KR100248315B1

KR100248315B1 - 사람 뇌성나트륨 이뇨펩티드의 카르복실 말단을 인식하는 모노클로날항체

Info

Publication number: KR100248315B1
Application number: KR1019920021448A
Authority: KR
Inventors: 쓰지데쓰오; 이노우에껭; 야마우찌아끼라; 고노마사오; 이가노껭이찌
Original assignee: 시오노 요시히코; 시오노기세이야쿠가부시키가이샤
Priority date: 1991-11-14
Filing date: 1992-11-14
Publication date: 2000-03-15
Also published as: DE69228436T2; US6677124B2; GR3029904T3; DE69228436D1; US20040253655A1; JP2665850B2; EP0542255A1; TW230787B; ATE176804T1; KR930010191A; US20020025559A1; ES2129421T3; JPH05184384A; DK0542255T3; EP0542255B1

Abstract

사람의 뇌성 나트륨이뇨 펩티드 (hBNP) 의 C 말단을 인식하는 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마를 배지 중 또는 마우스의 복강내에서 배양시키고, 각각의 배지 또는 복강내의 복수로 부터 모노클로날 항체를 회수한다. hBNP의 면역 측정법은 모노클로날 항체를 사용하여 확립한다.

본 발명의 hBNP 면역 측정법은 최소 검출 한계가 1pg/ml 의 높은 감도를 나타내므로 혈장으로 부터 hBNP 추출없이 직접 hBNP 레벨을 측정할 수 있다. 이것은 고혈압 등의 질병과 심장, 신장 등의 상태를 hBNP 레벨의 증감을 지표로 하여 진단하는데 유용하다.

Description

사람 뇌성 나트륨이뇨 펩티드의 카르복실 말단을 인식하는 모노클로날 항체

제1도는 본 발명의 샌드위치 방사성 면역 측정법 표준 곡석을 나타낸다.

제2도는 본 발명의 모노클로날 항체를 사용한 경합 방사성 면역 측정법의 표준 곡선을 나타낸다.

본 발명은 hBNP 의 C-말단을 인식하는 모노클로날 항체, 상기 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마, 상기 하이브리도마를 배지 중 또는 마우스(mouse)의 복강내에 배양시켜 상기 배지 또는 복강내의 복수(腹水) 로 부터 상기 모노클로날 항체를 회수하는 것을 특징으로 하는 모노클로날 항체 생산방법, 및 상기 모노클로날 항체를 사용한 hBNP 의 면역 측정법에 관한 것이다.

돼지 뇌에 있는 뇌성 나트륨이뇨 펩티드(Brain natriuretic peptide, BNP)는 마쓰오 등에 의해 최초로 보고(Nature 332, 78 ~ 81, 1988)되었다. 거기에는 26개의 아미노산 잔기가 있는 돼지(p) BNP-26과 32잔기가 있는 pBNP-32가 있다. 이러한 것은 심방성 나트륨이뇨 펩티드(atriumnatriuretic peptide, ANP)와 유사한 말초 및 중추에의 작용을 하며 ANP와 함께 혈압의 조절과 체액의 항상성 유지에 중요한 역할을 한다. 또한, BNP는 사람의 심장에서 합성 및 분비되는 것으로 암시하고 있으며 (Biochem, Biophys, Res, Commun, 159, 1427 ~ 1434 (1989)), 최근 사람의 심장에 있는 BNP의 분리 및 특성이 기술되고 있다. (FFBS Lett. 259, 341 ~ 345 (1990)). 32개의 아미노산 잔기를 함유하는 사람 BNP (hBNP)는 hBNP 전구체의 서열 77 ~ 108과 일치한다.

상술한 바와같이, BNP는 체액의 항상성 유지 및 혈압 조절에 중요한 역활을 하기 때문에 면역 측정 등에 의한 혈액 중의 hBNP측정은 고혈압 등의 질병과 심장, 신장 등의 상태를 hBNP 레벨의 증감을 지표로 하여 진단하는 것이 유용한 것 처럼 보인다. 그러나, 보통 성인의 혈액 중 hBNP의 평균 레벨은 0.9 ±0.07 fmol/ml (3.12 ± 0.24 pg/ml)이고 (J. Clin, Invest. 87, 1402 ~ 1412 (1990)) 이러한 낮은 레벨은 추출없이 혈장에서 hBNP를 직접 측정하는 것을 불가능하게 한다.

본 발명의 발명가들은 상술한 문제를 해결하기 위하여 연구를 행한 결과 hBNP의 C-말단을 인식하는 모노클로날 항체를 제조하였고, 그러므로 hBNP를 위한 특이적 샌드위치 방사성 면역 측정법(specific sandwich radioimmunoassay)을 확립하는데 성공하였다.

본 발명에 의해 제공되는 hBNP를 위한 면역 측정법은 매우 민감하기 때문에 최소 검출 한계는 1pg/ml이었으므로 혈장으로 부터 hBNP 추출없이 직접 혈장중에서 hBNP 레벨을 직접 측정할 수 있다. 고혈압 등의 질병과 심장, 신장 등의 상태를 hBNP 레벨의 증감을 지표로 하여 유용하게 사용할 수 있다.

본 발명은 hBNP의 C-말단을 인식하는 모노클로날 항체 및 그를 생산하는 하이브리도마를 제공하는 것이다. 본 발명의 모노클로날 항체는 hBNP와 반응하지만 C-말단에 Tyr 잔기를 부가적으로 갖는 hBNP와는 반응하지 않는다. 모노클로날 항체는 C-말단에 His 이외의 아미노산 잔기를 부가적으로 갖는 hBNP와는 반응하지 않을 것 처럼 보인다. 그러므로 본 발명의 모노클로날 항체는 주로 hBNP의 C-말단에 있는 His 잔기, 특히 His 잔기의 카르복실기를 인식한다.

본 발명의 모노클로날 항체는 하이브리도마 BC 203에 의해 생산될 수 있다. 상기 하이브리도마 BC 203은 이바라끼껭 쓰꾸바시 히가시 1쪼메 1방 3고에 위치한 미생물 공업 기술 연구소에 1991년 8월 20일자로 부다페스트 조약하에 수탁번호 FERM BP-3515로 마우스 하이브리도마 BC 203(Mouse Hybridoma BC 203)을 기탁하였다.

본 발명의 하이브리도마는 하기와 같이 제조된다. hBNP의 C-말단 부근 바람직하게는 hBNP(27 ~ 32)서열을 갖는 펩티드를 합성하고 그의 항원성을 증가시키기 위해 소 혈청 알부민, 소 티로글로불린 등을 콘쥬게이트시킨다. 이와같이 수득한 콘쥬게이트(conjugate)를 프로인드 완전 보조제 등의 적당한 보조제로 유탁시켜 마우스의 면역에 사용한다.

면역은 상기 유탁액을 수주의 간격으로 마우스에게 수차레 복강내, 정맥내 또는 피하 접종한다. 최종 면역 3 ~ 5일후에 비방을 잘라내어 항체 생산 세포로서 사용한다. 이와같이 수득한 항체 생산 세포를 적당한 마커(marker)를 갖는 골수종 세포 (myeloma cells)와 융합시켜 하이브리도마를 수득한다.

하이브리도마의 제조에 통상적으로 사용되는 배지로는 이글스 엠이엠(Eaglei's MEM), 둘베코스 변법 배지(Dulbecco's modified medium), RPMI - 1640 등이 있다. 골수종 세포는 비장 세포와 융합 (골수종 세포 : 비장 세포 = 약 1 : 5)된다. 융합제로서, 융합 세포의 고수율을 위해 50%의 폴리에틸렌글리콜(PEG)을 선택하는 것이 바람직할 수 있다. 융합 세포는 HAT법에 따라 선택한다. 이와같이 수득한 하이브리도마는 그들의 배양 상청액을 사용한 경합 방사성 면역 측정법 등에 의해 스크린되어 목적하는 면역 글로불린을 생산하는 하이브리도마를 수득한다. 모노클로날 하이브리도마를 만들기 위해서 수득한 하이브리도마를 서브클론화(subcloned)한다. 즉, 상기 하이브리도마를 1이상의 세포/웰의 농도로 96-웰 판에 뿌리고 증식된 클론을 다시 스크린한다. 이러한 서브클로닝을 반복하여 모노클로날 하이브리도마를 수득한다.

본 발명은 또한 상술한 모노클로날 항체의 생산 방법을 제공하는 것으로, 이 방법은 상술한 하이브리도마를 배지 중에 또는 마우스의 복강내에서 배양시키고 상기 배치 또는 복강내의 복수로 부터 모노클로날 항체를 회수하는 것을 함유한다.

즉, 상술한 하이브리도마는 배양 용기중 (시험관내) 또는 동물체내 (생체내)에서 배양시킨다. 시험관내 시스템의 배양은 상술한 통상의 배지에서 선택한 배지를 태아 소혈청(FCS : fetal calf serum)으로 강화하고 상기 배지 안에서 하이브리도마를 3 ~ 5일 동안 배양하여 배지의 상청액으로 부터 모노클로날 항체를 회수한다. 생체내 시스템의 배양은 하이브리도마를 포유동물의 복강내에 접종시키고 1 ~ 3주후 복강내에서 수집된 복수를 회수하는데, 이것으로 부터 모노클로날 항체가 회수된다. 생체내 시스템이 시험관내 시스템 보다 더 효과적으로 모노클로날 항체를 생산할 수 있기 때문에 생체내 시스템이 시험관내 시스템 보다 바람직하다.

본 발명의 모노클로날 항체 BC203은 hBNP의 C-말단 부위를 인식한다. 실시예에서 기재한 것처럼 hBNP의 C-말단 잔기 His³²에 Tyr 잔기가 결합되어 제조되는 C 말단에 부가적으로 Tyr 잔기를 갖는 hBNP, 즉[Tyr³³]-hBNP에 BC 203은 결합되지 않는다. 이것은 BC 203이 hBNP의 C-말단 잔기 His³²를 인식한다는 것을 나타낸다.

본 발명은 hBNP가 상술한 모노클로날 항체 A와 상기 항체 A와는 hBNP의 인식 부위가 다른 항체 B사이에서 샌드위치되는 것을 특징으로 하는 hBNP의 면역 측정법을 제공하는 것이다. 상기 항체 B의 바람직한 구현예는 특히 hBNP의 고리 구조를 인식하는 모노클로날 항체, 예를들어, 모노클로날 항체 KY-hBNP - II (일본국 특허출원 제 2-99623호)이다.

상기 항체를 생산하는 하이브리도마 KY-hBNP-II는 이바라끼껭 쓰꾸바시 히가시 1쪼메 1방 3고에 위치한 미생물 공업 기술 연구소에 1990년 4월 11일자로 부다페스트 조약하에 수탁번호 FERM BP-2863으로 마우스 하이브리도마 KY-hBNP-II (Mouse Hybridoma KY-hBNP-II)를 기탁하였다.

본 발명의 면역 측정은 예를들어 하기 샌드위치 방사성 면역 측정법을 취하여 간단히 설명할 수 있다.

(1) 방사성 동위원소 표식 항체의 제조

상술한 항체 A 또는 B의 IgG 분획을 펩신으로 소화시켜 F(ab')₂단편을 수득하고 2- 메트캅토에탄올로 환원시켜 Fab' 단편을 수득한다. IgG로 부터 Fab'를 제조하는 방법은 문헌「J. Immunoassay 4, 209 ~ 327 (1983)」에 상세히 기재하고 있으며 본 발명에도 이용할 수 있다.

이와같이 수득한 Fab' 단편은 말레이미드 - 모노요오드(¹²⁵I) 타라민 등을 사용한 방법은 클로르아민 T법 등의 통상적인 방법에 따라 표식된 방사성 동위원소를 수득한다. 표식 항체는 겔 여과, 컬럼 크로마토그래피 등으로 정제된다.

(2) 고정화한 제2항체의 제조

일본국 공개 제62-132172호에 기재한 방법에 따라, 항 - 마우스(anti-mouse) IgG Fc 단편 항체를 통상의 면역 측정에 사용되는 시판되는 항원 항체 반응용 담체 예를들면 유리 또는 합성 수지제로 만들어진 비이드, 볼, 관 또는 판 등의 담체상에서 고정화시킨다.

(3) hBNP의 측정

관안에서 hBNP의 표준액 또는 시료를 상기 단계(1)의 표식 항체 A 또는 B(Fab')와 반응시키고 다른 항체 B 또는 A와 반응시킨다.

상기 단계(2)의 고정화한 항-마우스 Fc를 가하여 반응시킨다. 원심분리후, 상청액을 세척을 위해 제거한다. 침강된 표식 항체의 방사능을 측정한다.

또한 표식 항체와 다른 항체 A 또는 B는 담체상에서 고정화시킬 수 있으며 고정화시킨 항체로서 사용된다. 이 경우, hBNP는 각기 표식 항체 A 또는 B와 반응시키고 고정화한 항체 B 또는 A와 반응 시킨다. 원심분리후 상청액을 세척을 위해 제거하고 침강된 표식 항체의 방사능을 측정한다.

본 발명의 방법은 방사성 면역 측정법 뿐만 아니다. 효소 면역 측정법(EIA)도 포함한다. EIA를 위한 효소 결합 항체는 하기와 같이 제조된다.

상술한 항체 A 또는 B의 IgG 단편을 펩신으로 소화시켜 F(ab')₂단편을 수득하고, 이것을 2-메르캅토에틸아민으로 환원시켜 Fab' 단편을 수득한다. IgG로 부터 Fab'의 제조방법은 문헌 「J. Immunoassay 4, 209 ~ 327 (1983)」에 상세히 기재하고 있으며, 상기 문헌은 본 발명에서도 이용될 수 있다.

이와같이 수득한 Fab' 단편은 효소와 결합한다. 결합할 효소는 알칼리성 포스포타제,-D-갈락토시다제, 퍼옥시다제, 글루코즈 옥시다제 등을 함유한다. 본 발명에서는 호스 레디쉬 퍼옥시다제(Horse radish peroxidase)가 바람직하게 이용된다. 결합을 위해 사용될 가교제로서는 N,N'-o-페닐렌디말레이미드, 4-(N-말레이미도메틸) 시클로헥산 N-숙신이미드 에스테르, 6-말레이미드 헥산 N-숙신이미드 에스테르, 3-(2-피리딜티오) 프로피온산 N-숙신이미드 에스테르, 4,4'-디티오피리딘 등의 가교제로서 공지되었다. 상기 가교제는 시약의 성질에 적당한 통상의 방법에 따라 항체와 효소를 결합시키는데 사용될 수 있다.

본 발명의 면역 측정법은 최소 검출 한계가 1 pg/ml로 감도가 매우 높으며 hBNP에 대하여 극단적으로 특이한 감도를 가지므로 추출없이 혈장에서 hBNP의 직접 측정법을 할 수 있게 한다.

본 발명을 하기 실시예에서 상세히 설명한다.

실시예에서 약어는 하기이다 ;

Boc : t - 부틸옥시카르보닐, Tos : 토실, PAM : 4 -(옥시메틸) - 페닐아세트아미도메틸, Cl-Z : 2 - 클로로 벤질옥시카르보닐, Br-Z : 2 - 브로모 - 벤질옥시카르보닐, Bom : 벤질옥시메틸, Bzl : 벤질, cHex : 시클로헥실, 말레이미드 모노요오도 [¹²⁵I] 티라민 : N - [2,4 [-히드록시 - 3 ([¹²⁵I] 요오드) 페닐]에틸] -4 - (말레이미도메틸) -1 -시클로헥산카르복사미드.

[실시예]

I. 항 hBNP 모노클로날 항체 생산 하이브리도마의 제조 및 항체의 생산

(1) 면역용 콘쥬게이트(Conjugate for Immunization)의 제조

hBNP 단편의 합성(27 ~ 32)

Boc-His (Tos) - PAM - Resin (Applied Biosystems 사제) (0.25mmol)에서 출발하여 SHIONOGI SRL-02 등의 아미노산 합성기로 통상의 고체상 방법에 따라 Boc - Lys (Cl-Z) - Val - Leu - Arg (Tos) - His (Tos) - PAM - Resin (보호된 아미노산은 Applied Biosystems 사에서 구입)을 합성한다. 이것은 HF / 아니솔로 탈보호된다. 이와같이 수득한 조펩티드를 정제를 위해 0 ~ 50% CH₃CN/0.1% CF₃COOH의 직선 농도 구배(linear gradient)로 역상 크로마토그래피(컬럼 : Wako Pure Chemical RQ-2, 24 × 360mm)하여 59mg의 목적하는 펩티드를 수득한다.

수득한 표본은 분석용 HPLC(컬럼 : Nucleosil 5C₁₈(4.6 × 150mm, 신와 화학 공업(주), 용매의 조건 ; 5% CH₃CN / 0.1% CF₃COOH, 유속 : 1.8ml / 분, 검출 ; 220nm)로 체류시간 6.04분의 단일 피이크를 수득한다.

펩티드는 히타치 자동 아미노산 분석계 835형으로 110℃에서 24시간 동안 6M HCl로 가수분해하고 가수분해물의 아미노산 분석 결과를 하기에 나타낸다.

Val 0.95(1); Leu 1.00(1) ; Lys 0.90(1) ; His 0.95(1) ; Arg 2.00(2)

콘쥬게이트의 제조

소의 티로글로불린 수용액(40mg/2.0ml)을 hBNP 단편(27 ~ 32)의 수용액 (16mg / 1.0ml)과 혼합한다. 혼합물에 1 - 에틸 - 3 - (3 - 디메틸아미노프로필) 카르보디이미드 히드로클로라이드(46mg/0.6ml) 수용액을 가하고 0℃에서 2시간동안 교반한다. 반응 혼합물은 증류수에 대하여 4℃에서 2일 동안 투석하고 투석내액을 동결건조시킨다. 겔 투과하거나 하지 않은 투석내액을 아미노산 분석한 결과 소 티로글로불린 한분자당 hBNP 단편(27 ~ 32) 29분 자가 콘쥬게이트비로 산출되었다.

(2) 면역

수득된 hBNP 단편(27 ~ 32) - 소 티로글로불린 콘쥬게이트 생리식염수 현탁액(콘쥬게이트 농도 : 4mg/ml)과 플로인드의 완전 보조제 등량의 부피를 유탁시킨다. 유탁액을 0.1ml의 투여량으로 3주의 간격으로 BALB/c 마우스(암컷, 6주령)에게 피하 주사한다. 한번의 주사에 한 마리의 마우스에게 투여한 양은 콘쥬게이트로는 200㎍이고 합텐 hBNP 단편(27~32)로서는 5.6mg이다. 최종 면역 6주후 400mg의 hBNP 단편(27 ~ 32)- 소 티로글로불린 콘쥬게이트(11.2㎍의 합텐)을 생리 식염수에서 현탁시키고 2일동안 연속해서 하루에 한번 각각의 마우스에게 부스터로 0.1ml의 현탁액을 복강내 주사한다.

(3) 세포 융합

부스터 3일 후에 마우스의 비장을 절단하고 비상 세포를 0.17M의 염화 암모늄 용액 중에 빙냉하에서 5분동안 넣어 적혈구를 파괴시킨다. 잔존하는 세포를 RPMI 1640 배지에서 현탁시켜 세포 융합에 사용되는 비 임파구(splenic lymphocyte)를 제조한다. 이와같이 수득한 비 임파구(1.88 ×10⁸)는 RPMI 1640 배지에 현탁된 8 - 아자구아닌 내성 골수종 세포 ( × 63.653, 3.76 ×10⁷)와 혼합한다. 원심분리후 상청액을제거하고 침강된 세포에 RPMI 1640 배지 중에 있는 0.8ml의 50% 폴리에틸렌글리콜 (분자당 4,000, Merck)을 교반하면서 1ml의 피펫으로 가하고 1.5분 동안 더 교반한다. 그후, 2ml의 RPMI 1640 배지를 2분간 가하고 2ml를 1분간 교반하면서 가한다. 또한, 18ml의 RPMI 1640 배지를 가볍게 교반하면서 적가한다. 원심 분리후 상청액을 제거하고 침강된 세포를 HAT 배지 (1 ×10^-4M의 히폭산틴, 4 × 10^-7M의 아미노프테린 및 1.6 × 10^-5M의 티미단을 함유하는 20% FCS-RPMI 1640 배지) 100ml에 현탁시키고, 96 웰 세포 배양판(코스터사) 7매의 각웰에 0.1ml를 넣는다. 각각의 웰 안에는 공급장치로서 밀 HAT 배지 0.1ml 안에 마우스 비장 세포 5 ×10⁴를 가지고 있다. 그후, 세포는 수일간의 간격으로 HAT 배지 양의 절반을 신선한 것으로 바꾸어서 배양시킨다. 약 10일후 하이브리도마의 증식이 관측된다. 하이브리도마가 증식한 웰의 수는 전부 670(99.7%)이었다.

(4) 하이브리도마의 선택

하이브리도마가 증식된 웰의 상청액을 경합 방사성 면역 측정법에 따라 항 - hBNP 항체의 생산에 대해 측정한다. 즉, 관에서 상청액 50㎕를 측정용 완충액(Assay buffer, V에서 후술함) 150㎕와 약 15,000cpm/ 관까지 측정용 완충액으로 희석한¹²⁵I표식 hBNP (V에서 후술함) 100㎕를 혼합하고 4℃애소 16시간 이상 동안 배양한다. 그후, 100㎕의 2.5% 소 감마 - 글로불린 및 500㎕의 25% 폴리에틸렌글리콜 6000 (요네야마 약품 공업 (주))을 가한 후, 교반하고 20분동안 3,000rpm에서 원심분리한다. 상청액을 제거하고 침전물의 방사능을 감마 카운터 (알로카 ARC - 600)으로 측정한다. 5,000cpm (비특이적 결합으로서 약 5배) 이상의 방사능을 양성으로서 취하여 전부 10웰을 선택한다.

(5) 클로닝

(4)에서 선택한 하이브리도마를 한계 희석법으로 클로닝한다. 96 - 웰 세포 배양 판에서 1 세포 / 200㎕ / 웰의 농도로 배양한다. 증식된 하이브리도마가 있는 웰의 상청액을 (4)의 방사성 면역 측정법으로 수행한다. 항체 양성 웰의 하이브리도마를 확대한다. 이러한 일련의 단계를 수차례 반복하여 항체 생산 세포 라인 BC203 을 확립한다.

(6) 복수의 제조

이와같이 확립된 하이브리도마를 복공에 이식시켜 높은 항체 농도의 복수를 제조한다. 즉, RPMI 1640에 현탁되어 있는 약 1 ×10⁷하이브리도마를 0.5ml의 프리스탄으로 미리 복강내 주사한 마우스 (숫컷 BALB / c)에게 복강내 주사한다. 주사 1 ~ 3주후 동안 복수는 적당한 시간에 회복되었다. 원심분리로 복수안에 있는 세포를 제거한 후, 0.1%아지화 나트륨을 가한 상기의 수득된 상청액을 냉각시킨다. 이와같이하여 하이브리도마 BC 203에 의해 생산된 모노클로날 항체 BC 203을 함유하는 복수 BC 203A를 수득한다.

II. 모노클로날 항체의 클라스 / 서브클라스의 결정

하이브리도마에 의해 생산된 모노클로날 항체의 클라스 / 서브클라스의 결정은 마우스 면역글로불린의 각각의 클래스 / 서브클래스에 특이적인 항체 (Serotec 사, 마우스 모노클로날 항체 - 타이핑용 키트)를 사용하는 면역 분산법으로 결정한다. 결과로서, 복수 BC 203A와 항 - IgG, 항체 사이에 침강선이 관측되며, 이것은 항체 BC 203이 IgG₁애 속한다는 것을 나타낸다.

III. 모노클로날 항체의 친화성(결합정수)의 측정

V에 기재한 방법으로 hBNP의 표준 곡선을 작성한다. 스캐챠드법(Scatchard's method)에 따라 hBNP의 각 농도에 대하여 종축에는 침전물의 방사능 / 상청액의 방사능, 횡축에는 항원에 결합된 항체의 몰 농도를 도면에 나타낸다. 항체의 결합 상수는 이와같이 수득한 직선의 기울기로 부터 1.3 × 10⁹M^-1인 것으로 측정됐다.

IV. 모노클로날 항체의 특이성

(1) Tyr^33-125I 표식 hBNP의 합성

Boc - Tyr (Br - Z) - PAM - Resin (Applied Biosystems, 0.25mmol Tyr)으로 부터 출발하여 Applied Biosystems 403A 아미노산 합성기를 사용한 참고예의 Tyr⁰-hBNP-32의 합성에 따라 정체한 Tyr³³-hBNP (7.0mg)을 제조하고 참고예에서와 동일한 방법으로 표식의 목적 화합물을 수득한다.

수득한 표본은 컬럼 : YMC A-302 S-5 120A ODS, 4.6 × 150mm (주식회사 YMC) ; 용매 ; 19.0% CH₃CN/0.1% CF₃COOH ; 유속 : 1.0ml/분 ; 및 검출 : 220nm의 조건하에서 단일 피이크(체류시간 : 5.98분)를 나타낸다. 수득한 표본의 일부를 페놀의 존재하에서 110℃, 20시간 동안 6M의 HCl로 가수분해하고 아미노산 분석하여 하기 결과를 수득한다.

Asp 1.05(1) ; Ser 5.46(6) ; Glu 1.04(1) ; Gly 5.21(5) ; Val 1.97(2) ; Met 1.94(2) ; Ile 0.97(1) ; Leu 2.00(2) ; Tyr 1.01(1) ; Phe 1.00(1) ; Lys 3.01(3) ; His 0.95(1) ; Arg 3.88(4) ; Pro 1.05(1)

(2) 항체의 특이성

I-(4)의 방사성 면역 측정법에서 hBNP C- 말단 His 잔기에 부가적으로 Tyr 잔기가 도입된 Tyr^{33 - 125}I 표식 hBNP가 본 발명의 모노클로날 항체에 결합되지 않는다는 것은 본 발명의 모노클로날 항체가 C - 말단 His 잔기에서 hBNP에 특이적으로 결합돤다는 것을 나타낸다.

V. 모노클로날 항체를 사용한 hBNP의 샌드위치 방사성 면역 측정법 (직접 측정법)

I에 기재한 모노클로날 항체 BC 203과 하이브리도마 KY-hBNP-II (일본국 특허출원 제2-99623호)에 의해 생산된 항 - hBNP (1 - 32) 항체 (이후 간단히 KY-hBNP-II라 명함)의¹²⁵I 표식 Fab'를 사용하여 hBNP의 샌드위치 방사성 면역 측정법을 확립한다.

(1)¹²⁵I - 표식 KY-hBNP-II Fab' 의 합성

복수의 정제 ; 하이브리도마 KY-hBNP-II 로부터 복수 (3ml)를 Protein G sepharose 4FF, MAb TrabTM G (Pharmacis)로 정제한다. 복수는 결합 완충액 (Protein G sepharose 4FF, MAb TrapTM G 키트의 일부)으로 2배 희석하고 미리 결합 완충액으로 평형화한 Protein G Sepharose 4FF 컬럼 (3ml)에 가한다. IgG가 아닌 불순물은 30ml의 결합 완충액으로 세척하여 제거한다. 15ml의 용출 완충액 (Protein G sepharose 4FF, MAb TrabTM G 키트의 일부)으로 분별후 1ml의 분획을 수득하고 IgG 분획은 280nm에서 0.2이상의 흡광도로 수집하고 센트리콘 - 100^TM(Amicon)으로 농축한다. 완충액을 0.1M의 구연산 완충액(pH 4.1)로 바꾸어 18mg의 IgG 분획을 수득한다.

F(ab')₂의 제조 : 상기에서 수득한 Ky-hBNP-II의 IgG 용액 (4.57mg / 2.19ml)에 2.5%(w/v)펩신 (돼지 위점막, 시그마사)을 가한 후 0.1M의 염화 나트륨을 가한다. 37℃에서 1시간동안 배양후, 혼합물을 0.1M의 붕산 나트륨 완충액 (pH 8.0)으로 평형화한 Sephadex G-100 컬럼 (1.5 × 58cm) (Bio-Rad 사)로 겔 여과하여 F(ab')₂를 수득한다. 여기에 함유되어 있는 소화되지 않은 IgG는 정제를 위해 Affigel Protein A MAPS-II (Bio - Rad 사)로 제거한다. 즉, Affigel Protein A상에 흡착되지 않은 분획을 수거하고 센트리콘 - 30^TM(Amicon)으로 농축한다. 완충액을 5mM EDTA를 함유하는 0.1M인산 나트륨 완충액 (pH 6.0)으로 바꾸어 1.4mg의 F(ab')₂분획을 수득한다.

FAb'의 제조 : KY-hBNP-II의 F(ab')₂용액 (0.4mg/70㎕)에 0.1M의 2-메르캅토에틸아민 히드로클로라이드 (5mM EDTA를 함유하는 0.1M의 인산 나트륨 완충액 (pH 6.0))를 가하여 10mM의 최종 농도를 수득한다. 37℃에서 배양 90분후, 혼합물을 5mM의 EDTA를 함유하는 0.1M의 인산 나트륨 완충액 (pH 6.0) 으로 평형화한 TSK 겔 2000XL (0.78 ×30cm, 도소오사)로 여과하여 Fab' 표본을 수득한다. Fab' 표본을 센트리콘 -30^TM(Amicon)으로 60㎕까지 농축하여 Fab' 분획 (0.2mg /60㎕)을 제조한다.

말레이미드 - 모노요오도 (¹²⁵I) 티라민의 제조 : 말레이미도티라민 (15㎕, 1mg/ml DMSO)를 유리관에 넣고, 여기에 0.2M의 인산 나트륨 완충액 (pH 7.0) 60㎕ 및 Na¹²⁵I 208 MBq (5.6 mCi)를 가한다.

0.2M의 인산나트륨 완충액 (pH 7.0)에 있는 0.5% 클로르아민 T 10㎕를 가한후, 혼합물을 30초 동안 격렬히 교반하고 역상 HPLC 전개 용매 (0.1% TFA : CH₃CN : CH₃OH = 5 : 3 : 2)로 평형화된 Nucleosil 10Cl8 컬럼 (04.6 ×30cm)를 사용한 역상 HPLC로 말레이미드모노요오도(¹²⁵I)티라민 분획을 수집한다. 분획을 질수 기류하 60℃에서 증발건조시키고 그후 2% 디메틸술폭시드 (DMSO) 및 5mM EDTA를 함유하는 0.1M의 인산 나트륨 완충액 (pH 6.0) 50㎕에 용해시킨다.

KY-hBNP-II Fab'의¹²⁵I 표식 : KY-hBNP-II Fab'(70㎕)을 유리관에 넣고, 여기에 말레이미드 - 모노요오도 (¹²⁵I)티라민 130MBq를 가한 후 실온에서 90분간 배양한다. 이 혼합물에 1% S - 카르복시메틸 BSA, 0.02% N - 에틸말레이미드 및 5mM의 EDTA를 함유하는 0.1M의 인산 나트륨 완충액 (pH 6.0)을 가한다. 생성된 혼합물을 5mM의 EDTA를 함유하는 0.1M이 인산 나트륨 완충액 (pH 6.0)으로 평형화한 PD-10(Sephadex G 10, Bio-Rad) 컬럼으로 겔 여과시키고, 그후 5mM의 EDTA를 함유하는 0.1M의 인산 나트륨 완충액 (pH 6.0)으로 평형화한 Superose 12컬럼(Pharmacia 사, 1.0×30cm)으로 표식 항체를 정제한다. 각기 1% S - 카르복시메틸 BSA 용액 10㎕를 함유하는 유리관에 여액을 넣어 정제된¹²⁵I- KY-hBNP-II Fab' (약 26 - 40MBq, 즉 0.7 ~.1mCi) 분획을 수득한다.

(2) 고정화한 제2항체의 제조

일본국 공개 제62 - 132172호에 기재된 방법에 따라 항 - 마우스 IgG Fc 단편 토끼 혈청 (Rockland 사)를 면역비드 매트릭스(Immunobeads matrix, Bio - Rad 사) 상에 고정화시킨다.

(3) 시약

측정용 완충액 ; 1ℓ당 0.372g의 디소듐 에틸렌디아민테트라 아세테이트, 0.063g의 시스틴 디히드로클로라이드, 0.1g의 아지화 나트륨, 10⁶KIU의 아프로티닌 및 1g의 소 혈청 알부민을 함유하는 0.1M 인산염 완충액 (pH 7.0)

희석된 복수 : BC 203 A 를 측정용 완충액으로 1000배 희석시킴.

hBNP 표준액 : 측정용 완충액 1ml중 1, 4, 10, 40, 100, 400 및 1000pg의 hBNP 함유.

(4) 방법

시오노기관(상품명)에 hBNP 표준액 100㎕,¹²⁵I 표식 KY-hBNP-II Fab' 100㎕ 및 복수 희석액 (BC 203 A) 100㎕를 넣는다. 4℃에서 16시간 이상 배양후, 면역비드 상에 고정화한 항 - 마우스 IgG Fc 단편 토끼 혈청의 현탁액(2mg/ml) 0.1ml을 가하고 4℃에서 4시간 동안 배양한다. 3,000rpm에서 10분동안 원심분리후 상청액을 제거하고 침전물을 세정액 (0.1% Tween-80, 0.9%의 염화 나트륨을 함유하는 0.01M 인산염 완충액(pH 7.0)) 1ml로 세척한다. 3000rpm에서 10분동안 원심분리후, 상청액을 제거하고 침전된¹²⁵I - 표식 항체의 방사능을 감마 카운터(Aloka ARC-600형)으로 측정한다.

(5) 표준곡선

샌드위치 방사성 면역 측정법의 전형적인 표준곡선을 제1도에 나타낸다. 상기 도면은 Ipg/ml ~ 1,000 pg/ml 범위의 측정에서 양호한 직선성을 나타낸다. 최소 검출 한계는 Ipg/ml 이다. 제1도에서 - ○ - (복수) 는 상기 방법으로 수득되는 표준곡선이고, - △ - (BC 2035)는 복수 희석액 (BC 203 A) 대신에 하이브리도마 BC 203의 시험관내 배양 상청액에서 수득되는 모노클로날 항체를 사용하는 것만 제외하고 상술한 방법과 동일하게 수행하여 수득되는 표준곡선이다.

(6) 건강한 사람의 혈중 hBNP 레벨

건강한 사람의 혈중 hBNP 레벨을 본 발명의 면역 측정법 (직접 측정법)으로 측정하였으며, 표 1에 나타낸 바와같이 1pg/ml ~ 15pg/ml의 범위였고, 본 발명의 면역 측정법으로 측정할 수 있는 충분한 범위안에 있었다.

[표 1]

(7) 직접 측정법과 추출 측정법의 비교

혈장중의 BNP를 직접 측정하는 본 발명의 직접 측정법과 혈장으로 부터 BNP를 추출하는 간접 측정법인 추출 측정법을 비교한다. 추출법에서, BNP는 Sep-pak C₁₈cartridge (상품명, Waters)으로 혈장으로 부터 추출되며 그 후 상술한 샌드위치 방사성 면역 측정법과 동일한 방법으로 측정한다. 표 2에서 나타낸 바와같이 직접 측정법 및 추출 측정법으로 측정되는 값은 양호한 상관성 (상관계수 :=0.98)을 나타낸다. 본 발명의 직접 측정법은 BNP의 추출없이도 충분히 양호한 감도 및 확실성을 나타냈고, 추출법과 비교하여 매우 간단한 방법이다.

[표 2]

[참고 예]

모노클로날 항체를 사용한 방사성 면역 측정법

본 발명의 모노클로날 항체를 사용하여 경합 방사성 면역 측정법을 수행한다.

(1)¹²⁵I 표식 hBNP 의 합성

Tyr⁰-hBNP-32의 합성

hBNP 는 표식할 Tyr 잔기가 없기 때문에, N - 말단에 부가적으로 Tyr 잔기를 갖는 hBNP 즉 Tyr⁰-hBNP를 합성한다. 즉, Boc-His(Bom)-PAM-resin(NOVA BioCHem AG) 0.45mmol로 부터 출발하여 Applied Biosystems 430A사의 아미노산 합성기를 사용한 통상의 고체상법에 따라 Boc-Tyr(Br-Z)-Ser(Bzl)-Pro-Lsy(Cl-Z)-Met-Val-Gin-Gly-Ser(Bzl)-Gly-Cys(4-CH₃OBzl)-Phe-Gly-Arg(Tos)-Lys(Cl-Z)-Met-Asp(OcHex)-Arg-Ile-Ser(Bzl)-Ser(Bzl)-Ser(Bzl)-Gly-Leu-Gly-Cys(4-CH₃OBzl)-Lys(Cl-Z)-Val-Leu-Arg(Tos)-Arg(Tos)-His(Bom)-PAM-resin을 합성한다. 수득한 펩티드의 절반을 HF/p-크레졸 / 디메틸술피드로 탈보호하고 증류수로 희석한다. 암모니아 수용액으로 pH 9를 조절한 후에, 혼합물은 실온에서 24시간 동안 교반하여 S-S 가교를 도입한다. 이와같이 수득한 조 펩티드를 0 ~ 40% CH₃CN/0.1% CF₃COOH의 직선 농도 구배로 역상 크로마토그래피 (컬럼 : YMC S-50 120A ODS AM-형, 30 ×200mm) 한 후 12 ~ 22% CH₃CN/0.1% CF₃COOH의 직선 농도 구배로 HPLC 분취 (칼럼 : μ-bondasphere 15C18 300A, 30×30mm (Waters))하고 19.5% CH₃CN/0.1% CF₃COOH 용매로 YMC 342-5 S-5 120A ODS (20 ×150mm) 컬럼을 사용하여 더 정제한 후 3.9mg의 목적하는 펩티드를 수득한다.

이와같이 수득한 목적하는 펩티드의 표본은 분석용 HPLC (컬럼 : Cosmosil 5C₁₈, 4.6 ×150mm (NACALAI TESQUE, INC.) : 용매 : 20% CH₃CN/0.1% CF₃COOH : 유속 : 1.0ml/분 : 검출 : 220nm) 상에서 단일 피이크 (체류시간 : 9.10분)를 나타낸다.

펩티드는 페놀의 존재하 110℃, 20시간 동안 6M 의 HCl로 가수 분해하고 아미노산 분석하여 하기 결과를 수득한다.

Asp 0.99(1) ; Ser 4.98(6) ; Glu 0.97(1) ; Gly 4.75(5) ; Val 1.90(2) ; Met 1.82(2) ; Ile 0.95(1) ; Leu 2.02(2) ; Tyr 0.85(1) ; Phe 0.93(1) ; Lys 2.79(3) ; His 1.00(1) ; Arg 3.78(4) ; Pro 0.89(1).

( () 안의 값은 이론 값이고, Ser은 보정되지 않은 값이다.)

Na¹²⁵I 에 의한 표식화

Tyr⁰-hBNP (10㎕)을 0.5M 인산염 완충액 (pH 7.5) 0.05ml와 Na¹²⁵I(Amersham) 의 18.8MBg와 혼합한다. 혼합물에 0.01ml의 0.2% 클로르아민 T를 가하고, 그 후 30초간 교반한다. 혼합물을 1% 소듐 메타비술피트로 혼합하고, 여기에 10% 요오드화 칼륨 0.01ml를 가한다. 생성된 혼하물을 CF₃CN/CF₃COOH에 의한 경사 용리액으로 HPLC (컬럼 : YMC - A - 302 S-5 12A ODS, 4.6 ×150mm)하여 19분의 체류시간을 형성하는 모노요오드로서 표식 화한 펩티드 4.2Mbeq를 수득한다.

(2) 시약

측정용 완충액 ; 각 1ℓ중에 0.372g의 디소듐 에틸렌디아민테트라아세테이트, 0.063g의 시스틴 디히드로클로라이드, 0.1g의 아지화 나트륨, 10⁶KIU의 아프로티닌 및 1g의 소혈청 알부민을 함유하는 0.1M 인산염 완충액 (pH 7.0).

복수 희석액 : 측정용 완충액으로 42,000배 희석한 BC 203 A

hBNP 표준액 : 측정용 완충액으로 시판의 hBNP (펩티드 연구소)를 0.046 ~ 99.9mg/ml의 범위로 3배 연속 희석액

2.5% 소 감마글로불린 : 측정용 완충액에 용해되어 있는 소 감마글로불린

25% 폴리에틸렌글리콜 : 소 혈청 알부민 없이 측정용 완충액에 용해된 폴리에틸렌글리콜 6000 (요네야마 약품 공업주)

(3) 방법

hBNP 표준액 또는 시료 100㎕를 함유하는 시오노기 관에¹²⁵I 표식 hBNP 100㎕ 및 복수 희석액 100㎕를 가하고 혼합하여 4℃에서 밤새 배양한다. 그 후 100㎕의 2.3% 소 감마글로불린을 4℃까지 냉각하고 500㎕의 25% 폴리에틸렌글리콜을 가한후 즉시 교반한다. 4℃, 3,000rpm에서 20분동안 원심분리후 상청액을 제거하고 침전물의 방사능을 감마 카운터 (Aloka ARC-600)로 측정한다.

(4) 표준곡선

방사성 면역 측정법의 표준 곡선을 제2도에 나타낸다. 감도 (90%, 50% 저해농도)는 각기 1.3ng/ml, 11.8ng/ml이었다. 제2도에서 - ○ - (복수) 는 상술한 방법으로 수득한 표준 곡선을 나타내고, - ● - (27 - 32 No. 1-F)는 복수 희석액 대신에 hBNP (27 -32)에 의해 면역된 마우스의 최종 항혈청을 사용했다는 것만 제외하고 상술한 방법과 동일하게 수행하여 수득된 것을 나타낸다.

Claims

결합 부위에 히스티딘 잔기가 포함되어 있는 hBNP의 C 말단을 특이적으로 인식하는 모노클로날 항체.
하이브리도마 BC 203 (FERM BP-3515) 의 특성을 가지는 하이브리도마 세포계에 의해 생산되는 모노클로날 항체.
제1항에 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마.
제3항에 있어서, 하이브리도마 BC 203 (FERM BP-3515)인 하이브리도마.
제3항 또는 제4항 기재의 하이브리도마를 배지중 또는 마우스의 복강내에서 배양시키고, 상기 배지 또는 상기 복강내의 복수로 부터 모노클로날 항체를 회수하는 것을 포함하는 제1항의 모노클로날 항체 제조방법.
제1항 기재의 모노클로날 항체 A 와 상기 모노클로날 항체 A 와는 hBNP의 인식 부위가 다른 항체 B 사이에 hBNP를 샌드위치화 하는 것을 포함하는 hBNP의 면역 측정법.
제6항에 있어서, 상기 항체 B 가 모노클로날 항체인 면역 측정법.
제7항에 있어서, 상기 항체 B 가 hBNP의 고리구조를 인식하는 면역 측정법.
제8항에 있어서, 상기 항체 B 가 하이브리도마 KY-hBNP-II (FERM BP-2863)에 의해 생산되는 면역 측정법.
제7항 내지 제9항 중의 어느 한 항에 있어서, 사람 혈장중의 hBNP를 혈장으로 부터 hBNP 추출없이 직접 측정하는 면역 측정법.
제1항의 모노클로날 항체 A와 상기 모노클로날 항체 A에 의해 인식되는 것과는 다른 hBNP 부위를 인식하는 항체 B를 함유하는 제6항 내지 제10항 중의 어느 한 항에 기재된 면역 측정용 키트.
제3항 또는 제4항 기재의 하이브리도마를 배지중 또는 마우스의 복강내에서 배양시키고, 상기 배지 또는 상기 복강내의 복수로 부터 모노클로날 항체를 회수하는 것을 포함하는 제2항의 모노클로날 항체 제조방법.
제2항 기재의 모노클로날 항체 A와 상기 모노클로날 항체 A와는 hBNP의 인식 부위가 다른 항체 B 사이에 hBNP를 샌드위치화 하는 것을 포함하는 hBNP의 면역 측정법.
제2항의 모노클로날 항체 A와 상기 모노클로날 항체 A에 의해 인식되는 것과는 다른 hBNP 부위를 인식하는 항체 B를 함유하는 제13항에 기재된 면역 측정용 키트.