１４）で調製することができる。清澄化バッファーは、約１Ｍのアルカリ性溶質、例えば、水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）を含有することができる。任意選択的に、清澄化バッファーは、約１～約２Ｍの塩（例えば、ＮａＣｌ）を追加的に含有することができる。好ましい一実施例では、清澄化バッファーは、１ＭのＮａＯＨ＋２ＭのＮａＣｌ（ｐＨ １４）を含有する。
また、精製方法は、別のラウンドの精製に使用するための媒体（例えば、エンドトキシン結合剤）を再生するために、清澄化バッファーを媒体に適用する、任意の清澄化工程を含むことができる。清澄化バッファーは、十分に高いｐＨ（例えば、約１２～約１４）で調製することができる。清澄化バッファーは、約１Ｍのアルカリ性溶質、例えば、水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）を含有することができる。任意選択的に、清澄化バッファーは、約１～約２Ｍの塩（例えば、ＮａＣｌ）を追加的に含有することができる。好ましい一実施例では、清澄化バッファーは、１ＭのＮａＯＨ＋２ＭのＮａＣｌ（ｐＨ １４）を含有する。
エンドトキシン結合剤を用いるＩαＩｐの精製
ＩαＩｐは、ＩαＩｐを含有する生物学的材料をエンドトキシン結合剤（例えば、本明細書に記載のエンドトキシン結合剤の１つ以上）に接触又は適用することにより、生物学的材料から精製することができる。生物学的材料は、希釈せずにエンドトキシン結合剤に直接適用することができ、あるいは、生物学的材料を希釈バッファー（上記のとおり）で希釈した後にエンドトキシン結合剤に適用することができる。例えば、エンドトキシン結合剤に接触又は適用される生物学的材料（希釈あり又はなし）の容量は、例えば、約０．５～約２０カラム体積（又は他の適切な体積）であってよい。
ＩαＩｐは、ＩαＩｐを含有する生物学的材料をエンドトキシン結合剤（例えば、本明細書に記載のエンドトキシン結合剤の１つ以上）に接触又は適用することにより、生物学的材料から精製することができる。生物学的材料は、希釈せずにエンドトキシン結合剤に直接適用することができ、あるいは、生物学的材料を希釈バッファー（上記のとおり）で希釈した後にエンドトキシン結合剤に適用することができる。例えば、エンドトキシン結合剤に接触又は適用される生物学的材料（希釈あり又はなし）の容量は、例えば、約０．５～約２０カラム体積（又は他の適切な体積）であってよい。
ＩαＩｐを含有する生物学的材料をエンドトキシン結合剤に適用した後、任意選択的に、フロースルーを分析し、ＩαＩｐを含有しない（又は１０％（ｗ／ｗ）未満しか含有しない）ことを確認することができる。例えば、ＥＬＩＳＡアッセイ（例えば、ＭＡｂ ６９．２６などの抗ＩαＩｐ抗体を使用する）又は他の既知の技術（例えば、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、及び／又はウェスタンブロット、又は他の既知の技術）を実施することができる。フロースルーがＩαＩｐを全く含有しないか、又は実質的ではない量（例えば、約３０μｇ／ｍＬ以下、例えば、約２０μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ、５μｇ／ｍＬ、又は１μｇ／ｍＬ以下）しか含有しないことが確認された後、フロースルーは廃棄できる。生物学的材料のすべてがエンドトキシン結合剤にロードされることが確実となるように、追加のフロースルーバッファーをエンドトキシン結合剤に適用することができる（例えば、約１～約５０のカラム体積の容量で）。このフロースルーは、その後、廃棄されてもよい（例えば、所望により、フロースルー中にＩαＩｐが存在しない（又は実質的な量ではない）ことを確認した後）。
次に、エンドトキシン結合剤に弱く結合している生物学的材料中に存在する非ＩαＩｐを除去するために、１つ以上の洗浄工程（例えば、２、３、４、又はそれ以上の洗浄工程）を実行することができる。所定の洗浄工程において、約０．５～約１０カラム体積の洗浄バッファー（又は他の適切な容量）を適用することができる。得られた洗浄画分は、所望により分析（例えば、ＥＬＩＳＡ又は他の既知の技術を使用）して、ＩαＩｐを含有しない（又は１０％（ｗ／ｗ）未満しか含有しない）ことを確認することができる。実質的な量のＩαＩｐ（例えば、１０％（ｗ／ｗ）以上）が洗浄バッファーフロースルー中に検出された場合、所望により、フロースルーを処理して、フロースルー中に存在するＩαＩｐを回収及び精製する（例えば、エンドトキシン結合剤又は本明細書に記載の他の媒体（例えば、陰イオン交換支持体）を使用）ことができる。
洗浄工程を行った後、エンドトキシン結合剤に溶出バッファー（例えば、約０．４～約５カラム体積又は他の適切な容量）を適用することによって、ＩαＩｐを含有する溶出液を回収することができる。所望により、すべてのＩαＩｐを溶出させるため、又は確実に溶出させるために、２つ以上（例えば、２、３、４、又はそれ以上）の溶出バッファーをエンドトキシン結合剤に適用することができる。溶出液は、例えば、ＥＬＩＳＡ又は当該技術分野で既知の他の技術を使用して、ＩαＩｐの存在について分析することができる。次いで、異なる溶出バッファーからの画分を、所望によりプールすることができる。
溶出液が回収された後、任意選択的に、清澄化バッファー（例えば、約０．５～約５カラム体積又は他の適切な容量）をエンドトキシン結合剤に適用することによってエンドトキシン結合剤を清澄化し、将来の使用のために、エンドトキシン結合剤を再生させることができる。得られた清澄化画分は、所望により、ＩαＩｐの存在について分析することができる（例えば、ＥＬＩＳＡ又は他の既知の技術を使用して）。
精製プロセスの各工程（例えば、生物学的材料の適用、洗浄工程、及び溶出工程）は、毎分約１～約１０ｍＬの流速（例えば、毎分約１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、又は１０．０ｍＬの流速）が発生するように、重力流動又は低圧（例えば、０～１５ｐｓｉ）のいずれかを使用して実行され得る）を用いて実施することができる。いくつかの実施例では、流速は、約２ｍＬ／分である。
このプロセスは、所望により、１回以上繰り返すことができる。あるいは、ＩαＩｐは、当該技術分野で知られている技術（例えば、他の技術のうち、濃縮、透析、及び／又は凍結乾燥）を用いて、溶出液画分から更に処理することができる。あるいは、ＩαＩｐを含有する溶出画分は、後述するように、所望により、１つ以上の追加の精製工程に供されることがある。
エンドトキシン結合剤の使用後のＩαＩｐの精製
エンドトキシン結合剤からの溶出後に回収したＩαＩｐを含有する溶出画分は、他の公知の精製工程（例えば、後述の「追加の精製工程」に記載する工程の１つ以上）を用いて更に精製することができる。例えば、ＩαＩｐを含有する溶出液は、例えば、ＵＳ２００３／０１９０７３２、ＵＳ２０１１／０１９０１９４、ＵＳ２０１２／００５３１１３、及びＵＳ２０１４／０２０６８４４に記載されているものなど、１つ以上の精製工程に供されることができ、その各々は参照により本明細書に組み込まれる。更に、ＩαＩｐを含有する溶出液は、上記のような陰イオン交換クロマトグラフィーを用いて更に精製することができる。
エンドトキシン結合剤からの溶出後に回収したＩαＩｐを含有する溶出画分は、他の公知の精製工程（例えば、後述の「追加の精製工程」に記載する工程の１つ以上）を用いて更に精製することができる。例えば、ＩαＩｐを含有する溶出液は、例えば、ＵＳ２００３／０１９０７３２、ＵＳ２０１１／０１９０１９４、ＵＳ２０１２／００５３１１３、及びＵＳ２０１４／０２０６８４４に記載されているものなど、１つ以上の精製工程に供されることができ、その各々は参照により本明細書に組み込まれる。更に、ＩαＩｐを含有する溶出液は、上記のような陰イオン交換クロマトグラフィーを用いて更に精製することができる。
エンドトキシン結合剤の使用前の精製工程
ＩαＩｐを含有する生物学的材料は、生物学的材料をエンドトキシン結合剤に接触又は適用する前に処理することができる。例えば、生物学的材料は、生物学的材料から、最大で、例えば、１０％（ｗ／ｗ）以上（例えば、１０～３０％（ｗ／ｗ）以上、例えば、１５％、２０％、２５％、又は３０％（ｗ／ｗ））の１つ以上の物質（例えば、ＩαＩｐ以外のタンパク質又は物質）を除去する試料調製又は精製工程を用いて処理されてもよい。
ＩαＩｐを含有する生物学的材料は、生物学的材料をエンドトキシン結合剤に接触又は適用する前に処理することができる。例えば、生物学的材料は、生物学的材料から、最大で、例えば、１０％（ｗ／ｗ）以上（例えば、１０～３０％（ｗ／ｗ）以上、例えば、１５％、２０％、２５％、又は３０％（ｗ／ｗ））の１つ以上の物質（例えば、ＩαＩｐ以外のタンパク質又は物質）を除去する試料調製又は精製工程を用いて処理されてもよい。
例えば、処理工程は、濾過、遠心分離、沈降、クロマトグラフィー、デカンテーション工程、清澄化、凍結、乾燥、蒸発、抽出、濾過、沈殿、又は当該技術分野において公知の他の精製若しくは調製方法を含んでもよい。好ましい一実施例では、方法は、ＩαＩｐを含有する生物学的材料を用いて陰イオン交換クロマトグラフィー（後述）を行い、その後、上記及び本明細書で論じたようにＩαＩｐを更に精製するために、陰イオン交換クロマトグラフィーから調製した１つ以上のＩαＩｐを含有する溶出液をエンドトキシン結合剤に接触又は適用することを含む。
事前の精製工程又は処理工程は、例えば、ＵＳ２００３／０１９０７３２、ＵＳ２０１１／０１９０１９４、ＵＳ２０１２／００５３１１３、及びＵＳ２０１４／０２０６８４４に記載の精製方法の１つ以上を含むことができ、これらの各々は、参照により本書に組み込まれる。
追加の精製工程
ＩαＩｐ（例えば、ＩαＩ、ＰαＩ、重鎖（例えば、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、及び／又はＨ５）、軽鎖（例えば、ビクニン）、又はそれらの組み合わせ）を含有する生物学的材料を、エンドトキシン結合剤を用いたＩαＩｐの精製の前又は後（例えば、陰イオン交換クロマトグラフィー支持体を用いることによって）に、エンドトキシン結合剤を含有するもの以外の１つ以上のクロマトグラフィー支持体に適用することができる。クロマトグラフィー支持体は、モノリシック支持体又は粒子ベースの支持体であり得る。クロマトグラフィー支持体は、カラム、メンブレン、ディスク、又はチップであり得る。更に、クロマトグラフィー支持体は、例えば、サイズ排除クロマトグラフィー支持体、イオン交換クロマトグラフィー支持体、アフィニティークロマトグラフィー支持体、又はそれらの組み合わせであり得る。
ＩαＩｐ（例えば、ＩαＩ、ＰαＩ、重鎖（例えば、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、及び／又はＨ５）、軽鎖（例えば、ビクニン）、又はそれらの組み合わせ）を含有する生物学的材料を、エンドトキシン結合剤を用いたＩαＩｐの精製の前又は後（例えば、陰イオン交換クロマトグラフィー支持体を用いることによって）に、エンドトキシン結合剤を含有するもの以外の１つ以上のクロマトグラフィー支持体に適用することができる。クロマトグラフィー支持体は、モノリシック支持体又は粒子ベースの支持体であり得る。クロマトグラフィー支持体は、カラム、メンブレン、ディスク、又はチップであり得る。更に、クロマトグラフィー支持体は、例えば、サイズ排除クロマトグラフィー支持体、イオン交換クロマトグラフィー支持体、アフィニティークロマトグラフィー支持体、又はそれらの組み合わせであり得る。
例えば、モノリシック支持体又は粒子ベースの支持体は、固定化陰イオン交換樹脂を含有してもよい。固定化陰イオン交換樹脂は、例えば、ジエチルアミノエタン（ＤＥＡＥ）又は四級アミン（Ｑ）（例えば、Ｔｏｓｏｈ ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（登録商標）ＧｉｇａＣａｐ Ｑ６５０Ｍ）であり得る。
ＩαＩｐを含有する生物学的材料は、クロマトグラフィー支持体（例えば、陰イオン交換クロマトグラフィー支持体）に直接適用することができる。あるいは、生物学的材料を上記のように希釈用バッファーで希釈した後、支持体に適用することもできる。例えば、クリオ貧血漿を、例えば、２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ＋２００ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．２）を含有する希釈バッファーで１：３（ｖ／ｖ）に希釈し、クロマトグラフィー支持体に適用することができる（例えば、約０．５～約２５カラム体積又は他の適切な容量で）。
生物学的材料をクロマトグラフィー支持体に適用した後、フロースルーを分離し、任意選択的に、分析して、ＩαＩｐを含有しない（又は１０％（ｗ／ｗ）未満しか含有しない）ことを確認することができる。例えば、ＥＬＩＳＡアッセイ又は他の既知の技術（例えば、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、及び／又はウェスタンブロット、又は他の既知の技術）を実施することができる。実質的な量のＩαＩｐ（例えば、１０％（ｗ／ｗ）以上）がフロースルー中に検出された場合、所望により、フロースルーを処理して、フロースルー中に存在するＩαＩｐを回収及び精製する（例えば、エンドトキシン結合剤又は本明細書に記載の他の媒体（例えば、陰イオン交換支持体）を使用）ことができる。フロースルーがＩαＩｐを全く含有しないか、又は実質的ではない量（例えば、約３０μｇ／ｍＬ以下、例えば、約２０μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ、５μｇ／ｍＬ、又は１μｇ／ｍＬ以下）しか含有しないことが確認された後、フロースルーは廃棄できる。
任意選択的には、生物学的材料のすべてが支持体にロードされることが確実となるように、フロースルーバッファーを調製し、クロマトグラフィー支持体に適用することができる（例えば、約１～約５０のカラム体積の容量、又は他の適切な容量で）。このフロースルーは、その後、廃棄されてもよい（例えば、所望により、フロースルー中にＩαＩｐが存在しない（又は実質的な量ではない）ことを確認した後）。
次に、クロマトグラフィー支持体に弱く結合している生物学的材料中の非ＩαＩｐを除去するために、１つ以上の洗浄工程（例えば、２、３、４、又はそれ以上）を実行することができる。洗浄バッファーは、上記のように調製されてもよい。所定の洗浄工程において、約０．４～約１０カラム体積の洗浄バッファー（又は他の適切な容量）をクロマトグラフィー支持体に適用することができる。得られた洗浄画分は、所望により分析（例えば、ＥＬＩＳＡ又は他の既知の技術を使用）して、ＩαＩｐを含有しない（又は１０％（ｗ／ｗ）未満しか含有しない）ことを確認することができる。実質的な量のＩαＩｐ（例えば、１０％（ｗ／ｗ）以上）が洗浄バッファーフロースルー中に検出された場合、所望により、フロースルーを処理して、フロースルー中に存在するＩαＩｐを回収及び精製する（例えば、エンドトキシン結合剤又は本明細書に記載の他の媒体（例えば、陰イオン交換支持体）を使用）ことができる。
一実施例では、第１の洗浄工程は、２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ＋２５０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．２）を含有するバッファーを、クロマトグラフィー支持体（例えば、Ｔｏｓｏｈ ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（登録商標）ＧｉｇａＣａｐ Ｑ６５０Ｍカラム）に、例えば、約５～１０、例えば、約８若しくは９のカラム体積の容量で適用することにより実施され、次いで、第２の洗浄工程は、５０ｍＭのグリシン＋１００ｍＭの酢酸＋１７５ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ５．２）を含有するバッファーを支持体に、例えば、約２～６、例えば、約４若しくは５のカラム量体積の容量で適用することにより実施される。
その後、クロマトグラフィー支持体に溶出液又は溶出バッファー（例えば、約０．４～約１０カラム体積の容量、又は他の適切な容量）を適用し、ＩαＩｐを含有する溶出液を回収することにより、ＩαＩｐを含有する加工された材料を得ることができる。溶出バッファーは、エンドトキシン結合剤精製工程に関連して上述したのと同様の方法で調製され、クロマトグラフィー支持体に適用することができる。所望により、すべてのＩαＩｐを溶出させるため、又は確実に溶出させるために、２つ以上（例えば、２、３、４、又はそれ以上）の溶出バッファーをクロマトグラフィー支持体に適用することができる。溶出液は、例えば、ＥＬＩＳＡ（又は当該技術分野で既知の他の技術）を使用して、ＩαＩｐの存在について分析することができる）。次いで、異なる溶出バッファーからの画分を、所望によりプールすることができる。
一実施例では、２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ＋７５０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．２）を含有する溶出バッファーは、例えば、約２～５カラム体積、例えば、３～４カラム体積の容量で、クロマトグラフィー支持体に適用される。次いで、ＩαＩｐを含有する溶出液は、上記のように、エンドトキシン結合剤への適用によって更に処理することができ、又は溶出液は、同じ若しくは異なるクロマトグラフィー支持体を用いてクロマトグラフィー工程を繰り返すことによって、又は１つ以上の異なる精製若しくは調製工程、例えば、濾過、遠心分離、沈降、クロマトグラフィー、デカンテーション工程、清澄化、凍結、乾燥、蒸発、抽出、濾過、沈殿、若しくは当該分野で知られている別の精製方法若しくは調製方法を用いることによって、更に加工することができる。
所望により、クロマトグラフィー支持体を清澄化バッファーで洗浄し、将来の使用のためにクロマトグラフィー支持体を再生することができる。得られた清澄化画分は、所望により、ＩαＩｐの存在について分析することができる（例えば、ＥＬＩＳＡ又は他の既知の技術を使用して）。
一実施例では、１ＭのＮａＯＨ＋２ＭのＮａＣｌ（ｐＨ１４）を含有する清澄化バッファーは、例えば、約１～５カラム体積、例えば、１．５～２カラム体積の容量で、クロマトグラフィー支持体に適用される。
一実施例では、１ＭのＮａＯＨ＋２ＭのＮａＣｌ（ｐＨ１４）を含有する清澄化バッファーは、例えば、約１～５カラム体積、例えば、１．５～２カラム体積の容量で、クロマトグラフィー支持体に適用される。
ＩαＩｐの検出
本明細書に記載の精製方法を用いて単離されたＩαＩｐは、例えば、参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２００９／１５４６９５、ＵＳ２０２０／００５７０７７、及びＷＯ２０２０／０８６８７９に記載されるような、当技術分野で既知の１つ以上のアッセイを用いて定量化できる。
本明細書に記載の精製方法を用いて単離されたＩαＩｐは、例えば、参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２００９／１５４６９５、ＵＳ２０２０／００５７０７７、及びＷＯ２０２０／０８６８７９に記載されるような、当技術分野で既知の１つ以上のアッセイを用いて定量化できる。
例えば、ＩαＩｐ定量化アッセイは、ＩαＩｐを含有する試料をＩαＩｐ結合剤（例えば、ＩαＩｐに特異的に結合する抗体（例えば、ＭＡｂ６９．２６（例えば、Ｓｈａ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｐｅｄｉａｔｒ．１８０：１３５－１４０，２０１７）、ＭＡｂ ６９．３１（例えば、Ｌｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ．１８８（６）：９１９－９２６，２００３を参照されたい）、若しくはＰＡｂ Ｒ２２Ｃ（例えば、ＷＯ２０２０／０８６８７９を参照されたい）、これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）、又はＩαＩｐリガンド（例えば、ヘパリン、ＬＰＳ、及び／又はヒアルロン酸（ＨＡ））に接触させることと、結合したＩαＩｐの量を検出すること（例えば、検出薬剤を用いて）と、を含み得る。ＩαＩｐ結合剤は、例えば、ビオチンで標識することができ、検出は、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼで標識したストレプトアビジンを使用することができ、その後、公知の検出方法を使用して検出することができる。別の方法では、ＩαＩｐ結合剤は、例えば、蛍光体で標識され、分光光度計で検出することができる。あるいは、ＩαＩｐ検出剤は、標識を使用せずに直接検出することができる（例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により）。ＩαＩｐ検出剤の添加後、未結合のＩαＩｐ検出剤を除去するために、追加の洗浄工程（例えば、１回又は複数回）を行うことができる。
その後、ＩαＩｐは、当技術分野で知られている標準的な技術を使用して、結合した標識又は結合した検出剤（例えば、酵素活性若しくは蛍光）からのシグナルに基づいて測定することができる。酵素を標識として使用する場合、基質を加えてシグナル（例えば、色の変化）を生成し、分光光度計などのシグナルの検出に適した装置で読み取ることができる。シグナル（例えば、吸光度又は蛍光）は、標準曲線を確立するために、ＩαＩｐの既知の濃度を用いた標準に対してプロットすることができ、又は既知の基準濃度に対して比較することができる。確立された標準曲線又は基準濃度値に基づいて、試料中の未知濃度を算出し、決定することができる。
単離されたＩαＩｐ
本明細書に記載の精製方法（例えば、エンドトキシン結合剤を単独で、又は陰イオン交換クロマトグラフィーなどの１つ以上の追加の前又は後精製工程との組み合わせで用いた精製）は、生物学的材料からＩαＩｐ（例えば、ＩαＩ、ＰαＩ、重鎖（例えば、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、及び／若しくはＨ５）、軽鎖（例えば、ビクニン）、又はその組み合わせ）を精製するのに使用できる。ＩαＩｐの純度は、（例えば、アッセイ又は免疫測定法、例えば、ＭＡｂ ６９．２６－ヘパリン－ビオチンサンドイッチＥＬＩＳＡ、ＳＤＳ／ＰＡＧＥ、及び／又はウェスタンブロットを用いて）精製後に得られたＩαＩｐの総量を検出することと、全タンパク質アッセイ（例えば、ビシンコニン酸アッセイ（ＢＣＡ）、ブラッドフォードアッセイ、ビウレット試験、又は当該分野で公知の別のアッセイ）により決定される総タンパク質含有量に対する割合（ｗ／ｗ）を計算することと、によって決定することができる。精製工程の後、ＩαＩｐは、少なくとも約５％（ｗ／ｗ）の純度、例えば、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％（ｗ／ｗ）超を有してもよい。
本明細書に記載の精製方法（例えば、エンドトキシン結合剤を単独で、又は陰イオン交換クロマトグラフィーなどの１つ以上の追加の前又は後精製工程との組み合わせで用いた精製）は、生物学的材料からＩαＩｐ（例えば、ＩαＩ、ＰαＩ、重鎖（例えば、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、及び／若しくはＨ５）、軽鎖（例えば、ビクニン）、又はその組み合わせ）を精製するのに使用できる。ＩαＩｐの純度は、（例えば、アッセイ又は免疫測定法、例えば、ＭＡｂ ６９．２６－ヘパリン－ビオチンサンドイッチＥＬＩＳＡ、ＳＤＳ／ＰＡＧＥ、及び／又はウェスタンブロットを用いて）精製後に得られたＩαＩｐの総量を検出することと、全タンパク質アッセイ（例えば、ビシンコニン酸アッセイ（ＢＣＡ）、ブラッドフォードアッセイ、ビウレット試験、又は当該分野で公知の別のアッセイ）により決定される総タンパク質含有量に対する割合（ｗ／ｗ）を計算することと、によって決定することができる。精製工程の後、ＩαＩｐは、少なくとも約５％（ｗ／ｗ）の純度、例えば、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％（ｗ／ｗ）超を有してもよい。
単離されたＩαＩｐは、約６０ｋＤａ～約２８０ｋＤａの間の見かけの分子量を有し、これは、当技術分野で知られている任意の適切な方法、例えば、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動によって決定することができる。単離されたＩαＩｐは、生物学的活性についても試験することができ、例えば、サイトカイン阻害活性、ケモカイン阻害活性、プロテアーゼ阻害活性（例えば、セリンプロテアーゼ阻害活性）、コンドロイチン硫酸結合、グリコサミノグリカン結合活性、ヒアルロン酸結合活性、補体結合活性、ヒストン結合活性、Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ（ＲＧＤ）ドメイン結合活性、凝固因子結合活性、細胞修復活性、及び細胞外マトリックスタンパク質結合活性からなる群から選択される活性について試験することもできる。ＩαＩｐはまた、トリプシン阻害特異的活性、例えば、約１０００ＩＵ／ｍｇ～約２０００ＩＵ／ｍｇ（例えば、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、又は２０００ＩＵ／ｍｇ）のトリプシン阻害特異的活性についても試験することができる。
最終精製画分中に存在するＩαＩｐ（例えば、ＩαＩ及び／又はＰαＩ）の割合又は濃度は、変化し得る。好ましくは、精製されたＩαＩｐ（例えば、ＩαＩ及び／又はＰαＩ）は、最終精製画分中に生理的比率で存在する。生理的比率とは、例えば、健康なヒト若しくは動物で見い出される比率、及び／又はヒトの血漿中に自然に現れるＩαＩとＰαＩの比率であってもよい。生理的比率は、典型的には、約６０％～約８０％のＩαＩと、約２０％～約４０％のＰαＩである。
精製方法はまた、生物学的材料（例えば、血液又は乳）中に存在するＩαＩｐに対して約２０％（ｗ／ｗ）以上（例えば、約２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、又は９０％（ｗ／ｗ）以上）の単離されたＩαＩｐの収率を生じる。いくつかの実施例では、収率は、約９０重量％以上又は９５重量％以上であり得る。
開示された精製方法は、ＩαＩｐを含有する組成物を製造するために使用することができる。また、組成物は、元の生物学的材料（例えば、血液又は乳）中に存在したＩαＩｐの濃度に対して、より高いＩαＩｐの濃度を用いて調製することができる。したがって、本方法は、１ｍＬあたり少なくとも約５μｇ／ｍＬ、例えば、約５μｇ、５０μｇ、１００μｇ、３００μｇ、６００μｇ、９００μｇ、１ｍｇ、２ｍｇ、３ｍｇ、４ｍｇ、５ｍｇ、６ｍｇ、７ｍｇ、８ｍｇ、９ｍｇ、１０ｍｇ、１５ｍｇ、２０ｍｇ、２５ｍｇ、３０ｍｇ、３５ｍｇ、４０ｍｇ、４５ｍｇ、又は５０ｍｇ以上の量でＩαＩｐを含有する組成物を調製するために使用可能である。組成物中に存在するＩαＩｐは、組成物の約５～約９９％（ｗ／ｗ）以上を占めることができる（例えば、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９５、９７、９９％（ｗ／ｗ）以上より大きい）。
開示された方法を用いて調製される組成物中のＩαＩｐの濃度を高めるために、追加の工程（例えば、凍結乾燥、真空濃縮）を実施することができる。これらの公知の方法は、例えば、本明細書に記載の方法に従って精製されたＩαＩｐから、例えば約１～５０ｍｇ／ｍＬ（例えば、１ｍＬあたり約１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０ｍｇ以上のＩαＩｐ）の量でＩαＩｐを含有する組成物を製造するために使用できる。
薬学的組成物
本明細書に開示される精製方法を用いた精製（例えば、上述のようにエンドトキシン結合剤を用いる）によって得られるＩαＩｐ（例えば、ＩαＩ、ＰαＩ、重鎖（例えば、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、及び／若しくはＨ５）、軽鎖（例えば、ビクニン）、又はそれらの組み合わせ）を用いて、薬学的組成物を調製することができる。ＩαＩｐは、例えば、薬学的に許容される賦形剤と組み合わせることができる。ＩαＩｐを含有する薬学的組成物は、ヒトへの投与に適している。
本明細書に開示される精製方法を用いた精製（例えば、上述のようにエンドトキシン結合剤を用いる）によって得られるＩαＩｐ（例えば、ＩαＩ、ＰαＩ、重鎖（例えば、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、及び／若しくはＨ５）、軽鎖（例えば、ビクニン）、又はそれらの組み合わせ）を用いて、薬学的組成物を調製することができる。ＩαＩｐは、例えば、薬学的に許容される賦形剤と組み合わせることができる。ＩαＩｐを含有する薬学的組成物は、ヒトへの投与に適している。
ＩαＩｐを含有する薬学的組成物の例、は、例えば、ＵＳ２００７／０２９７９８２、ＵＳ２０１５／０２３８５７８、ＵＳ２０１９／０２６９７６５、及びＷＯ２０２０／０８６８７９に記載されており、これらは参照により本明細書に組み込まれる。
治療の方法
本明細書に記載の方法によって調製されたＩαＩｐは、様々な疾患、状態、又はその症状、例えば、炎症及び／若しくは低レベルのＩαＩｐによって特徴付けられる疾患又は状態を治療又は予防するために使用することができる（例えば、薬学的組成物として調製する場合など）。治療の方法及び本開示の薬学的組成物による治療に適した対象を特定する方法は、例えば、ＵＳ２００７／０２９７９８２、ＵＳ２０１５／０２３８５７８、ＵＳ２０１９／０２６９７６５、ＵＳ２０２０／００５７０７７、及びＷＯ２０２０／０８６８７９に見出すことができ、これらは参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書に記載の方法によって調製されたＩαＩｐは、様々な疾患、状態、又はその症状、例えば、炎症及び／若しくは低レベルのＩαＩｐによって特徴付けられる疾患又は状態を治療又は予防するために使用することができる（例えば、薬学的組成物として調製する場合など）。治療の方法及び本開示の薬学的組成物による治療に適した対象を特定する方法は、例えば、ＵＳ２００７／０２９７９８２、ＵＳ２０１５／０２３８５７８、ＵＳ２０１９／０２６９７６５、ＵＳ２０２０／００５７０７７、及びＷＯ２０２０／０８６８７９に見出すことができ、これらは参照により本明細書に組み込まれる。
キット
本明細書に記載の方法によって調製されたＩαＩｐは、ＩαＩｐ（例えば、ＩαＩ、ＰαＩ、重鎖（例えば、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、及び／若しくはＨ５）、軽鎖（例えば、ビクニン）、又はそれらの組み合わせ）を含有するキットの調製に使用できる。例えば、ＩαＩｐは、キットで分配するために、約０．５～約５００ｍｇ／ｍＬ（例えば、約１～５０ｍｇ／ｍＬ）の量でバイアルに入れることができる。例示的なキットは、例えば、ＵＳ２００７／０２９７９８２、ＵＳ２０１５／０２３８５７８、ＵＳ２０１９／０２６９７６５、及びＷＯ２０２０／０８６８７９に記載されているように調製することができ、これらの文献は参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書に記載の方法によって調製されたＩαＩｐは、ＩαＩｐ（例えば、ＩαＩ、ＰαＩ、重鎖（例えば、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、及び／若しくはＨ５）、軽鎖（例えば、ビクニン）、又はそれらの組み合わせ）を含有するキットの調製に使用できる。例えば、ＩαＩｐは、キットで分配するために、約０．５～約５００ｍｇ／ｍＬ（例えば、約１～５０ｍｇ／ｍＬ）の量でバイアルに入れることができる。例示的なキットは、例えば、ＵＳ２００７／０２９７９８２、ＵＳ２０１５／０２３８５７８、ＵＳ２０１９／０２６９７６５、及びＷＯ２０２０／０８６８７９に記載されているように調製することができ、これらの文献は参照により本明細書に組み込まれる。
以下の実施例は、本発明を説明することを意図しており、限定しない。
実施例１：ＥＴＯＸＩＣＬＥＡＲ（商標）を用いるクリオ貧血漿由来のＩαＩｐの精製
クリオ貧血漿の試料を希釈し（２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ＋２００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．２で１：３（ｖ／ｖ）希釈）、希釈したクリオ貧血漿（１１４．４ｍＬ）を市販の５ｍＬのＱ陰イオン交換樹脂（Ｔｏｓｏｈ ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（登録商標）ＧｉｇａＣａｐ Ｑ６５０Ｍ）に流速毎分３．５ｍＬに適用した。フロースルーを分析のために回収した。ＩαＩｐを含有していない（又は実質的な量を含有していない）フロースルーは廃棄された。追加の血漿希釈バッファー（１７２．７ｍＬ：２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ＋２００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．２）をカラムに適用し、出発物質がカラムを完全に通過するようにした。追加のフロースルーを分析のために回収し、ＩαＩｐを含有していない（又は実質的な量でない）ことを判断し、廃棄した。
クリオ貧血漿の試料を希釈し（２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ＋２００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．２で１：３（ｖ／ｖ）希釈）、希釈したクリオ貧血漿（１１４．４ｍＬ）を市販の５ｍＬのＱ陰イオン交換樹脂（Ｔｏｓｏｈ ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（登録商標）ＧｉｇａＣａｐ Ｑ６５０Ｍ）に流速毎分３．５ｍＬに適用した。フロースルーを分析のために回収した。ＩαＩｐを含有していない（又は実質的な量を含有していない）フロースルーは廃棄された。追加の血漿希釈バッファー（１７２．７ｍＬ：２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ＋２００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．２）をカラムに適用し、出発物質がカラムを完全に通過するようにした。追加のフロースルーを分析のために回収し、ＩαＩｐを含有していない（又は実質的な量でない）ことを判断し、廃棄した。
カラムを約８ＣＶの第１の洗浄バッファーで洗浄し（４３．５ｍＬ：２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ＋２５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．２）で洗浄し、得られた画分を回収した。合わせた画分を、総タンパク質（ビシンコニン酸アッセイ（ＢＣＡ））、ＩαＩｐ（ＭＡｂ ６９．２６－ヘパリン－ビオチンサンドイッチＥＬＩＳＡ）、トリプシン阻害活性について、表１に示すように分析した。合わせた洗浄画分は、少量の不純物ＩαＩｐ（純度０．１％、６１．７２７μｇ、ＩαＩｐの収率０．８７６１％（ｗ／ｗ））を含有したため、廃棄した。
ｐＨ７．２での洗浄後、カラムを更により低いｐＨの第２の洗浄バッファー（２３．７ｍＬ：５０ｍＭのＧｌｙ＋１００ｍＭのＡｃＯＨ＋１７５ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ５．２）で洗浄（約５ＣＶ）し、得られた画分を回収し、合わせ、表１に示すように分析した。合わせた洗浄画分は、少量の不純物ＩαＩｐ（純度０．４％、７２．８０６μｇ、ＩαＩｐの収率１．０３３９％（ｗ／ｗ））を含有したため、廃棄した。
ｐＨ５．２での洗浄後、結合したタンパク質を高塩溶出バッファー（１６．１ｍＬ：２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ＋７５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．２）で溶出した。画分を回収し、合わせ、表１に示すように分析した（例えば、総タンパク質、ＩαＩｐ、トリプシン阻害活性）。回収された画分は、濃縮されたＩαＩｐ（純度５６．４３％、ＩαＩｐの収率９８．５３７％（ｗ／ｗ））を含有した。
次に、高ｐＨ／高塩含量の洗浄バッファー（８．３ｍＬ：１ＭのＮａＯＨ＋２ＭのＮａＣｌ）をカラムに適用し、得られた画分を合わせて、表１に記載されているようにＩαＩｐについて分析した。合わせた画分は、ＩαＩｐを含有しない（又は実質的な量を含有しない）と判断され、廃棄された。
表１は、各工程（例えば、フロースルー、第１の洗浄、第２の洗浄、溶出、及び清澄化）で観察されたタンパク質の合わせた画分及び量の要約を提供する。更に、図１Ａ～図１Ｂは、Ｔｏｓｏｈ ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（登録商標）ＧｉｇａＣａｐ Ｑ６５０Ｍカラムから回収された各工程からの合わせた画分を含有するＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びウェスタンブロットをそれぞれ示す。精製の第１工程では、最初の血漿タンパク質の９８．６％を除去した。
次に、ＩαＩｐを含有するＱ陰イオン交換カラムからの溶出液（１６ｍＬ）を、ｄＨ２Ｏで希釈（１：３（ｖ／ｖ））して、６４．０ｍＬの容量とした。この画分を、エンドトキシン結合剤（ＥＴＯＸＩＣＬＥＡＲ（商標），Ａｓｔｒｅａ Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ）を含有する市販の３２ｍＬのカラムに毎分３．５ｍＬの流速で適用した。フロースルーを分析のために回収し、次いで、全くＩαＩｐが検出されなかった（又は実質的な量でない）ため、廃棄された。追加のバッファー容量（２６．７ｍＬ：２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ＋１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．２）をカラムに適用した。フロースルー総容量（９０．７ｍＬ）を分析のために回収し、次いで、ＩαＩｐを含まない（又は実質的な量でない）ことが検出されたため、廃棄した。
カラムを約１．５ＣＶの第１の洗浄バッファーで洗浄し（４７．０ｍＬ：７５ｍＭのＧｌｙ＋１００ｍＭのＡｃＯＨ＋１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ５．２）、得られた画分を回収した。画分を合わせ、総タンパク質（ビシンコニン酸アッセイ（ＢＣＡ））、ＩαＩｐ（６９．２６Ｍａｂ－ヘパリン－ビオチンサンドイッチＥＬＩＳＡ）、トリプシン阻害活性について、表２に示すように分析した。次いで、合わせた洗浄画分は、全くＩαＩｐが検出されなかった（又は実質的な量でない）ため、廃棄された。
カラムを更に、より高いｐＨを有する第２の洗浄バッファーで洗浄した（４７．５ｍＬ：２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ＋３００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．２）で洗浄し、得られた画分を回収し、合わせた。合わせた洗浄画分は、少量の不純物ＩαＩｐ（純度０．５３％、３９．０４５μｇ、Ｑ溶出液からのＩαＩｐの収率０．５６２４％（ｗ／ｗ））を含有したため、廃棄した。
その後、結合したタンパク質は、高塩溶出バッファー（３２．３ｍＬ：２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ＋５００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．２）を適用することにより、カラムから溶出した。得られた画分を回収し、合わせ、表２に示すように分析した。合わせた溶出画分は、高純度のＩαＩｐ（純度９９．９％以上、収率９９．５％（現段階）、２工程での総収率９８．０％）を含有すると判断した。
第２の溶出バッファー（２８．９ｍＬ：２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ＋１０００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．２）をカラムに適用し、エンドトキシン結合剤から任意の残音ＩαＩｐを除去した。この溶出液中、ＩαＩｐは追加で検出されなかった（又は実質的な量ではない）（表２参照）。
カラムは、清澄化バッファー（１８．２ｍＬ：１ＭのＮａＯＨ＋２ＭのＮａＣｌ）を適用することにより、カラムを清澄化した。フロースルー中、ＩαＩｐは追加で検出されなかった（又は実質的な量ではない）。
表２は、各工程（例えば、フロースルー、第１の洗浄、第２の洗浄、溶出、第２の溶出、及び清澄化）で観察されたタンパク質の合わせた画分及び量の要約を提供する。更に、図１Ａ～図１Ｂは、ＥＴＯＸＩＣＬＥＡＲ（商標）カラムから回収された各工程からの合わせた画分のＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びウェスタンブロットによる試験の結果を示す。
本実施例は、エンドトキシン結合剤を用いて、ＩαＩｐを選択的に結合させることができることを実証している。この結合特性を利用して、血液などの生物学的材料（クリオ貧血漿など）からＩαＩｐを精製することができる。
実施例２：ＤＥＴＯＸＩ－ＧＥＬ（商標）、ｐＨ７．３を用いるヒト血漿由来のＩαＩｐの精製
ヒト血漿試料（新鮮凍結血漿、２．５ｍＬ）を希釈し（１５ｍＭのリン酸塩、ｐＨ ７．３で１：３（ｖ／ｖ）希釈）、希釈した血漿（１０．０ｍＬ）をエンドトキシン結合剤（ＤＥＴＯＸＩ－ＧＥＬ（商標）、Ｐｉｅｒｃｅ）を含有する市販の４ｍＬカラムに２ｍＬ／分の流速で適用した。フロースルーを分析のために回収した。追加の希釈バッファー（５０．２ｍＬ：１５ｍＭのリン酸塩、ｐＨ７．３）をカラムに適用し、出発物質がカラムを完全に通過するようにした。追加のフロースルーを分析のために回収し（表３参照）、ＩαＩｐ（純度０．１５９％、１０８．２８１μｇ、ＩαＩｐの収率１４．８７％（ｗ／ｗ））を含有していると判断した。
ヒト血漿試料（新鮮凍結血漿、２．５ｍＬ）を希釈し（１５ｍＭのリン酸塩、ｐＨ ７．３で１：３（ｖ／ｖ）希釈）、希釈した血漿（１０．０ｍＬ）をエンドトキシン結合剤（ＤＥＴＯＸＩ－ＧＥＬ（商標）、Ｐｉｅｒｃｅ）を含有する市販の４ｍＬカラムに２ｍＬ／分の流速で適用した。フロースルーを分析のために回収した。追加の希釈バッファー（５０．２ｍＬ：１５ｍＭのリン酸塩、ｐＨ７．３）をカラムに適用し、出発物質がカラムを完全に通過するようにした。追加のフロースルーを分析のために回収し（表３参照）、ＩαＩｐ（純度０．１５９％、１０８．２８１μｇ、ＩαＩｐの収率１４．８７％（ｗ／ｗ））を含有していると判断した。
カラムを第１の洗浄バッファー（２４．６ｍＬ：１５ｍＭのリン酸塩＋５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．３）で洗浄し、画分を回収し、合わせ、総タンパク質（ＢＣＡアッセイ）及びＩαＩｐ（ＭＡｂ ６９．２６－ヘパリン－ビオチンサンドイッチＥＬＩＳＡ）について分析した。合わせた洗浄画分は、ＩαＩｐ（純度１．３９０％、１７９．１８６μｇ、ＩαＩｐの収率２４．６１％（ｗ／ｗ））を含有していると判断した。
５０ｍＭのＮａＣｌでの洗浄後、カラムを更に高濃度のＮａＣｌを有する第２の洗浄バッファー（１６．７ｍＬ：１５ｍＭのリン酸塩＋１００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．３）で洗浄し、得られた画分を回収し、合わせ、分析した（表３、洗浄２を参照）。合わせた画分は、前の洗浄工程よりも多量のＩαＩｐを含有すると判断した（純度４．９６９％、２３５．３５３μｇ、ＩαＩｐの収率３２．３３％（ｗ／ｗ））。
１００ｍＭのＮａＣｌでの第２の洗浄後、より高濃度のＮａＣｌを有する溶出バッファー（７．３ｍＬ：１５ｍＭのリン酸塩＋１，０００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．３）をエンドトキシン結合剤に適用した。得られた画分を回収し、合わせ、分析した（表３、洗浄３を参照）。合わせた画分は、前の第１又は第２の洗浄工程よりも少量のＩαＩｐを含有すると判断した（純度２．７６３％、４０．６３２μｇ、ＩαＩｐの収率５．５８％（ｗ／ｗ））。
カラムを高ｐＨのバッファー（６．７ｍＬ：１ＭのＮａＯＨ）で洗浄することにより更に清澄化し、得られた画分を回収し、合わせ、ＩαＩｐについて分析した（６５．２９２μｇ、ＩαＩｐの収率８．９７％（ｗ／ｗ））。
表３は、各工程（例えば、フロースルー、第１の洗浄、第２の洗浄、溶出、及び清澄化）で観察されたタンパク質の合わせた画分及び量の要約を提供する。更に、図２は、精製のクロマトグラムを提供する。
第２の洗浄工程で溶出したＩαＩｐは、収率３２．３３％、純度４．９６９％を有した（クロマトグラムについては、図２Ａを参照）。更に、ｐＨ７．３では、フロースルー及びすべての洗浄画分にＩαＩｐが検出された。ＤＥＴＯＸＩ－ＧＥＬ（商標）は、エンドトキシン結合剤としてポリミキシンＢ樹脂を採用したエンドトキシン結合剤である。この方法は最適化されていないが、次の実施例では、異なるｐＨで、ＤＥＴＯＸＩ－ＧＥＬ（商標）がＩαＩｐに親和性を向上させて結合することを実証している。更に、本実施例及びそれに続く実施例は、ＤＥＴＯＸＩ－ＧＥＬ（商標）及び他の類似のエンドトキシン結合剤が、予想外にも、ＩαＩｐを選択的に結合できることを実証している。
実施例３：ＤＥＴＯＸＩ－ＧＥＬ（商標）、ｐＨ５．５を用いるヒト血漿由来のＩαＩｐの精製
ヒト血漿試料（新鮮凍結血漿、２．５ｍＬ）を希釈し（１５ｍＭのリン酸塩、ｐＨ５．５で１：３（ｖ／ｖ）希釈）、希釈した血漿（１０．０ｍＬ）を４ｍＬのエンドトキシン結合剤カラム（ＤＥＴＯＸＩ－ＧＥＬ（商標）、Ｐｉｅｒｃｅ）に２ｍＬ／分の流速で適用した。フロースルーを分析のために回収し、次いで、廃棄した。追加の希釈バッファー（６３．６ｍＬ：１５ｍＭのリン酸塩、ｐＨ５．５）をカラムに適用し、出発物質がカラムを完全に通過するようにした。追加のフロースルーを分析のために回収し、全くＩαＩｐが検出されなかった（又は実質的な量でない）ため、廃棄された。
ヒト血漿試料（新鮮凍結血漿、２．５ｍＬ）を希釈し（１５ｍＭのリン酸塩、ｐＨ５．５で１：３（ｖ／ｖ）希釈）、希釈した血漿（１０．０ｍＬ）を４ｍＬのエンドトキシン結合剤カラム（ＤＥＴＯＸＩ－ＧＥＬ（商標）、Ｐｉｅｒｃｅ）に２ｍＬ／分の流速で適用した。フロースルーを分析のために回収し、次いで、廃棄した。追加の希釈バッファー（６３．６ｍＬ：１５ｍＭのリン酸塩、ｐＨ５．５）をカラムに適用し、出発物質がカラムを完全に通過するようにした。追加のフロースルーを分析のために回収し、全くＩαＩｐが検出されなかった（又は実質的な量でない）ため、廃棄された。
カラムを第１の洗浄バッファー（２６．４ｍＬ：１５ｍＭのリン酸塩＋５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ５．５）で洗浄し、得られた画分を回収し、合わせ、総タンパク質（ＢＣＡアッセイ）及びＩαＩｐ（ＭＡｂ ６９．２６－ヘパリン－ビオチンサンドイッチＥＬＩＳＡ）について分析した。合わせた画分は、全くＩαＩｐが検出されなかった（又は実質的な量でない）ため、廃棄された。
５０ｍＭのＮａＣｌでの第１の洗浄後、カラムを更に高濃度のＮａＣｌを有する第２の洗浄バッファー（２５．６ｍＬ：１５ｍＭのリン酸塩＋１００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ５．５）で洗浄し、得られた画分を回収し、合わせ、分析した（表４を参照）。合わせた洗浄画分は、ＩαＩｐ（純度３．６９１％、２８１．９５８μｇ、ＩαＩｐの収率３８．７３％（ｗ／ｗ））を含有していると判断した。
１００ｍＭのＮａＣｌでの第２の洗浄後、より高濃度のＮａＣｌを有する溶出バッファー（１４．５ｍＬ：１５ｍＭのリン酸塩＋１，０００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ５．５）をエンドトキシン結合剤に適用し、得られた画分を回収し、合わせ、ＩαＩｐについて分析した。合わせた溶出画分は、表４で示されるように、大部分のＩαＩｐ（純度２０．５７８％、５６６．９７９μｇ、ＩαＩｐの収率７７．８８％（ｗ／ｗ））を含有していると判断した。
カラムを高ｐＨのバッファー（６．８ｍＬ：１ＭのＮａＯＨ）で洗浄することにより更に清澄化し、得られた画分を回収し、合わせ、ＩαＩｐについて分析した。合わせた画分は、表４で示されるように、ＩαＩｐ（４３．２５５μｇ、ＩαＩｐの収率５．９４％（ｗ／ｗ））を含有していると判断した。
表４は、各工程（例えば、フロースルー、第１の洗浄、第２の洗浄、溶出、及び清澄化）で観察されたタンパク質の合わせた画分及び量の要約を提供する。更に、図３は、精製のクロマトグラムを提供する。
ＩαＩｐの大部分は第３の洗浄工程（１，０００ｍＭのＮａＣｌ）で溶出し、ＩαＩｐの回収率は７７．８８％、純度は２０．５７８％であった（クロマトグラムについては、図２Ｂを参照）。更に、ｐＨ５．５では、ＩαＩｐは、フロースルー中にも第１の洗浄画分にも検出されず、これは、ＤＥＴＯＸＩ－ＧＥＬ（商標）が、ＩαＩｐに選択的に結合することを実証している。本実施例により、エンドトキシン結合剤を用いて生物学的材料からＩαＩｐを精製できることが確認された。
実施例４：ＤＥＴＯＸＩ－ＧＥＬ（商標）、ｐＨ７．２を用いるヒト血漿由来のＩαＩｐの精製
濃縮ＩαＩｐ（約４０％ｗ／ｗ）を含有するＱ陰イオン交換カラム（新鮮凍結ヒト血漿由来）からの溶出液を、４ｍＬのエンドトキシン結合剤カラム（ＤＥＴＯＸＩ－ＧＥＬ（商標）、Ｐｉｅｒｃｅ）に２ｍＬ／分の流速で適用した（３０ｍＬ）。フロースルーは、ＩαＩｐについての分析（ＭＡｂ ６９．２６－ヘパリン－ビオチンサンドイッチＥＬＩＳＡ）のために回収され、ＩαＩｐが検出されなかったため、廃棄された。
濃縮ＩαＩｐ（約４０％ｗ／ｗ）を含有するＱ陰イオン交換カラム（新鮮凍結ヒト血漿由来）からの溶出液を、４ｍＬのエンドトキシン結合剤カラム（ＤＥＴＯＸＩ－ＧＥＬ（商標）、Ｐｉｅｒｃｅ）に２ｍＬ／分の流速で適用した（３０ｍＬ）。フロースルーは、ＩαＩｐについての分析（ＭＡｂ ６９．２６－ヘパリン－ビオチンサンドイッチＥＬＩＳＡ）のために回収され、ＩαＩｐが検出されなかったため、廃棄された。
カラムを第１の洗浄バッファー（１４．６ｍＬ：２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ＋１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．２）で洗浄し、得られた画分を回収し、合わせ、ＩαＩｐについて分析した。合わせた画分は、出発物質からのＩαＩｐの大部分を含有していると判断した（６５３．５９８２μｇ、ＩαＩｐの回収率７５．３％（ｗ／ｗ））。
１５０ｍＭのＮａＣｌでの洗浄後、カラムを更に高濃度のＮａＣｌを有する第２の洗浄バッファー（５．８ｍＬ：２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ＋２５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．２）で洗浄し、得られた画分を回収し、合わせ、分析した（表５、洗浄１を参照）。合わせた洗浄画分は、前の洗浄工程からのＩαＩｐをより少量含有すると判断した（（４４．１７２８μｇ、ＩαＩｐの回収率５．０９％（ｗ／ｗ））。
２５０ｍＭのＮａＣｌでの洗浄後、エンドトキシン結合剤を更に高濃度のＮａＣｌを含む溶出バッファー（６．８ｍＬ、２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ＋５００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．２）で洗浄した。得られた画分を回収し、合わせ、ＩαＩｐについて分析した。これらの合わせた画分は、第２の洗浄工程画分よりも多くのＩαＩｐを含有していた（１４３．７３１６μｇ、ＩαＩｐの回収率１６．５６％（ｗ／ｗ））。
カラムを更に、高濃度のＮａＣｌを含む別の溶出バッファー（３．７ｍＬ、２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ＋１，０００ｍＭのＮａＣｌ）で洗浄し、得られた画分を合わせてＩαＩｐについて分析した。これらの合わせた画分は、第１の溶出画分よりも少ないＩαＩｐを含有していた（４２．１４μｇ、ＩαＩｐの回収率４．８６％（ｗ／ｗ））。
表５は、各工程（例えば、フロースルー、第１の洗浄、第２の洗浄、第１の溶出、及び第２の溶出）で観察されたタンパク質の合わせた画分及び量の要約を提供する。更に、図４は、精製のクロマトグラムを提供する。
ＩαＩｐの大部分は、Ｑ溶出液から残りのタンパク質の大部分とともに、第１の洗浄工程で溶出した（ＩαＩｐの回収率は７５．３０％）。更に、もう一方の洗浄画分及び２つの溶出画分中にも、ＩαＩｐが検出された。
実施例５：ＥＴＯＸＩＣＬＥＡＲ（商標）を用いるクリオ貧血漿由来のＩαＩｐの精製
クリオ貧血漿の試料（１１．５ｍＬ）を、２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．２＋２００ｍＭのＮａＣｌ）で（１：４（ｖ／ｖ）に希釈し、希釈したクリオ貧血漿を、市販の５ｍＬのＱ陰イオン交換樹脂（Ｔｏｓｏｈ ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（登録商標）ＧｉｇａＣａｐ Ｑ６５０Ｍ）に流速毎分５ｍＬで適用した（１２０ｃｍ／時間）。フロースルーを分析のために回収した。ＩαＩｐを含有していない（又は実質的な量を含有していない）フロースルーは廃棄された。追加の血漿希釈バッファー（２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ７．２＋２００ｍＭのＮａＣｌ）をカラムに適用し、出発物質がカラムを完全に通過するようにした。追加のフロースルーを分析のために回収し、ＩαＩｐを含有していない（又は実質的な量でない）ことを判断し、廃棄した。
クリオ貧血漿の試料（１１．５ｍＬ）を、２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．２＋２００ｍＭのＮａＣｌ）で（１：４（ｖ／ｖ）に希釈し、希釈したクリオ貧血漿を、市販の５ｍＬのＱ陰イオン交換樹脂（Ｔｏｓｏｈ ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（登録商標）ＧｉｇａＣａｐ Ｑ６５０Ｍ）に流速毎分５ｍＬで適用した（１２０ｃｍ／時間）。フロースルーを分析のために回収した。ＩαＩｐを含有していない（又は実質的な量を含有していない）フロースルーは廃棄された。追加の血漿希釈バッファー（２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ７．２＋２００ｍＭのＮａＣｌ）をカラムに適用し、出発物質がカラムを完全に通過するようにした。追加のフロースルーを分析のために回収し、ＩαＩｐを含有していない（又は実質的な量でない）ことを判断し、廃棄した。
カラムを第１の洗浄バッファー（２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ７．２＋２５０ｍＭのＮａＣｌ）で洗浄し、得られた画分を回収した。合わせた画分を、総タンパク質（ビシンコニン酸アッセイ（ＢＣＡ））、ＩαＩｐ（ＭＡｂ ６９．２６－ヘパリン－ビオチンサンドイッチＥＬＩＳＡ）、トリプシン阻害活性について、表６に示すように分析した。合わせた洗浄画分は、少量の不純物ＩαＩｐを含有しており、廃棄された。
ｐＨ７．２での洗浄後、更により低いｐＨの第２の洗浄バッファー（５０ｍＭのＧｌｙ １００ｍＭのＡｃＯＨ １５０ｍＭのＮａＣｌ ｐＨ５．２）でカラムを洗浄し、得られた画分を回収し、合わせ、表６に示すように分析した。合わせた洗浄画分は、少量の不純物ＩαＩｐを含有しており、廃棄された。
ｐＨ５．２での洗浄後、結合したタンパク質を高塩溶出バッファー（２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ７．２＋７５０ｍＭのＮａＣｌ）で溶出した。画分を回収し、合わせ、表６に示すように分析した（例えば、総タンパク質、ＩαＩｐ、トリプシン阻害活性）。回収された画分は、濃縮されたＩαＩｐを含有した。
次に、高ｐＨ／高塩含量（１ＭのＮａＯＨ＋２ＭのＮａＣｌ）を伴う清澄化バッファーをカラムに適用し、得られた画分を合わせて、表６に記載されているようにＩαＩｐについて分析した。合わせた画分は、ＩαＩｐを含有しない（又は実質的な量を含有しない）と判断され、廃棄された。
表６は、各工程（例えば、フロースルー、第１の洗浄、第２の洗浄、溶出、及び清澄化）で観察されたタンパク質の合わせた画分及び量の要約を提供する。更に、図５Ａ～図５Ｂは、Ｔｏｓｏｈ ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（登録商標）ＧｉｇａＣａｐ Ｑ６５０Ｍカラムから回収された各工程からの合わせた画分を含有するＳＤＳ－Ｐａｇｅゲル及びウェスタンブロットをそれぞれ示す。
次に、ＩαＩｐを含有するＱ陰イオン交換カラムからの溶出液を、ｄＨ２Ｏで希釈（１：５（ｖ／ｖ））した。この画分を、エンドトキシン結合剤（ＥＴＯＸＩＣＬＥＡＲ（商標），Ａｓｔｒｅａ Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ）を含有する市販の８ｍＬのカラムに毎分３．５ｍＬの流速で適用した（１２０ｃｍ／時間）。フロースルーを分析のために回収し、次いで、全くＩαＩｐが検出されなかった（又は実質的な量でない）ため、廃棄された。フロースルーバッファー（２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ７．２＋２００ｍＭのＮａＣｌ）をカラムに適用した。フロースルーを分析のために回収し、次いで、廃棄された（全くＩαＩｐが検出されなかった（又は実質的な量でなかった））。
カラムを第１の洗浄バッファー（５０ｍＭのＧｌｙ １００ｍＭのＡｃＯＨ＋２００ｍＭのＮａＣｌ ｐＨ ５．２）で洗浄し、得られた画分を回収した。画分を合わせ、総タンパク質（ビシンコニン酸アッセイ（ＢＣＡ））、ＩαＩｐ（６９．２６Ｍａｂ－ヘパリン－ビオチンサンドイッチＥＬＩＳＡ）、トリプシン阻害活性について、表７に示すように分析した。次いで、合わせた洗浄画分は、廃棄された（全くＩαＩｐが検出されなかった（又は実質的な量でなかった））。
カラムを更に、より高いｐＨ（２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ７．２＋３００ｍＭのＮａＣｌ）を有する第２の洗浄バッファーで洗浄し、得られた画分を回収し、合わせた。合わせた洗浄画分は、少量の不純物ＩαＩｐを含有しており、廃棄された。
その後、結合したタンパク質は、第１の高塩溶出バッファー（２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ７．２＋４００ｍＭのＮａＣｌ）を適用することによりカラムから溶出された。その後、結合したタンパク質は、第２の高塩溶出バッファー（２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ７．２＋５００ｍＭのＮａＣｌ）を適用することによりカラムから溶出された。その後、結合したタンパク質は、第３の高塩溶出バッファー（２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ７．２＋１０００ｍＭのＮａＣｌ）を適用することにより溶出された。得られた画分を回収し、合わせ、表７に示すように分析した。
清澄化バッファー（１ＭのＮａＯＨ＋２ＭのＮａＣｌ）を適用することにより、カラムを清澄化した。フロースルー中、ＩαＩｐは追加で検出されなかった（又は実質的な量ではなかった）。
表７は、各工程（例えば、フロースルー、第１の洗浄、第２の洗浄、溶出、第２の溶出、及び清澄化）で観察されたタンパク質の合わせた画分及び量の要約を提供する。更に、図５Ａ～５Ｂは、ＥＴＯＸＩＣＬＥＡＲ（商標）カラムから回収された各工程からの合わせた画分のＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びウェスタンブロットによる試験の結果を示す。
実施例６：ＥＴＯＸＩＣＬＥＡＲ（商標）を用いるクリオ貧血漿由来のＩαＩｐの精製
クリオ貧血漿の試料（５０ｍＬ）を、２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．２＋２００ｍＭのＮａＣｌ）で（１：４（ｖ／ｖ）に希釈し、希釈したクリオ貧血漿を、市販の１００ｍＬのＱ陰イオン交換樹脂（Ｔｏｓｏｈ ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（登録商標）ＧｉｇａＣａｐ Ｑ６５０Ｍ）に流速毎分１２ｍＬで適用した（１２０ｃｍ／時間）。フロースルーを分析のために回収した。ＩαＩｐを含有していない（又は実質的な量を含有していない）フロースルーは廃棄された。追加の血漿希釈バッファー（２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ７．２＋２００ｍＭのＮａＣｌ）をカラムに適用し、出発物質がカラムを完全に通過するようにした。追加のフロースルーを分析のために回収し、ＩαＩｐを含有していない（又は実質的な量でない）ことを判断し、廃棄した。
クリオ貧血漿の試料（５０ｍＬ）を、２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．２＋２００ｍＭのＮａＣｌ）で（１：４（ｖ／ｖ）に希釈し、希釈したクリオ貧血漿を、市販の１００ｍＬのＱ陰イオン交換樹脂（Ｔｏｓｏｈ ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（登録商標）ＧｉｇａＣａｐ Ｑ６５０Ｍ）に流速毎分１２ｍＬで適用した（１２０ｃｍ／時間）。フロースルーを分析のために回収した。ＩαＩｐを含有していない（又は実質的な量を含有していない）フロースルーは廃棄された。追加の血漿希釈バッファー（２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ７．２＋２００ｍＭのＮａＣｌ）をカラムに適用し、出発物質がカラムを完全に通過するようにした。追加のフロースルーを分析のために回収し、ＩαＩｐを含有していない（又は実質的な量でない）ことを判断し、廃棄した。
カラムを第１の洗浄バッファー（２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ７．２＋２５０ｍＭのＮａＣｌ）で洗浄し、得られた画分を回収した。合わせた画分を、総タンパク質（ビシンコニン酸アッセイ（ＢＣＡ））、ＩαＩｐ（ＭＡｂ ６９．２６－ヘパリン－ビオチンサンドイッチＥＬＩＳＡ）、トリプシン阻害活性について、表８に示すように分析した。合わせた洗浄画分は、少量の不純物ＩαＩｐを含有しており、廃棄された。
ｐＨ７．２での洗浄後、更により低いｐＨの第２の洗浄バッファー（５０ｍＭのＧｌｙ １００ｍＭのＡｃＯＨ １５０ｍＭのＮａＣｌ ｐＨ５．２）でカラムを洗浄し、得られた画分を回収し、合わせ、表８に示すように分析した。合わせた洗浄画分は、少量の不純物ＩαＩｐを含有しており、廃棄された。
ｐＨ５．２での洗浄後、結合したタンパク質を高塩溶出バッファー（２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ７．２＋７５０ｍＭのＮａＣｌ）で溶出した。画分を回収し、合わせ、表８に示すように分析した（例えば、総タンパク質、ＩαＩｐ、トリプシン阻害活性）。回収された画分は、濃縮されたＩαＩｐを含有した。
次に、高ｐＨ／高塩含量（１ＭのＮａＯＨ＋２ＭのＮａＣｌ）を伴う清澄化バッファーをカラムに適用し、得られた画分を合わせて、表８に記載されているようにＩαＩｐについて分析した。合わせた画分は、ＩαＩｐを含有しない（又は実質的な量を含有しない）と判断され、廃棄された。
表８は、各工程（例えば、フロースルー、第１の洗浄、第２の洗浄、溶出、及び清澄化）で観察されたタンパク質の合わせた画分及び量の要約を提供する。更に、図６Ａ～図６Ｂは、Ｔｏｓｏｈ ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（登録商標）ＧｉｇａＣａｐ Ｑ６５０Ｍカラムから回収された各工程からの合わせた画分を含有するＳＤＳ－Ｐａｇｅゲル及びウェスタンブロットをそれぞれ示す。
次に、ＩαＩｐを含有するＱ陰イオン交換カラムからの溶出液を、ｄＨ２Ｏで希釈（１：５（ｖ／ｖ））し、１２５ｍＬとした。この画分を、エンドトキシン結合剤（ＥＴＯＸＩＣＬＥＡＲ（商標），Ａｓｔｒｅａ Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ）を含有する市販の７４ｍＬのカラムに毎分３．５ｍＬの流速で適用した（１２０ｃｍ／時間）。フロースルーを分析のために回収し、次いで、全くＩαＩｐが検出されなかった（又は実質的な量でない）ため、廃棄された。フロースルーバッファー（２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ７．２＋２００ｍＭのＮａＣｌ）をカラムに適用した。フロースルーを分析のために回収し、次いで、廃棄された（全くＩαＩｐが検出されなかった（又は実質的な量でなかった））。
カラムを第１の洗浄バッファー（５０ｍＭのＧｌｙ １００ｍＭのＡｃＯＨ＋２００ｍＭのＮａＣｌ ｐＨ ５．２）で洗浄し、得られた画分を回収した。画分を合わせ、総タンパク質（ビシンコニン酸アッセイ（ＢＣＡ））、ＩαＩｐ（６９．２６Ｍａｂ－ヘパリン－ビオチンサンドイッチＥＬＩＳＡ）、トリプシン阻害活性について、表９に示すように分析した。次いで、合わせた洗浄画分は、廃棄された（全くＩαＩｐが検出されなかった（又は実質的な量でなかった））。
カラムを更に、より高いｐＨ（２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ７．２＋３００ｍＭのＮａＣｌ）を有する第２の洗浄バッファーで洗浄し、得られた画分を回収し、合わせた。合わせた洗浄画分は、少量の不純物ＩαＩｐを含有しており、廃棄された。
その後、結合したタンパク質は、第１の高塩溶出バッファー（２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ７．２＋５００ｍＭのＮａＣｌ）を適用することによりカラムから溶出された。その後、結合したタンパク質は、第２の高塩溶出バッファー（２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ７．２＋１０００ｍＭのＮａＣｌ）を適用することによりカラムから溶出された。得られた画分を回収し、合わせ、表９に示すように分析した。
清澄化バッファー（１ＭのＮａＯＨ＋２ＭのＮａＣｌ）を適用することにより、カラムを清澄化した。フロースルー中、ＩαＩｐは追加で検出されなかった（又は実質的な量ではなかった）。
表９は、各工程（例えば、フロースルー、第１の洗浄、第２の洗浄、溶出、第２の溶出、及び清澄化）で観察されたタンパク質の合わせた画分及び量の要約を提供する。更に、図６Ａ～図６Ｂは、ＥＴＯＸＩＣＬＥＡＲ（商標）カラムから回収された各工程からの合わせた画分のＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びウェスタンブロットによる試験の結果を示す。
実施例７：同時に精製された不純物の分析：第ＩＩ因子（プロトロンビン）
実施例５～６でＩαＩｐと同時に精製された第ＩＩ因子（プロトロンビン）をＥＬＩＳＡで分析した（表１０）。サンドイッチＥＬＩＳＡは、９６ウェルプレート（ＮＵＮＣ Ｉｍｍｕｎｏ ＭＡＸＩＳＯＲＰ Ｆ９６）中で、ペルオキシダーゼ標識検出抗体を用いるペアの市販ポリクローナル抗体を用いて実施し、４５０ｎｍの相対吸光度シグナルで反応を検出した。ＥＬＩＳＡプレートを、ポリクローナルヒツジ抗ヒトプロトロンビン（コートバッファー中、１：１０００）で一晩コートし、洗浄バッファーで３回洗浄し、洗浄バッファー（ブロックバッファー）中で０．１％のＭｉｌｃｈ、２ｍｍｏｌ／Ｌのベンザミジンでブロッキングし、洗浄バッファーで洗浄した。試験材料及び標準検量線試料（いずれもブロックバッファーを用いて選択した希釈範囲である）を、ＥＬＩＳＡコートプレート上で１時間、室温でインキュベートした。標準検量線は、典型的には、市販の基準血漿調製物（ＣＲＹＯｃｈｅｃｋ、ＰｒｅｃｉｓｉｏｎＢｉｏＬｏｇｉｃ）を用いて５点検量線を作成し、ＦＩＩ活性が認証された二次国際標準ＩＳＴＨ／ＳＳＣに対して定期的にチェックした。
実施例５～６でＩαＩｐと同時に精製された第ＩＩ因子（プロトロンビン）をＥＬＩＳＡで分析した（表１０）。サンドイッチＥＬＩＳＡは、９６ウェルプレート（ＮＵＮＣ Ｉｍｍｕｎｏ ＭＡＸＩＳＯＲＰ Ｆ９６）中で、ペルオキシダーゼ標識検出抗体を用いるペアの市販ポリクローナル抗体を用いて実施し、４５０ｎｍの相対吸光度シグナルで反応を検出した。ＥＬＩＳＡプレートを、ポリクローナルヒツジ抗ヒトプロトロンビン（コートバッファー中、１：１０００）で一晩コートし、洗浄バッファーで３回洗浄し、洗浄バッファー（ブロックバッファー）中で０．１％のＭｉｌｃｈ、２ｍｍｏｌ／Ｌのベンザミジンでブロッキングし、洗浄バッファーで洗浄した。試験材料及び標準検量線試料（いずれもブロックバッファーを用いて選択した希釈範囲である）を、ＥＬＩＳＡコートプレート上で１時間、室温でインキュベートした。標準検量線は、典型的には、市販の基準血漿調製物（ＣＲＹＯｃｈｅｃｋ、ＰｒｅｃｉｓｉｏｎＢｉｏＬｏｇｉｃ）を用いて５点検量線を作成し、ＦＩＩ活性が認証された二次国際標準ＩＳＴＨ／ＳＳＣに対して定期的にチェックした。
インキュベートしたＥＬＩＳＡプレートを３回洗浄し、ヒツジ抗ヒトプロトロンビンペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識の検出抗体とともに室温で１時間インキュベートした。洗浄バッファーで３回洗浄し、ＴＭＢ試薬（３，３’，５，５’テトラメチルベンジジン二塩酸塩）によりＨＲＰ発色反応を起こし、４５０ｎｍでの発色検出シグナルによりプロトロンビンレベルを測定した。
他の実施形態
上記明細書に記載されたすべての刊行物、特許及び特許出願は、個々の各刊行物、特許、又は特許出願が、その全体が参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示されている場合と同じ程度に、参照により本明細書に組み込まれる。記載された本発明の方法、薬学的組成物、及びキットの種々の修飾及び変形は、本発明の範囲及び精神から逸脱することなく、当業者には明らかであろう。本発明は、具体的な実施形態と組み合わせて記載されてきたが、更なる変形が可能であること、及び特許請求の範囲の発明が、かかる具体的な実施形態に不当に限定されるべきではないことが理解されるべきである。実際に、当業者にとって自明な本発明を実施するために記載された態様の種々の修飾は、本発明の範囲内であることが意図される。本出願は、一般的に、本発明の原理に従った本発明の任意の変形、使用、又は適応を包含し、本開示からのこのような逸脱は、本発明が属する技術分野における既知の慣行内にあり、本明細書で前に示した本質的特徴に適用できるものを含むことを意図している。
上記明細書に記載されたすべての刊行物、特許及び特許出願は、個々の各刊行物、特許、又は特許出願が、その全体が参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示されている場合と同じ程度に、参照により本明細書に組み込まれる。記載された本発明の方法、薬学的組成物、及びキットの種々の修飾及び変形は、本発明の範囲及び精神から逸脱することなく、当業者には明らかであろう。本発明は、具体的な実施形態と組み合わせて記載されてきたが、更なる変形が可能であること、及び特許請求の範囲の発明が、かかる具体的な実施形態に不当に限定されるべきではないことが理解されるべきである。実際に、当業者にとって自明な本発明を実施するために記載された態様の種々の修飾は、本発明の範囲内であることが意図される。本出願は、一般的に、本発明の原理に従った本発明の任意の変形、使用、又は適応を包含し、本開示からのこのような逸脱は、本発明が属する技術分野における既知の慣行内にあり、本明細書で前に示した本質的特徴に適用できるものを含むことを意図している。
Claims (149)
- 生物学的材料からインターアルファインヒビタータンパク質（ＩαＩｐ）を精製する方法であって、
（ａ）前記ＩαＩｐを含む前記生物学的材料をエンドトキシン結合剤に適用し、前記エンドトキシン結合剤に結合しない前記生物学的材料を含むフロースルーを分離することと、
（ｂ）塩を含む溶出バッファーを前記エンドトキシン結合剤に適用し、前記ＩαＩｐを含む溶出液を回収することと、を含む、方法。 - 前記エンドトキシン結合剤が、支持体に固定されている、請求項１に記載の方法。
- 前記支持体が、モノリシック支持体又は粒子ベースの支持体である、請求項２に記載の方法。
- 前記モノリシック支持体又は粒子ベースの支持体が、樹脂であるか、又は樹脂を含む、請求項３に記載の方法。
- 前記支持体が、カラム、メンブレン、ディスク、又はチップを含む、請求項２～４のいずれか一項に記載の方法。
- 前記エンドトキシン結合剤が、ＥＴＯＸＩＣＬＥＡＲ（商標）、ＰＩＥＲＣＥ（商標）高容量エンドトキシン除去樹脂、ＴＯＸＩＮＥＲＡＳＥＲ（商標）エンドトキシン除去樹脂、ＰＵＲＫＩＮＥ（商標）エンドトキシン除去樹脂、ＤＥＴＯＸＩ－ＧＥＬ（商標）エンドトキシン除去ゲル、及びＰＲＯＭＥＧＡ（商標）エンドトキシン除去樹脂からなる群から選択される、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
- 前記エンドトキシン結合剤が、ＤＥＴＯＸＩ－ＧＥＬ（商標）又はＥＴＯＸＩＣＬＥＡＲ（商標）である、請求項６に記載の方法。
- 前記生物学的材料が、アルファ－１アンチトリプシン、Ｃ１インヒビター、アルブミン、グロブリン、フィブリノーゲン（第Ｉ因子）、プロトロンビン（第ＩＩ因子）、トロンビン、アンチトロンビンＩＩＩ、第ＩＩＩ因子、第Ｖ因子、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第ＸＩ因子、第ＸＩＩ因子、第ＸＩＩＩ因子、フィブロネクチン、アルファ－２アンチプラスミン、ウロキナーゼ、プロテインＣ、プロテインＳ、プロテインＺ、プロテインＺ関連プロテアーゼインヒビター、プラスミノーゲン、組織プラスミノーゲンアクチベーター、プラスミノーゲンアクチベーターインヒビター１、プラスミノーゲンアクチベーターインヒビター２、フォンビルブランド因子、Ｈ因子、プレカリクレイン、高分子キノーゲン、及びヘパリンコファクターＩＩからなる群から選択される３つ以上のタンパク質を更に含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
- 前記グロブリンが、免疫グロブリン（Ｉｇ）である、請求項８に記載の方法。
- 前記免疫グロブリンが、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、及びＩｇＧからなる群から選択される、請求項９に記載の方法。
- 前記ＩｇＧが、静脈内Ｉｇ（ＩＶＩｇ）、抗Ｄ ＩｇＧ、Ｂ型肝炎ＩｇＧ、麻疹ＩｇＧ、狂犬病ＩｇＧ、破傷風ＩｇＧ、及び水痘帯状疱疹ＩｇＧからなる群から選択される、請求項１０に記載の方法。
- 前記生物学的材料が、３～１０、３～１５、３～２０、３～２５、３～３０、１０～２０、１０～２５、１０～３０、１５～２５、１５～３０、２０～３０、又は３０以上の異なるタンパク質を含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
- 前記生物学的材料が、約４０～約６５％（ｗ／ｗ）のアルブミンを含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
- 前記生物学的材料が、約２５～約４５％（ｗ／ｗ）のグロブリンを含む、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。
- 前記生物学的材料が、約２～約１２％（ｗ／ｗ）のフィブリノーゲンを含む、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。
- 工程（ａ）の後、かつ工程（ｂ）の前に、前記エンドトキシン結合剤に第１の洗浄バッファーを適用することを更に含む、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第１の洗浄バッファーを含むフロースルーを分離することを更に含む、請求項１６に記載の方法。
- 前記第１の洗浄バッファーが、約４．５～８．５のｐＨを有する、請求項１６又は１７に記載の方法。
- 前記第１の洗浄バッファーが、約５．２のｐＨを有する、請求項１８に記載の方法。
- 前記第１の洗浄バッファーが、グリシン、酢酸、クエン酸、リン酸塩、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、カルシウム、マグネシウム、ＥＤＴＡ、及びＴｒｉｓ－ＨＣｌのうちの１つ以上を含む、請求項１６～１９のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第１の洗浄バッファーが、約１０～約２００ｍＭのグリシン及び／又は約２０～約３００ｍＭの酢酸を含む、請求項１６～２０のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第１の洗浄バッファーが、約７５ｍＭのグリシン及び約１００ｍＭの酢酸を含む、請求項２１に記載の方法。
- 前記第１の洗浄バッファーが、約２００ｍＭ以下のＮａＣｌを含む、請求項１６～２２のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第１の洗浄バッファーが、約５０～約１５０ｍＭのＮａＣｌを含む、請求項２３に記載の方法。
- 前記第１の洗浄バッファーが、約５０ｍＭのＮａＣｌ又は約１００ｍＭのＮａＣｌを含む、請求項２４に記載の方法。
- 前記第１の洗浄バッファーを適用した後、前記エンドトキシン結合剤に第２の洗浄バッファーを適用することを更に含む、請求項１６～２５のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第２の洗浄バッファーを含むフロースルーを分離することを更に含む、請求項２６に記載の方法。
- 前記第２の洗浄バッファーが、約４．５～約８．５のｐＨを有する、請求項２６又は２７に記載の方法。
- 前記第２の洗浄バッファーが、約７．２のｐＨを有する、請求項２８に記載の方法。
- 前記第２の洗浄バッファーが、グリシン、酢酸、クエン酸、リン酸塩、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、カルシウム、マグネシウム、ＥＤＴＡ、及びＴｒｉｓ－ＨＣｌのうちの１つ以上を含む、請求項２６～２９のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第２の洗浄バッファーが、約５～約１００ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌを含む、請求項２６～３０のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第２の洗浄バッファーが、約２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌを含む、請求項３１に記載の方法。
- 前記第２の洗浄バッファーが、約５００ｍＭ以下のＮａＣｌを含む、請求項２６～３２のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第２の洗浄バッファーが、約１００～約５００ｍＭのＮａＣｌを含む、請求項３３に記載の方法。
- 前記第２の洗浄バッファーが、約３００ｍＭのＮａＣｌを含む、請求項３４に記載の方法。
- 前記溶出バッファーが、約４．５～約８．５のｐＨを有する、請求項１～３５のいずれか一項に記載の方法。
- 前記溶出バッファーが、約７．２のｐＨを有する、請求項３６に記載の方法。
- 前記溶出バッファーが、グリシン、酢酸、クエン酸、リン酸塩、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、カルシウム、マグネシウム、ＥＤＴＡ、及びＴｒｉｓ－ＨＣｌのうちの１つ以上を含む、請求項１～３７のいずれか一項に記載の方法。
- 前記溶出バッファーが、約５～１００ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌを含む、請求項１～３８のいずれか一項に記載の方法。
- 前記溶出バッファーが、約２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌを含む、請求項３９に記載の方法。
- 前記溶出バッファーが、約１，０００ｍＭ以下のＮａＣｌを含む、請求項１～４０のいずれか一項に記載の方法。
- 前記溶出バッファーが、約５００～約１０００ｍＭのＮａＣｌを含む、請求項１～４１のいずれか一項に記載の方法。
- 前記溶出バッファーが、約５００ｍＭのＮａＣｌ又は約１，０００ｍＭのＮａＣｌを含む、請求項４１又は４２に記載の方法。
- 工程（ａ）の前に、前記生物学的材料に希釈バッファーを適用することを更に含む、請求項１～４３のいずれか一項に記載の方法。
- 前記希釈バッファーが、脱イオン水を含む、請求項４４に記載の方法。
- 前記希釈バッファーが、約４．５～約８．５のｐＨを有する、請求項４４又は４５に記載の方法。
- 前記希釈バッファーが、約５．５、約７．２、又は７．３のｐＨを有する、請求項４６に記載の方法。
- 前記生物学的材料が、前記希釈バッファーで１：１～１：１０（ｖ／ｖ）に希釈される、請求項４４～４７のいずれか一項に記載の方法。
- 前記希釈バッファーが、グリシン、酢酸、クエン酸、リン酸塩、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、カルシウム、マグネシウム、ＥＤＴＡ、及びＴｒｉｓ－ＨＣｌのうちの１つ以上を含む、請求項４４～４８のいずれか一項に記載の方法。
- 前記希釈バッファーが、約５～約１００ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌを含む、請求項４４～４９のいずれか一項に記載の方法。
- 前記希釈バッファーが、約２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌを含む、請求項５０に記載の方法。
- 前記希釈バッファーが、約５０ｍＭ以下のＮａＣｌを含む、請求項４４～５１のいずれか一項に記載の方法。
- 前記希釈バッファーが、塩を含まないか、又は約５０ｍＭのＮａＣｌを含む、請求項５２に記載の方法。
- 前記希釈バッファーが、約５～約１００ｍＭのリン酸塩を含む、請求項４４～５３のいずれか一項に記載の方法。
- 前記希釈バッファーが、約１５ｍＭのリン酸塩を含む、請求項５４に記載の方法。
- 前記フロースルー中の前記ＩαＩｐの量を検出することを更に含む、請求項１～５５のいずれか一項に記載の方法。
- 前記フロースルーを破棄することを含む、請求項５６に記載の方法。
- 前記溶出液中のＩαＩｐの量を検出することを更に含む、請求項１～５７のいずれか一項に記載の方法。
- 約１～１０ｍＬ／分の流速を含む、請求項１～５８のいずれか一項に記載の方法。
- 工程（ａ）の前に、前記生物学的材料をクロマトグラフィー支持体に適用することを含む、請求項１～５８のいずれか一項に記載の方法。
- 前記クロマトグラフィー支持体が、陰イオン交換クロマトグラフィー支持体、サイズ排除クロマトグラフィー支持体、イオン交換クロマトグラフィー支持体、アフィニティークロマトグラフィー支持体、又はそれらの組み合わせを含む、請求項６０に記載の方法。
- 前記クロマトグラフィー支持体が、前記陰イオン交換クロマトグラフィー支持体である、請求項６１に記載の方法。
- （ｉ）前記生物学的材料を前記クロマトグラフィー支持体に適用し、前記クロマトグラフィー支持体に結合しない前記生物学的材料を含む工程（ｉ）のフロースルーを分離することと、
（ｉｉ）塩を含む溶出バッファーを前記クロマトグラフィー支持体に適用し、前記ＩαＩｐを含む第１の溶出液を回収することと、を更に含む、請求項６０～６２のいずれか一項に記載の方法。 - 前記クロマトグラフィー支持体が、モノリシック支持体又は粒子ベースの支持体である、請求項６３に記載の方法。
- 前記モノリシック支持体又は粒子ベースの支持体が、固定された陰イオン交換樹脂を含む、請求項６４に記載の方法。
- 前記固定された陰イオン交換樹脂が、ジエチルアミノエタン（ＤＥＡＥ）樹脂又は四級アミン（Ｑ）樹脂である、請求項６５に記載の方法。
- 前記クロマトグラフィー支持体が、カラム、メンブレン、ディスク、又はチップを含む、請求項６０～６６のいずれか一項に記載の方法。
- 工程（ｉ）の後、かつ工程（ｉｉ）の前に、前記クロマトグラフィー支持体に第１の洗浄バッファーを適用することを更に含む、請求項６０～６７のいずれか一項に記載の方法。
- 工程（ｉｉ）の前に、前記第１の洗浄バッファーを含むフロースルーを分離することを更に含む、請求項６８に記載の方法。
- 前記クロマトグラフィー支持体に適用された前記第１の洗浄バッファーが、約４．５～約８．５のｐＨを有する、請求項６８又は６９に記載の方法。
- 前記クロマトグラフィー支持体に適用された前記第１の洗浄バッファーが、約７．２のｐＨを有する、請求項７０に記載の方法。
- 前記クロマトグラフィー支持体に適用された前記第１の洗浄バッファーが、グリシン、酢酸、クエン酸、リン酸塩、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、カルシウム、マグネシウム、ＥＤＴＡ、及びＴｒｉｓ－ＨＣｌのうちの１つ以上を含む、請求項６８～７１のいずれか一項に記載の方法。
- 前記クロマトグラフィー支持体に適用された前記第１の洗浄バッファーが、約５～約１００ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌを含む、請求項６８～７２のいずれか一項に記載の方法。
- 前記クロマトグラフィー支持体に適用された前記第１の洗浄バッファーが、約２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌを含む、請求項７３に記載の方法。
- 前記クロマトグラフィー支持体に適用された前記第１の洗浄バッファーが、約４００ｍＭ以下のＮａＣｌを含む、請求項６８～７４のいずれか一項に記載の方法。
- 前記クロマトグラフィー支持体に適用された前記第１の洗浄バッファーが、約５０～約２５０ｍＭのＮａＣｌを含む、請求項７５に記載の方法。
- 前記クロマトグラフィー支持体に適用された前記第１の洗浄バッファーが、約２５０ｍＭの ＮａＣｌを含む、請求項７６に記載の方法。
- 前記第１の洗浄バッファーを適用した後、前記クロマトグラフィー支持体に第２の洗浄バッファーを適用することを更に含む、請求項６８～７７のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第２の洗浄バッファーを含むフロースルーを分離することを更に含む、請求項７８に記載の方法。
- 前記クロマトグラフィー支持体に適用された前記第２の洗浄バッファーが、約４．５～約８．５のｐＨを有する、請求項７８又は７９に記載の方法。
- 前記クロマトグラフィー支持体に適用された前記第２の洗浄バッファーが、約５．２のｐＨを有する、請求項８０に記載の方法。
- 前記クロマトグラフィー支持体に適用された前記第２の洗浄バッファーが、グリシン、酢酸、クエン酸、リン酸塩、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、カルシウム、マグネシウム、ＥＤＴＡ、及びＴｒｉｓ－ＨＣｌのうちの１つ以上を含む、請求項７８～８１のいずれか一項に記載の方法。
- 前記クロマトグラフィー支持体に適用された前記第２の洗浄バッファーが、約１０～約２００ｍＭのグリシン及び／又は約２０～約３００ｍＭの酢酸を含む、請求項７８～８２のいずれか一項に記載の方法。
- 前記クロマトグラフィー支持体に適用された前記第２の洗浄バッファーが、約５０ｍＭのグリシン及び約１００ｍＭの酢酸を含む、請求項８３に記載の方法。
- 前記クロマトグラフィー支持体に適用された前記第２の洗浄バッファーが、約１００～約５００ｍＭのＮａＣｌを含む、請求項７８～８４のいずれか一項に記載の方法。
- 前記クロマトグラフィー支持体に適用された前記第２の洗浄バッファーが、約１７５ｍＭのＮａＣｌを含む、請求項８５に記載の方法。
- 前記クロマトグラフィー支持体に適用された前記溶出バッファーが、約４．５～約８．５のｐＨを有する、請求項６３～８６のいずれか一項に記載の方法。
- 前記クロマトグラフィー支持体に適用された前記溶出バッファーが、約７．２のｐＨを有する、請求項８７に記載の方法。
- 前記クロマトグラフィー支持体に適用された前記溶出バッファーが、グリシン、酢酸、クエン酸、リン酸塩、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、カルシウム、マグネシウム、ＥＤＴＡ、及びＴｒｉｓ－ＨＣｌのうちの１つ以上を含む、請求項６３～８８のいずれか一項に記載の方法。
- 前記クロマトグラフィー支持体に適用された前記溶出バッファーが、約５～約１００ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌを含む、請求項６３～８９のいずれか一項に記載の方法。
- 前記クロマトグラフィー支持体に適用された前記溶出バッファーが、約２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌを含む、請求項９０に記載の方法。
- 前記クロマトグラフィー支持体に適用された前記溶出バッファーが、約１０００ｍＭ以下のＮａＣｌを含む、請求項６３～９１のいずれか一項に記載の方法。
- 前記クロマトグラフィー支持体に適用された前記溶出バッファーが、約７５０ｍＭのＮａＣｌを含む、請求項９２に記載の方法。
- 工程（ｉ）の前に、前記生物学的材料に希釈バッファーを適用することを更に含む、請求項６３～９３のいずれか一項に記載の方法。
- 前記希釈バッファーが、脱イオン水を含む、請求項９４に記載の方法。
- 前記希釈バッファーが、約４．５～約８．５のｐＨを有する、請求項９４又は９５に記載の方法。
- 前記希釈バッファーが、約７．２のｐＨを有する、請求項９６に記載の方法。
- 前記生物学的材料が、前記希釈バッファーで１：１～１：１０（ｖ／ｖ）に希釈される、請求項９４～９７のいずれか一項に記載の方法。
- 前記希釈バッファーが、グリシン、酢酸、クエン酸、リン酸塩、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、カルシウム、マグネシウム、ＥＤＴＡ、及びＴｒｉｓ－ＨＣｌのうちの１つ以上を含む、請求項９４～９８のいずれか一項に記載の方法。
- 前記希釈バッファーが、約５～約１００ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌを含む、請求項９４～９９のいずれか一項に記載の方法。
- 前記希釈バッファーが、約２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌを含む、請求項１００に記載の方法。
- 前記希釈バッファーが、約３００ｍＭ以下のＮａＣｌを含む、請求項９４～１０１のいずれか一項に記載の方法。
- 前記希釈バッファーが、塩を含まないか、又は約２００ｍＭのＮａＣｌを含む、請求項１０２に記載の方法。
- 工程（ｉ）の前記フロースルー中のＩαＩｐの量を検出することを更に含む、請求項６３～１０３のいずれか一項に記載の方法。
- 工程（ｉ）の前記フロースルーを破棄することを含む、請求項１０４に記載の方法。
- 工程（ｉｉ）の前記溶出液中のＩαＩｐの量を検出することを更に含む、請求項６３～１０５のいずれか一項に記載の方法。
- 約１～１０ｍＬ／分の流速を含む、請求項６３～１０６のいずれか一項に記載の方法。
- 工程（ｂ）の前記溶出液中に回収された前記ＩαＩｐが、前記生物学的材料中の前記ＩαＩｐの純度に対して約５重量％～９９重量％以上の純度を有する、請求項１～１０７のいずれか一項に記載の方法。
- 工程（ｂ）で回収された前記溶出液中のＩαＩｐの収率が、前記生物学的材料中に存在する前記ＩαＩｐに対して約２０％（ｗ／ｗ）よりも大きい、請求項１～１０８のいずれか一項に記載の方法。
- 前記収率が、前記生物学的材料中に存在する前記ＩαＩｐに対して約３５％～約９０％（ｗ／ｗ）以上である、請求項１０９に記載の方法。
- 前記ＩαＩｐの収率が、前記生物学的材料中に存在する前記ＩαＩｐに対して約９５％（ｗ／ｗ）以上である、請求項１１０に記載の方法。
- 前記生物学的材料からの前記ＩαＩｐの収率が、少なくとも約５μｇ／ｍｌである、請求項１０９～１１１のいずれか一項に記載の方法。
- 前記生物学的材料からの前記ＩαＩｐの収率が、少なくとも約５０μｇ／ｍｌである、請求項１１２に記載の方法。
- 前記生物学的材料からの前記ＩαＩｐの収率が、少なくとも約１００μｇ／ｍｌである、請求項１１３に記載の方法。
- 前記生物学的材料からの前記ＩαＩｐの収率が、少なくとも約３００μｇ／ｍｌである、請求項１１４に記載の方法。
- 前記生物学的材料からの前記ＩαＩｐの収率が、少なくとも約６００μｇ／ｍｌである、請求項１１５に記載の方法。
- 前記生物学的材料からの前記ＩαＩｐの収率が、少なくとも約９００μｇ／ｍｌである、請求項１１６に記載の方法。
- 前記ＩαＩｐの前記純度が、少なくとも約５％（ｗ／ｗ）である、請求項１０８～１１７のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ＩαＩｐの前記純度が、少なくとも約２５％（ｗ／ｗ）である、請求項１１８に記載の方法。
- 前記ＩαＩｐの前記純度が、少なくとも約５０％（ｗ／ｗ）である、請求項１１９に記載の方法。
- 前記ＩαＩｐの前記純度が、少なくとも約７５％（ｗ／ｗ）である、請求項１２０に記載の方法。
- 前記ＩαＩｐが、インターアルファインヒビター（ＩαＩ）、プレアルファインヒビター（ＰαＩ）、及びビクニンのうちの２つ以上を含む、請求項１～１２１のいずれか一項に記載の方法。
- 前記生物学的材料中に存在する前記ＩαＩｐが、６０％～８０％（ｗ／ｗ）のＩαＩｐ及び／若しくは２０％～４０％（ｗ／ｗ）のＰαＩを含み、かつ／又は工程（ｂ）の前記溶出液中に存在する前記ＩαＩｐが、６０％～８０％（ｗ／ｗ）のＩαＩｐ及び／若しくは２０％～４０％（ｗ／ｗ）のＰαＩを含む、請求項１～１２２のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ＩαＩｐが、約６０～約２８０ｋＤａの見かけの分子量を有する、請求項１～１２３のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ＩαＩｐが、生物学的活性を有する、請求項１～１２４のいずれか一項に記載の方法。
- 前記生物学的活性が、サイトカイン阻害活性、ケモカイン阻害活性、又はセリンプロテアーゼ阻害活性を含む、請求項１２５に記載の方法。
- 前記生物学的材料が、血液製剤材料である、請求項１～１２６のいずれか一項に記載の方法。
- 前記血液製剤材料が、全血漿、クリオ貧血漿、液体血漿、凍結血漿（ＦＰ）、原料血漿、回収した血漿、溶媒／界面活性剤処理した血漿（ＳＤＰ）、多血小板血漿（ＰＲＰ）、血小板貧血漿（ＰＰＰ）、血清、全血、及びそれらの希釈又は濃縮製剤からなる群から選択される、請求項１２７に記載の方法。
- 前記ＦＰが、新鮮凍結血漿（ＦＦＰ）、ＦＦＰ２４、ＦＰ２４、解凍ＦＦＰ、解凍ＦＦＰ２４、解凍ＦＰ、解凍ＦＰ２４、及びそれらの希釈又は濃縮製剤からなる群から選択される、請求項１２８に記載の方法。
- 前記生物学的材料が、乳又は初乳である、請求項１～１２６のいずれか一項に記載の方法。
- 前記生物学的材料が、哺乳類由来である、請求項１～１３０のいずれか一項に記載の方法。
- 前記哺乳類が、ヒト、霊長類、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ネコ、又はイヌである、請求項１３１に記載の方法。
- 前記生物学的材料が、前記エンドトキシン結合剤への適用前に実質的に未加工である、請求項１～５９のいずれか一項に記載の方法。
- 工程（ｂ）で回収された前記溶出液を使用して１つ以上のクロマトグラフィー工程を実施することを更に含む、請求項１～１３３のいずれか一項に記載の方法。
- 前記１つ以上の追加のクロマトグラフィー工程が、請求項１～１３４のいずれか一項に記載の方法を繰り返すことを含む、請求項１３４に記載の方法。
- 工程（ｂ）で前記エンドトキシン結合剤に適用される前記溶出バッファーが、ｐＨ７．２を有し、かつ約２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ及び約５００ｍＭのＮａＣｌを含む、請求項１～１３５のいずれか一項に記載の方法。
- 前記エンドトキシン結合剤に適用される前記第１の洗浄バッファーが、ｐＨ５．２を有し、かつ約７５ｍＭのグリシン、約１００ｍＭの酢酸、及び約１５０ｍＭのＮａＣｌを含む、請求項１６～３５のいずれか一項に記載の方法。
- 前記エンドトキシン結合剤に適用される前記第２の洗浄バッファーが、ｐＨ７．２を有し、かつ約２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ及び約３００ｍＭのＮａＣｌを含む、請求項２６～３５のいずれか一項に記載の方法。
- 前記クロマトグラフィー支持体に適用される前記溶出バッファーが、ｐＨ７．２を有し、かつ約２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ及び約７５０ｍＭのＮａＣｌを含む、請求項６３～１０７のいずれか一項に記載の方法。
- 前記クロマトグラフィー支持体に適用される前記第１の洗浄バッファーが、ｐＨ７．２を有し、かつ約２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ及び約２５０ｍＭのＮａＣｌを含む、請求項６８～８６のいずれか一項に記載の方法。
- 前記クロマトグラフィー支持体に適用される前記第２の洗浄バッファーが、ｐＨ５．２を有し、かつ約５０ｍＭのグリシン、約１００ｍＭの酢酸、及び約１７５ｍＭのＮａＣｌを含む、請求項７８～８６のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項１～１４１のいずれか一項に記載の方法により製造されたＩαＩｐを含む組成物。
- 前記組成物が、ヒトへの投与に適している、請求項１４２に記載の組成物。
- 請求項１４２又は１４３に記載の組成物と、薬学的に許容される賦形剤とを含む、薬学的組成物。
- 疾患又は状態の治療を必要とする対象におけるそれを治療する方法であって、前記対象に、請求項１４２若しくは１４３に記載の組成物又は請求項１４４に記載の薬学的組成物を投与することを含む、方法。
- 請求項１４２若しくは１４３に記載の組成物又は請求項１４４に記載の薬学的組成物を含む、キット。
- 前記キットが、治療的使用のための指示書を更に含む、請求項１４６に記載のキット。
- 血漿からＩαＩｐを精製する方法であって、
（ａ）前記血漿を、脱イオン水を含む希釈バッファーで希釈して、希釈した血漿を形成することと、
（ｂ）前記希釈した血漿を、ＥＴＯＸＩＣＬＥＡＲ（商標）樹脂に適用し、前記ＥＴＯＸＩＣＬＥＡＲ（商標）樹脂に結合しない前記希釈した血漿を含むフロースルーを分離することと、
（ｃ）約７５ｍＭのグリシン、約１００ｍＭのＡｃＯＨ、及び約１５０ｍＭのＮａＣｌを含む約ｐＨ５．２の第１の洗浄バッファーを前記ＥＴＯＸＩＣＬＥＡＲ（商標）樹脂に適用し、前記第１の洗浄バッファーを含むフロースルーを分離することと、
（ｄ）約２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ及び約３００ｍＭのＮａＣｌを含む約ｐＨ７．２の第２の洗浄バッファーを前記ＥＴＯＸＩＣＬＥＡＲ（商標）樹脂に適用し、前記第２の洗浄バッファーを含むフロースルーを分離することと、
（ｅ）約２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ及び約５００ｍＭのＮａＣｌを含むｐＨ７．２の溶出バッファーを前記ＥＴＯＸＩＣＬＥＡＲ（商標）樹脂に適用し、前記ＩαＩｐを含む溶出液を回収することと、を含む方法。 - 血漿からＩαＩｐを精製する方法であって、
（ａ）前記血漿を、１５ｍＭのリン酸塩をｐＨ約５．５で含む希釈バッファーで希釈して、希釈した血漿を形成することと、
（ｂ）前記希釈した血漿を、ＤＥＴＯＸＩ－ＧＥＬ（商標）樹脂に適用し、前記ＤＥＴＯＸＩ－ＧＥＬ（商標）樹脂に結合しない前記希釈した血漿を含むフロースルーを分離することと、
（ｃ）約１５ｍＭのリン酸塩及び約５０ｍＭのＮａＣｌをｐＨ約５．５で含む第１の洗浄バッファーを前記ＤＥＴＯＸＩ－ＧＥＬ（商標）樹脂に適用し、前記第１の洗浄バッファーを含むフロースルーを分離することと、
（ｄ）約１５ｍＭのリン酸塩及び約１００ｍＭのＮａＣｌをｐＨ約５．５で含む第２の洗浄バッファーを前記ＤＥＴＯＸＩ－ＧＥＬ（商標）樹脂に適用し、前記第２の洗浄バッファーを含むフロースルーを分離することと、
（ｅ）約１５ｍＭのリン酸塩及び約１，０００ｍＭのＮａＣｌをｐＨ約５．５で含む溶出バッファーを前記ＤＥＴＯＸＩ－ＧＥＬ（商標）樹脂に適用し、前記ＩαＩｐを含む溶出液を回収することと、を含む方法。
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