CN104880446B - 一种脑钠肽近红外荧光检测试剂盒及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种脑钠肽近红外荧光检测试剂盒及其用途。本发明提供一种脑钠肽近红外荧光检测试剂盒，包括位于背板上的试剂条，试剂条从加样端开始依次为样品垫、标记有免疫荧光探针的玻璃纤维素膜、包被有抗脑钠肽抗体的硝酸纤维素膜和吸水纸。本发明所提供的检测试剂盒结合近红外荧光检测技术，可快速，准确的检测出人全血、血清或血浆中的脑钠肽。

Description

一种脑钠肽近红外荧光检测试剂盒及其用途

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种脑钠肽(BNP)近红外荧光检测试剂盒及其用途。

背景技术

脑钠肽(Brain Natriuretic Peptide,BNP)又称B型利钠肽(B-type NatriureticPeptide)、脑利钠肽，是继心钠肽(ANP)后利钠肽系统的又一成员，由于它首先是由日本学者Sudoh等于1988年从猪脑分离出来因而得名，实际上它主要来源于心室。BNP具有重要的病理生理学意义，它可以促进排钠、排尿，具较强的舒张血管作用，可对抗肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS)的缩血管作用，同ANP一样是人体抵御容量负荷过重及高血压的一个主要内分泌系统。心功能障碍能够极大地激活利钠肽系统，心室负荷增加导致BNP释放。

BNP同ANP均是肾素血管紧张素-醛固酮系统(RAAS)的天然拮抗剂，亦抵制后叶加压素及交感神经的保钠保水、升高血压作用。BNP主要在心室合成，在心室负荷过重或扩张时增加；因此反映心室功能改变更敏感、更具特异性。越来越多的文献支持在心肌梗死(MI)后测定BNP，这不仅可识别有无左心收缩功能不全，而且在判断左室重构和死亡危险方面可能优于心超声诊断。在临床实际工作中，BNP还有助于将心衰引起的气喘和其它原因引起的气喘区分开，所以测定血浆BNP浓度可以为临床提供许多有用的信息。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种脑钠肽近红外荧光检测试剂盒及其用途，用于建立高效可行的脑钠肽近红外荧光检测技术，解决现有技术中的问题。

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种脑钠肽近红外荧光检测试剂盒及其用途。本发明所提供的检测试剂盒结合近红外荧光检测技术，可快速，准确的检测出人全血/血清/血浆中脑钠肽。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明第一方面提供一种脑钠肽近红外荧光检测试剂盒，包括位于背板上的试剂条，试剂条从加样端开始依次为样品垫、标记有免疫荧光探针的玻璃纤维素膜、包被有抗脑钠肽单克隆抗体的硝酸纤维素膜和吸水纸。

优选的，所述免疫荧光探针为抗脑钠肽单克隆抗体包被的近红外荧光乳胶微球颗粒。

硝酸纤维素膜上包被的抗脑钠肽单克隆抗体和所述近红外荧光乳胶微球颗粒上包被的抗脑钠肽单克隆抗体可以为相同的抗脑钠肽单克隆抗体，也可以为不同的抗脑钠肽单克隆抗体。

更优选的，所述硝酸纤维素膜上包被的抗脑钠肽单克隆抗体为抗体[EP3737(2)]-C-terminal，所述近红外荧光乳胶微球颗粒上包被的抗脑钠肽单克隆抗体为抗体[EPR3735]，或所述硝酸纤维素膜上包被的抗脑钠肽单克隆抗体为抗体[EPR3735]，所述近红外荧光乳胶微球颗粒上包被的抗脑钠肽单克隆抗体为抗体[EP3737(2)]-C-terminal。

更优选的，所述荧光乳胶微球颗粒的直径为140-160nm。

近红外光(NIR)，是介于可见光(VIS)和中红外光(MIR)之间的电磁波，ASTM定义NIR为波长在780nm-2526nm范围内的电磁波。在近红外光区，生物体自吸收或荧光强度很小，可避免背景干扰。同时由于散射光强度与波长的四次方呈反比，近红外区的散射干扰大为减少。

本发明第二方面提供所述脑钠肽近红外荧光检测试剂盒的制备方法，包括如下步骤：

1)用缓冲液将荧光乳胶微粒离心清洗并将乳胶颗粒分散，在清洗好的乳胶颗粒分散液中加入抗脑钠肽单克隆抗体；加入EDCA使抗体与颗粒偶联；再加入封闭液封闭乳胶颗粒上多余的基团，制备获得探针溶液；

2)将含有抗脑钠肽单克隆抗体的缓冲溶液喷加到硝酸纤维素膜上，烘干备用；

3)将步骤1制备获得的探针溶液浸润玻璃纤维薄膜，干燥备用；

4)将步骤2所得的硝酸纤维素膜、步骤3所得的标记有免疫荧光探针的玻璃纤维素膜、样品垫、吸水纸及背板组装制备成脑钠肽近红外荧光检测试剂盒。

优选的，所述步骤1中，再加入封闭液封闭乳胶颗粒上多余的基团，并加入冠醚，制备获得探针溶液，所述冠醚选自二环已基-18-冠-6、15-冠醚-5、18-冠醚-6中的一种或多种的组合。

更优选的，步骤1制备获得的探针溶液中冠醚的浓度为0.1-20mg/ml，更优选为4-8mg/ml。

优选的，所述步骤1中，缓冲液为磷酸盐(PBS)缓冲液。

更优选的，所述PBS缓冲液为0.009-0.011mol/L，PH7.25-7.35的PBS缓冲液。

优选的，所述步骤1中，荧光乳胶微粒的直径为140-160nm。

优选的，所述步骤1中，乳胶颗粒、抗脑钠肽单克隆抗体、EDCA的重量比为9-11：0.9-1.1：0.9-1.1。

在本发明一实施例中，乳胶颗粒、抗脑钠肽单克隆抗体、EDCA的投料量分别为1mg、100ug、100ug。

优选的，所述封闭液为乙醇胺，加入量为适量，本领域技术人员可根据实际情况调整乙醇胺的用量。

优选的，所述步骤2中，所述缓冲溶液为PBS缓冲液。

本领域技术人员可选取适当浓度和pH的PBS缓冲液，更优选为0.009-0.011mol/L，PH7.25-7.35的PBS缓冲液。

优选的，所述步骤2中，含有抗脑钠肽单克隆抗体的缓冲溶液中还含有冠醚，所述冠醚选自二环已基-18-冠-6、15-冠醚-5、18-冠醚-6中的一种或多种的组合。

更优选的，所述含有抗脑钠肽单克隆抗体的缓冲溶液中冠醚的浓度为0.1-20mg/ml，更优选为4-8mg/ml。

优选的，所述步骤2中，含有抗脑钠肽单克隆抗体的缓冲溶液中抗脑钠肽单克隆抗体的浓度为1.8-2.2mg/ml。

优选的，所述步骤2中，抗脑钠肽单克隆抗体的缓冲溶液的喷加量为0.9-1.1ul/cm。

优选的，所述步骤2中，烘干的具体条件为36-38℃烘箱烘干。

所述喷加过程利用微量蛋白点膜系统。

优选的，所述步骤1中的抗脑钠肽单克隆抗体为抗体[EP3737(2)]-C-terminal，所述步骤2中的抗脑钠肽单克隆抗体为抗体[EPR3735]，或所述步骤1中的抗脑钠肽单克隆抗体为抗体[EPR3735]，所述步骤2中的抗脑钠肽单克隆抗体为抗体[EP3737(2)]-C-terminal。

优选的，所述步骤3中，干燥的具体条件为真空干燥机干燥。

本发明第三方面提供所述脑钠肽近红外荧光检测试剂盒在脑钠肽检测领域的用途。

所述用途具体为使用所述脑钠肽近红外荧光检测试剂盒对样品中的脑钠肽进行检测，所述样品选自人全血、血清或血浆中的一种或多种的组合。

本发明所提供的检测试剂盒以人全血/血清/血浆为检测样本，结合近红外荧光检测技术，可快速，准确的检测出患者标本中的脑钠肽。所述试剂盒采用免疫荧光层析法，其最小可测量可达0.5pg/ml，检测方便、成本低，灵敏度高，特异性好，比同类定量诊断试剂价格低20-30％，大大节约了社会医疗成本，检测过程中样品收集及处理简单，可快速准确的获得结果，非常适合突发事件现场和基层使用，并可应用到临床检测中，为临床治疗提供定性依据。

具体实施方式

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring HarborLaboratory Press，1989and Third edition，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，New York，1987and periodic updates；theseries METHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATINSTRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998；METHODS INENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，AcademicPress，San Diego，1999；和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，ChromatinProtocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。

本发明各实施例中试验样品由浦东新区人民医院提供。近红外荧光检测仪，由上海凯创生物技术有限公司开发提供。

实施例1

1.免疫荧光抗脑钠肽抗体颗粒制备：

用0.01mol/L，PH7.3±0.05的磷酸盐缓冲液将直径为150nm的荧光乳胶微粒离心清洗2遍并将乳胶颗粒分散，在清洗好的乳胶颗粒中加入抗体[EP3737(2)]-C-terminal；加入EDCA使抗体与颗粒偶联；加入封闭液封闭乳胶颗粒上多余的基团，再加入二环已基-18-冠-6。按每毫克微球乳胶100微克的待标记抗体，100微克的EDCA用量标记。每毫克的微球乳胶最后加相当于20微克的乙醇胺当量的封闭液进行封闭，冠醚的终浓度为6mg/ml。

2.试剂盒的制备：

用0.01M pH7.2的PBS缓冲液稀释抗体[EPR3735]至浓度2.0mg/ml，并加入冠醚，冠醚的终浓度为6mg/ml，再利用微量蛋白点膜系统将溶液喷加到适当孔径的硝酸纤维素膜上，按1ul/cm的量进行喷膜，37℃烘箱烘干备用。

用制备好的探针(步骤1制得的标记有抗体[EP3737(2)]-C-terminal的近红外荧光乳胶微球)溶液浸润玻璃纤维薄膜，真空干燥机中干燥备用。

将包被抗脑钠肽抗体的硝酸纤维素膜、标记有免疫荧光探针的玻璃纤维素膜、样品垫、吸水纸及背板组装制备成脑钠肽近红外荧光检测试剂盒。

实施例2

脑钠肽近红外荧光检测法实验：

试剂盒检测：

以基因工程合成的BNP和PBS缓冲液分别配置浓度为0.5pg/ml、0.8pg/ml、1pg/ml、2pg/ml、5pg/ml、10pg/ml、20pg/ml、50pg/ml、100pg/ml、200pg/ml、300pg/ml、400pg/ml、500pg/ml、1000pg/ml的BNP标准品，以0pg/ml作为空白对照，空白对照及每个浓度的标准品均重复测定5次。标准品及试剂盒均平衡至室温开始检测，用滴管在每个试剂盒的加样孔内滴加3滴样本(约120-150ul)。15分钟时，用近红外荧光检测仪检测荧光信号，并用荧光仪器进行判断，分析仪的对荧光信号的检测范围是AD值0-10000。以BNP浓度为横坐标，近红外荧光检测仪检测荧光信号(平均值)为纵坐标，建立标准曲线。在标准曲线上，随着标准品浓度的升高，测得的荧光信号值也随之升高。

根据标准曲线计算可知，本试剂盒对0.5pg/ml的样品可以部分检出，对0.8pg/ml的样品全部检出，其最低检出限≤0.8pg/ml，并在2-1000pg/ml的范围具有良好的线性。

各浓度的批内最大CVs为4.1％，平均CVs为3.46％(每个浓度的样品同批进行测试)，各浓度的批间最大CVs为5.5％，平均CVs为4.5％(每个浓度的样品分5批进行测试)表明本发明所提供的试剂盒具有良好的重复性。

选择未检测出BNP的小牛血清进行加标回收实验，加入BNP标准品，将BNP的浓度分别调整至20pg/ml、100pg/ml、300pg/ml、500pg/ml、800pg/ml，空白对照及每个浓度的样品均重复测定5次。各浓度的批内最大CVs为4.2％，平均CVs为3.5％，各浓度的加标回收率为98.5％-100.1％，表明本发明所提供的试剂盒具有良好的准确度。

将本发明所提供的脑钠肽近红外荧光检测试剂盒密封保存，并存放于4℃及室温(25℃左右)下，观察不同存放温度对试剂盒稳定性的影响。保存于4℃的试剂盒每周取出4盒，分别检测0.5pg/ml、0.8pg/ml、1.0pg/ml、1.5pg/ml的脑钠肽标准品；保存于室温(25℃)的试剂盒每3天取出4盒，分别检测0.5pg/ml、0.8pg/ml、1.0pg/ml、1.5pg/ml的脑钠肽标准品。经验证，试纸盒在4℃下可保存24个月，且最低检出限和重复性没有明显变化，在室温下可保存18个月，且最低检出限和重复性没有明显变化；在可保存的期限内，试剂盒均可达到0.8pg/ml的检测灵敏度。

综上所述，本发明有效克服了现有技术中的种种缺点而具高度产业利用价值。

上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

Claims (4)

1.一种脑钠肽近红外荧光检测试剂盒，包括位于背板上的试剂条，试剂条从加样端开始依次为样品垫、标记有免疫荧光探针的玻璃纤维素膜、包被有抗脑钠肽单克隆抗体的硝酸纤维素膜和吸水纸，所述免疫荧光探针为抗脑钠肽单克隆抗体包被的近红外荧光乳胶微球颗粒；

所述脑钠肽近红外荧光检测试剂盒的制备方法，包括如下步骤：

1)用0.01mol/L，PH7.3±0.05的磷酸盐缓冲液将荧光乳胶微粒离心清洗并将乳胶颗粒分散，在清洗好的乳胶颗粒分散液中加入Anti-BNP抗体[EP3737(2)]-C-terminal；加入EDCA使抗体与颗粒偶联；再加入封闭液封闭乳胶颗粒上多余的基团，并加入冠醚，制备获得探针溶液；其中，按每毫克微球乳胶100微克的待标记抗体、100微克的EDCA用量标记；

2)0.01M pH7.2的PBS缓冲液稀释Anti-BNP抗体[EPR3735]至浓度2.0mg/ml，并加入冠醚，冠醚的终浓度为6mg/ml，将含有抗脑钠肽单克隆抗体的缓冲溶液喷加到硝酸纤维素膜上，按1ul/cm的量进行喷膜，37℃烘箱烘干备用；

3)将步骤1制备获得的探针溶液浸润玻璃纤维薄膜，干燥备用；

4)将步骤2所得的硝酸纤维素膜、步骤3所得的标记有免疫荧光探针的玻璃纤维素膜、样品垫、吸水纸及背板组装制备成脑钠肽近红外荧光检测试剂盒；

所述步骤2中，含有抗脑钠肽单克隆抗体的缓冲溶液中还含有冠醚；

所述冠醚选自二环已基-18-冠-6；

所述荧光乳胶微球颗粒的直径为140-160nm；

所述硝酸纤维素膜上包被的抗脑钠肽单克隆抗体和所述近红外荧光乳胶微球颗粒上包被的抗脑钠肽单克隆抗体为相同的抗脑钠肽单克隆抗体或不同的抗脑钠肽单克隆抗体。

2.如权利要求1所述的脑钠肽近红外荧光检测试剂盒的制备方法，包括如下步骤：

1)用缓冲液将荧光乳胶微粒离心清洗并将乳胶颗粒分散，在清洗好的乳胶颗粒分散液中加入抗脑钠肽单克隆抗体；加入EDCA使抗体与颗粒偶联；再加入封闭液封闭乳胶颗粒上多余的基团，并加入冠醚，制备获得探针溶液；

2)将含有抗脑钠肽单克隆抗体的缓冲溶液喷加到硝酸纤维素膜上，烘干备用；

3)将步骤1制备获得的探针溶液浸润玻璃纤维薄膜，干燥备用；

4)将步骤2所得的硝酸纤维素膜、步骤3所得的标记有免疫荧光探针的玻璃纤维素膜、样品垫、吸水纸及背板组装制备成脑钠肽近红外荧光检测试剂盒；

所述步骤2中，含有抗脑钠肽单克隆抗体的缓冲溶液中还含有冠醚，所述冠醚选自18-冠醚-6。

3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤1中，步骤1制备获得的探针溶液中冠醚的浓度为0.1-20mg/ml；

和/或，所述步骤1中，缓冲液为PBS缓冲液；

和/或，所述步骤1中，乳胶颗粒、抗脑钠肽单克隆抗体、EDCA的重量比为9-11：0.9-1.1：0.9-1.1；

和/或，所述封闭液为乙醇胺。

4.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤2中，所述含有抗脑钠肽单克隆抗体的缓冲溶液中冠醚的浓度为0.1-20mg/ml；

和/或，含有抗脑钠肽单克隆抗体的缓冲溶液中抗脑钠肽单克隆抗体的浓度为1.8-2.2mg/ml；

和/或，抗脑钠肽单克隆抗体的缓冲溶液的喷加量为0.9-1.1ul/cm；

和/或，所述步骤2中，所述缓冲溶液为PBS缓冲液。