CN116600825A - 用于纯化间-α 抑制剂蛋白的方法 - Google Patents
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Abstract
本文描述了使用内毒素结合剂从生物材料中纯化IαIp的方法。所述方法涉及将包含所述IαIp的所述生物材料施加至内毒素结合剂、弃去流穿液、施加一种或多种洗涤缓冲液以及从所述内毒素结合剂中洗脱所述IαIp。
Description
背景技术
间-α抑制剂蛋白(IαIp)是天然存在的免疫调节血浆蛋白家族，其在所有哺乳动物的血液中以高浓度循环。IαIp促进对感染、创伤和损伤引起的炎症的保护作用。IαIp的保护作用独立于致病微生物剂或触发物。
此家族的成员由通过糖胺聚糖共价连接的重链和轻链多肽亚基构成。IαIp在体内可作为间-α抑制剂(IαI)(一种由两条重链(H1和H2)和一条轻链(L)构成的250kDa分子，称为双库尼茨抑制剂)和前-α抑制剂(PαI)(一种由一条重链(H3)和一条轻链(L)构成的125kDa分子)存在。
当身体产生炎性信号诸如在受伤或感染期间引起的信号时，IαIp进入组织并且直接到达炎症部位。IαIp的重链通过与作为炎性级联反应的一部分的蛋白质诸如补体和细胞外组蛋白(损伤信号)结合从而减弱炎性过程来增强抗炎性反应，而轻链双库尼茨抑制剂抑制丝氨酸蛋白酶诸如胰蛋白酶、弹性蛋白酶、纤溶酶、组织蛋白酶G和弗林蛋白酶的活性。
IαIp已在体外和体内模型中被证明促进损伤后的肺上皮修复，并且IαIp也已在多个体内模型中被证明下调炎性细胞因子诸如TNF-α和IL-6。
在健康个体中，血液中循环IαIp的量相对较高(在400mg/L至800mg/L之间)。在新生儿和成人患者的全身炎症/脓毒症期间，IαIp水平迅速下降(Baek YW等人JPediatr.2003；143:11-15；Lim YP等人J Infect Dis.2003；188:919-926；以及Opal SM等人Crit Care Med.2007；35:387-392)，并且降低的IαIp水平已被证明与疾病进展密切相关。IαIp疗法已被描述用于治疗脓毒症和相关联的器官损伤、肺炎、急性呼吸道疾病、坏死性小肠结肠炎(NEC)、伤口、烧伤、癌症、卒中和阿尔茨海默病。
先前，IαIp使用分步提取，然后层析分离来制备。虽然这些方法可实现高纯度(例如，纯度>90％)，但这些方法存在IαIp产率低的缺点(例如，20％至30％(w/w))。因此，需要以高产率和纯度纯化或制备IαIp的方法以用于在例如治疗组合物的制备中使用。
发明内容
本公开的特征在于纯化IαIp(例如，IαI、PαI和双库尼茨抑制剂中的一种或多种)的方法。该方法涉及将含有IαIp的生物材料(例如，血液或乳)诸如获自受试者(例如，人)的生物材料施加至内毒素结合剂(例如，固体支持物，诸如层析柱，其含有内毒素结合剂)，作为纯化工艺中的一个步骤。
本公开的第一方面的特征在于一种通过以下步骤从生物材料中纯化间-α抑制剂蛋白(IαIp)的方法：(a)将包含IαIp的生物材料施加至内毒素结合剂，并且分离包含不与内毒素结合剂结合的生物材料的流穿液；以及(b)将包含盐的洗脱缓冲液施加至内毒素结合剂，并且收集包含IαIp的洗脱物。
在若干实施例中，将内毒素结合剂固定在支持物(例如，整体支持物或基于颗粒的支持物)上。在若干实施例中，整体支持物或基于颗粒的支持物为树脂或包含树脂。支持物可以为例如柱、膜、圆盘或芯片。
在其他实施例中，内毒素结合剂选自由以下各项组成的组：ETOXICLEARTM、PIERCETM高容量内毒素去除树脂、TOXINERASERTM内毒素去除树脂、PURKINETM内毒素去除树脂、DETOXI-GELTM内毒素去除凝胶和PROMEGATM内毒素去除树脂。在特定实施例中，内毒素结合剂为DETOXI-GELTM或ETOXICLEARTM。
生物材料可以含有三种或更多种选自由以下各项组成的组的蛋白质：α-1抗胰蛋白酶、C1-抑制剂、白蛋白、球蛋白(例如，免疫球蛋白(例如，IgA、IgE、IgM、IgD和IgG(例如，静脉内Ig(IVIg)、抗-D IgG、乙型肝炎IgG、麻疹IgG、狂犬病IgG、破伤风IgG和水痘带状疱疹IgG)))、纤维蛋白原(因子I)、凝血酶原(因子II)、凝血酶、抗凝血酶III、因子III、因子V、因子VII、因子VIII、因子IX、因子X、因子XI、因子XII、因子XIII、纤连蛋白、α-2纤溶酶抑制剂、尿激酶、蛋白C、蛋白S、蛋白Z、蛋白Z相关蛋白酶抑制剂、纤溶酶原、组织纤溶酶原激活物、纤溶酶原激活物抑制剂-1、纤溶酶原激活物抑制剂-2、血管性血友病因子、因子H、前激肽释放酶、高分子量激肽原和肝素辅因子II。
在一些实施例中，生物材料包含三至十种、三至十五种、三至二十种、三至二十五种、三至三十种、十至二十种、十至二十五种、十至三十种、十五至二十五种、十五至三十种、二十至三十种、或三十或更多种不同的蛋白质。
在一些实施例中，生物材料包含约40％至约65％白蛋白(w/w)和/或约25％至约45％球蛋白(w/w)和/或约2％至约12％纤维蛋白原(w/w)。
在一些实施例中，方法进一步包括在步骤(a)之后并且在步骤(b)之前将第一洗涤缓冲液施加至内毒素结合剂。在一些实施例中，方法进一步包括分离包含第一洗涤缓冲液的流穿液。在一些实施例中，第一洗涤缓冲液具有约4.5至8.5的pH(例如，约pH 5.2)。在一些实施例中，第一洗涤缓冲液包含甘氨酸、乙酸、柠檬酸、磷酸盐、氯化钠(NaCl)、钙、镁、EDTA和Tris-HCl中的一种或多种。在一些实施例中，第一洗涤缓冲液包含约10mM至约200mM甘氨酸和/或约20mM至300mM乙酸(例如，75mM甘氨酸和约100mM乙酸)。在一些实施例中，第一洗涤缓冲液包含约200mM或更少的NaCl(例如，约50mM至约150mM NaCl(例如，约50mMNaCl或约100mM NaCl))。在一些实施例中，第一洗涤缓冲液包含约100mM至约300mM NaCl(例如，约200mM NaCl)。在一些实施例中，第一洗涤缓冲液包含约75mM甘氨酸、约100mMAcOH和约200mM NaCl。在一些实施例中，方法进一步包括在施加第一洗涤缓冲液之后将第二洗涤缓冲液施加至内毒素结合剂。在一些实施例中，方法进一步包括分离包含第二洗涤缓冲液的流穿液。在一些实施例中，第二洗涤缓冲液具有约4.5至约8.5的pH(例如，约pH7.2)。在一些实施例中，第二洗涤缓冲液包含甘氨酸、乙酸、柠檬酸、磷酸盐、氯化钠(NaCl)、钙、镁、EDTA和Tris-HCl中的一种或多种。在一些实施例中，第二洗涤缓冲液包含约5mM至约100mM Tris-HCl。(例如，约20mM Tris-HCl)。在一些实施例中，第二洗涤缓冲液包含约500mM NaCl或更少(例如，约100mM至约500mM NaCl(例如，约300mM NaCl))。在一些实施例中，第二洗涤缓冲液包含约200mM至约400mM NaCl(例如，约300mM NaCl))。在一些实施例中，第二洗涤缓冲液包含约20mM Tris和约300mM NaCl。
在一些实施例中，方法进一步包括在施加第二洗涤缓冲液之后将第三洗涤缓冲液施加至内毒素结合剂。在一些实施例中，洗脱缓冲液具有约4.5至约8.5的pH(例如，约pH7.2)。在一些实施例中，洗脱缓冲液包含甘氨酸、乙酸、柠檬酸、磷酸盐、氯化钠(NaCl)、钙、镁、EDTA和Tris-HCl中的一种或多种。在一些实施例中，洗脱缓冲液包含约5mM至约100mMTris-HCl(例如，约20mM Tris-HCl)。在一些实施例中，洗脱缓冲液包含约1,000mM NaCl或更少(例如，约500mM至约1,000mM NaCl(例如，约500mM NaCl或约1,000mM NaCl))。在一些实施例中，洗脱缓冲液包含约20mM Tris和约500mM NaCl。
在一些实施例中，方法进一步包括在施加洗脱缓冲液之后将第二洗脱缓冲液施加至内毒素结合剂，该第二洗脱缓冲液具有约4.5至约8.5的pH(例如，约pH 7.2)。在一些实施例中，第二洗脱缓冲液包含甘氨酸、乙酸、柠檬酸、磷酸盐、氯化钠(NaCl)、钙、镁、EDTA和Tris-HCl中的一种或多种。在一些实施例中，第二洗脱缓冲液包含约5mM至约100mM Tris-HCl(例如，约20mM Tris-HCl)。在一些实施例中，第二洗脱缓冲液包含约1,000mM NaCl或更少(例如，约500mM至约1,000mM NaCl(例如，约500mM NaCl或约1,000mM NaCl))。在一些实施例中，第二洗脱缓冲液包含约20mM Tris和约1,000mM NaCl。
在一些实施例中，方法进一步包括在步骤(a)之前将稀释缓冲液施加至生物材料。在一些实施例中，稀释缓冲液包含去离子水。在一些实施例中，稀释缓冲液包含纯化水。在一些实施例中，稀释缓冲液具有约4.5至约8.5的pH(例如，约pH 5.5、约pH 7.2或约pH7.3)。在一些实施例中，将生物材料用稀释缓冲液按1:1至1:10(v/v)稀释。在一些实施例中，稀释缓冲液包含甘氨酸、乙酸、柠檬酸、磷酸盐、氯化钠(NaCl)、钙、镁、EDTA和Tris-HCl中的一种或多种。在一些实施例中，稀释缓冲液包含约5mM至约100mM Tris-HCl(例如，约20mM Tris-HCl)。在一些实施例中，稀释缓冲液包含约50mM NaCl或更少(例如，无盐、无NaCl或约50mM NaCl)。在一些实施例中，稀释缓冲液包含约5mM至约100mM磷酸盐(例如，15mM磷酸盐)。
在一些实施例中，方法进一步包括在步骤(a)之前调节生物材料的pH。在一些实施例中，方法包括在步骤(a)之前通过添加乙酸将生物材料的pH调节至约4.5至约8.5(例如约pH 5.5、约pH 7.2或约pH 7.3)。在一些实施例中，方法进一步包括在步骤(a)之前调节生物材料的电导率。在一些实施例中，方法包括在步骤(a)之前将生物材料的电导率调节至约10mS/cm至约30mS/cm、约15mS/cm至约25mS/cm(例如约20mS/cm)。
在一些实施例中，方法进一步包括检测流穿液中的IαIp的量。在一些实施例中，方法包括弃去流穿液。
在一些实施例中，方法进一步包括检测洗脱物中的IαIp的量。
在一些实施例中，方法包括约1mL/min至10mL/min的流速。
在一些实施例中，方法进一步包括将生物材料施加至层析支持物(例如，阴离子交换层析支持物、尺寸排阻层析支持物、离子交换层析支持物、亲和层析支持物或其组合)。在一些实施例中，层析支持物为所述阴离子交换层析支持物。
在一些实施例中，该方法进一步包括：(i)将生物材料施加至层析支持物，并且分离步骤(i)的包含不与层析支持物结合的生物材料的流穿液；以及(ii)将洗脱缓冲液施加至层析支持物，并且收集包含IαIp的洗脱物。
在一些实施例中，层析支持物为整体支持物或基于颗粒的支持物。在一些实施例中，整体支持物或基于颗粒的支持物包含固定化阴离子交换树脂(例如，二乙基氨基乙烷(DEAE)树脂或季胺(Q)树脂)。在一些实施例中，整体支持物或基于颗粒的支持物包含季胺(Q)树脂。在一些实施例中，层析支持物为柱、膜、圆盘或芯片。
在一些实施例中，方法进一步包括在步骤(i)之后并且在步骤(ii)之前将第一洗涤缓冲液施加至层析支持物。在一些实施例中，在步骤(ii)之前，方法进一步包括分离包含第一洗涤缓冲液的流穿液。在一些实施例中，施加至层析支持物的第一洗涤缓冲液具有约4.5至约8.5(例如，约7.2)的pH。在一些实施例中，施加至层析支持物的第一洗涤缓冲液包含甘氨酸、乙酸、柠檬酸、磷酸盐、氯化钠(NaCl)、钙、镁、EDTA和Tris-HCl中的一种或多种。在一些实施例中，施加至层析支持物的第一洗涤缓冲液包含约5mM至约100mM Tris-HCl(例如，约20mM Tris-HCl)。在一些实施例中，施加至层析支持物的第一洗涤缓冲液包含约400mM或更少的NaCl(例如，约50mM至约250mM NaCl(例如，约250mM NaCl))。在一些实施例中，施加至层析支持物的第一洗涤缓冲液包含约20mM Tris和约250mM NaCl。
在一些实施例中，方法进一步包括在施加第一洗涤缓冲液之后将第二洗涤缓冲液施加至层析支持物。在一些实施例中，方法进一步包括分离包含第二洗涤缓冲液的流穿液。在一些实施例中，施加至层析支持物的第二洗涤缓冲液具有约4.5至约8.5的pH(例如，约pH5.2)。在一些实施例中，施加至层析支持物的第二洗涤缓冲液包含甘氨酸、乙酸、柠檬酸、磷酸盐、氯化钠(NaCl)、钙、镁、EDTA、NaOH和Tris-HCl中的一种或多种。在一些实施例中，施加至层析支持物的第二洗涤缓冲液包含约10mM至约200mM甘氨酸和/或约20mM至约300mM乙酸(例如，约50mM甘氨酸和约100mM乙酸)。在一些实施例中，施加至层析支持物的第二洗涤缓冲液包含约100mM至约500mM NaCl(例如，约175mM NaCl)。
在一些实施例中，方法进一步包括在施加第二洗涤缓冲液之后将第三洗涤缓冲液施加至层析支持物。在一些实施例中，方法进一步包括分离包含第三洗涤缓冲液的流穿液。在一些实施例中，施加至层析支持物的第三洗涤缓冲液具有约4.5至约8.5的pH(例如，约pH7.2)。在一些实施例中，施加至层析支持物的第三洗涤缓冲液具有约4.5至约8.5(例如，约7.2)的pH。在一些实施例中，施加至层析支持物的第三洗涤缓冲液包含甘氨酸、乙酸、柠檬酸、磷酸盐、氯化钠(NaCl)、钙、镁、EDTA和Tris-HCl中的一种或多种。在一些实施例中，施加至层析支持物的第三洗涤缓冲液包含约5mM至约100mM Tris-HCl(例如，约20mM Tris-HCl)。在一些实施例中，施加至层析支持物的第一洗涤缓冲液包含约400mM或更少的NaCl(例如，约50mM至约250mM NaCl(例如，约200mM NaCl))。在一些实施例中，施加至层析支持物的第一洗涤缓冲液包含约20mM Tris和约200mM NaCl。在一些实施例中，施加至层析支持物的洗脱缓冲液具有约4.5至约8.5的pH(例如，约pH 7.2)。在一些实施例中，施加至层析支持物的洗脱缓冲液包含甘氨酸、乙酸、柠檬酸、磷酸盐、氯化钠(NaCl)、钙、镁、EDTA和Tris-HCl中的一种或多种。在一些实施例中，施加至层析支持物的洗脱缓冲液包含约5mM至约100mM Tris-HCl(例如，约20mM Tris-HCl)。在一些实施例中，施加至层析支持物的洗脱缓冲液包含约1,000mM NaCl(例如，约750mM NaCl)。
在一些实施例中，方法进一步包括在步骤(i)之前将稀释缓冲液施加至生物材料。在一些实施例中，稀释缓冲液包含去离子水。在一些实施例中，稀释缓冲液包含纯化水。在一些实施例中，稀释缓冲液具有约4.5至约8.5的pH(例如，约pH 7.2)。在一些实施例中，将生物材料用稀释缓冲液按1:1至1:10(v/v)稀释。在一些实施例中，稀释缓冲液包含甘氨酸、乙酸、柠檬酸、磷酸盐、氯化钠(NaCl)、钙、镁、EDTA和Tris-HCl中的一种或多种。在一些实施例中，稀释缓冲液包含约5mM至约100mM Tris-HCl(例如，约20mM Tris-HCl)。在一些实施例中，稀释缓冲液包含约300mM NaCl或更少(例如，无盐或约200mM NaCl)。
在一些实施例中，方法进一步包括检测步骤(i)的流穿液中的IαIp的量。在一些实施例中，方法包括弃去步骤(i)的流穿液。
在一些实施例中，方法进一步包括检测步骤(ii)中洗脱物中的IαIp的量。
在一些实施例中，方法包括约1mL/min至10mL/min的流速。
在一些实施例中，在步骤(b)的洗脱物中收集的IαIp相对于生物材料中的IαIp的纯度具有约5重量％至99重量％或更高的纯度。
在一些实施例中，在步骤(b)中收集的洗脱物中的IαIp的产率相对于存在于生物材料中的IαIp大于约20％(w/w)(例如，35％至约90％或更大(例如，约95％或更大))。在一些实施例中，来自生物材料的IαIp的产率为至少约5μg/ml、约50μg/ml、约100μg/ml、约300μg/ml、约600μg/ml或约900μg/ml(例如，约5μg/ml至约900μg/ml)。
在一些实施例中，IαIp的纯度为至少约5％(w/w)(例如，至少约25％、约50％(w/w)或约75％(w/w)(例如，约5％(w/w)至约75％(w/w)或更多(例如，多达约90％、95％、97％、99％或100％(w/w))。
在一些实施例中，IαIp包含间-α抑制剂(IαI)、前-α抑制剂(PαI)和双库尼茨抑制剂中的两种或更多种。
在一些实施例中，存在于生物材料中的IαIp包含在60％至80％(w/w)之间的IαIp和/或在20％至40％(w/w)之间的PαI；并且/或者其中存在于步骤(b)的洗脱物中的IαIp包含在60％至80％(w/w)之间的IαIp和/或在20％至40％(w/w)之间的PαI。
在一些实施例中，IαIp包含间-α抑制剂(IαI)、前-α抑制剂(PαI)和双库尼茨抑制剂中的两种或更多种。在一些实施例中，IαIp为间-α抑制剂(IαI)。在一些实施例中，IαIp为前-α抑制剂(PαI)。在一些实施例中，IαIp为间-α抑制剂(IαI)和前-α抑制剂(PαI)。
在一些实施例中，存在于生物材料中的IαIp包含在60％至80％(w/w)之间的IαIp和/或在20％至40％(w/w)之间的PαI；并且/或者其中存在于步骤(b)的洗脱物中的IαIp包含在60％至80％(w/w)之间的IαIp和/或在20％至40％(w/w)之间的PαI。
在一些实施例中，存在于生物材料中的基本上所有IαIp均为IαI。在一些实施例中，存在于生物材料中的在约90％与约99.5％(w/w)之间的IαIp为IαI。在一些实施例中，存在于生物材料中的在约80％与约90％(w/w)之间的IαIp为IαI。在一些实施例中，存在于生物材料中的在约70％与约80％(w/w)之间的IαIp为IαI。在一些实施例中，存在于生物材料中的在约60％与约70％(w/w)之间的IαIp为IαI。在一些实施例中，存在于生物材料中的在约50％与约60％(w/w)之间的IαIp为IαI。在一些实施例中，存在于生物材料中的在约40％与约50％(w/w)之间的IαIp为IαI。在一些实施例中，存在于生物材料中的在约30％与约40％(w/w)之间的IαIp为IαI。在一些实施例中，存在于生物材料中的在约20％与约30％(w/w)之间的IαIp为IαI。在一些实施例中，存在于生物材料中的在约10％与约20％(w/w)之间的IαIp为IαI。在一些实施例中，存在于生物材料中的在约1％与约10％(w/w)之间的IαIp为IαI。
在一些实施例中，存在于生物材料中的基本上所有IαIp均为PαI。在一些实施例中，存在于生物材料中的在约90％与约99.5％(w/w)之间的IαIp为PαI。在一些实施例中，存在于生物材料中的在约80％与约90％(w/w)之间的IαIp为PαI。在一些实施例中，存在于生物材料中的在约70％与约80％(w/w)之间的IαIp为PαI。在一些实施例中，存在于生物材料中的在约60％与约70％(w/w)之间的IαIp为PαI。在一些实施例中，存在于生物材料中的在约50％与约60％(w/w)之间的IαIp为PαI。在一些实施例中，存在于生物材料中的在约40％与约50％(w/w)之间的IαIp为PαI。在一些实施例中，存在于生物材料中的在约30％与约40％(w/w)之间的IαIp为PαI。在一些实施例中，存在于生物材料中的在约20％与约30％(w/w)之间的IαIp为PαI。在一些实施例中，存在于生物材料中的在约10％与约20％(w/w)之间的IαIp为PαI。在一些实施例中，存在于生物材料中的在约1％与约10％(w/w)之间的IαIp为PαI。
在一些实施例中，存在于生物材料中的基本上所有IαIp均为IαI和PαI。在一些实施例中，存在于生物材料中的在约90％与约99.5％(w/w)之间的IαIp为IαI和PαI。在一些实施例中，存在于生物材料中的在约80％与约90％(w/w)之间的IαIp为IαI和PαI。在一些实施例中，存在于生物材料中的在约95％与约99.5％(w/w)之间的IαIp为IαI和PαI。在一些实施例中，存在于生物材料中的在约94％与约98％(w/w)之间的IαIp为IαI和PαI。在一些实施例中，存在于生物材料中的在约93％与约97％(w/w)之间的IαIp为IαI和PαI。在一些实施例中，存在于生物材料中的在约91％与约96％(w/w)之间的IαIp为IαI和PαI。在一些实施例中，存在于生物材料中的在约90％与约95％(w/w)之间的IαIp为IαI和PαI。在一些实施例中，存在于生物材料中的在约89％与约94％(w/w)之间的IαIp为IαI和PαI。在一些实施例中，存在于生物材料中的在约88％与约93％(w/w)之间的IαIp为IαI和PαI。在一些实施例中，存在于生物材料中的在约87％与约92％(w/w)之间的IαIp为IαI和PαI。在一些实施例中，存在于生物材料中的在约86％与约91％(w/w)之间的IαIp为IαI和PαI。在一些实施例中，存在于生物材料中的在约85％与约90％(w/w)之间的IαIp为IαI和PαI。
在一些实施例中，存在于步骤(b)的洗脱物中的基本上所有IαIp均为IαI。在一些实施例中，存在于步骤(b)的洗脱物中的在约90％与约99.5％(w/w)之间的IαIp为IαI。在一些实施例中，存在于步骤(b)的洗脱物中的在约80％与约90％(w/w)之间的IαIp为IαI。在一些实施例中，存在于步骤(b)的洗脱物中的在约70％与约80％(w/w)之间的IαIp为IαI。在一些实施例中，存在于步骤(b)的洗脱物中的在约68％与约78％(w/w)之间的IαIp为IαI。在一些实施例中，存在于步骤(b)的洗脱物中的在约66％与约76％(w/w)之间的IαIp为IαI。在一些实施例中，存在于步骤(b)的洗脱物中的在约64％与约74％(w/w)之间的IαIp为IαI。在一些实施例中，存在于步骤(b)的洗脱物中的在约62％与约72％(w/w)之间的IαIp为IαI。在一些实施例中，存在于步骤(b)的洗脱物中的在约60％与约65％(w/w)之间的IαIp为IαI。在一些实施例中，存在于步骤(b)的洗脱物中的在约61％与约66％(w/w)之间的IαIp为IαI。在一些实施例中，存在于步骤(b)的洗脱物中的在约62％与约67％(w/w)之间的IαIp为IαI。在一些实施例中，存在于步骤(b)的洗脱物中的在约63％与约68％(w/w)之间的IαIp为IαI。在一些实施例中，存在于步骤(b)的洗脱物中的在约64％与约69％(w/w)之间的IαIp为IαI。在一些实施例中，存在于步骤(b)的洗脱物中的在约65％与约70％(w/w)之间的IαIp为IαI。在一些实施例中，存在于步骤(b)的洗脱物中的在约66％与约71％(w/w)之间的IαIp为IαI。在一些实施例中，存在于步骤(b)的洗脱物中的在约67％与约72％(w/w)之间的IαIp为IαI。在一些实施例中，存在于步骤(b)的洗脱物中的在约68％与约73％(w/w)之间的IαIp为IαI。在一些实施例中，存在于步骤(b)的洗脱物中的在约69％与约74％(w/w)之间的IαIp为IαI。在一些实施例中，存在于步骤(b)的洗脱物中的在约59％与约64％(w/w)之间的IαIp为IαI。在一些实施例中，存在于步骤(b)的洗脱物中的在约58％与约63％(w/w)之间的IαIp为IαI。在一些实施例中，存在于步骤(b)的洗脱物中的在约57％与约62％(w/w)之间的IαIp为IαI。在一些实施例中，存在于步骤(b)的洗脱物中的在约56％与约61％(w/w)之间的IαIp为IαI。在一些实施例中，存在于步骤(b)的洗脱物中的在约55％与约60％(w/w)之间的IαIp为IαI。在一些实施例中，存在于步骤(b)的洗脱物中的在约54％与约59％(w/w)之间的IαIp为IαI。在一些实施例中，存在于步骤(b)的洗脱物中的在约54％与约59％(w/w)之间的IαIp为IαI。在一些实施例中，存在于步骤(b)的洗脱物中的在约53％与约58％(w/w)之间的IαIp为IαI。在一些实施例中，存在于步骤(b)的洗脱物中的在约52％与约57％(w/w)之间的IαIp为IαI。在一些实施例中，存在于步骤(b)的洗脱物中的在约51％与约56％(w/w)之间的IαIp为IαI。在一些实施例中，存在于步骤(b)的洗脱物中的在约50％与约55％(w/w)之间的IαIp为IαI。在一些实施例中，存在于步骤(b)的洗脱物中的在约49％与约54％(w/w)之间的IαIp为IαI。在一些实施例中，存在于步骤(b)的洗脱物中的在约48％与约53％(w/w)之间的IαIp为IαI。在一些实施例中，存在于步骤(b)的洗脱物中的在约47％与约52％(w/w)之间的IαIp为IαI。在一些实施例中，存在于步骤(b)的洗脱物中的在约46％与约51％(w/w)之间的IαIp为IαI。在一些实施例中，存在于步骤(b)的洗脱物中的在约45％与约50％(w/w)之间的IαIp为IαI。在一些实施例中，存在于步骤(b)的洗脱物中的在约60％与约70％(w/w)之间的IαIp为IαI。在一些实施例中，存在于步骤(b)的洗脱物中的在约58％与约68％(w/w)之间的IαIp为IαI。在一些实施例中，存在于步骤(b)的洗脱物中的在约56％与约66％(w/w)之间的IαIp为IαI。在一些实施例中，存在于步骤(b)的洗脱物中的在约54％与约64％(w/w)之间的IαIp为IαI。在一些实施例中，存在于步骤(b)的洗脱物中的在约52％与约62％(w/w)之间的IαIp为IαI。在一些实施例中，存在于步骤(b)的洗脱物中的在约50％与约60％(w/w)之间的IαIp为IαI。在一些实施例中，存在于步骤(b)的洗脱物中的在约48％与约58％(w/w)之间的IαIp为IαI。在一些实施例中，存在于步骤(b)的洗脱物中的在约46％与约56％(w/w)之间的IαIp为IαI。在一些实施例中，存在于步骤(b)的洗脱物中的在约44％与约54％(w/w)之间的IαIp为IαI。在一些实施例中，存在于步骤(b)的洗脱物中的在约42％与约52％(w/w)之间的IαIp为IαI。在一些实施例中，存在于步骤(b)的洗脱物中的在约40％与约50％(w/w)之间的IαIp为IαI。在一些实施例中，存在于步骤(b)的洗脱物中的在约30％与约40％(w/w)之间的IαIp为IαI。在一些实施例中，存在于步骤(b)的洗脱物中的在约20％与约30％(w/w)之间的IαIp为IαI。在一些实施例中，存在于步骤(b)的洗脱物中的在约10％与约20％(w/w)之间的IαIp为IαI。在一些实施例中，存在于步骤(b)的洗脱物中的在约1％与约10％(w/w)之间的IαIp为IαI。
在一些实施例中，存在于步骤(b)的洗脱物中的基本上所有IαIp均为PαI。在一些实施例中，存在于步骤(b)的洗脱物中的在约90％与约99.5％(w/w)之间的IαIp为PαI。在一些实施例中，存在于步骤(b)的洗脱物中的在约80％与约90％(w/w)之间的IαIp为PαI。在一些实施例中，存在于步骤(b)的洗脱物中的在约70％与约80％(w/w)之间的IαIp为PαI。在一些实施例中，存在于步骤(b)的洗脱物中的在约60％与约70％(w/w)之间的IαIp为PαI。在一些实施例中，存在于步骤(b)的洗脱物中的在约50％与约60％(w/w)之间的IαIp为PαI。在一些实施例中，存在于步骤(b)的洗脱物中的在约40％与约50％(w/w)之间的IαIp为PαI。在一些实施例中，存在于步骤(b)的洗脱物中的在约38％与约48％(w/w)之间的IαIp为PαI。在一些实施例中，存在于步骤(b)的洗脱物中的在约36％与约46％(w/w)之间的IαIp为PαI。在一些实施例中，存在于步骤(b)的洗脱物中的在约34％与约44％(w/w)之间的IαIp为PαI。在一些实施例中，存在于步骤(b)的洗脱物中的在约32％与约42％(w/w)之间的IαIp为PαI。在一些实施例中，存在于步骤(b)的洗脱物中的在约30％与约35％(w/w)之间的IαIp为PαI。在一些实施例中，存在于步骤(b)的洗脱物中的在约31％与约36％(w/w)之间的IαIp为PαI。在一些实施例中，存在于步骤(b)的洗脱物中的在约32％与约37％(w/w)之间的IαIp为PαI。在一些实施例中，存在于步骤(b)的洗脱物中的在约33％与约38％(w/w)之间的IαIp为PαI。在一些实施例中，存在于步骤(b)的洗脱物中的在约34％与约39％(w/w)之间的IαIp为PαI。在一些实施例中，存在于步骤(b)的洗脱物中的在约35％与约40％(w/w)之间的IαIp为PαI。在一些实施例中，存在于步骤(b)的洗脱物中的在约30％与约40％(w/w)之间的IαIp为PαI。在一些实施例中，存在于步骤(b)的洗脱物中的在约28％与约38％(w/w)之间的IαIp为PαI。在一些实施例中，存在于步骤(b)的洗脱物中的在约26％与约36％(w/w)之间的IαIp为PαI。在一些实施例中，存在于步骤(b)的洗脱物中的在约24％与约34％(w/w)之间的IαIp为PαI。在一些实施例中，存在于步骤(b)的洗脱物中的在约22％与约32％(w/w)之间的IαIp为PαI。在一些实施例中，存在于步骤(b)的洗脱物中的在约30％与约35％(w/w)之间的IαIp为PαI。在一些实施例中，存在于步骤(b)的洗脱物中的在约29％与约34％(w/w)之间的IαIp为PαI。在一些实施例中，存在于步骤(b)的洗脱物中的在约28％与约33％(w/w)之间的IαIp为PαI。在一些实施例中，存在于步骤(b)的洗脱物中的在约27％与约32％(w/w)之间的IαIp为PαI。在一些实施例中，存在于步骤(b)的洗脱物中的在约26％与约31％(w/w)之间的IαIp为PαI。在一些实施例中，存在于步骤(b)的洗脱物中的在约25％与约30％(w/w)之间的IαIp为PαI。在一些实施例中，存在于步骤(b)的洗脱物中的在约24％与约29％(w/w)之间的IαIp为PαI。在一些实施例中，存在于步骤(b)的洗脱物中的在约23％与约28％(w/w)之间的IαIp为PαI。在一些实施例中，存在于步骤(b)的洗脱物中的在约22％与约27％(w/w)之间的IαIp为PαI。在一些实施例中，存在于步骤(b)的洗脱物中的在约21％与约26％(w/w)之间的IαIp为PαI。在一些实施例中，存在于步骤(b)的洗脱物中的在约20％与约25％(w/w)之间的IαIp为PαI。在一些实施例中，存在于步骤(b)的洗脱物中的在约20％与约30％(w/w)之间的IαIp为PαI。在一些实施例中，存在于步骤(b)的洗脱物中的在约10％与约20％(w/w)之间的IαIp为PαI。在一些实施例中，存在于步骤(b)的洗脱物中的在约1％与约10％(w/w)之间的IαIp为PαI。
在一些实施例中，存在于步骤(b)的洗脱物中的基本上所有IαIp均为IαI和PαI。在一些实施例中，存在于步骤(b)的洗脱物中的在约90％与约99.5％(w/w)之间的IαIp为IαI和PαI。在一些实施例中，存在于步骤(b)的洗脱物中的在约80％与约90％(w/w)之间的IαIp为IαI和PαI。在一些实施例中，存在于步骤(b)的洗脱物中的在约95％与约99.5％(w/w)之间的IαIp为IαI和PαI。在一些实施例中，存在于步骤(b)的洗脱物中的在约94％与约98％(w/w)之间的IαIp为IαI和PαI。在一些实施例中，存在于步骤(b)的洗脱物中的在约93％与约97％(w/w)之间的IαIp为IαI和PαI。在一些实施例中，存在于步骤(b)的洗脱物中的在约91％与约96％(w/w)之间的IαIp为IαI和PαI。在一些实施例中，存在于步骤(b)的洗脱物中的在约90％与约95％(w/w)之间的IαIp为IαI和PαI。在一些实施例中，存在于步骤(b)的洗脱物中的在约89％与约94％(w/w)之间的IαIp为IαI和PαI。在一些实施例中，存在于步骤(b)的洗脱物中的在约88％与约93％(w/w)之间的IαIp为IαI和PαI。在一些实施例中，存在于步骤(b)的洗脱物中的在约87％与约92％(w/w)之间的IαIp为IαI和PαI。在一些实施例中，存在于步骤(b)的洗脱物中的在约86％与约91％(w/w)之间的IαIp为IαI和PαI。在一些实施例中，存在于步骤(b)的洗脱物中的在约85％与约90％(w/w)之间的IαIp为IαI和PαI。
在一些实施例中，存在于步骤(b)的洗脱物中的IαIp包含约60％至约70％(w/w)的IαI和约20％至30％(w/w)的PαI。在一些实施例中，存在于步骤(b)的洗脱物中的IαIp包含约62％至约72％(w/w)的IαI和约28％至30％(w/w)的PαI。
在一些实施例中，IαIp具有在约60kDa至约280kDa之间的表观分子量。
在一些实施例中，IαIp具有生物活性(例如，细胞因子抑制剂活性、趋化因子抑制剂活性或丝氨酸蛋白酶抑制剂活性)。
在一些实施例中，生物材料为血液制品材料(例如，全血浆、去冷沉淀血浆、液态血浆、冷冻血浆(FP)(例如，新鲜冷冻血浆(FFP)、FFP24、FP24、解冻FFP、解冻FFP24、解冻FP、解冻FP24及其稀释或浓缩制剂)、原料血浆、回收血浆、溶剂/去污剂处理血浆(SDP)、富血小板血浆(PRP)、贫血小板血浆(PPP)、血清、全血及其稀释或浓缩制剂)。
在一些实施例中，生物材料为通过一个或多个工艺步骤(例如，过滤、离心、沉降、层析、吸附、分离、冷冻、解冻、稀释、浓缩、病毒清除等)从血液制品材料产生的血浆级分中间体。
在一些实施例中，生物材料为通过一个或多个工艺步骤(例如，过滤、离心、沉降、层析、吸附、分离、冷冻、解冻、稀释、浓缩、病毒清除等)从血液制品材料产生的血液制品。在一些实施例中，生物材料为乳或初乳。
在一些实施例中，生物材料来自哺乳动物(例如，人、灵长类动物、牛、马、猪、羊、猫或犬)。
在一些实施例中，生物材料在施加至内毒素结合剂之前基本上未经处理。
在一些实施例中，方法进一步包括执行一个或多个层析步骤(例如，使用在步骤(b)中收集的洗脱物重复第一方面和/或其实施例的方法一次或多次)。
在一些实施例中，在步骤(b)中施加至内毒素结合剂的洗脱缓冲液具有7.2的pH并且包含约20mM Tris-HCl和约500mM NaCl。
在一些实施例中，施加至内毒素结合剂的第一洗涤缓冲液具有5.2的pH并且包含约75mM甘氨酸、约100mM乙酸和约150mM NaCl。
在一些实施例中，施加至内毒素结合剂的第二洗涤缓冲液具有7.2的pH并且包含约20mM Tris-HCl和约300mM NaCl。
在一些实施例中，施加至层析支持物的洗脱缓冲液具有7.2的pH并且包含约20mMTris-HCl和约750mM NaCl。
在一些实施例中，施加至层析支持物的第一洗涤缓冲液具有7.2的pH并且包含约20mM Tris-HCl和约250mM NaCl。
在一些实施例中，施加至层析支持物的第二洗涤缓冲液具有5.2的pH并且包含约50mM甘氨酸、约100mM乙酸和约175mM NaCl。
本公开的第二方面的特征在于一种包含通过第一个方面及其实施例的方法产生的IαIp的组合物。在一个实施例中，组合物适合施用于人。
本公开的第三方面的特征在于一种包含第二方面及其实施例的组合物和药用赋形剂的药物组合物。
本公开内容的第四方面的特征在于一种通过向受试者施用第二方面或其实施例中的一者的组合物或第三方面的药物组合物来治疗有此需要的受试者的疾病或病症的方法。
本公开的第五方面的特征在于一种包含第二方面或其实施例中的一者的组合物或第三方面的药物组合物的试剂盒。在一个实施例中，试剂盒进一步包含关于治疗用途的说明书。
本公开的第六方面的特征在于一种通过以下步骤从血浆中纯化IαIp的方法：(a)用包含去离子水的稀释缓冲液稀释血浆，以形成稀释的血浆；(b)将稀释的血浆施加至ETOXICLEARTM树脂，并且分离包含不与ETOXICLEARTM树脂结合的稀释的血浆的流穿液；(c)将包含约75mM甘氨酸、约100mM AcOH和约150mM NaCl的pH为约5.2的第一洗涤缓冲液施加至ETOXICLEARTM树脂，并且分离包含第一洗涤缓冲液的流穿液；(d)将包含约20mM Tris-HCl和约300mM NaCl的pH为约7.2的第二洗涤缓冲液施加至ETOXICLEARTM树脂，并且分离包含第二洗涤缓冲液的流穿液；以及(e)将包含约20mM Tris-HCl和约500mM NaCl的pH为7.2的洗脱缓冲液施加至ETOXICLEARTM树脂，并且收集包含IαIp的洗脱物。
本公开的第七方面的特征在于一种从血浆中纯化IαIp的方法，该方法包括：(a)用包含15mM磷酸盐的pH为约5.5的稀释缓冲液稀释血浆，以形成稀释的血浆；(b)将稀释的血浆施加至DETOXI-GELTM树脂，并且分离包含不与DETOXI-GELTM树脂结合的稀释的血浆的流穿液；(c)将包含约15mM磷酸盐和约50mM NaCl的pH为约5.5的第一洗涤缓冲液施加至DETOXI-GELTM树脂，并且分离包含第一洗涤缓冲液的流穿液；(d)将包含约15mM磷酸盐和约100mM NaCl的pH为约5.5的第二洗涤缓冲液施加至DETOXI-GELTM树脂，并且分离包含第二洗涤缓冲液的流穿液；以及(e)将包含约15mM磷酸盐和约1,000mM NaCl的pH为约5.5的洗脱缓冲液施加至DETOXI-GELTM树脂，并且收集包含IαIp的洗脱物。
定义
如本文所用，除非另有说明，否则单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数引用。
如本文所用，术语“约”意指所述值的+/-10％。
如本文所用，“施用”意指给予受试者一定剂量的物质(例如，IαIp)或组合物的方法。在本文所述的方法中利用的IαIp可经例如口服、肌内、静脉内、皮内、经皮、动脉内、病灶内、颅内、关节内、前列腺内、胸膜内、气管内、鼻内、玻璃体内、阴道内、直肠内、局部、瘤内、腹膜、皮下、结膜下、血管内、粘膜、心包内、脐内、眼内、外用、局部、通过吸入、通过注射、通过输注、通过连续输注、通过局部灌注直接浸浴靶细胞、通过导管、通过灌洗、以乳霜或脂质组合物形式施用。施用方法可根据多种因素(例如，待施用的物质或组合物以及待治疗的病症、疾病或疾患的严重程度)而变化。
如本文所用，术语“生物材料”是指来自受试者(例如，哺乳动物，诸如人)的含有IαIp的样品。生物材料的实例包括血液制品材料，例如全血浆、去冷沉淀血浆、液态血浆、新鲜冷冻血浆(FFP)、FFP24、冷冻血浆(FP)、FP24、解冻FFP、解冻FFP24、解冻FP、解冻FP24、原料血浆、回收血浆、溶剂/去污剂处理血浆(SDP)、富血小板血浆(PRP)、贫血小板血浆(PPP)、血清、血液及其稀释或浓缩制剂、乳或初乳、尿液、痰和脑脊液。生物材料的实例包括通过一个或多个工艺步骤(例如，过滤、离心、沉降、层析、吸附、分离、冷冻、解冻、稀释、浓缩、病毒清除等)产生的血浆级分中间体或血液制品。生物材料可来自人、灵长类动物、牛、马、猪、羊、猫、犬或其组合。生物材料也可以为使用表达IαIp的细胞制备的提取物，或者可以为或含有分泌IαIp的细胞，例如已被重组修饰以表达IαIp的细胞。
生物材料可为基本上未经处理的，使得在如本文所述的使用例如内毒素结合剂的纯化步骤之前，尚未对该材料施加其他一个或多个纯化步骤，或者使得任何用材料执行的一个或多个先前纯化步骤去除该材料中的一种或多种物质的少于10％(w/w)(例如，少于0.1％至10％(w/w)，诸如少于0.1％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％或9％(w/w))。生物材料也可为已经在如本文所述的使用例如内毒素结合剂的纯化步骤之前经过处理或制备的材料。例如，可使用倾析步骤、澄清步骤、层析步骤(例如，阴离子交换层析)、离心和/或沉降步骤、冷冻步骤、干燥步骤、蒸发步骤、提取步骤、过滤步骤、沉淀步骤或通过本领域已知的其他纯化或制备方法对生物材料进行处理。工艺步骤可去除生物材料中的一种或多种物质(例如，蛋白质或IαIp以外的物质)的多达例如10％或更多(w/w)(例如，多于10％至30％(w/w)，诸如15％、20％、25％或30％(w/w))。
如本文所用，术语“层析”或“层析步骤”是指通过使溶液或悬浮液中的混合物穿过介质(其中混合物的分析物以不同速率移动)来分离混合物中的一种或多种分析物。例如，层析步骤可为尺寸排阻层析、离子交换层析、亲和层析或染料-配体层析。更具体地，可使用例如内毒素结合剂(诸如树脂)执行如本文所述的层析步骤，以从含有IαIp的生物材料中分离IαIp。
在本公开中，术语“包含(comprises/comprising)”、“含有”和“具有”等可具有美国专利法中赋予它们的含义，并且可意指“包括(includes/including)”等；“基本上由……组成”或“基本上组成”同样具有美国专利法所赋予的含义，并且该术语是开放式的，允许存在比所列举的更多的内容，只要所列举的基本或新颖特征不因超出所列举的内容的存在而改变即可，但不包括现有技术实施例。
如本文所用，术语“洗脱物”是指在纯化步骤(例如，层析步骤)期间从介质(例如，支持物材料)洗脱的含有分析物材料(例如，IαIp)的级分。可以通过将洗脱液施加至介质而从介质中释放洗脱物，从而释放分析物。更具体地，洗脱物可指在将洗脱液(例如，洗脱缓冲液，诸如含有盐的缓冲液)施加至介质后从洗脱物从介质(例如，内毒素结合剂)中释放的含有IαIp的级分。
如本文所用，术语“内毒素”是指包括脂质和多糖的物质。内毒素诸如脂多糖(LPS)通常存在于革兰氏阴性菌细胞壁的外膜中。内毒素的大小可为大约10kDa，但可易于形成高达1,000kDa的大聚集体。LPS(或内毒素)可存在于大肠杆菌(E.coli)以及其他革兰氏阴性细菌中(参见例如Bertani和Ruiz,EcoSal Plus doi:10.1128/ecosalplus.ESP-0001-2018,2018，其通过引用以其整体并入本文)。
如本文所用，“内毒素结合剂”意指能够或已知能够结合内毒素诸如脂多糖的分子。内毒素结合剂可以为与内毒素特异性结合的结合剂。内毒素结合剂可为例如已知用于从生物材料或蛋白质的混合物中去除脂多糖的树脂。示例性内毒素结合剂包括但不限于ETOXICLEARTM(www.astreabioseparations.com/product/etoxiclear)、PIERCETM高容量内毒素去除树脂(www.thermofisher.com/order/catalog/product/88270#/88270)、TOXINERASERTM内毒素去除树脂(www.genscript.com/kit/L00402-ToxinEraser_sup_TM_sup_Endotoxin_Removal_Resin.html)、PURKINETM内毒素去除树脂(www.abbkine.com/product/purkine-endotoxin-removal-resin-bmr21400/)、DETOXI-GELTM内毒素去除凝胶(www.thermofisher.com/order/catalog/product/20339#/20339)和PROMEGATM内毒素去除树脂(www.promega.com/products/nucleic-acid-extraction/plasmid-purification/endotoxin-removal-resin/？catNum＝A2191)。内毒素结合剂可为分子，例如多粘菌素B、聚赖氨酸或其衍生物、或合成的模拟肽。
如本文所用，术语“流穿液”是指穿过介质(例如，用于层析的介质，诸如内毒素结合剂)而不结合的一部分材料或一定体积的流体。可加入额外的流动相(例如，流体，诸如具有低盐(例如，小于50mM盐)或无盐(例如，氯化钠)的缓冲液)，以确保施加至介质的混合物的一种或多种组分完全加载到介质上并且实现分析物(例如，IαIp)与混合物中其他组分的初始或额外分离。
如本文所用，术语“间-α抑制剂蛋白”和“IαIp”及其复数形式是指结构相关的丝氨酸蛋白酶抑制剂家族中的多组分糖蛋白。IαIp已被证明在抑制一系列蛋白酶(包括嗜中性粒细胞弹性蛋白酶、纤溶酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶、颗粒酶K、前蛋白转化酶、弗林蛋白酶、组织蛋白酶G和顶体蛋白)方面很重要。在人血浆中，IαIp以相对较高的浓度(400mg/L至800mg/L)存在。与其他抑制剂分子不同，此抑制剂家族通常包括通过硫酸软骨素链共价连接的多肽链(轻链和重链)的组合。IαIp的重链(H1、H2和H3)也称为透明质酸(HA)结合蛋白。在人血浆中存在的IαIp的主要形式为间-α抑制剂(IαI)(其含有两条重链(H1和H2)和一条轻链(L))以及前-α抑制剂(PαI)(其含有一条重链(H3)和一条轻链(L))。另一种IαIp为轻链(也称为具有两个库尼茨结构域的双库尼茨抑制剂(bikunin))，已知其广泛抑制血浆丝氨酸蛋白酶。另一种IαIp为重链相关分子H4，其在血液中循环而不与双库尼茨抑制剂键合。又一种IαIp为重链相关分子H5。血浆级分中存在的IαI和PαI具有在约60kDa至约280kDa之间的表观分子量。
如本文所用，术语“药用赋形剂”意指一种或多种相容的固体或液体填料、稀释剂或包囊物质，其适合施用于人。赋形剂可含有添加剂，诸如增强等渗性和/或化学稳定性的物质。此类材料在所用的量和浓度下对接受者无毒，并且可包括：缓冲液，诸如磷酸盐、柠檬酸盐、琥珀酸盐、乙酸盐、乳酸盐、酒石酸盐和其他有机酸或其盐；三羟甲基氨基甲烷(Tris)、碳酸氢盐、碳酸盐和其他有机碱及其盐；抗氧化剂，诸如抗坏血酸；低分子量(例如，少于约十个残基)多肽，例如聚精氨酸、聚赖氨酸、聚谷氨酸和聚天冬氨酸；蛋白质，诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚丙二醇(PPG)和聚乙二醇(PEG)；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、组氨酸、赖氨酸或精氨酸；单糖、双糖和其他碳水化合物，包括纤维素或其衍生物、葡萄糖、甘露糖、蔗糖、糊精或硫酸化碳水化合物衍生物诸如肝素、硫酸软骨素或硫酸葡聚糖；多价金属离子，诸如二价金属离子，包括钙离子、镁离子和锰离子；螯合剂，诸如乙二胺四乙酸(EDTA)；糖醇，诸如甘露醇或山梨糖醇；抗衡离子，诸如钠或铵；和/或非离子表面活性剂，诸如聚山梨醇酯或泊洛沙姆。还可以包括其他添加剂，诸如稳定剂、抗微生物剂、惰性气体、液体和营养补充剂(即林格氏右旋糖)、电解质补充剂等，它们可以常规的量存在。
如本文所用，术语“预防(prevent/preventing/prevention)”、“预防性治疗”等是指降低未患有疾病、疾患或病症但有发生疾病、疾患或病症的风险或易患疾病、疾患或病症的受试者发生疾患或病症的可能性。
如本文所用，术语“经处理的”是指在根据本文所述的方法使材料与内毒素结合剂接触之前已经使用一个或多个样品制备步骤(例如，过滤、离心、沉降、层析等)进行修饰的生物材料。处理的其他实例包括倾析步骤、澄清步骤、冷冻步骤、干燥步骤、蒸发步骤、提取步骤、过滤步骤、沉淀步骤或本领域已知的其他纯化或制备方法。工艺步骤可去除生物材料中的一种或多种物质(例如，蛋白质或IαIp以外的物质)的多达例如10％或更多(w/w)(例如，10％至30％(w/w)，诸如15％、20％、25％或30％(w/w)或更多)。
如本文所用，术语“纯化(purify/purifying/purification)”是指从含有IαIp和其他蛋白质和/或物质的异源混合物(例如，生物材料，诸如血液或乳)中去除蛋白质(例如，IαIp以外的蛋白质)和/或非蛋白质物质(例如，磷脂和核酸)以产生含有IαIp而不含原始混合物(例如，生物材料)中存在的其他蛋白质和/或物质或其中IαIp以外的蛋白质和/或物质相对于例如起始混合物(例如，生物材料)已按重量减少40％或更多(例如50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、97％或99％或更多)的组合物。可从含有IαIp的混合物中去除的蛋白质的实例包括但不限于α-1抗胰蛋白酶、C1-抑制剂、白蛋白、球蛋白(包括免疫球蛋白，例如，IgA、IgG(例如，静脉内Ig(IVIg)、抗-D IgG、乙型肝炎IgG、麻疹IgG、狂犬病IgG、破伤风IgG和水痘带状疱疹IgG)、IgM、IgD和IgE)、纤维蛋白原(因子I)、凝血酶原(因子II)、凝血酶、抗凝血酶III、因子III、因子V、因子VII、因子VIII、因子IX、因子X、因子XI、因子XII、因子XIII、纤连蛋白、α-2纤溶酶抑制剂、尿激酶、蛋白C、蛋白S、蛋白Z、蛋白Z相关蛋白酶抑制剂、纤溶酶原、组织纤溶酶原激活物、纤溶酶原激活物抑制剂-1、纤溶酶原激活物抑制剂-2、血管性血友病因子、因子H、前激肽释放酶、高分子量激肽原和肝素辅因子II。
如本文所用，术语“纯”或“纯度”是指分析物已被分离并且不含其他组分的程度。在蛋白质的背景下，分离的蛋白质的纯度可相对于不含任何污染物(例如，一种或多种不相关的蛋白质或其他物质)的蛋白质来表示。例如，IαIp组合物的纯度指示按分离的材料的总重量计组合物中的IαIp的含量，其可以使用例如纯IαIp作为参考来确定。在本公开中发现的纯度水平可为5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、大于95％或大于99％(w/w)。本公开的“纯”IαIp组合物可为按重量计纯度大于20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％或高达70％。“基本上纯的”IαIp组合物可基本上不含污染物或杂质，例如按重量计纯度大于70％、75％、80％、85％、90％、95％或>99％。在一些实施例中，污染物或杂质的水平不超过约20重量％、15重量％、12重量％、10重量％、9重量％、8重量％、7重量％、6重量％、5重量％、4重量％、3重量％、2重量％或1重量％。纯度可通过使用免疫测定或其他技术(例如MAb 69.26–肝素-生物素夹心ELISA、SDS/PAGE和/或蛋白质印迹)检测特定分析物(例如，IαIp)的水平并且计算相对于总蛋白质含量(例如，如通过总蛋白质测定法(例如，二喹啉甲酸测定法(BCA)、Bradford测定法、双缩脲试验或本领域已知的其他测定法所确定)的分析物的百分比(w/w)来确定。
如本文所用，术语“受试者”是指哺乳动物，包括但不限于人或非人哺乳动物，诸如灵长类动物、牛、马、猪、羊、猫或犬。受试者可以为患者。
如本文所用，术语“基本上未经处理的”是指已相对于原始源材料(例如，血液)经过极少修饰(如果有的话)的生物材料。例如，基本上未经处理的生物材料可保留原始源材料的原始含量(例如，相同的蛋白质和/或物质和/或两种或更多种蛋白质或物质的相同比率)和/或原始特征(例如，一种或多种生物活性)。生物材料可为基本上未经处理的，使得用该材料执行的任何一个或多个先前纯化步骤去除该材料中的一种或多种蛋白质或物质的少于10％(w/w)(例如，少于0.1％至10％(w/w)，诸如少于0.1％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％或9％(w/w))。基本上未经处理的生物材料可以为(特别是例如在根据本文所述的方法使生物材料与内毒素结合剂接触之前)尚未使用样品制备步骤(例如，过滤、离心、沉降、层析等)修饰的材料。
如本文所用，短语“特异性结合”是指分析物(例如，蛋白质，诸如IαIp)与结合剂(例如，内毒素结合剂)之间的结合反应。特异性结合反应是一种即使在异源蛋白质和其他生物分子群(例如，生物材料中IαIp以外的蛋白质)存在下也发生在分析物与结合剂之间的反应。分析物(例如，IαIp)与结合剂(例如，内毒素结合剂)之间的特异性结合的特征可在于小于约1000nM(例如，在1pM与1000nM之间)的Kd。不与结合剂(例如，内毒素结合剂)特异性结合的分析物(例如，IαIp)的特征可在于大于约1000nM(例如，大于1μM、100μM、500μM或1mM)的Kd。
如本文所用，术语“支持物”意指含有可与含有至少一种分析物(例如，IαIp)的材料(例如，生物材料)接触的试剂(例如，内毒素结合剂)的任何装置。支持物可以为柱、膜、圆盘、芯片或其他用于层析或亲和捕获的装置，其实例是本领域已知的并且描述于本文中。
如本文所用，术语“治疗”是指减少或改善疾患和/或与其相关联的一种或多种症状。应当理解，治疗疾患或病症不需要与其相关联的疾患或症状被完全消除(尽管不排除)。
如本文所用，术语“产率”是指与起始材料(例如，生物材料)中的分析物的量相比，在纯化步骤或工艺后获得的分析物(例如，IαIp)的相对量(w/w)。产率可以用百分比来表示。在本公开的上下文中，起始材料中的分析物(例如，IαIp)和纯化步骤后获得的分析物的量可使用免疫测定法或测定法(例如，抗IαIp抗体(例如，MAb 69.26)–肝素-生物素夹心ELISA、SDS/PAGE和/或蛋白质印迹)来测量。本公开的方法可用于产生相对于存在于原始生物材料中的量的约20％(w/w)或更大的纯化IαIp的产率。例如，这些方法可用于产生约25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、65％、70％、75％、80％、85％或90％(w/w)或更大的纯化IαIp的产率。
附图说明
图1A和1B为示出在从去冷沉淀血浆中层析分离IαIp期间获得的起始材料、流穿液、洗涤级分和洗脱级分的图像。在4％至15％Mini-TGX Stain-Free(BioRad)SDS-PAGE凝胶上分离起始材料、流穿液、洗涤级分和洗脱物(图1A)并且转移至硝酸纤维素膜上进行蛋白质印迹分析(图1B)。使用针对IαIp(Mab 69.26)和生物素缀合肝素的单克隆抗体检测IαIp。IαIp的125kDa和250kDa条带两者(分别对应于PαI和IαI)在使用Q阴离子交换树脂的去冷沉淀血浆的洗脱级分(图1A中的箭头，泳道5)和使用内毒素结合剂(ETOXICLEARTM；图1A中的箭头，泳道10)的经处理的去冷沉淀血浆的洗脱级分中均检出。SDS-PAGE凝胶和蛋白质印迹的泳道1至6对应于使用去冷沉淀血浆作为起始材料的Q-阴离子交换层析的结果，而泳道7至12对应于使用Q-阴离子交换层析的洗脱物作为起始材料用内毒素结合剂进行纯化的结果。泳道如下：泳道1：起始材料–去冷沉淀血浆；泳道2：来自Q阴离子交换树脂的流穿液；泳道3：洗涤级分1(pH 7.2,250mM NaCl)；泳道4：洗涤级分2(pH5.2,175mM NaCl)；泳道5：来自Q阴离子交换树脂的洗脱物(pH 7.2,750mM NaCl)；泳道6：从Q阴离子交换树脂净化(1M NaOH+2M NaCl)；泳道7：来自内毒素结合剂的流穿液；泳道8：洗涤级分1(pH 5.2,150mM NaCl)；泳道9：洗涤级分2(pH 7.2,300mM NaCl)；泳道10：洗脱物级分1(pH 7.2,500mM NaCl)；泳道11：洗脱物级分2(pH 7.2,1,000mM NaCl)；泳道12：从内毒素结合剂净化(1M NaOH+2M NaCl)。
图2为示出使用内毒素结合剂(DETOXI-GELTM)和15mM磷酸盐缓冲液(pH 7.3)从人血浆中层析分离IαIp的层析谱。在用箭头指示的峰中检测到IαIp。y轴示出吸光度(A280)，并且x轴示出时间(分钟)。
图3为示出使用内毒素结合剂(DETOXI-GELTM)和15mM磷酸盐缓冲液(pH 5.5)从人血浆中层析分离IαIp的层析谱。在用箭头指示的峰中检测到IαIp。y轴示出吸光度(A280)，并且x轴示出时间(分钟)。
图4为示出使用内毒素结合剂(DETOXI-GELTM)和20mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.2)从人血浆中层析分离IαIp的层析谱。在用箭头指示的峰中检测到IαIp。y轴示出吸光度(A280)，并且x轴示出时间(分钟)。
图5A和5B为示出在从去冷沉淀血浆中层析分离IαIp期间获得的起始材料、流穿液、洗涤级分和洗脱级分的图像。在4％至20％ TGX Stain-Free(BioRad)预制SDS-PAGE凝胶上分离起始材料、流穿液、洗涤级分和洗脱物(图5A)并且转移至硝酸纤维素膜上进行蛋白质印迹分析(图5B)。使用针对IαIp(Mab 69.26)和HRP缀合链霉抗生物素蛋白的生物素化单克隆抗体检测IαIp。IαIp的125kDa和250kDa条带两者(分别对应于PαI和IαI)在使用Q阴离子交换树脂的去冷沉淀血浆的洗脱级分(图5B中的箭头，泳道5)和使用内毒素结合剂(ETOXICLEARTM；图5B中的箭头，泳道6至7)的去冷沉淀血浆的洗脱级分中均检出。SDS-PAGE凝胶和蛋白质印迹的泳道1至5对应于使用去冷沉淀血浆作为起始材料的Q-阴离子交换层析的结果，而泳道6至7对应于使用Q-阴离子交换层析的洗脱物作为起始材料用内毒素结合剂进行纯化的结果。泳道如下：泳道1：起始材料–去冷沉淀血浆；泳道2：来自Q阴离子交换树脂的流穿液；泳道3：洗涤级分1(pH 7.2,250mM NaCl)；泳道4：洗涤级分2(pH 5.2,150mMNaCl)；泳道5：来自Q阴离子交换树脂的洗脱物(pH 7.2,750mM NaCl)；泳道6：洗脱物级分1(pH 7.2,400mM NaCl)；泳道7：洗脱物级分2(pH 7.2,500mM NaCl)。
图6A和6B为示出在IαIp从去冷沉淀血浆中层析分离期间获得的起始材料、流穿液、洗涤级分和洗脱级分的图像。在4％至20％ TGX Stain-Free(BioRad)预制SDS-PAGE凝胶上分离起始材料、流穿液、洗涤级分和洗脱物(图6A)并且转移至硝酸纤维素膜上进行蛋白质印迹分析(图6B)。使用针对IαIp(Mab 69.26)和HRP缀合链霉抗生物素蛋白的生物素化单克隆抗体检测IαIp。IαIp的125kDa和250kDa条带两者(分别对应于PαI和IαI)在使用Q阴离子交换树脂的去冷沉淀血浆的洗脱级分(图6B中的箭头，泳道5)和使用内毒素结合剂(ETOXICLEARTM；图6B中的箭头，泳道9)的去冷沉淀血浆的洗脱级分中均检出。SDS-PAGE凝胶和蛋白质印迹的泳道1至7对应于使用去冷沉淀血浆作为起始材料的Q-阴离子交换层析的结果，而泳道8至12对应于使用Q-阴离子交换层析的洗脱物作为起始材料用内毒素结合剂进行纯化的结果。泳道如下：泳道1：起始材料–去冷沉淀血浆；泳道2：来自Q阴离子交换树脂的流穿液；泳道3：洗涤级分1(pH 7.2,250mM NaCl)；泳道4：洗涤级分2(pH 5.2,150mMNaCl)；泳道5：来自Q阴离子交换树脂的洗脱物级分1(pH 7.2,750mM NaCl)；泳道6：来自Q阴离子交换树脂的洗脱物级分2(pH 7.2,1000mM NaCl)；泳道7：从Q阴离子交换树脂净化(1MNaOH+2M NaCl)；泳道8：来自内毒素结合剂的流穿液和洗涤级分(pH 5.2,150mM NaCl)；泳道9：洗脱物级分1(pH 7.2,500mM NaCl)；泳道10：洗脱物级分2(pH 7.2,1,000mM NaCl)；泳道11：从内毒素结合剂净化(1M NaOH+2M NaCl)；泳道12：缓冲液交换和超滤(MilliporeUltracell 30kDa截止离心膜)后的浓缩洗脱物级分1。
具体实施方式
本公开的特征在于通过使用内毒素结合剂从生物材料(例如，血液)中纯化IαIp(例如，IαI、PαI、重链(例如，H1、H2、H3、H4和/或H5)、轻链(例如，双库尼茨抑制剂)或其组合)的方法。这些方法涉及将含有IαIp的生物材料(例如，经处理的或基本上未经处理的生物材料，诸如血液或乳)施加至内毒素结合剂。我们发现内毒素结合剂，诸如内毒素特异性层析树脂(例如，ETOXICLEARTM和DETOXI-GELTM)结合IαIp，这一结果出乎意料。令人惊讶的是，当在纯化IαIp的工艺中使用内毒素结合剂时，相对于其他方法，减少了IαIp在纯化期间的损失，从而保持或改善回收的IαIp的产率。此外，使用内毒素结合剂作为IαIp纯化工艺的一部分也保持或改善了回收的IαIp的纯度。
因此，我们使用此类内毒素结合剂例如从生物来源(诸如血液)中纯化IαIp。此外，当使用内毒素结合剂作为纯化工艺的一部分时，可获得高达50％或更高(例如，高达90％或更高)的IαIp的产率和纯度。当采用本公开的方法时，该发现可用于简化纯化工艺并且同时提高IαIp的产量和纯度。
其特征还在于使用通过本文所述的方法获得的纯化的IαIp制备的药物组合物，以及通过施用使用通过本文所述的方法获得的纯化的IαIp所制备的药物组合物来治疗和/或降低有此需要的受试者发生疾病或病症的可能性的方法。
纯化方法
内毒素结合剂可用于从生物材料(例如，血液和乳)中纯化IαIp(例如，IαI、PαI、重链(例如，H1、H2、H3、H4和/或H5)、轻链(例如，双库尼茨抑制剂)或其组合)。下文描述的方法可用于将IαIp与存在于生物材料中的其他组分分离。这些方法可用于制备纯度范围为约5％至约99％或更大(例如，5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、大于95％诸如97％或99％、或大于99％)的IαIp。此外，这些方法可用于产生相对于存在于原始生物材料中的量的约20％(w/w)或更大的纯化IαIp的产率。例如，这些方法可用于产生约20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、65％、70％、75％、80％、85％或90％(w/w)或更大的纯化IαIp的产率。
生物材料
下文的方法可用于从生物材料中纯化IαIp。含有IαIp的生物材料可获自人、灵长类动物、牛、马、猪、羊、猫、犬或其组合。生物材料可为例如血液、乳(例如，初乳)、尿液、痰和脑脊液。例如，生物材料可以为但不限于全血浆、去冷沉淀血浆、液态血浆、新鲜冷冻血浆(FFP)、FFP24、冷冻血浆(FP)、FP24、解冻FFP、解冻FFP24、解冻FP、解冻FP24、原料血浆、回收血浆、溶剂/去污剂处理血浆(SDP)、富血小板血浆(PRP)、贫血小板血浆(PPP)、血清、血液(例如，全血)及其稀释或浓缩制剂。含有IαIp的生物材料可以为但不限于血浆级分中间体。血浆级分中间体通过一个或多个工艺步骤(例如，过滤、离心、沉降、层析、吸附、分离、冷冻、解冻、稀释、浓缩、S/D处理等)从全血浆、去冷沉淀血浆、液态血浆、新鲜冷冻血浆(FFP)、FFP24、冷冻血浆(FP)、FP24、解冻FFP、解冻FFP24、解冻FP、解冻FP24、原料血浆、回收血浆、溶剂/去污剂处理血浆(SDP)、富血小板血浆(PRP)、贫血小板血浆(PPP)、血清、血液(例如，全血)及其稀释或浓缩制剂产生。
生物材料也可以为使用表达IαIp的细胞制备的提取物，或者可以为或含有分泌IαIp的细胞，例如已被修饰以表达IαIp的重组细胞。
除IαIp以外，生物材料还可以含有蛋白质(诸如血液中存在的三种或更多种蛋白质或乳(例如，初乳)中存在的三种或更多种蛋白质)的混合物。例如，生物材料可以含有α-1抗胰蛋白酶、C1-抑制剂、白蛋白、球蛋白(诸如免疫球蛋白，例如，IgA、IgG(例如，静脉内Ig(IVIg)、抗-D IgG、乙型肝炎IgG、麻疹IgG、狂犬病IgG、破伤风IgG和水痘带状疱疹IgG)、IgM、IgD和IgE)、纤维蛋白原(因子I)、凝血酶原(因子II)、凝血酶、抗凝血酶III、因子III、因子V、因子VII、因子VIII、因子IX、因子X、因子XI、因子XII、因子XIII、纤连蛋白、α-2纤溶酶抑制剂、尿激酶、蛋白C、蛋白S、蛋白Z、蛋白Z相关蛋白酶抑制剂、纤溶酶原、组织纤溶酶原激活物、纤溶酶原激活物抑制剂-1、纤溶酶原激活物抑制剂-2、血管性血友病因子、因子H、前激肽释放酶、高分子量激肽原和肝素辅因子II。生物材料可以为乳(例如，初乳)，其可以含有一种或多种乳清(例如，多达约50％至80％(w/w)；例如，β-乳球蛋白(例如，约1％至5％(w/w))、α-乳清蛋白(例如，约0.5％至2％(w/w))、白蛋白、卵清蛋白和球蛋白(例如，免疫球蛋白，诸如IgA、IgG(例如，IVIg)、IgM、IgD和IgE，例如，约0.01％至1％(w/w))、酪蛋白(例如，α-酪蛋白和/或β-酪蛋白；例如，多达约3％至35％(w/w))、乳铁蛋白(例如，约0.01％至0.2％(w/w)、乳糖、α-1抗胰蛋白酶、抗胰凝乳蛋白酶、纤溶酶原、纤维蛋白原、生长因子和细胞因子)。
根据下文所述的方法，接触或施加至内毒素结合剂(或本文所述的不同支持物，诸如阴离子交换层析支持物)的生物材料可为基本上未经处理的(例如，原始源材料)，或者生物材料可在接触或施加至内毒素结合剂之前经过处理，例如通过使用一种或多种样品制备方法或其他已知的纯化方法(诸如本文所述的那些)进行处理。
基本上未经处理的生物材料是相对于原始源材料(例如，血液或其他来源，如本文所述)经过极少修饰(如果有的话)以使得该生物材料保持源材料的原始特性的材料。例如，基本上未经处理的生物材料可以在该材料接触或施加至内毒素结合剂之前经受一个或多个样品制备或纯化步骤，从该材料中去除少于10％(w/w)(例如，少于0.1％至10％(w/w)，诸如少于0.1％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％或9％(w/w))的一种或多种物质。替代性地，基本上未经处理的生物材料可为来自一个或多个先前纯化步骤的洗脱物或级分，其中所述一个或多个先前纯化步骤从材料中去除少于10％的杂质。
在将生物材料施加至内毒素结合剂(或施加至本文所述的不同支持物，诸如阴离子交换层析支持物)之前，生物材料还可以经受一个或多个工艺步骤(诸如本文所述的那些)。例如，在使用内毒素结合剂的纯化步骤之前，可从生物材料中部分地去除(例如，去除1％至70％(w/w))或基本上去除(例如，去除大于70％至100％(w/w))该生物材料(例如，血液或乳)中存在的一种或多种蛋白质，诸如，例如α-1抗胰蛋白酶、C1-抑制剂、白蛋白、球蛋白(诸如免疫球蛋白，例如，IgA、IgG(例如，静脉内Ig(IVIg)、抗-D IgG、乙型肝炎IgG、麻疹IgG、狂犬病IgG、破伤风IgG和水痘带状疱疹IgG)、IgM、IgD和IgE)、纤维蛋白原(因子I)、凝血酶原(因子II)、凝血酶、抗凝血酶III、因子III、因子V、因子VII、因子VIII、因子IX、因子X、因子XI、因子XII、因子XIII、纤连蛋白、α-2纤溶酶抑制剂、尿激酶、蛋白C、蛋白S、蛋白Z、蛋白Z相关蛋白酶抑制剂、纤溶酶原、组织纤溶酶原激活物、纤溶酶原激活物抑制剂-1、纤溶酶原激活物抑制剂-2、血管性血友病因子、因子H、前激肽释放酶、高分子量激肽原和肝素辅因子II。
本公开的方法可用于从含有三至十种(或更多种)上述血液蛋白的生物材料制备IαIp(例如，IαI、PαI、重链(例如，H1、H2、H3、H4和/或H5)、轻链(例如，双库尼茨抑制剂)或其组合)。所公开的方法也可用于从含有三至十种、三至十五种、三至二十种、三至二十五种、三至三十种、十至二十种、十至二十五种、十至三十种、十五至二十五种、十五至三十种、二十至三十种、或三十或更多种不同蛋白质(例如，血液或乳蛋白质)的生物材料中分离IαIp。除IαIp以外，施加至内毒素结合剂的生物材料还可以含有按该生物材料中的蛋白质的总重量计约40％至65％(例如，约55％)白蛋白、按蛋白质的总重量计约25％至45％(例如，约38％)球蛋白、按蛋白质的总重量计约2％至12％(例如，约7％)纤维蛋白原或按蛋白质的总重量计的它们的任意组合。
内毒素结合剂
本文所述的方法涉及使用内毒素结合剂，该内毒素结合剂可用于与蛋白质混合物中的IαIp(例如，生物材料诸如乳或血液中存在的IαIp)结合。内毒素结合剂为已知可以与内毒素结合的分子，诸如脂多糖。内毒素结合剂可以为与内毒素特异性结合的结合剂。内毒素结合剂可以例如掺入或固定在支持物上。支持物可以为整体支持物或基于颗粒的支持物。颗粒可为例如树脂。内毒素结合剂可包装或固定在任意数量的已知支持物(例如，柱、膜、圆盘或芯片)上。内毒素结合剂可为分子，例如多粘菌素B、聚赖氨酸或其衍生物、或合成的模拟肽。
在本文所述的方法中可以使用的内毒素结合剂的非限制性实例包括例如ETOXICLEARTM、PIERCETM高容量内毒素去除树脂、TOXINERASERTM内毒素去除树脂、PURKINETM内毒素去除树脂、DETOXI-GELTM内毒素去除凝胶和PromegaTM内毒素去除树脂。这些方法可使用例如含有内毒素结合剂的预包装柱或筒(例如，具有约0.1mL至约100mL体积的柱，或具有更大体积的柱)来执行。
可制备含有内毒素结合剂的柱，例如，通过将悬浮于缓冲液(例如，去离子水)中的内毒素结合剂的浆料施加至多孔滤芯柱(例如，约2mL至约100mL或更大的柱)并且使内毒素结合剂沉降约30分钟。然后可以在施加生物材料之前将沉降的树脂用约3倍至约5倍柱体积的合适的无热原缓冲液或水(例如，去离子水)平衡。
在一些实例中，将DETOXI-GELTM内毒素去除凝胶用作内毒素结合剂的来源。DETOXI-GELTM使用固定化多粘菌素B来结合内毒素的脂质A结构域。在另一实例中，将ETOXICLEARTM用作内毒素结合剂。
用于纯化方法的试剂
稀释缓冲液
在纯化步骤之前(诸如在使生物材料接触或将其施加至介质诸如内毒素结合剂之前)，可以将含有IαIp(例如，IαI、PαI)的生物材料与稀释缓冲液合并。可添加稀释缓冲液以降低生物材料的盐(例如，NaCl)浓度，例如以避免或降低IαIp从内毒素结合剂中提早洗脱的可能性。可以将生物材料用稀释缓冲液按例如1:1至1:10(v/v)(例如，1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9或1:10(v/v)，诸如1:3(v/v))稀释，然后使其接触或将其施加至介质(例如，内毒素结合剂)。
稀释缓冲液可具有约4.5至8.5的pH范围(例如，约4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4或约8.5)。稀释缓冲液可含有去离子水、甘氨酸、乙酸、柠檬酸、磷酸盐、氯化钠(NaCl)、钙、镁、EDTA和Tris-HCl中的一种或多种。用于加载生物材料的稀释缓冲液可具有低浓度的盐诸如NaCl(例如，300mM或更少的盐(例如，NaCl，诸如200mM、150mM、100mM、75mM、50mM、25mM、10mM、5mM或0mM盐(例如NaCl))。例如，可将含有IαIp的生物材料用含有20mM Tris-HCl的缓冲液按1:3(v/v)稀释，并且可使稀释的材料接触或将其施加至内毒素结合柱。生物材料可为例如在先前纯化步骤(例如，层析步骤，诸如使用阴离子交换支持物的步骤)期间制备的材料。稀释缓冲液可为水。
上样缓冲液
在纯化步骤之前(诸如在使生物材料接触或将其施加至介质诸如内毒素结合剂、阴离子交换剂之前)，可以调节含有IαIp(例如，IαI、PαI)的生物材料的pH和电导率。含有生物材料的上样缓冲液可具有约4.5至8.5的pH范围(例如，约4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4或约8.5)。上样缓冲液可含有去离子水、甘氨酸、乙酸、柠檬酸、磷酸盐、氯化钠(NaCl)、钙、镁、EDTA和Tris-HCl中的一种或多种。上样缓冲液可具有低浓度的盐诸如NaCl(例如，300mM或更少的盐(例如，NaCl，诸如200mM、150mM、100mM、75mM、50mM、25mM、10mM、5mM或0mM盐(例如NaCl))。缓冲液可含有约20mM Tris-HCl和200mM NaCl。上样缓冲液可为例如在先前工艺步骤(例如，层析步骤(诸如使用阴离子交换支持物的步骤)、过滤步骤)期间制备的缓冲液。上样缓冲液可具有约10mS/cm至约30mS/cm、约15mS/cm至约25mS/cm或约20mS/cm的电导率。
流穿液缓冲液
可任选地使用流穿液缓冲液以确保在纯化步骤期间将所有生物材料加载到介质(例如，内毒素结合剂或本文所述的其他支持物)上。流穿液缓冲液也可用于在施加至介质后实现存在于生物材料中的组分的初始或额外分离。流穿液缓冲液可与稀释缓冲液相同。替代性地，流穿液缓冲液可与稀释缓冲液不同。
例如，流穿液缓冲液相对于用于将生物材料加载到介质上的稀释缓冲液，可具有相同或不同的pH(例如，在约4.5至约8.5范围内的pH(例如，约4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4或约8.5)和/或不同的组分构成(例如，约5mM至约300mM甘氨酸、乙酸、柠檬酸、磷酸盐、NaCl、钙、镁、EDTA和Tris-HCl中的一种或多种)。流穿液缓冲液具有的盐浓度可高于稀释缓冲液的盐浓度(例如，盐(例如，NaCl)浓度比稀释缓冲液的盐浓度高5mM至约300mM(例如，方法可涉及在使用包含少于150mM NaCl的稀释缓冲液诸如不含NaCl的稀释缓冲液后，使用包含约150mM NaCl的流穿液缓冲液)。可选择流穿液缓冲液的特性以在纯化步骤期间(例如，在柱层析步骤期间)改善生物材料的组分之间的初始分离。
洗涤缓冲液
纯化方法还可包括在一个或多个洗涤步骤(例如，1、2、3、4个或更多洗涤步骤)中使用的洗涤缓冲液，这些洗涤步骤发生在例如使生物材料接触或将其施加至内毒素结合剂之后或在如本文所述的一个或多个其他纯化步骤期间。可执行一个或多个洗涤步骤，以去除可能存在于内毒素结合剂或其他介质(例如阴离子交换剂)中但与之结合不太强(例如，弱结合，例如以约1mM或更大的Kd)的组分(例如，存在于生物材料中的并非IαIp的蛋白质或其他物质)。
施加至介质(例如，内毒素结合剂或本文所述的其他类型的支持物)的洗涤缓冲液可用于改变介质的pH、改变介质的盐浓度或改变介质的pH和盐浓度两者。施加至介质的第一洗涤缓冲液可改变pH，而施加至介质的第二洗涤缓冲液可改变盐浓度，反之亦然。使用洗涤缓冲液的一个或多个洗涤步骤可通过促进IαIp以外的蛋白质从介质中释放，从而有利于IαIp的纯化。
洗涤缓冲液在组分或其他特性(例如，pH、电导率或盐浓度)方面可能不同于流穿液缓冲液、稀释缓冲液或上样缓冲液。例如，洗涤缓冲液可含有比流穿液缓冲液或稀释缓冲液中的盐浓度更高的盐浓度(例如，NaCl)。如果洗涤缓冲液中的盐浓度与流穿液或稀释缓冲液相同，则洗涤缓冲液在其pH或其一种或多种组分方面可能有所不同。例如，在纯化方法中使用的流穿液缓冲液可含有20mM Tris-HCl+150mM NaCl(pH 7.2)，而洗涤缓冲液可含有75mM甘氨酸+100mM乙酸+150mM NaCl(pH 5.2)。例如，在纯化方法中使用的上样缓冲液可含有约18mM Tris-HCl+约2mM Tris+约200mM NaCl(约pH 7.2)，而第一洗涤缓冲液含有约18mM Tris-HCl+约2mM Tris+约250mM NaCl(pH 7,2)，而第二洗涤缓冲液可含有约75mM甘氨酸+约100mM HAc+约150mM NaCl+约92.5mM NaOH(约pH 5.2)。例如，在纯化方法中使用的上样缓冲液可含有约18mM Tris-HCl+约2mM Tris+约200mM NaCl(约pH 7.2)，而第一洗涤缓冲液含有约75mM甘氨酸+约100mM HAc+约200mM NaCl(约pH5.2)，而第二洗涤缓冲液可含有约18mM Tris-HCl+约2mM Tris+约250mM NaCl(约pH 7.2)。
洗涤缓冲液可具有在约4.5至约8.5范围内(例如，约4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4或约8.5)的pH。洗涤缓冲液可具有约5.2的pH。洗涤缓冲液可具有约7.2的pH。洗涤缓冲液还可含有约5mM至约400mM甘氨酸、乙酸、柠檬酸、磷酸盐、氯化钠(NaCl)、钙、镁、EDTA和Tris-HCl中的一种或多种。例如，洗涤缓冲液可具有约50mM至约400mM的盐(例如，NaCl)浓度。例如，洗涤缓冲液可具有约200mM至约300mM的盐(例如，NaCl)浓度。例如，洗涤缓冲液可具有约250mM、约250mM或约300mM的盐(例如，NaCl)浓度。例如，洗涤缓冲液可具有约200mM至约300mM NaCl。例如，洗涤缓冲液可具有约200mM NaCl、约250mM NaCl或约300mM NaCl。还可以制备具有不同于先前在纯化工艺中使用的其他缓冲液(例如，稀释缓冲液、流穿液缓冲液和/或一种或多种先前洗涤缓冲液)的pH的洗涤缓冲液。
在纯化方法中使用的洗涤缓冲液可含有不同的盐浓度，并且可以从低盐浓度洗涤缓冲液开始施加至介质，诸如内毒素结合剂、阴离子交换树脂，然后执行一个或多个后续洗涤步骤，所述一个或多个后续洗涤步骤在每个洗涤步骤中使用盐浓度增加的一种或多种洗涤缓冲液。
例如，第一洗涤步骤可涉及将具有低pH(例如，小于pH 7.0，诸如pH5.5或更低(例如，pH 5.2))和/或盐浓度(例如，盐(例如，NaCl)浓度小于150mM)的第一洗涤缓冲液施加至介质诸如内毒素结合剂(例如，第一洗涤缓冲液可含有75mM甘氨酸+100mM乙酸+150mM NaCl(pH5.2))，并且第二洗涤步骤可涉及将具有较高pH(例如，pH高于pH 7.0，诸如pH 7.2)和/或盐浓度(例如，盐(例如，NaCl)浓度大于150mM(例如，约300mM))的第二洗涤缓冲液施加至介质(例如，第二洗涤缓冲液可含有20mM Tris-HCl+300mM NaCl(pH 7.2))。在另一实例中，第一个洗涤步骤可使用含有15mM磷酸盐+50mM NaCl(pH 5.5)的洗涤缓冲液，而后续洗涤步骤可使用含有15mM磷酸盐+100mM NaCl(pH 5.5)的第二洗涤缓冲液。
洗脱缓冲液
纯化方法还可包括从介质(例如，内毒素结合剂或其他试剂，诸如阴离子交换树脂)中收集含有IαIp的洗脱物。该方法涉及使洗脱物或洗脱缓冲液接触或将其施加至介质(例如，内毒素结合剂、阴离子交换树脂)并且收集洗脱物。
可以用足够高的盐(例如，氯化钠(NaCl))浓度(例如，大于约200mM盐(例如，NaCl)(例如，250mM、300mM、350mM、375mM、400mM、450mM、500mM、550mM、600mM、650mM、700mM、750mM、800mM、850mM、900mM、950mM或1,000mM盐(例如，NaCl))制备洗脱缓冲液，使得结合IαIp可从介质(例如，内毒素结合剂、阴离子交换树脂)中释放。洗脱缓冲液可含有与先前描述的缓冲液(例如，稀释缓冲液、上样缓冲液、流穿液缓冲液和一种或多种洗涤缓冲液)相同的组分，或者洗脱缓冲液可含有一种或多种不同的组分(例如，洗脱缓冲液可含有约5mM至约300mM甘氨酸、乙酸、柠檬酸、磷酸盐和Tris-HCl中的一种或多种)。可使用其他盐或添加剂代替NaCl，例如同等浓度的钙、镁或EDTA。洗脱缓冲液的pH值也可以与先前接触或施加至介质(例如，内毒素结合剂)的缓冲液(例如，稀释和/或洗涤缓冲液)相同，或者洗脱缓冲液的pH值可能不同(例如，洗脱缓冲液可具有在约4.5至约8.5范围内(例如，约4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4或8.5)的pH)。洗脱缓冲液中的盐(例如，NaCl)浓度可能高于先前施加至介质(例如，内毒素结合剂)的一种或多种洗涤缓冲液中的盐(例如，NaCl)浓度。洗脱缓冲液的pH可以为约7.2。例如，洗脱缓冲液可含有约400mM至约1,000mM NaCl。例如，洗脱缓冲液可含有约500mM NaCl、约750mM NaCl或1000mM NaCl。在一个优选实例中，通过将缓冲液施加至内毒素结合剂而将IαIp从内毒素结合剂中洗脱，该缓冲液含有20mM Tris-HCl+500mM NaCl(pH7.2)。可重复将洗脱缓冲液施加至内毒素结合剂一次或多次。施加至内毒素结合剂的洗脱缓冲液可以相同或不同。例如，施加至内毒素结合剂的第二或后续洗脱缓冲液相对于第一或先前洗脱缓冲液(例如，500mM NaCl)，可含有更高的盐浓度(例如，1,000mM NaCl)。如果需要，可使用例如ELISA或本领域已知的其他技术分别分析施加洗脱缓冲液后收集的级分中的IαIp的存在和浓度，然后任选地将其合并。或者，可以合并这些级分，然后分析IαIp的存在和浓度。
净化缓冲液
纯化方法还可包括任选的净化步骤，其中将净化缓冲液施加至介质以使该介质(例如，内毒素结合剂)再生以用于另一轮纯化。可制备具有足够高pH(例如，约12至约14)的净化缓冲液。净化缓冲液可含有约1M碱性溶质，例如氢氧化钠(NaOH)。任选地，净化缓冲液可另外含有约1M至约2M盐(例如，NaCl)。在一个优选实例中，净化缓冲液含有1M NaOH+2MNaCl(pH 14)。
使用内毒素结合剂纯化IαIp
可通过使含有IαIp的生物材料接触或将其施加至内毒素结合剂(例如，本文所述的内毒素结合剂中的一种或多种)，从生物材料中纯化IαIp。生物材料可直接施加至内毒素结合剂而不经稀释，或替代性地，生物材料可用稀释缓冲液(如上所述)稀释，然后施加至内毒素结合剂。例如，接触或施加至内毒素结合剂的生物材料(稀释或未稀释)的体积可以为例如约0.5倍至约20倍柱体积(或其他合适的体积)。
在将含有IαIp的生物材料施加至内毒素结合剂后，可任选地分析流穿液以确认其不含(或含有少于10％(w/w))IαIp。例如，可执行ELISA测定(例如，使用抗IαIp抗体，诸如MAb 69.26)或其他已知技术(例如，SDS-PAGE和/或蛋白质印迹或其他已知技术)。一旦已经确认流穿液不含或含有微小量的IαIp(例如，约30μg/mL或更少诸如约20μg/mL、10μg/mL、5μg/mL或1μg/mL或更少的量)，即可弃去流穿液。可以将额外的流穿液缓冲液(例如，以约1倍至约50倍柱体积的体积)施加至内毒素结合剂，以确保所有生物材料均加载到内毒素结合剂上。然后可弃去该流穿液(例如，如果需要，在确认流穿液中不存在(或存在微小量的)IαIp之后)。
接着，可执行一个或多个洗涤步骤(例如，2个、3个、4个或更多洗涤步骤)，以去除存在于生物材料中的与内毒素结合剂弱结合的非IαIp物质。在给定的洗涤步骤中，可施加约0.5倍至约10倍柱体积的洗涤缓冲液(或其他合适的体积)。如果需要，可分析所得洗涤级分(例如，使用ELISA或其他已知技术)，以确认其不含有(或含有少于例如10％(w/w))IαIp。如果在洗涤缓冲液流穿液中检测到大量IαIp(例如，10％(w/w)或更大)，则可根据需要处理该流穿液，以收集和纯化存在于该流穿液中的IαIp(例如，使用内毒素结合剂或本文所述的其他介质(例如，阴离子交换支持物))。
在执行一个或多个洗涤步骤之后，可通过将洗脱缓冲液(例如，约0.4倍至约5倍柱体积或其他合适的体积)施加至内毒素结合剂来收集含有IαIp的洗脱物。如果需要，可将多于一种(例如，2种、3种、4种或更多种)洗脱缓冲液施加至内毒素结合剂，以洗脱或确保洗脱所有IαIp。可使用例如ELISA或本领域已知的其他技术来分析洗脱物中IαIp的存在。如果需要，然后可以合并来自不同洗脱缓冲液的级分。
收集洗脱物后，可任选地通过将净化缓冲液(例如，约0.5倍至约5倍柱体积或其他合适的体积)施加至内毒素结合剂，以使内毒素结合剂再生，以供将来使用。如果需要，可分析所得一种或多种净化级分(例如，使用ELISA或其他已知技术)中IαIp的存在。
纯化工艺的每个步骤(例如，施加生物材料、一个或多个洗涤步骤和一个或多个洗脱步骤)可使用重力流或低压(例如，0psi至15psi)执行，以便产生约1mL/min至约10mL/min(例如，约1.0mL/min、1.5mL/min、2.0mL/min、2.5mL/min、3.0mL/min、3.5mL/min、4.0mL/min、4.5mL/min、5.0mL/min、5.5mL/min、6.0mL/min、6.5mL/min、7.0mL/min、7.5mL/min、8.0mL/min、8.5mL/min、9.0mL/min、9.5mL/min或10.0mL/min)的流速。在一些实例中，流速为约2mL/min。
如果需要，此工艺可重复一次或多次。替代性地，可使用本领域已知的技术(例如，浓缩、透析和/或冻干以及其他技术)从洗脱物级分进一步处理IαIp。替代性地，如果需要，含有IαIp的洗脱物级分可经受一个或多个额外的纯化步骤，如下文所讨论。
在使用内毒素结合剂后纯化IαIp
从内毒素结合剂洗脱后收集的含有IαIp的洗脱物级分可使用其他已知的纯化步骤(例如，下文“额外纯化步骤”下所述的步骤中的一个或多个)进行进一步纯化。例如，含有IαIp的洗脱物可经受一个或多个纯化步骤，诸如描述于例如US 2003/0190732、US 2011/0190194、US 2012/0053113和US 2014/0206844中的那些，这些专利各自以引用方式并入本文。此外，含有IαIp的洗脱物可使用如上所述的阴离子交换层析法进行进一步纯化。
使用内毒素结合剂之前的一个或多个纯化步骤
在使生物材料接触或将其施加至内毒素结合剂之前，可以对含有IαIp的生物材料进行处理。例如，可以使用一个或多个样品制备或纯化步骤来处理生物材料，所述步骤去除生物材料中的一种或多种物质(例如，蛋白质或IαIp以外的物质)的多达例如10％或更多(w/w)(例如，10％至30％(w/w)，例如15％、20％、25％或30％(w/w)或更多)。
工艺步骤可包括例如过滤、离心、沉降、层析、倾析步骤、澄清、冷冻、干燥、蒸发、提取、过滤、沉淀或本领域已知的其他纯化或制备方法。在一个优选实例中，方法涉及使用含有IαIp的生物材料执行阴离子交换层析(如下文所述)，随后使含有一种或多种由阴离子交换层析制备的IαIp的洗脱物接触或将其施加至内毒素结合剂，用于进一步纯化如上文和本文所述的IαIp。
先前纯化步骤或工艺步骤可涉及例如US 2003/0190732、US 2011/0190194、US2012/0053113和US 2014/0206844中描述的一种或多种纯化方法，这些专利各自以引用方式并入本文。
额外纯化步骤
可在使用内毒素结合剂纯化IαIp之前或之后(例如，通过使用阴离子交换层析支持物)将含有IαIp(例如，IαI、PαI、重链(例如，H1、H2、H3、H4和/或H5)、轻链(例如，双库尼茨抑制剂)或其组合)的生物材料(例如，去冷沉淀血浆、血浆级分中间体、血液制品)施加至一种或多种除含有内毒素结合剂的支持物以外的层析支持物。层析支持物可为整体支持物或基于颗粒的支持物。层析支持物可为柱、膜、圆盘或芯片。此外，层析支持物可为例如尺寸排阻层析支持物、离子交换层析支持物、亲和层析支持物或其组合。
例如，整体支持物或基于颗粒的支持物可含有固定化阴离子交换树脂。固定化阴离子交换树脂可为例如二乙基氨基乙烷(DEAE)或季胺(Q)(例如，Tosoh GigaCap Q650M)。
可将含有IαIp的生物材料直接施加至层析支持物(例如，阴离子交换层析支持物)。替代性地，可以如上所述用稀释缓冲液稀释生物材料，然后将其施加至支持物。例如，可将去冷沉淀血浆用含有例如20mM Tris-HCl+200mM NaCl(pH 7.2)的稀释缓冲液按1:3(v/v)稀释，然后施加至层析支持物(例如，以约0.5倍至约25倍柱体积的体积或其他合适的体积)。
在将生物材料施加至层析支持物后，可分离流穿液，并且任选地进行分析以确认其不含有(或含有少于10％(w/w))IαIp。例如，可执行ELISA测定或其他已知技术(例如，SDS-PAGE和/或蛋白质印迹或其他已知技术)。如果在流穿液中检测到大量IαIp(例如，10％(w/w)或更大)，则可根据需要处理该流穿液，以收集和纯化存在于该流穿液中的IαIp(例如，使用内毒素结合剂或本文所述的其他介质(例如，阴离子交换支持物))。一旦已经确认流穿液不含或含有微小量的IαIp(例如，约30μg/mL或更少诸如约20μg/mL、10μg/mL、5μg/mL或1μg/mL或更少的量)，即可弃去流穿液。
任选地，可制备流穿液缓冲液并且将其施加(例如，以约1倍至约50倍柱体积的体积或其他合适体积的体积)至层析支持物，以确保所有生物材料均加载到支持物上。然后可弃去该流穿液(例如，如果需要，在确认流穿液中不存在(或存在微小量的)IαIp之后)。
接着，可执行一个或多个洗涤步骤(例如，2个、3个、4个或更多)，以去除与层析支持物弱结合的生物材料的非IαIp物质。可以如上所述制备洗涤缓冲液。在给定的洗涤步骤中，可将约0.4倍至约10倍柱体积的洗涤缓冲液(或其他合适的体积)施加至层析支持物。如果需要，可分析所得洗涤级分(例如，使用ELISA或其他已知技术)，以确认其不含有(或含有少于例如10％(w/w))IαIp。如果在洗涤缓冲液流穿液中检测到大量IαIp(例如，10％(w/w)或更大)，则可根据需要处理该流穿液，以收集和纯化存在于该流穿液中的IαIp(例如，使用内毒素结合剂或本文所述的其他介质(例如，阴离子交换支持物))。
在一个实例中，通过将含有20mM Tris-HCl+250mM NaCl(pH 7.2)的缓冲液例如以约5倍至10倍(诸如约8倍或9倍)柱体积的体积施加至层析支持物(例如，TosohGigaCap Q650M柱)来执行第一洗涤步骤，随后通过将含有50mM甘氨酸+100mM乙酸+175mM NaCl(pH 5.2)的缓冲液例如以约2倍至6倍(诸如约4倍或5倍)柱体积施加至支持物来执行第二洗涤步骤。
然后可通过将洗脱物或洗脱缓冲液(例如，以约0.4倍至约10倍柱体积的体积或其他合适的体积)施加至层析支持物并且收集含有IαIp的洗脱物来获得含有IαIp的经处理的材料。洗脱缓冲液可按如上文结合内毒素结合剂纯化工艺所述的类似方式来制备并且施加至层析支持物。如果需要，可将多于一种(例如，2种、3种、4种或更多种)洗脱缓冲液施加至层析支持物，以洗脱或确保洗脱所有IαIp。可使用例如ELISA(或本领域已知的其他技术)来分析洗脱物中IαIp的存在。如果需要，然后可以合并来自不同洗脱缓冲液的级分。
在一个实例中，将含有20mM Tris-HCl+750mM NaCl(pH 7.2)的洗脱缓冲液以例如约2倍至5倍柱体积(诸如，例如3倍至4倍柱体积)的体积施加至层析支持物。然后含有IαIp的洗脱物可通过施加至内毒素结合剂进行进一步处理，如上所述，或者洗脱物可通过使用相同或不同的层析支持物重复层析步骤或通过使用一种或多种不同的纯化或制备步骤(例如，过滤、离心、沉降、层析、倾析步骤、澄清、冷冻、干燥、蒸发、提取、过滤、沉淀或本领域已知的其他纯化或制备方法)进行进一步处理。
如果需要，可将层析支持物用净化缓冲液洗涤，以使层析支持物再生，以供将来使用。如果需要，可分析所得净化级分(例如，使用ELISA或其他已知技术)中IαIp的存在。
在一个实例中，将含有1M NaOH+2M NaCl(pH 14)的净化缓冲液以例如约1倍至5倍柱体积(诸如，例如1.5倍至2倍柱体积)的体积施加至层析支持物。
IαIp的检测
使用本文所述的纯化方法分离的IαIp可使用本领域已知的一种或多种测定法进行定量，诸如描述于例如WO 2009/154695、US 2020/0057077和WO 2020/086879中的那些测定法，这些专利以引用方式并入本文。
例如，IαIp定量测定可涉及使含有IαIp的样品与IαIp结合剂(例如，与IαIp特异性结合的抗体(诸如，例如MAb 69.26(参见例如Sha等人,JPediatr.180:135-140,2017)、MAb69.31(参见例如Lim等人,J Infect Dis.188(6):919-926,2003)或PAb R22C(参见例如WO2020/086879)，其各自通过引用以其整体并入本文)或IαIp配体(例如，肝素、LPS和/或透明质酸(HA))接触，并且检测结合的IαIp的量(例如，使用检测剂)。IαIp结合剂可以用例如生物素进行标记，并且可通过使用例如辣根过氧化物酶标记的链霉抗生物素蛋白(其然后可使用已知的检测方法进行检测)进行检测。在另一方法中，将IαIp结合剂用例如荧光团标记，其可通过分光光度法进行检测。替代性地，可在不使用标记的情况下直接检测IαIp检测剂(例如，通过表面等离子体共振(SPR))。加入IαIp检测剂后，可执行额外的洗涤步骤(例如，一个或多个)以去除未结合的IαIp检测剂。
然后可使用本领域已知的标准技术，基于来自缀合的标记或结合的检测剂的信号(例如，酶活性或荧光)来测量IαIp。如果使用酶作为标记，则可加入底物以产生信号(例如，颜色变化)，并且可通过适合检测信号的设备(诸如分光光度计)进行读取。可将信号(例如，吸光度或荧光)相对于具有已知的IαIp浓度的标准品作图以建立标准曲线，或可与已知参考浓度进行比较。可基于建立的标准曲线或参考浓度值来计算并且确定样品中的未知浓度。
分离的IαIp
本文所述的纯化方法(例如，单独或与一个或多个额外的纯化前或纯化后步骤(诸如阴离子交换层析)组合使用内毒素结合剂纯化)可用于纯化生物材料中的IαIp(例如，IαI、PαI、重链(例如，H1、H2、H3、H4和/或H5)、轻链(例如，双库尼茨抑制剂)或其组合)。IαIp的纯度可通过检测纯化后获得的IαIp的总量(例如，使用测定法或免疫测定法，诸如MAb69.26–肝素-生物素夹心ELISA、SDS/PAGE和/或蛋白质印迹)并且计算相对于通过总蛋白质测定法(例如，二喹啉甲酸测定法(BCA)、Bradford测定法、双缩脲试验或本领域已知的其他测定法)确定的总蛋白质含量的百分比(w/w)来确定。在一个或多个纯化步骤后，IαIp可具有至少约5％(w/w)例如至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或>99％(w/w)的纯度。
分离的IαIp具有在约60kDa至约280kDa之间的表观分子量，该表观分子量可通过本领域已知的任何合适的方法(例如，通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳)来确定。还可测试分离的IαIp的生物活性，诸如，例如选自由以下各项组成的组的活性：细胞因子抑制剂活性、趋化因子抑制剂活性、蛋白酶抑制剂活性(例如，丝氨酸蛋白酶抑制剂活性)、硫酸软骨素结合、糖胺聚糖结合活性、透明质酸结合活性、补体结合活性、组蛋白结合活性、Arg-Gly-Asp(RGD)结构域结合活性、凝血因子结合活性、细胞修复活性和细胞外基质蛋白结合活性。还可测试IαIp的胰蛋白酶抑制比活性，例如，胰蛋白酶抑制比活性在约1000IU/mg至约2000IU/mg之间(例如，1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900或2000IU/mg)。
存在于最终纯化级分中的IαIp(例如，IαI和/或PαI)的比例或浓度可以变化。优选地，纯化的IαIp(例如，IαI和/或PαI)以生理比例存在于最终纯化的级分中。生理比例可以为例如存在于健康的人或动物体内的比例和/或在人血浆中自然出现的IαI与PαI的比率。生理比例通常为在约60％至约80％之间的IαI和在约20％至约40％之间的PαI。
纯化方法还产生相对于生物材料(例如，血液或乳)中存在的IαIp约20％(w/w)或更大(例如，约25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或90％(w/w)或更大)的分离的IαIp的产率。在一些实例中，产率可大于或等于约90重量％或95重量％。
所公开的纯化方法可用于产生含有IαIp的组合物。还可制备具有相对于原始生物材料(例如，血液或乳)中存在的IαIp浓度具有更高浓度的IαIp的组合物。因此，这些方法可用于制备含有至少约5μg/mL的量的IαIp(例如，约5μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、300μg/mL、600μg/mL、900μg/mL、1mg/mL、2mg/mL、3mg/mL、4mg/mL、5mg/mL、6mg/mL、7mg/mL、8mg/mL、9mg/mL、10mg/mL、15mg/mL、20mg/mL、25mg/mL、30mg/mL、35mg/mL、40mg/mL、45mg/mL或50mg/mL或更多IαIp)的组合物。组合物中存在的IαIp可以占该组合物的大于约5％至约99％或更大(w/w)(例如，大于5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、97％、99％或更大(w/w))。
可执行额外的步骤(例如，冻干、真空浓缩)，以提高使用所公开的方法制备的组合物中的IαIp的浓度。这些已知方法可用于例如从根据本文所述方法纯化的IαIp产生含有例如约1至50mg/mL的量的IαIp(例如约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10mg/mL或更多IαIp)的组合物。
药物组合物
通过使用本文所公开的纯化方法(例如，使用内毒素结合剂，如上所述)进行纯化所获得的IαIp(例如，IαI、PαI、重链(例如，H1、H2、H3、H4和/或H5)、轻链(例如，双库尼茨抑制剂)或其组合)可用于制备药物组合物。例如，可将IαIp与药用赋形剂合并。含有IαIp的药物组合物将适合施用于人。
含有IαIp的药物组合物的实例描述于例如US 2007/0297982、US 2015/0238578、US 2019/0269765和WO 2020/086879中，这些专利以引用方式并入本文。
治疗方法
通过本文所述的方法制备的IαIp可用于(例如，当制备为药物组合物时)治疗或预防各种疾病、病症或其症状，例如特征在于炎症和/或低水平IαIp的疾病或病症。治疗方法和鉴别适合用本公开的药物组合物治疗的受试者的方法可见于例如US 2007/0297982、US2015/0238578、US 2019/0269765、US 2020/0057077和WO 2020/086879，这些专利以引用方式并入本文。
试剂盒
通过本文所述的方法制备的IαIp可用于制备含有IαIp(例如，IαI、PαI、重链(例如，H1、H2、H3、H4和/或H5)、轻链(例如，双库尼茨抑制剂)或其组合)的试剂盒。例如，可将IαIp以约0.5mg/mL至约500mg/mL(例如，约1mg/mL至50mg/mL)的量置于小瓶中以在试剂盒中分配。示例性试剂盒可如例如US 2007/0297982、US 2015/0238578、US 2019/0269765、US2020/0057077和WO 2020/086879中所述进行制备，这些专利以引用方式并入本文。
以下实例旨在说明而不是限制本发明。
实例
实例1.使用ETOXICLEARTM从去冷沉淀血浆中纯化IαIp
稀释去冷沉淀血浆样品(在20mM Tris-HCl+200mM NaCl(pH 7.2)中按1:3(v/v)稀释)，并且将稀释的去冷沉淀血浆(114.4mL)以3.5mL/min的流速施加至市售可商购获得的5mL Q阴离子交换树脂(TosohGigaCap Q650M)。收集流穿液进行分析。弃去不含有(或含有微小量的)IαIp的流穿液。将额外的血浆稀释缓冲液(172.7mL:20mMTris-HCl+200mM NaCl,pH 7.2)施加至该柱，以使起始材料完全穿过该柱。收集额外的流穿液进行分析，并且确定其不含有(或含有微小量的)IαIp，并且将其弃去。
将该柱用大约8CV的第一洗涤缓冲液(43.5mL:20mM Tris-HCl+250mM NaCl,pH7.2)洗涤，并且收集所得级分。分析合并级分中的总蛋白(二喹啉甲酸测定法(BCA))、IαIp(MAb 69.26–肝素-生物素夹心ELISA)和胰蛋白酶抑制活性，如表1所示。将含有少量不纯的IαIp(纯度0.1％，61.727μg，IαIp的产率为0.8761％(w/w))的合并的洗涤级分弃去。
在pH 7.2下洗涤后，将柱用具有较低pH的第二洗涤缓冲液(23.7mL:50mM Gly+100mM AcOH+175mM NaCl,pH 5.2)进一步洗涤(大约5CV)，并且收集、合并和分析所得级分，如表1所示。将含有少量不纯的IαIp(纯度0.4％，72.806μg，IαIp的产率为1.0339％(w/w))的合并的洗涤级分弃去。
在pH 5.2下洗涤后，将结合蛋白用高盐洗脱缓冲液(16.1mL:20mM Tris-HCl+750mM NaCl,pH 7.2)洗脱。收集、合并和分析级分(例如，总蛋白、IαIp和胰蛋白酶抑制活性)，如表1所示。收集的级分含有丰富的IαIp(纯度56.43％，IαIp的产率为98.537％(w/w))。
接着将具有高pH/高盐含量的净化缓冲液(8.3mL:1M NaOH+2MNaCl)施加至层析柱，并且合并和分析IαIp的所得级分，如表1所述。确定合并级分不含有(或含有微小量的)IαIp，并且将其弃去。
表1提供了在每个步骤(例如，流穿、第一洗涤、第二洗涤、洗脱和净化)中观察到的蛋白质的合并级分和数量的汇总。此外，图1A至1B分别示出SDS-PAGE和蛋白质印迹，其含有从Tosoh GigaCap Q650M柱收集的来自每个步骤的合并级分。纯化的第一步去除了98.6％的初始血浆蛋白。
表1.使用Q阴离子交换树脂的捕获步骤。
步骤产率：98.537％
然后将含有IαIp的来自Q阴离子交换柱的洗脱物(16mL)在dH2O中稀释(1:3(v/v))至体积为64.0mL。将该级分以3.5mL/min的流速施加至可商购获得的32mL含有内毒素结合剂的层析柱(ETOXICLEARTM,Astrea Bioseparations)。收集流穿液进行分析，然后将其弃去，因为未检测到(或检测到微小量的)IαIp。将额外的缓冲液体积(26.7mL:20mM Tris-HCl+150mM NaCl,pH 7.2)施加至该柱。收集总流穿液体积(90.7mL)进行分析，然后将其弃去，因为未检测到(或检测到微小量的)IαIp。
将该柱用大约1.5CV的第一洗涤缓冲液(47.0mL:75mM Gly+100mM AcOH+150mMNaCl,pH 5.2)洗涤，并且收集所得级分。将级分合并，并且分析总蛋白(二喹啉甲酸测定法(BCA))、IαIp(69.26Mab–肝素-生物素夹心ELISA)和胰蛋白酶抑制活性，如表2所示。然后弃去合并的洗涤级分，因为未检测到(或检测到微小量的)IαIp。
将该柱用具有更高pH的第二洗涤缓冲液(47.5mL:20mM Tris-HCl+300mM NaCl,pH7.2)进一步洗涤，并且收集和合并所得级分。将含有少量不纯的IαIp(纯度0.53％，39.045μg，来自Q洗脱物的IαIp的产率为0.5624％(w/w))的合并的洗涤级分弃去。
然后通过施加高盐洗脱缓冲液(32.3mL:20mM Tris-HCl+500mM NaCl,pH 7.2)，将结合蛋白从柱上洗脱。收集、合并和分析所得级分，如表2所示。确定合并的洗脱物级分含有高纯度IαIp(纯度>99.9％，产率99.5％(对于当前步骤)，两个步骤的总体产率为98.0％)。
将第二洗脱缓冲液(28.9mL:20mM Tris-HCl+1000mM NaCl,pH 7.2)施加至该柱，以从内毒素结合剂中去除任何剩余IαIp。在此洗脱物中未检测到额外的(或微小量的)IαIp(见表2)。
通过施加净化缓冲液(18.2mL:1M NaOH+2M NaCl)净化该柱；在流穿液中未检测到额外的(或微小量的)IαIp。
表2提供了在每个步骤(例如，流穿、第一洗涤、第二洗涤、洗脱物、第二洗脱物和净化)中观察到的蛋白质的合并级分和数量的汇总。此外，图1A至1B示出通过SDS-PAGE和蛋白质印迹对从ETOXICLEARTM柱收集的每个步骤的合并级分测试的结果。
表2.使用ETOXICLEARTM(pH 7.2)进行纯化。
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步骤产率：99.468％
总体产率：98.013％
此实例证明内毒素结合剂可用于选择性结合IαIp。此结合特性可用于从生物材料(诸如血液(例如，去冷沉淀血浆))中纯化IαIp。
实例2.使用DETOXI-GELTM(pH 7.3)从人血浆中纯化IαIp
将人血浆样品(新鲜冷冻血浆，2.5mL)稀释(在15mM磷酸盐(pH7.3)中按1:3(v/v)稀释)，并且将稀释的血浆(10.0mL)以2mL/min的流速施加至可商购获得的4mL含有内毒素结合剂的层析柱(DETOXI-GELTM,Pierce)。收集流穿液进行分析。将额外的稀释缓冲液(50.2mL：15mM磷酸盐，pH 7.3)施加至该柱，以使起始材料完全穿过该柱。收集额外的流穿液进行分析(见表3)，并且确定其含有IαIp(纯度0.159％，108.281μg，IαIp的产率为14.87％(w/w))。
用第一洗涤缓冲液(24.6mL：15mM磷酸盐+50mM NaCl，pH 7.3)洗涤该柱，并且收集、合并级分，并且分析总蛋白(BCA测定)和IαIp(MAb69.26–肝素-生物素夹心ELISA)。确定合并级分含有IαIp(纯度1.390％，179.186μg，IαIp的产率为24.61％(w/w))。
在50mM NaCl洗涤后，将该柱用具有更高NaCl浓度的第二洗涤缓冲液(16.7mL：15mM磷酸盐+100mM NaCl，pH 7.3)进一步洗涤，并且收集、合并和分析所得级分(见表3，洗涤2)。确定合并级分含有比前一步洗涤步骤更高量的IαIp(纯度4.969％，235.353μg，IαIp的产率为32.33％(w/w))。
在100mM NaCl第二次洗涤后，将具有更高NaCl浓度的洗脱缓冲液(7.3mL:15mM磷酸盐+1,000mM NaCl，pH 7.3)施加至内毒素结合剂。收集、合并和分析所得级分(见表3，洗涤3)。确定合并级分含有比先前的第一或第二洗涤步骤更低量的IαIp(纯度2.763％，40.632μg，IαIp的产率为5.58％(w/w))。
将该柱通过用高pH缓冲液(6.7mL:1M NaOH)洗涤来进一步净化，并且收集、合并所得级分并且分析IαIp(65.292μg，IαIp的产率为8.97％(w/w))。
表3提供了在每个步骤(例如，流穿、第一洗涤、第二洗涤、洗脱物和净化)中观察到的蛋白质的合并级分和数量的汇总。此外，图2提供了纯化的层析谱。
表3.使用DETOXI-GELTM(pH 7.3)进行纯化。
IαIp在第二洗脱步骤中以32.33％的产率和4.969％的纯度洗脱(层析谱请参见图2A)。此外，在pH 7.3下，在流穿液和每种洗涤级分中均检测到IαIp。DETOXI-GELTM是一种内毒素结合剂，其采用多粘菌素B树脂作为内毒素结合剂。虽然此方法未经优化，但接下来实例证明在不同pH下，DETOXI-GELTM以更高的亲和力与IαIp结合。此外，此实例和后续实例证明DETOXI-GELTM和其他类似的内毒素结合剂可选择性地结合IαIp，这一结果出乎意料。
实例3.使用DETOXI-GELTM(pH 5.5)从人血浆中纯化IαIp
将人血浆样品(新鲜冷冻血浆，2.5mL)稀释(在15mM磷酸盐(pH5.5)中按1:3(v/v)稀释)，并且将稀释的血浆(10.0mL)以2mL/min的流速施加至4mL内毒素结合剂柱(DETOXI-GELTM,Pierce)。收集流穿液进行分析，然后将其弃去。将额外的稀释缓冲液(63.6mL：15mM磷酸盐，pH5.5)施加至该柱，以使起始材料完全穿过该柱。收集额外的流穿液进行分析，并且将其弃去，因为未检测到(或检测到微小量的)IαIp。
用第一洗涤缓冲液(26.4mL：15mM磷酸盐+50mM NaCl，pH 5.5)洗涤该柱，并且收集、合并所得级分，并且分析总蛋白(BCA测定法)和IαIp(MAb 69.26–肝素-生物素夹心ELISA)。弃去合并级分，因为未检测到(或检测到微小量的)IαIp。
在50mM NaCl第一次洗涤后，将该柱用具有更高NaCl浓度的第二洗涤缓冲液(25.6mL：15mM磷酸盐+100mM NaCl，pH 5.5)进一步洗涤，并且收集、合并，和分析所得级分(见表4)。确定合并级分含有IαIp(纯度3.691％，281.958μg，IαIp的产率为38.73％(w/w))。
在100mM NaCl第二次洗涤后，将具有更高NaCl浓度的洗脱缓冲液(14.5mL:15mM磷酸盐+1,000mM NaCl，pH 5.5)施加至内毒素结合剂，并且收集、合并和分析IαIp。确定合并的洗脱物级分含有大部分IαIp(纯度20.578％，566.979μg，IαIp的产率为77.88％(w/w))，如表4所示。
将该柱通过用高pH缓冲液(6.8mL:1M NaOH)洗涤来进一步净化，并且收集、合并所得级分并且分析IαIp。确定这些合并级分含有IαIp(43.255μg，IαIp的产率为5.94％(w/w))，如表4所示。
表4提供了在每个步骤(例如，流穿、第一洗涤、第二洗涤、洗脱物和净化)中观察到的蛋白质的合并级分和数量的汇总。此外，图3提供了纯化的层析谱。
表4.使用DETOXI-GELTM(pH 5.5)进行纯化。
大部分IαIp在第三洗涤步骤(1,000mM NaCl)中洗脱，IαIp的回收率为77.88％，并且纯度为20.578％(层析谱请参见图2B)。此外，在pH 5.5下，在流穿液和第一次洗涤级分中均未检测到IαIp，证明DETOXI-GELTM选择性地与IαIp结合。此实例确认内毒素结合剂可用于从生物材料中纯化IαIp。
实例4.使用DETOXI-GELTM(pH 7.2)从人血浆中纯化IαIp
将含有富集IαIp(约40％w/w)的来自Q阴离子交换柱的洗脱物(来自新鲜冷冻人血浆)以2mL/min的流速施加(30mL)至4mL内毒素结合剂柱(DETOXI-GELTM,Pierce)。收集流穿液进行IαIp分析(MAb 69.26–肝素-生物素夹心ELISA)，并且将其弃去，因为未检测到IαIp。
用第一洗涤缓冲液(14.6mL：20mM Tris-HCl+150mM NaCl,pH 7.2)进一步洗涤，并且收集、合并所得级分并且分析IαIp。确定合并级分含有来自起始材料的大部分IαIp(653.5982μg，IαIp的回收率为75.3％(w/w))。
在150mM NaCl洗涤后，将该柱用具有更高NaCl浓度的第二洗涤缓冲液(5.8mL：20mM Tris-HCl+250mM NaCl,pH 7.2)进一步洗涤，并且收集、合并和分析所得级分(见表5，洗涤1)。确定合并的洗涤级分含有来自前一个洗涤步骤的更少量的IαIp(44.1728μg，IαIp的回收率为5.09％(w/w))。
在250mM NaCl洗涤后，将内毒素结合剂用具有更高NaCl浓度的洗脱缓冲液(6.8mL,20mM Tris-HCl+500mM NaCl,pH 7.2)进一步洗涤。收集、合并所得级分并且分析IαIp。这些合并级分含有比第二个洗涤步骤级分更多的IαIp(143.7316μg，IαIp的回收率为16.56％(w/w))。
将该柱用另一种具有更高NaCl浓度的洗脱缓冲液(3.7mL,20mM Tris-HCl+1,000mM NaCl)进一步洗涤，并且合并所得级分，并且分析IαIp。这些合并级分含有比第一洗脱物级分更少的IαIp(42.14μg，IαIp的回收率为4.86％(w/w))。
表5提供了在每个步骤(例如，流穿、第一洗涤、第二洗涤、第一洗脱物和第二洗脱物)中观察到的蛋白质的合并级分和数量的汇总。此外，图4提供了纯化的层析谱。
表5.使用DETOXI-GELTM(pH 7.2)进行纯化。
质量平衡：101.80％
大部分IαIp在第一洗涤步骤中洗脱，来自Q洗脱物的大部分剩余蛋白质也是如此(IαIp的回收率为75.30％)。此外，在其他洗涤级分和两种洗脱物级分中检测到IαIp。
实例5.使用ETOXICLEARTM从去冷沉淀血浆中纯化IαIp
稀释去冷沉淀血浆样品(11.5mL)(在20mM Tris-HCl pH 7.2+200mM NaCl中按1:4(v/v)稀释)，并且将稀释的去冷沉淀血浆以5mL/min(120cm/h)的流速施加至市售可商购获得的5mL Q阴离子交换树脂(TosohGigaCap Q650M)。收集流穿液进行分析。弃去不含有(或含有微小量的)IαIp的流穿液。将额外的血浆稀释缓冲液(20mM Tris-HCl pH7.2+200mM NaCl)施加至该柱，以使起始材料完全穿过该柱。收集额外的流穿液进行分析，并且确定其不含有(或含有微小量的)IαIp，并且将其弃去。
将该柱用第一洗涤缓冲液(20mM Tris-HCl pH 7.2+250mM NaCl)洗涤，并且收集所得级分。分析合并级分中的总蛋白(二喹啉甲酸测定法(BCA))、IαIp(MAb 69.26–肝素-生物素夹心ELISA)和胰蛋白酶抑制活性，如表6所示。合并的洗涤级分含有少量不纯的IαIp，并且将其弃去。
在pH 7.2下洗涤后，将该柱用具有较低pH的第二洗涤缓冲液(50mM Gly 100mMAcOH 150mM NaCl pH 5.2)进一步洗涤，并且收集、合并和分析所得级分，如表6所示。合并的洗涤级分含有少量不纯的IαIp，并且将其弃去。
在pH 5.2下洗涤后，将结合蛋白用高盐洗脱缓冲液(20mM Tris-HCl pH 7.2+750mM NaCl)洗脱。收集、合并和分析级分(例如，总蛋白、IαIp和胰蛋白酶抑制活性)，如表6所示。收集的级分含有丰富的IαIp。
接着将具有高pH/高盐含量的净化缓冲液(1M NaOH+2M NaCl)施加至层析柱，并且合并和分析IαIp的所得级分，如表6所述。确定合并级分不含有(或含有微小量的)IαIp，并且将其弃去。
表6提供了在每个步骤(例如，流穿、第一洗涤、第二洗涤、洗脱和净化)中观察到的蛋白质的合并级分和数量的汇总。此外，图5A至5B分别示出SDS-Page凝胶和蛋白质印迹，其含有从Tosoh GigaCap Q650M柱收集的来自每个步骤的合并级分。
表6.使用Q阴离子交换树脂的捕获步骤。
步骤产率：94％
然后将含有IαIp的Q阴离子交换柱的洗脱物在dH2O中稀释(1:5(v/v))。将该级分以3.5mL/min(120cm/h)的流速施加至可商购获得的8mL含有内毒素结合剂的层析柱(ETOXICLEARTM,Astrea Bioseparations)。收集流穿液进行分析，然后将其弃去，因为未检测到(或检测到微小量的)IαIp。将流穿液缓冲液(20mM Tris-HCl pH 7.2+200mM NaCl)施加至该柱。收集流穿液进行分析，然后将其弃去(未检测到(或检测到微小量的)IαIp)。
将该柱用第一洗涤缓冲液(50mM Gly 100mM AcOH+200mM NaCl pH5.2)洗涤，并且收集所得级分。将级分合并，并且分析总蛋白(二喹啉甲酸测定法(BCA))、IαIp(69.26Mab–肝素-生物素夹心ELISA)和胰蛋白酶抑制活性，如表7所示。然后弃去合并的洗涤级分(未检测到(或检测到微小量的)IαIp)。
将该柱用具有更高pH的第二洗涤缓冲液(20mM Tris-HCl pH 7.2+300mM NaCl)进一步洗涤，并且收集和合并所得级分。合并的洗涤级分含有少量不纯的IαIp，并且将其弃去。
然后通过施加第一高盐洗脱缓冲液(20mM Tris-HCl pH 7.2+400mM NaCl)，将结合蛋白从柱上洗脱。然后通过施加第二高盐洗脱缓冲液(20mM Tris-HCl pH 7.2+500mMNaCl)，将结合蛋白从柱上洗脱。然后通过施加第三高盐洗脱缓冲液(20mM Tris-HCl pH7.2+1000mM NaCl)，将结合蛋白从柱上洗脱。收集、合并和分析所得级分，如表7所示。
通过施加净化缓冲液(1M NaOH,2M NaCl)净化该柱；在流穿液中未检测到额外的(或微小量的)IαIp。
表7提供了在每个步骤(例如，流穿、第一洗涤、第二洗涤、洗脱物、第二洗脱物和净化)中观察到的蛋白质的合并级分和数量的汇总。此外，图5A至5B示出通过SDS-PAGE和蛋白质印迹对从ETOXICLEARTM柱收集的每个步骤的合并级分测试的结果。
表7.使用ETOXICLEARTM进行纯化
步骤产率：94.27％
总体产率：88.6％
实例6.使用ETOXICLEARTM从去冷沉淀血浆中纯化IαIp
稀释去冷沉淀血浆样品(50mL)(在20mM Tris-HCl pH 7.2+200mM NaCl中按1:4(v/v)稀释)，并且将稀释的去冷沉淀血浆以12mL/min(120cm/h)的流速施加至市售可商购获得的100mL Q阴离子交换树脂(TosohGigaCap Q650M)。收集流穿液进行分析。弃去不含有(或含有微小量的)IαIp的流穿液。将额外的血浆稀释缓冲液(20mMTris-HCl pH7.2+200mM NaCl)施加至该柱，以使起始材料完全穿过该柱。收集额外的流穿液进行分析，并且确定其不含有(或含有微小量的)IαIp，并且将其弃去。
将该柱用第一洗涤缓冲液(20mM Tris-HCl pH 7.2+250mM NaCl)洗涤，并且收集所得级分。分析合并级分中的总蛋白(二喹啉甲酸测定法(BCA))、IαIp(MAb 69.26–肝素-生物素夹心ELISA)和胰蛋白酶抑制活性，如表8所示。合并的洗涤级分含有少量不纯的IαIp，并且将其弃去。
在pH 7.2下洗涤后，将该柱用具有较低pH的第二洗涤缓冲液(50mM Gly 100mMAcOH 150mM NaCl pH 5.2)进一步洗涤，并且收集、合并和分析所得级分，如表8所示。合并的洗涤级分含有少量不纯的IαIp，并且将其弃去。
在pH 5.2下洗涤后，将结合蛋白用高盐洗脱缓冲液(20mM Tris-HCl pH 7.2+750mM NaCl)洗脱。收集、合并和分析级分(例如，总蛋白、IαIp和胰蛋白酶抑制活性)，如表8所示。收集的级分含有丰富的IαIp。
接着将具有高pH/高盐含量的净化缓冲液(1M NaOH+2M NaCl)施加至层析柱，并且合并和分析IαIp的所得级分，如表8所述。确定合并级分不含有(或含有微小量的)IαIp，并且将其弃去。
表8提供了在每个步骤(例如，流穿、第一洗涤、第二洗涤、洗脱和净化)中观察到的蛋白质的合并级分和数量的汇总。此外，图6A至6B分别示出SDS-Page凝胶和蛋白质印迹，其含有从Tosoh GigaCap Q650M柱收集的来自每个步骤的合并级分。
表8.使用Q阴离子交换树脂的捕获步骤。
步骤产率：96％
然后将含有IαIp的Q阴离子交换柱的洗脱物在dH2O中稀释(1:5(v/v))至125mL。将该级分以3.5mL/min(120cm/h)的流速施加至可商购获得的74mL含有内毒素结合剂的层析柱(ETOXICLEARTM,Astrea Bioseparations)。收集流穿液进行分析，然后将其弃去，因为未检测到(或检测到微小量的)IαIp。将流穿液缓冲液(20mM Tris-HCl pH 7.2+200mM NaCl)施加至该柱。收集流穿液进行分析，然后将其弃去(未检测到(或检测到微小量的)IαIp)。
将该柱用第一洗涤缓冲液(50mM Gly 100mM AcOH+200mM NaCl pH5.2)洗涤，并且收集所得级分。将级分合并，并且分析总蛋白(二喹啉甲酸测定法(BCA))、IαIp(69.26Mab–肝素-生物素夹心ELISA)和胰蛋白酶抑制活性，如表9所示。然后弃去合并的洗涤级分(未检测到(或检测到微小量的)IαIp)。
将该柱用具有更高pH的第二洗涤缓冲液(20mM Tris-HCl pH 7.2+300mM NaCl)进一步洗涤，并且收集和合并所得级分。合并的洗涤级分含有少量不纯的IαIp，并且将其弃去。
然后通过施加第一高盐洗脱缓冲液(20mM Tris-HCl pH 7.2+500mM NaCl)，将结合蛋白从柱上洗脱。然后通过施加第二高盐洗脱缓冲液(20mM Tris-HCl pH 7.2+1000mMNaCl)，将结合蛋白从柱上洗脱。收集、合并和分析所得级分，如表9所示。
通过施加净化缓冲液(1M NaOH,2M NaCl)净化该柱；在流穿液中未检测到额外的(或微小量的)IαIp。
表9提供了在每个步骤(例如，流穿、第一洗涤、第二洗涤、洗脱物、第二洗脱物和净化)中观察到的蛋白质的合并级分和数量的汇总。此外，图6A至6B示出通过SDS-PAGE和蛋白质印迹对从ETOXICLEARTM柱收集的每个步骤的合并级分测试的结果。
表9.使用ETOXICLEARTM进行纯化
步骤产率：96.23％
总体产率：91.99％
实例7.共纯化杂质的分析：因子II(凝血酶原)
利用ELISA分析实例5至6中与IαIp共纯化的因子II(凝血酶原)(表10)。在96孔板(NUNC Immuno MAXISORP F96)中执行夹心ELISA，使用配对的可商购获得的多克隆抗体，应用过氧化物酶标记的检测抗体，并且通过450nm处的相对吸光度信号进行反应检测。将ELISA板用多克隆绵羊抗人凝血酶原包被过夜(在包被缓冲液中采用1:1000的比率)，用洗涤缓冲液洗涤3次，用含0.1％ Milch、2mmol/L苯甲脒的洗涤缓冲液(封闭缓冲液)封闭，并且用洗涤缓冲液洗涤。将测试材料和标准校准样品(均在选定的稀释范围内与封闭缓冲液一起)在室温在ELISA包被的板上孵育1小时。标准校准通常使用可商购获得的参考血浆制剂(CRYOcheck,PrecisionBioLogic)在五点校准曲线上执行，并且定期根据二级国际标准ISTH/SSC用经认证的FII活性进行检查。
将孵育的ELISA板洗涤三次，并且与绵羊抗人凝血酶原过氧化物酶(HRP)标记的检测抗体在室温孵育1h。用洗涤缓冲液洗涤3次，并且利用TMB试剂(3,3',5,5'-四甲基联苯胺二盐酸盐)触发HRP显色反应，并且通过450nm处的显色检测信号测量凝血酶原水平
表10.ELISA因子II(凝血酶原)
其他实施例
本说明书上文中提及的所有出版物、专利和专利申请均据此通过引用并入本文，并入程度如同每个单个出版物、专利或专利申请被具体地和单独地指示通过引用以其整体并入一样。在不脱离本发明的范围和精神的情况下，本发明所述的方法、药物组合物和试剂盒的各种修改和变化对于本领域技术人员来说是显而易见的。尽管已经结合具体实施例描述了本发明，但是应当理解，本发明能够进行进一步的修改，并且所要求保护的本发明不应不适当地受限于此类具体实施例。实际上，对于本领域技术人员显而易见的是，用于实施本发明的所述方式的各种修改均在本发明的范围内。本申请旨在覆盖以下本发明的任何变型、用途或改编，一般来说，本发明的原理以及包括与本公开的此类偏离均落入本发明所属领域的已知的惯常实践之内，并且可以应用于前文阐述的基本特征。
Claims (149)
1.一种从生物材料中纯化间-α抑制剂蛋白(IαIp)的方法，所述方法包括：
(a)将包含所述IαIp的所述生物材料施加至内毒素结合剂，并且分离包含不与所述内毒素结合剂结合的所述生物材料的流穿液；以及
(b)将包含盐的洗脱缓冲液施加至所述内毒素结合剂，并且收集包含所述IαIp的洗脱物。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述内毒素结合剂固定在支持物上。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述支持物为整体支持物或基于颗粒的支持物。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述整体支持物或基于颗粒的支持物为树脂或包含树脂。
5.根据权利要求2至4中任一项所述的方法，其中所述支持物包括柱、膜、圆盘或芯片。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述内毒素结合剂选自由以下各项组成的组：ETOXICLEARTM、PIERCETM高容量内毒素去除树脂、TOXINERASERTM内毒素去除树脂、PURKINETM内毒素去除树脂、DETOXI-GELTM内毒素去除凝胶和PROMEGATM内毒素去除树脂。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述内毒素结合剂为DETOXI-GELTM或ETOXICLEARTM。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述生物材料进一步包含三种或更多种选自由以下各项组成的组的蛋白质：α-1抗胰蛋白酶、C1-抑制剂、白蛋白、球蛋白、纤维蛋白原(因子I)、凝血酶原(因子II)、凝血酶、抗凝血酶III、因子III、因子V、因子VII、因子VIII、因子IX、因子X、因子XI、因子XII、因子XIII、纤连蛋白、α-2纤溶酶抑制剂、尿激酶、蛋白C、蛋白S、蛋白Z、蛋白Z相关蛋白酶抑制剂、纤溶酶原、组织纤溶酶原激活物、纤溶酶原激活物抑制剂-1、纤溶酶原激活物抑制剂-2、血管性血友病因子、因子H、前激肽释放酶、高分子量激肽原和肝素辅因子II。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述球蛋白为免疫球蛋白(Ig)。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述免疫球蛋白选自由以下各项组成的组：IgA、IgE、IgM、IgD和IgG。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述IgG选自由以下各项组成的组：静脉内Ig(IVIg)、抗-D IgG、乙型肝炎IgG、麻疹IgG、狂犬病IgG、破伤风IgG和水痘带状疱疹IgG。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中所述生物材料包含三至十种、三至十五种、三至二十种、三至二十五种、三至三十种、十至二十种、十至二十五种、十至三十种、十五至二十五种、十五至三十种、二十至三十种、或三十或更多种不同的蛋白质。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中所述生物材料包含约40％至约65％白蛋白(w/w)。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其中所述生物材料包含约25％至约45％球蛋白(w/w)。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的方法，其中所述生物材料包含约2％至约12％纤维蛋白原(w/w)。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括在步骤(a)之后并且在步骤(b)之前将第一洗涤缓冲液施加至所述内毒素结合剂。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述方法进一步包括分离包含所述第一洗涤缓冲液的流穿液。
18.根据权利要求16或17所述的方法，其中所述第一洗涤缓冲液具有约4.5至8.5的pH。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述第一洗涤缓冲液具有约5.2的pH。
20.根据权利要求16至19中任一项所述的方法，其中所述第一洗涤缓冲液包含甘氨酸、乙酸、柠檬酸、磷酸盐、氯化钠(NaCl)、钙、镁、EDTA和Tris-HCl中的一种或多种。
21.根据权利要求16至20中任一项所述的方法，其中所述第一洗涤缓冲液包含约10mM至约200mM甘氨酸和/或约20mM至300mM乙酸。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述第一洗涤缓冲液包含约75mM甘氨酸和约100mM乙酸。
23.根据权利要求16至22中任一项所述的方法，其中所述第一洗涤缓冲液包含约200mM或更少的NaCl。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述第一洗涤缓冲液包含约50mM至约150mMNaCl。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述第一洗涤缓冲液包含约50mM NaCl或约100mM NaCl。
26.根据权利要求16至25中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括在施加所述第一洗涤缓冲液之后将第二洗涤缓冲液施加至所述内毒素结合剂。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述方法进一步包括分离包含所述第二洗涤缓冲液的流穿液。
28.根据权利要求26或27所述的方法，其中所述第二洗涤缓冲液具有约4.5至约8.5的pH。
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述第二洗涤缓冲液具有约7.2的pH。
30.根据权利要求26至29中任一项所述的方法，其中所述第二洗涤缓冲液包含甘氨酸、乙酸、柠檬酸、磷酸盐、氯化钠(NaCl)、钙、镁、EDTA和Tris-HCl中的一种或多种。
31.根据权利要求26至30中任一项所述的方法，其中所述第二洗涤缓冲液包含约5mM至约100mM Tris-HCl。
32.根据权利要求31所述的方法，其中所述第二洗涤缓冲液包含约20mM Tris-HCl。
33.根据权利要求26至32中任一项所述的方法，其中所述第二洗涤缓冲液包含约500mM或更少的NaCl。
34.根据权利要求33所述的方法，其中所述第二洗涤缓冲液包含约100mM至约500mMNaCl。
35.根据权利要求34所述的方法，其中所述第二洗涤缓冲液包含约300mM NaCl。
36.根据权利要求1至35中任一项所述的方法，其中所述洗脱缓冲液具有约4.5至约8.5的pH。
37.根据权利要求36所述的方法，其中所述洗脱缓冲液具有约7.2的pH。
38.根据权利要求1至37中任一项所述的方法，其中所述洗脱缓冲液包含甘氨酸、乙酸、柠檬酸、磷酸盐、氯化钠(NaCl)、钙、镁、EDTA和Tris-HCl中的一种或多种。
39.根据权利要求1至38中任一项所述的方法，其中所述洗脱缓冲液包含约5mM至约100mM Tris-HCl。
40.根据权利要求39所述的方法，其中所述洗脱缓冲液包含约20mM Tris-HCl。
41.根据权利要求1至40中任一项所述的方法，其中所述洗脱缓冲液包含约1,000mM或更少的NaCl。
42.根据权利要求1至41中任一项所述的方法，其中所述洗脱缓冲液包含约500mM至约1,000mM NaCl。
43.根据权利要求41或42所述的方法，其中所述洗脱缓冲液包含约500mM NaCl或约1,000mM NaCl。
44.根据权利要求1至43中任一项所述的方法，所述方法进一步包括在步骤(a)之前将稀释缓冲液施加至所述生物材料。
45.根据权利要求44所述的方法，其中所述稀释缓冲液包含去离子水。
46.根据权利要求44或45所述的方法，其中所述稀释缓冲液具有约4.5至约8.5的pH。
47.根据权利要求46所述的方法，其中所述稀释缓冲液具有约5.5、约7.2或约7.3的pH。
48.根据权利要求44至47中任一项所述的方法，其中将所述生物材料用所述稀释缓冲液按1:1至1:10(v/v)稀释。
49.根据权利要求44至48中任一项所述的方法，其中所述稀释缓冲液包含甘氨酸、乙酸、柠檬酸、磷酸盐、氯化钠(NaCl)、钙、镁、EDTA和Tris-HCl中的一种或多种。
50.根据权利要求44至49中任一项所述的方法，其中所述稀释缓冲液包含约5mM至约100mM Tris-HCl。
51.根据权利要求50所述的方法，其中所述稀释缓冲液包含约20mM Tris-HCl。
52.根据权利要求44至51中任一项所述的方法，其中所述稀释缓冲液包含约50mM或更少的NaCl。
53.根据权利要求52所述的方法，其中所述稀释缓冲液不包含盐或包含约50mM NaCl。
54.根据权利要求44至53中任一项所述的方法，其中所述稀释缓冲液包含约5mM至约100mM磷酸盐。
55.根据权利要求54所述的方法，其中所述稀释缓冲液包含约15mM磷酸盐。
56.根据权利要求1至55中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括检测所述流穿液中的所述IαIp的量。
57.根据权利要求56所述的方法，其中所述方法包括弃去所述流穿液。
58.根据权利要求1至57中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括检测所述洗脱物中的IαIp的量。
59.根据权利要求1至58中任一项所述的方法，所述方法包括约1mL/min至10mL/min的流速。
60.根据权利要求1至58中任一项所述的方法，其中在步骤(a)之前，所述方法包括将所述生物材料施加至层析支持物。
61.根据权利要求60所述的方法，其中所述层析支持物包括阴离子交换层析支持物、尺寸排阻层析支持物、离子交换层析支持物、亲和层析支持物或其组合。
62.根据权利要求61所述的方法，其中所述层析支持物为所述阴离子交换层析支持物。
63.根据权利要求60至62中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括：
(i)将所述生物材料施加至所述层析支持物，并且分离步骤(i)的包含不与所述层析支持物结合的所述生物材料的流穿液；以及
(ii)将包含盐的洗脱缓冲液施加至所述层析支持物，并且收集包含所述IαIp的第一洗脱物。
64.根据权利要求63所述的方法，其中所述层析支持物为整体支持物或基于颗粒的支持物。
65.根据权利要求64所述的方法，其中所述整体支持物或基于颗粒的支持物包含固定化阴离子交换树脂。
66.根据权利要求65所述的方法，其中所述固定化阴离子交换树脂为二乙基氨基乙烷(DEAE)树脂或季胺(Q)树脂。
67.根据权利要求60至66中任一项所述的方法，其中所述层析支持物为柱、膜、圆盘或芯片。
68.根据权利要求60至67中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括在步骤(i)之后并且在步骤(ii)之前将第一洗涤缓冲液施加至所述层析支持物。
69.根据权利要求68所述的方法，其中在步骤(ii)之前，所述方法进一步包括分离包含所述第一洗涤缓冲液的流穿液。
70.根据权利要求68或69所述的方法，其中施加至所述层析支持物的所述第一洗涤缓冲液具有约4.5至约8.5的pH。
71.根据权利要求70所述的方法，其中施加至所述层析支持物的所述第一洗涤缓冲液具有约7.2的pH。
72.根据权利要求68至71中任一项所述的方法，其中施加至所述层析支持物的所述第一洗涤缓冲液包含甘氨酸、乙酸、柠檬酸、磷酸盐、氯化钠(NaCl)、钙、镁、EDTA和Tris-HCl中的一种或多种。
73.根据权利要求68至72中任一项所述的方法，其中施加至所述层析支持物的所述第一洗涤缓冲液包含约5mM至约100mM Tris-HCl。
74.根据权利要求73所述的方法，其中施加至所述层析支持物的所述第一洗涤缓冲液包含约20mM Tris-HCl。
75.根据权利要求68至74中任一项所述的方法，其中施加至所述层析支持物的所述第一洗涤缓冲液包含约400mM或更少的NaCl。
76.根据权利要求75所述的方法，其中施加至所述层析支持物的所述第一洗涤缓冲液包含约50mM至约250mM NaCl。
77.根据权利要求76所述的方法，其中施加至所述层析支持物的所述第一洗涤缓冲液包含约250mM NaCl。
78.根据权利要求68至77中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括在施加所述第一洗涤缓冲液之后将第二洗涤缓冲液施加至所述层析支持物。
79.根据权利要求78所述的方法，其中所述方法进一步包括分离包含所述第二洗涤缓冲液的流穿液。
80.根据权利要求78或79所述的方法，其中施加至所述层析支持物的所述第二洗涤缓冲液具有约4.5至约8.5的pH。
81.根据权利要求80所述的方法，其中施加至所述层析支持物的所述第二洗涤缓冲液具有约5.2的pH。
82.根据权利要求78至81中任一项所述的方法，其中施加至所述层析支持物的所述第二洗涤缓冲液包含甘氨酸、乙酸、柠檬酸、磷酸盐、氯化钠(NaCl)、钙、镁、EDTA和Tris-HCl中的一种或多种。
83.根据权利要求78至82中任一项所述的方法，其中施加至所述层析支持物的所述第二洗涤缓冲液包含约10mM至约200mM甘氨酸和/或约20mM至约300mM乙酸。
84.根据权利要求83所述的方法，其中施加至所述层析支持物的所述第二洗涤缓冲液包含约50mM甘氨酸和约100mM乙酸。
85.根据权利要求78至84中任一项所述的方法，其中施加至所述层析支持物的所述第二洗涤缓冲液包含约100mM至约500mM NaCl。
86.根据权利要求85所述的方法，其中施加至所述层析支持物的所述第二洗涤缓冲液包含约175mM NaCl。
87.根据权利要求63至86中任一项所述的方法，其中施加至所述层析支持物的所述洗脱缓冲液具有约4.5至约8.5的pH。
88.根据权利要求87所述的方法，其中施加至所述层析支持物的所述洗脱缓冲液具有约7.2的pH。
89.根据权利要求63至88中任一项所述的方法，其中施加至所述层析支持物的所述洗脱缓冲液包含甘氨酸、乙酸、柠檬酸、磷酸盐、氯化钠(NaCl)、钙、镁、EDTA和Tris-HCl中的一种或多种。
90.根据权利要求63至89中任一项所述的方法，其中施加至所述层析支持物的所述洗脱缓冲液包含约5mM至约100mM Tris-HCl。
91.根据权利要求90所述的方法，其中施加至所述层析支持物的所述洗脱缓冲液包含约20mM Tris-HCl。
92.根据权利要求63至91中任一项所述的方法，其中施加至所述层析支持物的所述洗脱缓冲液包含约1,000mM或更少的NaCl。
93.根据权利要求92所述的方法，其中施加至所述层析支持物的所述洗脱缓冲液包含约750mM NaCl。
94.根据权利要求63至93中任一项所述的方法，所述方法进一步包括在步骤(i)之前将稀释缓冲液施加至所述生物材料。
95.根据权利要求94所述的方法，其中所述稀释缓冲液包含去离子水。
96.根据权利要求94或95所述的方法，其中所述稀释缓冲液具有约4.5至约8.5的pH。
97.根据权利要求96所述的方法，其中所述稀释缓冲液具有约7.2的pH。
98.根据权利要求94至97中任一项所述的方法，其中将所述生物材料用所述稀释缓冲液按1:1至1:10(v/v)稀释。
99.根据权利要求94至98中任一项所述的方法，其中所述稀释缓冲液包含甘氨酸、乙酸、柠檬酸、磷酸盐、氯化钠(NaCl)、钙、镁、EDTA和Tris-HCl中的一种或多种。
100.根据权利要求94至99中任一项所述的方法，其中所述稀释缓冲液包含约5mM至约100mM Tris-HCl。
101.根据权利要求100所述的方法，其中所述稀释缓冲液包含约20mM Tris-HCl。
102.根据权利要求94至101中任一项所述的方法，其中所述稀释缓冲液包含约300mM或更少的NaCl。
103.根据权利要求102所述的方法，其中所述稀释缓冲液不包含盐或包含约200mMNaCl。
104.根据权利要求63至103中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括检测步骤(i)的所述流穿液中的IαIp的量。
105.根据权利要求104所述的方法，其中所述方法包括弃去步骤(i)的所述流穿液。
106.根据权利要求63至105中任一项所述的方法，所述方法进一步包括检测步骤(ii)中的所述洗脱物中的IαIp的量。
107.根据权利要求63至106中任一项所述的方法，所述方法包括约1mL/min至10mL/min的流速。
108.根据权利要求1至107中任一项所述的方法，其中在步骤(b)的所述洗脱物中收集的所述IαIp相对于所述生物材料中的所述IαIp的纯度，具有约5重量％至99重量％或更高的纯度。
109.根据权利要求1至108中任一项所述的方法，其中在步骤(b)中收集的所述洗脱物中的IαIp的产率相对于存在于所述生物材料中的所述IαIp大于约20％(w/w)。
110.根据权利要求109所述的方法，其中所述产率相对于存在于所述生物材料中的所述IαIp为约35％至约90％或更高(w/w)。
111.根据权利要求110所述的方法，其中IαIp的所述产率相对于存在于所述生物材料中的所述IαIp为约95％或更高(w/w)。
112.根据权利要求109至111中任一项所述的方法，其中来自所述生物材料的IαIp的所述产率为至少约5μg/ml。
113.根据权利要求112所述的方法，其中来自所述生物材料的IαIp的所述产率为至少约50μg/ml。
114.根据权利要求113所述的方法，其中来自所述生物材料的IαIp的所述产率为至少约100μg/ml。
115.根据权利要求114所述的方法，其中来自所述生物材料的IαIp的所述产率为至少约300μg/ml。
116.根据权利要求115所述的方法，其中来自所述生物材料的IαIp的所述产率为至少约600μg/ml。
117.根据权利要求116所述的方法，其中来自所述生物材料的IαIp的所述产率为至少约900μg/ml。
118.根据权利要求108至117中任一项所述的方法，其中所述IαIp的所述纯度为至少约5％(w/w)。
119.根据权利要求118所述的方法，其中所述IαIp的所述纯度为至少约25％(w/w)。
120.根据权利要求119所述的方法，其中所述IαIp的所述纯度为至少约50％(w/w)。
121.根据权利要求120所述的方法，其中所述IαIp的所述纯度为至少约75％(w/w)。
122.根据权利要求1至121中任一项所述的方法，其中所述IαIp包括间-α抑制剂(IαI)、前-α抑制剂(PαI)和双库尼茨抑制剂中的两种或更多种。
123.根据权利要求1至122中任一项所述的方法，其中存在于所述生物材料中的所述IαIp包含在60％至80％(w/w)之间的IαIp和/或在20％至40％(w/w)之间的PαI；并且/或者其中存在于步骤(b)的所述洗脱物中的所述IαIp包含在60％至80％(w/w)之间的IαIp和/或在20％至40％(w/w)之间的PαI。
124.根据权利要求1至123中任一项所述的方法，其中所述IαIp具有在约60kDa至约280kDa之间的表观分子量。
125.根据权利要求1至124中任一项所述的方法，其中所述IαIp具有生物活性。
126.根据权利要求125所述的方法，其中所述生物活性包括细胞因子抑制剂活性、趋化因子抑制剂活性或丝氨酸蛋白酶抑制剂活性。
127.根据权利要求1至126中任一项所述的方法，其中所述生物材料为血液制品材料。
128.根据权利要求127所述的方法，其中所述血液制品材料选自由以下各项组成的组：全血浆、去冷沉淀血浆、液态血浆、冷冻血浆(FP)、原料血浆、回收血浆、溶剂/去污剂处理血浆(SDP)、富血小板血浆(PRP)、贫血小板血浆(PPP)、血清、全血及其稀释或浓缩制剂。
129.根据权利要求128所述的方法，其中所述FP选自由以下各项组成的组：新鲜冷冻血浆(FFP)、FFP24、FP24、解冻FFP、解冻FFP24、解冻FP、解冻FP24及其稀释或浓缩制剂。
130.根据权利要求1至126中任一项所述的方法，其中所述生物材料为乳或初乳。
131.根据权利要求1至130中任一项所述的方法，其中所述生物材料来自哺乳动物。
132.根据权利要求131所述的方法，其中所述哺乳动物为人、灵长类动物、牛、马、猪、羊、猫或犬。
133.根据权利要求1至59中任一项所述的方法，其中所述生物材料在施加至所述内毒素结合剂之前基本上未经处理。
134.根据权利要求1至133中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括使用在步骤(b)中收集的所述洗脱物执行一个或多个层析步骤。
135.根据权利要求134所述的方法，其中一个或多个额外的层析步骤包括重复根据权利要求1至134中任一项所述的方法。
136.根据权利要求1至135中任一项所述的方法，其中在步骤(b)中施加至所述内毒素结合剂的所述洗脱缓冲液具有7.2的pH并且包含约20mM Tris-HCl和约500mM NaCl。
137.根据权利要求16至35中任一项所述的方法，其中施加至所述内毒素结合剂的所述第一洗涤缓冲液具有5.2的pH并且包含约75mM甘氨酸、约100mM乙酸和约150mM NaCl。
138.根据权利要求26至35中任一项所述的方法，其中施加至所述内毒素结合剂的所述第二洗涤缓冲液具有7.2的pH并且包含约20mM Tris-HCl和约300mM NaCl。
139.根据权利要求63至107中任一项所述的方法，其中施加至所述层析支持物的所述洗脱缓冲液具有7.2的pH并且包含约20mM Tris-HCl和约750mM NaCl。
140.根据权利要求68至86中任一项所述的方法，其中施加至所述层析支持物的所述第一洗涤缓冲液具有7.2的pH并且包含约20mM Tris-HCl和约250mM NaCl。
141.根据权利要求78至86中任一项所述的方法，其中施加至所述层析支持物的所述第二洗涤缓冲液具有5.2的pH并且包含约50mM甘氨酸、约100mM乙酸和约175mM NaCl。
142.一种组合物，其包含通过根据权利要求1至141中任一项所述的方法产生的IαIp。
143.根据权利要求142所述的组合物，其中所述组合物适合施用于人。
144.一种药物组合物，其包含根据权利要求142或143所述的组合物和药用赋形剂。
145.一种治疗有此需要的受试者的疾病或病症的方法，所述方法包括向所述受试者施用根据权利要求142或143所述的组合物或根据权利要求144所述的药物组合物。
146.一种试剂盒，其包含根据权利要求142或143所述的组合物或根据权利要求144所述的药物组合物。
147.根据权利要求146所述的试剂盒，其中所述试剂盒进一步包括关于治疗用途的说明书。
148.一种从血浆中纯化IαIp的方法，所述方法包括：
(a)用包含去离子水的稀释缓冲液稀释所述血浆，以形成稀释的血浆；
(b)将所述稀释的血浆施加至ETOXICLEARTM树脂，并且分离包含不与所述ETOXICLEARTM树脂结合的所述稀释的血浆的流穿液；
(c)将包含约75mM甘氨酸、约100mM AcOH和约150mM NaCl的pH为约5.2的第一洗涤缓冲液施加至所述ETOXICLEARTM树脂，并且分离包含所述第一洗涤缓冲液的流穿液；
(d)将包含约20mM Tris-HCl和约300mM NaCl的pH为约7.2的第二洗涤缓冲液施加至所述ETOXICLEARTM树脂，并且分离包含所述第二洗涤缓冲液的流穿液；以及
(e)将包含约20mM Tris-HCl和约500mM NaCl的pH为7.2的洗脱缓冲液施加至所述ETOXICLEARTM树脂，并且收集包含所述IαIp的洗脱物。
149.一种从血浆中纯化IαIp的方法，所述方法包括：
(a)用包含15mM磷酸盐的pH为约5.5的稀释缓冲液稀释所述血浆，以形成稀释的血浆；
(b)将所述稀释的血浆施加至DETOXI-GELTM树脂，并且分离包含不与所述DETOXI-GELTM树脂结合的所述稀释的血浆的流穿液；
(c)将包含约15mM磷酸盐和约50mM NaCl的pH为约5.5的第一洗涤缓冲液施加至所述DETOXI-GELTM树脂，并且分离包含所述第一洗涤缓冲液的流穿液；
(d)将包含约15mM磷酸盐和约100mM NaCl的pH为约5.5的第二洗涤缓冲液施加至所述DETOXI-GELTM树脂，并且分离包含所述第二洗涤缓冲液的流穿液；以及
(e)将包含约15mM磷酸盐和约1,000mM NaCl的pH为约5.5的洗脱缓冲液施加至所述DETOXI-GELTM树脂，并且收集包含所述IαIp的洗脱物。
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