DE3882011T2

DE3882011T2 - Verfahren und Vorrichtung zur Herstellung von Biopolymer-Einkristall.

Info

Publication number: DE3882011T2
Application number: DE88310097T
Authority: DE
Inventors: Koji Asano; Shozo Fujita; Takafumi Hashitani
Original assignee: Fujitsu Ltd
Current assignee: Fujitsu Ltd
Priority date: 1987-10-27
Filing date: 1988-10-27
Publication date: 1993-09-30
Anticipated expiration: 2008-10-28
Also published as: US5126115A; EP0314469A3; EP0314469A2; US4990216A; EP0314469B1; DE3882011D1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein verfahren und eine Vorrichtung zur Herstellung eines Einzelkristalls eines Biopolyiners. Die vorliegende Erfindung betrifft insbesondere ein Verfahren und eine Vorrichtung zum Herstellen eines Einzelkristalls aus einem Biopolymer durch Züchtung aus einer Lösung.
Die Herstellung eines Einzelkristalls eines Biopolymers, wie eines proteins, durch Züchtung aus einer Lösung ist eine wichtige Technik, die beim Verarbeiten von Proteinen oder bei der Gestaltung von Arzneimitteln angewendet wird.
Um eine Kristallbildung zu induzieren, wird eine wässerige Lösung aus Ammoniumsulfat, Methylpentandiol oder Polyethylenglycol einer wässerigen Lösung eines Biopolymers, das kristallisiert werden soll, zugegeben, das gefällte Hochpolymer stehengelassen, und die Bildung eines Kristallkeims und die Züchtung eines Kristalls werden durch das Lösungszüchtungsverfahren bewirkt. In diesem Zusammenhang sind verschiedene Verfahren zur Ausfällung eines Biopolymers bekannt [Lecture on Biochemical Experiments, Band 1-III, Seiten 6-17, veröffentlicht von Tokyo Kagaku Dojin im Jahre 1976].
Da ein Einstellen der Kristallisationsbedingungen präzise sein muß, wird die Kristallisation nichtsdestotrotz unter einer Reihe von Bedingungen durchgeführt, um die optimalen Bedingungen festzulegen, und da eine händische Operation zum Herausfinden der optimalen Bedingungen ausgeführt wird, ist es schwierig, eine gute Reproduzierbarkeit beizubehalten. Dementsprechend schlugen die Erfinder der vorliegenden Erfindung früher ein Verfahren zum automatischen Durchführen dieser Operation vor (siehe japanische ungeprüfte Patentveröffentlichung Nr. 62-106000, korrespondierend zur EP-A - 0 225 050). Aber in diesem System, in dem ein Lösungspfad, gemäß welchem viele Kristallisationsbedingungen angewendet werden, durch eine Düse geändert wird, ist das Totvolumen des Rohrsystems erhöht und viel wertvolle proteinprobe wird verschwendet.
Ein primäres Ziel der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein Verfahren und eine vorrichtung zur Herstellung eines Einzelkristalls eines Biopolymers durch Züchtung aus einer Lösung vorzusehen, in welchen die optimalen Bedingungen zur Kristallisation eines Biopolymers auf einfache Weise und effizient bestimmt werden können, wobei eine kleine Menge der Probe verwendet wird.
Insbesondere umfaßt gemäß einem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von Einkristallen eines Biopolymers durch Züchtung aus einer Lösung: Errichten eines im wesentlichen kontinuierlichen Gradienten eines die Kristallbildung beeinflussenden Faktors in der Lösung, Fraktionieren der Lösung in Fraktionen nach ihrem Gehalt entlang des Gradienten und unabhängiges Kristallisieren der erhaltenen Fraktionen.
Obgleich im herkömmlichen Verfahren Lösungen einzeln gebildet und für jede Kristallisationsbedingungen übertragen werden, involviert die vorliegende Erfindung die Produktion einer Serie von vorbestimmten Kristallisationsbedingungen entlang eines Gradienten, und diese werden entsprechend den unabhängigen Bedingungen fraktioniert.
Gemäß einem zweiten Aspekt der vorliegenden Erfindung umfaßt eine vorrichtung zur Herstellung von Einzelkristallen eines Biopolymers durch Züchtung aus einer Lösung des Biopolymers: Mischungsmittel, Mittel zum Zuführen einer Lösung eines kristallbildenden Mittels zu den Mischungsmitteln und Mittel zum Zuführen einer Biopolymerlösung zu den Mischungsmitteln, in welchen die Vorrichtung Mittel zum Erzeugen in dem bei den Mischungsmitteln gebildeten Gemisch eines im wesentlichen kontinuierlichen Gradienten eines die Kristallbildung beeinflussenden Faktors enthält, und Mittel zum Fraktionieren der Lösung und zum unabhängigen Kristallisieren der erhaltenen Fraktionen.
In den beigefügten Zeichnungen:
ist Figur 1 ein Diagramm, welches eine erste Ausführungsform der Vorrichtung zum Ausführen des Verfahrens der vorliegenden Erfindung darstellt;
sind die Fig. 2 und 3 Graphe, die den Ammoniumsulfat- Konzentrationsgradienten und die Anzahl der in den Beispielen der vorliegenden Erfindung gebildeten Kristalle zeigen;
ist Fig. 4 ein Diagramm, welches eine zweite Ausführungsform der Vorrichtung zum Ausführen des Verfahrens der vorliegenden Erfindung darstellt;
ist Fig. 5 eine schematische perspektivische Ansicht, welche ein Kompressionswerkzeug darstellt, das im Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet wird;
ist Fig. 6 ein Diagramm, welches einen schlauch darstellt, wenn er durch das Kompressionswerkzeug zusammengedrückt wird;
ist Fig. 7 eine vergrößerte Ansicht eines Teils von Fig. 6;
ist Fig. 8 ein Diagramm, welches eine Kristallwachstumsvorrichtung gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung darstellt.
ist Fig. 9 ein Diagramm, welches ein Beispiel der Fabrikation eines Kristallisierungsgefäßes darstellt;
ist Fig. 10 ein Diagramm, welches eine weitere Ausführungsform des Verfahrens zum Herstellen eines Kristalls gemäß der vorliegenden Erfindung darstellt;
ist Fig. 11 ein Graph, welcher die Ergebnisse darstellt, die mit der in Fig. 10 gezeigten Ausführungsform erhalten wurden;
sind die Fig. 12A und 12B Diagramme, die jeweils ein Beispiel des Aufbaus der Vorrichtung zeigen, in welcher das Verfahren der vorliegenden Erfindung vorteilhafterweise ausgeführt wird; und
ist Fig. 13 ein Blockdiagramm, welches die Operationen in der Vorrichtung zeigt, die in den Fig. 12A und 12B gezeigt ist.
Die vorliegende Erfindung ist von dem herkömmlichen Verfahren verschieden, in welchem eine Lösung unabhängig gebildet und für jede Kristallisationsbedingung übertragen wird, da gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung eine Serie von Änderungen von vorbestimmten Kristallisationsbedingung kontinuierlich erzeugt und die Lösung fraktioniert wird, um Fraktionen entsprechend den unabhängigen Bedingungen zu bilden.
Genauer gesagt wird zum Beispiel die Konzentration an Ammoniumsulfat, welches ein Protein fällt, allmählich geändert, um einen Konzentrationsgradienten zu bilden, werden Tropfen der Lösung, einer nach dem anderen, gesammelt und wird die Kristallisation für die jeweiligen Tropfen mittels des Dampfdiffusionsverfahrens durchgeführt.
Als Faktor der Kristallisationsbedingung zur Ausbildung des Konzentrationsgradienten können ausgenutzt werden: die Konzentration eines fällenden Mittels oder kristallbildenden Mittels , wie das oben erwähnte Ammoniumsulfat, Magnesiumsulfat, Natriumsulfat, Natriumphosphat, Natriumchlorid, Caesiumchlorid, Methylpentandiol, Methanol oder Aceton, die Proteinkonzentration, der pH-Wert (Wasserstoffionenkonzentration), die Konzentration einer Substanz, deren Anwesenheit die Regelmäßigkeit des Kristalls erhöht, zum Beispiel eines anorganischen Salzes, wie Natriumsulfat, Caesiumchlorid oder Aluminiuinchlorid, und die Konzentration einer Substanz, die sich spezifisch an ein Protein bindet, zum Beispiel ein Enzymreaktionsinhibitor.
Als die fraktionierenden und kristallbildenden Mittel kann ein Verfahren erwähnt werden, in welchem die Lösung in zum Beispiel Flaschen mit Schraubverschluß, die ein kleines Fassungsvermögen besitzen, gegeben und versiegelt wird, und die Kristallbildung wird chargenweise in jeder entsprechenden Flasche durch Stehen (Fig. 1) ausgeführt, und ein Verfahren, in welchem Tropfen auf kleinen Glasplatten empfangen werden, und die Kristallbildung durch das Dampfdiffusionsverfahren bewirkt wird.
Ein Beispiel des Aufbaus der Vorrichtung zum Ausführen des Verfahrens der vorliegenden Erfindung ist in Fig. 1 gezeigt. In diesem Beispiel werden eine Ammoniumsulfatlösung 1 (Ammoniumsulfatkonzentration = 80% der Sättigungskonzentration, 10 mM Natriumphosphatpuffer, pH = 7,0) und eine Ammoniumsulfatlösung 2 (Ammoniumsulfatkonzentration = 95% der Sättigungskonzentration, 10 mM Natriumsulfatpuffer, pH = 7,0) einem System 3 zur Erstellung eines Konzentrationsgradienten für eine herkömmliche Hochgeschwindigkeits-Flüssigchromatographie zugeführt, und ein Konzentrationsgradient von 83% der Sättigungskonzentration bis 95% der Sättigungskonzentration wird mit einer Gesamtlösungsmenge von 3,34 ml gebildet. Eine getrennt hergestellte Proteinlösung 4 (3% Wal-Spermmyoglobin, 50% Ammoniumsulfat, 10 mM Natriumphosphatpuffer, pH = 7,0) wird mit der obigen Lösung mit dem Konzentrationsgradienten unter einem Volumsverhältnis von 1/2 gemischt. Um dieses Mischungsverhältnis zu erzielen, werden die Zuführgeschwindigkeiten der zwei Pumpen 5 und 6 auf 0,5 ml/min beziehungsweise 1,0 ml/min eingestellt. Die gebildete Lösung enthält 1% Myoglobin in 10 mM Natriumphosphat und besitzt einen pH-Wert von 7 und ein Konzentrationsgradienten, in welchem sich die Ammoniumsulfatkonzentration linear von 70% auf 80% ändert, wird gebildet (Fig. 2). Die Lösung wird einem Fraktionssammler 7 für die Flüssigchromatographie zugeführt, und die Lösung wird in Fraktionen geteilt, wobei jede ein Volumen von 0,5 ml besitzt, und in Mikrofläschchen mit einem Fassungsvermögen von 1 ml gegeben. Die Mikrofläschchen werden sofort versiegelt und in einem Thermostaten bei 20ºC gehalten, und auf diese Weise werden Myoglobinlösungen erhalten, die Ammoniumsulfat in Konzentrationen entsprechend 70,5, 71,5, 72,5, 73,5, 74,5, 75,5, 76,5, 77,5, 78,5 und 79,5% der Sättigungskonzentration enthalten. Nach 1 Tag wird die Bildung von Kristallen initiiert, und die Kristalle wachsen allmählich während ungefähr 7 Tagen. Die Anzahl der gebildeten Kristalle ist bei der Konzentration am größten, welche 75,5% der Sättigungskonzentration entspricht (Fig. 3). Diese Konzentration ist nämlich eine optimale Konzentrationsbedingung für die Kristallbildung im vorliegenden Beispiel.
Ein weiteres Beispiel des Aufbaus der Vorrichtung zum Ausführen des Verfahrens der vorliegenden Erfindung ist in Fig. 4 gezeigt. In diesem Beispiel werden eine Proteinlösung 8 (3% Wal-Spermmyoglobin, 60% gesättigtes Ammoniumsulfat, 10mM Natriumphosphatpuffer, pH = 7,0) und eine Proteinlösung 9 (0,75% Wal-Spermmyoglobin, 60% gesättigtes Ammoniumsulfat, 10 mM Natriumphosphatpuffer, pH = 7,0) einer Vorrichtung 10 aus einem Acrylharz (geliefert von sanko Plastics Co.) zur Gradientenbildung zugeführt, und ein Konzentrationsgradient wird auf eine gesamte Flüssigkeitsmenge von 2 ml gebildet. Die Zuführgeschwindigkeiten der zwei peristaltischen Pumpen 12 und 13 werden auf 0,3 ml/min beziehungsweise 0,6 ml/min eingestellt, so daß eine getrennt hergestellte Ammoniumsulfatlösung 11 (80% Ammoniumsulfat, 1,0 mM Natriumphosphatpuffer, pH = 7,0) mit der obigen Lösung mit einem Konzentrationsgradienten bei einem Volumsverhältnis von 1/2 gemischt wird. Die Endlösung enthält 70% Ammoniumsulfat in 10 mM Natriumphosphatpuffer und besitzt einen pH-Wert von 7,0, und die Myoglobinkonzentration ändert sich von 0,5% auf 2%. Die Lösung wird in Fraktionen geteilt, welche jeweils ein Volumen von 1,0 ml besitzen, und auf Glasplatten 14 empfangen, und die Kristallbildung wird bei 20ºC durch das Dampfdiffusionsverfahren bewirkt. Nach 3 Tagen wird die Bildung von Kristallen initiiert, und die Kristalle wachsen langsam während ungefähr 2 Wochen. Die Anzahl der gebildeten Kristalle ist bei einer Myoglobinkonzentration von 1,5% am größten. Diese Konzentration ist nämlich eine optimale Myoglobinkonzentration für die Kristallbildung in diesem Beispiel.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird als Mittel zum Fraktionieren und zum Kristallisieren einer Lösung mit einem Konzentrationsgradienten ein Verfahren eingeschlagen, in welchem die Lösung mit dem auf die oben erwähnte Weise hergestellten Konzentrationsgradienten in einen weichen, hohlen schlauch geführt wird, der weiche, hohle Schlauch an einer Vielzahl von vorbestimmten Teilen zusammengedrückt wird, um den Schlauch in eine Vielzahl von kleinen Kammern zu teilen und in welchem jede Kammer als eine Kristallzüchtungskammer verwendet wird, die mit der Lösung gefüllt ist, die kristallisiert werden soll.
Gemäß noch einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Vielzahl von Blöcken mit einem Durchloch eng aneinander angeordnet, um einen hohlen Rohrhohlraum auszubilden, der von den Durchlöchern der Blöcke begrenzt wird, wodurch eine Vorrichtung zum Kristallzüchten aufgebaut wird. Die Lösung, die kristallisiert werden soll und einen Konzentrationsgradienten besitzt, wird in den hohlen Rohrhohlraum gefüllt, und die Verbindung der Durchlöcher wird so abgedichtet, daß die Durchlöcher als unabhängige kleine Kammern verwendet werden. Jede kleine Kammer wirkt nämlich als eine Kammer zum Kristallzüchten, die mit der zu kristallisierenden Lösung gefüllt ist.
Zur Kompression des weichen, hohlen schlauches kann zum Beispiel ein Kompressionswerkzeug 21 verwendet werden, welches Elemente mit der gleichen rechteckigen schnittform aufweist, wie in den Fig. 5 und 6 gezeigt. Zum Beispiel wird ein weicher schlauch 22 auf dem Kompressionswerkzeug 21 gehalten, und der Schlauch 22 wird durch dieses Werkzeug 21 in eine Vielzahl von kleinen Kammern zum Kristallzüchten geteilt. Diese Vorrichtung wird auf die folgende Weise betrieben. Ein Ende des Kompressionswerkzeuges ist fixiert, und vier Kugelumlaufspindeln sind am anderen Ende so angebracht, daß eine Auslegerstruktur nicht gebildet wird. synchronriemenscheiben, die an einem Ende der Spindeln angebracht sind, werden von einem Motor über einen Synchronriemen angetrieben, um das Kompressionswerkzeug gegen seine andere Seite zusammenzudrücken. Der Endpunkt wird automatisch unter Verwendung eines Lichtunterbrechers oder ähnlichem detektiert, um die Zuführung von Energie zum Motor zu stoppen. Eine umgekehrte Umdrehung, nachdem die Energiezuführung gestoppt ist, kann verhindert werden, indem der Motor über ein Getriebe angetrieben wird.
Ein transparenter, weicher, hohler schlauch wird in der vorliegenden Erfindung verwendet, aber falls eine Beobachtung des kristallbildenden Verfahrens über eine Zeitspanne hinweg nicht notwendig ist, kann ein halb-transparenter oder opaker schlauch verwendet werden. Ein Material mit einer niedrigen Wasserdurchlässigkeit wird vorzugsweise als das Material des hohlen Schlauches verwendet. Vorteilhafterweise werden zum Beispiel verwendet: ein Vinylchloridpolymer, vertrieben unter dem Handelsnamen "Tygon", und Fluor enthaltende Polymere, wie ein Tetrafluorethylen/Perfluoralkylvinylether - Copolymer (PFA), ein Tetrafluorethylen/Hexafluorpropylen - Copolymer (FEP), ein Tetrafluorethylen/Ethylen - Copolymer (ETFE), Polytrifluorchlorethylen (PCTFE), ein Trifluorchlorethylen- /Ethylen - Copolymer (ECTFE), Polyvinylfluorid (PVF), Polyvinylidenfluorid (PVDF) und Polytetrafluorethylen (PTFE).
Die Probe wird in den weichen, hohlen Schlauch der oben erwähnten Vorrichtung aus der Vorrichtung zur Herstellung des Konzentrationsgradienten eingebracht, der weiche, hohle Schlauch wird in kleine Kammern geteilt, und Kristalle werden darin gezogen. Die Kristalle werden gewonnen, indem ein Ende der kleinen Kammern des weichen Schlauches abgeschnitten wird.
Genauer gesagt wird ein transparenter Schlauch mit einer guten Elastizität und einer niedrigen Wasserdurchlässigkeit (in der vorliegenden Ausführungsform aus Tygon bestehend), wie in Fig. 5 gezeigt, stromabwärts der Vorrichtung zur Herstellung des Konzentrationsgradienten angeordnet, wie in Fig. 1 oder 4 gezeigt. Eine vorbestimmte Menge der Lösung wird aus der Vorrichtung zur Herstellung des Konzentrationsgradienten dem Schlauch zugeführt, um im Schlauch einen vorbestimmten Konzentrationsgradienten herzustellen, der Schlauch wird bei vorbestimmten Intervallen komprimiert, um den Schlauch in kleine Kammern zu teilen, und Kristalle werden in jeder Kammer gezogen.
Eine Konzentrationsgradienten-Lösung enthaltend 1% Myoglobin und 10 mM Natriumphosphatpuffer und mit einer Ammoniumsulfatkonzentration, die sich allmählich von 70% auf 80% ändert, wird auf die gleiche Weise hergestellt, wie oben mit Bezug auf Fig. 1 beschrieben wird, und die Lösung wird in einen Tygon-Schlauch mit einem Innendurchmesser von 3 mm und einer Länge von 8 cm geführt. Der Schlauch wird von Metallplatten, die konvexe und konkave Stellen aufweisen, eingespannt, um den Schlauch in 10 kleine Kammern zu Intervallen von 0,8 cm zu teilen. Lösungen mit Konzentrationen entsprechend 70,5, 71,5, 79,5% der Sättigungskonzentration werden in die kleinen Kammern geleitet, und die Züchtung der Kristalle wird in einem Thermostat ausgeführt, welcher auf 20ºC gehalten wird, während der Schlauch dadurch eingespannt ist.
Nach einem Tag wird das Züchten von Kristallen initiiert, und die Kristalle wachsen allmählich während 7 Tagen. Die Anzahl der gebildeten Kristalle ist am größten bei einer Konzentration, die 75,5% der Sättigungskonzentration entspricht. In der vorliegenden Ausführungsform ist diese Konzentration für eine Kristallbildung eine optimale Konzentration.
Wo der weiche, hohle Schlauch aus einem Fluor-enthaltenden Polymer gebildet wird, wird ein hohler schlauch mit einer struktur, die unten beschrieben wird, sehr vorteilhaft verwendet. Hohle Schläuche aus PFA, FEP, PVDF, PVF und PTFE mit wandstärken von 0,2 bis 2,0 mm und schläuche aus ETFE, PCTFE und ECTFE mit einer Wandstärke von 0,2 bis 1,0 mm werden nämlich bevorzugt verwendet.
Wo kleine Kammern unter Verwendung einer Vielzahl von Blöcken gebildet werden, kann eine in Fig. 8 gezeigte Vorrichtung zum Kristallzüchten verwendet werden, in welcher eine Vielzahl von Blöcken 24 mit einem Loch 23, das an einer geeigneten Stelle gebildet ist, und eine Vielzahl von dünnen Platten 26 mit einem Loch 25, welches mit dem Loch 23 korrespondiert, abwechselnd angeordnet sind. Diese Vorrichtung zum Kristallzüchten wird zum Beispiel auf die folgende Weise verwendet. Ein Loch wird am Zentralabschnitt des oberen Endes der dünnen Platte gebildet, die zwischen den Blöcken eingespannt ist, und ein Stab zum Aufwärts-Schieben der dünnen Platte wird durch dieses Loch eingeführt. Kugelumlaufspindeln sind an beiden Enden des Stabes angeordnet. Wie in der oben erwähnten Vorrichtung werden Synchronriemenscheiben von einem Motor über einen Synchronriemen angetrieben, um die dünnen Platten 26 gleichzeitig aufwärts zu schieben, wodurch das Schlauchloch in kleine Kammern as Kristallzüchtungskammern geteilt wird.
Das Material der Blöcke kann entweder ein anorganisches Material sein, wie Glas, oder ein organisches Polymer, wie ein Acrylpolymer, Polymethylpenten oder Polycarbonat.
Die dünnen Platten sind vorzugsweise aus einem Metall, wie rostfreiem Stahl oder Titan.
Es können zum Beispiel Blöcke mit einer Dicke von mindestens 2 mm und diese Platten mit einer Dicke von nicht größer als 200 um verwendet werden.
Wenn die Kristallzüchtungsvorrichtung der vorliegenden Ausführungsform konstruiert wird, wird ein Durchloch in jedem Element gebildet, welches einen Block und eine dünne Platte umfaßt, und werden die Elemente unter Verwendung von Schrauben und Muttern zusammengebaut. Nachdem die Kristalle durch die vorbestimmte Operation gezüchtet worden sind, werden die Kristalle zum Beispiel auf die folgende Weise gewonnen. Die Vorrichtung wird vertikal aufgerichtet und die Schrauben und Muttern werden unter Verwendung eines Trennwerkzeuges entfernt, während alle Blöcke festgeklemint sind (um ein Austreten der Lösung zu verhindern, indem etwas wie ein O-Ring 32 verwendet wird, wie in den Fig. 9 und 10 gezeigt), und dann werden die Blöcke einer nach dem anderen entfernt und die Kristalle in den jeweiligen Kammern der Reihe nach gewonnen.
Es wird zum Beispiel ein Werkzeug verwendet, welches Polymethacrylatpolymer-(Plexiglas)-Blöcke (mit einer Länge von 0,8 cm) mit einem Loch mit einem Durchmesser von 3 mm und Platten aus rostfreiem Stahl umfaßt (mit einer Dicke von 50 ijm), mit einem Loch mit einem Durchmesser von 3 mm, welche zwischen benachbarten Blöcken eingespannt sind (siehe Fig. 8). Wo die dünnen Platten zwischen den Acrylharz-Blöcken so eingespannt sind, daß die Löcher der Blöcke mit den Löchern der dünnen Platten übereinstimmen, wird die gleiche Konzentrationsgradientenlösung, wie oben mit Bezug auf Figur 1 beschrieben, in den Schlauchweg gefüllt, und die Platten aus rostfreiem Stahl werden um 10 cm geschoben, um den schlauchweg in 10 kleine Kammern zu teilen. Auf die gleiche Weise wie in den vorhergehenden Ausführungsformen beschrieben, werden die Kristalle während 7 Tagen gezüchtet, und die gebildeten Kristalle werden durch Trennen der Blöcke gewonnen, wobei das oben erwähnte Trennwerkzeug verwendet wird.
Gemäß einer noch anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden kleine Kammern durch die in Fig. 10 dargestellten Mittel gebildet. In Figur 10 zeigt (A) den Zustand des Werkzeuges beim Beladungsschritt mit der Konzentrationsgradientenlösung und (B) den Zustand nach der Teilung der Konzentrationsgradientenlösung.
Nun wird ein weiteres Beispiel der Konzentrationsgradientenlösung angegeben. Bezugnehmend auf Fig. 1 werden eingefüllt: eine wässerige Lösung aus Ammoniumsulfat mit einer Konzentration entsprechend 95% der Sättigungskonzentration als eine konzentrierte Lösung 1, eine wässerige Lösung aus Ammoniumsulfat mit einer Konzentration, die 72,5% der Sättigungskonzentration entspricht, als eine verdünnte Lösung 2 und eine Proteinlösung 4, die durch Lösen von 3% des Wal-Spermmyoglobins in einer wässerigen Lösung aus Ammoniumsulfat mit einer Konzentration entsprechend 50% der Sättigungskonzentration, gebildet wird. Es wird angemerkt, daß 1/15 Mol/l Natriumphosphatpuffer (pH = 7,4) jeder Lösung zum Puffern des pH-Wertes zugegeben wird.
Die Mischvorrichtung 3 wird betrieben, um eine Konzentrationsgradientenlösung mit einer Konzentration zu bilden, die sich von 72,5% der Sättigungskonzentration auf 95% der Sättigungskonzentratian mit einer gesamten Flüssigkeitsmenge von 2 ml ändert. Die Konzentrationsgradientenlösung wird durch die Pumpe 5 in den Zeichnungen nach rechts fließen gelassen, und die Proteinlösung 4 wird durch die Pumpe 6 in einem Volumen fließen gelassen, welches 1/2 des Volumens der Konzentrationsgradientenlösung entspricht, beide Lösungen werden dann gemischt, und die Lösung mit einem Konzentrationsgradienten wird nach außen gespeist.
Das in Fig. 10 gezeigte Werkzeug 30 umfaßt eine Vielzahl transparenter Blockplatten 31, die aus einem transparenten Acrylharz gebildet sind, und eine Dicke von einigen mm und ein Durchloch 31a mit einem Durchmesser von 2 bis 3 mm aufweisen und in Kontakt miteinander stehen. Die Blockplatten 31 werden abwechselnd zum Beispiel in Richtung b (vertikal auf die Oberfläche des Zeichnungsblattes) im rechten Winkel zur Dickenrichtung mittels eines betreibenden Elementes (nicht gezeigt), welches außen angebracht ist, bewegt. Abdichtungen 32 sind in kreisförmigen Rillen 31b um die Durchlöcher 31a an beiden Seiten der Blockplatten 31 vorgesehen, so daß eine Versiegelung zwischen den einander gegenüberstehenden Oberflächen der benachbarten Blockplatten aufrechterhalten wird.
Eine Lösungseinlaßöffnung 33 ist an einem Ende des Werkzeugs 30 fixiert, und ein Loch 33a der Öffnung 33 wird im wesentlichen koaxial mit dem Durchloch 31a der Blockplatte 31 ausgebildet.
Im Zustand (A), wo die Durchlöcher 31a der Blockplatten 31 miteinander in Verbindung stehen, wird die vorbestimmte Konzentrationsgradientenlösung in das Werkzeug 30 von der Öffnung 33 eingebracht, und die Blockplatten 31a werden abwechselnd mittels eines externen Mechanismus, der in den Zeichnungen nicht gezeigt ist, auf dem Zeichnungsblatt nach oben bewegt, um die Verbindung der Durchlöcher zu unterbrechen und den Zustand (B) herzustellen.
In diesem geteilten Zustand werden die Durchlöcher 31a der entsprechenden Blockplatten 31 mit Lösungen gefüllt, die jeweils verschiedene Zusammensetzungen besitzen, und die Lösungen werden in diesem Zustand in einem Thermostaten stehengelassen, der auf ungefähr 20ºC aufrechterhalten wird. Die Bildung von Kristallkernen und das Wachstum der Kristalle wird von außen beobachtet.
Sogar falls die Blockplatten 31 aus einem transparenten Glas, Polymethylpentenharz oder Polycarbonatharz, statt aus dem Acrylharz, das in der vorliegenden Ausführungsform verwendet wird, gebildet werden, können ähnliche Wirkungen erzielt werden, wie experimentell bestätigt worden ist.
Figur 11 zeigt die Beziehung zwischen der Konzentration der Konzentrationsgradientenlösung und der Größe der Kristalle in jeder kleinen Kammer, wie sie in der oben erwähnten Ausführungsform beobachtet wurde. Die Ammoniumsulfatkonzentration (%) wird auf der linken Ordinate Y1 aufgetragen, und der Mittelwert (mm) der langen Seiten der Kristalle ist auf der rechten Ordinate Y2 aufgetragen, und die Zahl der kleinen Kammer ist auf der Abszisse x gezeigt.
In der vorliegenden Erfindung ist der Abschnitt, in welchem die Kristalle am größten sind, das heißt, der Mittelwert der langen Seiten der Kristalle ungefähr 0,8 mm ist, in der Nähe der kleinen Kammer Nr. 11, und der Punkt P, der die wässerige Lösung des Ammoniumsulfats mit einer Konzentration entsprechend 74% der Sättigungskonzentration angibt, entspricht im wesentlichen diesem Abschnitt.
Die Figuren 12A und 12B zeigen jeweils noch eine weitere Ausführungsform der Struktur der Vorrichtung zum vorteilhaften Ausführen des Verfahrens der vorliegenden Erfindung. Bezugnehmend auf die Fig. 12A und 12B ist eine Lösung 42 mit dem kristallbildenden Mittel in einem Abschnitt 41 zur Zuführung von Flüssigkeit enthalten, und eine Lösung 44 mit dem kristallbildenden Mittel, die einen verschiedenen Faktor der Lösung 42 mit dem Kristallisierungsmittel besitzt, ist in einem Konzentrationsgradienten-bildenden Abschnitt 43 enthalten. Die Lösung mit dem kristallbildenden Mittel kann in den Konzentrationsgradienten bildenden Abschnitt 43 vorher durch Mittel ähnlich dem Mechanismus des Abschnitts 41 für die Zuführung von Flüssigkeit eingespeist werden. Die Lösung 42 wird mit einer konstanten Geschwindigkeit aus dem Abschnitt 41 zur Zuführung von Flüssigkeit zugeführt, wodurch ein vorbestimmter Konzentrationsgradient durch Rühren der Lösung mit dem kristallbildenden Mittel gebildet wird, die in den Abschnitt 43 zur Konzentrationsgradientenbildung eingespeist wird, und die Lösung 44 mit dem kristallbildenden Mittel, und gleichzeitig die Konzentrationsgradientenlösung, werden der Reihe nach nach außen gespeist. Eine Probelösung 46 wird aus einem Abschnitt 45 für die Flüssigkeitszuführung mit einer konstanten Geschwindigkeit entnommen. Diese Lösungen werden mittels des Rührabschnittes 61 vermischt, um eine das kristallbildende Mittel enthaltende Probelösung mit einem bestimmten onzentrationsgradienten zu bilden. Die Konzentrationsgradientenlösung wird dann in einen Kristallisierungsabschnitt 47 eingebracht, und ein Kompressionswerkzeug 48 wird von einem Abschnitt 49 zum Antreiben des Zusammendrückens des schlauches angetrieben, um eine Vielzahl von kleinen, die Probelösung enthaltenden Kammern, zu bilden. Es ist anzumerken, daß die Bezugsziffer 50 ein Ablaßgefäß darstellt und daß die Bezugsziffer 60 Ventile darstellt. Figur 13 ist ein Blockdiagramm, welches die Operationen in der in Fig. 12 gezeigten Vorrichtung zeigt. In Fig. 13 steht 51 für einen Steuerungsabschnitt, steht 52 für einen Abschnitt zur Temperatursteuerung, steht 53 für eine Reservelösung und Zuführabschnitt, steht 54 für einen den Konzentrationsgradienten bildenden Abschnitt, steht 55 für eine Reservelösung und einen Zuführabschnitt, steht 56 für einen ristallisierungsabschnitt, und steht 57 für einen Abschnitt zum Antreiben des Zusammendrückens des Schlauchs. Der Pfeil aus dem Abschnitt 51 gibt den Befehlsstrom zum Einleiten einer koordinierten Aktion der jeweiligen Abschnitte an. Es ist wichtig, daß die Abschnitte 53, 54, 55, 56 und 57 entsprechend wirken. Die Pfeile aus 52 zeigen die Befehlsströme für ein geeignetes Steuern der Temperaturen der jeweiligen Abschnitte an. Die Pfeile aus dem Abschnitt 53 zum Abschnitt 54 (oder 55), 54 zu 55, und 55 zu 56 zeigen die Lösungsströme an. Der Pfeil aus dem Abschnitt 57 zum Abschnitt 56 gibt die Antriebskraft zum Zusammendrücken des Schlauchs an.
Das Verfahren und die Vorrichtung der vorliegenden Erfindung können nicht nur für terrestrische Versuche, sondern auch für kosmische Versuche angewendet werden.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung von Einzelkristallen eines Biopolymers durch Züchtung aus einer Lösung des Biopolymers, welches umfaßt: Errichten eines im wesentlichen kontinuierlichen Gradienten eines die Kristallbildung beeinflussenden Faktors in der Lösung, Fraktionieren der Lösung in Fraktionen nach ihrem Gehalt entlang des Gradienten und unabhängiges Kristallisieren der erhaltenen Fraktionen.

2. Verfahren nach Anspruch 1, in dem der Faktor die Konzentration eines kristallbildenden Mittels ist, welches der Lösung zugegeben wird, um das Biopolymer zu fällen.

3. Verfahren nach Anspruch 2, in dem das kristallbildende Mittel ausgewählt ist aus Ammoniumsulfat, Magnesiumsulfat, Natriumsulfat, Natriumphosphat, Natriumchlorid, caesiumchlorid, Methylpentandiol, Ethanol, Methanol, Aceton und Polyethylenglycol.

4. Verfahren nach Anspruch 1, in dem der Faktor die Konzentration des Biopolymers ist.

5. Verfahren nach Anspruch 1, in dem der Faktor die Konzentration eines Additivs ist, welches zum Verbessern der Regelmäßigkeit des Biopolymers zugegeben wird.

6. Verfahren nach Anspruch 5, in dem das Additiv ein anorganisches Salz oder ein Ligand ist, der in der Lage ist, sich an das Biopolymer spezifisch zu binden.

7. Verfahren nach Anspruch 1, in dem der Faktor die Wasserstoffionenkonzentration der Lösung ist.

8. Verfahren nach irgendeinem vorhergehenden Anspruch, in dem der Gradient entlang der Länge eines Gefäßes errichtet wird und die Fraktionierung dann durch Querteilen des Gefäßes bewirkt wird, um eine Serie von getrennten, kristallzüchtenden Kammern zu bilden, von denen jede eine Fraktion der Lösung enthält, und die Fraktionen in ihren jeweiligen Kammern unabhängig kristallisiert werden.

9. Verfahren nach Anspruch 8, in dem das Gefäß ein weicher, hohler Schlauch ist und der weiche, hohle Schlauch an einer Vielzahl von vorbestimmten Positionen zusammengedrückt wird, um den weichen, hohlen Schlauch in eine Serie von Kammern zu teilen.

10. Verfahren nach Anspruch 9, in dem der weiche, hohle Schlauch transparent ist.

11. Verfahren nach Anspruch 9 oder 10, in dem der weiche, hohle Schlauch aus einem Material besteht ist, das aus Vinylchlorid-Polymeren, Tetrafluorethylen/Perfluoralkylvinylether- Copolymeren, Tetrafluorethylen/Hexafluorpropylen-Copolymeren, Polyvinylidenfluorid, Polyvinylfluorid und Polytetrafluorethylen ausgewählt ist.

12. Verfahren nach Anspruch 11, in dem das Schlauchmaterial ein Tetrafluorethylen/Ethylen-Copolymer, Polytrifluorchlorethylen oder ein Trifluorchlorethylen/Ethylen-Copolymer ist.

13. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 9 bis 12, in dem die Schlauchwand eine Dicke von 0,2 bis 2,0 mm besitzt.

14. Verfahren nach Anspruch 13, in dem die Schlauchwanddicke 0,2 bis 1,0 mm ist.

15. Verfahren nach Anspruch 8, in dem das Gefäß eine Vielzahl von Blöcken umfaßt, die jeweils eine Öffnung begrenzen und aneinandergrenzend angeordnet sind, wobei die Öffnungen miteinander in Verbindung stehen, um einen röhrenförmigen Hohlraum zu bilden, und in welchem die Verbindung Zwischen den Öffnungen geschlossen wird, um den röhrenförmigen Hohlraum in eine Serie von Kammern Zu teilen.

16. Verfahren nach Anspruch 15, in dem die kristallbildende Vorrichtung zusammengebaut ist, indem eine Vielzahl von Blöcken, von denen jeder eine Öffnung besitzt, und eine Vielzahl von dünnen Platten, von denen jede eine Öffnung besitzt, abwechselnd montiert sind, wobei die Montage derart ist, daß die Öffnungen initeinander in Verbindung stehen, um einen röhrenförmigen Hohlraum zu bilden.

17. Verfahren nach Anspruch 16, in dem die Blöcke eine Dicke von mindestens 2 mm haben und aus einem transparenten Material bestehen, und in dem die dünnen Platten Metallfilme mit einer Dicke von nicht größer als 200 um sind.

18. Verfahren nach Anspruch 15, in dem die Kammern durch Anordnen einer Vielzahl von Blockplatten gebildet sind, von denen jede eine Öffnung besitzt und in der Lage ist, sich unabhängig in einer Richtung normal auf die Richtung der Dicke so zu bewegen, daß die Öffnungen miteinander in Verbindung stehen, um einen röhrenförmigen Hohlraum zu bilden, Füllen der Lösung mit dem Konzentrationsgradienten in den abgedichteten Hohlraum und Bewegen der Blockplatten relativ Zueinander, ausreichend, um den Hohlraum in Kammern zu teilen.

19. Verfahren nach Anspruch 18, in dem die Blockplatten eine Dicke von mindestens 2 mm besitzen und aus einem transparenten Material bestehen.

20. Verfahren nach Anspruch 17 oder Anspruch 19, in dem das transparente Material Glas oder ein Acryl-, Polymethylpenten- oder Polycarbonatharz ist.

21. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 15 bis 20, in dem die Blöcke oder Blockplatten aus Glas sind.

22. Vorrichtung zur Herstellung von Einzelkristallen eines Biopolymers durch Züchtung aus einer Lösung des Biopolymers, welche umfaßt: Mischungsmittel, Mittel zum Zuführen einer Lösung eines kristallbildenden Mittels zu den Mischungsmitteln und Mittel zum Zuführen einer Biopolymerlösung zu den Mischungsmitteln, in welchen die Vorrichtung Mittel zum Erzeugen in dem bei den Mischungsmitteln gebildeten Gemisch eines im wesentlichen kontinuierlichen Gradienten eines die Kristallbildung beeinflussenden Faktors enthält, und Mittel zum Fraktionieren der Lösung und zum unabhängigen Kristallisieren der erhaltenen Fraktionen.

23. Vorrichtung nach Anspruch 22, in dem die erzeugenden Mittel Mittel zum Bilden eines Konzentrationsgradienten zum kontinuierlichen Ändern eines Faktors umfassen, welcher einen Einfluß auf Bedingungen zur Kristallbildung besitzt.

24. Vorrichtung nach Anspruch 22 oder Anspruch 23, in der die Fraktionierungsmittel und die kristallbildenden Mittel umfassen: Mittel zum Einbringen der Lösung mit einem Konzentrationsgradienten, der von den Gradienten-bildenden Mitteln gebildet wird, in einen röhrenförmigen Hohlraum, und Mittel zum Teilen des röhrenförmigen Hohlraums in eine Vielzahl von unabhängigen, kleinen Kammern.

25. Vorrichtung nach Anspruch 24, in der der röhrenförmige Hohlraum einen weichen, hohlen schlauch umfaßt und die Teilungsmittel Mittel umfassen, um den Schlauch bei einer Vielzahl von voneinander beabstandeten Positionen zusammenzudrücken, um den weichen, hohlen Schlauch in eine Vielzahl unabhängiger, kleiner Kammern zu teilen.

26. Vorrichtung nach Anspruch 24, in der der röhrenförmige Hohlraum begrenzt ist von einer Vielzahl von Blöcken, die jeweils eine Öffnung besitzen, und von einer Vielzahl von dünnen Platten, die jeweils eine Öffnung besitzen, und in welcher die Blöcke und Platten abwechselnd so angeordnet sind, daß die Öffnungen miteinander in Verbindung stehen, um den Hohlraum zu bilden, und die Teilungsmittel Antreibemittel zum gleichzeitigen schieben der dünnen Platten umfassen, wodurch der Raum in kleine Kammern geteilt wird, die als die kristallbildenden Gefäße dienen.

27. Vorrichtung nach Anspruch 24, in der der röhrenförmige Hohlraum von einer Vielzahl von Blöcken begrenzt ist, die jeweils eine Öffnung besitzen und welche aneinandergrenzend so angeordnet sind, daß die Öffnungen miteinander in Verbindung stehen, um den Hohlraum zu bilden, und die Teilungsmittel Antreibemittel zum abwechselnden schieben der Blöcke in eine Richtung quer zur Richtung der Dicke umfassen, wodurch die Verbindung zwischen den Öffnungen geschlossen wird, um kleine Kammern als kristallzüchtende Gefäße zu bilden.