JP2602850B2 - 単結晶作製方法 - Google Patents
単結晶作製方法Info
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- JP2602850B2 JP2602850B2 JP62269411A JP26941187A JP2602850B2 JP 2602850 B2 JP2602850 B2 JP 2602850B2 JP 62269411 A JP62269411 A JP 62269411A JP 26941187 A JP26941187 A JP 26941187A JP 2602850 B2 JP2602850 B2 JP 2602850B2
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- biopolymer
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- single crystal
- crystallization
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C30—CRYSTAL GROWTH
- C30B—SINGLE-CRYSTAL GROWTH; UNIDIRECTIONAL SOLIDIFICATION OF EUTECTIC MATERIAL OR UNIDIRECTIONAL DEMIXING OF EUTECTOID MATERIAL; REFINING BY ZONE-MELTING OF MATERIAL; PRODUCTION OF A HOMOGENEOUS POLYCRYSTALLINE MATERIAL WITH DEFINED STRUCTURE; SINGLE CRYSTALS OR HOMOGENEOUS POLYCRYSTALLINE MATERIAL WITH DEFINED STRUCTURE; AFTER-TREATMENT OF SINGLE CRYSTALS OR A HOMOGENEOUS POLYCRYSTALLINE MATERIAL WITH DEFINED STRUCTURE; APPARATUS THEREFOR
- C30B7/00—Single-crystal growth from solutions using solvents which are liquid at normal temperature, e.g. aqueous solutions
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- Chemical & Material Sciences (AREA)
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- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Materials Engineering (AREA)
- Metallurgy (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Crystals, And After-Treatments Of Crystals (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 〔概 要〕 生体高分子の単結晶を作製する方法に関し、生体高分
子の最適結晶化条件を少量の試料を用いて、容易かつ効
率的に見出すことを可能にするために、 生体高分子の単結晶を溶液波長により作製するに当
り、生体高分子溶液の結晶化条件を左右する因子の１つ
を連続的に変化させ、次いでこれを分画して、それぞれ
の画分を個別に結晶化させることにより構成する。
子の最適結晶化条件を少量の試料を用いて、容易かつ効
率的に見出すことを可能にするために、 生体高分子の単結晶を溶液波長により作製するに当
り、生体高分子溶液の結晶化条件を左右する因子の１つ
を連続的に変化させ、次いでこれを分画して、それぞれ
の画分を個別に結晶化させることにより構成する。
本発明は、生体高分子の単結晶作製方法に関し、さら
に詳しく述べるならば、生体高分子の単結晶を溶液波長
により作製する方法に関する。
に詳しく述べるならば、生体高分子の単結晶を溶液波長
により作製する方法に関する。
タンパク質などの生体高分子について、溶液成長によ
り単結晶を作製することは、タンパク質工学やドラッグ
デザイン等への応用上、重要な技術である。
り単結晶を作製することは、タンパク質工学やドラッグ
デザイン等への応用上、重要な技術である。
結晶化にあたっては、結晶させるべき生体高分子物質
の水溶液に硫酸アンモニウム、メチルペンタンジオー
ル、ポリエチレングリコールなどの水溶液を添加し、高
分子を沈澱させて放置することにより、溶液成長法によ
って結晶核生成と結晶成長を行わせている。そして、従
来より、生体高分子を沈澱させる方法として種々の方法
が公知である（生化学実験講座第１巻III、６〜17頁、
東京化学同人（出版）、1976）。
の水溶液に硫酸アンモニウム、メチルペンタンジオー
ル、ポリエチレングリコールなどの水溶液を添加し、高
分子を沈澱させて放置することにより、溶液成長法によ
って結晶核生成と結晶成長を行わせている。そして、従
来より、生体高分子を沈澱させる方法として種々の方法
が公知である（生化学実験講座第１巻III、６〜17頁、
東京化学同人（出版）、1976）。
しかし、結晶化条件の設定が微妙であるため、最適条
件を見出すために、並行して複数の条件において結晶化
を行うことが多い。通常、この作業は、人手によってお
り、再現性の確保が困難であるため、我々は自動化され
た装置を提案した（特開昭62−106000）。しかしなが
ら、多くの結晶化条件に１つ１つ対応させて溶液の流路
をバルブで切り換えていくこの提案の方式においては、
配管系のデッドボリュームが大きくなり、貴重な試料タ
ンパク質が無駄になるために、この点で改善が望まれ
る。
件を見出すために、並行して複数の条件において結晶化
を行うことが多い。通常、この作業は、人手によってお
り、再現性の確保が困難であるため、我々は自動化され
た装置を提案した（特開昭62−106000）。しかしなが
ら、多くの結晶化条件に１つ１つ対応させて溶液の流路
をバルブで切り換えていくこの提案の方式においては、
配管系のデッドボリュームが大きくなり、貴重な試料タ
ンパク質が無駄になるために、この点で改善が望まれ
る。
しかして、本発明は、生体高分子の単結晶を溶液波長
により作製するに当り、生体高分子の最適結晶化条件を
少量の試料を用いて、容易かつ効率的に見出すことを可
能にする方法を提供しようとするものである。
により作製するに当り、生体高分子の最適結晶化条件を
少量の試料を用いて、容易かつ効率的に見出すことを可
能にする方法を提供しようとするものである。
本発明によれば、生体高分子の単結晶を溶液成長によ
り作製するに当り、生体高分子溶液の結晶化条件を左右
する因子の１つを連続的に変化させ、次いでこれを分画
して、それぞれの画分を個別に結晶化させることを特徴
とする方法が提供される。
り作製するに当り、生体高分子溶液の結晶化条件を左右
する因子の１つを連続的に変化させ、次いでこれを分画
して、それぞれの画分を個別に結晶化させることを特徴
とする方法が提供される。
本発明では、従来の方法のように結晶化条件の１つ１
つに対応して溶液を混合し、移送するのではなく、一連
の条件の変化を連続的に作りだしてこれを分割し、それ
ぞれが独立した結晶化条件となるようにするものであ
る。
つに対応して溶液を混合し、移送するのではなく、一連
の条件の変化を連続的に作りだしてこれを分割し、それ
ぞれが独立した結晶化条件となるようにするものであ
る。
具体的には、例えば、タンパク質を沈澱させる硫酸ア
ンモニウムの濃度を徐々に変化させて濃度勾配を形成さ
せ、１滴づつ分取して蒸気拡散法による結晶化を行わせ
るなどするものである。
ンモニウムの濃度を徐々に変化させて濃度勾配を形成さ
せ、１滴づつ分取して蒸気拡散法による結晶化を行わせ
るなどするものである。
濃度勾配を形成させるべき結晶化条件の因子として
は、先に挙げた硫酸アンモニウム以外の沈澱剤もしくは
結晶化剤、例えば、硫酸マグネシウム、硫酸ナトリウ
ム、燐酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化セシウム、
メチルペンタンジオール、ポリエチレングリコール、エ
タノール、メタノール、アセトンなどや、タンパク質濃
度、pH（水素イオン濃度）、共存することにより結晶の
秩序性を高める物質、例えば、硫酸ナトリウム、塩化セ
シウム、塩化アルミニウムなどの無機塩類や酵素反応阻
害物質などのようにタンパク質と特異的に結合する物質
などの濃度などが利用できる。
は、先に挙げた硫酸アンモニウム以外の沈澱剤もしくは
結晶化剤、例えば、硫酸マグネシウム、硫酸ナトリウ
ム、燐酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化セシウム、
メチルペンタンジオール、ポリエチレングリコール、エ
タノール、メタノール、アセトンなどや、タンパク質濃
度、pH（水素イオン濃度）、共存することにより結晶の
秩序性を高める物質、例えば、硫酸ナトリウム、塩化セ
シウム、塩化アルミニウムなどの無機塩類や酵素反応阻
害物質などのようにタンパク質と特異的に結合する物質
などの濃度などが利用できる。
また、分取し、結晶化を行う方法として、小容量のネ
ジ口瓶に分取して密栓し、静置バッチ法により結晶化さ
せる方法（第１図）や、小ガラス板に液滴を受け、蒸気
拡散法で結晶化させる方法（第４図）などが挙げられ
る。
ジ口瓶に分取して密栓し、静置バッチ法により結晶化さ
せる方法（第１図）や、小ガラス板に液滴を受け、蒸気
拡散法で結晶化させる方法（第４図）などが挙げられ
る。
本発明の方法を実施するための装置の構成例を第１図
に示す。本例では、硫安液（１）（80％飽和硫酸アンモ
ニウム、10mMリン酸ナトリウム緩衝液pH7.0）と、硫安
液（２）（95％飽和硫酸アンモニウム、10mMリン酸ナト
リウム緩衝液pH7.0）を、通常の高速液体クロマトグラ
フィー用濃度勾配作製システム（３）にかけ、総液量3.
34mlの83％飽和〜95％飽和の直線的濃度勾配を作った。
別に作ったタンパク質溶液（４）（３％マッコウクジラ
ミオグロビン、50％硫酸アンモニウム、10mMリン酸ナト
リウム緩衝液pH7.0）と上記濃度勾配液とを１対２の体
積比で混合するように２つのポンプ（５），（６）の送
液量をそれぞれ0.5ml/分と1.0ml/分に設定した。これに
より、最終的な溶液の組成は１％ミオグロビン、10mMリ
ン酸ナトリウム緩衝液pH7.0を含み、硫酸アンモニウム
濃度が70〜80％に直線的に変化する濃度勾配が形成され
た（第２図）。これを液体クロマトグラフィー用のフラ
クションコレクタ（７）にかけ、0.5ml毎に容量1mlのマ
イクロバイアル瓶に受け、直ちに密栓をし20℃の恒温槽
内に保存した。この操作により各バイアル瓶にはそれぞ
れ70.5,71.5,72.5,73.5,74.5,75.5,76.5,77.5,78.5およ
び79.5％飽和硫酸アンモニウムを含みミオグロビン溶液
が形成された。１日後には結晶ができはじめ、約７日間
にわたってゆっくりと成長した。生成した結晶数は75.5
％飽和時に最も多く（第３図）、本実施例では同濃度が
結晶化に最適であったことを示している。
に示す。本例では、硫安液（１）（80％飽和硫酸アンモ
ニウム、10mMリン酸ナトリウム緩衝液pH7.0）と、硫安
液（２）（95％飽和硫酸アンモニウム、10mMリン酸ナト
リウム緩衝液pH7.0）を、通常の高速液体クロマトグラ
フィー用濃度勾配作製システム（３）にかけ、総液量3.
34mlの83％飽和〜95％飽和の直線的濃度勾配を作った。
別に作ったタンパク質溶液（４）（３％マッコウクジラ
ミオグロビン、50％硫酸アンモニウム、10mMリン酸ナト
リウム緩衝液pH7.0）と上記濃度勾配液とを１対２の体
積比で混合するように２つのポンプ（５），（６）の送
液量をそれぞれ0.5ml/分と1.0ml/分に設定した。これに
より、最終的な溶液の組成は１％ミオグロビン、10mMリ
ン酸ナトリウム緩衝液pH7.0を含み、硫酸アンモニウム
濃度が70〜80％に直線的に変化する濃度勾配が形成され
た（第２図）。これを液体クロマトグラフィー用のフラ
クションコレクタ（７）にかけ、0.5ml毎に容量1mlのマ
イクロバイアル瓶に受け、直ちに密栓をし20℃の恒温槽
内に保存した。この操作により各バイアル瓶にはそれぞ
れ70.5,71.5,72.5,73.5,74.5,75.5,76.5,77.5,78.5およ
び79.5％飽和硫酸アンモニウムを含みミオグロビン溶液
が形成された。１日後には結晶ができはじめ、約７日間
にわたってゆっくりと成長した。生成した結晶数は75.5
％飽和時に最も多く（第３図）、本実施例では同濃度が
結晶化に最適であったことを示している。
本発明の方法を実施するための他の装置の構成例を第
４図に示す。本例では、タンパク質溶液（８）（３％マ
ッコウクジラミオグロビン、60％飽和硫酸アンモニウ
ム、10mMリン酸ナトリウム緩衝液pH7.0）と、タンパク
質溶液（９）（0.75％マッコウクジラミオグロビン、60
％飽和硫酸アンモニウム、10mMリン酸ナトリウム緩衝液
pH7.0）を、アクリル樹脂製の勾配作製器（10）（サン
コープラスチック社など）によって、総液量2mlの濃度
勾配を作った。別に作った硫酸アンモニウム溶液（11）
（80％硫酸アンモニウム、10mMリン酸ナトリウム緩衝液
pH7.0）と上記濃度勾配液とを１対２の体積比で混合す
るように２つのペリスタルティックポンプ（12），（1
3）の送液量をそれぞれ0.3ml/分と0.6ml/分に設定し
た。これにより、最終的な溶液の組成は70％硫酸アンモ
ニウム、10mMリン酸ナトリウム緩衝液pH7.0を含み、ミ
オグロビン濃度が0.5〜２％で変化する濃度勾配が形成
された。これを0.1ml毎にガラス板（14）上に受け、蒸
気拡散法によって20℃で結晶化させた。３日後には結晶
ができはじめ、約２週間にわたってゆっくりと成長し
た。生成した結晶数は1.5％ミオグロビン条件で最も多
く、本実施例では同濃度が結晶化に最適であったことを
示している。
４図に示す。本例では、タンパク質溶液（８）（３％マ
ッコウクジラミオグロビン、60％飽和硫酸アンモニウ
ム、10mMリン酸ナトリウム緩衝液pH7.0）と、タンパク
質溶液（９）（0.75％マッコウクジラミオグロビン、60
％飽和硫酸アンモニウム、10mMリン酸ナトリウム緩衝液
pH7.0）を、アクリル樹脂製の勾配作製器（10）（サン
コープラスチック社など）によって、総液量2mlの濃度
勾配を作った。別に作った硫酸アンモニウム溶液（11）
（80％硫酸アンモニウム、10mMリン酸ナトリウム緩衝液
pH7.0）と上記濃度勾配液とを１対２の体積比で混合す
るように２つのペリスタルティックポンプ（12），（1
3）の送液量をそれぞれ0.3ml/分と0.6ml/分に設定し
た。これにより、最終的な溶液の組成は70％硫酸アンモ
ニウム、10mMリン酸ナトリウム緩衝液pH7.0を含み、ミ
オグロビン濃度が0.5〜２％で変化する濃度勾配が形成
された。これを0.1ml毎にガラス板（14）上に受け、蒸
気拡散法によって20℃で結晶化させた。３日後には結晶
ができはじめ、約２週間にわたってゆっくりと成長し
た。生成した結晶数は1.5％ミオグロビン条件で最も多
く、本実施例では同濃度が結晶化に最適であったことを
示している。
本発明によれば、連続的に変化する複数の結晶化条件
を作り出し、これによって最適結晶化条件を容易かつ効
率的に見出すことができるので、無駄に使われる貴重な
タンパク質試料を大幅に節約することができ、また非熟
練者が簡便に作業を行えるなどの効果がある。
を作り出し、これによって最適結晶化条件を容易かつ効
率的に見出すことができるので、無駄に使われる貴重な
タンパク質試料を大幅に節約することができ、また非熟
練者が簡便に作業を行えるなどの効果がある。
第１図は本発明の方法を実施するための装置の第１の実
施例を示す模式図、第２図および第３図はそれぞれ実施
例で得られた硫安濃度勾配と作製された結晶数を示すグ
ラフ、第４図は本発明方法を実施するための装置の第２
の実施例を示す模式図である。 1,2,11……硫安液、 3,10……濃度勾配作製装置、 4,8,9……タンパク質溶液、 5,6,12,13……ポンプ、 ７……フラクションコレクタ、 14……ガラス板。
施例を示す模式図、第２図および第３図はそれぞれ実施
例で得られた硫安濃度勾配と作製された結晶数を示すグ
ラフ、第４図は本発明方法を実施するための装置の第２
の実施例を示す模式図である。 1,2,11……硫安液、 3,10……濃度勾配作製装置、 4,8,9……タンパク質溶液、 5,6,12,13……ポンプ、 ７……フラクションコレクタ、 14……ガラス板。
Claims (10)
- 【請求項１】生体高分子の単結晶を溶液波長により作製
するに当り、生体高分子溶液の結晶化条件を左右する因
子の１つを連続的に変化させ、次いでこれを分画して、
それぞれの画分を個別に結晶化させることを特徴とする
単結晶作製方法。 - 【請求項２】前記因子が前記生体高分子を沈澱させるた
めに前記溶液に添加される結晶化剤の濃度である、特許
請求の範囲第１項記載の方法。 - 【請求項３】結晶化剤が硫酸アンモニウム、硫酸マグネ
シウム、硫酸ナトリウム、燐酸ナトリウム、塩化ナトリ
ウムまたは塩化セシウムである、特許請求の範囲第２項
記載の方法。 - 【請求項４】結晶化剤がメチルペンタンジオール、エタ
ノール、メタノールまたはアセトンである、特許請求の
範囲第２項記載の方法。 - 【請求項５】結晶化剤がポリエチレングリコールであ
る、特許請求の範囲第２項記載の方法。 - 【請求項６】前記因子が前記生体高分子の濃度である、
特許請求の範囲第１項記載の方法。 - 【請求項７】前記因子が前記生体高分子の秩序性を改良
するために添加される添加物の濃度である、特許請求の
範囲第１項記載の方法。 - 【請求項８】添加物が無機塩類である、特許請求の範囲
第７項記載の方法。 - 【請求項９】添加物が前記生体高分子に特異的に結合す
る配位子である、特許請求の範囲第７項記載の方法。 - 【請求項１０】前記因子が前記溶液の水素イオン濃度で
ある、特許請求の範囲第１項記載の方法。
Priority Applications (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62269411A JP2602850B2 (ja) | 1987-10-27 | 1987-10-27 | 単結晶作製方法 |
| DE88310097T DE3882011T2 (de) | 1987-10-27 | 1988-10-27 | Verfahren und Vorrichtung zur Herstellung von Biopolymer-Einkristall. |
| EP88310097A EP0314469B1 (en) | 1987-10-27 | 1988-10-27 | Process and apparatus for preparation of single crystal of biopolymer |
| US07/263,242 US4990216A (en) | 1987-10-27 | 1988-10-27 | Process and apparatus for preparation of single crystal of biopolymer |
| US07/605,352 US5126115A (en) | 1987-10-27 | 1990-10-30 | Process and apparatus for preparation of single crystal of biopolymer |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62269411A JP2602850B2 (ja) | 1987-10-27 | 1987-10-27 | 単結晶作製方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH01111798A JPH01111798A (ja) | 1989-04-28 |
| JP2602850B2 true JP2602850B2 (ja) | 1997-04-23 |
Family
ID=17472040
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62269411A Expired - Lifetime JP2602850B2 (ja) | 1987-10-27 | 1987-10-27 | 単結晶作製方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2602850B2 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP3094880B2 (ja) * | 1995-03-01 | 2000-10-03 | 住友金属工業株式会社 | 有機化合物の結晶化制御方法およびそれに用いる結晶化制御用固体素子 |
| DE60237841D1 (de) | 2001-11-13 | 2010-11-11 | Genentech Inc | Zusammensetzungen basierend auf APO2-Ligand/ TRAIL und ihre Verwendung |
-
1987
- 1987-10-27 JP JP62269411A patent/JP2602850B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH01111798A (ja) | 1989-04-28 |
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