JPH0218373A

JPH0218373A - 有機単結晶作製方法

Info

Publication number: JPH0218373A
Application number: JP16849088A
Authority: JP
Inventors: Takaharu Asano; 高治浅野; Shozo Fujita; 省三藤田; Takafumi Hataya; 隆文端谷
Original assignee: Fujitsu Ltd
Current assignee: Fujitsu Ltd
Priority date: 1988-07-05
Filing date: 1988-07-05
Publication date: 1990-01-22

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔概　要〕濃度勾配液を利用して生体高分子単結晶を複数の小室内
に個別に作製する有機単結晶作成方法に関し、不純物を含まない特性的にすぐれた生体高分子単結晶を
作製することを目的とし、生体高分子結晶の溶液成長による単結晶化条件を規定す
る因子の一つを濃度勾配とした液を小室に分割すること
によって該小室内に個別に生体高分子単結晶を作製する
方法において、前記小室を、貫通孔を有し且つ厚さと直
角方向に独立して移動できる複数のブロック板を該貫通
孔が密封された連通孔となるごとく配置し、前記濃度勾
配液を該連通孔に充填した後に上記各ブロック板を連通
孔が遮断される位置まで相互に移動させて形成し構成す
る。

また、生体高分子結晶の溶液成長による単結晶化条件を
規定する因子の一つを濃度勾配とした液を小室に分割す
ることによって該小室内に個別に生体高分子単結晶を作
製する方法において、前記小室を、弗素系化合物樹脂で
形成した所定壁厚を持つ中空管に前記濃度勾配液を導い
た後、凹凸を有する治具で該中空管をその外部から凹凸
方向に圧着して形成し構成する。

〔産業上の利用分野〕

本発明は濃度勾配液を利用しして複数の小室に有機高分
子単結晶を作製する方法に係り、特に不純物を含まない
特性的に優れた生体高分子単結晶を長期間に亙って継続
して作製する有機単結晶作製方法に関する。

〔従来の技術〕

タンパク質工学やドラッグデザイン等では、例えばＸ線
解析によるタンパク質結晶等の高次構造解析を行う場合
にはサイズ的に大きく且つ不純物を含まない生体高分子
単結晶が必要である。

一般に生体高分子単結晶を作製する方法としては、静置
バッチ法、自由界面拡散法等種々の方法があるが、本発
明はこの内特に静置バッチ法に関するものである。

この静置バッチ法によって結晶化させる場合には、結晶
化させるべき生体高分子の水溶液に例えば硫酸アンモニ
ウム、硫酸マグネシウム、メチルベンタンジオール、ア
セトン等の水溶液を添加し、高分子を沈澱させて放置す
る溶液成長法によって結晶核生成と結晶成長を行わせて
いる。

しかしこれらの場合には結晶化条件の設定が微妙である
ため、平行して複数の条件で結晶化させることが多い。

通常この作業は人手によっているが、その省力化のため
本出願人は作業が自動化できる方法を既に提案している
。

この方法では、あらかじめ結晶化条件の一因子が連続的
に変化する濃度勾配液を作製し、この溶液を治具を用い
て小室に分割し、該各室を結晶化容器となすことを特徴
としている。

第３図は濃度勾配液の作製部分を概略的に示した図であ
り、第４図は従来の濃度勾配液分側方法の例を示した図
で（Ａ）は濃度勾配液注入時の治具の状態を示しくＢ）
は濃度勾配液を分割した後の状態を示している。また第
５図は他の従来例を示した図である。

第３図で、容器１には硫酸アンモニウム液（以下硫安液
とする）　ｌａを、容器２には該硫安″ｉｌａと濃度の
異なる硫安液２ａをまた容器３には所定のタンパク質溶
液３ａがそれぞれ充填されている。

また４はそれぞれの容器をつなぐ配管であり、５は溶液
１ａと２ａを所定の比率に混合する混合器、６．６ｇは
各溶液を図示矢印ａ方向に送出するポンプである。

かかる構成になる濃度勾配液注入時分では、混合器５お
よびポンプ６．６１を予め設定する条件で動作させるこ
とによって、所定の直線的濃度勾配を持つ硫安液とタン
パク質溶液の混合液７を時系列的に送出することができ
る。

また第４図（Ａ）　、　（Ｂ）で、濃度勾配液を分割す
る治具８は、各々に２〜３＋ｎ＋ｗの径の貫通孔９ａを
持つ複数の透明なブロックｔ７ｉ　９と該貫通孔９ａと
ほぼ同径の貫通孔１０ａを持つ複数の金属薄板１０を交
互に配置して構成したものであり、該金属薄板１０は上
記ブロック板９の貫通孔９ａの周囲に装着されているバ
ッキング１１で密封を保ちなから該ブロック板９に挟ま
れた状態で図示す方向（紙面の上下方向）に移動できる
ように構成されている。

１２は該治具８の一端に固定されている溶液注入ボート
であり、該注入ボート１２の孔１２ａは上記ブロック板
９の貫通孔９ａと同軸上に配置形成されている。

ここで上記ブロック板９の貫通孔９ａと金属薄板１０の
貫通孔１０ａとを同軸に連通させた図（Ａ）の状態で、
第３図で得られる所定の濃度勾配液７を注入ボート１２
から該治具８内に注入する。

この場合政治具８内の連通した孔には、場所によって濃
度の異なった濃度勾配液７が充填されることになる。

ここで金属薄板１０を図示されていない外部の機構によ
って紙面上方に移動させて図（Ｂ）に示す如き状態とす
る。

この場合には、該治具８内の連通孔に充填された濃度勾
配液７が上記金属薄板ｌＯで分割されることから、これ
らの分割された小室内に存在する組成濃度の異なった溶
液を約２０℃の恒温槽内で結晶核生成と結晶成長を行わ
せるようにしている。

この場合に成長する結晶は、溶液の濃度によって大きさ
およびその量が変化するため、複数の分割された小室の
内結晶が最も大きくまた量の多い領域を容易に選び出す
ことができる。

しかしかかる構成になる治具では、摺動面が多いため密
封するためのシールの信頼性に欠ける点がありまた金属
薄板１０のエツジでバッキングが損傷することがあると
共に、金属薄板ｌＯからの微量イオンの溶出が結晶化に
悪影響を与え更に該金属薄板ｌＯ自身を腐食させる場合
があるため、均一な組成の有機単結晶を長期間に亙って
′ｍ続して成長させることに難点がある。

また他の従来例を示す第５図で、（八）は分割前の状況
を、また図（Ｂ）は分割後の状態を拡大して示している
。

図（Ａ）　、　（Ｂ）で、可塑材を含む軟質のタイボン
等よりなる内径３ｍｍの中空管１５の内部には第３図で
作製された濃度勾配液７が充填されている。

また金属製の圧着治具１６．１６°は、例えば長方形状
の容器内部の短辺方向に複数の仕切板１６ａ、　１６ａ
’をそれぞれ０．８ｃｍ程度の間隔で配置したものであ
り、上記中空管１５を挟んだ状態で該圧着治具１６．１
６’を図示ｃ、ｃ’方向に圧着することによって図（Ｂ
）に示す如く上記中空管１５を部分的につぶして内部の
濃度勾配液７を分割している。

この場合、各仕切板１６ａ、　１６ａ“で仕切られた濃
度勾配液７の各部分は第４図の場合と同様に各場所によ
ってその組成濃度が異なっているので、第４図と同様に
約２０℃の恒温槽内で結晶核生成と結晶成長を行わせる
ことができる。

しかし、上記タイボン中空管の如く軟質化させるための
可塑材を含む材料では、通常数か月の期間を必要とする
結晶成長期間内に中空管から可塑材が溶出して結晶の成
長や結晶形１回折時の解像性等に悪影響を与えると共に
、水蒸気の透過性が高いため結晶成長中に内部の溶液組
成が変動して結晶の一様化を阻害する。

〔発明が解決しようとする課題〕

従来の有機単結晶作製方法では、組成的に一様で且つ特
性的に安定した所要の有機単結晶を長期的に継続して作
製することが出来ないと云う問題があった。

〔課題を解決するための手段〕

上記問題点は、生体高分子結晶の溶液成長による単結晶
化条件を規定する因子の一つを濃度勾配とした液を小室
に分割することによって該小室内に個別に生体高分子単
結晶を作製する方法において、前記小室を、貫通孔を有し且つ厚さと直角方向に独立し
て移動できる複数のブロック板を該貫通孔が密封された
連通孔となるごとく配置し、前記濃度勾配液を該連通孔
に充填した後に上記各ブロック板を連通孔が遮断される
位置まで相互に移動させて形成する有機単結晶作成方法
、すなわち具体的には上記ブロック板を、厚さ２ｍｍ以
上の透−明なガラス、アクリル樹脂、ポリメチルペンテ
ン樹脂またはポリカーボネート樹脂で形成することによ
って解決される。

また、生体高分子結晶の溶液成長による単結晶化条件を
規定する因子の一つを濃度勾配とした液を小室に分割す
ることによって該小室内に個別に生体高分子単結晶を作
製する方法において、前記小室を、弗素系化合物樹脂で
形成した所定壁厚を持つ中空管に前記濃度勾配液を導い
た後、凹凸を有する治具で該中空管をその外部から凹凸
方向に圧着して形成する有機単結晶作成方法、すなわち
具体的には、 ■上記中空管を、管壁厚さを０．２ｍｍ〜２．０ｍｍの
範囲内で四弗化エチレン・パーフロロアルキルビニルエ
ーテル共重合樹脂（ＰＦＡ）で形成することにより、 ■上記中空管を、管壁厚さを０．２ｍｍ〜２．０＋ｕ＋
の範囲内で四弗化エチレン・六弗化プロピレン共重合樹
脂（ＦＥＰ）で形成することにより、■上記中空管を、
管壁厚さを０．２ｍｍ〜１　、０ｓＩＩの範囲内で四弗
化エチレン・エチレン共重合樹脂（ＥＴＦＥ）で形成す
ることにより、 ■上記中空管を、管壁厚さを０．２ｍｍ〜１．０＋ｎｍ
の範囲内で三弗化塩化エチレン樹脂（ＰＣＴＦＥ）で形
成することにより、 ■上記中空管を、管壁厚さを０．２ｍ＋ａ〜１．０ｍｍ
の範囲内で三弗化塩化エチレン・エチレン共重合樹脂樹
脂（ＥＣＴＦＥ）で形成することにより、■上記中空管
を、管壁厚さを０．２ｍ＋ｗ〜２．０＋＋＋ａ＋の範囲
内で弗化ビニリデン樹脂（Ｐ　Ｖ　Ｄ　Ｆ）で形成する
ことにより、 ■上記中空管を、管壁厚さを０．２ｍｍ〜２．０ｍｍの
範囲内で弗化ビニル樹脂（Ｖ　Ｄ　Ｆ）で形成すること
により、 ■上記中空管を、管壁厚さを０　、２ｍｍ〜２．０ｍｍ
の範囲内で四弗化エチレン樹脂（ＰＴＦＥ）で形成する
ことによって、解決される。

〔作　用〕

２に−様な組成で且つ特性的に安定した有機単結晶を作
製するには、長期に亙る結晶成長期間内に該結晶の成長
に悪影響を及ぼす不純物を発生させないことが望ましい
。

すなわち本発明は、ブロック板を使用して濃度勾配液を
複数に分割する方法においては、金属イオン溶出の要因
となる金属薄板を使用せずまた透明なブロックを相互に
移動させることによって連通孔を複数の小室に分割して
いる。

従って摺動面が半減して密封シールが容易となると共に
金属イオンの溶出がなくなって常に−様な組成で且つ特
性的に安定した有機単結晶を外部から観察しなから作製
することができる。

更に本発明は、軟質の中空管を使用して濃度勾配液を複
数に分割する方法においては、軟質の中空管を形成する
材料に、所定の形状条件を付加することによって可塑剤
を必要とせずまた水蒸気の透過性の低い弗素系化合物樹
脂の使用を可能としている。

従って可塑剤から溶出する不純物がなくなるため常に−
様な組成で且つ特性的に安定した有機単結晶の作製を可
能としている。

〔実施例〕

第１図は本発明になる結晶作製方法の例を示す図であり
（Ａ）は濃度勾配液注入時の治具の状態を（Ｂ）は濃度
勾配液を分割した後の状態をそれぞれ示している。また
第２図は他の実施例を説明する図である。

ここで濃度勾配液の一例を説明すると、第３図の容器１
には濃溶液として９５％飽和硫酸アンモニウム水溶液１
ａを、容器２には希溶液として７２．５％飽和硫酸アン
モニウム水溶液２ａを、また容器３にはタンパク質溶液
３ａとして３％のマツコラクジラミオグロビンを溶解し
た硫酸アンモニウム５０％飽和水溶液をそれぞれ充填す
る。なお各溶液にはＰＨ緩衝のため、　１／１５Ｍｏｌ
ｅ／１の燐酸緩衝液（ＰＨ７，４）を含ませている。

ここで混合器５を動作させて総液量２＋ｅ／の７２．５
〜９５％飽和硫酸アンモニウムの濃度勾配液を作製して
ポンプ６で図示ａ方向に流すと共に、１／２容積のタン
パク質溶液３ａをポンプ６′で流して両者を混合し、濃
度勾配液７を送出する。

第１図で治具２０は、２〜３ＩＩＩｌｌの径の貫通孔２
１ａを有する厚さ数―醜で且つ透明なアクリル樹脂で形
成された複数の透明なブロック板２１を相互に接触させ
て構成しており、特に該ブロック板２１は図示されてい
ない外部に設けた機構部によって例えば一つおきに厚さ
と直角方向の図示す方向（紙面の上下方向）に移動でき
るようになっている。なお該ブロック板２１の両面で貫
通孔２１ａの周囲に設けた円形溝２１ｂにはバッキング
２２が装着されており、互いに接した状態で相互に摺動
するブロック板２１の対向する面との間で密封を保つよ
うに構成している。

また２３は該治具２０の一端に固定されている溶液注入
ポートであり、該注入ポート２３の孔２３ａは上記ブロ
ック板２１の貫通孔２１ａとほぼ同軸上に形成されてい
る。

ここで上記ブロック板２１の貫通孔２１ａを連通させた
図（＾）の状態で、上記所定の濃度勾配液７を注入ポー
ト２１から該治具２０内に注入し、更に図示されていな
い外部の機構によって一つおきのブロック板２１を紙面
上方に移動させて連通孔を分割し図（Ｂ）の状態とする
。

この場合分割された各ブロック板２１の貫通孔２１ａは
、それぞれが組成濃度の異なる溶液で満たされているこ
とからこの状態で約２０℃の恒温槽内に放置し、外部か
ら観察しなから各貫通孔２１ａ内に結晶核生成と結晶成
長させることができる。

なお、ブロック板２１を本図におけるアクリル樹脂の代
わりに透明なガラスやポリメチルペンテン樹脂またはポ
リカーボネート樹脂で形成しても、全く同等の結果が得
られることを実験的に確認している。

一方、弗素化合物樹脂よりなる中空管を使用して濃度勾
配液を小室に分割する方法は、第２図に示す如く第５図
における中空管１５をそのまま弗素系化合物樹脂よりな
る中空管１７に置き換えたものである。

しかし、一般に弗素系化合物樹脂は第５図で例示したタ
イボン等に比べて柔軟性に劣るため中空管の形状には特
別の配慮を必要とする。

すなわち、管壁が厚すぎると治具による小室の分割が完
全に行われず小室間で溶液が移動したり中空管末端で水
分の蒸散が発生する。

また管壁が薄すぎると小室の分割は完全であるが、管壁
を拡散して水分が外部へ蒸散し管内の濃度勾配液の濃度
が変化する。

従って、中空管を形成する材質によって中空管の壁厚ｔ
を最適条件に設定する必要がある。

実験結果によれば、 ■四弗化エチレン・パーフロロアルキルビニルエーテル
共重合樹脂（ＰＦＡ）の場合は管壁厚さ乞を０．２〜２
　、　Ｏｒａｍの範囲内に、■四弗化エチレン・六弗化
プロピレン共重合樹脂（ＰＥＰ）の場合はｔを０．２〜
２．０ＩＩＩａ＋の範囲内に、■四弗化エチレン・エチ
レン共重合樹脂（ＥＴＦｒりの場合はｔを０．２〜１．
０ｍｍの範囲内に、■三弗化塩化エチレン樹脂（ＰＣＴ
ＦＥ）の場合はｔを０．２〜１．０ｍｍの範囲内に、 ■三弗化塩化エチレン・エチレン共重合樹脂（ＥＣＴＦ
Ｅ）の場合はｔを０．２〜１．Ｏｎ＋Ｉ１１の範囲内に
、■弗化ビニリデン樹脂（ＰＶＤＦ）の場合はｔを０．
２〜２．０ｍｍの範囲内に、 ■弗化ビニル樹脂（ＶＤＦ）の場合はｔを０．２〜２゜
０Ｉｌ１ｍの範囲内に、 ■四弗化エチレン樹脂（ＰＴＦＥ）の場合はｔを０．２
〜２．０＋ｓ＋の範囲内に、それぞれしたとき、最適条件で濃度勾配液を小室に分割
できることを確認している。

第２図（Ｂ）は−実験例における濃度勾配液の濃度と小
室ごとの結晶の大きさとの関係を示した図であり、左縦
軸Ｙ１に硫安濃度を％でまた右縦軸Ｙ２には結晶長辺の
平均値を１でそれぞれ示し、横軸Ｘには小室の番号を記
載している。

図（Ｂ）の場合には、小室番号１１の近傍に結晶の最も
大きい領域すなわち結晶長辺の平均値がほぼ０．８ｍｓ
＋程度を示す部分が存在しまた硫酸アンモニウム７４％
飽和水溶液を示すｐ点がほぼこれに対応していることを
示している。

（発明の効果〕上述の如く本発明によって、均一で且つ安定した組成を
持つ有機単結晶を長期間に亙って＊’ｉｏｌして作製す
ることができる有機単結晶作製方法を提供することがで
きる。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明になる結晶作製方法の例を示す図、第２図は他の実施例を説明する図、第３図は濃度勾配液の作製部分を概略的に示した図、第４図は従来の濃度勾配液分側方法の例を示した図第５図は他の従来例を示した図、である０図において、７は濃度勾配液、　２０は治具、２１はブロック板、　２１ａは貫通孔、２１ｂは円形溝
、２２はバッキング、２３は溶液注入ボート、２３ａは孔、をそれぞれ表わす。 −「− イ仁タリ（侯白介１１こ説日月ヌ１ろ図＄　２　図有余ｅｑ（−シろ結晶ｉＥ製方法の發’ｊ乞示す図＄　
１　図濃度勾配液の作製舒功活槽プ各ｉ切て示した図＄　３　
図従来の１度句配麦分轡ｊ木斌のりｌｊと示ＬＥ図第　４
−　図砲ｎ従来例乏示した図第　ダ　図

Claims

【特許請求の範囲】

（１）生体高分子結晶の溶液成長による単結晶化条件を
規定する因子の一つを濃度勾配とした液を小室に分割す
ることによって該小室内に個別に生体高分子単結晶を作
製する方法において、前記小室を、貫通孔を有し且つ厚さと直角方向に独立し
て移動できる複数のブロック板を該貫通孔が密封された
連通孔となるごとく配置し、前記濃度勾配液を該連通孔
に充填した後に上記各ブロック板を連通孔が遮断される
位置まで相互に移動させて形成することを特徴とする有
機単結晶作製方法。
（２）生体高分子結晶の溶液成長による単結晶化条件を
規定する因子の一つを濃度勾配とした液を小室に分割す
ることによって該小室内に個別に生体高分子単結晶を作
製する方法において、前記小室を、弗素系化合物樹脂で形成した所定壁厚を持
つ中空管に前記濃度勾配液を導いた後、凹凸を有する治
具で該中空管をその外部から凹凸方向に圧着して形成す
ることを特徴とする有機単結晶作製方法。