CN1854739A - 一种快速检测衣原体的试剂盒及其制备方法 - Google Patents

Abstract

一种快速检测衣原体的试剂盒，衣原体是导致人类尿道炎、宫颈炎、肺炎和沙眼疾病的病原微生物，具有严重的危害性，试剂盒是衣原体检测的方法中检测衣原体的检测试剂，其特征在于：1)试剂条由四部分组成：吸水纸、硝酸纤维素膜条、玻璃纤维纸片和滤样纸；2)检测目标物为感染人体的衣原体，检测标本为女性宫颈或男性尿道黏膜细胞取样拭子标本、眼结膜细胞拭子标本；3)通过显色反应肉眼观察结果，检测快速，15分钟内完成检测。本发明有下列优点：衣原体LPS纯度高；抗衣原体LPS单克隆抗体纯度高、效价高、特异性好，可大批量制备；衣原体检测试剂盒具有灵敏度高、特异性强，假阳性、假阴性率低、操作简单、检测快速、检测结果易于观察。适合各类医疗和研究机构使用。

Description

一种快速检测衣原体的试剂盒及其制备方法

一、技术领域：

本发明涉及一种利用抗衣原体脂多糖(LPS)单克隆抗体及胶体金免疫层析技术的快速检测衣原体的试剂盒及其制备方法。

二、背景技术：

衣原体(Chlamydia)，是导致人类尿道炎、宫颈炎、肺炎和沙眼等的病原微生物，具有严重的危害性。从遗传学上主要分三类：沙眼衣原体(Chlamydia Trachomatis)、鹦鹉热衣原体(Chlamydia Psittas)和肺炎衣原体(Chlamydia Pneumoniae)。其中沙眼衣原体是导致人类泌尿生殖系统感染的主要病原微生物之一，是主要的性传播疾病病原微生物之一。在美国每年大约有400万衣原体感染新病例发生，在发展中国家的性乱及性活跃期正常家庭中，沙眼衣原体在泌尿生殖道感染率一般在10～35％之间。另外，至少40％的非淋球菌性尿道炎是由衣原体感染引起。

鉴于衣原体感染的危害性，研究灵敏度高、特异性好、检测方便快捷的衣原体检测试剂成为衣原体检测方法的发展方向。

目前现有的检测方法的缺点：现有衣原体的检测方法主要有细胞培养法、聚合酶链反应(PCR)法、衣原体抗体检测法。细胞培养法的主要缺点是敏感度低一般为40～60％，培养时间长48～72小时，设备昂贵，操作复杂，需要严格训练的专业人员完成。聚合酶链反应(PCR)法主要缺点是样品易受污染导致假阳性高，设备昂贵，操作冗长复杂。衣原体抗体检测法的主要缺点是特异性差，检测结果不能说明被检者真实的感染情况。

衣原体脂多糖(LPS)是衣原体属细胞外膜上特有种属特异性抗原，和其他微生物有很大的结构和性质差异。因此检测出样品中有衣原体LPS能准确的说明样品中存在衣原体。因此，利用衣原体LPS免疫动物，筛选建立单克隆抗体细胞株，制备特异性的抗衣原体LPS单克隆抗体。用该单克隆抗体来生产衣原体快速检测试剂盒，用来检测衣原体LPS，是现今敏感度、特异性、准确性都最好的衣原体检测方法，而且不需要专门设备，操作简单快速，15分钟可完成检测。

衣原体抗原检测试剂盒最核心的技术就是其使用单克隆抗体的质量，抗体质量的好坏是影响试剂盒灵敏度、特异性的核心因素。而不同研发机构在筛选单克隆抗体时，因为使用的免疫抗原不同、单克隆细胞株系的不同、抗体纯化工艺的不同，而导致的单克隆抗体质量水平差距很大，所以试剂盒质量差异亦很大。

衣原体是专性寄生在人黏膜上皮细胞内，细胞外不能生长。故理想的检测样本应当是黏膜细胞拭子而不是黏膜分泌物标本。而分泌物样本中检测样品为细胞分泌物，不是黏膜细胞拭子，故检出衣原体的敏感度差。

国内现有类似的检测衣原体抗原方法的相关专利，如申请号01131835.X，该专利技术缺陷是：一是没有相关的单克隆抗体筛选工艺，单克隆抗体的质量不能得到保证，二是检测样品为分泌物，而不是黏膜细胞拭子，故检测敏感度差。申请号02116407.X，该专利技术缺陷是：使用混合沙眼衣原体初体(EBS)做为抗原免疫小鼠制备单克隆抗体，沙眼衣原体初体(EBS)做为完整的菌体，以它做为免疫原将会得到非常复杂的抗体细胞系，十分不利于单克隆细胞系的建立，筛选到的抗体交叉反应多，特异性差。申请号03112265.5，该专利技术缺陷是：虽然该技术采用的特异的衣原体脂多糖(LPS)作为抗原免疫动物，直接纯化动物制备生产衣原体检测试剂盒所需的抗体，而不是使用的抗衣原体LPS单克隆抗体。显然该方法得到的抗体是混合物，是多克隆抗体，所以特异性差。本发明使用独特工艺制备的特异性强、灵敏度高的抗LPS单克隆抗体来生产衣原体检测试剂盒，且采用黏膜细胞拭子标本作为检测样本，替代了现有的黏膜分泌物标本，较之已有的相关技术有明显的先进性。

三、发明内容：

本发明的第一个目的是：提供一种特异性强的抗衣原体LPS单克隆抗体的制备方法。本发明的第二个目的是：提供一种克服了现有的衣原体检测方法局限性，灵敏度高、特异性、操作简单检测快速的衣原体检测试剂盒。

本发明的原理是：

利用纯化的衣原体脂多糖(LPS)特异性抗原免疫BALB/c小鼠，然后取小鼠的脾细胞及SP2/O骨髓瘤细胞进行细胞融合，再用HAT培养基筛选出高抗体分泌细胞，将筛选出的细胞再行克隆化，用ELISA法筛选高分泌特异性细胞株，建立抗衣原体LPS单克隆抗体细胞株，利用该细胞株制备并纯化抗衣原体LPS单克隆抗体。

本发明是这样实现的：一种快速检测衣原体的试剂盒的制备方法，包括特异性强的抗衣原体LPS单克隆抗体的制法和快速检测衣原体试剂盒的制法，其特征在于所述的特异性强的抗衣原体LPS单克隆抗体的制法：

a)、制备单克隆抗体所需衣原体抗原为纯化抗原，是纯化的衣原体的脂多糖LPS；

b)、制备衣原体LPS的抽提剂为3-(3-(胆酰胺基丙基)二甲氨基)丙磺酸盐CHAPS；

c)、生产原料采用特异的抗衣原体LPS单克隆抗体；

d)、抗衣原体LPS单克隆抗体的纯化方法为蛋白A-琼脂糖柱亲和层析法，层析柱平衡缓冲液为PH8.2，1.0M的三羟基氨基甲烷Tris缓冲液，洗脱缓冲液为PH3.0，50mM的甘氨酸缓冲液。

利用上述方法制备的抗衣原体LPS单克隆抗体来生产一种快速检测衣原体的试剂盒：试剂盒由单人份的试剂卡组成，卡内有一条试剂条。试剂条由四部分组成：吸水纸、硝酸纤维素膜条、玻璃纤维纸片和滤样纸。硝酸纤维素膜上的检测区包被有抗衣原体脂多糖(LPS)单克隆抗体、质控区包被有羊抗鼠IgG，玻璃纤维纸片上包被有胶体金标记的抗衣原体脂多糖(LPS)单克隆抗体。检测时，待测样品加到滤样纸上后，并层析到试剂条的硝酸纤维素膜上，产生显色反应。如果在试剂条的检测区和质控区各出现一条红色线条，说明被检样品中有衣原体存在，结果为阳性。如果检测区无线条出现，只在质控区出现一条红色线条，说明样品中没有衣原体，为阴性结果。整个检测时间在15分钟内可完成，操作简单方便。

本发明的第一个目的通过下列方式实施：

1、衣原体特异性抗原的制备及纯化

(1)、用衣原体包涵体接种McCoy细胞，2500～3000pm离心1小时，加含0.5μg/ml Eagle MEM培养基培养，置细胞培养箱内37℃ 48～72小时。

(2)收集培养扩增的衣原体培养物，用CHAPS(3-(3-(胆酰胺基丙基)二甲氨基)丙磺酸盐)提取衣原体LPS，5000～10000rpm离心后，取上清液，用DEAE离子交换层析法纯化处理，然后经SephadexG-75凝胶过滤，用PH7.2，50mM，的磷酸盐缓冲液洗脱，洗脱速度50ml/h，收集洗脱液，浓缩。即得高纯度衣原体LPS特异性抗原(SDS-PAGE法检测纯度大于95％)，于4～8℃保存备用。

2、用纯化的衣原体LPS抗原免疫小鼠，利用细胞融合杂交瘤技术建立抗衣原体LPS单克隆抗体细胞株

(1)、用纯化的衣原体LPS抗原以5mg/ml免疫BALB/c小鼠，经腹腔和四肢腋下注射，总量1ml。每隔2周以同样的方法加强免疫1次，共免疫3次，末次免疫后的第4天，分离免疫小鼠的脾细胞并和和SP2/0骨髓瘤细胞进行细胞融合，制得杂交瘤细胞。

(2)、用HAT培养基筛选出高抗体分泌细胞，将筛选出的细胞再行克隆化，用ELISA法选出高分泌特异性细胞株(即ELISA效价在1∶10000以上的阳性克隆)，并克隆化细胞株，制得特异大量分泌抗衣原体LPS单克隆抗体细胞株，保存备用。

3、小鼠腹腔法培养收集腹水：将筛选出的高分泌特异性细胞株接种小鼠腹腔进行扩增培养，每只腹腔注射1ml(含1.0×10⁷个细胞株/ml)，2周持续收集腹水。

4、衣原体LPS单克隆抗体的纯化

(1)、腹水经硫酸铵沉淀后，再用DEAE离子交换柱纯化，用PH5.6，20mM的醋酸盐缓冲液洗脱，收集洗脱液。

(2)、用亲和层析纯化法(蛋白A-Sepharose4B柱)继续纯化，上样条件：样品和蛋白A-Sepharose4B柱用PH8.2，1.0M的Tris缓冲液平衡后在上样。洗脱条件：用PH3.0，50mM的甘氨酸缓冲液洗脱，收集洗脱液，制得抗衣原体特LPS单克隆抗体。用SDS-PAGE法检测其纯度应大于95％，用ELISA法测定效价，应大于1∶10⁶倍稀释，-20℃保存备用。

本发明的第二个目的通过下列方式实施：

1、抗衣原体LPS单克隆抗体标记胶体金：用柠檬酸三钠还原氯金酸制备粒径40～60nm胶体金，然后每1ml胶体金标记50μg抗衣原体LPS单克隆抗体。

2、将抗衣原体LPS单克隆抗体标记的胶体金包被到玻璃纤维纸片上。

3、将衣原体LPS单克隆抗体稀释至浓度1.5mg/ml，将羊抗鼠IgG稀释至浓度2.0mg/ml，将两种溶液喷点于硝酸纤维素膜上的检测区和质控区。

4、将制得的玻璃纤维纸片、硝酸纤维素膜与滤样纸、吸水纸等一起组合成试剂条。

5、将试剂条装配在塑料卡内，组装成衣原体检测试剂盒。

6、试剂盒的使用：

(1)、使用目的：本品用于定性检测女性宫颈和男性尿道中和眼结膜黏膜细胞拭子标本中衣原体的存在，临床用于诊断衣原体感染。

(2)、检测原理和结果判断：试剂盒由单人份的试剂卡组成，卡内有一条试剂条。试剂条由四部分组成：吸水纸、硝酸纤维素膜条、玻璃纤维纸片和滤样纸。硝酸纤维素膜上的检测区包被有抗衣原体脂多糖(LPS)单克隆抗体、质控区包被有羊抗鼠IgG，玻璃纤维纸片上包被有胶体金标记的抗衣原体脂多糖(LPS)单克隆抗体。检测时，待测样品加到滤样纸上后，并层析到试剂条的硝酸纤维素膜上，产生显色反应。如果在试剂条的检测区和质控区各出现一条红色线条，说明被检样品中有衣原体存在，结果为阳性。如果检测区无线条出现，只在质控区出现一条红色线条，说明样品中没有衣原体，为阴性结果。整个检测时间在15分钟内可完成，操作简单方便。

7、本试剂盒的性能特点：

(1)、敏感度：可检出样本中浓度4×10³IFU/ml以下的衣原体。

(2)、特异性：用本衣原体检测试剂盒下列微生物不发生交叉反应，ACINETOBACTER(不动杆菌属)、SALMONELLA TYPHI(沙门菌属)、NEISSERIAGONORRHOEAE(淋病奈瑟菌)、STAPHYLOCOCCUS AUREUS(金黄色葡萄球菌)、PSEUDOMONAS(假单胞菌)、CANDIDAALBICANS(白色念珠菌)、ESCHERICHIACOLI(大肠埃希杆菌)、STREPTOCOCCUS FAECALIS(粪链球菌)、STREPTOCOCCUSFAECIUM(屎链球菌)、STREPT B(B族链球菌)、TRICHOMONAS VAGINALIS(阴道毛滴虫)。

和现有技术相比本发明具有下列优点：

1、本发明制备的衣原体LPS纯度高(SDS-PAGE纯度可达95％以上)，用它作为抗原免疫小鼠而建立的单克隆抗体细胞株能分泌高效价高特异性的抗衣原体LPS单克隆抗体。

2、本发明的制备的抗衣原体LPS单克隆抗体纯度高(SDS-PAGE纯度可达95％以上)，效价高(ELISA效价至少在1∶10⁶以上)、特异性好，可大批量制备等优点。

3、本发明制备的衣原体检测试剂盒，使用独特工艺制备，且采用黏膜细胞拭子标本作为检测样本，替代了现有的黏膜分泌物标本，具有灵敏度高(可检出4×10³IFU/ml的衣原体)，特异性强，假阳性、假阴性率低，操作简单，无需特殊仪器及专业技术人员，检测快速，检测结果易于观察，检测费用低廉，贮存和运输方便等优点。十分适合各类医疗和研究机构使用。

四、具体实施方式：

快速衣原体检测试剂盒的制备：是利用本发明制备的抗衣原体LPS单克隆抗体，制成胶体金一步法检测衣原体试剂盒的具体制备方法。

1、胶体金的制备：用柠檬酸三钠还原氯金酸制备粒径40～60nm的胶体金

(1)、分别配制0.01％的HAuCl₄水溶液，和1.0％的枸橼酸三钠水溶液。

(2)、将0.01％氯金酸溶液1000ml置烧杯中，在电炉上加热至沸腾。加入1.0％的柠檬酸三钠水溶液6.5ml，边加边搅拌。并继续加热煮沸10～15分钟至溶液呈透明的红色。冷却至室温，加纯化水恢复至原体积，即得。

2、抗衣原体LPS单克隆抗体标记胶体金

(1)、将抗衣原体LPS单克隆抗体用PH7.2、0.1M磷酸盐缓冲液稀释至蛋白浓度2.0mg/ml。

(2)、将抗衣原体LPS单克隆抗体加入到准备好的胶体金溶液中，室温反应10分钟，并不时搅拌。加入5％的BSA，使溶液中BSA的终浓度为0.1％。

(3)、纯化衣原体LPS单克隆抗体标记的胶体金。

3、将衣原体LPS单克隆抗体稀释至浓度1.5mg/ml，将羊抗鼠IgG稀释至浓度2.0mg/ml，将两种溶液喷点于硝酸纤维素膜上的检测区和质控区。

4、将制得的玻璃纤维纸片、硝酸纤维素膜与滤样纸、吸水纸等一起组合成试剂条。

5、将试剂条装配在塑料卡内，组装成衣原体检测试剂盒。

6、试剂盒的使用：

(1)、使用目的：本品用于定性检测女性宫颈和男性尿道中和眼结膜黏膜细胞拭子标本中衣原体的存在，临床用于诊断衣原体感染。

(2)、检测原理和结果判断：试剂盒由单人份的试剂卡组成，卡内有一条试剂条。试剂条由四部分组成：吸水纸、硝酸纤维素膜条、玻璃纤维纸片和滤样纸。硝酸纤维素膜上的检测区包被有抗衣原体脂多糖(LPS)单克隆抗体、质控区包被有羊抗鼠IgG，玻璃纤维纸片上包被有胶体金标记的抗衣原体脂多糖(LPS)单克隆抗体。检测时，待测样品加到滤样纸上后，并层析到试剂条的硝酸纤维素膜上，产生显色反应。如果在试剂条的检测区和质控区各出现一条红色线条，说明被检样品中有衣原体存在，结果为阳性。如果检测区无线条出现，只在质控区出现一条红色线条，说明样品中没有衣原体，为阴性结果。整个检测时间在15分钟内可完成，操作简单方便。

7、样本的收集

(1)、宫颈样品：使用试剂盒提供的配套拭子，或消毒的亚麻、涤纶拭子。在取样前用另外的拭子或棉球将宫颈口外区域的黏液抹去，将取样拭子插入宫颈管内通过鳞柱状上皮交界处，直到几乎拭子头已看不到。旋转拭子15～20秒钟取出，不要碰到宫颈外及阴道壁。这样能保证得到更多的柱状上皮细胞，而衣原体主要寄生在柱状上皮细胞中。宫颈样品也可用细胞刷(未提供)收集(注意：孕妇不可用此方法)。清洁宫颈口外后，将细胞刷插入宫颈管，通过鳞柱状上皮细胞交界处，停留2～3秒钟，旋转细胞刷两圈后取出，注意不要碰到阴道壁。

(2)、男性尿道样品：尿道用拭子或细胞刷可用于尿道取样。病人在取样前至少1小时内不要小便。将拭子或细胞刷插入尿道2～4厘米，旋转3～5秒钟后取出。

(3)、眼结膜样品：用拭子取样。翻开眼睑，将拭子反复在结膜上擦拭3～5次，即得。

8、检测操作方法：

(1)、用8滴含有CHAPS(3-(3-(胆酰胺基丙基)二甲氨基)丙磺酸盐，为衣原体LPS抽提剂)处理样品2分钟。

(2)、将处理好的样品滴加2～3滴至检测试剂盒的滤样纸上。

(3)、等待结果的出现。在加样10～15分钟判读结果。

(4)、结果判读：如果在试剂条的检测区和质控区各出现一条红色线条，说明被检样品中有衣原体存在，结果为阳性。如果检测区无线条出现，只在质控区出现一条红色线条，说明样品中没有衣原体，为阴性结果。

9、本试剂盒的性能特点：

(1)、敏感度：可检出样本中浓度4×103IFU/ml以下的衣原体。

(2)、特异性：用本衣原体检测试剂盒下列微生物不发生交叉反应，ACINETOBACTER(不动杆菌属)、SALMONELLA TYPHI(沙门菌属)、NEISSERIAGONORRHOEAE(淋病奈瑟菌)、staphylococcus aureus(金黄色葡萄球菌)、PSEUDOMONAS(假单胞菌)、CANDIDAALBICANS(白色念珠菌)、ESCHERICHIACOLI(大肠埃希杆菌)、STREPTOCOCCUS FAECALIS(粪链球菌)、STREPTOCOCCUSFAECIUM(屎链球菌)、STREPT B(B族链球菌)、TRICHOMONAS VAGINALIS(阴道毛滴虫)。

Claims (2)

1.一种快速检测衣原体的试剂盒，衣原体是导致人类尿道炎、宫颈炎、肺炎和沙眼疾病的病原微生物，具有严重的危害性，试剂盒是衣原体检测的方法中检测衣原体的检测试剂，其特征在于：

(1)、试剂条由四部分组成：吸水纸、硝酸纤维素膜条、玻璃纤维纸片和滤样纸，硝酸纤维素膜上的检测区包被有抗衣原体脂多糖LPS单克隆抗体、质控区包被有羊抗鼠IgG，玻璃纤维纸片上包被有胶体金标记的抗衣原体脂多糖LPS单克隆抗体；

(2)、检测目标物为感染人体的衣原体，检测标本为女性宫颈或男性尿道黏膜细胞取样拭子标本、眼结膜细胞拭子标本；

(3)、通过显色反应肉眼观察结果，检测快速，15分钟内完成检测。

2.一种由权利要求1所述的快速检测衣原体的试剂盒的制备方法，包括特异性强的抗衣原体LPS单克隆抗体的制法和快速检测衣原体试剂盒的制法，其特征在于所述的特异性强的抗衣原体LPS单克隆抗体的制法：

a)、制备单克隆抗体所需衣原体抗原为纯化抗原，是纯化的衣原体的脂多糖LPS；

b)、制备衣原体LPS的抽提剂为3-(3-(胆酰胺基丙基)二甲氨基)丙磺酸盐CHAPS；

c)、生产原料采用特异的抗衣原体LPS单克隆抗体；

d)、抗衣原体LPS单克隆抗体的纯化方法为蛋白A-琼脂糖柱亲和层析法，层析柱平衡缓冲液为PH8.2，1.0M的三羟基氨基甲烷Tris缓冲液，洗脱缓冲液为PH3.0，50mM的甘氨酸缓冲液。