MX2007015051A - Metodos para purificar proteinas que contienen la region fc. - Google Patents

Abstract

La presente solicitud proporciona metodos para purificar polipeptidos que tienen una region de Fc, por ejemplo, anticuerpos o fusiones de anticuerpos, por la adsorcion de los polipeptidos a un agente de union de Fc, tal como, por ejemplo, la Proteina A o la Proteina G, seguido por un lavado con un regulador de sal de cation divalente, para remover las impurezas y en seguida recuperar los polipeptidos adsorbidos. La presente solicitud tambien caracteriza metodos de levigacion del polipeptido purificado, al igual que la incorporacion de los metodos dentro de un tren de purificacion. Tambien se suministran equipos que comprenden componentes para llevar a cabo los metodos y las instrucciones para el uso de los mismos.

Description

MÉTODOS PARA PURIFICAR PROTEÍNAS QUE CONTIENEN LA REGIÓN Fc SOLICITUDES RELACIONADAS Esta solicitud reclama prioridad a la solicitud de patente provisional "MÉTODOS PARA PURI FICAR PROTEÍNAS QUE CONTIENEN LA REGIÓN Fc" , presentada el 17 de junio del 2006, que tiene número de serie 60/691821 . Todo el contenido de esta solicitud se incorpora aqui .

ANTECEDENTES DE LA iNVENCIÓN Los anticuerpos son componentes potentes del sistema inmunológico de muchos animales y especialmente humanos. Los avances recientes en la tecnología recombinante han permitido la producción de anticuerpos contra virtualmente cualquier objetivo, por ejemplo células del cáncer, bacterias y virus. Tipicamente, se produce un anticuerpo usando una linea celular, que se ha obtenido por ingeniería, para expresar el anticuerpo a altos niveles. La linea celular de ingeniería es crecida subsiguientemente en un cultivo que comprende una mezcla compleja de azúcares, aminoácidos y factores del crecimiento, al igual que varias proteinas, que incluyen, por ejemplo, proteinas del suero. Sin embargo, la separación de anticuerpos completos de subproductos de células y componentes del cultivo con una pureza suficiente para el uso en investigaciones o como agentes terapéuticos, tiene un reto formidable. La purificación de las moléculas del anticuerpo es especialmente critica si estos anticuerpos se van a usar como una droga para la administración a humanos. Los esquemas (o trenes) de purificación tradicionales de anticuerpos a menudo comprenden una etapa de cromatografía, que explota la habilidad de la molécula del anticuerpo a unirse preferiblemente o ser retenidos por la fase sólida (o fase sólida funcionalizada) de una columna de cromatografía , comparada con la unión o retención de varias impurezas. Los esquemas han sido propuestos o llevados a cabo para purificar anticuerpos que unen primero las proteinas que contienen la región CH2/CH3 a la Proteina A, inmovilizada sobre una fase sólida, seguido por remoción de las impurezas unidas a la fase sólida por lavado de esta fase sólida con un solvente de electrólito hidrofóbico y la recuperación subsiguiente de las proteinas que contienen la región CH2/CH3 desde la fase sólida. Sin embargo, estos esquemas se limitan debido a que las condiciones usadas para unir preferiblemente las proteinas que contienen la región CH2/CH3 también soportan la unión de impurezas (por ejemplo, anticuerpos con regiones CH2/CH3 incompletas) . En el desarrollo de agentes terapéuticos humanos, tales impurezas son altamente indeseables. Por lo tanto, existe una necesidad para mejoras en la purificación de proteinas o polipéptidos, que tienen regiones constantes, en particular proteinas que tienen regiones Fc (por ejemplo, anticuerpos), producidas en el cultivo de células.

COMPENDIO DE LA INVENCIÓN En varios aspectos, la presente invención caracteriza métodos para separar una proteina, que tiene una región Fc, de un liquido fuente, que comprende la proteina y una o más impurezas. En los métodos de la invención, la proteinas, que tiene una región Fc (la proteina objetivo) es adsorbida a un agente de unión de Fc y luego este agente de unión de Fc se lava con una solución reguladora que contiene una sal de catión divalente, para remover una o más impurezas. La proteina es luego recuperada del agente de unión de Fc en una solución de levigación. los métodos de la invención son particularmente útiles en remover impurezas, tal como la lectura de intron a través de especies variantes (IRT), especies enlazadas najo disulfuro (UDB) y/o especies variantes de bajo peso molecular (LM ) . Los métodos de la invención también son efectivos en remover impurezas, tal como proteinas de células huésped (HCP) y el ADN.

Los métodos de la presente invención comprenden una o más etapas de separación cromatográfica y además pueden comprender una o más etapas de filtración. Las etapas de separación cromatográfica pueden ser continuas o discontinuas (por ejemplo, un acercamiento en lotes) o una combinación de ambas. En varias modalidades, los métodos comprenden una o más etapas de filtración, por ejemplo, para remover virus, concentrando y regulando la solución que contiene una proteina objetivo, y para remover contaminantes microbianos. En varias modalidades, la proteina que contiene la región Fc es un polipéptido de unión de anfigeno (por ejemplo, un anticuerpo o su fragmento) o una inmunoadhesión (por ejemplo, una inmunoadhesión del receptor de TNF) . En varias modalidades, la proteina que contiene la región Fc es una fusión de anticuerpo, un anticuerpo del murino, un anticuerpo quimérico o un anticuerpo humanizado. En una modalidad preferida, la proteina que contiene la región de Fc es un anticuerpo anti-IL-13 humano o humanizado. Alternativamente, en otras modalidades, la proteina que contiene la región Fc puede unirse a un antigeno tal como AD, CD3, CD52, VEGF, EGFR, CD33, CD20, HER-2, TNFD, CD25, RSV, IgE, gp Ilb/IIIa, CDlla O 04 integrina En varias modalidades, la proteina que contiene la región Fc es producida en forma recombinante. En otras modalidades, la proteina que contiene la región Fc es producida en forma recombinante en una célula del Ovario de Hámster Chino (CHO) En varias modalidades, esta una o más impurezas comprenden una o más de, una proteina de célula huésped, un ADN de célula huésped, una proteina de cultivo celular, una especie indeseada de la proteina que tiene una región de Fc, y sus mezclas. Por ejemplo, en varias modalidades, las especies indeseadas de la proteina que tienen una región Fc comprenden una o más cadenas de anticuerpo o sus fragmentos, que tienen la lectura de intron a través de la secuencia de una o más cadenas l' de anticuerpo o sus fragmentos, que tienen un enlace de disulfuro no apropiada, un semi-anticuerpo o su fragmento, un dimero de cadena ligera o su fragmento y un dimero de cadena pesada o su fragmento. En un aspecto, los métodos de la presente invención purifican una proteina que tiene una región de Fc de un liquido fuente, que comprende la proteina y una o más impurezas, adsorbiendo primero la proteina a un agente de unión de Fc, seguido por el lavado de este agente de unión de Fc con una solución reguladora que contiene una sal de catión divalente para remover una o más impurezas, y recuperar subsiguientemente la proteina desde el agente de unión de Fc . En varias modalidades, as etapas de adsorber la proteina a un agente de unión de Fc y el lavado del agente de unión de Fc con una solución reguladora que contiene una al de catión divalente, se realizan a temperaturas en el intervalo entre aproximadamente 2°C a alrededor de 24°C. En otras modalidades, la etapa de recuperación de la proteina desde el agente de unión de Fc comprende la levigación de la proteina usando un regulador que tiene un pH en el intervalo de aproximadamente 2.0 a alrededor de 6.5 En varias modalidades, el agente de unión de la región Fc comprende uno o más de la Proteina A y la Proteina G. En una modalidad preferida, el agente de unión de Fc es inmovilizado sobre una fase sólida. Esta fase sólida puede comprender, por ejemplo, uno o más de una perlita, una matriz de agarosa, silice y sus mezclas. La sal de catión divalente, presente en el regulador que se usa para lavar el agente de unión de Fc, comprende, por ejemplo, una sal caotrópica. Sales adecuadas de un catión divalente para la preparación de la solución reguladora de lavado, incluyen, pero no se limitan a, el cloruro de magnesio, cloruro de calcio, cloruro de niquel y sus mezclas. En varias modalidades, sales adecuadas de catión divalente, para la preparación de la solución de regulado de lavado incluyen, pero no se limitan a las sales de tiocianato (SCN") , perclorato (C104") nitrato (N03") , cloruro y bromuro del grupo II divalente (por ejemplo, cationes de magnesio, calcio, bario, etc.=, un metal de transición divalente (por ejemplo cationes de cobre, niquel, manganeso, etc.) y combinaciones de estas sales. En varias modalidades, la solución reguladora que contiene la sal de catión divalente, tiene un valor del pH en el intervalo entre aproximadamente 4 y alrededor de 9, y en algunas modalidades, entre aproximadamente 4 y alrededor de 8, entre aproximadamente 4.5 y alrededor de 7.5 o entre alrededor de 5 a alrededor de 8. Valores e intervalores incluidos y/o intermedios dentro de los intervalos, señalados aqui se intenta también estén dentro del ámbito de la presente invención. Por ejemplo, la sal de catión divalente tiene un valor del pH entre aproximadamente 7.1 y alrededor de 7.9, entre aproximadamente 7,2. y alrededor de 7.9, entre aproximadamente 7.3 y alrededor de 7.7, entre aproximadamente 7.4 y alrededor de 7.6, entre aproximadamente 4 y alrededor de 6, entre aproximadamente 5 y alrededor de 6, entre aproximadamente 6 y alrededor de 7, o entre aproximadamente 8 a alrededor de 9. Asimismo, intervalos que tienen los valores aqui mencionados como limites superior e inferior, se intenta estén dentro del ámbito de la presente invención. Por ejemplo, la sal de catión divalente tiene un pH de cuando menos aproximadamente 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5 u 8.

En varias modalidades, la solución reguladora tiene una concentración de la sal del catión divalente en el intervalo entre aproximadamente 0. ÍM hasta aproximadamente 5M, y en algunas modalidades, entre aproximadamente 0.5M a aproximadamente 3M, entre aproximadamente l.OM a aproximadamente 3M o entre aproximadamente 0.6M a aproximadamente 2.5M. Por ejemplo, el regulador de catión divalente puede comprender cuando menos alrededor de 0.6M de CaCl2 o al menos alrededor de 2M de MgCl2 o al menos alrededor de 2M de CaCl2. Los valores de intervalores incluidos y/o intermedios dentro de los intervalos señalados aqui también se intenta estén dentro del ámbito de la presente invención. Por ejemplo, la solución reguladora tiene una concentración de la sal de catión divalente entre alrededor de 0.5M a alrededor de 0.75M, entre alrededor de 0.5M a alrededor de 0.8M, entre alrededor de 0.5M a alrededor de 0.9 M, entre alrededor de 05 M a l.OM, entre alrededor de 0.5M a 2M, entre alrededor de 1.5M a alrededor de 2M, entre alrededor de 1.5M a alrededor de 2.5M, entre alrededor de 1.5M a alrededor de 3.0M, o entre alrededor de 2.5 M a alrededor de 3M. Asimismo, los intervalos que tienen los valores mencionados aqui como limites superior e inferior, se intenta estén dentro del ámbito de la presente invención. Por ejemplo, la solución reguladora tiene una concentración de sal de catión divalente de al menos alrededor de 0.6M, ÍM, 1.5M, 2M, 2.5M o 3M. En varias modalidades, la solución reguladora que contiene la sal del catión divalente tiene una temperatura en el intervalo entre aproximadamente 2°C a aproximadamente 24 °C. En varias modalidades, la etapa de recuperar la proteina del agente de unión de Fc, comprende la levigación de la proteina usando un regulador que tiene un pH en el intervalo de aproximadamente 2.0 a aproximadamente 6.5, preferiblemente en el intervalo de alrededor de 2.0 a alrededor de 4.0, más preferiblemente en el intervalo de alrededor de 2.5 a alrededor de 3.5. Valores e intervalos incluidos y/o intermedios están dentro del ámbito de la presente invención. Por ejemplo, el regulador de levigación tiene un pH entre alrededor de 2 a alrededor de 3 o entre alrededor de 3 a alrededor de 4. Asimismo, los intervalos que tienen los valores aqui mencionados, como un limite superior o inferior, se intenta estén dentro del ámbito de la presente invención. Por ejemplo, el regulador de levigación tiene un pH de cuando menos aproximadamente 2, 2.5, 3, 3. ó 4. En varias modalidades, las proteinas recuperadas pueden ser sometidas a etapas de purificación adicionales, o antes o después de la etapa de cromatografía del agente de unión de Fc . Por ejemplo, otras etapas de purificación ejemplares incluyen, pero no se limitan a la cromatografía de intercambio de aniones, cromatografía de intercambio de cationes, cromatografía de afinidad de metal inmovilizado, cromatografía de interacción hidrofóbica (HIC) , cromatografía de hidroxiapatita, diálisis, cromatografía de afinidad, precipitación del sulfato de amonio, precipitación del etano, HPLC de fase inversa (RP-HPLC) , cromato-enfoque, ultrafiltración, diafiltración, microfiltración y filtración de gel. En varias modalidades, la etapa de cromatografía del agente de unión de Fc es seguida por una cromatografía de intercambio de aniones y una etapa de HIC. En varias modalidades, las etapas de cromatografía son además seguidas por una etapa de filtración de virus, una etapa de ultrafiltración / diafiltración, y/o una etapa de filtración de contaminante microbiano. En un aspecto, la presente invención proporciona métodos para purificar un anticuerpo de una solución que contiene impurezas del mismo. En varias modalidades, los métodos comprenden primero adsorber la proteína a un agente de unión de Fc, seguido por lavado del agente de unión de Fc con una solución reguladora que contiene una sal de un catión divalente para remover una o más impurezas, y en seguida recuperar la proteína del agente de unión de Fc, para producir un primer grupo de eluyentes.

En varias modalidades, el proceso de purificación continúa sometiendo el primer grupo de eluyentes a la cromatografía de intercambio de iones, por el contacto de una resina de intercambio de iones con la primera combinación de eluyentes, de manera que la proteína objetivo no se adsorba a la resina y recuperar la proteína objetivo a través del flujo, para producir una segunda combinación de eluyentes. En varias modalidades, la etapa de la cromatografía de intercambio de iones además comprende lavar la resina de intercambio de iones con una solución de lavado regulada, para recuperar cuando menos una porción de cualquier proteína adsorbida objetivo. En varias modalidades, el proceso de purificación continúa sometiendo la segunda combinación de eluyentes a la cromatografía de interacción hidrofóbica, por adsorber la proteína objetivo a una resina de interacción hidrofóbica (por ejemplo, una fase sólida funcionalizada con ligaduras hidrofóbicas), lavado de la resina de interacción hidrofóbica con una solución de lavado regulada con una fuerza iónica que no eluye sustancialmente la proteína objetivo, y recuperación de la proteína objetivo purificada (usando típicamente un regulador de levigación con una fuerza iónica suficientemente baja para desorber la proteína objetivo de la resina de interacción hidrofóbica) .

En las modalidades preferidas de los varios aspectos de las invenciones, el agente de unión de Fc se inmoviliza en una fase sólida, la cual es equilibrada preferiblemente con un regulador adecuado, antes del contacto con el líquido fuente. La fase sólida es preferiblemente una columna que comprende agarosa que inmoviliza el agente de unión de Fc . En varias modalidades, la columna se recubre con un reactivo, tal como el glicerol, para disminuir o evitar la adherencia no específica a la columna. En varias modalidades, las proteínas purificadas por los métodos de la presente invención, se pueden formular en un portador aceptable farmacéuticamente y usadas para varios usos de diagnóstico, terapéuticos u otros usos conocidos para tales moléculas . En varios aspectos, la presente invención proporciona métodos para purificar la proteína que contiene la región Fc de una solución que contiene la proteína y sus variantes a través de la lectura de intron (IRT) . En aspectos característicos, los métodos de la presente invención se usan para reducir los niveles de una o más especies de variantes a través de la lectura de intron en una preparación de proteína, por ejemplo, en una preparación de anticuerpo. En varias modalidades, la proteína recuperada del agente de unión de Fc tiene un nivel de variantes a través de la lectura de intron que es al menos de 5 veces menor que el nivel de las variantes a través de la lectura de intron en el líquido de fuente, y en algunas modalidades, al menos 10 veces menor que el nivel de las variantes a través de la lectura de intron en el líquido de fuente. En varias modalidades, las variantes a través de la lectura de intron comprenden menos de aproximadamente el .10%, 0.8%, 0.5%. 0.2% ó 0.1% de las especies de dicha proteína en la solución que contiene la proteína recuperada del agente de unión de Fc . En varios aspectos, la presente invención proporciona métodos para purificar una proteína que contiene la región de Fc de una solución que contiene la proteína y sus variantes de bajo peso molecular (LMW) . En aspectos característicos, se usan los métodos de la presente invención para reducir los niveles de uno o más especies de variantes de bajo peso molecular en una preparación de proteínas, por ejemplo, en una preparación de anticuerpos. En varias modalidades, la proteína recuperada del agente de unión de Fc, tiene un nivel de variantes de bajo peso molecular, que es al menos 5 veces menor que el nivel de variantes de bajo peso molecular en el líquido fuente y, en algunas modalidades, al menos 10 veces menor que el nivel de variantes de bajo peso molecular en el líquido fuente. En varias modalidades, las variantes de bajo peso molecular comprenden menor de aproximadamente el 1.0%, 0.8%, 0.5%, 0.2% o 0.2% de las especies de dicha proteína en la solución que contiene dicha proteína, recuperada desde el agente de unión de Fc. En varios aspectos, la presente invención proporciona métodos de purificar una proteína que contiene la región de Fc de una solución que contiene la proteína y sus variantes unidas bajo el disulfuro (UDB) . En aspectos caracterizados, los métode la presente invención se usan para reducir los niveles de una o más especies de variantes unidas najo disulfuro en una preparación de proteínas, por ejemplo, en una preparación de anticuerpos. En varias modalidades, la proteína recuperada del agente de unión de Fc tiene un nivel de las variantes unidas najo disulfuro que es al menos de 5 veces menor que el nivel de variantes unidas bajo disulfuro en el líquido fuente, y en algunas modalidades, al menos 10 veces menor que el nivel de variantes unidas najo disulfuro en el líquido fuente. En varias modalidades, las variantes unidas al disulfuro comprenden menos de aproximadamente el 20%, 15%, 10%, % o 1% de las especies de dicha proteína en la solución que contiene dicha proteína recuperada del agente de unión de Fc . En otro aspecto, la invención pertenece a una proteína que contiene la región Fc purificada de acuerdo con el método de la invención.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un sistema adecuado para realizar cualquiera de los métodos que comprenden al menos las etapas de primero adsorber la proteína a un agente de unión de Fc, seguido por el lavado del agente de unión de Fc con una solución reguladora que contiene una sal de catión divalente, para remover una o más impurezas, y en seguida recuperar la proteína del agente de unión de Fc . En otros aspectos, la presente invención proporciona un tren de purificación para realizar cualquiera de los métodos, que comprende al menos las etapas de primero adsorber la proteína al agente de unión de Fc, seguido por el levado del agente de unión de Fc, con una solución reguladora, que contiene una sal de catión divalente, para remover una o más impurezas, y en seguida recuperar la proteína del agente de unión de Fc. La presente invención también se caracteriza en varios aspectos al equipo para el uso en realizar uno o más de los métodos de la presente invención. En varias modalidades, el equipo comprende al menos un reactivo e instrucciones para el uso de este equipo. Por ejemplo, un equipo puede comprender uno o más reactivos, tal como un agente de unión de Fc, una al de catión divalente y reactivos para la preparación de la solución de lavado de regulación, que contiene una sal de catión divalente, junto con las instrucciones para el uso de dicho equipo.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENC8ÓN Antes de describir ulteriormente la invención, puede ser útil en su entendimiento, señalar definiciones de ciertos términos que serán usados aquí. Las definiciones aquí señaladas se han agrupado para facilidad de referencia solamente y no de alguna manera de limitación.

Definiciones Relacionadas a Proteínas En varios aspectos, la presente invención proporciona métodos para purificar una proteína que contiene la región de Fc de una solución que contiene la proteína y una o más de sus variantes a través de la lectura, tal como, por ejemplo, variantes a través de la lectura de intron. En aspectos caracterizados, se usan los métodos de la presente invención para reducir los niveles de una o más especies de variantes a través de la lectura de intron (IRT) en una preparación de proteína, por ejemplo en una preparación de anticuerpo. Los términos de "variante a través de la lectura de intron" y "especies variantes a través de la lectura de intron" se usan intercambiablemente aquí y se refieren al producto de un proceso donde en la síntesis de la proteína que contiene la región de Fc de interés (por ejemplo, la proteína objetivo), se termina el alargamiento de la cadena del polipéptido antes de la trascripción de una región de codificación por un codón de detención en el intron, antes de la región de codificación. El resultado es una variante de la proteína de interés (es decir, una variante a través de la lectura de intron) con uno o más dominios incompletos o perdidos. Estos introns pueden contener más de un codón de detención, lo que resulta en la posibilidad de producir varias diferentes variantes a través de la lectura de intron. El término de "la variante enlazada bajo disulfuro" o "UDB" se refiere a cualquier especie donde al menos un enlace de disulfuro se pierde. Este enlace de disulfuro que se pierde puede ser cualquiera de un enlace de disulfuro de intercadena o un enlace de disulfuro de intracadena o una combinación de los dos. El término de "especies de bajo peso molecular" o especies de "LM ", se refiere a variantes de las proteínas que contienen la región de Fc, que incluyen las especies de proteínas que consisten de una cadena pesada libre, cadena ligera libre, especies de IRT, semi-moléculas, y tres cuartos de moléculas, o sus mezclas.

La Proteína A es una proteína de pared celular de aproximadamente 42 kD, encontrada en la mayoría de las cepas de Streptococcus áureas que se unen con alta afinidad (alrededor de 10"8M a la IgG humana) a la región de Fc de anticuerpos. Según se usa aquí, el término de "Proteína A" abarca la Proteína A recuperada de su fuente nativa. La Proteína A, producida sintéticamente (por ejemplo por la síntesis de péptidos por técnicas recombinantes, etc.) y sus variantes las cuales retienen la habilidad de unirse a proteínas que tienen una región de CH2/ CH3. La Proteína G es una proteína de pared celular del grupo de G Strptococci . La Proteína G es un tipo de III-Fc-receptor, que se une con alta afinidad a la región de Fc de anticuerpos, en particular a anticuerpos de IgG. Según se usa aquí, el término de "Proteína G" abarca la Proteína G recuperada de su fuente nativa. La Proteína G producida sintéticamente (por ejemplo, por la síntesis de péptidos, por técnicas recombinantes, etc.) y sus variantes, las cuales retienen la capacidad de unirse a proteínas, que tienen una región de Fc . El término de "anticuerpo" o "inmunoglobulina" (usadas aquí intercambiablemente) se refiere a una proteína de unión de antígeno, que tiene una estructura de cadena básica de cuatro polipéptidos, que consiste de dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras, dichas cadenas se estabilizan, por ejemplo, por los enlaces de disulfuro de intercadenas, los cuales tienen la capacidad de específicamente unirse al antigeno. Las cadenas tanto pesadas como ligeras se doblan en dominios. El término de "dominio" se refiere a una región globular de un polipéptido de cadena pesada o ligera que emprende lazos de péptidos (por ejemplo, que comprende 3 a 4 lazos de péptidos) estabilizados, por ejemplo, por hojas ß-plegables y/o enlace de disulfuro intercadena. Los dominios son además referidos aquí como "constantes" o "variables", con base en la carencia relativa de variación de secuencia, dentro de los dominios de varios miembros de clase en el caso de un dominio "consistente" o la variación significante dentro de los dominios de varios miembros de clase en el caso de un dominio "variable". Los dominios "constantes" en la cadena ligera se refieren a la capacidad de intercambio como "regiones constantes de cadena ligera", "dominios constantes de cadena ligera", regiones "CL" o dominios "CL") . Los dominios "constantes en la cadena pesada son referidos intercambiablemente como "regiones constantes de cadena pesada", "dominios constantes de cadena pesada", regiones "CH" o dominico "CH") Los dominios "variables" en la cadena ligera se refieren intercambiablemente como "regiones variables de cadena ligera", "dominios variables de cadena ligera", regiones "VL" o dominios "VL"). Los dominios variables en la cadena pesada son referidos intercambiablemente como "regiones variables de cadena pesada", "dominios variables de cadena pesada", regiones "VB" o dominios "VH" . El término de "fragmento" se refiere a una parte o porción de un anticuerpo o cadena de anticuerpo que comprende menos residuos de aminoácidos que un anticuerpo o cadena de anticuerpo intacto o completo. Los fragmentos se pueden obtener por medios químicos o tratamiento enzimático de un anticuerpo intacto o completo o una cadena de anticuerpos. Los fragmentos pueden también ser obtenidos por medios recombinantes. Fragmentos ejemplares incluyen Fab, Fab', F(ab')2, Fabc y/o fragmentos Fc . El término de "fragmento de unión al antígeno" se refiere a un fragmento de polipéptido de una inmunoglobulina o anticuerpo que se une al antígeno o compite con el anticuerpo intacto desde el cual se deriva para la unión específica al antígeno. Los términos de "proteína de fusión de anticuerpo" y "fusión de anticuerpo" se refieren a una proteína de fusión que incluye toda o una porción de un anticuerpo fundido a cuando menos una porción o polipéptido de proteína no de anticuerpo. La fusión se acompaña generalmente por ingeniería genética del gene que codifica dicha proteína. Proteínas de fusión de anticuerpo ejemplares adicionales incluyen la porción de unión del receptor de célula de un anticuerpo (que incluye la región de Fc) fundida a toda o una porción de otra proteína biológica soluble o celular, por ejemplo un receptor (celular o soluble) o su porción, una citocina o su porción, una enzima o su porción, etc. Tales proteínas de fusión de anticuerpo que comprenden la región Fc del anticuerpo fundido a otra proteína, son también referidos en la técnica como proteínas de fusión de Fc. El término de "agente de unión de Fc" se refiere a una molécula que es capaz de unirse a la región de Fc de un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo de la IgG) que incluye, pero no se limita a, una proteína de complemento, un receptor de Fc o una proteína derivada de bacterias, tal como la Proteína A o Proteína G, que tienen alta afinidad para la región Fc de un anticuerpo. El término de " ¡ región Fc" se refiere a región de la terminal C de un anticuerpo de la IgG, en particular, la región de la terminal C de la(s) cadena (s) pesada (s) de dicho anticuerpo de la IgG. Aunque los límites de la región Fc de una cadena pesada de la IgG puede variar levemente, una región Fc es definida típicamente como extendiédose desde aproximadamente el residuo de aminoácido Cys 226 a la terminal de carboxilo de la cadena pesada de la IgG.

Definiciones Relacionadas a la Cromatografía El término de "líquido de fuente!, según se usa aquí, se refiere a un líquido que contiene cuando menos una sustancia objetivo, la cual se busca será purificada de otras sustancias. también presentes. Los líquidos de fuente pueden, por ejemplo, ser soluciones acuosas, sistemas de solventes orgánicos o mezclas o soluciones acuosas de solventes orgánicos. Los líquidos de fuente son a menudo mezclas o soluciones complejas que contienen muchas molécula biológicas (tal como proteínas, anticuerpo, hormonas y virus), pequeñas moléculas (tal como sales, azúcares, lipidos, etc.) y aún materia de partículas. Mientras un líquido típico de fuente de origen biológico puede comenzar como una solución o suspensión acuosa, también contenderá solventes orgánicos usados en las etapas de separación más tempranas, tal como precipitaciones de solventes, extracciones y similares. Ejemplos de líquidos de fuente que pueden contener valiosas sustancias biológicas adecuadaza para la purificación por las varias modalidades de la presente invención, incluyen, pero no se limitan a, un sobrenadante de cultivo de un bio-reactor. una suspensión celular homogeneizada, plasma, fracciones de plasma y leches. El término de "sustancia objetivo" o "proteína objetivo" se refiere aquí a una o más proteínas deseadas que contienen la región Fc, que se van a purificar del líquido de fuente. La sustancia objetivo puede estar presente en el líquido de fuente como una suspensión o en solución. El término de "impurezas" se refiere a materiales en el líquido de fuente, que son diferentes de la(s) sustancia (s) objetivo y se excluyen convenientemente de los productos de una sustancia objetivo final. Impurezas típicas incluyen los ácidos nucleicos, proteínas (que incluyen las especies a través de la lectura de intron, especies de bajo peso molecular, y bajo especies de unión de disulfuro, péptidos, endotoxinas, virus y moléculas pequeñas. Según se usa aquí, el término de "fase sólida" se refiere a una matriz no acuosa con la cual interactúa la sustancia objetivo durante la purificación o a la cual un agente de unión de Fc puede adherirse. Materiales adecuados de fase sólida incluyen, pero no se limitan a, el vidrio, sílice (por ejemplo el gel de sílice) , polisacáridos (por ejemplo una matriz de polisacárido) tal como la agarosa y celulosa, polímeros orgánicos, tal co o la poliacrilamida, metilmetacrilato y copolímeros de poliestireno-divinilbenceno, tal como, por ejemplo, la resina Amberlite™ (disponible comercialmente de Rohm & Haas Chemical Co. , Philadelphia, Pa.) La fase sólida puede ser seleccionada de cualquiera de los grupos de resinas, descritas comúnmente como resinas de afinidad de intercambio de iones y resinas de afinidad de captura de iones. La fase sólida puede ser, por ejemplo, una columna de purificación, una fase discontinua de partículas discretas o una combinación de los mismos, y puede se compresible o incompresible. En varias modalidades, la fase sólida es una matriz polimérica o una partícula o perlita de agarosa. En varias modalidades, la fase sólida puede ser recubierta con un reactivo (tal como el glicerol) por ejemplo, para prevenir la adherencia no específica de impurezas a la fase sólida. Una fase sólida de unión a Fc necesita solamente poseer una ligadura química o asociada que permite que el agente de unión de Fc se adhiera a la superficie de la fase sólida. Materiales preferidos de la fase sólida serán física como químicamente resilientes a las condiciones empleadas en el proceso de purificación, que incluye el bombeo y la filtración de flujo cruzado y las temperaturas, pH y otros aspectos de los líquidos empleados. La "ligadura de afinidad" se refiere a una parte que se une selectiva o preferencialmente a un componente del líquido de fuente a través de una interacción específica con un sitio de unión del componente. En la presente invención, la ligadura de afinidad (por ejemplo, un agente de ligadura de Fc) está típicamente inmovilizada a una fase sólida, tal como una resina. Ejemplos de ligaduras de afinidad que pueden ser unidas al soporte de resina para proporcionar las resinas de cromatografía útiles en el proceso de la presente invención, incluyen, pero no se limitan a, la Proteína A, Proteína G y sus análogos, los cuales se unen selectivamente a una región Fc de la proteína. Métodos de unir las ligaduras de afinidad a materiales de soporte sólido son bien conocidos en la técnica de purificación. Véase, por ejemplo, los textos de referencia, Separaciones de Afinidad: Un Acercamiento Práctico (Series de Acercamientos Prácticos), Paul Matejtschuk (Editor) Irl Pr . 1997 y Cromatografía de Afinidad, Herbert Schott, Marcel Dekker, New York, 1997. La "resina de cromatografía de afinidad" o ""resina de afinidad" se refiere a una resina de cromatografía que comprende una fase sólida o substrato con ligaduras de afinidad unidas a sus superficies. La "resina de cromatografía de intercambio de iones" o "resina de intercambio de iones" se refiere a un soporte sólido al cual se unen covalentemente ligaduras que llevan una carga positiva o negativa, y la cual tiene así contraiones libres, disponibles para el intercambio con iones en una solución con la cual la resina de intercambio de iones hace contacto. Las "resinas de intercambio de cationes" se refiere a una resina de intercambio de iones con ligaduras cargadas negativamente de un enlace covalente, y que así tiene cationes libres para el intercambio con cationes en una solución, con la cual hace contacto la resina. Una amplia variedad de las resinas de intercmabio de cationes se conoce en la técnica, por ejemplo, aquellas en que los grupos de enlace covalente son de carboxilato o sulfonato. Resinas de intercambio de cationes, disponibles comercialmente, incluyen la VMC-celulosa, S-Sephadex™ y Fast S- Sepharose™ (las últimas, disponibles comercialmente de Pharmacia) . Las "resinas de intercambio de aniones" se refieren a una resina de intercmabio de iones con grupos cargados positivamente enlazados covalentemente, tal como grupos de amino cuaternarios. Resinas de intercambio de aniones, disponibles comercialmente, incluyen la DEAE celulosa, TMAR, OAE Sephadex™ y Fast Q Sepharose™ (la última disponible comercialmente de Pharmacia). Según se usa aquí, el término de "sal caotrópica" se refiere a una sal que comprende uno o más componentes iónicos, que son bajos en la serie liotrópica, que son capaces de penetrar las cubiertas de hidratación de proteínas y unirse directamente a sus superficies. Esto interrumpe la asociación cohidrativa, favorecen la solubilización de proteína. Ejemplos de sales caotrópicas incluyen, pero no se limitan a ellas, son las sales de haluro de elementos del Grupo II (por ejemplo el cloruro de calcio, cloruro de magnesio, cloruro de bario, bromuro de calcio, bromuro de magnesio, bromuro de bario, yoduro de calcio, yoduro de magnesio, yoduro de bario) . Ejemplos de sales de cationes divalentes adecuados incluyen, pero no se limitan a, sales de Mn2+, Ni2+, o Cu2+, Mg2+, Ca2+ y Ba2+, con el tioisocianato (SCN") , percloradto (C104+) , nitrato (N03") , cloruro Cl") y bromuro (Br") y sus combinaciones . En ciertas modalidades, la al de catión divalente comprende un catión divalente (por ejemplo, Mg2+, Ca2+, Ni2+ o Ba2+) . Sales caotrópicas preferidas para el uso en los procesos caracterizados son: MgCl, NiCl2 y CaCl2. Después de la etapa de lavado de la al de catión divalente, la proteína objetivo se eluye de la matriz de cromatografía de afinidad. Un "reglador" o "amortiguador" es una sustancia que, por su presencia en la solución, aumenta la cantidad de ácido o álcali que debe ser agregada para causar un cambio en la unidad en el pH . Una solución regulada resiste cambios en el pH por la acción de sus componentes conjugados de ácido-base. Soluciones reguladas para su uso con los reactivos biológicos son generalmente capaces de mantener una concentración constante de iones de hidrógeno de modo que el pH de la solución esté dentro de un intervalo fisiológico. El término de "pH fisiológico" se refiere al pH de la sangre del mamífero (es decir de 7.38 a alrededor de 7.4) Así, un intervalo del pH fisiológico es de aproximadamente 7.2 a 7.6. Componentes reguladores tradicionales incluyen, pero no se limitan a, las sales orgánicas e inorgánicas, ácidos y bases. Reguladores ejemplares para su uso en la purificación de moléculas biológicas (por ejemplo moléculas de proteínas) incluyen los reguladores zwitteriónicos (ambiguos) o "Reguladores Good", véase, por ejemplo, Good et al (1966) Biochemistry 5 : 467 y Good e Iawa (1912) TES, MES, PIPES, HEPES, MOPS, MOPSO, TRICINE y BICINE. El "regulador de equilibrio" aquí es un regulador (usado para preparar el reactivo de unión de Fc, la fase sólida o ambos, para cargar el líquido de fuente que contiene la proteína objetivo. El regulador de equilibrio es preferiblemente isotónico y tiene comúnmente un pH en el intervalo de aproximadamente 6 a alrededor de 8. Eñ "regulador de carga" es un regulador usado para cargar el líquido de fuente que incluye la proteína que contiene la región de Fc e impurezas sobre la fase sólida, a la cual el agente de unión de Fc se inmoviliza. A menudo, los reguladores de equilibrio y de carga son los mismos. El "regulador de levigación" se usa para levigar la proteína que contiene la región de Fc del agente de unión de Fc inmovilizado. Preferiblemente, el regulador de levigación tiene un pH bajo ye interrumpe así las interacciones entre el agente de unión de Fc y la proteína de interés. Preferiblemente, el regulador de levigación de pH bajo tiene un pH en el intervalo de aproximadamente 2 a aproximadamente 5, más preferiblemente en el intervalo de aproximadamente 3 a aproximadamente 4. Ejemplos de reguladores que controlan el pH dentro de este intervalo incluyen los reguladores del fosfato, acetato, citrato y amonio, al igual que sus combinaciones, os reguladores preferidos son aquellos de citrato y de acetato, más preferiblemente el regulador del citrato de sodio o el acetato de sodio, Otros reguladores de levigación son considerados, que incluyen los reguladores de pH alto (por ejemplo, aquellos que tienen un pH de 9 o más) o reguladores que comprenden un compuesto o composición, tal como el MgCl2 )2 mM) para la levigación de la proteína de interés. El "líquido de lavado" o "regulador de lavado", según se usa aquí, se refiere al líquido usado para alejar las impurezas de la resina de cromatografía a la cual se une la sustancia objetivo. Se puede emplear más de un líquido de lavado en secuencia, por ejemplo con líquidos de lavado sucesivos que tienen varias propiedades, tal como pH, conductividad, concentración de solvente, etc., diseñado para disociar y remover varios tipos de impurezas, que se asocian no específicamente con la resina de cromatografía. El "líquido de levigación" o "regulador de levigación" se refiere aquí al líquido que se usa para disociar la sustancia objetivo déla resina de cromatografía, después que se ha lavado con uno o más líquidos de lavado. El líquido de levigación actúa para disociar la sustancia objetivo sin desnaturalizarla irreversiblemente. Líquidos de levigación típicos son bien conocidos en la técnica de cromatografía y pueden tener concentraciones mayores de sales, ligaduras de afinidad libres o análogos u otras sustancias que promueven la disociación de la sustancia objetivo desde la resina de cromatografía. Las "condiciones de levigación" se refieren a las condiciones del proceso impuestas en la resina de cromatografía que se une a la sustancia objetivo, que disocia esta sustancia objetivo de la resina de cromatografía, tal como el contacto de la resina de cromatografía unida a la sustancia objetivo con un líquido de levigación o regulador de levigación, para producir tal disociación. El ¡líquido de limpieza" o "regulador de limpieza" se refiere aquí al líquido que se usa para lavar la resina de cromatografía, después de completar el proceso de purificación. El líquido de limpieza puede contener un detergente, un agente que inactiva virus, o concentraciones relativamente altas de sales, y puede tener un pH mayor o menor que los líquidos usados durante el proceso de purificación. Su propósito es descontaminar la resina de cromatografía para hacerla lista para su reutilización. Los líquidos de limpieza son bien conocidos en la técnica de cromatografía.

El "líquido de almacenamiento" o "regulador de almacenamiento" se refiere aquí al líquido en el cual se suspender la resina de cromatografía entre usos. Los líquidos de almacenamiento, además de los iones de regulación, pueden también microbicidas u otros preservativos. Estos líquidos de almacenamiento son bien conocidos en la técnica de cromatografía . En varios aspectos, la presente invención caracteriza métodos para purificar una proteína que tiene una región de Fc, desde un líquido de fuente que comprende la proteína y una o más impurezas, por adsorber la proteína a un agente de unión de Fc, seguido por lavado de este agente de unión de Fc con una solución reguladora que contiene una sal de catión divalente, para remover una o más impurezas y en seguida recuperar la proteína desde el agente de unión de Fc . Agentes adecuados de unión de Fc incluyen, pero no se limitan a, la Proteína A y la Proteína G. La presente invención caracteriza procesos para la purificación de proteínas que contienen la región Fc, por ejemplo, anticuerpos. Procesos de purificación ejemplares incluyen una etapa de cromatografía de afinidad. Esta etapa de cromatografía de afinidad puede ser continua, discontinua o una combinación de ambas. Por ejemplo, la etapa de cromatografía de afinidad puede ser realizada como un proceso discontinuo, tal como, por ejemplo, un proceso en lotes. La cromatografía de afinidad es el proceso de adsorción bioselectiva y la recuperación subsiguiente de un compuesto objetivo desde una ligadura inmovilizada. Este proceso permite la purificación altamente específica y eficiente del compuesto objetivo. El proceso requiere la utilización de una ligadura selectiva apropiadamente (por ejemplo, el agente de ligadura de Fc) que se unirá al compuesto objetivo (por ejemplo la proteína que contiene la región de Fc) generalmente con una constante de disociación en el intervalo de 10"4 a 10"8, mientras permite la recuperación bajo condiciones moderadas. La ligadura está generalmente inmovilizada sobre una matriz de perlitas y porosa, la cual puede estar en la forma de un medio de paquete de columna o de adsorción en lotes. Un agente de unión preferido es la Proteína A. La Proteína A se une a la región Fc de las inmunoglobulinas. Esta Proteína A consiste de seis regiones, cinco de las cuales se unen a la IgG. Se une con alta afinidad a las igGi, IgG3 e IgG4 humanas, al igual que la IgG2a, IgG2b e IgG3. La Proteína A se une con afinidad moderada a las IgD, IgM, IgA e IgE, humanas, al igual que la IgGi del ratón. Como una ligadura de afinidad, la Proteína A se inmoviliza a una matriz de modo que estas regiones estén libres de unión. Una molécula de la Proteína A inmovilizada puede unirse a cuando menos dos moléculas de IgG.

Las versiones nativas y recombinantes de la Proteína A comparten especificidad similar para la región Fc de la IgG. La Proteína A recombinante (r (Proteína A) puede ser tratada por ingeniería para incluir, por ejemplo, una cisteína de la terminal C y puede estar inmovilizada por medio de un acoplamiento de tioéster a una matriz de fase sólida. Tal acoplamiento resulta en la capacidad de unión aumentada de la proteína A. Un agente de unión alternativo es la Proteína G. Esta Proteína G es específica para la unión de la IgG con alta afinidad para la IgGi , IgG2, IgG3 e IgG4, humanas, al igual que la IgGi e IgG3 del ratón.. La Proteína G PLUS tiene una afinidad moderada para la IgG4 humana y la IgG2a, IgG2b, e IgG3 del ratón. La Proteína G recombinante (rProtína G) puede ser tratada por ingeniería para suprimir la región de unión de albúmina de la proteína nativa. La Proteína G recombinante contiene dos regiones de unión de Fc. Un agente de unión alternativo es la Proteína A/G. Esta Proteína A/G es una proteína genéticamente de ingeniería que combina los perfiles de unión de la IgG de ambas Proteína A y Proteína G. Es un producto de fusión de gene secretado de una forma no patógena de Bacillus . La Proteína A/G contiene cuatro dominios de unión de Fc de la Proteína A y dos de la Proteína G. La Proteína A/G no es dependiente del pH como la Proteína A, pero de otra manera tiene las propiedades aditivas de la Proteína A y G. Esta Proteína A/G se une a las subclase de la IgG humana, particularmente adecuadas para la purificación de los anticuerpos de la IgG policlonales o monoclonales, cuyas subclases no se han determinado. Además, se une a IgA, IgE, IgM y (en una extensión menor) a IgD. La proteína A/G también se une bien a todas las subclases de la IgG del ratón, particularmente adecuadas para la purificación de anticuerpos monoclonales del ratón desde las subclases de la IgG, sin interferencia de la IgA, IgM y albúmina del suero del murino (Véase, por ejemplo, Suikkema (1989) Amer. Biotech . Lab 7, 42) . Subclases individuales de tipos monoclonales del ratón pueden tener una afinidad más fuerte para la Proteína A/G quimérica, comparada con cualquiera de la Proteína A o la Proteína G. (Véase, por ejemplo, Eliasson et al (1989), J. Biol . Chem . 263, 4323-4327. ) En la presente invención, el agente de unión de Fc inmovilizado (por ejemplo, la Proteína A) se lava con una solución de sal de catión divalente para remover impurezas. En particular, se ha descubierto que las impurezas indeseadas, producidas como resultado de las tecnologías de expresión del anticuerpo recombinante, pueden ser removidas usando una etapa de lavado de la sal de catión divalente.

Los métodos de la presente invención pueden incluir, opcionalmente, etapas subsiguientes a la cromatografía de afinidad y la etapa de lavado de catión divalente. La etapas de purificación subsiguientes pueden incluir una etapa de cromatografía de intercambio de iones y/o una etapa de cromatografía de interacción hidrofóbica (HIC) . Las etapas de cromatografía subsiguientes pueden ser continuas, discontinuas (por ejemplo, tal como un proceso en lotes) o una combinación de ambas. La cromatografía de intercambio de iones separa las moléculas basado en las diferencias entre la carga general de las proteínas. La proteína objetivo de tener una carga opuesta a aquella del grupo funcional adjunto a la resina para la unión. Por ejemplo, los anticuerpos, que tienen generalmente una carga positiva general se unirán bien a los intercambiadores de cationes, que contienen grupos funcionales cargados negativamente. Debido a que esta interacción es iónica, la unión debe tomar lugar bajo condiciones iónicas bajas. Se logra la levigación aumentando la fuerza iónica para romper la interacción iónica, o por cambiar el pH de la proteína. En tanto la cromatografía de intercambio depende de las cargas de las proteínas para aislarlas, la cromatografía de interacción hidrofobica usa las propiedades hidrofóbicas de algunas proteínas. Grupos hidrofóbicos en la proteína se unen a los grupos hidrofílicos en la columna. Cuanto más hidrofóbica sea una proteína, más fuerte se unirá a la columna. La etapa de HIC remueve, por ejemplo, las impurezas derivadas de células huésped (por ejemplo el ADN y otras especies relacionadas con productos de alto y bajo peso molecular) . Otras etapas de purificación pueden incluir las etapas de remoción de virus al igual que las etapas de ultrafiltrción y/o diafiltración, como se describen aquí. En varias modalidades, la proteína que contiene la región de Fc es un anticuerpo o una proteína de fusión de anticuerpo que tiene una región de Fc que se une a un receptor de Fc del agente de unión de Fc . El uso de la solución reguladora que contiene una sal de catión divalente para lavar el agente de unión de Fc, permite mayor remoción de impurezas, tal como, por ejemplo, variantes a través de lectura y fragmentos que contienen una región constante, que incluyen las especies de L W y UDB) de la proteína de interés (por ejemplo, la sustancia objetivo en el líquido de fuente) . Los métodos de la presente invención comprenden una o más etapas de separación cromatográfica y además pueden comprender una o más etapas de filtración, para separar una proteína, que tiene una región de Fc (la "proteína objetivo") de impurezas en un líquido de fuente.

Por ejemplo, el líquido de fuente puede ser filtrado, centrifugado o procesado de otra manera, para remover los desechos en partículas y similares, antes del contacto del líquido de fuente con el agente de unión de la Fc . Por ejemplo, usando técnicas recombinanates, se pueden producir proteínas intracelularmente, en el espacio periplasmático, o secretadas directamente dentro del medio de cultivo. Si la proteína se produce intracelularmente, el desecho en partículas de cualquiera de células huésped o de fragmentos lisados, puede ser removido, por ejemplo, por centrifugación o ultrafiltración. Donde la proteína se secreta en el medio, las células huésped recombinantes pueden ser separadas del medio de cultivo celular, por ejemplo, por la filtración del flujo tangencial . En varias modalidades, el líquido de fuente que contiene la proteína objetivo, se pone en contacto con el agente de unión de Fc (preferiblemente inmovilizado sobre una fase sólida y equilibrado con un regulador adecuado) de modo que la proteína objetivo adsorba el agente de unión de Fc (por ejemplo un agente de unión de Fc inmovilizado) . El líquido de fuente se pone en contacto con el agente de unión inmovilizado (por ejemplo un agente de unión de Fc inmovilizado) en un regulador de carga, que puede ser el mismo como el regulador de equilibrio. Conforme fluye el líquido de fuente que contiene impurezas a través de la fase sólida, la proteína objetivo es adsorbida al agente de unión de Fc y varias otras impurezas (tal como las proteínas de célula huésped, donde se produce la proteína objetivo en una célula huésped recombinante u otra impurezas derivadas del proceso) a través del flujo o unida no específicamente a la fase sólida. En varias modalidades, el agente de unión de Fc es la Proteína A, y el regulador de equilibrio puede ser de 20 mM de Tris.0.15 M NaCl, pH de 7.5. Otros reguladores de equilibrio adecuados incluyen, por ejemplo, BIS, HEPES, etc. en concentraciones fisiológicas, por ejemplo, una concentración en el intervalo entre aproximadamente 0.5 mM y aproximadamente 100 mM (por ejemplo de 10 mM, 20 mM, 50 mM, etc.) y concentraciones de sal fisiológica (por ejemplo de alrededor de 0.15 mM de NaCl) y a un pH de 5.0-9.0. La fase sólida es preferiblemente de perlitas o partículas de agarosa (por ejemplo de Sepharose) para inmovilizar el agente de unión de Fc . En varias modalidades, la columna se recubre con un reactivo, tal como el glicerol, para disminuir o impedir la adherencia no específica a la columna. En varias modalidades, el agente de unión de Fc es la Proteína A. La rmp Proteína A Sepharose™ Fast Flow /FF( de columna, disponible comercialmente de Amersham Biosicences, es un ejemplo de una columna adecuada de Proteína A para su uso en las metodologías caracterizadas. El agente de unión de Fc es luego lavado con una solución de lavado regulada, que contiene una sal de catión divalente para remover las especies variantes de proteínas unidas a la fase sólida o el agente de unión de Fc . En particular, se ha descubierto que el uso de una etapa de lavado de la sal de catión divalente, puede remover una cantidad significante de impurezas indeseadas. Específicamente, se ha descubierto que las variantes a través de la lectura de intron, variantes de bajo peso molecular y variantes bajo la unión de sulfuro de una proteína objetivo, pueden ser removidas usando un lavado de sal de catión divalente. Asimismo, las proteínas de células huésped (HCP) y el ADN pueden también ser removidos usando el lavado de sal de catión divalente. En varias modalidades, la al de catión divalente en la solución de lavado, contiene una sal caotrópica. Ejemplos de sales caotrópicas adecuadas incluyen, pero no se limitan a, el cloruro de calcio (Cal2) , cloruro de níquel (NiCl2) , y cloruro de magnesio (MgCl2) . Mientras una sal de catión divalente puede estar presente en la solución de lavado, en varis modalidad, se pueden usar dos o más sales de catión divalente.

En varias modalidades, las soluciones de lavado, además de la solución de lavado que contiene la sal de catión divalente, se usan para remover impurezas. Por ejemplo, en varias modalidades, una solución de 20 a 50 mM de Tris, 0.75 a 2.0 M de NaCl, pH de 5.0-9.0 y/o una solución de 10 mM de Tris, pH de 7.5, se usan para lavar el agente de unión de Fc antes de, después o tanto antes como después del agente de unión de Fc de lavado, con la solución de lavado que contiene la sal del catión divalente. En varias modalidades, la sal de catión divalente se agrega preferiblemente a una concentración entre aproximadamente 0.5M y aproximadamente 2.5 M de una solución regulada en pH, que tiene un pH en el intervalo de aproximadamente 5 a 9, y preferiblemente un pH en el intervalo de 7 a 8. Concentraciones preferidas de la al de catión divalente incluyen, pero no se limitan a 0.7 M, 2.0 M y 2.5 M. Reguladores adecuados para este propósito incluyen, pero no se limitan a, reguladores Tris o acetato en una concentración de 20 a 50 mM. En seguida de las etapas de lavado, la proteína objetivo se recupera del agente de unión de Fc . Esto se logra normalmente usando un regulador de levigación adecuado. La proteína objetivo puede, por ejemplo, ser levigada de la columna usando un regulador de levigación que tiene un pH bajo, por ejemplo en el intervalo de aproximadamente 2 a 6.5, y preferiblemente en el intervalo de aproximadamente 2.5 a 3.5. En varias modalidades, la proteína objetivo, así recuperada, puede ser formulada en un portador aceptable farmacéuticamente y usado para varios usos diagnósticos, terapéuticos u otros usos conocidos para estas moléculas. En varias modalidades, la preparación de la proteína objetivo levigada puede ser sometida a etapas de purificación adicionales después de la etapa de cromatografía del agente de unión de Fc. Por ejemplo, etapas de purificación ejemplares ulteriores incluyen, pero no se limitan a: la cromatografía de intercambio de aniones, cromatografía de intercambio de cationes, cromatografía de interacción hidrofóbica (HIC) , cromatografía de hidroxiapatita, diálisis, cromatografía de afinidad (que incluye la cromatografía de afinidad de metal inmovilizada) cromatografía de exclusión de tamaño (SEC) , precipitación de sulfato de amonio, precipitación de etano, la, HPLC de fase inversa (RP-HPLC) , cromato enfoque, ultrafiltración, diafiltración y filtración de gel. En varias modalidades, el paso de cromatografía de unión de Fc se sigue por una cromatografía de intercambio de aniones y una etapa de HIC. En varias modalidades, las etapas de cromatografía son además seguidas por una etapa de filtración de virus, una etapa de ultrafiltración / diafiltración, y una etapa de filtración de contaminantes microbianos. En varias modalidades, estas etapas de purificación adicionales pueden ser conducidas antes de la etapa de cromatografía del agente de unión de Fc . En varios aspectos, los métodos presentes implican la purificación de una proteína que contiene la región de Fc de impurezas por la cromatografía de la Proteína A. En varias modalidades, métodos de purificación de una proteína que contiene la región de Fc (la proteína objetivo) comienzan con la adsorción de la proteína objetivo a un agente de unión de Fc, que comprende la Proteína A inmovilizada sobre una fase sólida, seguido por el levado del agente de unión de Fc con una solución reguladora que contiene una sal de catión divalente, para remover una o más impurezas y recuperar subsiguientemente la proteína desde a Proteína A para producir una primera combinación de levigación. En varias modalidades, el proceso de purificación continúa sometiendo el primer conjunto de levigación a la cromatografía de intercambio de aniones por el contacto de una resina de intercambio de aniones con la primera combinación de levigación, de modo que las impurezas se adsorban a la resina, mientras la proteína objetivo no se adsorbe a la resina. Así, la proteína objetivo puede ser recuperada de a través del flujo para producir una segunda combinación de levigación. En varis modalidades, la etapa de la cromatografía de intercambio de aniones además comprende lavar la resina de intercmabio de aniones con una solución de lavado regulada, para recuperar al menos una porción de la proteína objetivo adsorbida, la cual luego será combinada con la segunda agrupación de levigación. Alternativamente, la primera agrupación de levigación puede estar en contacto con la resina de intercambio de aniones de tal manera que el anticuerpo se adsorba, permitiendo que cualquier impureza fluya a través del flujo, seguido, opcionalmente, por el lavado y levigación del anticuerpo adsorbido. En varias modalidades, el proceso de purificación continúa por someter la segunda agrupación de levigación a HIC por adsorber la proteína objetivo a una resina de interacción hidrofóbica (por ejemplo, una fase sólida funcionalizada con ligaduras hidrofóbicas) lavando la resina de interacción hidrofóbica con una solución de lavado regulada, con una fuerza iónica que no aluye sustancialmente la proteína objetivo, y recuperar esta proteína objetivo (usando típicamente un regulador de levigación con una fuerza iónica suficientemente baja para desorber la proteina objetivo desde la resina de interacción hidrofóbica) sobre una tercera agrupación de levigación. Alternativamente, la segunda agrupación de levigación puede ser conducida con la columna de HIC de tal manera que la proteína objetivo no adsorba, la recuperación de la proteína objetivo a través del flujo como una tercera agrupación de levigación. En varias modalidades, el proceso de purificación incluye una o más etapas de filtración, por ejemplo, para remover virus, concentrando y regulando la solución que contiene la proteína objetivo, y para remover los contaminantes microbianos . En varias modalidades, la presente invención proporciona métodos para la purificación de una proteína, que tiene una región de Fc, desde un líquido fuente que comprende la proteína y una o más impurezas, donde estas impurezas comprenden una o más variantes de IRT. En una modalidad, los métodos proporcionan alrededor de 2 a alrededor de 20 veces la reducción en niveles de variantes de IRT, desde aquellos del líquido fuente. Preferiblemente, los niveles de variantes IRT se reducen por al menos 5 veces y más preferible los niveles de la variante IRT se reducen por al menos 10 veces. Por ejemplo, en el líquido de fuente (muestra de partida) , que tiene alrededor del 3-5% de variantes de anticuerpo IRT (como un porcentaje de especies totales en el líquido de fuente) , las especies de variantes del anticuerpo de IRT pueden ser reducida a alrededor de 0.3 a alrededor de 0.5%. En varias modalidades, las especies de variantes IRT se reducen a. menos del 1%, menos del 0.8%, menos del 0.5%, menos del 0.3%, menos del 0.2%, y/o menos del 0.1%. Preferiblemente, en la purificación de un líquido de fuente para la preparación de una proteína, variantes de IRT se reducen a menos del 1%, menos del 0.7%, menos del 0.5%, menos del 0.3%, menos del 0.2% y/o menos del 0.1%, como un porcentaje de las especies totales en el líquido de fuente. En varias modalidades, la presente invención proporciona métodos para la purificación de una proteína que tiene una región de Fc, desde un líquido de fuente, que comprende la proteína y una o más impurezas, donde estas impurezas comprenden una o más variantes de LMW. En una modalidad, los métodos proporcionan alrededor de 2 a alrededor de 20 veces de reducción en niveles de variantes de LMW, de aquellos en el líquido de fuente. Preferiblemente, los niveles de variantes de LMW se reducen por al menos 5 veces y, más preferiblemente, los niveles de variante LMW se reducen por al menos 10 veces. Por ejemplo, en un líquido de fuente (muestra de partida), que tiene alrededor del 20% de variantes del anticuerpo UDB (como un porcentaje de las especies totales en el líquido de fuente ( , las especies de la variante de anticuerpo de UDB pueden ser reducidas a alrededor del 10% hasta alrededor del 2%. En varias modalidades, las especies de variantes de UDB se reducen a menos del 20%, menos del 15%, menos del 10%, menos del 5%, menos del 2% o menos del 1%. Preferiblemente, en la purificación de un líquido de fuente para la preparación de una proteína, las variantes de UDB se reducen a menos del 20%, menos del 15%, menos del 10%, menos del 5%, menos del 3% o menos del 1%, como un porcentaje de las especies totales en el líquido de fuente. Por ejemplo, en un líquido de fuente (muestra de partida), que tiene alrededor de 3.5% de variantes del anticuerpo LMC (como un porcentaje de las especies totales en el líquido de fuente ( , las especies de la variante de anticuerpo de LMW pueden ser reducidas a alrededor del 0.3 a alrededor del 0.5%.. En varias modalidades, las especies de variantes de LMV se reducen a menos del 1%, menos del 0.8%, menos del 0.5%, menos del 0.3%, menos del 0.2% o menos del 0.1%. Preferiblemente, en la purificación de un líquido de fuente para la preparación de una proteína, las variantes de LMW se reducen a menos del 1%, menos del 0.8%, menos del 0.5%, menos del 0.3%, menos del 0.2% y/o menos del 0.1%, como un porcentaje de las especies totales en el líquido de fuente. En varias modalidades, la presente invención proporciona métodos para la purificación de una proteína que tiene una región de Fc, desde un líquido de fuente, que comprende la proteína y una o más impurezas, donde estas impurezas comprenden una o más variantes de UDB. En una modalidad, los métodos proporcionan alrededor de 2 a alrededor de 20 veces de reducción en niveles de variantes de UDB, de aquellos en el líquido de fuente. Preferiblemente, los niveles de variantes de UDB se reducen por al menos 5 veces y, más preferiblemente, los niveles de variante LMW se reducen por al menos 10 veces. Por ejemplo, en un líquido de fuente (muestra de partida) , que tiene alrededor del 20% de variantes del anticuerpo UDB (como un porcentaje de las especies totales en el líquido de fuente, las especies de la variante de anticuerpo de UDB pueden ser reducidas a alrededor del 10% hasta alrededor del 2%. En varias modalidades, las especies de variantes de UDB se reducen a menos del 20%, menos del 15%, menos del 10%, menos del 5%, menos del 2% o menos del 1%. Preferiblemente, en la purificación de un líquido de fuente para la preparación de una proteína, las variantes de UDB se reducen a menos del 20%, menos del 15%, menos del 10%, menos del 5%, menos del 3% o menos del 1%, como un porcentaje de las especies totales en el líquido de fuente. Igualmente, por ejemplo, en un líquido de fuente (muestra de partida), que tiene alrededor del 3.5% de variantes del anticuerpo UDB (como un porcentaje de las especies totales en el líquido de fuente, las especies de la variante de anticuerpo de UDB pueden ser reducidas a alrededor del 0.3% hasta alrededor del 0.5%. En varias modalidades, las especies de variantes de UDB se reducen a menos del 1%, menos del 0.8%, menos del 0.5%, menos del 0.3%, menos del 2% o menos del 0.2%. y/o menos del 0.1%. Preferiblemente, en la purificación de un líquido de fuente para la preparación de una proteína, las variantes de UDB se reducen a menos del 1%, menos del 0.8%, menos del 0.5%, menos del 5%, menos del 0.3% o menos del 0.2%, y/o menos del 0.1%, como un porcentaje de las especies totales en el líquido de fuente.

Proteínas para su uso en los Métodos de Purificación de la Invención) La proteína, que tiene una región de Fc que se va a purificar, de acuerdo con la invención, como se describe aquí, se preparó usando técnicas que son bien establecidas en el arte e incluyen, por ejemplo, técnicas sintéticas (tal como técnicas recombinantes y síntesis de oéptidos o una combinación de estas técnicas) o pueden ser aisladas de una fuente endógena de la proteína. En ciertas modalidades de la invención, la proteína que tiene una región de Fc es un polipéptido de unión al antígeno, más preferiblemente, un anticuerpo. Este anticuerpo puede ser, por ejemplo, una preparación de anticuerpo policlonal, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo recombinante, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humanizado o un anticuerpo humano. Técnicas para la producción de un polipéptido de unión al antígeno y, en particular, anticuerpos, se describen abajo. Alternativamente, la proteína que tiene una región de Fc puede ser una forma modificada de un anticuerpo, tal como un anticuerpo biespecífico, un conjugado de anticuerpo o una proteína de fusión de anticuerpo (por ejemplo, una proteína de fusión de Fc) . Las técnicas para la producción de tales formas modificadas de anticuerpos y las proteínas de fusión de anticuerpos, también se describen abajo.

Anticuerpos Policlonales Los anticuerpos policlonales pueden ser preparados por inmunizar un sujeto adecuado con un inmunógeno. El título del anticuerpo en el sujeto inmunizado puede ser mencionado con el tiempo por técnicas estándar, tal como con un ensayo inmunosorbente enlazado a la enzima (ELISA) usando el antígeno objetivo inmovilizado. Si se desea, las molécula del anticuerpo dirigidas contra el antígeno objetivo pueden ser aisladas del mamífero (por ejemplo, desde la sangra) y además purificadas por técnicas bien conocidas, tal como la cromatografía de Sepharose de la Proteína A, para obtener el anticuerpo, por ejemplo, la fracción IgG. En un tiempo apropiado después de la inmunización, por ejemplo, cuando los títulos del anticuerpo anti-antígeno son más altos, la células que producen el anticuerpo se pueden obtener del sujeto y se usan para preparar anticuerpos monoclonales por técnica estándar, tal como la técnica de hibridoma, descrita originalmente por Koher y Mmilstein (1075 Na ture 356:495-497) (véase también Brown et al (1981) J. Immunol . 127:539-46; Brown et al. (1980) J. Biol Chem . 255 4980-83, Yeh et al (1976) Proc. Natl. Acad. Sci USA 76:2927-31; y Yeh et al (1982) Kint J. cáncer 28_269-75). Para la preparación de anticuerpos policlonales quiméricos, véase Buechler et al, U.S. Patente No. 6,420,113.

Anticuerpos Monoclonales Cualquiera de los muchos protocolos bien conocidos, usados para fundir los linfocitos y las líneas celulares inmortalizadas, puede ser aplicado con el fin de generar un anticuerpo monoclonal (véase, por ejemplo, G. Galfre et al (1977) Nature 266:55052. Gefter et al. Soma tic Cell Genet , citado antes, Lerner, Yale J. Boz Med. citado antes, Kenneth, Monoclonal Antibodies, citado antes) . Asimismo el trabajador experto ordinario apreciará que hay muchas variantes de tales métodos que podrían ser útiles. Típicamente, la línea celular inmortal (por ejemplo, una línea celular de mieloma) se deriva de las mismas especies de mamíferor como los linfocitos. Por ejemplo los hibridomas del murino pueden ser obtenidos por fundir linfocitos de un ratón inmunizado con una preparación inmunigénica de la presente invención, con una línea celular del ratón inmortalizada. Líneas celulares inmortales preferidas son las líneas celulares del mieloma del ratón que son sensibles al medio de cultivo que contiene la hipoxantina, aminopterina y timidina ("medio HAT"). Cualquier número de líneas celulares de mieloma puede ser usado como un socio de fusión, de acuerdo con técnicas estándar, por ejemplo, las línea de mieloma P3-NSl/l-Ag4-l, P3-x6-Ag8.653 o p2/0-Agl4. Estas líneas de mieloma están disponibles de ATCC. Típicamente, las células de mieloma del ratón, sensibles a HAT, se funden a los esplenocitos del ratón, resultante de la fusión y son luego seleccionadas usando el medio HAT, que mata las células de mieloma fundidas improductivamente, y no fundidas, (los eplenocitos sin fundir mueren después de varios días, debido a que ellos no se transforman) . Las células de hibridoma que producen un anticuerpo monoclonal de la invención, se detectan por clasificar los sobrenadantes del cultivo de hibridoma por anticuerpos que se unen al antígeno objetivo, usando un ensayo ELISA estándar.

Anticuerpos Recombinantes La alternativa a la preparación de hibridomas que secretan anticuerpos monoclonales, un anticuerpo monoclonal puede ser identificado y aislado por la clasificación de una colección de inmunoglobulina combinatoria recombinante (por ejemplo, una colección de exhibición de fago de anticuerpo) con un antígeno objetivo para aislar así los miembros de la colección de la inmunoglobulina que se unen al antígeno objetivo. Equipos para generar y clasificar colecciones de exhibición de fagos están disponibles comercialmente (por ejemplo, el Catálogo del Sistema de Anticuerpos de Fagos Recombinantes, de Pharmacia, No. 27-9400-01, y el Catálogo No. 240612 de Equipo de Exhibición de Fagos de Stratagene SurfZAP™ Adicionalmente, ejemplos de métodos y reactivos particularmente adecuados para el uso en generar y clasificar la colección de exhibición de anticuerpos puede ser encontrada en, por ejemplo Ladner et al, U.S. Patenta No. 5,223,409; Kang et al, International Publication No. WO 92/18619; Dower et al . PCT International Publication No. WO 91/17271; Winter et al . PCT International Publication WO 92/20791; Markland et al . PCT International Publication No. WO 92/15679; Breitling et al . PCT International Publication WO 93/01288; McCafferty et al . PCT International Publication No. WO 92/01047; Garrard et al . PCT International Publication No. WO 92/09690; Ladner et al . PCT International Publication No. WO 90/02809; Fuchs et al . (1991) Bio/Technology 9:1370-1372; Hay et al . (1992) Hum . An tibod. Hybridomas 3:81-85; Huse et al . (1989) Science 246:1275-1281; Griffiths et al . (1993) EMBO J 12:725-734; Hawkins et al . (1992) J. Mol . Biol . 226:889-896; Clarkson et al . (1991) Na ture 352:624-628; Gram et al . (1992) Proc . Na tl . Acad. Sci . USA 89:3576-3580; Garrad et al . (1991) Bio/Technology 9:1373-1377; Hoogenboom et al . (1991) Wuc. Acid Res . 19:4133-4137; Barbas et al . (1991) Proc . Na tl . Acad. Scí . USA 88:7978-7982; and McCafferty et al . Na ture (1990) 348:552-554.

Anticuerpos Quiméricos y Humanizados Adicionalmente, anticuerpos recombinantes, tal como los anticuerpos monoclonales quiméricos y humanizados, que comprenden porciones tanto humanas como no humanas, que pueden ser obtenidas usando las técnicas de ADN recombinantes estándar, están dentro del ámbito de la invención. El término de "inmunoglobulina humanizada" o anticuerpo humanizado" se refiere a una inmunoglobulina o anticuerpo que incluye al menos una inmunoglobulina humanizada o cadena de anticuerpos (es decir, al menos una cadena ligera o pesada humanizada) . El término de "cadena de inmunoglobulina humanizada" o "cadena de anticuerpo humanizada" (es decir, "una cadena ligera de inmunoglobulina humanizada" o "una cadena pesada de inmunoglobulina humanizada) se refiere a una inmunoglobulina o anticuerpo en cadena (es decir, una cadena ligera o pesada, respectivamente) que tiene una región variable que incluye una región de armazón variable sustancialmente de una inmunoglobulina o anticuerpo humano y regiones determinantes complementarias (CDRs) (por ejemplo al menos una CDR, preferiblemente dos CDRs, más preferiblemente tres CDRs) sustancialmente de una inmunoglobulina o anticuerpo no humanos, y además incluye regiones constantes (por ejemplo, al menos una región constante o su porción, en el caso de una cadena ligera, y tres regiones constantes en el caso de una cadena pesada) . El término de "región variable humanizada" (por ejemplo, región variable de cadena ligera humanizada" o "región variable de cadena pesada humanizada") se refiere a una región variable que incluye una región de armazón variable, sustancialmente de una inmunoglobulina humana o anticuerpo y regiones de determinación complementarias (CDRs) sustancialmente de una inmunoglobulina o anticuerpo no humana. La frase "sustancialmente de una inmunoglobulina o anticuerpo humano" o "sustancialmente humano" significa que, cuando se es alineada a una inmunoglobulina humana o anticuerpo, a la secuencia de amino para fines de comparación, la región comparte al menos el 80-90%, el 90-95% o el 95-99%, de identidad (es decir, la identidad de secuencia local, con el armazón humano o la secuencia de la región constante, que permite por ejemplo, sustituciones conservativas, sustituciones de secuencia de consenso, sustituciones de línea de gérmenes, retro-mutaciones y similares. La introducción de sustituciones conservativas, sustituciones de secuencia de consenso, sustituciones de líneas de gérmenes, retro-mutaciones y similares, es a menudo referido como "optimización" de un anticuerpo o cadena humanizada. La frase "sustancialmente de una inmunoglobulina o anticuerpo no humano! o "sustancialmente no humano!, significa que tiene una secuencia de inmunoglobulina o anticuerpo de al menos el 80-95%, preferiblemente al menos el 90-95%, más preferiblemente, el 96%, 97%, 98% o 99% de identidad a aquella de un organismo no humano, por ejemplo un mamífero no humano. Por lo tanto, todas las regiones o residuos de una inmunoglobulina o anticuerpo, o de una cadena de inmunoglobulina o anticuerpo, excepto las CDRs, son sustancialmente idénticas a las regiones correspondientes o residuos de una o más secuencias de inmunoglobulina humana nativa. El término de "región correspondiente" o "residuo correspondiente" se refiere a una región o residuo en un segundo aminoácido o secuencia de nucleótidos que ocupa la misma posición (es decir, equivalente) como una región o residuo sobre un primer aminoácido o secuencia de nucleótidos, cuando la primera y segunda secuencias son alineadas óptimamente para fines de comparación. El término de ¡identidad significante" significa que dos secuencias de polipéptidos, cuando están alineadas óptimamente, tal como por los programas GAP o BRSTFIT, que usan pesos de huecos implícitos, comparten al menos el 50-60% de identidad de secuencia, preferiblemente, al menos el 60-70% de identidad de secuencia, más preferiblemente, al menos el 70-80% de identidad de secuencia, más preferiblemente al menos el 80-90% de identidad de secuencia, aún más preferiblemente, al menos el 90-95% de identidad de secuencia y todavía más preferiblemente, al menos el 95% de identidad de secuencia o más (por ejemplo el 99% de identidad de secuencia o más) . El término de"identidad sustancial" significa que dos secuencias de polipéptidos, cuando están alineas óptimamente, tal como los programas GAP o BESTFIT que usan pesos de huecos implícitos, comparten al menos el 80-90% de identidad de secuencia, preferiblemente al menos el 90-95% de identidad de secuencia, y más preferiblemente al menos el 95% de identidad de secuencia o más (por ejemplo, el 99% de identidad de secuencia o más). Para la comparación de secuencias, típicamente una secuencia actúa como una secuencia de referencia para la cual se comparan las secuencia de prueba. Cuando se usa un algoritmo de comparación de secuencia, las secuencias de prueba y referencia entran en una computadora, se designan las coordenadas de secuencia, si fuera necesario, y se designan los parámetros del programa del algoritmo de secuencia. El algoritmo de comparación de secuencia luego calcula el porcentaje de identidad de secuencia para las secuencias de prueba) en relación a la secuencia de referencia, con base en los parámetros del programa designado. El alineamiento óptimo de secuencias para comparación pede ser conducido, por ejemplo, por el algoritmo de homología local de Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981) por el algoritmo de alineamiento de homología de Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol 48:443 (1970) por la búsqueda para el método de similaridad de Pearson & Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci, USA 85:244 (1988) para las formas de realización computarizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASRA en Wiscosin Genetics Software Package, Genetic Computer Goup, 575 Science Dr. Madison Wl) o por la inspección visual (véase generalmente Ausbel et al, Current Protocols in Molecular Biology) . Un ejemplo del algoritmo que es adecuado para determinar el porcentaje de identidad de secuencia y la similaridad de secuencia es el algoritmo BLAST, el cual se describe en Altschul et al. J. Mol. Biol. 215:403 (1990) El software para realizar los análisis BLAST están disponibles públicamente a través de National Center for Biotechnology Information (publicidad accesble a través de National Institutes of Health NCB internet server) . Típicamente, los parámetros del programa implícitos pueden ser usados para ejecutar la comparación de secuencia aunque los parámetros acostumbrados pueden también ser usados. Para las secuencias de aminoácidos, el programa BLASTP usa como valores implícitos una longitud de palabra (W) de 3, una expectación (E) de 10 y la matriz de marcadoBLOSUM62 (véase Henkoff & Henkoff, Proc. Natl. Acad. Si. USA 89:10915 (1989) ) . Preferiblemente, las posiciones de residuos que no son idénticas difieren por las sustituciones conservativas de aminoácidos. Para propósitos de clasificar las sustituciones de aminoácidos, como conservativas y no conservativas, los aminoácidos se agrupan como sigue: Grupo I (cadenas laterales hidrofóbicas): leu, met, ala, val, leu, ile; Grupo II (cadenas laterales hidrofílicas neutraales) : cys, ser, thr; Grupo III (cadenaas laterales acidas): asp, glu; Grupo IV (cadenas laterales básicas): asn, gln, his, lys, arg; Grupo V (residuos que tienen influencia en la orientación de la cadena) : gly, pro; y Grupo VI (cadenaas laterales aromáticas): trp, tyr, phe. Las sustituciones conservativasa implican sustituciones entre aminoácidos en la misma clase. Sustituciones no conservativas constituyen intercambiar un miembro de una de estas clases por un miembro de otra . Preferiblemente, las inmunoglobulinas o anticuerpos humanizados se unen al antígeno con una afinidad que está dentro de un factor de tres, cuatro o cinco de ese anticuerpo no humanizado correspondiente. Por ejemplo, si el anticuerpo no humanizado tiene un afinidad de unión de 10"9, los anticuerpos humanizados tendrán una afinidad de unión de al menos3 x 10~8 M, 4 x 10"8 M, 5 x 10"8 M, o 10"9 M. Una cadena de inmunoglobulina se dice tiene una "unión de antígeno directa" cuando confiere a una inmunoglobulina o anticuerpo intacto (o su fragmento de unión del antígeno) una propiedad de unión específica o afinidad de unión. Una mutación (por ejemplo, una retro-mutación) se dice afecta sustancialmente la habilidad de una cadena pesada o ligera a la unión de antígeno directa si afecta (por ejemplo, disminuye la afinidad de unión de una inmuoglobulina o anticuerpo intacto (o su fragmento de unión del antígeno) que comprende dcha cadea por al menos un orden de magnitud, comparado con aquel del anticuerpo (o su fragmento de unión del antígeno) que comprende una cadena equivalente que carece de dicha mutación. Una mutación "no afecta sustancialmente (por ejemplo, disminuye) la habilida de una cadena a la unión directa del antígeno", si ella afecta (por ejemplo, disminuye) la afinidad de unión de una inmunogloblina o anticuerpo intecto (o su fragmento que une al antóigeno) que comprende dicha aena, por sólo un factor de dos, tres o cuatro de aquel del anticuerpo (o su fragmento de unión del antígeno) que comprende una cadena equivalente que carece de dicha mutación.

El término de "inmunoglobulina quimérica" o anticuerpo se refiere a una inmunoglobulin o anticuerpo ciuyas regiones variables se derivan de una primea especie y cuyas regiones constantes se derivan de una segunda especie. Las inmunoglobulinas quiméricas o anticuerpos se pueden construir, por ejemplo, por ingeniería genética de segmentos de gene de inmunoglobulina que pertenecen a especies diferentes. Los términos de "inmunoglobulina humanizada" o "anticuerpo humenizado" no intentan abarcar las inmunoglobulinas o anticuerpos quiméricos, como se definieron antes. Aunque las inmunoglobulinas o anticuerpos humanizados son quiméricos en su construcción (es decir, comprenden regiones de máas de una especie de proteína) , ellos incluyen característicasa adicionales (es decir regiones variables que comprenden residuos de CDR donadores y residuos de armazón de aceptación) no encontrados en las inmunoglobulinas o anticuerpos quiméricos, como se definen aquí. Tales anticuerpos monoclonales quiméricos y humanizados se pueden producir por las técnicas del ADN recombinantes, conocidas en el arte, por ejemplo usando los métodos descritos en Robinson et al . International Application No. PCT/US86/02269; Akira, et al . European Patent Application 184,187; Taniguchi, M., European Patent Application 171,496; Morrison et al . European Patent Application 173,494; Neuberger et al. PCT International Publication No. WO 86/01533; Cabilly et al. U.S. Patent No. 4,816,567; Cabilly et al. European Patent Application 125,023; Better et al. (1988) Science 240:1041-1043; Liu et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:3439-3443; Liu et al. (1987) J. Immunol. 139:3521-3526; Sun et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:214-218; Nishimura et al. (1987) Canc. Res. 47:999-1005; Wood et al. (1985) Nature 314:446-449; and Shaw et al. (1988) J. Natl. Cáncer Inst. 80:1553-1559); Morrison, S. L. (1985) Science 229:1202-1207; Oi et al. (1986) BioTechniques 4:214; Winter U.S. Patent 5,225,539; Jones et al. (1986) Nature 321:552-525; Verhoeyan et al. (1988) Science 239:1534; and Beidler et al. (1988) J. Immunol. 141:4053-4060.

Anticuerpos humanos de animales transqénicos y exhibición de fagos Alternativamente, es ahora posible producir animales transgénicos (por ejemplo, monos) que sean capaces, en la inmunización, de producir un repertorio completo de anticuerpos humanos, en la ausencia de la producción de la inmunoglobulina endógena. Por ejemplo, se ha descrito que la supresión homocigótica de la cadena pesada de anticuerpo que une el gene de región (JH) en monos mutantes de la línea quimérica y de germen, en la inhibición completa de la producción de anticuerpos endógenos. La transferencia del arreglo del gene de la inmunoglobulina de la línea de germen humana en estos monos mutantes de la línea del germen, resulta en la producción de anticuerpos humanos en el reto del antígeno. Véase, por ejemplo, las patentes U.S. Nos. 6,150,584, 6,114,598 y 5,770,419. Los anticuerpos completamente humanos pueden también ser derivados de colecciones de exhibición de fagos (Hoogenboom et al., J. Mol. Biol. 227:381 (1991); Marks et al., J. Nol Biol., 222.581-597 (1991). Los anticuerpos policlonales quiméricos pueden también ser obtenidos de las colecciones de exhibición de fagos (Buechler et al.. Patente U.S. No. 6, 420, 113) .

Anticuerpos Biespecíficos y Conjugados de Anticuerpos Los anticuerpos biespecíficos (BsAbs) son anticuerpos que tienen especificidades de unión para al menos dos epítopes diferentes. Tales anticuerpos pueden ser derivados de anticuerpos de longitud completa o fragmentos de anticuerpos (por ejemplo anticuerpos biespecíficos F(ab)/2). Métodos para obtener anticuerpos biespecíficos son conocidos en el arte. La producción tradicional de anticuerpos biespecíficos de longitud completa se basa en la co-expresión de dos parejas de cadena pesada-cadena ligera de la inmunoglobulina, donde estas dos cadenas tienen diferentes especificidades (Millstein et al., Nature, 305:537-539 (1983)). Debido a la clasificación aleatoria de las cadenas, pesada y ligera, de la inmunoglobulina, estos hibridomas (cuadromas) producen una mezcla potencial de diferentes moléculas de anticuerpos (véase, WO 93/08829 y en Traunecer et al, EMBO J., 10:3644-3659 (1991)) . Los anticuerpos biespecíficos también incluyen anticuerpos entrelazados o "heteroconjugados" . Por ejemplo, uno de los anticuerpos en el heteroconjugado puede ser acoplado a la avidina y el otro a labiotina o a otra carga útil. Los anticuerpos heteroconjugados pueden ser obtenidos usando cualquier método de entrelazado conveniente. Agentes adecuados de entrelazamiento son bien conocidos en el arte y se describen en la Patente U.S. No. 4,676,980, junto con un número de técnica de entrelazamiento. En aún otra modalidad, el anticuerpo puede ser conjugado, química o genéticamente, a una carga útil, tal como un reactivo, parte detectable o funcional, por ejemplo una inmunotoxina, para producir un conjugado de anticuerpo. Tales cargas útiles incluyen, por ejemplo, las inmunotoxinas, quimioterpéuticos y radioisótopos, todos los cuales son bien conocidos en el arte.

Proteínas de Fusión de Anticuerpos Una proteína, que tiene una región de Fc, según se usa en la invención, puede ser una proteína de fusión que contiene al menos la porción de Fc de un anticuerpo fundido a una proteína no de anticuerpo o polipéptido. Por ejemplo, la región de Fc puede ser fundida a una ligadura para un receptor, de manera que la proteína de fusión soluble sea creada y sea capaz de unirse al receptor y tenga las funciones relacionadas con la Fc (tal como la estabilidad del suero, unión al receptor de Fc y similares) . Alternativamente, la región de Fc puede ser fundida al dominio extracelular de un receptor, de modo que sea creada una proteína de fusión soluble, que sea capaz de unirse a la ligadura para el receptor (compitiendo así con el receptor nativo) y que tenga funciones relacionadas a Fc . Un ejemplo no limitativo de tal proteína de fusión de Fc es el etanercept (Embrel®) , que comprende el dominio de unión de ligadura extracelular del receptor TNF fundido a la porción de Fc de la IgGl humana. Las proteínas de fusión de anticuerpo (también referidas en el arte como proteínas de fusión de Fc o proteínas de fusión de Ig) pueden ser preparadas usando las técncias del ADN recombinante estándar y se han descrito en el arte, véase, por ejemplo, U.S. Patente No. 5,116,964, U.S. Patente No. 5,225,538, U.S. Patenta No. 5,336,603 y U.S. Patenta No. 5,428,130, todas por Capón et al.

Antibodies Anti IL-13 En una modalidad preferida, la proteína que tiene una región de Fc, que se va a purificar, de acuerdo con la invención, es un anticuerpo anti-IL-13. Los anticuerpos Anti-IL-13 se describen en las Solicitudes Provisionales de U.S. Nos. de Serie 60/578,473, presentada el 9 de junio del 2004 y 60/581,375, presentada el 22 de junio del 2004, ambas con título de " Anticuerpos contra IL-13 humana y sus usos". Los contenidos de estas solicitudes se incorporan aquí como referencia. Un anticuerpo preferido anti-IL-13 puede ser referido caqui, como "IMA". Los anticuerpos que son capaces de unirse a, neutralizar y/o inhibir una o más actividades asociadas con UIL-13, particularmente la actividad se señalización de IL-13, son útiles para tratar las enfermedades mediadas con IL-13, tal como el asma alérgica, asma no alérgica y patologías relacionadas con el asma, tal como fibrosis, eoxinofilia y producción de moco. Los agentes de unión a IL-13 que son antagonistas del IL-13, que incluyen anticuerpos y sus fragmentos de unión al antígeno, que se unen a IL-13, en particular, el IL-13 humano, con alta afinidad y especificidad. Los anticuerpo y sus fragmentos de unión del antígeno de la presente descripción, son también referidos aquí como "anticuerpos anti-IL-13" y sus fragmentos", respectivamente. En una modalidad, el anticuerpo anti-IL-13 o su fragmento, reduce, neutraliza y/o antagoniza al menos una actividad asociada con IL-13.Por ejemplo, el anticuerpo anti-IL-13 o su fragmento, puede unirse a IL-13, por ejemplo un epítope de IL-13, e interferir con su interacción, por ejemplo la unión, entre el IL-13 y el complejo receptor de IL-13 ("IL-13R!), por ejemplo un complejo que comprenda el receptor de IL-13 ("IL-13Ral") y la cadena alfa del receptor de la interleucina ("IL-4Ra") o una subunidad de la misma (por ejemplo "IL-13Ral o IL-4Ra, individualmente. Así, los anticuerpos y sus fragmentos, aquí descritos, se pueden usar para interferir con (por ejemplo, inhibir, bloquear o reducir de otra manera) y una interacción, por ejemplo la unión entre IL-13 y un complejo del receptor de IL-13, o su subunidad, interfiriendo así con la formación de un complejo de señalización funcional.

Otras Proteínas Preferidas que Contienen la Región de Fc En otra modalidad preferida, la proteína que tiene una región de Fc que se va a purificar, de acuerdo con la invención, es un anticuerpo anti-Aa. Los anticuerpos anti-Aa se describen en la Publicación PCT No WO 2002/46237 y la Publicación U.S. No. 20050118651, ambas con título de "anticuerpos humanizados que reconocen el péptido beta-amiloide". Los contenidos de estas solicitudes se incorporan aquí como referencia. Los anticuerpos anti-Aa preferidos puede ser referidos como "AAB" y"12All" aquí. Otras proteínas preferidas que contienen la región de Fc incluyen los anticuerpos que se han aprobado para el uso terapéutico en humanos. Tales anticuerpos incluyen los anticuerpos que se unen al antígeno de células de tumor, anticuerpos que se unen a una citocina, anticuerpos que se unen a un receptor de citocina y anticuerpos que se unen a una proteína de adhesión. Por lo tanto, en varias modalidades, una proteína que contiene la región de Fc, puede ser un anticuerpo o proteínas de fusión de Fc, que se unen a un antígeno, seleccionado del grupo que consiste de CD3 (por ejemplo, 0KT3), CD52 (por ejemplo, alemtuzumab, Campath®) VEGF (por ejemplo bevacizumab, Avastin®) RGFR (por ejemplo cetuximab, Erbitux®) , CD22 (por ejemplo, gemtuzumab, Mylotarg®) , CD20 (por ejemplo rituximab; Rituxan®, tositumomab, Bexxar®; ibritumomab; Zevalin®), HER-2 (por eje pl, trastuzumab, Herceptin®), TNFa (por ejemplo, adalimumab, Humira®, infliximab; Remicade® etanercept; Embrel®) , 25 (por ejemplo, daclizumab; Zenapax ®; basiliximab, Simulect®) , RSV (por ejemplo, palivizumab, Synagist®) , IgE (por ejemplo omalizumab; Xolair®) gp Iib/IIIa (por ejemplo abcsimab, Reopro®) , CDlla (por ejemplo, efalizumab, Raptiva®) y 4-integrin (por ejemplo natalizumabn; Tysabri®.. Se entenderá que cualquiera de las moléculas de polipéptidos anteriores, solas o en combinación, son adecuadas para la preparación como proteínas que contienen la región de Fv, de acuerdo con la invención. Varios aspectos y modalidades de la presente invención son además descritos en forma de los siguientes Ejemplos. Los ejemplos se ofrecen como ilustración y de ninguna manera como limitación.

EJEMPLOS Se ofrecen los siguientes ejemplos solamente para fines ilustrativos. Los Ejemplos se proporcionan usando tres anticuerpos monoclonales diferentes (referidos como AAB, 12A11 e IMA) Se describen ocho experimentos separados, cada uno representando una combinación de anticuerpo y remoción de impurezas.

Materiales y Métodos En general, la práctica de la presente invención emplea, a no ser que se indique de otra forma, técnicas convencionales de química, biología molecular, tecnología del ADN recombinante, inmunología (especialmente, por ejemplo, tecnología de la inmunoglobulina) y técnicas estándar en la electroforesis. Véase, por ejemplo, Sambrook, Fitsch y Maniats, .Molecular Cloning Cold Spring Haarbor Laboratory Press (1989); Antibody Engineering Protocols (Methods in Molecular Biology), 510, Paul, S., Humana Pr (1996); Antibody Engineering: A Practical Approach (Practical Approach Series, 169), McCafferty, Ed., Irl Pr (1996); Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow et al . , C.S. H.L. Press, Pub . (1999); Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel et al . , John Wiley & Sons (1992). Bousse et al . , Protein Sizing on a Microchip, Anal . Chem . 73, 1207-1212 (2001); Knapp et al . , Commercialized and Emerging Lab-on-a-Chip Applications; In: Proceedings of the UTAS 2001 Symposium, Ramsey, J.M. & van den Berg, A., 7-10 (2001); and Mhatre et al . , Estrategias para localizar enlaces de disulfuro en un anticuerpo monoclonal por medio de la espectrometría de masa, Rapid Commun . Mass Spectrom, 13 (24) 2503-2510 (1999).

Producción de la Proteína Obietivo Las proteínas objetivo que contienen la Fc pueden ser producidas por métodos de expresión estándar, por ejemplo, usando la línea de células de mamíferos recombinante que crece en un cultivo de suspensión. Medios acondicionados con la proteína que contiene la Fc de interés se generan en un bio-reactor de producción. El producto resultante puede ser recogido y clarificado con cualquier etapa de clarificación apropiada, tal como, por ejemplo, cualquiera de la microfiltración y filtración de 0.22 µm o centrifugación, filtración de lecho y filtración de 0.22 µm.

Purificación de la proteína obietivo La purificación de los anticuerpos monoclonales objetivo (AAB, 12A11 e IMA) consisten en la captura de la molécula objetivo en la cromatografía de afinidad de la Proteína A. Esto puede consistir de rpm Proteína A, Sepharose® Fast Flow, Proteina A Sepharose® Fast Flow o Mabselect proteína A. La resina es luego lavada omo se describe para cada uno de los experimentos y el proucto se leviga y prueba en sus niveles de impurezas.

Análisis de la proteína obietivo Se usó la HPLC de Gase Inversa (RP-HPLC) para cuantificar la cantidad de IRT presente en las muestras de anticuerpo monoclonales de AAB, mientras se empleó el método Pro A HPLC para determinar los niveles de IRT para el anmticuerpo monoclonal IMA. Se usó la Cromatografía de Exclusión de Tamaño (SEC-HPLC) para determinar el porcentaje de proteínas monoméricas (IgG monomérica), especies de alto peso molecular (YMW) y bajo peso molecular. El análisis de SEC-HPLC de desnaturalización se llevó a cabo para determinar la cantidad relativa de especies bajo enlace de disulfuro (UDB) en las muestras, Los niveles deHCP en las muestrasa de prueba se determinaron usando un ensayo de inmunosobente enlazado a enzima (ELISA) .

Ensayos analíticos: IRT y UDB HPLC de Fase Inversa (Análisis AAB IRT Se condujo el RP-HPLC como sigue. La reducción de disulfuro de cada muestra se realizó por incubación a 40°C durante 60 minutos, en la presencia de 2.5 mM de DTT. Se realizó la alquilación por incubación a la temperatura ambiente, en la presencia de ácido yodoacético 5.5 mM. En seguida de la reducción y alquilación, todas las muestras se enfriaron con 5 µl de DTT ÍM. El límite de cuantifiación paa este ensayo es del 0.5%. Aproximaamente 40 µg de cada muetra reducida, alquilada, se inyectó sobre una columna POROS Rl/H RP-HPLC y se operó durante 70 minutos bajo las siguientes condiciones: Columna: Poros Rl/H RP-HPLC Temperatura de la Columna: 50°C Fase Móvil A: 0.1% TFA (peso/volumen) en agua Fase Móvil B: 0.1% TFA (peso/volumen) en 96% de acetonitrilo Régimen de flujo: 1.0 ml/min. Detección: 217 nm Tiempo de Operación: 70 minutos Inyección: triplicada de 40 µg cada una Los tiempos de gradiente son como se listan en la TABLA 1.

Tabla 1 - Tiempos de Gradiente para el Método RP-HPLC Análisis de proteína A HPLC (IMA IRT) La A-HPLC de la Proteína A se condujo como sigue: Se realizó un total de 100 µg por inyección de la columna POROS Pro A, a la temperatura ambiente, durante 35 minutos, bajo las siguientes condiciones: Columna: Poros Pro A 4.6 x 50 mm Temperatura de la Columna: Ambiente Fase Móvil A: Formato de amonio 50 mM, pH 6.0 Fase Móvil B: Formato de amonio 10 mM, 0.8% de ácido fórmico Régimen de flujo: 2.0 ml/min. Detección: 270 nm Tiempo de Operación: 35 minutos Inyección: triplicada de 100 µg cada una Los tiempos de gradiente son como se listan en la TABLA 2.

Tabla 2: Tiempos de Gradiente para la Columna Pro A dSEC-HPLC (Análisis AAB UDB) La SEC-HPLC de desnaturalización se condujo como sigue. El pre-tratamiento de las muestras para el ensayo SEC de desnaturalización implica una mezcla de reactivo/muestra a concentraciones finales de 200 µg/ml de proteína, 3M guanidina HCL y 100 mM Tris, a un pH de 7.4. Las muestras se calentaron a 80°C durante 20 minutos mientras se mezcla a través de inversión. Para este ensayo, se emplearon dos controles para permitir una agrupación de los niveles de UDB. Las referencias internas con niveles bajos y altos de UDB se usaron como controles. Las condiciones Cromatográficas/Ensayo fueron como sigue : Columna: Tosoh BioSep G 3000 SWxI Temperatura de la Columna: Ambiente Fase Móvil A: Guanidina HCl 3M, Na4 25 mM, pH de 6.8 Fase Móvil B: 0.1% TFA (peso/volumen) en 96% de acetonitrilo Gradiente: Isocrático Régimen de flujo: 0.5 ml/min. Detección: 280 nm Tiempo de Operación: 50 minutos Inyección: triplicada 50 µl (10 µg) .

EJEMPLO 1: Comparación de Reguladores de lavado para la rerpocióp de (A B) En este ejemplo, la solución impura que contiene el anticuerpo monoclonal AAB se purificó por adsorción sobre una columna de Proteína A, seguido por un primer lavado con un regulador de lavado que contiene cualquiera de CaCl2, MgCl2, NaCl2 o propilen-glicol . El cultivo que contiene el anticuerpo monoclonal se purificó a una escala pequeña usando una columna rmp Proteína A Sepharose™ FF (8.9 ml ) conectada a un sistema de cromatografía GE Healthcare AKTA FPLC. Para todas las etapas de la cromatografía rpm Proteína A Sepharose™ FF, descritas en el experimento 1, se usaron las siguientes condiciones (Excepciones se notan en las descripciones experimentales individuales). Dimensiones de la columna: 10 cm x 11.4 cm Régimen de flujo de operación: 150 m/hr Equilibrio a:20 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 7.5 (5 volúmenes de columna) Flujo : 20 mM Tris, 140 mM NaCl, pH de 7.5 (1 volumen de columna) Lavado 1 _ variable (véase Tabla 3), excepto para la operación #1, que no tiene lavado 1 Lavado 2: 20 mM Tris, 1.0 m NaCl, pH de 7.5 (5 volúmenes de columna) Lavado 3 : 10 mM Tris, 75 mM NaCl, pH de 7.5 (7 volúmenes de columna) Levigación: 40 mM de glicina, 75 mM de NaCl, pH de 3.1 (6 volúmenes de columna) Separación l:a: 20 mM de citrato de sodio, pH de 2.7 (5 volúmenes de columna) Separación 2: 6 M guanidina HCl (2 volúmenes de columna) Lavado de separación: 20 mM Tris, 150 mM de NaCl, pH de 7.5 (5 volúmenes de columna) almacenamiento_ 16% de etanol (5 volúmenes de columna) Temperatura de operación: 2-8°C.

Las operaciones de la columna rmp Proteína A Sepharose™ FF se equilibraron con 5 volúmenes de columna de 20 mM Tris, 150 mM al, pH 7.5. La columna se cargó con aproximadamente 10 mg de producto / ml de resina. La carga fue seguida por un flujo de volumen de columna con regulador de equilibrio y 5 volúmenes de la columna de la solución de lavado 1. Todas las soluciones de lavado 1 se probaron y se presentan en la Tabla 3. El Lavado 1 se incluye en todas las operaciones, excepto en la operación #1. El lavado 1 fue seguido por 5 volúmenes de la columna de 20 mM Tris, 1.0 M CaCl2, pH de 7.5 y 7 volúmenes de la columna de 10 mM Tris, 75 mM de NaCl, pH de 7.5. El anticuerpo monoclonal se levigó de la columna con 50 mM de glicina, 75 mM de NaCl, pH de 3.1. La combinación de productos luego se neutralizó a 7.9-8.1 con 2M Tris, pH de 8.6. Las columnas luego se separaron, lavaron y almacenaron. La Tabla 3 lista los niveles de las especies IRT y LMW presentes en las combinaciones de productos de las varias operaciones Tabla 3. Valores de y LMV para varios Reguladores del Lavado 1 Los resultados mostraron que los lavados del cloruro de magnesio y el cloruro de calcio reducen los niveles de las especies de IRT y LMW, en tanto los lavados del cloruro de sodio y el propilen-glicol no reducen las especies de IRT o LMW.

EJEMPLO 2 - Cromatografía de la Proteína A con lavado dß CaCl2, para la remoción de IRT En este ejemplo, se llevó a cabo una purificación del anticuerpo a escala mayor, usando la cromatografía de la Proteína A con un lavado de CaCl2 para remover las especies IRT. El cultivo que contiene el anticuerpo monoclonal se purificó a una escala piloto, usando la columna de Proteína A MabSelect (2.4 litros) conectada al sistema de la cromatografía de Millipore -Prime 400. Se realizaron dos operaciones MabSelect, como se describen abajo.

Dimensiones de la columna: 13 cm x 18 cm Régimen de flujo de operación: 150 m/hr, 300 cm/hr Equilibrio 1 -:20 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 7.5 (5 volúmenes de columna) Flujo : 20 mM Tris, 150 mM NaCl, pH de 7.5 (1 volumen de columna) Lavado 1 - 50 mM Tris, 2M CaCl2, pH de 7.5 para operación #1 y ningún lavado para la operación #2 Lavado 2: 20 mM Tris, 1.0 m NaCl, pH de 7.5 (5 volúmenes de columna) Lavado 3 : 10 mM Tris, 75 mM NaCl, pH de 7.5 (5 volúmenes de columna) Levigación: 60 mM de glicina, 25 mM de NaCl, pH de 3.1 (6 volúmenes de columna) Separación 1: 50 mM glicina, 0.5 M NaCl, pH 2.7 (5 volúmenes de columna) Separación 2: 6 M guanidina HCl (2 volúmenes de columna) Lavado de separación: 20 mM Tris, 150 mM de NaCl, pH de 7.5 (5 volúmenes de columna) Almacenamiento_ 16% de etanol (5 volúmenes de columna) Temperatura de operación: 2-8°C.

La columna MabSelect Proteína A se equilibró con 5 volúmenes de columna de 20 mM Tris, 150 mM NaCl, pH de 7.5. Las columnas luego se cargaron a aproximadamente 10 mg de producto/ ml de resina. Esto fue seguido por un flujo del volumen de columna de 2 con regulación de equilibrio y 5 volúmenes de columna de la solución de lavado 1. Esta solución de lavado 1 consistió de 50 mM Tris, 2.0 M CaCl2, pH de 7.5 para la operación 1, mientras se dejó completamente fuera para la operación 2. El lavado 1 luego fue seguido por 5 volúmenes de columna de 50 mM Tris, 1.0 M NaCl, pH de 7.5 y 5 volúmenes de columna de 10 mM Tris, 75 mM NaCl, pH de 7.5,. El anticuerpo monoclonal se levigó de la columna de Mabelect Proteína A con 50 mM glicina, 25 mM NaCl, pH de 3.1. El producto combinado luego se neutralizó a 7.8.8.3 con 2M Tris, pH de 8.5. Las columnas luego se separaron, lavaron y almacenaron. Los resultados se muestran en la Tabla 4.

Tabla 4: % de niveles de IRT en operaciones a escala piloto con y s-m lavados de cloruro de calcio.

Los resultados mostraron que a una escala piloto, el lavado de cloruro de calcio removió IRT del producto combinado.

EJEMPLO 3: Remoción de IRT (IMA) En este ejemplo, un anticuerpo monoclonal diferente (IMA) del usado en el Ejemplo 1 se empleó en una purificación de escala pequeña con un lavado de CaCl2. El cultivo que contiene el anticuerpo monoclonal diferente (IMA) se purificó a escala pequeña usando una Proteína MabSelect. Una columna (17.3 ml) se conectó /17.3 ml) a un sistema de cromatografía GE Healthcare AKTA Explorer. La operación se realizó como se describe abajo.

Dimensiones de la columna: 1.1 cm x 18.2 cm (17.3 ml) Régimen de flujo de operación: 300 cm/hr Equilibrio 1 -:20 mM Tris, 1 M NaCl, pH 7.5 (5.1 volúmenes de columna) Lavado 1 - 30 mM Tris, ÍM CaCl2, pH de 7.5 (5 volúmenes de columna) Lavado 2: 50 mM Acetato de sodio, 0.6 M CaC12, pH de 5.0 (5 volúmenes de columna) Lavado 3 : 50 mM Tris, 5 mM NaCl, pH de 7.5 (3 volúmenes de columna) Lavado 4 - 10 mM Tris, 5 mM NaCl, pH de 7.5 (5 volúmenes de columna) Levigación: 60 mM de glicina, 5 mM de NaCl, pH de 3.0 (5 volúmenes de columna) Separación: 6 mM glicina HCl (5 volúmenes de columna) Lavado de separación: 20 mM Tris, 150 mM de NaCl, pH de 7.5 (7 volúmenes de columna) Almacenamiento_ 16% de etanol (5 volúmenes de columna) Temperatura de operación: 18-24°C.

La columna MabSelect Proteína A se equilibró con 5 volúmenes de columna de 20 mM Tris, ÍM NaCl, pH de 7.5. La columna luego se cargaron a aproximadamente 45 mg de producto/ ml de resina. La columna luego se lavó como sigue: 5 volúmenes de columna de 2.0 mM Tris, l.OM NaCl, pH de 7.5, 5 volúmenes de columna de 50 mM de Acetato de sodio, 0.6 M de CaC12, pH de 5.0. 3 volúmenes de columna de 50 mM Tris, 5 mM de NaCl, pH de 7.5 y 5 volúmenes de columna de 10 mM Tris, 5 mM NaCl, pH de 7.5. El producto se levigó de la columna MabSelect Proteína A con 50 mM de glicina, 5 mM de NaCl, pH de 3.0. El producto combinado luego se neutralizó a 7.7 con 2M Tris, pH de 8.0. La columna luego se separó, se lavó y almacenó. Los resultados se muestran en la Tabla 5. la cual proporciona los niveles de especies IRT en la carga y cresta.

Tabla 5: % de IRT en la carga y pico en la operación con lavado de CaG12.

Los resultaos mostraron que el lavado con 0.6 M CaCl2, proporcionó una reducción de URT de 5 veces.

EJEMPLO 4 - Remoción de ia Proteína de Célula Huésped (BMA) En este ejemplo, la habilidad de un lavado de CaCl2 para remover la proteína de la célula huésped (HCP) de una preparación que contiene el anticuerpo monoclonal de IMA se examinó.

El cultivo que contiene el anticuerpo monoclonal se purificó a pequeña escala usando una columna MabSelect proteína A (19 ml) conectada a un sistema de cromatografía GE Healthcare AKTA FPLC. Las dos operaciones de MabSelect se realizaron como se describe abajo.

Dimensiones de la columna: 1.1 cm x 30.0 cm (19 ml ) Régimen de flujo de operación: 300 cm/hr Equilibrio 1 -:20 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 7.5 (5 volúmenes de columna) Lavado 1 - 20 mM Tris, 150 mM NaCl, pH de 7.5 (5 volúmenes de columna) Lavado 2: 50 mM Acetato de sodio, 0.6 M CaC12, pH de 5.0 (5 volúmenes de columna , sólo para la operación 2) Lavado 3 : 10 mM Tris, 5 mM NaCl, pH de 7.5 (2 volúmenes de columna) Lavado 4 - 10 mM Tris, 5 mM Nal, pH de 7.5 (5 volúmenes de columna) Levigación: 60 mM de glicina, 5 mM de NaCl, pH de 3.0 (5 volúmenes de columna) Separación 1: 6 mM Guanidina HCl, (5 volúmenes de columna) Lavado de separación: 20 mM Tris, 150 mM de NaCl, pH de 7.5 (5 volúmenes de columna) Almacenamiento: 16% de etanol (5 volúmenes de columna) Temperatura de operación: 18-24°C.

La columna MabSelect Proteína A se equilibró con 5 volúmenes de columna de 20 mM Tris, 150 mM NaCl, pH de 7.5. Las columnas luego se cargaron a aproximadamente 45 mg de producto/ ml de resina. La columna fue luego lavada con 5 volúmenes de columna de 20 mM Tris, 1.0 M NaCl, pH de 7.5, para la Operación 2, un lavado adicional de 5 volúmenes de columna de 50 mM Acetato de Sodio (0.5 M CaC12, pH de 5.0 se usó. Antes de la levigacion, la columna luego se lavó con 5 volúmenes de columna de 50 mM Tris, 5 mM NaCl, pH de 7.5 y 5 volúmenes de columna de 10 mM Tris, 5 mM NaCl, pH de 7.5. El producto se levigó de la columna de Mabelect Proteína A con 50 mM glicina, 5 mM NaCl, pH de 3.0. El producto combinado luego se neutralizó a un pH de 7.7. con 2M Tris, pH de 8.0. Las columnas luego se separaron, lavaron y almacenaron. Los resultados se muestran en la Tabla 6, que proporciona el nivel de las especies de HCP presentes en la operación de control y la operación lavada con CaCl2..

Tabla 6: Remoción de HCP con y sin lavado con CaCI2 Los resultados mostraron que el lavado de CaCl2 proporcionó una remoción 3 veces mayor de HCP, comparado con la operación de control.

EJEMPLO 5 - Remoción del ADN (AAV) En este ejemplo, se examinó la habilidad de un lavado de CaCl2 para remover el ADN de células huésped de una preparación que contiene el anticuerpo monoclonal AAB. El cultivo, que contenía el anticuerpo monoclonal, se purificó a una escala pequeña, usando la columna de MabSelect Proteína A (19 ml) conectada a un sistema de cromatografía GE Healthcare AKTA FPLC. Las tres operaciones de MabSelect se realizaron como se describe abajo.

Dimensiones de la columna: 1.1 cm x 20 cm Régimen de flujo de operación: 300 cm/hr Equilibrio 1 -:20 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 7.5 (5 volúmenes de columna) Flujo : 20 mM Tris, 150 mM NaCl, pH de 7.5 (2 volúmenes de columna) Lavado 1 - 50 mM Tris, 2M CaCl2, pH de 7.5 (5 volúmenes de columna) (Operaciones 2 y 3 solamente) Lavado 2: 20 mM Tris, 1.0 m NaCl, pH de 7.5 (5 volúmenes de columna) (Operaciones 1 y 3 solamente) Lavado 3 : 10 mM Tris, 75 mM NaCl , pH de 7.5 (7 volúmenes de columna) Levigación: 60 mM de glicina, 75 mM de NaCl, pH de 3.0 (6 volúmenes de columna) Separación 1: 50 mM glicina, 0.5 M NaCl, pH 2.7 (5 volúmenes de columna) Lavado de separación: 20 mM Tris, 150 mM de NaCl, pH de 7.5 (5 volúmenes de columna) Almacenamiento: 16% de etanol (5 volúmenes de columna) Temperatura de operación: 18-24 °C.

Las operaciones de la columna MabSelect Proteína A se equilibraron con 5 volúmenes de columna de 20 mM Tris, 150 mM NaCl, pH de 7.5. Las columnas luego se cargaron a aproximadamente 40 mg de producto/ ml de resina. Esto fue seguido por un flujo del volumen de columna 2 con regulación de equilibrio . Para las operaciones 2 y 3, esta etapa fue seguida por 5 volúmenes de columna de la solución de lavado 1. Para las operaciones 1 y 3, se usaron 5 volúmenes de columna de la solución de Lavado 2. Todas las 3 operaciones emplearon 7 volúmenes de columna de la solución de lavado 3. El anticuerpo monoclonal se levigó con la columna MabSelect Proteina A con 50 mM de Glicina, 75 mM de NaCl, pH de 3.0. El producto combinado luego se neutralizó a 7.5-8.0 con 2M Tris pH de 8.5. Las columnas luego se separaron, lavaron y almacenaron. Los resultados se muestran en la Tabla 7.

Tabla 7 - Remoción del ADN con lavado de cloruro de caieñ Los resultados mostraron que la adición de 50 mM de Tris, 2.0 M cloruro de calcio, pH de 7.6, suministró una reducción 10 veces mayor de ADN en comparación con usar el NaCl en la solución de lavado.

EJEMPLO 6 - Remoción de Proteína de Célula Huésped (HCP (12A11) En este ejemplo, un tercer anticuerpo monoclonal 12A11, se usó en las operaciones de purificación en donde se probaron varias condiciones de lavado en la habilidad de remover la HCP. Una clasificación completa alta (HTS) en un formato de placa de filtro de 96 cavidades, se realizó para identificar las mejores condiciones de lavado para remover las impurezas, tal como la HCP en la etapa de MabSelect. Esta clasificación varió los excipientes de lavado, la concentración del excipiente y el pH para determinar su efecto en el proceso relacionado con impurezas, tal como la HCP. La resina MabSelect se equilibró usando 5 mM Tris, 10 mM NaCl, pH de 7.3 y cargada con el producto en una columna. La resina luego se desempacó, se mezcló y se distribuyeron 50 µl de resina en cada cavidad de una placa de filtro de 96 cavidades. La resina en cada cavidad se equilibró en solución de 5 mM Tris, 10 mM NaCl, pH de 7.3 y luego se lavó con cada una de varias soluciones de lavado de excipientes en 3 etapas, cada una usando 300 µ, del regulador de lavado, Después del lavado de excipientes, un segundo lavado con 5 mM Tris, 10 mM NaCl, pH de 7.3 se realizó en 4 etapas de 300 µl cada una. El producto luego se eluyó de la resina en 3 etapas de 300 µl cada una. Las etapas de levigación 1 y 2 se combinaron y probaron en los niveles de HCP.

Volumen de resina - 50 µl Excipientes de lavado - Cloruro de sodio, cloruro de calcio, cloruro de magnesio Concentraciones de excipiente - 100, 250, 500, 1000, 1500 y 200 mM pH del excipiente - 6.0 y 7.5 Reguladores de levigación - 25 mM Hepes, 10 mM NaCl, pH de 3., 25 mM de Hepes, 100 mM de NaCl pH 3.0, 50 mM Glicina, 10 mM NaCl, pH de 3.0 40 mM Glicina, 100 mM NaCl, pH de 32.0 y 100 mM Arginina, 10 mM NaCl, p 3.0, 100 mM Arginina, 100 mM NaCl, pH de 3.0 temperatura de operación: 18-24°C Los resultados se muestran en las Tablas 8 y 9.

Tabla 8 - Valores de la HCP para la resina MabSelect lavada coo cloruro de sodio, cloruro de calcio o cloruro de magnesio, a un pH de 6.0 Tabla 9 - Valores de la HCP para la resina MabSeiect, lavada con cloruro de sodio, cloruro de calcio o cloruro de magnesio, a un pH de 7.5 Los resultados mostraron que tanto el cloruro de calcio como el cloruro de magnesio reducen el nivel de la HCP en la combinación cresta de MabSelect, comparado con el cloruro de sodio a un pH de 5.0 (Tabla 8) y un pH de 7.5 (Tabla 9) a todas las concentraciones del excipiente.

EJEMPLO 7 - Remoción de especies enlazadas bajo el disulfuro En este ejemplo, la habilidad del lavado de CaCl2 para remover las especies enlazadas bajo el disulfuro se examinó . Se realizaron dos operaciones de rmp Proteína A Sepharose FF, como se describió en el Ejemplo 1. Dimensiones de la columna: 1 1.0 cm x 11.4 cm Régimen de flujo de operación: 150 cm/hr Equilibrio 1 -:20 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 7.5 (5 volúmenes de columna) Flujo : 20 mM Tris, 150 mM NaCl, pH de 7.5 (2 volúmenes de columna) Lavado 1 - 50 mM Acetato, 2M CaCl2, pH de 5.0 (para la Operación 1, Ninguno para la Operación 2) Lavado 2: 20 mM Tris, 1.0 m NaCl, pH de 7.5 (5 volúmenes de columna) Lavado 3 : 10 mM Tris, 75 mM NaCl, pH de 7.5 (7 volúmenes de columna) Levigación: 60 mM de glicina, 75 mM de NaCl, pH de 3.0 (6 volúmenes de columna) Separación 1: 20 mM Citrato de sodio, pH 2.7 (5 volúmenes de columna) Separación 2 - 6M de guanidina HCl, (2 volúmenes de columna) Lavado de separación: 20 mM Tris, 150 mM de NaCl, pH de 7.5 (5 volúmenes de columna) Almacenamiento: 16% de etanol (5 volúmenes de columna) Temperatura de operación: 2-8°C.

Las columnas de rmp Proteína A Sepharose FF se equilibraron con 5 volúmenes de columna de 20 mM Tris, 150 mM NaCl, pH de 7.5. Las columnas luego se cargaron a aproximadamente 10 mg de producto/ ml de resina. Esto fue seguido por un flujo del volumen de columna 2 con regulación de equilibrio . Para las operaciones 2 y 3, esta etapa fue seguida por 5 volúmenes de columna de la solución de lavado 1. Esta solución de lavado 1 consistió de 50 mM Acetato, 2.0 M CaC12, pH de 5.0 para la operación 1, mientras se dejaba fuera completamente para la operación 2. El lavado 1 fue luego seguido por 5 volúmenes de columna de 20 mM Tris, 1.0 M NaCl, pH de 7.5 y 7 volúmenes de columna de 20 mM Tris, 75 mM NaCl, pH de 7.5. El anticuerpo monoclonal se levigó fuera de la columna rmp Proteína A Sepharose™ FF con 50 mM de Glicina, 75 mM NaCl, pH de 3.1. El producto combinado luego se neutralizó a 7.8 - 8.2 con 2M Tris, pH de 8.5. Las columnas luego se separaron lavaron y almacenaron. Los resultados se muestran en la Tabla 10. Dimensiones de la columna: 1 1.0 cm x 11.5 cm (9 ml) Régimen de flujo de operación: 300 cm/hr (Equilibrio, Lavado 2, Levigación, Regeneración, Almacenamiento) Régimen de flujo de operación - 230 cm/hr, (Carga, Flujo, Lavado 1) Equilibrio 1 -:60 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 7.5 (5 volúmenes de columna) Flujo : 20 mM Tris, 150 mM NaCl, pH de 7.5 (2 volúmenes de columna) Lavado 1 - Variable (véase Tabla 11 para composición) ) Lavado 2: 60 mM Tris, 10 m NaCl, pH de 7.5 (5 volúmenes de columna) Levigación: 60 mM de glicina, 10 mM de NaCl, pH de 3.0 (3 volúmenes de columna) Regeneración - 50 mM NaOH, 0.5 M Na2So4 (5 volúmenes de columna) Almacenamiento - 16% etanol, 50 mM Tris, 150 mM NaCl, pH de 7.5 (5 volúmenes de columna) Temperatura de operación: 18-24°C.

La columna de MabSelect Proteína A se equilibró con 5 volúmenes de columna de 50 mM Tris, 150 mM NaCl, pH de 7.5. La columna luego se cargó a aproximadamente 40 mg de producto/ ml de resina. La carga remanente se separó de la columna con 5 volúmenes de columna de 50 mM Tris, 150 mM NaCl, pH de 7.5. La columna luego se lavó con una de las soluciones descritas en la Tabla 11. Antes de la levigación, la columna se lavó con 5 volúmenes de columna de 50 mM Tris, 10 mM de NaCl, pH de 7.5. El producto se eluyó de la columna MabSelect Proteína A con 50 mM de glicina, 10 mM de NaCl, pH de 3.0. El producto combinado luego se neutralizó a un pH de 8.0 con 2M Tris, pH de 9.0. La columna se separó con 5 volúmenes de columna, 50 mM NaOH, 0.5 M Na2S04, luego se almacenó con 5 volúmenes de columna de 16% de etanol, 50 mM Tris, 150 mM NaCl, pH de 7.5. Los resultados se muestran en la Tabla 11 (remoción de HCP) y Tabla 12 (remoción de IRT) .

Tabla 11 - Remoción de HCP con varias soluciones de lavadlo o El pH de 5.0 se escogió debido a la solubilidad del MnCl2 y el NiCl2 Tabla 12 - Remoción de IRT con varias soluciones de lavado o El pH de 5 . 0 se escogió debido a la solubil idad del MnCl2 y el NiCl2 La Tabla 11 muestra que el nivel de las HCP presentes en las operaciones que se lavaron con las soluciones que contienen cationes divalentes son de 1.5 a 3.5 veces menores que las HCP en el control (Lavado ) La Tabla 12 muestra que las operaciones que contienen los lavaos con soluciones de sales catiónicas divalentes también proporcionan más de 3.5 veces la remoción de IRT comparado con la operación con soluciones de lavado que contienen 1.0 M de NaCl. Así, estos resultados demostraron que los lavados de sal con otros cationes divalentes (por ejemplo, MnCl2 o NiCl2 difieren del CaCl2, también son efectivas en la remoción de impurezas.

Equivalentes . Los expertos en la materia reconocerán o serán capaces de cerciorarse usando la experimentación no mayor de la rutinaria, muchos equivalentes a las modalidades específicas de la invención, aquí descrita. Tales equivalentes se intenta estén dentro de las siguientes reivindicaciones.

Claims (45)

1. REIVINDICACIONES Un método para purificar una proteína que tiene una región Fc, desde un líquido de fuente, que comprende esta proteína y una o más impurezas, este método comprende las etapas de: adsorber la proteína a un agente de unión de Fc; lavar el agente de unión de Fc con una solución reguladora, que contiene una sal de catión divalente, para remover una o más impurezas, y recuperar la proteína desde el agente de unión de Fc en una solución de levigación .
2. El método de la reivindicación 1, en que estas al menos una o más impurezas se seleccionan del grupo que consiste de: especies variantes a través de la lectura intron (IRT), especies unidas bajo el disulfuro (UDB) y especies de bajo peso molecular (LMW) .
3. El método de la reivindicación 2, en que estas una o más impurezas son de tipo IRT.
4. El método de la reivindicación 1, en que la proteína es un anticuerpo.
5. El método de la reivindicación 4, en que el anticuerpo se selecciona del grupo que consiste de una fusión de anticuerpo, un anticuerpo del murino, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humanizado y un anticuerpo humano.
6. 6. El método de la reivindicación 4, en que el anticuerpo es un anticuerpo de tipo anti-IL-13.
7. 7. El método de la reivindicación 4, en que el anticuerpo se une a un antígeno seleccionado del grupo que consiste de CD3, CD52, VEGF, EGFR, CD33, CD20, HER- 2, TNFD, CD25, RSV, IgE, gp Ilb/IIIa, CDlla y D4 integrina
8. 8. El método de la reivindicación 1, en que la proteína, que tiene una región de Fc, es producida en forma recombinante .
9. 9. El método de la reivindicación 4, en que la proteína, que tiene la región de Fc, es producida en forma recombinante en una célula de Ovario de Hámster Chino (CHO) .
10. 10. El método de la reivindicación 4, en que el agente de unión de Fc comprende una o más de la Proteína A y la Proteína G.
11. 11. El método de la reivindicación 4, en que el agente de unión de Fc está inmovilizado sobre una fase sólida.
12. El método de la reivindicación 11, en que la fase sólida comprende uno o más de una perlita, un gel, una resina y una partícula.
13. El método de la reivindicación 4, en que la sal de catión divalente comprende una sal caotrópica.
14. El método de la reivindicación 4, en que la sal de catión divalente se selecciona del grupo que consiste de CaCl2, MgCl2, NiCl2 y sus mezclas.
15. El método de la reivindicación 4, en que la solución reguladora, que contiene la sal de catión divalente, tiene un valor del pH en el intervalo entre aproximadamente 4 y aproximadamente 8.
16. El método de la reivindicación 4, en que la solución reguladora, que contiene la sal de catión divalente, tiene un valor del pH en el intervalo entre aproximadamente 4.5 y aproximadamente 7.5.
17. El método de la reivindicación 4, en que la solución reguladora tiene una concentración de la sal de catión divalente en un intervalo entre aproximadamente 0. ÍM a aproximadamente 5 M.
18. El método de la reivindicación 17, en que la solución reguladora tiene una concentración de la sal de catión divalente en un intervalo entre aproximadamente 0.5M a aproximadamente 3 M.
19. 19. El método de la reivindicación 4, en que la solución reguladora, que contiene una sal de catión divalente, comprende cuando menos el CaCl2 con una concentración de aproximadamente 0.6 M
20. 20. El método de la reivindicación 4, en que la solución reguladora, que contiene la sal de catión divalente, comprende cuando menos el MgCl2 con una concentración de aproximadamente 2M.
21. 21. El método de la reivindicación 4, en que la solución reguladora, que contiene la sal de catión divalente, comprende cuando menos el CaCl2 con una concentración de de aproximadamente 2M.
22. 22. El método de la reivindicación 4, en que las etapas de adsorción de la proteína a un agente de unión de Fc y lavar el agente de unión de Fc, se llevan a cabo a una temperatura en el intervalo entre aproximadamente 2°C y aproximadamente 24 °C.
23. 23. El método de la reivindicación 4, en que esta una o más impurezas comprenden una o más de una proteína de célula huésped, un ADN de célula huésped, una proteína de cultivo celular, y sus mezclas.
24. 24. El método de la reivindicación 4, en que esta una o más impurezas comprenden una especie indeseada de una proteína que tiene una región de Fc .
25. 25. El método de la reivindicación 24, en que las especies indeseadas de la proteína, que tiene una región de Fc, comprenden una o más cadenas de anticuerpos o sus fragmentos, que tienen una secuencia a través de la lectura intrónica, una o más cadenas de anticuerpo o sus fragmentos, que tienen un enlace de disulfuro impropio, un semi-anticuerpo o su fragmento, un dímero de cadena ligera o su fragmento, y de cadena pesada, o su fragmento.
26. 26. El método de la reivindicación 1, en que la etapa de recuperar la proteína del agente de unión de Fc comprende levigar la proteína usando un regulador de levigación, que tiene un pH en el intervalo de aproximadamente 2.0 a aproximadamente 6.5.
27. 27. El método de la reivindicación 1, en que dicho método además comprende una etapa de cromatografía, seleccionada del grupo que consiste de la cromatografía de intercambio de aniones, cromatografía de intercambio de cationes, cromatografía de afinidad de metal inmovilizada y cromatografía de interacción hidrofóbica .
28. El método de la reivindicación 1, en que dicho método además comprende una etapa de cromatografía, seleccionada del grupo que consiste de: cromatografía de hidroxiapatita, diálisis, cromatografía de afinidad, precipitación de sulfato de amonio, precipitación de etanol, HPLC de fase inversa (RP-HPLC) y cromato-enfoque.
29. El método de la reivindicación 1, en que la una o más impurezas comprenden una o más variantes a través de la lectura de intron de la proteína y la solución de levigación que contiene la proteína con un nivel de variantes a través de la lectura de introns, que es cuando menos 5 veces menor que el nivel de las variantes a través de la lectura de introns en el líquido de fuente.
30. El método de la reivindicación 29, en que una solución que contiene la proteína, recuperada en la solución de levigación, tiene un nivel de variantes a través de la lectura de introns, que es al menos 10 veces menor que el nivel de las variantes de lectura de introns en el líquido de fuente.
31. El método de la reivindicación 1, en que la una o más impurezas comprenden una o más variantes a través de la lectura de introns de la proteína y las variantes a través de la Electra de introns comprenden menos de aproximadamente el 1% de una especie de dicha proteína en la solución de levigación.
32. El método de la reivindicación 31, en que las variantes a través de la lectura de introns comprenden menos de aproximadamente el 0.8% de una especie de dicha proteína en la solución de levigación.
33. El método de la reivindicación 32, en que las variantes a través de la lectura de introns comprenden menos de aproximadamente el 0.5% de una especie de dicha proteína en la solución de levigación.
34. El método de la reivindicación 33, en que las variantes a través de la lectura de introns comprenden menos de aproximadamente el 0.2% de una especie de dicha proteína en la solución de levigación.
35. El método de la reivindicación 1, en que la una o más impurezas comprenden una o más especies de peso molecular bajo de la proteína y especies de peso molecular bajo comprenden menos de aproximadamente el 1% de una especie de dicha proteína en la solución de levigación .
36. 36. El método de la reivindicación 35, en que las especies de peso molecular bajo comprenden menos de aproximadamente el 0.8% de una especie de dicha proteína en la solución de levigación.
37. 37. El método de la reivindicación 36, en que las especies de peso molecular bajo comprenden menos de aproximadamente el 0.5% de una especie de dicha proteína en la solución de levigación.
38. 38. El método de la reivindicación 37, en que las especies de peso molecular bajo comprenden menos de aproximadamente el 0.2% de una especie de dicha proteína en la solución de levigación.
39. 39. El método de la reivindicación 1, en que la una o más impurezas comprenden una o más variantes unidas bajo el disulfuro de la proteína y estas variantes unidas bajo disulfuro comprenden menos de aproximadamente el 15% de una especie de dicha proteína en la solución de levigación .
40. 40. El método de la reivindicación 30, en que las variantes unidas bajo disulfuro comprenden menos de aproximadamente el 10% de una especie de dicha proteína en la solución de levigación.
41. 41. El método de la reivindicación 40, en que las variantes unidas bajo disulfuro comprenden menos de aproximadamente el 5% de una especie de dicha proteína en la solución de levigación.
42. 42. El método de la reivindicación 41, en que las variantes unidas bajo disulfuro comprenden menos de aproximadamente el 2% de una especie de dicha proteína en la levigación.
43. 43. Una proteína purificada de acuerdo con el método de la reivindicación 1.
44. 44. Una proteína de la reivindicación 43, en que esta proteína es un anticuerpo.
45. 45. Un equipo que comprende reactivos para purificar una proteína, que tiene una región de Fc de impurezas, este equipo comprende : un reactivo, seleccionado del grupo que consiste de una sal de catión divalente y un agente de unión de Fc; e instrucciones para su uso.