PT115028B

PT115028B - Processo para purificar um anticorpo a partir da gema de ovo, seus produtos e usos

Info

Publication number: PT115028B
Application number: PT115028A
Authority: PT
Inventors: Manuel Da Costa E Araújo Pereira Coutinho João; Guadalupe Freire Martins Mara; Cristina Da Silva Bernardo Sandra
Original assignee: Univ Aveiro
Priority date: 2018-09-20
Filing date: 2018-09-20
Publication date: 2021-07-30
Also published as: EP3854813A1; PT115028A; JP2022501375A; WO2020058936A1; US20210253632A1

Abstract

A PRESENTE DIVULGAÇÃO DIZ RESPEITO A UM PROCESSO RÁPIDO E SIMPLES PARA A OBTENÇÃO DE IMUNOGLOBULINAS (IGS), OU ANTICORPOS, COM UM GRAU DE PUREZA ELEVADO. ESTES ANTICORPOS POLICLONAIS SÃO OBTIDOS ATRAVÉS DA GEMA DO OVO, REPRESENTANDO UM MEIO ALTERNATIVO PARA A SUA AQUISIÇÃO E UMA FONTE RENOVÁVEL E RENTÁVEL PARA A SUA PRODUÇÃO. O PROCESSO AQUI DESCRITO ENGLOBA VÁRIAS ETAPAS NAS QUAIS SE PODEM UTILIZAR AGENTES DE PRECIPITAÇÃO SELETIVOS, BIOCOMPATÍVEIS E DE BAIXO CUSTO, ALIADOS A UM PASSO DE ULTRAFILTRAÇÃO

Description

DESCRIÇÃO PROCESSO PARA PURIFICAR UM ANTICORPO A PARTIR DA GEMA DE OVO, SEUS PRODUTOS E USOS

Domínio técnico

[0001] A presente divulgação diz respeito a um processo rápido e simples para a obtenção de imunoglobulinas (Igs), ou anticorpos, com um grau de pureza elevado. Estes anticorpos policlonais são obtidos através da gema do ovo, representando um meio alternativo para a sua aquisição e uma fonte renovável e rentável para a sua produção.

[0002] O processo descrito na presente divulgação engloba várias etapas nas quais se podem utilizar agentes de precipitação seletivos, biocompativeis e de baixo custo, aliados a um passo de ultrafiltração. Com a realização deste processo, obtém-se um precipitado enriquecido em IgY com elevado grau de pureza, um elevado rendimento e a baixo custo, quando comparados com os anticorpos obtidos a partir do sérum de mamíferos (imunoglobulina G, IgG) usando os processos atualmente descritos e utilizados pela indústria, nomeadamente processos cromatográficos. Em particular, com o processo aqui descrito é possível obter-se cerca de 100 a 120 mg de anticorpos (Igs), com uma pureza entre 90 a 99%, maioritariamente acima dos 98%, por gema de ovo.

Antecedentes

[0003] Imunoglobulinas (Igs) ou anticorpos são glicoproteínas que podem ser encontradas no plasma ou fluidos extracelulares de vertebrados, sendo o principal agente da resposta humoral do sistema imunitário e constituindo cerca de 20% de todas as proteínas existentes no plasma humano. Os anticorpos são produzidos em resposta a agentes patogénicos, tais como bactérias e vírus, ou a proteínas e moléculas estranhas ao organismo.

[0004] Especificamente, a imunoglobulina Y (IgY) é um tipo de anticorpo de aves funcionalmente equivalente à imunoglobulina G dos mamíferos. A IgY é produzida pelas aves, sendo que estes anticorpos se concentram na gema do ovo durante a sua formação.

[0005] Estes anticorpos podem ser utilizados em imunodiagnóstico ou para fins medicinais, nomeadamente em imunização passiva de animais e/ou humanos. A imunização passiva representa um método alternativo para o tratamento de infeções provocadas por agentes patogénicos, tais como vírus ou bactérias. Uma vez que nos últimos anos têm surgido cada vez mais casos de resistência bacteriana a antibióticos, encontrar métodos alternativos para o tratamento de infeções bacterianas é um ponto de extrema relevância para a sociedade atual. A proteção terapêutica utilizando imunoglobulina Y tem vindo a ser reportada com sucesso em vários estudos, encontrando-se duas patentes sobre a aplicação de IgY inibir a adesão da bactéria Helicobacter pylori à mucosa do estômago humano (K.R. Pat. No. 2002/0023521 e C.N. Pat. No. 103360491).

[0006] Em imunização passiva é usual recorrer a imunoglobulina G (IgG) , que é obtida a partir do soro de mamíferos (coelhos, cabras, ratos, ovelhas, etc.). No entanto, este processo é geralmente desagradável para os animais, uma vez que envolve repetidos passos de recolha de sangue, o que inclusivamente pode conduzir à morte do animal.

[0007] Outra vantagem em usar-se IgY, em vez dos anticorpos provenientes de mamíferos (IgG), prende-se com o facto de se poder obter uma elevada quantidade de anticorpos duma forma economicamente mais rentável, correspondendo a mais de 100 mg de IgY por gema de ovo de galinha. Para se obter a mesma quantidade de IgG são necessários cerca de 20 mL de sangue de um mamífero, o que equivale a metade da quantidade máxima que se pode colher por mês num animal de pequeno porte (p. ex. coelho).

[0008] O facto de as aves estarem afastadas filogeneticamente dos humanos trás vantagens adicionais relacionadas com a reatividade destes anticorpos, uma vez que o IgY, contrariamente ao IgG, não é responsável pela ativação do sistema complemento da nossa resposta imunitária, bem como não reconhece fatores reumatoides pois estes não reconhecem a região Fc do IgY, o que por sua vez minimiza uma resposta não específica e reatividade cruzada com o IgG intrínseco aos mamíferos, evitando-se assim falsos positivos em testes de imunodiagnóstico e a reações indesejáveis quando estes são utilizados em imunoterapia.

[0009] A purificação de IgY tem vindo a ser reportada nas últimas décadas por vários autores. Têm sido reportados métodos de precipitação que envolvem vários agentes de precipitação, tais como etanol, acetona, clorofórmio, polietileno glicol, gomas naturais e também sais (p.ex. sulfato de amónio, citrato de sódio, cloreto de sódio, etc.) (Polson, von Wechmar and van Reqenmortel, 1980; Hatta, Kim and Yamamoto, 1990; Akita and Nakai, 1993; Bizhanov and Vyshniauskis, 2000; Hodek et al., 2013).

[00010] Também existem patentes relativas à purificação de IgY a partir da gema de ovo. No documento de patente U.S. 5,367,054 descreve-se a utilização da combinação de um conjunto de métodos que incluem: etapas de precipitação dos lipidos da gema de ovo com ácido caprílico; cromatografias de troca iónica e de filtração em gel; processos de ultrafiltração; e precipitação de IgY utilizando sais, obtendo-se no final das várias combinações de processos uma fração de IgY com pelo menos 90% de pureza. Posteriormente, no documento de patente U.S. 2011/0015374A1 foi reportada a purificação de IgY através da diluição da gema do ovo com água e posterior purificação dos anticorpos usando-se uma coluna cromatográfica de troca iónica, seguida da sua concentração por um processo de filtração em membrana e consequente secagem, obtendo-se no final do processo IgY com um grau de pureza entre 40% e 98%. Nos documentos de patentes U.S. 2006/223986A1 e 2014/073766A1 refere-se o uso de agentes de precipitação, tais como sais (p.ex. sulfato de amónio), mas neste caso para efetuar a precipitação seletiva de um tipo de anticorpo de menores dimensões, o IgY delta Fc, somente existente em aves da ordem anseriformes. A purificação alternativa de proteínas, entre as quais anticorpos monoclonais, através de processos de precipitação foi também alvo de atenção por parte de várias indústrias, nomeadamente a Bristol-Myers Squibb Company que detém uma invenção onde se descreve o uso de citrato de sódio para precipitação de proteínas (U.S. 2010/0261886A1) , e a Amgen Inc. que possui uma patente que reivindica a precipitação de anticorpos monoclonais utilizando polietileno glicol (U.S. 2008/0214795A1).

[00011] As soluções conhecidas do estado da arte ilustram o problema técnico a resolver pela presente divulgação.

Descrição Geral

[00012] A presente divulgação diz respeito a um processo para purificar um anticorpo policlonal a partir de gema de ovo com grau de pureza elevado, através de vários passos, em particular através de passos de precipitação seletiva e ultrafiltração.

[00013] Os anticorpos aqui referidos (imunoglobulina Y) são obtidos a partir de uma fonte natural, renovável e de baixo custo, nomeadamente a gema do ovo de uma ave. Os ovos de aves, e em particular a gema de ovo, representam um meio alternativo de obtenção de anticorpos, que poderão ser utilizados em imunização passiva. Os agentes de precipitação utilizados ao longo de todo o processo são também considerados biocompativeis e de baixo custo.

[00014] A imunoglobulina Y é uma proteína, mais especificamente uma glicoproteína, com um peso molecular total de cerca de 180 kDa e é constituída por duas cadeias polipeptídicas idênticas e com dimensões de 67-70 kDa cada, e ligadas entre si por uma ponte dissulfureto, sendo que cada uma destas cadeias pesadas (Hc) está ligada também através de uma ponte dissulfureto a uma cadeia leve de dimensões de 25 kDa cada.

[00015] A presente divulgação diz respeito a um processo para purificar um anticorpo a partir de gema de ovo, em que o processo compreende os seguintes passos:

centrifugar a gema do ovo de modo a obter uma fração aquosa de proteínas solúveis (FPS);

submeter a fração aquosa de proteínas solúveis a pelo menos um passo de precipitação com um agente de precipitação;

ultrafiltrar a fração aquosa de proteínas solúveis submetida a pelo menos um passo de precipitação de modo a obter o anticorpo purificado, e remover o agente de precipitação.

[00016] Numa forma de realização, o referido processo pode compreender um passo prévio de congelar e descongelar a gema do ovo.

[00017] Numa forma de realização, o passo de submeter a fração aquosa de proteínas solúveis (FPS) a pelo menos um passo de precipitação com um agente de precipitação pode compreender um primeiro passo e a um segundo passo de precipitação com um agente de precipitação.

[00018] Numa forma de realização, o agente de precipitação pode ser selecionado da seguinte lista: polietilenoglicol, cloreto de sódio, citrato de sódio, sulfato de amónio, ou suas misturas, de preferência cloreto de sódio, de maior preferência citrato de sódio, ainda de maior preferência polietilenoglicol em que o referido polietilenoglicol tem um peso molecular entre 1000-10000 g/mol, de preferência 6000-10000 g/mol, ainda de maior preferência 6000 g/mol.

[00019] Numa forma de realização e par obter melhores resultados, o polietilenoglicol pode ter uma concentração entre 5-40% (m_Poiimero/V_Fps) , de preferência 8-30% (iTlpolímero/Vfps) , ainda de maior preferência 8,5-15% (mpolímero/VFPS)

[00020] Numa forma de realização, o primeiro passo de precipitação pode ser realizado com uma concentração de 8,5 % (mpoií_mero/VFPs) de polietilenoglicol.

[00021] Numa forma de realização, o segundo passo de precipitação pode ser realizado com uma concentração de 12 % (mpolímero/V igy ressuspendida após primeiro passo de precipitação) de polietilenoglicol.

[00022] Numa forma de realização, o passo de ultrafiltrar a fração aquosa de proteínas solúveis pode ser realizado com um filtro de poro entre 70-150 kDa, de preferência 100150 kDa, ainda de maior preferência 150 kDa.

[00023] Numa forma de realização, o referido processo pode compreender um passo prévio de conservar um ovo entre 1-12 semanas, de preferência 2-5 semanas, ainda de maior preferência 3 semanas, sendo que este passo pode ser realizado a uma temperatura entre 2-6 °C.

[00024] Numa forma de realização, o referido processo pode compreender um passo de separar a gema do ovo da clara do ovo, em que a albumina é removida da superfície da membrana vitelina do ovo antes que a referida membrana seja perfurada, de modo a obter apenas a gema do ovo.

[00025] Numa forma de realização, o processo pode compreender um passo prévio de diluir a gema de ovo 5-20 vezes com água, de preferência 6-10 vezes com água, ainda de maior preferência 7 vezes em água. Em particular, este passo prévio de diluir a gema é realizado com um pH entre 4-6, de preferência com um pH de 5.

[00026] Numa forma de realização, o passo de congelar a gema de ovo pode ser realizado a uma temperatura entre -200 °C, durante 8-24 horas.

[00027] Numa forma de realização, o passo de descongelar a gema do ovo pode ser realizado a uma temperatura entre 15-25 °C, durante 2-10 horas.

[00028] Numa forma de realização, o passo de centrifugar a gema do ovo descongelada de modo a obter uma fração aquosa solúvel pode ser realizado entre 2000-5000 g, uma temperatura entre 4-20 °C e durante 45-90 minutos, de preferência a 4 °C e durante 60 minutos.

[00029] Numa forma de realização, o anticorpo é IgY.

[00030] Numa forma de realização, a gema de ovo é preferencialmente gema de ovo de galinha (Gallus gallus domes ti cus} .

[00031] Esta divulgação também diz respeito a um anticorpo, em particular o IgY, em que o referido anticorpo é obtenível pelo processo aqui descrito.

Descrição das Figuras

[00032] Para uma mais fácil compreensão da presente divulgação juntam-se em anexo as figuras, as quais, representam realizações preferenciais que, contudo, não pretendem limitar o objeto da presente divulgação.

[00033] Figura 1: Diagrama esquemático das principais etapas do processo apresentado na presente divulgação.

[00034] Figura 2: Diagrama esquemático detalhado das etapas e condições preferenciais referentes ao processo de purificação da presente divulgação.

[00035] Figura 3: Reprodução de um gel obtido por electroforese em gel de poliacrilamida com dodecilsulfato de sódio (SDS-PAGE) e corado com azul de Coomassie (Coomassie Brilliant Blue) no qual estão representados os resultados obtidos após a realização do processo descrito na presente divulgação. As posições 1 a 3 correspondem a um gel efetuado em condições redutoras (na presença de ditiotreitol, DTT) e as posições 4 a 7 correspondem a um gel efetuado em condições não redutoras (na ausência de DTT). As posições 1 e 7 correspondem a padrões de peso molecular, sendo que o primeiro corresponde a Precision Plus Protein™ Dual Color Standards (Biorad) e o último a Full-Range Rainbow Molecular Weight Markers (Amersham ECL) . As posições 2 e 4 correspondem a um padrão de IgY purificado (HenBiotech), e as posições 3 e 5 correspondem ao IgY purificado usando o processo de precipitação seletiva com um dos polímeros descritos na presente divulgação, em particular polietilenoglicol com massa molecular de 6000 g/mol. A posição 6 corresponde à fração de proteínas solúveis. A quantidade de proteína colocada em cada um dos poços do gel foi uniformizada.

[00036] Figura 4: Reprodução de um gel obtido por SDSPAGE e corado com azul de Coomassie no qual estão representados os resultados obtidos para diferentes gemas de ovo após a realização do processo de precipitação do IgY com um dos polímeros descritos na presente divulgação, em particular polietilenoglicol com massa molecular de 6000 g/mol. O gel foi efetuado em condições redutoras (na presença de DTT). A posição 1 corresponde ao padrão de peso molecular, Precision Plus Protein™ Dual Color Standards (Biorad). As posições 2 a 4 correspondem a IgY purificada utilizando-se gemas de ovos com 8 semanas, posições 5 a 8 correspondem a IgY purificada utilizando-se gemas de ovos com 5 semanas, e as posições 9 e 10 correspondem a IgY purificada utilizando-se gemas de ovos com apenas 3 semanas. A quantidade de proteína colocada em cada um dos poços do gel foi uniformizada.

[00037] Figura 5: Avaliação de diferentes lotes de ovos após a realização do processo de precipitação da IgY com um dos polímeros descritos na presente divulgação, em particular polietilenoglicol com massa molecular de 6000 g/mol. Cromatogramas de diferentes amostras de IgY e avaliação do grau de pureza, determinado por cromatografia liquida de alta eficiência usando uma coluna de exclusão molecular (SEC-HPLC) Shodex Protein KW-802.5 (25 cm χ 2 mm i.d., 25 pm) , e o HPLC Chromaster HPLC (VWR, Hitachi) . Os ovos 1, 2 e 3 correspondem, respetivamente, a 3, 5 e 8 semanas após a sua coleta. A pureza foi calculada a partir da área dos picos dos cromatogramas e usando o controlo 1 como IgY padrão, tal como é possível observar na Tabela 1.

Tabela 1

Amostra	Pureza %
IgY_controlol	100
IgY_controlo2	84.4
IgY_ovol	98.2
IgY_ovo2	97.0
IgY_ovo3	92.4

Descrição Detalhada

[00038] A presente divulgação descreve um processo de obtenção e purificação de anticorpos, nomeadamente imunoglobulina Y (IgY), a partir da gema de ovo. Os anticorpos aqui referidos são funcionalmente equivalentes à imunoglobulina G presente nos mamíferos.

[00039] As Figuras 1 e 2 ilustram realizações preferenciais do processo aqui divulgado para purificar a IgY a partir da gema do ovo de galinha, sendo que o referido processo pode compreender várias etapas, entre as quais:

separar a gema da clara do ovo. Este passo poderá ser realizado de modo a que toda a porção de albumina (também designada de clara) seja removida da superfície da membrana vitelina do ovo antes que esta seja perfurada para extrair a gema;

diluir a gema obtida com água destilada, em particular entre 6-10 vezes o volume inicial da gema e consequente homogeneizar a mistura e ajustar o seu pH, em particular para valores entre 4-8, de preferência pH=5;

a mistura obtida pode ser sujeita a temperaturas baixas (0 a -20 °C) durante um período de 8-24 horas e desta forma é possível optimizar a remoção da fração lipídica;

o processo de descongelamento da mistura pode ser efetuado à temperatura ambiente, em particular a temperaturas entre 15-25 °C durante 2-10 horas;

a mistura descongelada pode ser submetida a um processo de centrifugação com velocidades de rotação compreendidas entre 2000-5000 g, a uma temperatura de 4-20 °C e durante 45-90 minutos;

após centrifugação, são obtidas duas frações, nomeadamente uma fração sólida insolúvel (lipidos) e uma fração aquosa límpida, sendo esta última constituída pelas proteínas solúveis da gema;

esta fração de proteínas solúveis (FPS) pode ser filtrada de modo a remover pequenas partículas sólidas em suspensão;

a FPS é depois sujeita a etapas de precipitação seletiva com agentes de precipitação adequados que podem incluir, mas não exclusivamente, polímeros, tais como polietileno glicol, e/ou sais, tais como citrato de sódio, cloreto de sódio, etc., de preferência cloreto de sódio, de maior preferência citrato de sódio, ainda de maior preferência polietileno glicol;

o precipitado final obtido corresponde a IgY parcialmente purificado, em particular com uma pureza acima de 90%, que pode ser ressuspendido num volume adequado de uma solução aquosa tampão;

aplicar uma etapa final de ultrafiltração que permite obter IgY com um grau de pureza entre 98-100%, permitindo simultaneamente a eliminação do(s) agente(s) de precipitação utilizado(s).

[00040] Numa forma de realização, e para se obter uma maior quantidade de IgY no final deste método os ovos podem ser conservados, após a colheita de ovos de galinhas imunizadas, entre 2-4 semanas após serem colhidos, preferencialmente 3 semanas (Figura 4) , a uma temperatura de 2-6 °C, sendo que as gemas podem apresentar cerca de 15 mL de volume total. A vantagem de conservar os ovos, durante algumas semanas antes de se iniciar o processo, está relacionada com uma separação entre a gema e a albumina mais eficiente.

[00041] Desta forma, com o processo agora divulgado é possível obter-se um precipitado de IgY a partir da gema do ovo com elevada pureza, apresentando o mesmo grau de pureza dos mesmos anticorpos purificados através de processos cromatográficos comummente utilizados (Figura 3) . O processo proposto não requer a utilização de métodos cromatográficos dispendiosos, os agentes de precipitação utilizados são biocompativeis e de baixo custo e removidos por um passo de ultrafiltração que possibilita simultaneamente melhor o grau de pureza do anticorpo purificado.

[00042] Assim, o processo aqui descrito permite purificar IgY com uma pureza acima dos 90%, preferencialmente acima dos 98%, sendo que os componentes correspondentes a impurezas são outras proteínas presentes na gema do ovo. O rendimento global do processo está avaliado entre os 60% e 90%, preferencialmente acima dos 85%, sendo que por cada gema de ovo é possível obter-se cerca de 100 a 120 mg de IgY.

[00043] O processo descrito na presente divulgação compreende várias etapas (Figuras 1 e 2) , nomeadamente a separação da gema e consequente diluição com água e ajuste do pH, seguido pelo congelamento e descongelamento da mistura de modo a precipitar a fração de sólidos lipidica que é removida através de um passo de centrifugação, obtendo-se assim a fração de proteínas solúveis (FPS) que é posteriormente submetida a etapas de precipitação seletiva do IgY.

[00044] Numa forma de realização, o precipitado obtido com o processo agora divulgado, é compreendido maioritariamente pelo anticorpo desejado, com um grau de pureza superior a 90%, e é ressuspendido numa solução aquosa de um sal tampão adequado, como por exemplo numa solução aquosa de tampão fosfato-salino, em particular NaCl 137 mM, fosfato de potássio 10 mM, KC1 2,7 mM, pH de 7,4.

[00045] Numa forma de realização e para obter ainda melhores resultados, pode-se aplicar uma etapa final de purificação e concentração aplicando um passo de ultrafiltração, permitindo obter IgY com um grau de pureza entre 98-100%, e removendo simultaneamente o agente precipitante.

[00046] Numa forma de realização, o passo de separara gema da clara do ovo necessita de ser realizada com cautela, de modo a que toda a porção de albumina (ou clara) seja removida da superfície da membrana vitelina do ovo antes que esta seja perfurada, para a obtenção exclusiva da gema do ovo.

[00047] Numa forma de realização, após a perfuração da membrana vitelina, o liquido incluso nesta é vertido para um recipiente de vidro graduado (p.ex. proveta graduada) permitindo o registo do seu volume. Posteriormente, pode proceder-se à diluição da gema obtida com água destilada, entre 6-10 vezes o volume inicial desta, preferencialmente diluindo-se com 7 vezes o seu volume. A vantagem de diluir a gema obtida entre 6-10 vezes está relacionada com eficácia de remoção da fração de lipidos, uma vez que se verificou que diluir menos de 6 vezes provocava uma solução turva após a centrifugação e que diluir mais do que 10 vezes provocava um menor rendimento e pureza da IgY nos subsequentes passos de purificação.

[00048] Numa forma de realização, e de seguida, a mistura pode ser homogeneizada durante cerca de 5 minutos à temperatura ambiente, em particular com temperaturas entre 15-25 °C, e pode-se realizar o ajuste do seu pH, com uma solução de HC1 a 1M, para valores compreendidos entre 4-8, de preferência 5. A razão pela qual o pH é ajustado entre 4-8 deve-se à falta de estabilidade da IgY fora desta gama.

[00049] Numa forma de realização, o homogeneizado obtido pode ser submetido a um processo de congelamento, com temperaturas de 0 a -20 °C, durante um período de 8 - 24 horas, preferencialmente 12 horas. O processo de descongelamento da mistura pode ser efetuado à temperatura ambiente, em particular a uma temperatura entre 15 e 25 °C, durante 2 a 10 horas, até a mistura estar uniformemente descongelada. As vantagens de congelar e descongelar a mistura são as seguintes: o processo de congelamento leva a uma maior agregação de grânulos, e assim, a fração de lipidos pode ser eficazmente removida após o descongelamento e subsequente centrifugação.

[00050] Numa forma de realização, a mistura uniformemente descongelada pode ser então submetida a um processo de centrifugação com velocidades de rotação compreendidas entre 2000-5000 g, a uma temperatura de 4-20 °C e durante 45-90 minutos, mais preferencialmente a 4696 g, 4 °C e durante 60 minutos. Após a etapa de centrifugação, são obtidas duas frações: (i) uma fração sólida e amarelada que é descartada e que constitui a porção insolúvel (lipidos) da gema do ovo; e (ii) uma fração aquosa límpida, constituída pelas proteínas da gema que são solúveis em água que corresponde à fração de proteínas solúveis (FPS) da gema de ovo. Esta fração pode ser filtrada com um papel de filtro de modo a remover pequenas partículas sólidas e insolúveis que ainda se encontram em suspensão.

[00051] Numa forma de realização, o passo seguinte do processo descrito na presente divulgação pode compreender a precipitação seletiva do IgY a partir da FPS preparada anteriormente, de modo a obter-se um precipitado de IgY parcialmente purificado, com uma pureza acima de 90%, preferencialmente entre os 95-98% (Figura 3) . Neste passo utilizam-se vários agentes de precipitação, sendo que estes podem incluir, mas não exclusivamente, o polímero polietileno glicol, e/ou sais como sulfato de amónio, citrato de sódio, cloreto de sódio, entre outros.

[00052] Numa forma de realização, podem ser implementados um ou dois passos de precipitação sequenciais, sendo que as concentrações do agente precipitante selecionado podem encontrar-se entre 5-40% (m_agente de precipitação/V_Fps) , de preferência 30% (m_agente de precipitação/V_FPS) , ainda de maior preferência 8,5% (m_agente de precipitação/V_Fps) .

[00053] Numa forma de realização, após homogeneização da solução com o agente precipitante escolhido, a mistura é submetida a um processo de centrifugação com velocidades de rotação compreendidas entre 2000-5000 g, a uma temperatura de 4-20 °C e durante 45-90 minutos, preferencialmente a 4696 g, 4 °C e durante 60 minutos.

[00054] Numa forma de realização, e no caso de serem utilizados sais como agentes de precipitação, apenas uma etapa de precipitação poderá ser suficiente para se obter um grau de pureza acima dos 85%, sendo que neste caso concentrações acima dos 30% (m/V) de sais como agentes de precipitação podem ser selecionadas.

[00055] Numa forma de realização, e preferencialmente, para ser obtida uma melhor pureza, acima dos 95%, pode ser utilizado o polietileno glicol (PEG) como agente de precipitação, sendo que o peso molecular do PEG pode estar compreendido entre 1000-10000 g/mol, de preferência 600010000 g/mol, preferencialmente 6000 g/mol.

[00056] Numa forma de realização, podem ser implementadas duas etapas sequenciais de precipitação com PEG. A concentração de PEG na primeira etapa pode estar compreendida entre 8-10% (m/V), preferencialmente 8,5% (m/V) . Após a obtenção de um primeiro precipitado este é ressuspendido num volume de solução aquosa de tampão adequado, como por exemplo, mas não exclusivamente, o tampão fosfato a 10 mM e pH 7,4, de modo a realizar-se uma segunda precipitação com PEG. Nesta segunda etapa de precipitação, a concentração do PEG deverá estar compreendida entre 10-15% (m/V), preferencialmente 12% (m/V) . O precipitado final obtido é o IgY parcialmente purificado, que apresenta uma pureza acima de 90%, preferencialmente com pureza entre os 95-98%. Por cada 10 mL de EPS utilizada para se efetuar esta etapa de precipitação com PEG é possível obter-se cerca de 10 mg de IgY.

[00057] Numa forma de realização, o processo pode compreender ainda uma etapa de ultrafiltração. O precipitado de IgY obtido anteriormente é ressupendido num volume adequado de uma solução tampão à escolha, em particular tampão fosfato a 10 mM e pH 7,4. Seguidamente é então implementada uma etapa de ultrafiltração realizada com um filtro de poro entre 70-150 kDa, de preferência 100150 kDa, ainda de maior preferência 150 kDa de modo a removerem-se da solução quantidades remanescentes do agente precipitante usado (PEG) e de algumas proteínas de baixo peso molecular ainda presentes e assim, obter-se um concentrado final de IgY com uma pureza entre 98-100%.

[00058] No final deste processo de purificação, a quantidade de IgY obtido e a sua pureza podem ser determinados por métodos analíticos convencionais e comummente utilizados para este fim, que incluem, mas não exclusivamente: eletroforese em gel de poliacrilamida com dodecilsulfato de sódio (SDS-PAGE) e cromatografia líquida de alta eficiência com uma coluna de exclusão molecular (SEC-HPLC).

[00059] Ainda que na presente divulgação se tenham somente representado e descrito realizações particulares da mesma, o perito na matéria saberá introduzir modificações e substituir umas caracteristicas técnicas por outras equivalentes, dependendo dos requisitos de cada situação, sem sair do âmbito de proteção definido pelas reivindicações anexas. As realizações apresentadas são combináveis entre si. As seguintes reivindicações definem adicionalmente realizações.

Referências

Akita and Nakai (1993) 'Comparison of four purification methods for the production of immunoglobulins from eggs laid by hens immunized with an enterotoxogenic E. coli strain', Journal of Immunological Methods, 160(2), 207-214.

Bizhanov and Vyshniauskis (2000) Ά Comparison of Three Methods for Extracting IgY from the Egg Yolk of Hens Immunized with Sendai Virus', Veterinary Research Communications, 24(2), 103-113.

Hatta et al. (1990) Ά Novel Isolation Method for Hen Egg

Yolk Antibody, IgY', Agric. Biol. Chem. , 54(10), 2531

2535.

Hodek et al. (2013) 'Optimized Protocol of Chicken Antibody (IgY) Purification Providing Electrophoretically Homogenous

Preparations', International Journal of Electrochemical

Science, 8, 113-124.

Polson et al. (1980) 'Isolation of virai IgY Antibodies from Yolks of Immunized Hens', Immunological Communications, 9(5), 475-493.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Processo para purificar um anticorpo IgY a partir de gema de ovo, em que o processo compreende a seguinte sequência especifica de passos:

diluir a gema do ovo 5-20 vezes com água, em que o referido passo de diluição da gema do ovo é realizado a pH entre 4-5;

congelar e descongelar a gema do ovo, em que o passo de congelar a gema de ovo é realizado a uma temperatura entre -20-0 °C entre 8-24 horas; em que o passo de descongelar a gema do ovo é realizado entre 2-10 horas a uma temperatura entre 15-25 °C;

centrifugar a gema do ovo de modo a obter uma fração aquosa de proteínas solúveis (FPS), em que o passo de centrifugar a gema do ovo descongelada de modo a obter uma fração aquosa solúvel é realizado entre 2000-5000 g, a uma temperatura entre 4-20 °C e durante 45-90 minutos, de preferência a 4 °C e durante 60 minutos; submeter a fração aquosa de proteínas solúveis a pelo menos um processo de precipitação com um agente de precipitação ;

ultrafiltrar a fração aquosa de proteínas solúveis submetida a pelo menos um passo de precipitação de modo a obter o anticorpo purificado, removendo o agente de precipitação ;

em que o passo de submeter a fração aquosa de proteínas solúveis a pelo menos um processo de precipitação com um agente de precipitação compreende um primeiro passo e um segundo passo de precipitação com um agente de precipitação, em que o precipitado obtido no primeiro passo é ressuspendido;

em que o agente de precipitação é polietilenoglicol, citrato de sódio, ou suas misturas;

em que o peso molecular de polietilenoglicol varia entre 6000-10000 g/mol;

em que o primeiro passo de precipitação é realizado com uma concentração de 8,5% (m_poiímero/VFPs) de polietilenoglicol;

em que o segundo passo de precipitação é realizado com uma concentração de 12r (mpoiimero/VigY ressuspendida após primeiro passo de precipitação) de polietilenoglicol;

em que o passo de ultrafiltrar a fração aquosa de proteínas solúveis é realizado com um filtro de poro entre 70-150 kDa.
2. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o passo de ultrafiltrar a fração aquosa de proteínas solúveis é realizado com um filtro de poro entre 100-150 kDa, de preferência 150 kDa.
3. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, que compreende adicionalmente um passo prévio de conservar o ovo entre 1-12 semanas, de preferência 2-5 semanas, ainda de maior preferência 3 semanas.
4. Processo de acordo com a reivindicação anterior, em que o referido passo é realizado a uma temperatura entre 26 °C.
5. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, que compreende adicionalmente um passo de separar a gema do ovo da clara do ovo, em que a albumina é removida da superfície da membrana vitelina do ovo antes que a referida membrana seja perfurada.
6. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a gema do ovo é diluída 6-10 vezes com água, de preferência 7 vezes em água.
7 . Processo de acordo com a reivindicação anterior, em que o referido passo de diluição da gema de ovo é realizado a pH 5.